JP2017500038A5 - - Google Patents
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Claims (21)
- 宿主細胞ゲノムの標的部位に外来性核酸を組み込むための方法であって、該方法は、
(a)1つまたはそれを超える単離された宿主細胞を、
(i)該宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸(ES);
(ii)TSに断裂を作製することができるヌクレアーゼ(N);および
(iii)該宿主細胞と接触される1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
と接触させる工程;
ならびに
(b)該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。 - 前記直鎖状核酸が、前記宿主細胞と接触されるさらなる直鎖状核酸の相同性領域と組み換わることができる相同性領域を含み、2つの該直鎖状核酸の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、請求項1に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、該直鎖状核酸が、該選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および/または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、該直鎖状核酸から発現され得ず、該環状の染色体外核酸の該形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該環状の染色体外核酸から発現され得る、方法。 - 工程(b)の前記選択する工程が、視覚的検出法、比色法または蛍光検出法によって前記選択マーカーの発現を検出する工程を含む、請求項1または請求項2のいずれかに記載の方法。
- ESがTSにおいて相同的に組み換えられた宿主細胞を回収する工程をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、
(a)該回収する工程が、前記宿主細胞ゲノムへの選択マーカーの組込みを必要としないか;または
(b)該回収する工程が、スクリーニングされた10、9、8、7、6、5、4、3もしくは2個の接触された宿主細胞毎またはそれらのクローン集団毎に少なくとも約1回の頻度で行われる、方法。 - 複数(n個)の外来性核酸が、前記宿主細胞ゲノムの複数(n個)の標的部位に組み込まれ、ここで、nは、少なくとも2であり、工程(a)は、前記単離された宿主細胞を
(i)該複数の外来性核酸であって、ここで、
xは、1からnまで変動する整数であり、各整数xに対して、外来性核酸(ES)xの各々は、該宿主細胞ゲノムの該複数(n個)の標的部位から選択される標的部位(TS)xにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸;
(ii)該標的部位(TS)xの各々に対して、(TS)xにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N)x
と接触させる工程を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、:
(a)単一のヌクレアーゼが、(TS) x の各々を切断することができるか;または
(b)n=3、4、5、6、7、8、9または10である、方法。 - ESが、第1の相同性領域(HR1)および第2の相同性領域(HR2)を含み、ここで、HR1およびHR2は、相同組換えを介して、それぞれ第3の相同性領域(HR3)および第4の相同性領域(HR4)と組み換わることができ、HR3およびHR4は各々、TSに存在する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、
(a)Nが、TSに一本鎖断裂または二本鎖断裂をもたらすことができるか;または、
(b)ESが、直鎖状である、方法。 - ESが、目的の核酸Dをさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、Dが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、方法。 - 前記環状の染色体外核酸が、前記ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法であって、必要に応じて、さらに、該ヌクレアーゼが、RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼであり、必要に応じて、さらに、該ヌクレアーゼが、Cas9エンドヌクレアーゼである、方法。
- 前記環状の染色体外核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼによるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする、crRNA活性およびtracrRNA活性をコードする配列をさらに含む、請求項8に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、該crRNA活性および該tracrRNA活性が、単一の連続したRNA分子として発現される、方法。 - 前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法であって、必要に応じて、さらに、
(a)該ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプIIS制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質であり、該タイプIIS制限エンドヌクレアーゼが、HOエンドヌクレアーゼおよびFokIエンドヌクレアーゼからなる群より選択され、該ジンクフィンガー結合ドメインが、3、5または6つのジンクフィンガーを含むか;あるいは、
(b)該エンドヌクレアーゼが、
(i)LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼであるか;
(ii)H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択されるか;または
(iii)内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合せず、該エンドヌクレアーゼは(i)または(ii)の野生型エンドヌクレアーゼに由来する、方法。 - 前記宿主細胞が、
(a)原核細胞であるか;
(b)真核細胞であるか;
(c)真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択されるか;
(d)げっ歯類細胞、霊長類細胞およびヒト細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞であるか;あるいは
(e)必要に応じてSaccharomyces cerevisiaeである酵母細胞である、
請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。 - 宿主細胞であって、
(i)該宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸(ES);
(ii)TSにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N);および
(iii)直鎖状核酸として該宿主細胞に導入される核酸であって、該宿主細胞内の1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能であり、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、核酸
を含む、宿主細胞であって、必要に応じて、さらに、該直鎖状核酸が、該宿主細胞内のさらなる直鎖状核酸の相同性領域と組み換わることができる相同性領域を含み、
必要に応じて、さらに、該直鎖状核酸が、該選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および/または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、該直鎖状核酸から発現され得ず、該環状の染色体外核酸の該形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該環状の染色体外核酸から発現され得る、宿主細胞。 - 前記宿主細胞が、
(i)複数の外来性核酸であって、ここで、
xは、1からnまで変動する整数であり、各整数xに対して、外来性核酸(ES)xの各々は、該宿主細胞ゲノムの前記複数(n個)の標的部位から選択される標的部位(TS)xにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸;
(ii)該標的部位(TS)xの各々に対して、(TS)xにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N)x
を含む、請求項12に記載の宿主細胞。 - ESが、第1の相同性領域(HR1)および第2の相同性領域(HR2)を含み、ここで、HR1およびHR2は、相同組換えを介して、それぞれ第3の相同性領域(HR3)および第4の相同性領域(HR4)と組み換わることができ、HR3およびHR4は各々、TSに存在し、必要に応じて、さらに、
(a)Nが、TSに一本鎖断裂または二本鎖断裂をもたらすことができるか;または
(b)ESが、直鎖状である、宿主細胞。 - ESが、目的の核酸Dをさらに含む、請求項12〜14のいずれか1項に記載の宿主細胞であって、必要に応じて、さらに、Dが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、宿主細胞。
- 前記環状の染色体外核酸が、前記ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、請求項12〜15のいずれか1項に記載の宿主細胞であって、必要に応じて、さらに、該ヌクレアーゼが、RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼであり、必要に応じて、さらに、該ヌクレアーゼが、Cas9エンドヌクレアーゼである、宿主細胞。
- 前記環状の染色体外核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼによるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする、crRNA活性およびtracrRNA活性をコードする配列をさらに含む、請求項16に記載の宿主細胞であって、必要に応じて、さらに、該crRNA活性および該tracrRNA活性が、単一の連続したRNA分子として発現される、宿主細胞。
- 前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項12〜17のいずれか1項に記載の宿主細胞であって、必要に応じて、さらに、
(a)該ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプIIS制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質であり、該タイプIIS制限エンドヌクレアーゼが、HOエンドヌクレアーゼおよびFokIエンドヌクレアーゼからなる群より選択され、該ジンクフィンガー結合ドメインが、3、5または6つのジンクフィンガーを含むか;あるいは
(b)該エンドヌクレアーゼが、
(i)LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼであるか;
(ii)H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択されるか;または
(iii)内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合せず、該エンドヌクレアーゼは(i)または(ii)の野生型エンドヌクレアーゼに由来する、宿主細胞。 - (a)部位特異的ヌクレアーゼ、または部位特異的ヌクレアーゼのコード配列を含む核酸;ならびに
(b)第1の直鎖状核酸および1つまたはそれを超えるさらなる直鎖状核酸であって、ここで、該第1および第2の直鎖状核酸は、宿主細胞への導入の後に互いとの相同組換えが可能であり、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状核酸が形成される、第1の直鎖状核酸および1つまたはそれを超えるさらなる直鎖状核酸
を含む、組成物。 - 細胞培養培地ならびに請求項12〜18のいずれか1項に記載の宿主細胞を含む、細胞培養組成物。
- 宿主細胞ゲノムの標的部位に外来性核酸を組み込むための方法であって、該方法は、
(a)1つまたはそれを超える単離された宿主細胞を、
(i)該宿主細胞ゲノムの該標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸(ES);および
(ii)該宿主細胞と接触される1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列およびTSにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N)のコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
と接触させる工程;
ならびに
(b)該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。
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