JP2017221200A - 二重標的化 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】重鎖可変(VH)ドメイン及び軽鎖可変(VL)ドメインの相補対内に2つの重複しないパラトープを含む二重特異性抗体又はその抗原結合性断片であって、第一のパラトープが、VLドメインのCDR1及びCDR3並びにVHドメインのCDR2に由来する残基を含み、第二のパラトープが、VHドメインのCDR1及びCDR3並びにVLドメインのCDR2に由来する残基を含む、二重特異性抗体又はその抗原結合性断片。
【選択図】図1
Description
a.ダイアボディ(Diabodies)(Perisic et al., Structure. 1994 Dec 15;2(12):1217-26; Kontermann, Acta Pharmacol Sin. 2005 Jan;26(1):1-9; Kontermann, Curr Opin Mol Ther. 2010 Apr;12(2):176-83.)
b.TandAbs等(Cochlovius et al., Cancer Res. 2000 Aug 15;60(16):4336-41.)
c.異なる標的に特異的な複数の単一ドメインを、ペプチドリンカーを介して遺伝子的に融合したもの(例えばDomantis:国際特許公開第2008/096158号;Ablynx:国際特許公開第2007/112940号)
d.その他(総説として、Enever et al., Curr Opin Biotechnol. 2009 Aug; 20(4):405-11. Epub 2009 Aug 24.; Carter, Nat. Rev. Immunol. 6, 343 (2006); P. Kufer et al., Trends Biotechnol. 22, 238 (2004))
a.血清アルブミン又は血清アルブミン結合部分(binding entity)の付加
b.PEG化
c.遺伝子融合によるタンパク質ポリマーの付加、例えばHAP化(Schlapschy et al., Protein Eng Des Sel. 2007 Jun; 20(6):273-84. Epub 2007 Jun 26) 又はXTEN(Schellenberger, Nat. Biotechnology 12 (2009) 1186)
a.十分に確立された方法、例えば従来の単一特異性IgGの製法で使用されるものと同一の方法を用いて、製法を改善できる可能性がある。
b.FcRnを介して患者及び動物モデルの血清半減期を調節できる可能性がある。
c.非細胞毒性の本質的に不活性の挙動(例えば受容体を遮断するよう設計された抗体)から、攻撃的な細胞毒性の挙動(例えば腫瘍細胞を死滅させるよう設計された抗体)まで、異なるアイソタイプに関連するエフェクター機能を自由に選択できる。
a.ヘテロ二量体VH−VL可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第一の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib1の群から選択される少なくとも3つのCDR位に多様性を有し、但し少なくとも1つの多様化残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの多様化位置がVLドメイン内に存在し、ここでLib2位由来の残基は何れも多様化されておらず;
b.前記第一の集合から、第一の標的又はエピトープに特異的な第一の抗体分子又はその機能断片を選択し;
c.ヘテロ二量体VH−VL可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第二の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib2の群から選択される少なくとも3つのCDR位に多様性を有し、但し少なくとも1つの多様化残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの多様化位置がVLドメイン内に存在し、ここでLib1位由来の残基は何れも多様化されておらず;
d.前記第二の集合から、第二の標的又はエピトープに特異的な第二の抗体分子又はその機能断片を選択し;
e.ヘテロ二量体VH−VL可変領域を含む第三の抗体分子又はその機能断片をコードする核酸配列を生成し、ここで第三の抗体分子又はその機能断片は、第一の抗体分子又はその機能断片内のLib1位の群に含まれる少なくとも3つの残基を含み、その中の少なくとも1つの残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの残基がVLドメイン内に存在し、ここで第三の抗体分子又はその機能断片は更に、第二の抗体分子又はその機能断片内のLib2位の群に含まれる少なくとも3つの残基を含み、その中の少なくとも1つの残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの残基がVLドメイン内に存在する
工程を含む、方法に関する。
a.ヘテロ二量体VH−VL可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第一の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib1の群から選択される少なくとも3つのCDR位に多様性を有し、但し少なくとも1つの多様化残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの多様化位置がVLドメイン内に存在し、ここでLib2位由来の残基は何れも多様化されておらず;
b.前記第一の集合から、第一の標的又はエピトープに特異的な第一の抗体分子又はその機能断片を選択し;
c.Lib2の群から選択される少なくとも3つのCDR位に多様性を導入し、前記第一の抗体分子又はその機能断片を多様化することにより、ヘテロ二量体VH−VL可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第二の集合を生成し、但し少なくとも1つの多様化残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの多様化位置がVLドメイン内に存在し、ここでLib1位由来の残基は何れも多様化されておらず;
d.前記第二の集合から、第二の標的又はエピトープに特異的な第二の抗体分子又はその機能断片を選択する
工程を含み、
e.或いは、工程a.における第一の集合を、Lib2の群から選択される少なくとも3つのCDR位を多様化することにより生成すると共に、工程c.において、前記第一の抗体又はその抗体断片を、Lib1の群から選択される少なくとも3つのCDR位で多様化するように変更して、工程a.〜d.を実施する、方法に関する。
a.ヘテロ二量体VH−VL可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第一の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib1の群から選択される少なくとも3つのCDR位に多様性を有し、但し少なくとも1つの多様化残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの多様化位置がVLドメイン内に存在し、ここでLib2位由来の残基は何れも多様化されておらず;
b.前記第一の集合から、第一の標的又はエピトープに特異的な第一の抗体分子又はその機能断片を選択し;
c.ヘテロ二量体VH−VL可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第二の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib2の群から選択される少なくとも3つのCDR位に多様性を有し、但し少なくとも1つの多様化残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの多様化位置がVLドメイン内に存在し、ここでLib1位由来の残基は何れも多様化されておらず;
d.前記第二の集合から、第二の標的又はエピトープに特異的な第二の抗体分子又はその機能断片を選択し;
e.ヘテロ二量体VH−VL可変領域を含む第三の抗体分子又はその機能断片をコードする核酸配列を生成し、ここで第三の抗体分子又はその機能断片は、第一の抗体分子又はその機能断片内のLib1位の群に含まれる少なくとも3つの残基を含み、その中の少なくとも1つの残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの残基がVLドメイン内に存在し、ここで第三の抗体分子又はその機能断片は更に、第二の抗体分子又はその機能断片内のLib2位の群に含まれる少なくとも3つの残基を含み、その中の少なくとも1つの残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの残基がVLドメイン内に存在する
工程を含む、方法に関する。
a.ヘテロ二量体VH−VL可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第一の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib1の群から選択される少なくとも3つのCDR位に多様性を有し、但し少なくとも1つの多様化残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの多様化位置がVLドメイン内に存在し、ここでLib2位由来の残基は何れも多様化されておらず;
b.前記第一の集合から、第一の標的又はエピトープに特異的な第一の抗体分子又はその機能断片を選択し;
c.Lib2の群から選択される少なくとも3つのCDR位に多様性を導入し、前記第一の抗体分子又はその機能断片を多様化することにより、ヘテロ二量体VH−VL可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第二の集合を生成し、但し少なくとも1つの多様化残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの多様化位置がVLドメイン内に存在し、ここでLib1位由来の残基は何れも多様化されておらず;
d.前記第二の集合から、第二の標的又はエピトープに特異的な第二の抗体分子又はその機能断片を選択する
工程を含み、
e.或いは、工程a.における第一の集合を、Lib2の群から選択される少なくとも3つのCDR位を多様化することにより生成すると共に、工程c.において、前記第一の抗体又はその抗体断片を、Lib1の群から選択される少なくとも3つのCDR位で多様化するように変更して、工程a.〜d.を実施する、方法に関する。
f.工程a.〜e.で生成される核酸配列を宿主細胞で発現させるか、前記核酸をタンパク質に翻訳して、第三の抗体分子又はその機能断片を作成する
工程を更に含む方法に関する。
ライブラリーLib D1L1及びLib D1H1のための合成遺伝子プールはGeneArtから購入し、ライブラリーD1L2及びD1H2のための合成遺伝子プールはSloning Biotechnologyから購入した。4つのライブラリーは何れも新たに構築したファージディスプレイベクターにクローン化した。ファージディスプレイベクターはpUC19(NEBから購入)骨格に対して、M13起点、抗体重及び軽鎖の発現を誘導する2つの合成リボゾーム結合部位、並びに、抗体ポリペプチドの大腸菌(E. coli)ペリプラズムへの分泌を誘導する2つのシグナルペプチドをコードする合成遺伝子、ヒトCH1及びCK定常ドメイン、及びヒトCH1定常ドメインのC末端に融合されたM13タンパク質IIIの切断C末端部を追加して構築したものである。ライブラリーをTG1大腸菌(E. coli)細胞に形質転換し、各々109の形質転換多様性を有する4つのライブラリーを作製した。形質転換TG1大腸菌(E. coli)細胞から、M13KO7ヘルパーファージを用いて、既報の標準的な分子生物学的手法により、多様化されたFab断片を提示するファージのライブラリーとして、4つのライブラリーを作製した(Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1st ed., 2001; Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3rd ed., 2001)。
Fab提示ファージ粒子のライブラリーからのバインダーは、標準的なパニング法に従って(Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1st ed., 2001; Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3rd ed., 2001)、固定化された標的MBP及びGSTを用いて得ることができる。
例2で選択されたファージ粒子は、細菌宿主細胞を感染させることによりレスキューすることができる(Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1st ed., 2001; Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3rd ed., 2001)。個別のクローンから発現されたFabタンパク質の標的MPB及びGSTに対する特異的結合を試験する。陽性ヒットを次工程に使用し、二重特異性コンストラクトをクローン化する。
抗体遺伝子は所望のアミノ酸配列に基づいて設計し、GeneArt又はDNA2.0から合成遺伝子又は合成遺伝子断片として購入した。点突然変異を有する抗体変異体をコードする遺伝子はPCR又はオーバーラップPCRにより、ポリメラーゼPwo Master(Rocheより購入)及び所望の点突然変異をコードする合成オリゴヌクレオチド(Thermo Fisher Scientificより購入)を用いて、メーカーの使用説明書に従って生成した。大腸菌(E. coli)Fab発現ベクターは、プラスミドpUC19(New England Biolabsより購入)を改変することにより作製した。pUC19骨格に対して、抗体重及び軽鎖の発現を誘導する2つの合成リボゾーム結合部位、抗体鎖の大腸菌(E. coli)ペリプラズムへの分泌を誘導する2つの合成シグナルペプチド配列、及び、一本鎖産生を可能とする1つのM13ファージ起点を追加する改変を行った。合成抗体遺伝子、抗体遺伝子の合成断片、及び点突然変異をコードする抗体遺伝子のPCR生成変異体を、制限エンドヌクレアーゼ(Rocheより購入)を用いた制限酵素消化、次いでLigaFast(Promegaより購入)を用いたライゲーションにより、メーカーの使用説明書に従って、この大腸菌(E. coli)Fab発現ベクターにクローン化した。ライゲーション反応物を、コンピテントTG1大腸菌(E. coli)細胞(StrataGene又はZymoresearchより購入)に形質転換した。
Fab発現コンストラクトを担持するTG1大腸菌(E. coli)クローンを、LB及びTB固体及び液体培地(Carl Rothより購入)で増殖させた。培地にはカルベニシリン及びグルコース(VWRより購入)を添加した。液体培養物中の抗体発現は、三角フラスコを振盪培養器に入れて一晩かけて実施し、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)(Carl Rothより購入)を培養培地に添加して誘導した。発現培養物を遠心分離して、分泌されたFab断片を含む培養上清を単離した。清明な培養上清に、1%量のストレプトマイシン/ペニシリン溶液(PAA Laboratoriesより購入)、2%量の1M Tris pH8.0(VWRより購入)、及び0.4%量のSTREAMLINE rProtein A樹脂(GE Healthcareより購入)を添加した。添加後の培養上清を回転培養器で3時間又は一晩インキュベートし、Fab断片をProtein A樹脂に結合させた。その後、樹脂を重力流カラムに移送し、30床体積の2×PBS pH7.4(Invitrogenより購入)で1回洗浄し、10mM Tris pH6.8及び100mM NaClを含む5床体積の緩衝剤(VWRより購入)で1回洗浄し、10mM クエン酸 pH3及び100mM NaClを含む緩衝剤(VWRより購入)を用いて溶出した。溶出されたFab断片に8%量の1M Tris pH8.0を加えて中和した。中和された精製Fab断片を、illustra NAP−5 脱塩カラム(GE Healthcareより)を用い、メーカーの使用説明書に従って、純粋な1×PBS pH7.4(1.06mM KH2PO4、2.97mM Na2HPO4−7H2O、及び155.17mM NaCl含有、他の添加物なし;Invitrogenカタログ番号10010056)へとバッファー交換した。
精製及びバッファー交換されたFab断片の生物物理学的安定性を、1×PBS pH7.4(Invitrogenカタログ番号10010056)中、差分走査熱量法(differential scanning calorimetry:DSC)により測定した。何れの測定でも、オートさんぷらーを装着したキャピラリーセルマイクロ熱量計を用い、VPViewer2000 CapDSCソフトウェア(MicroCalより)で制御を行った。何れのFab断片も、抗体を含まない純粋な緩衝剤(1×PBS pH7.4;Invitrogenカタログ番号10010056)に対して走査した。走査パラメーターは、32℃から105℃と115℃との間までの温度域を分析するように設定し、走査前サーモスタットは2分間、走査後サーモスタットは0分間、ゲイン無とした。走査速度は、スクリーニング用途については毎時250℃、最も安定な組み合わせ変異体の再分析については毎時60℃に設定した。スクリーニングモード(走査速度毎時250℃)で決定されたFab断片の絶対融点温度は、再分析モード(走査速度毎時60℃)で決定された温度よりも3.7℃〜4.5℃高かったが、クローンの順位は両モードで同一であった。Fab断片の融点温度はPBS基準減算に従い、Origin 7.0ソフトウェア(MicroCalより)を用いて決定した。
1の標的に基づいてLib1及びLib2ライブラリーから選択された抗体の特異性、及び、両標的に結合するように設計された二重特異性抗体の特異性を試験するために、標準的な方法を用いて酵素結合免疫吸着法(enzyme-linked immunosorbent assay:ELISA)を実施した。要約すると、Nunc Maxisorpプレートを1×PBS中ストレプトアビチンで被覆し、PBS−T(0.3%Tween−20を1×PBSに溶解)中20nMビオチニル化標的(GST、MBP、HEL、又はVEGF)を結合させ、PBS−T中5%脱脂粉乳でブロックすることにより調製した。その後、マイクロタイタープレート中、抗体クローンを溶解性Fab断片として発現する50μlの大腸菌(E. coli)TG1培養上清を加え、続いてヤギ抗ヒトkappa軽鎖ポリクローナル抗体(Sigma)、又は、溶解性Fab発現コンストラクト内の重鎖のC末端に融合されたStrep-IIタグに特異的なマウス抗Strepタグ抗体(IBA)を用いて、結合したFab断片を検出した。HRP標識三級抗体を用いて二次抗体を検出し、TMB基質(KPL)を用いてELISAを展開し、Victorプレートリーダー(PerkinElmerより)を450nmにセットしてシグナルを定量化した。大腸菌(E. coli)培養上清に分泌されたダミー1Fabは4つの標的の何れにも結合せず、Fab LG1(ライブラリーLib D1L1から分泌された)はGSTのみに結合し、Fab HM2(ライブラリーLib D1H1から分泌された)はMBPのみに結合し、Fab DT3(Fab LG1及びHM2に存在する全ての標的特異的残基を組み合わせた)はGST及びMBPのみに結合した。何れのクローンも対照標的であるHEL又はVEGFには結合しなかった(図5)。各Fabについて2つの独立のコロニーを用い、実験を二重に行った。
ヒトVEGF(Peprotechカタログ番号100-20)及びヒトIL6(Peprotechカタログ番号200-06)に対して抗体ライブラリーの選択を行った。単離された親抗体クローンのうち、IL6P及びVEGFPを組み合わせて二重特異性抗体クローンVH6Lとした。VH6Lの配列を図4に示す。図示するように、更なる点突然変異が軽鎖のアミノ酸4に存在する。親及び二重特異性抗体の親和性を検証するべく、バイアコア(Biacore)(登録商標)分析を実施して、IL6P、VH6L、及びVEGFPの結合挙動を分析した。このために、アミンカップリングを用いて抗軽鎖捕捉抗体をCM5チップ上に固定化したところ、12000RUであった。Fab断片は400〜500RUのレベルで捕捉され、種々濃度の異なるIL6及びVEGF(0〜450nM)をチップ状に通過させた。図7に図示するように、クローンIL6PはIL6に結合するがVEGFには結合せず、クローンVEGFPはVEGFに結合するがIL6には結合せず、組み合わせクローンVH6LはIL6及びVEGFの双方に結合した。表1に示すように、標的に対する親和性は親と二重特異性抗体とでほぼ同等であった。解離定数KDは、IL6P及びVH6Lについてはそれぞれ38nM及び40nMであり、VEGFP及びVH6Lについてはそれぞれ11nM及び7.8nMであった。
本発明に係る二重特異性抗体が同一のVH−VL可変領域において2つの異なる抗原に同時に結合し得ることを立証するために、ヒトGMCSF及びヒトIL6に特異的な二重特異性抗体クローンGH6Lを用いてバイアコア(Biacore)(登録商標)実験を実施した。GH6Lの配列を図4に示す。図示するように、更なる点突然変異が軽鎖のアミノ酸4に存在する。GH6L重及び軽鎖並びにシグナルペプチドcDNAを担持する標準的な哺乳類発現ベクターを用いてHEK293−6E細胞を一時的に形質転換することにより、抗体をヒトIgG1フォーマットで発現させた。発現されたIgGをProtein A樹脂により親和性精製した。バイアコア(Biacore)(登録商標)分析のために、アミンカップリングを用いてGMCSF(Peprotechカタログ番号300-03)又は抗軽鎖捕捉抗体をCM5チップ上に固定化したところ、それぞれ4000RU及び12000RUのGMCSF及び抗軽鎖捕捉抗体が固定化された。
幾つかの本発明に係る二重特異性抗体について、2つの結合部位の独立した挙動を示すべく、Lib1又はLib2結合領域内に存在する単一の残基に位置特異的に突然変異形成した。一例では、標的A及び標的Bを対象とする二重特異性抗体クローンを突然変異させた。
Claims (22)
- 重鎖可変(VH)ドメイン及び軽鎖可変(VL)ドメインからなる少なくとも1つの可変結合ドメインを含む抗体又はその機能断片であって、前記結合ドメインが2つの非関連エピトープに対する2つのパラトープを含み、ここで(i)各パラトープの対応するエピトープに対する結合が、他方のパラトープの対応するエピトープに対する同時結合を妨げず、(ii)両パラトープが、少なくとも1つのVH CDRに由来する少なくとも1つの残基と、少なくとも1つのVL CDRに由来する少なくとも1つの残基とを含む、抗体又はその機能断片。
- 二重特異性抗体である、請求項1の抗体又はその機能断片。
- 両エピトープ同時存在時の各パラトープの対応するエピトープに対する結合量が、他方のエピトープが不在である他は同一の条件下で達成される結合量の少なくとも25%である、請求項1又は2の抗体又はその機能断片。
- 結合量が少なくとも50%、特に少なくとも75%、とりわけ少なくとも90%である、請求項3の抗体又はその機能断片。
- 第一のパラトープが、VLドメインのCDR1及びCDR3並びにVHドメインのCDR2に由来する残基を含み、第二のパラトープが、VHドメインのCDR1及びCDR3並びにVLドメインのCDR2に由来する残基を含む、請求項1〜4の何れか一項の抗体又はその機能断片。
- ヒト抗体又はその機能断片である、請求項1〜5の何れか一項の抗体又はその機能断片。
- ヒトVH3ファミリー重鎖配列及びヒトVkappa1ファミリー軽鎖配列に基づく、請求項6の抗体又はその機能断片。
- ヒトVH3ファミリー重鎖配列及びヒトVlambda1ファミリー軽鎖に基づく、請求項6の抗体又はその機能断片。
- 単鎖Fv断片、Fab断片、及びIgGから選択される、請求項1〜8の何れか一項の抗体又はその機能断片。
- 請求項1〜9の何れか一項に係る抗体又はその機能断片をコードする核酸配列。
- 請求項10に係る核酸配列を含むベクター。
- 請求項10に係る核酸配列又は請求項11に係るベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜9の何れか一項の抗体又はその機能断片を生成する方法であって、請求項10に係る核酸配列又は請求項11に係るベクターをインビトロ(in vitro)で、或いは請求項12に係る宿主細胞を含む適切な宿主細胞から、発現させる工程を含む方法。
- 抗体又はその機能断片の集合であって、前記集合が抗体可変ドメイン配列の多様集合を含み、ここで(i)Lib1位由来の少なくとも3つのCDR残基が多様化され、但し少なくとも1つの多様化残基がVHドメイン内に存在し、少なくとも1つの多様化位置がVLドメイン内に存在し、Lib2位由来の残基は何れも多様化されておらず、或いは(ii)少なくとも3つのCDRLib2位由来の残基が多様化され、但し少なくとも1つの多様化残基がVHドメイン内に存在し、少なくとも1つの多様化位置がVLドメイン内に存在し、Lib1位由来の残基は何れも多様化されていない、抗体又はその機能断片の集合。
- (i)の場合には、VLドメインのCDR1及びCDR3並びにVHのCDR2の各々の少なくとも1つの残基が多様化され、或いは(ii)の場合には、VHドメインのCDR1及びCDR3並びにVLのCDR2の各々の少なくとも1つの残基が多様化されている、請求項14の抗体又はその機能断片の集合。
- (i)の場合には、前記可変結合ドメイン内のLib1E位の少なくとも1つの残基が更に多様化され、及び/又は、(ii)の場合には、前記可変結合ドメイン内のLib2E位の少なくとも1つの残基が更に多様化されている、請求項14の抗体又はその機能断片の集合。
- 二重特異性抗体分子又はその機能断片を生成する方法であって、
a.ヘテロ二量体VH−VL可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第一の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib1の群から選択される少なくとも3つのCDR位に多様性を有し、但し少なくとも1つの多様化残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの多様化位置がVLドメイン内に存在し、ここでLib2位由来の残基は何れも多様化されておらず;
b.前記第一の集合から、第一の標的又はエピトープに特異的な第一の抗体分子又はその機能断片を選択し;
c.ヘテロ二量体VH−VL可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第二の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib2の群から選択される少なくとも3つのCDR位に多様性を有し、但し少なくとも1つの多様化残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの多様化位置がVLドメイン内に存在し、ここでLib1位由来の残基は何れも多様化されておらず;
d.前記第二の集合から、第二の標的又はエピトープに特異的な第二の抗体分子又はその機能断片を選択し;
e.ヘテロ二量体VH−VL可変領域を含む第三の抗体分子又はその機能断片をコードする核酸配列を生成し、ここで第三の抗体分子又はその機能断片は、第一の抗体分子又はその機能断片内のLib1位の群に含まれる少なくとも3つの残基を含み、その中の少なくとも1つの残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの残基がVLドメイン内に存在し、ここで第三の抗体分子又はその機能断片は更に、第二の抗体分子又はその機能断片内のLib2位の群に含まれる少なくとも3つの残基を含み、その中の少なくとも1つの残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの残基がVLドメイン内に存在する
工程を含む、方法。 - 二重特異性抗体分子又はその機能断片を生成する方法であって、
a.ヘテロ二量体VH−VL可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第一の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib1の群から選択される少なくとも3つのCDR位に多様性を有し、但し少なくとも1つの多様化残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの多様化位置がVLドメイン内に存在し、ここでLib2位由来の残基は何れも多様化されておらず;
b.前記第一の集合から、第一の標的又はエピトープに特異的な第一の抗体分子又はその機能断片を選択し;
c.Lib2の群から選択される少なくとも3つのCDR位に多様性を導入し、前記第一の抗体分子又はその機能断片を多様化することにより、ヘテロ二量体VH−VL可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第二の集合を生成し、但し少なくとも1つの多様化残基がVHドメイン内に存在すると共に、少なくとも1つの多様化位置がVLドメイン内に存在し、ここでLib1位由来の残基は何れも多様化されておらず;
d.前記第二の集合から、第二の標的又はエピトープに特異的な第二の抗体分子又はその機能断片を選択する
工程を含み、
e.或いは、工程a.における第一の集合を、Lib2の群から選択される少なくとも3つのCDR位を多様化することにより生成すると共に、工程c.において、前記第一の抗体又はその抗体断片を、Lib1の群から選択される少なくとも3つのCDR位で多様化するように変更して、工程a.〜d.を実施する、方法。 - f.工程a.〜e.で生成される核酸配列を宿主細胞で発現させるか、前記核酸をタンパク質に翻訳して、第三の抗体分子又はその機能断片を作成する
工程を更に含む、請求項17又は18の方法。 - Lib1群から選択される多様性を有する前記集合の何れかが、Lib1Eの群から選択される少なくとも1つの増強位置(enhancing position)に更なる多様性を含み、及び/又は、Lib1群から選択される多様性を有する前記集合の何れかが、Lib2Eの群から選択される少なくとも1つの増強位置(enhancing position)に更なる多様性を含む、請求項17〜19の何れか一項の方法。
- 前記第一の集合が、Lib D1L1、Lib D1L2、及びLib D2L1から選択されるライブラリーと同一であるか、Lib D1L1、Lib D1L2、又はLib D2L1に存在する多様化位置を有すると共に、フレームワーク領域において90%超の配列同一性、特に95%超の配列同一性を有するライブラリーに由来し;前記第一の集合が、Lib D1H1、Lib D1H2、Lib D1H3、及びLib D2H1から選択されるライブラリーと同一であるか、Lib D1H1、Lib D1H2、Lib D1H3、又はLib D2H1に存在する多様化位置を有すると共に、フレームワーク領域において90%超の配列同一性、特に95%超の配列同一性を有するライブラリーに由来する、請求項17〜20の何れか一項の方法。
- 抗体分子又はその機能断片が、単鎖Fv断片、Fab断片、及びIgGから選択される、請求項17〜21の何れか一項の方法。
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