JP2017134067A - 可溶性インターロイキン−２受容体の測定方法及び測定用試薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】 簡便で、かつ、高感度な試料中の可溶性インターロイキン−２受容体（以下、ｓＩＬ−２Ｒと記す）の測定方法及び測定用試薬を提供する。【解決手段】 試料と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子とを反応させ、抗原抗体反応によって生じた凝集を測定することを特徴とする、試料中のｓＩＬ−２Ｒの測定方法。【選択図】 なし
Description
本発明は、可溶性インターロイキン−２受容体の測定方法、及び、可溶性インターロイキン−２受容体の測定用試薬に関する。
インターロイキン−２受容体（以下、ＩＬ−２Ｒと記す）はα鎖、β鎖、γ鎖から構成されているが、α鎖の一部が細胞上から遊離した可溶性インターロイキン−２受容体（以下、ｓＩＬ−２Ｒと記す）が血中に存在することが知られている（特許文献１、非特許文献１参照）。ｓＩＬ−２Ｒは活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞によって産生されるために、生体の免疫防御機構の活性化、Ｔ細胞系及びＢ細胞系などの活性化に伴い血中のｓＩＬ−２Ｒが上昇することが報告されている。血清中のｓＩＬ−２Ｒ濃度は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫疾患や、ウイルス性肝炎、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などのウイルス感染症の患者で高値を示し、体内の活性化リンパ球量の指標の１つとなることが報告されている（非特許文献２参照）。また腫瘍細胞がｓＩＬ−２Ｒを産生し、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）や非ホジキンリンパ腫の進行と血清中のｓＩＬ−２Ｒ濃度の変動が良く相関することが知られている（非特許文献３、非特許文献４参照）。このようにｓＩＬ−２Ｒに関して、様々な免疫系の疾患や病態との関連が報告されており、なかでも造血疾患の有望な血液中のマーカーと認識されている。血清中のｓＩＬ−２Ｒ濃度は成人Ｔ細胞白血病においては病態モニタリングの指標など、非ホジキンリンパ腫においては治療効果の判定、寛解後のモニタリング、再発の早期発見の指標などとして臨床的に有効活用されている。
血清や血漿等の試料中のｓＩＬ−２Ｒの測定方法としては、ｓＩＬ−２Ｒに結合する抗体を用いる免疫測定法によるｓＩＬ−２Ｒの測定方法が知られており、ｓＩＬ−２Ｒに結合する抗体を担持する不溶性担体として、プレートを用いる方法（特許文献２）や磁性粒子を用いる方法（特許文献３）等が知られている。これらの方法においては、ｓＩＬ−２Ｒに結合する抗体とｓＩＬ−２Ｒとを抗原抗体反応させ免疫複合体を形成させたのち、免疫複合体中の標識の量を測定することにより、血清又は血漿等の試料中のｓＩＬ−２Ｒ濃度を測定することを原理とする標識法が用いられている。しかしながら、これらの標識法は、一般的に、免疫複合体中の標識の量を測定する前に、血清又は血漿等の試料中に含まれるｓＩＬ−２Ｒ以外の物質を取り除くために、洗浄液を用いて洗浄（Ｂ／Ｆ分離）を行う必要があり、測定に時間を要する。
一方、標識を使用しない免疫測定法の１つにラテックス凝集比濁法がある（特許文献４、５）。ラテックス凝集比濁法は、測定対象成分に結合する抗体または抗原を結合したラテックス粒子を用いて、検体中の測定対象成分と抗原抗体反応を起こさせ、ラテックス粒子の凝集による濁度変化を吸光度として測定する方法であり、Ｂ／Ｆ分離が不要な方法であるため、生化学検査用の汎用自動分析機での測定にも適用されている。しかしながら、ラテックス凝集比濁法は測定感度が悪いという問題があり、高感度が必要とされる測定対象成分の測定には適用が難しい。
The Journal of Immunology, vol.135, No.5, p.3172〜3177 (1985).
Clinical immunology and immunopathology, vol.50, No.3, p.321〜332 (1989).
臨床病理，vol.42, No.8, p.834-842 (1994).
臨床検査，vol.35, No.1, p.87-91 (1991).
本発明の目的は、簡便で、かつ、高感度な試料中のｓＩＬ−２Ｒの測定方法及び測定用試薬を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、試料を、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子、及び、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子と反応させる免疫凝集法により、簡便かつ高感度に、試料中のｓＩＬ−２Ｒを測定できる、という知見を見出して本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［８］に関する。
［１］ 試料と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子とを反応させ、抗原抗体反応によって生じた凝集を測定することを特徴とする、試料中のｓＩＬ−２Ｒの測定方法。
［２］ 第１抗体と不溶性担体粒子との結合、及び、第２抗体と不溶性担体粒子との結合が共に化学結合である、［１］に記載の方法。
［３］ 第1抗体及び第２抗体が共にモノクローナル抗体である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子、及び、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子が、共にラテックス粒子である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［１］ 試料と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子とを反応させ、抗原抗体反応によって生じた凝集を測定することを特徴とする、試料中のｓＩＬ−２Ｒの測定方法。
［２］ 第１抗体と不溶性担体粒子との結合、及び、第２抗体と不溶性担体粒子との結合が共に化学結合である、［１］に記載の方法。
［３］ 第1抗体及び第２抗体が共にモノクローナル抗体である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子、及び、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子が、共にラテックス粒子である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子とを含むことを特徴とする、試料中のｓＩＬ−２Ｒの測定用試薬。
［６］ 第１抗体と不溶性担体粒子との結合、及び、第２抗体と不溶性担体粒子との結合が共に化学結合である、［５］に記載の試薬。
［７］ 第１抗体及び第２抗体が共にモノクローナル抗体である、［５］又は［６］に記載の試薬。
［８］ ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子、及び、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子が、共にラテックス粒子である、［５］〜［７］のいずれかに記載の試薬。
［６］ 第１抗体と不溶性担体粒子との結合、及び、第２抗体と不溶性担体粒子との結合が共に化学結合である、［５］に記載の試薬。
［７］ 第１抗体及び第２抗体が共にモノクローナル抗体である、［５］又は［６］に記載の試薬。
［８］ ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子、及び、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子が、共にラテックス粒子である、［５］〜［７］のいずれかに記載の試薬。
本発明により簡便で、かつ、高感度な試料中のｓＩＬ−２Ｒの測定方法及び測定用試薬が提供される。
（測定方法）
本発明の測定方法は、試料と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子とを反応させ、抗原抗体反応によって生じた凝集を測定することを特徴とする、試料中のｓＩＬ−２Ｒの測定方法である。
本発明の測定方法は、試料と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子とを反応させ、抗原抗体反応によって生じた凝集を測定することを特徴とする、試料中のｓＩＬ−２Ｒの測定方法である。
本発明のｓＩＬ−２Ｒの測定方法としては、例えば以下の工程を含有する方法等が挙げられる。
［１］試料と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子とを反応させる工程；
［２］工程［１］の反応液に、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子を添加し、試料と、当該第１抗体、及び、当該第２抗体とを反応させ凝集を生成させる工程；
［３］工程［２］で生成した凝集を測定する工程;
［４］既知濃度のｓＩＬ−２Ｒを試料として用いて、上記［１］〜［３］を行うことにより、予め作成した、ｓＩＬ−２Ｒ濃度と凝集との関係を表す検量線と、工程［３］で測定された凝集の測定値とから、試料中のｓＩＬ−２Ｒ濃度を決定する工程。
［１］試料と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子とを反応させる工程；
［２］工程［１］の反応液に、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子を添加し、試料と、当該第１抗体、及び、当該第２抗体とを反応させ凝集を生成させる工程；
［３］工程［２］で生成した凝集を測定する工程;
［４］既知濃度のｓＩＬ−２Ｒを試料として用いて、上記［１］〜［３］を行うことにより、予め作成した、ｓＩＬ−２Ｒ濃度と凝集との関係を表す検量線と、工程［３］で測定された凝集の測定値とから、試料中のｓＩＬ−２Ｒ濃度を決定する工程。
工程［１］及び工程［２］は順次行っても、同時に行ってもよい。工程［１］及び工程［２］の反応、すなわち、抗原抗体反応は水性媒体中で行うことができる。水性媒体としては、本発明の測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば後述の水性媒体等が挙げられる。水性媒体には、後述の金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、凝集促進剤等が含有されてもよい。また、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子は、抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ａ）が結合した第１抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ａ）が結合した不溶性担体粒子とを反応させることにより、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子を生成することができる。同様に、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子は、抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ｂ）が結合した第２抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ｂ）が結合した不溶性担体粒子とを反応させることにより、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子を生成することができる。ここで、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子とが同一の反応液中で生成する場合には、Ａ及びａからなる一組の親和性物質は、Ｂ及びｂからなる一組の親和性物質とは異なっていることが好ましい。一組の親和性物質としては、例えばアビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）とビオチンとの組み合わせ、抗体のFc領域と、Fc領域と結合する抗体との組み合わせ等が挙げられる。Ａ−ａの組み合わせとＢ−ｂの組み合わせとが異なる場合における、Ａ−ａの組み合わせ、及び、Ｂ−ｂの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせが挙げられる。
・ビオチン−アビジン類、又は、アビジン類−ビオチンの組み合わせ；第２抗体のFc領域と、当該Fc領域と結合する抗体との組み合わせ。
・第１抗体のFc領域と、当該Fc領域と結合する抗体との組み合わせ；ビオチン−アビジン類、又は、アビジン類−ビオチンの組み合わせ。
・ビオチン−アビジン類、又は、アビジン類−ビオチンの組み合わせ；第２抗体のFc領域と、当該Fc領域と結合する抗体との組み合わせ。
・第１抗体のFc領域と、当該Fc領域と結合する抗体との組み合わせ；ビオチン−アビジン類、又は、アビジン類−ビオチンの組み合わせ。
工程［１］及び工程［２］における抗原抗体反応の反応温度は、本発明のｓＩＬ−２Ｒの測定を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、０〜５０℃であり、４〜４５℃が好ましく、２０〜４０℃が特に好ましい。工程［１］及び工程［２］における抗原抗体反応の反応時間は、本発明のｓＩＬ−２Ｒの測定を可能とする時間であれば特に制限はなく、通常、１分間〜1時間であり、２〜２０分間が好ましい。
工程［１］において、試料を予め後述の水性媒体で希釈して保持した後に抗原抗体反応に供することもできる。水性媒体には、後述の金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、凝集促進剤等が含有されてもよい。試料を予め水性媒体で希釈して保持する温度は、本発明のｓＩＬ−２Ｒの測定を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、０〜５０℃であり、４〜４５℃が好ましく、２０〜４０℃が特に好ましい。試料を予め水性媒体で希釈して保持する時間は、本発明のｓＩＬ−２Ｒの測定を可能とする時間であれば特に制限はなく、通常、１分間〜1時間であり、２〜２０分間が好ましい。
工程［３］において、工程［２］で生成した凝集を測定する方法としては、工程［２］で生成した凝集を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えば特定の波長での吸光度を測定する方法等が挙げられる。波長としては、工程［２］で生成した凝集を測定し得る波長であれば特に制限はなく、例えば５７０ｎｍ等が挙げられる。
工程［４］において、既知濃度のｓＩＬ−２Ｒを試料として用いて工程［１］〜［３］を行うことにより、予め作成した、ｓＩＬ−２Ｒ濃度と凝集との関係を表す検量線と、工程［３］で測定した凝集とから、試料中のｓＩＬ−２Ｒ濃度を決定することができる。
本発明における試料としては、本発明のｓＩＬ−２Ｒの測定を可能とする試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、全血、血漿、血清等が好ましい。
ｓＩＬ−２Ｒに結合する抗体（第１抗体及び第２抗体）と不溶性担体粒子との間の結合としては、本発明のｓＩＬ−２Ｒの測定を可能とする結合であれば特に制限はなく、物理吸着、化学結合等が挙げられる。物理吸着としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学結合としては、例えば共有結合、配位結合等が挙げられる。
ｓＩＬ−２Ｒに結合する抗体（第１抗体及び第２抗体）は、前述の物理吸着及び／又は化学結合を利用して、直接、不溶性担体粒子に固定化してもよいし、間接的に不溶性担体粒子に固定化してもよい。間接的な固定化方法としては、例えばビオチンとアビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）との特異的結合を介して、抗体を不溶性担体粒子に固定化する方法が挙げられる。あるいは、抗体は、リンカーを介した共有結合により不溶性担体粒子に固定化してもよい。
リンカーとしては、不溶性担体粒子表面の官能基と抗体の側鎖の官能基の両者を共有結合できる分子等が挙げられ、例えば、抗体が有する官能基と反応することができる第１の反応活性基と、不溶性担体粒子表面の官能基と反応することができる第２の反応活性基とを同時に持つ分子であって、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基である分子が好ましく用いられる。抗体の官能基および不溶性担体粒子がその表面に保持している官能基としては例えば、カルボキシ基、アミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、Ｎ−ヒドロキシサクシニル基、マレイミド基等が挙げられる。リンカーにおける反応活性基としては、例えば、アリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン等の基が挙げられる。
本発明における水性媒体としては、本発明のｓＩＬ−２Ｒの測定を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に制限されないが、ｐＨ１〜１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられる。
グッド緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］（Ｔｒｉｃｉｎｅ）緩衝剤、［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］（Ｂｉｃｉｎｅ）緩衝剤、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤等が挙げられる。
本発明における金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。本発明における糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等が挙げられる。本発明における防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン300、プロキセル（Proxel）ＧＸＬ等が挙げられる。本発明における蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、カゼイン、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル社製）等が挙げられる。本発明における界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。
本発明における凝集促進剤としては、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルセルロース、デキストラン、Lipidure類（Lipidure BL-206等；日油社製）、Ficoll類（Ficoll 400等；ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられる。
本発明における不溶性担体粒子としては、本発明のｓＩＬ−２Ｒの測定を可能とする不溶性担体粒子であれば特に制限はなく、例えば、ラテックス粒子、磁性粒子等が挙げられ、ラテックス粒子が好ましい。ラテックス粒子の素材としては、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン等が挙げられる。
本発明における反応溶液中の不溶性担体粒子の形状は、本発明のｓＩＬ−２Ｒの測定を可能とする形状であれば特に制限はなく、例えば球状、円柱状等が挙げられ、球状が好ましい。球状の粒子の粒径としては、通常、平均粒径３０〜８００ｎｍであり、平均粒径１００〜５００ｎｍが好ましく、平均粒径１５０〜４５０ｎｍがより好ましい。本発明における反応溶液中の不溶性担体粒子の濃度は、本発明のｓＩＬ−２Ｒの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、０．０００１〜１０重量％であり、０．０００５〜５重量％が好ましく、０．００１〜０．１重量％がより好ましい。
ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体を結合させる不溶性担体粒子と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体を結合させる不溶性担体粒子とは同じであっても異なっていてもよいが、同じである方が好ましい。
本発明におけるｓＩＬ−２Ｒに結合する抗体（第１抗体及び第２抗体）は、ｓＩＬ−２Ｒに結合し、本発明のｓＩＬ−２Ｒの測定を可能とする抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、本発明においては、全長の抗体のみならず、抗体フラグメントを用いることもできる。抗体フラグメントとしては、例えば、抗体をパパイン処理により得られるＦａｂ、ペプシン処理により得られるＦ（ａｂ’）２、ペプシン処理−還元処理により得られるＦａｂ’等のＦｃ部分を除去した抗体フラグメント等が挙げられる。不溶性担体粒子として、アビジン、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンがその表面に固定化された不溶性担体粒子を用いる場合には、第１抗体にビオチンが結合したビオチン結合第１抗体及び第２抗体にビオチンが結合したビオチン結合第２抗体を用いることができる。
本発明において使用される、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が認識するｓＩＬ−２Ｒの部位と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が認識するｓＩＬ−２Ｒの部位とは同じであっても、異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。
本発明において使用される、ｓＩＬ−２Ｒに結合する抗体は、ｓＩＬ−２Ｒそのもの、又は、ｓＩＬ−２Ｒ中のエピトープに相当するペプチドを抗原として用いる通常の抗体の製造方法により製造することができるが、市販品としても入手可能である。ｓＩＬ−２Ｒに結合する抗体の市販品としては、例えばモノクローナル抗体AM92.3（ピアース社製）、モノクローナル抗体7G7/B6（ピアース社製）等が挙げられる。
（測定用試薬）
本発明の試料中のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬は、本発明のｓＩＬ−２Ｒの測定方法に使用される試薬であり、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子、及び、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子を含有する。
本発明の試料中のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬は、本発明のｓＩＬ−２Ｒの測定方法に使用される試薬であり、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子、及び、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子を含有する。
本発明の測定用試薬は凍結乾燥状態でも液状でもよい。凍結乾燥状態の測定用試薬を用いる場合には、予め水性媒体で溶解した後、測定に供する。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。水性媒体には、前述の金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、凝集促進剤等が含有されてもよい。液状の測定用試薬には、水性媒体が含まれている。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。水性媒体には、前述の金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、凝集促進剤等が含有されてもよい。
本発明の測定用試薬における、不溶性担体粒子、ｓＩＬ−２Ｒに結合する抗体（第１抗体、第２抗体）としては、前述の不溶性担体粒子、ｓＩＬ−２Ｒに結合する抗体（第１抗体、第２抗体）がそれぞれ挙げられる。本発明の測定用試薬における不溶性担体粒子の含量は、水性媒体で溶解された時の濃度または、水性媒体中の濃度が、通常０．０００１〜１０重量％となる含量であり、０．０００５〜５重量％となる含量が好ましく、０．００１〜０．１重量％となる含量がより好ましい。
本発明の測定用試薬において、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子は、抗原抗体反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の試薬には、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ａ）が結合した第１抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ａ）が結合した不溶性担体粒子を含む。同様に、本発明の測定用試薬において、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子は、抗原抗体反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の試薬には、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ｂ）が結合した第２抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ｂ）が結合した不溶性担体粒子を含む。ここで、（Ａ）が結合した第１抗体と（ａ）が結合した不溶性担体粒子とから、第１抗体が結合した不溶性担体粒子を生成させる反応と、（Ｂ）が結合した第２抗体と（ｂ）が結合した不溶性担体粒子とから、第２抗体が結合した不溶性担体粒子を生成させる反応とが、同一の反応液中で行われる試薬の場合、Ａ及びａからなる一組の親和性物質は、Ｂ及びｂからなる一組の親和性物質とは異なっていることが好ましい。一組の親和性物質としては、例えば前述の親和性物質等が挙げられ、Ａ−ａの組み合わせとＢ−ｂの組み合わせとが異なる場合における、Ａ−ａの組み合わせ、及び、Ｂ−ｂの組み合わせとしては、例えば前述の組み合わせ等が挙げられる。
本発明の測定用試薬において、試料を前処理するための試料前処理試薬が含まれていてもよい。前処理としては、例えば希釈、可溶化、変性等が挙げられる。試料前処理試薬としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。水性媒体には、前述の金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、凝集促進剤等が含有されてもよい。試料前処理試薬は液状でも凍結乾燥状態でもよい。凍結乾燥状態の試料前処理試薬を用いる場合には、予め水性媒体で溶解した後、試料の前処理に用いることができる。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。水性媒体には、前述の金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、凝集促進剤等が含有されてもよい。
本発明の測定用試薬は、保存、運搬、流通等の観点からキットの形態と取ることもできる。キットの形態としては、ｓＩＬ−２Ｒの測定を可能とする形態であれば特に制限はなく、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられる。ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子として、一組の親和性物質の片方（Ａ）が結合した第１抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ａ）が結合した不溶性担体粒子を用いる場合には、一組の親和性物質の片方（Ａ）が結合した第１抗体と、もう一方の（ａ）が結合した不溶性担体粒子とは、同一の試薬に含まれても、別々の試薬に含まれてもよいが、別々の試薬に含まれることが好ましい。また、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子として、一組の親和性物質の片方（Ｂ）が結合した第２抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ｂ）が結合した不溶性担体粒子を用いる場合には、一組の親和性物質の片方（Ｂ）が結合した第１抗体と、もう一方の（ｂ）が結合した不溶性担体粒子とは、同一の試薬に含まれても、別々の試薬に含まれてもよいが、別々の試薬に含まれることが好ましい。
本発明の測定用キットの具体的態様を以下に例示する。
・測定用キット１
ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子とを含む第１試薬；及び、
試料前処理試薬を含む第２試薬
を含む、試料中のｓＩＬ−２Ｒ測定用キット。
・測定用キット２
ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子を含む第１試薬；及び、
ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子を含む第２試薬
を含む、試料中のｓＩＬ−２Ｒ測定用キット。
・測定用キット３
ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子を含む第１試薬；
ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子を含む第２試薬；及び、
試料前処理試薬を含む第３試薬
を含む、試料中のｓＩＬ−２Ｒ測定用キット。
・測定用キット１
ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子とを含む第１試薬；及び、
試料前処理試薬を含む第２試薬
を含む、試料中のｓＩＬ−２Ｒ測定用キット。
・測定用キット２
ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子を含む第１試薬；及び、
ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子を含む第２試薬
を含む、試料中のｓＩＬ−２Ｒ測定用キット。
・測定用キット３
ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子を含む第１試薬；
ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子を含む第２試薬；及び、
試料前処理試薬を含む第３試薬
を含む、試料中のｓＩＬ−２Ｒ測定用キット。
以下、実施例により本発明を実施例、比較例、参考例により、更に詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら制限するものではない。尚、以下の実施例、比較例、参考例においては、次のメーカーの試薬類を使用した。
カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（粒径３３０ｎｍ、藤倉化成社製）、抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体AM92.3（ピアース社製）、抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体7G7/B6（ピアース社製）、Sulfo-NHS（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、1-[3-（ジメチルアミノ）プロピル]-3-エチルカルボジイミド（ＷＳＣ）（和光純薬工業社製）、リン酸水素二ナトリウム・12水和物（関東化学社製）、リン酸二水素ナトリウム・2水和物（関東化学社製）、ＨＥＰＥＳ （同仁化学研究所社製）、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）、ＢＳＡ（Ｂｏｖｏｇｅｎ社製）、ツイーン２０（非イオン性界面活性剤；シグマ−アルドリッチ社製）、ヒドロキシエチルセルロース（同仁化学研究所社製）。
以下の組成のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を調製した。
〔第１試薬〕
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．１５ ｍｏｌ／Ｌ
ヒドロキシエチルセルロース ０．１５％
〔第２試薬〕
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７） ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
第１抗体結合ラテックス粒子１（参考例１で製造） ０．０１重量％
第２抗体結合ラテックス粒子１（参考例２で製造） ０．０１重量％
〔第１試薬〕
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．１５ ｍｏｌ／Ｌ
ヒドロキシエチルセルロース ０．１５％
〔第２試薬〕
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７） ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
第１抗体結合ラテックス粒子１（参考例１で製造） ０．０１重量％
第２抗体結合ラテックス粒子１（参考例２で製造） ０．０１重量％
［比較例１］
実施例１おける第１抗体結合ラテックス粒子１及び第２抗体結合ラテックス粒子１に代えて、同一のラテックス粒子上に第１抗体及び第２抗体が結合した、第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子１を含有する以下の組成のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を調製した。
〔第１試薬〕
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．１５ ｍｏｌ／Ｌ
ヒドロキシエチルセルロース ０．１５％
〔第２試薬〕
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７） ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子１（参考例３で製造） ０．０２重量％
実施例１おける第１抗体結合ラテックス粒子１及び第２抗体結合ラテックス粒子１に代えて、同一のラテックス粒子上に第１抗体及び第２抗体が結合した、第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子１を含有する以下の組成のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を調製した。
〔第１試薬〕
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．１５ ｍｏｌ／Ｌ
ヒドロキシエチルセルロース ０．１５％
〔第２試薬〕
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７） ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子１（参考例３で製造） ０．０２重量％
第１抗体結合ラテックス粒子１及び第２抗体結合ラテックス粒子１を含有する実施例１のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬と、第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子１を含有する比較例１のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を用いて、ｓＩＬ−２Ｒの測定感度を比較した。
（１）ｓＩＬ−２Ｒ溶液の調製
抗原用希釈液（４％ＢＳＡ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を用いて３０００００Ｕ／ｍＬ ｓＩＬ−２Ｒ溶液を希釈し、１０００Ｕ／ｍＬのｓＩＬ−２Ｒ溶液を調製した。
（２）ｓＩＬ−２Ｒの測定
分光光度計Ｕ−３０００（日立ハイテクノロジーズ社製）を使用し、反応温度３７℃にて、前記ｓＩＬ−２Ｒ溶液５μＬと第１試薬１５０μＬとをセルに加えて均一攪拌した後、５分間保持した。その後、３７℃で保持しながら、第２試薬５０μＬを当該反応液に加えて均一攪拌した後、３０秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度と３００秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度との差（ΔＡｂｓ）を測定した。ΔＡｂｓが高い程、高感度で測定できることを意味する。実施例１の試薬又は比較例１の試薬を用いて測定した結果を表１に示す。表１から、本発明の実施例１のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬は、比較例１のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬と比較して、試料中のｓＩＬ−２Ｒを高感度で測定できることがわかる。
（１）ｓＩＬ−２Ｒ溶液の調製
抗原用希釈液（４％ＢＳＡ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を用いて３０００００Ｕ／ｍＬ ｓＩＬ−２Ｒ溶液を希釈し、１０００Ｕ／ｍＬのｓＩＬ−２Ｒ溶液を調製した。
（２）ｓＩＬ−２Ｒの測定
分光光度計Ｕ−３０００（日立ハイテクノロジーズ社製）を使用し、反応温度３７℃にて、前記ｓＩＬ−２Ｒ溶液５μＬと第１試薬１５０μＬとをセルに加えて均一攪拌した後、５分間保持した。その後、３７℃で保持しながら、第２試薬５０μＬを当該反応液に加えて均一攪拌した後、３０秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度と３００秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度との差（ΔＡｂｓ）を測定した。ΔＡｂｓが高い程、高感度で測定できることを意味する。実施例１の試薬又は比較例１の試薬を用いて測定した結果を表１に示す。表１から、本発明の実施例１のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬は、比較例１のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬と比較して、試料中のｓＩＬ−２Ｒを高感度で測定できることがわかる。
以下の組成のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を調製した。
〔第１試薬〕
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．６ ｍｏｌ／Ｌ
ヒドロキシエチルセルロース ０．２２５％
〔第２試薬〕
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７） ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
第１抗体結合ラテックス粒子１（参考例１で製造） ０．０１重量％
第２抗体結合ラテックス粒子１（参考例２で製造） ０．０１重量％
〔第１試薬〕
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．６ ｍｏｌ／Ｌ
ヒドロキシエチルセルロース ０．２２５％
〔第２試薬〕
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７） ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
第１抗体結合ラテックス粒子１（参考例１で製造） ０．０１重量％
第２抗体結合ラテックス粒子１（参考例２で製造） ０．０１重量％
不溶性担体としてプレートを用いる、体外診断用医薬品であるｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬「セルフリーＮ ＩＬ−２Ｒ」（協和メデックス社製）及び実施例３のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を用いて、それぞれの試薬を用いた場合のｓＩＬ−２Ｒ濃度を比較した。
（１）測定試料
ｓＩＬ−２Ｒを含有する３種の血清（血清１、血清２、血清３：アリエス社より購入）、セルフリーＮ ＩＬ−２Ｒ付属の較正試薬レベルＩ、ＩＩを測定試料とした。
（１）測定試料
ｓＩＬ−２Ｒを含有する３種の血清（血清１、血清２、血清３：アリエス社より購入）、セルフリーＮ ＩＬ−２Ｒ付属の較正試薬レベルＩ、ＩＩを測定試料とした。
（２）セルフリーＮ ＩＬ−２Ｒを用いた試料中ｓＩＬ−２Ｒ濃度の測定
セルフリーＮ ＩＬ−２Ｒに付属の添付文書に記載の方法に従い、（１）の試料中のｓＩＬ−２Ｒ濃度を測定した。その結果を表２に示す。
セルフリーＮ ＩＬ−２Ｒに付属の添付文書に記載の方法に従い、（１）の試料中のｓＩＬ−２Ｒ濃度を測定した。その結果を表２に示す。
（３）実施例３の試薬を用いた試料中ｓＩＬ−２Ｒ濃度の測定
（３）−Ａ 検量線の作成
WO2005/121795に記載された方法によって製造したｓＩＬ−２Ｒを、抗原用希釈液（４％ＢＳＡ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）により、ｓＩＬ−２Ｒ濃度が１８６ Ｕ／ｍＬ、５９０ Ｕ／ｍＬ、１７６３ Ｕ／ｍＬ、５３０７ Ｕ／ｍＬ、１０５６４ Ｕ／ｍＬになるように希釈したｓＩＬ−２Ｒ溶液、及び抗原用希釈液（ｓＩＬ−２Ｒ濃度 ０ Ｕ／ｍＬ）を標準試料とした。
（３）−Ａ 検量線の作成
WO2005/121795に記載された方法によって製造したｓＩＬ−２Ｒを、抗原用希釈液（４％ＢＳＡ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）により、ｓＩＬ−２Ｒ濃度が１８６ Ｕ／ｍＬ、５９０ Ｕ／ｍＬ、１７６３ Ｕ／ｍＬ、５３０７ Ｕ／ｍＬ、１０５６４ Ｕ／ｍＬになるように希釈したｓＩＬ−２Ｒ溶液、及び抗原用希釈液（ｓＩＬ−２Ｒ濃度 ０ Ｕ／ｍＬ）を標準試料とした。
日立７１７０型自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ社製）を使用し、反応温度３７℃にて、前記標準試料５μＬと第１試薬１５０μＬとをセルに加えて均一攪拌した後、５分間保持した。その後、３７℃で保持しながら、第２試薬５０μＬを当該反応液に加えて均一攪拌した後、３６秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度と３２４秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度との差（ΔＡｂｓ）を測定した。各濃度のｓＩＬ−２Ｒ標準試料を測定した際のΔＡｂｓを縦軸、ｓＩＬ−２Ｒ標準試料の濃度を横軸にプロットし、ｓＩＬ−２Ｒ濃度とΔＡｂｓとの関係を示す検量線を作成した。
（３）−Ｂ （１）の試料の測定
（１）の試料について、実施例３のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を用いて、以下の方法で、各試料のΔＡｂｓを測定した。
日立７１７０型自動分析装置を使用し、反応温度３７℃にて、（１）の試料５μＬと第１試薬１５０μＬとをセルに加えて均一攪拌した後、５分間保持した。その後、３７℃で保持しながら、第２試薬５０μＬを当該反応液に加えて均一攪拌した後、３６秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度と３２４秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度との差（ΔＡｂｓ）を測定した。
（１）の試料について、実施例３のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を用いて、以下の方法で、各試料のΔＡｂｓを測定した。
日立７１７０型自動分析装置を使用し、反応温度３７℃にて、（１）の試料５μＬと第１試薬１５０μＬとをセルに加えて均一攪拌した後、５分間保持した。その後、３７℃で保持しながら、第２試薬５０μＬを当該反応液に加えて均一攪拌した後、３６秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度と３２４秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度との差（ΔＡｂｓ）を測定した。
（３）−Ｃ 試料中のｓＩＬ−２Ｒ濃度の算出
（３）−Ａで作成した検量線を用いて、（３）−Ｂにより得られた各試料のΔＡｂｓから、各試料中のｓＩＬ−２Ｒ濃度を算出した。その結果を表２に示す。
（３）−Ａで作成した検量線を用いて、（３）−Ｂにより得られた各試料のΔＡｂｓから、各試料中のｓＩＬ−２Ｒ濃度を算出した。その結果を表２に示す。
表２に示すように、実施例３の本発明のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を用いて測定した場合のｓＩＬ−２Ｒ濃度は、セルフリーＮ ＩＬ−２Ｒを用いて測定した場合のｓＩＬ−２Ｒ濃度とほぼ一致しており、実施例３のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を用いて、ｓＩＬ−２Ｒ濃度を正確に測定できることがわかる。
以下の組成のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を調製した。
〔第１試薬〕
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．３ ｍｏｌ／Ｌ
ヒドロキシエチルセルロース ０．０７５％
〔第２試薬〕
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７） ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
第１抗体結合ラテックス粒子２（参考例４で製造） ０．０１重量％
第２抗体結合ラテックス粒子２（参考例５で製造） ０．０１重量％
〔第１試薬〕
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．３ ｍｏｌ／Ｌ
ヒドロキシエチルセルロース ０．０７５％
〔第２試薬〕
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７） ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
第１抗体結合ラテックス粒子２（参考例４で製造） ０．０１重量％
第２抗体結合ラテックス粒子２（参考例５で製造） ０．０１重量％
本発明の、抗体とラテックス粒子とが物理吸着した抗体結合ラテックス粒子を含む、実施例５のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を用いて、ｓＩＬ−２Ｒを測定した。
（１）ｓＩＬ−２Ｒ溶液の調製
抗原用希釈液（４％ＢＳＡ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を用いて、１００００Ｕ／ｍＬのｓＩＬ−２Ｒ溶液を調製した。
（２）ｓＩＬ−２Ｒの測定
分光光度計Ｕ−３０００を使用し、波長５７０ｎｍおよび反応温度３７℃にて、前記ｓＩＬ−２Ｒ溶液５μＬと第１試薬１５０μＬとをセルに加えて均一攪拌した後、５分間保持した。その後、３７℃で保持しながら、第２試薬５０μＬを当該反応液に加えて均一攪拌した後、３０秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度と３００秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度との差（ΔＡｂｓ）を測定した。その結果を表３に示す。
（１）ｓＩＬ−２Ｒ溶液の調製
抗原用希釈液（４％ＢＳＡ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を用いて、１００００Ｕ／ｍＬのｓＩＬ−２Ｒ溶液を調製した。
（２）ｓＩＬ−２Ｒの測定
分光光度計Ｕ−３０００を使用し、波長５７０ｎｍおよび反応温度３７℃にて、前記ｓＩＬ−２Ｒ溶液５μＬと第１試薬１５０μＬとをセルに加えて均一攪拌した後、５分間保持した。その後、３７℃で保持しながら、第２試薬５０μＬを当該反応液に加えて均一攪拌した後、３０秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度と３００秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度との差（ΔＡｂｓ）を測定した。その結果を表３に示す。
以下の組成のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を調製した。
〔第１試薬〕
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．３ ｍｏｌ／Ｌ
ヒドロキシエチルセルロース ０．２％
〔第２試薬〕
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７） ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
第１抗体結合ラテックス粒子１（参考例１で製造） ０．０１重量％
第２抗体結合ラテックス粒子１（参考例２で製造） ０．０１重量％
〔第１試薬〕
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．３ ｍｏｌ／Ｌ
ヒドロキシエチルセルロース ０．２％
〔第２試薬〕
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７） ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
第１抗体結合ラテックス粒子１（参考例１で製造） ０．０１重量％
第２抗体結合ラテックス粒子１（参考例２で製造） ０．０１重量％
実施例７における第１抗体結合ラテックス粒子１及び第２抗体結合ラテックス粒子１に代えて、第１抗体結合ラテックス粒子２及び第２抗体結合ラテックス粒子２を含有する以下の組成のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を調製した。
〔第１試薬〕
リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０） ０．１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．３ ｍｏｌ／Ｌ
ヒドロキシエチルセルロース ０．２％
〔第２試薬〕
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（ｐＨ７．７） ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
第１抗体結合ラテックス粒子２（参考例４で製造） ０．０１重量％
第２抗体結合ラテックス粒子２（参考例５で製造） ０．０１重量％
〔第１試薬〕
リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０） ０．１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．３ ｍｏｌ／Ｌ
ヒドロキシエチルセルロース ０．２％
〔第２試薬〕
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（ｐＨ７．７） ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
第１抗体結合ラテックス粒子２（参考例４で製造） ０．０１重量％
第２抗体結合ラテックス粒子２（参考例５で製造） ０．０１重量％
［比較例２］
実施例７おける第１抗体結合ラテックス粒子１及び第２抗体結合ラテックス粒子１に代えて、同一のラテックス粒子上に第１抗体及び第２抗体が結合した、第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子２を含有する以下の組成のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を調製した。
〔第１試薬〕
リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０） ０．１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．３ ｍｏｌ／Ｌ
ヒドロキシエチルセルロース ０．２％
〔第２試薬〕
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（ｐＨ７．７） ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子２（参考例６で製造） ０．０２重量％
実施例７おける第１抗体結合ラテックス粒子１及び第２抗体結合ラテックス粒子１に代えて、同一のラテックス粒子上に第１抗体及び第２抗体が結合した、第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子２を含有する以下の組成のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を調製した。
〔第１試薬〕
リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０） ０．１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
塩化ナトリウム ０．３ ｍｏｌ／Ｌ
ヒドロキシエチルセルロース ０．２％
〔第２試薬〕
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（ｐＨ７．７） ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ ０．１％
第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子２（参考例６で製造） ０．０２重量％
第１抗体結合ラテックス粒子１及び第２抗体結合ラテックス粒子１を含有する実施例７のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬と、第１抗体結合ラテックス粒子２及び第２抗体結合ラテックス粒子２を含有する実施例８のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬と、第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子２を含有する比較例２のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を用いて、ｓＩＬ−２Ｒの測定感度を比較した。
（１）ｓＩＬ−２Ｒ溶液の調製
実施例２の抗原用希釈液を用いて３０００００Ｕ／ｍＬ ｓＩＬ−２Ｒ溶液を希釈し、１０００００Ｕ／ｍＬのｓＩＬ−２Ｒ溶液を調製した。
実施例２の抗原用希釈液を用いて３０００００Ｕ／ｍＬ ｓＩＬ−２Ｒ溶液を希釈し、１０００００Ｕ／ｍＬのｓＩＬ−２Ｒ溶液を調製した。
（２）ｓＩＬ−２Ｒの測定
分光光度計Ｕ−３０００（日立ハイテクノロジーズ社製）を使用し、波長５７０ｎｍおよび反応温度３７℃にて、前記ｓＩＬ−２Ｒ溶液５μＬと第１試薬１５０μＬとをセルに加えて均一攪拌した後、５分間保持した。その後、３７℃で保持しながら、第２試薬５０μＬを当該反応液に加えて均一攪拌した後、３０秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度と３００秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度との差（ΔＡｂｓ）を測定した。ΔＡｂｓが高い程、高感度で測定できることを意味する。実施例７、実施例８又は比較例２の各ｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を用いて測定した結果を表４に示す。表４から、本発明の実施例７および実施例８のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬は、比較例２のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬と比較して、試料中のｓＩＬ−２Ｒを高感度で測定できることがわかる。さらに、ラテックス粒子と抗体との結合が物理吸着であるラテックス粒子を含む実施例８のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を用いるよりも、ラテックス粒子と抗体との結合が化学結合であるラテックス粒子を含む実施例７のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を用いる方が、より高感度に、試料中のｓＩＬ−２Ｒを測定できることがわかる。
分光光度計Ｕ−３０００（日立ハイテクノロジーズ社製）を使用し、波長５７０ｎｍおよび反応温度３７℃にて、前記ｓＩＬ−２Ｒ溶液５μＬと第１試薬１５０μＬとをセルに加えて均一攪拌した後、５分間保持した。その後、３７℃で保持しながら、第２試薬５０μＬを当該反応液に加えて均一攪拌した後、３０秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度と３００秒経過後の反応液の５７０ｎｍでの吸光度との差（ΔＡｂｓ）を測定した。ΔＡｂｓが高い程、高感度で測定できることを意味する。実施例７、実施例８又は比較例２の各ｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を用いて測定した結果を表４に示す。表４から、本発明の実施例７および実施例８のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬は、比較例２のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬と比較して、試料中のｓＩＬ−２Ｒを高感度で測定できることがわかる。さらに、ラテックス粒子と抗体との結合が物理吸着であるラテックス粒子を含む実施例８のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を用いるよりも、ラテックス粒子と抗体との結合が化学結合であるラテックス粒子を含む実施例７のｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬を用いる方が、より高感度に、試料中のｓＩＬ−２Ｒを測定できることがわかる。
このように、１つのラテックス粒子上に２種類の抗体が結合するラテックス粒子を用いてｓＩＬ−２Ｒ測定する方法に比べて、１つのラテックス粒子上に１種類の抗体のみが結合するラテックス粒子を用いてｓＩＬ−２Ｒ測定する方法の方が、試料中のｓＩＬ−２Ｒを高感度で測定できることが判明した。また、１つのラテックス粒子上に１種類の抗体のみが結合するラテックス粒子を用いてｓＩＬ−２Ｒを測定する方法において、ラテックス粒子と抗体との結合が化学結合である場合、さらに、試料中のｓＩＬ−２Ｒを高感度で測定できることが判明した。
［参考例１］
（第１抗体結合ラテックス粒子１の調製）
０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（粒径３３０ｎｍ）懸濁液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１ｍＬに２ｍｇ／ｍＬ ＷＳＣ溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１５０ μＬと４ ｍｇ／ｍＬ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１５０ μＬを順に加え、２５℃で１５分間攪拌してカルボキシル基を活性化させた。当該反応液に、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体AM92.3（第１抗体）溶液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を１５８ μＬ添加し、２５℃で６０分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を化学結合させた。当該反応液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた後、２５℃で６０分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液（０．１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０を含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁し、第１抗体結合ラテックス粒子１の溶液とした。
（第１抗体結合ラテックス粒子１の調製）
０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（粒径３３０ｎｍ）懸濁液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１ｍＬに２ｍｇ／ｍＬ ＷＳＣ溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１５０ μＬと４ ｍｇ／ｍＬ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１５０ μＬを順に加え、２５℃で１５分間攪拌してカルボキシル基を活性化させた。当該反応液に、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体AM92.3（第１抗体）溶液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を１５８ μＬ添加し、２５℃で６０分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を化学結合させた。当該反応液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた後、２５℃で６０分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液（０．１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０を含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁し、第１抗体結合ラテックス粒子１の溶液とした。
［参考例２］
（第２抗体結合ラテックス粒子１の調製）
０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（粒径３３０ｎｍ）懸濁液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１ｍＬに２ｍｇ／ｍＬ ＷＳＣ溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１５０ μＬと４ ｍｇ／ｍＬ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１５０ μＬを順に加え、２５℃で１５分間攪拌してカルボキシル基を活性化させた。当該反応液に、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体7G7/B6（第２抗体）溶液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を１５８ μＬ添加し、２５℃で６０分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を化学結合させた。当該反応液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた後、２５℃で６０分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液（０．１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０を含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁し、第２抗体結合ラテックス粒子１の溶液とした。
（第２抗体結合ラテックス粒子１の調製）
０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（粒径３３０ｎｍ）懸濁液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１ｍＬに２ｍｇ／ｍＬ ＷＳＣ溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１５０ μＬと４ ｍｇ／ｍＬ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１５０ μＬを順に加え、２５℃で１５分間攪拌してカルボキシル基を活性化させた。当該反応液に、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体7G7/B6（第２抗体）溶液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を１５８ μＬ添加し、２５℃で６０分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を化学結合させた。当該反応液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた後、２５℃で６０分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液（０．１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０を含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁し、第２抗体結合ラテックス粒子１の溶液とした。
［参考例３］
（第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子１の調製）
０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（粒径３３０ｎｍ）懸濁液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１ｍＬに２ｍｇ／ｍＬ ＷＳＣ溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１５０ μＬと４ ｍｇ／ｍＬ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１５０ μＬを順に加え、２５℃で１５分間攪拌してカルボキシル基を活性化させた。当該反応液に、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体AM92.3溶液 ７９ μＬ（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）と、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体7G7/B6溶液 ７９ μＬ（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）とを添加し、２５℃で６０分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を化学結合させた。当該反応液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた後、２５℃で６０分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液（０．１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０を含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁し、第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子１の溶液とした。
（第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子１の調製）
０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（粒径３３０ｎｍ）懸濁液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１ｍＬに２ｍｇ／ｍＬ ＷＳＣ溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１５０ μＬと４ ｍｇ／ｍＬ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１５０ μＬを順に加え、２５℃で１５分間攪拌してカルボキシル基を活性化させた。当該反応液に、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体AM92.3溶液 ７９ μＬ（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）と、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体7G7/B6溶液 ７９ μＬ（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）とを添加し、２５℃で６０分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を化学結合させた。当該反応液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた後、２５℃で６０分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液（０．１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０を含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁し、第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子１の溶液とした。
［参考例４］
（第１抗体結合ラテックス粒子２の調製）
０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（粒径３３０ｎｍ）懸濁液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１ｍＬに、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体AM92.3（第１抗体）溶液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を１５８ μＬ添加し、２５℃で６０分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を物理吸着させた。当該反応液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた後、２５℃で６０分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液（０．１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０を含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁し、第１抗体結合ラテックス粒子２の溶液とした。
（第１抗体結合ラテックス粒子２の調製）
０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（粒径３３０ｎｍ）懸濁液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１ｍＬに、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体AM92.3（第１抗体）溶液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を１５８ μＬ添加し、２５℃で６０分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を物理吸着させた。当該反応液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた後、２５℃で６０分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液（０．１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０を含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁し、第１抗体結合ラテックス粒子２の溶液とした。
［参考例５］
（第２抗体結合ラテックス粒子２の調製）
０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（粒径３３０ｎｍ）懸濁液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１ｍＬに、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体7G7/B6（第２抗体）溶液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を１５８ μＬ添加し、２５℃で６０分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を物理吸着させた。当該反応液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた後、２５℃で６０分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液（０．１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０を含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁し、第２抗体結合ラテックス粒子２の溶液とした。
（第２抗体結合ラテックス粒子２の調製）
０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（粒径３３０ｎｍ）懸濁液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１ｍＬに、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体7G7/B6（第２抗体）溶液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を１５８ μＬ添加し、２５℃で６０分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を物理吸着させた。当該反応液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた後、２５℃で６０分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液（０．１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０を含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁し、第２抗体結合ラテックス粒子２の溶液とした。
［参考例６］
（第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子２の調製）
０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（粒径３３０ｎｍ）懸濁液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１ｍＬに、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体AM92.3（第１抗体）溶液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）と、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体7G7/B6溶液 ７９ μＬ（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）７９ μＬとを添加し、２５℃で６０分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を物理吸着させた。当該反応液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた後、２５℃で６０分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液（０．１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０を含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁し、第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子２の溶液とした。
（第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子２の調製）
０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス（粒径３３０ｎｍ）懸濁液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）１ｍＬに、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体AM92.3（第１抗体）溶液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）と、１．９ ｍｇ／ｍＬ抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体7G7/B6溶液 ７９ μＬ（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）７９ μＬとを添加し、２５℃で６０分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を物理吸着させた。当該反応液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた後、２５℃で６０分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液（０．１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０を含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液（０．１％ＢＳＡを含有する１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．７）を１ ｍＬ添加し、超音波処理（５０ Ｗ、３０秒間）によって懸濁し、第１抗体及び第２抗体結合ラテックス粒子２の溶液とした。
本発明により、成人Ｔ細胞白血病や非ホジキンリンパ腫における病態モニタリング等に有効な、試料中のｓＩＬ−２Ｒの簡便で、かつ、高感度な測定方法、及び、測定用試薬が提供される。
Claims (8)
- 試料と、可溶性インターロイキン−２受容体（以下、ｓＩＬ−２Ｒと記す）に結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子とを反応させ、抗原抗体反応によって生じた凝集を測定することを特徴とする、試料中のｓＩＬ−２Ｒの測定方法。
- 第１抗体と不溶性担体粒子との結合、及び、第２抗体と不溶性担体粒子との結合が共に化学結合である、請求項１に記載の方法。
- 第１抗体及び第２抗体が共にモノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
- ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子、及び、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子が、共にラテックス粒子である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 可溶性インターロイキン−２受容体（以下、ｓＩＬ−２Ｒと記す）に結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子と、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子とを含むことを特徴とする、試料中のｓＩＬ−２Ｒの測定用試薬。
- 第１抗体と不溶性担体粒子との結合、及び、第２抗体と不溶性担体粒子との結合が共に化学結合である、請求項５に記載の試薬。
- 第１抗体及び第２抗体が共にモノクローナル抗体である、請求項５又は６に記載の試薬。
- ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合していない不溶性担体粒子、及び、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第２抗体が結合しており、かつ、ｓＩＬ−２Ｒに結合する第１抗体が結合していない不溶性担体粒子が、共にラテックス粒子である、請求項５〜７のいずれかに記載の試薬。
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