JP2017048231A - 長期持続性の医薬製剤 - Google Patents

Abstract

【課題】安全で効果的な長期持続性の医薬製剤を提供する。【解決手段】本発明は、長期持続性の治療用製剤とそれらの使用の方法へ向けられ、ここで該製剤は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含むベクターを含む遺伝子修飾された微小器官を含み、ここで核酸配列は、エリスロポエチン又はインターフェロンαのような治療用ポリペプチドをコードする。【選択図】図１

Description

[001] 本発明は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した、エリスロポエチン又はインターフェロンαのような治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなるベクターを含んでなる遺伝子修飾された微小器官を含んでなる長期持続性の治療用製剤とそれらの使用の方法へ向けられる。

[002] 治療薬剤は、経口により、経皮的に、吸入により、注射により、又は遅い放出性のデポーにより送達することができる。しかしながら、送達の方法は、薬剤がレシピエント中へ処される手順により、頻繁な投与の必要性により、そして活用し得る分子の大きさの限界により制限される。この方法のいくつかでは、治療薬剤の量が投与間で変動するものである。

[003] 特定の宿主細胞を修飾するために後に使用される、所望の核酸配列／断片のベクター中へのサブクローニングを伴うタンパク産生技術（所望のタンパク質をさらなる精製工程のために産生することを意味する）は、発現されるタンパク質、タンパク分泌、翻訳後修飾（タンパク質のグリコシル化と正確なフォールディングのような）、等の量に限界がある。さらに、高レベルのタンパク産生が達成され得るとしても、このとき多量の組換えタンパク質を産生して、混在物を含まないように精製しなければならない。精製スキームの開発は、きわめて時間のかかるプロセスである。そして、精製された組換えタンパク質が得られたならば、それを安定にして、動物又はヒトへの導入に受容し得るようにさらに製剤化しなければならない。さらに、製剤化されたとしても、精製された組換えタンパク質は、維持管理及び保存の限界により有限の貯蔵寿命を有するので、より多くのタンパク質の再度の精製及び製剤化がしばしば求められる。適正な製剤を開発するプロセスも、時間を費やし、困難で、高くつくものである。

[004] 従って、高レベルの組換えタンパク質を入手することに典型的に関連した面倒で高くつく方法を必要とせずに廉価で迅速に産生される、その生物学的活性を保存するのに必要な翻訳後修飾を有する、長期持続性のタンパクベースの治療用分子への広く認知されたニーズがある。

[005] ある研究者たちは、遺伝子治療を介して組換え遺伝子産物の n vivo 発現を得ることを試みてきた。典型的には、ウイルスベクターを使用して、組換え遺伝子産物を発現するように細胞に in vivo で形質導入する。これらのウイルスベースのベクターには、標的組織に感染する本来の能力のような、有利な特徴がある。しかしながら、レトロウイルスベースのベクターは、組換え産物の発現を可能にするには、標的組織のゲノム内への組込みを必要として（近在の癌遺伝子を活性化する可能性がある）、活発に分裂中の組織に形質導入するためにしか使用できない。ウイルスベクターはまた、長期のトランス遺伝子発現を持続し得ないことが多く、これは、少なくとも一部は、二次的な宿主免疫応答によるその消失による場合がある。

[006] 従って、当該技術分野には、一貫して高い発現レベルが数週間以上続く組換え遺伝子産物製剤へのニーズと、疾患を治療するためにその製剤を使用する方法へのニーズが依然としてある。

[007] 本発明は、１つの態様において、遺伝子修飾された微小器官を含んでなる長期持続性の治療用製剤を提供し、前記微小器官は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含んでなるベクターを含んでなり、ここで前記核酸配列は治療用ポリペプチドをコードして、それにより前記製剤は、前記治療用ポリペプチドの発現レベルを基底レベルに対して５％より多く増加させて、前記増加は、１ヶ月より多い間維持される。１つの態様において、ベクターは、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターである。１つの態様において、治療用ポリペプチドはエリスロポエチンであり、一方、別の態様において、治療用ポリペプチドは、インターフェロンαであり、それは、１つの態様において、インターフェロンα２ｂである。

[008] 別の態様において、本発明は、１以上の遺伝子修飾された微小器官を提供すること（前記微小器官は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含んでなるベクターを含んでなる）；及び、前記遺伝子修飾された微小器官を前記被検者に移植することを含んでなる、治療用ポリペプチドを必要とする被検者へ持続期間にわたり提供する方法を提供し、ここで前記核酸配列は、治療用ポリペプチドをコードして、それにより前記製剤は、前記治療用ポリペプチドの発現レベルを基底レベルに対して５％より多く増加させて、前記増加は、１ヶ月より多い間維持される。１つの態様において、ベクターは、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターである。１つの態様において、治療用ポリペプチドはエリスロポエチンであり、一方、別の態様において、治療用ポリペプチドは、インターフェロンαであり、それは、１つの態様において、インターフェロンα２ｂである。別の態様において、必要とする被検者は、貧血に罹患している。別の態様において、必要とする被検者は、感染症に罹患している。別の態様において、必要とする被検者は、癌に罹患している。

[009] 別の態様において、本発明は、配列番号１に対して８５％より高い相同性がある核酸配列、そのような核酸配列を含んでなるベクター、及びそのようなベクターを含んでなる細胞を提供する。

[0010] 別の態様において、本発明は、配列番号２に対して８５％より高い相同性がある核酸配列、そのような核酸配列を含んでなるベクター、及びそのようなベクターを含んでなる細胞を提供する。

[0011]図１は、本発明の製剤により in vitro で産生した最適化組換えヒトインターフェロンα（ＩＦＮα）のレベルを提示する。 [0012]図２は、本発明の製剤により in vitro で産生した組換えヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）のレベルを提示する。ＨＤ−Ａｄ−ＣＡＧ−ｗｔ−ｈＥＰＯ ＧＭＭＯ滴定（Ａ）。微小器官をＨＤ−Ａｄ−ＣＡＧ−ｗｔ−ｈＥＰＯウイルスの増加希釈、即ち１：２５、１：１００、及び１：１０００の希釈で形質導入した。Ａｄ５／ＣＭＶ／ｗｔ−ｈＥＰＯは、１：１０及び１：５０の作用濃度へ希釈した。２種の異なる皮膚、Ｈ−１及びＨ−２より産生したＧＭＭＯの間での比較（Ｂ）。微小器官をＨＤ−Ａｄ−ＣＡＧ−ｗｔ−ｈＥＰＯ（１：２５）で形質導入した。棒印は、３〜４日ごとに回収して交換する培養基においてＥＬＩＳＡにより測定したｈＥＰＯ濃度を示す。 [0013]図３は、ＥＰＯ発現性の無実質（gutless）アデノウイルスを含んでなる最適化製剤とＥＰＯ発現性アデノウイルス−５を含んでなる微小器官からの in vitro でのピークエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現レベルのパーセントを提示する。微小器官は、ＨＤ−Ａｄ−ＣＡＧ−ｈＥＰＯ（１：２５）又はＡｄ５／ＣＭＶ／ｈＥＰＯ（１：１０）で形質導入した。 [0014]図４は、最適化及び非最適化ＥＰＯ発現性の無実質アデノウイルスを含んでなる製剤からの in vitro でのエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現レベルを提示する。微小器官は、１：１００のウイルス粒子の作用濃度で形質導入した。棒印は、３〜４日ごとに回収して交換する培養基においてＥＬＩＳＡにより測定したｈＥＰＯ濃度を示す。 [0015]図５は、ＥＰＯ発現性の無実質アデノウイルスをＣＡＧ又はＣＭＶプロモーターの下流に含んでなる製剤からの in vitro でのエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現レベルを提示する。 [0016]図６は、ＳＣＩＤマウスにおいて in vivo で産生される組換えヒトエリスロポエチンのレベル（Ａ）と本発明の製剤により in vitro で産生される組換えヒトエリスロポエチンのレベル（Ｂ）、並びに関連するヘマトクリットの変化（Ａ）を提示する。１０匹のマウス／群にＧＭＭＯを皮下移植した。アデノウイルス−ｈＥＰＯ、ヘルパー依存型アデノウイルス−ｈＥＰＯ、及びヘルパー依存型アデノウイルス−最適化ｈＥＰＯで形質導入したＧＭＭＯ、並びに非形質導入ＧＭＭＯを移植したマウスの血清において測定した、ｈＥＰＯレベル（ｍＵ／ｍｌ）と対応するヘマトクリット（％）を提示する。出血は、１０日ごとに行った（Ａ）。ヘマトクリットは遠心分離法により測定して、血液中の血清ｈＥＰＯレベルはｈＥＰＯ ＥＬＩＳＡキットにより測定した。非移植のＧＭＭＯを培養に維持して、ＥＰＯのレベルを測定した（Ｂ）。

[0017] いくつかの態様において、本発明は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した、エリスロポエチン又はインターフェロンαのような治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなるベクターを含んでなる、遺伝子修飾された組織ベースの微小器官を含んでなる長期持続性の治療用製剤と、それらの使用の方法へ向けられる。

[0018] 本発明は、１つの態様において、遺伝子修飾された微小器官を含んでなる長期持続性の治療用製剤を提供し、前記微小器官は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含んでなるベクターを含んでなり、ここで前記核酸配列は治療用ポリペプチドをコードして、それにより治療用ポリペプチドの発現レベルは、基底レベルに対して５％より多く増加して、前記増加は、１ヶ月より多い間維持される。別の態様において、治療用ポリペプチドの発現レベルは、基底レベルに対して５％より多く増加して、前記増加は、６ヶ月より多い間維持される。

[0019] 別の態様において、本発明は、遺伝子修飾された微小器官を含んでなる長期持続性の治療用製剤を提供し、前記微小器官は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含んでなるベクターを含んでなり、ここで前記核酸配列は治療用ポリペプチドをコードして、それにより治療用ポリペプチドの発現レベルは、基底レベルに対して５％より多く増加して、前記増加は、１ヶ月より多い間維持されて、ここで前記ベクターは、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターである。

[0020] 別の態様において、本発明は、遺伝子修飾された微小器官を含んでなる長期持続性の治療用製剤を提供し、前記微小器官は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含んでなるベクターを含んでなり、ここで前記核酸配列は治療用ポリペプチドをコードして、それにより治療用ポリペプチドの発現レベルは、基底レベルに対して５％より多く増加して、前記増加は、免疫能を有する（immuno-competent）宿主において１ヶ月より多い間維持される。

[0021] 別の態様において、本発明は、遺伝子修飾された微小器官を含んでなる長期持続性の治療用製剤を提供し、前記微小器官は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含んでなるベクターを含んでなり、それにより治療用核酸の発現レベルは、基底レベルに対して５％より多く増加する。１つの態様において、治療用核酸の発現レベルは、免疫能を有する宿主において基底レベルに対して５％より多く増加し、一方、別の態様において、前記ベクターは、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターである。

[0022] １つの態様において、本発明は、長期持続性の治療用製剤とその使用の方法を提供し、ここで該製剤は、遺伝子修飾された微小器官を含む。１つの態様において、本明細書に使用する用語「微小器官」は、１つの態様において、細胞の生存能力及び機能に貢献するやり方で調製された外植片に由来する又はそれと同一である単離された組織又は器官の構造を意味する。１つの態様において、微小器官は、それが入手される組織又は器官に類似した、少なくともいくらかの in vivo 構造、又は別の態様では、相互作用を維持する。別の態様において、微小器官は、それが由来した組織又は器官の微小構造及び三次元構造を保持して、微小器官内の細胞への十分な栄養分及びガスの受動拡散と細胞老廃物の微小器官の細胞の外への拡散を可能にして、不十分な栄養及び／又は老廃物の蓄積による細胞毒性と併発する細胞死を最少化するように選択される大きさを有する。１つの態様において、微小器官は、皮膚組織の小片である。

[0023] １つの態様において、微小器官は、直径１〜２ｍｍで、長さ３０〜４０ｍｍである。別の態様において、微小器官の直径は、例えば、１〜３ｍｍ、１〜４ｍｍ、２〜４ｍｍ、０．５〜３．５ｍｍ、又は１．５〜１０ｍｍであってよい。別の態様において、微小器官の直径は、例えば、ほぼ２ｍｍ又はほぼ１．５ｍｍであってよい。別の態様において、微小器官の長さは、５〜１００ｍｍ、１０〜６０ｍｍ、２０〜６０ｍｍ、２０〜５０ｍｍ、２０〜４０ｍｍ、２０〜１００ｍｍ、３０〜１００ｍｍ、４０〜１００ｍｍ、５０〜１００ｍｍ、６０〜１００ｍｍ、７０〜１００ｍｍ、８０〜１００ｍｍ、又は９０〜１００ｍｍであってよい。別の態様において、微小器官の長さは、ほぼ２０ｍｍ、ほぼ３０ｍｍ、ほぼ４０ｍｍ、又はほぼ５０ｍｍであってよい。１つの態様において、微小器官は、１．５ｃｍ^２より小さく、別の態様において、１ｃｍ^２未満である。別の態様において、その直径は、１．５ｃｍ未満であり、別の態様において、その長さは、１．５ｃｍ未満である。

[0024] １つの態様において、微小器官は、外植片である。１つの態様において、微小器官は、組織由来である。別の態様において、微小器官は、組織の切片又は一部又は部分である。別の態様において、微小器官は、器官の切片又は一部又は部分である。微小器官は、１つの態様では、それが in vivo 及び in vitro で長い期間の間生存するように特別に設計されているという点で、そして別の態様では、その大きさが微小器官内の細胞への十分な栄養分及びガスの受動拡散と細胞老廃物の微小器官の細胞の外への拡散を可能にするように特別に選択される（そのことは、１つの態様において、不十分な栄養及び／又は老廃物の蓄積による細胞毒性と併発する細胞死を最少化する）という点で皮膚移植片から識別することができる。従って、１つの態様において、微小器官は、皮膚移植片ではない。別の態様において、微小器官は、それが由来した組織又は器官の微小構造及び三次元構造を微小器官が維持するという点で、１つの態様において天然又は人工のスカフォルドで増殖する単離細胞の集合体から識別することができる。このように、１つの態様において、微小器官は、スカフォルドで増殖する１以上の細胞種ではない。

[0025] 微小器官についての詳しい記載は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ−２００３−０１５２５６２に見出すことができる。
[0026] 初期の特許（ＷＯ０３／００６６６９、ＷＯ０３／０３５８５、ＷＯ０４／０９９３６３１、これらは参照により本明細書に組み込まれる）は、目的の遺伝子産物を発現するように修飾し得て、自律的に機能的な状態で延長された期間の間体外で維持し得てから、疾患又は障害を治療する目的のために皮下又は体内の他の部位に移植することができる微小器官について記載した。しかしながら、本発明の微小器官は、意外にも、目的の遺伝子産物の in vitro 及び in vivo でのずっと長い期間の発現プロフィールを示した。

[0027] 本明細書に使用するように、用語「外植片」は、１つの態様において、生物中のその天然の増殖部位から取り出されて、ある期間の間培養基に置かれる組織又は器官又はその一部を意味する。１つの態様において、この組織又は器官は生存可能であり、別の態様において、代謝的に活性であるか、又はその組合せである。

[0028] 本明細書に使用するように、用語「微小構造」は、１つの態様において、組織外植片の細胞の一部又は全部が、それらが in vivo で物理的及び／又は機能的に接触していた少なくとも１つの細胞又は非細胞物質との物理的及び／又は機能的な接触を in vitro で維持する、外植片の特徴に関連する。

[0029] 別の態様において、微小器官の外植片は、それらが由来した組織又は器官の三次元構造を維持する。１つの態様において、微小器官の外植片は、空間的な相互作用、例えば、細胞−細胞、細胞−マトリックス、及び細胞−基質の相互作用と、それらが由来した組織の配向を保持する。１つの態様において、上記に記載のような空間的な相互作用の保存は、自己分泌因子と傍分泌因子の分泌と他の細胞外刺激のような外植片の生物学的機能の維持を可能にして、これは、１つの態様において、外植片へ長期の生存能力を提供する。１つの態様において、微小器官外植片の細胞の少なくともいくらかは、それらが in vivo で物理的及び／又は機能的に接触していた少なくとも１つの細胞又は非細胞物質とのその物理的及び／又は機能的な接触を in vitro で維持する。１つの態様において、その細胞のいくらかは、集団の細胞の少なくとも約５０％、別の態様において少なくとも約６０％、別の態様において少なくとも約７０％、別の態様において少なくとも約８０％、及び別の態様において少なくとも約９０％以上を意味する。別の態様において、外植片の細胞は、それらが単離される器官又は組織の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。

[0030] いくつかの態様において、本発明の製剤のいずれも、遺伝子修飾された微小器官を本明細書に記載のどの形態又は態様でも含む。いくつかの態様において、本発明の製剤のいずれも、本明細書に記載のあらゆる形態又は態様での遺伝子修飾された微小器官からなる。いくつかの態様において、本発明の組成物のいずれも、本明細書に記載のあらゆる形態又は態様での遺伝子修飾された微小器官から本質的になる。いくつかの態様において、用語「含む」は、遺伝子修飾された微小器官のような指定の活性剤の包含、並びに、他の活性剤と、製薬業界で知られているような、医薬的に許容される担体、賦形剤、エモリエント、安定化剤、等の包含を意味する。いくつかの態様において、用語「から本質的になる」は、その唯一の有効成分が指定の有効成分であるが、製剤を安定化する、保存する、等のためであるが、指定の有効成分の治療効果に直接は関与しない他の化合物も含めてよい組成物に関連する。いくつかの態様において、用語「から本質的になる」は、有効成分の放出を促進する成分に関連する場合がある。いくつかの態様において、用語「からなる」は、有効成分と医薬的に許容される担体又は賦形剤を含有する製剤に関連する。

[0031] 同様に、いくつかの態様において、本発明のベクターとその方法に使用のベクターは、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含み、ここで前記核酸配列は、治療用ポリペプチドをコードする。別の態様において、ベクターは、そのような核酸配列から本質的になり、そして別の態様において、ベクターは、そのような核酸配列からなる。

[0032] 微小器官を単離することができる哺乳動物の例には、ヒトと他の霊長動物、完全又は一部同系交配のブタのようなブタ（例、ミニブタ、及びトランスジェニックブタ）、齧歯動物、等が含まれる。微小器官は、多様な器官由来の組織より処理してよく、それは、１つの態様において、皮膚、真皮、リンパ系、膵臓、肝臓、胆嚢、腎臓、消化管、気道、生殖系、尿管、血液、膀胱、角膜、前立腺、骨髄、胸腺、脾臓、又はこれらの組合せである。これらの器官からの外植片は、外植片を入手した器官の微小構造に似た微小構造において配置された、ランゲルハンス細胞の島、毛包、腺、上皮及び結合組織の細胞、又はこれらの組合せを含んでよい。１つの態様において、外植片を入手した器官の微小構造は、当該技術分野で知られた材料、装置、及び／又は方法を使用して、微小器官の外植片において識別又は確認してよい。

[0033] １つの態様において、本発明は、遺伝子修飾された微小器官を含んでなる製剤とその使用の方法を提供する。１つの態様において、用語「遺伝子修飾された微小器官」又は「ＧＭＭＯ」は、少なくとも１つの組換え遺伝子産物を発現する微小器官を意味する。他の態様において、微小器官への言及は、遺伝子修飾されていない微小器官を必ず意味するわけではなく、ある事例では、当業者には文脈より明らかであるように、遺伝子修飾された微小器官を意味する場合もある。１つの態様において、句「遺伝子産物」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、及び機能性ＲＮＡ分子を意味する。１つの態様において、核酸分子によりコードされる遺伝子産物は、被検者へ供給されることが望まれる遺伝子産物である。そのような遺伝子産物の例には、通常はレシピエント被検者の細胞により産生されるタンパク質、ペプチド、糖タンパク質、及びリポタンパク質が含まれる。１つの態様において、遺伝子産物は、微小器官を採取した生物、及び／又はＧＭＭＯを移植する生物において天然には存在せず、一方、別の態様において、遺伝子産物は、天然に存在する。１つの態様において、ＧＭＭＯの遺伝子産物は、微小器官の１以上の細胞により内因的に産生される遺伝子産物に類似しているか又はそれと同一である。１つの態様において、遺伝子修飾は、遺伝子修飾されていない微小器官において産生される遺伝子産物のレベルを増加させる。別の態様において、ＧＭＭＯにより発現される遺伝子産物は、微小器官の１以上の細胞により内因的に発現される遺伝子産物に類似せず、それと同一でもない。別の態様において、核酸分子によりコードされる遺伝子産物は、目的の遺伝子の発現を直接的又は間接的に制御する分子をコードする。別の態様において、核酸分子によりコードされる遺伝子産物は、被検者へ供給されることが望まれる遺伝子産物の発現レベルをアプレギュレートするか又はダウンレギュレートする。

[0034] 別の態様において、微小器官の遺伝子修飾は、内因性遺伝子の発現プロフィールを修飾する場合がある。このことは、例えば、内因性遺伝子の発現を制御するためのエンハンサー、又は抑圧性又は誘導性の調節エレメントを導入することによって達成し得る。

[0035] 微小器官外植片を遺伝子改変するには、当該技術分野で知られているどの方法論も使用することができる。治療剤をコードする外因性核酸断片を標的細胞及び／又は組織へ導入するには、当該技術分野で知られているように、ウイルスベクター、プラスミドベクター、線状ＤＮＡ、等のような多数の異なるベクターのいずれも使用することができる。これらのベクターは、例えば、感染、形質導入、トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、微粒子銃（biolistic）遺伝子送達、融合性及びアニオン性リポソーム（カチオン性リポソームの使用に代わる手段）を使用するリポソーム遺伝子送達、直接注入、受容体媒介取込み、磁気ポレーション（magnetoporation）、超音波、又はこれらのあらゆる組合せ、並びに当該技術分野で知られている他の技術を使用して挿入することができる（さらなる詳細については、例えば、「Methods in Enzymology（酵素学の方法）」１〜３１７巻、アカデミックプレス、「Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学のプロトコール）」、Ausubel F. M. et al.（監修）Greene Publishing Associates（1989）、及び「Molecular Cloning: A Laboratory Manual（分子クローニング：実験マニュアル）」第２版、Sambrook et al. コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（1989）、又は他の標準実験マニュアルを参照のこと)。目的の配列をコードするポリヌクレオチド断片は、哺乳動物細胞に形質導入することと形質導入された細胞内での組換え産物の発現を指令することに適した発現ベクター系の中へ連結することができる。この外因性核酸断片の導入は、そのベクターを微小器官の近傍へ導入することによって達成する。上記に記載の技術又は当該技術分野で知られている技術のいずれかを使用して、外因性核酸断片を細胞へ取り込んだならば、核酸断片によりコードされる治療剤の産生及び／又は分泌速度を定量することができる。１つの態様において、用語「外因性」は、外側で発生した物質、例えば、細胞又は組織の外側で発生した核酸に関連する。

[0036] １つの態様において、本発明の製剤及び方法の微小器官はベクターを含み、これは、１つの態様において、組換え遺伝子発現を促進する。１つの態様において、ベクターは、非ウイルスベクター（例、ＤＮＡプラスミド又はミニサークルＤＮＡ）、「無実質（gutless）」、即ち内因性遺伝子のないウイルスベクター（これは、１つの態様において、欠失により、別の態様において、遺伝子発現を妨げる遺伝子の挿入、置換、又は欠失による）、ヘルパー依存型アデノウイルス（ＨＤＡｄ）ベクター、又はアデノ関連ウイルスＡＡＶ（これは、１つの態様において一本鎖であり、別の態様において、二本鎖である）のような非免疫原性の遺伝子導入剤である。別の態様において、前記製剤は、組換え遺伝子発現が微小器官による遺伝子産物の毒性又は免疫媒介拒絶の欠落をもたらすように選択される。１つの態様において、ベクターは、ウイルス由来であり、別の態様において、ベクターは、プラスミドである。１つの態様において、ウイルス由来ベクターは、アデノウイルスに由来し、これは、１つの態様において、ヘルパー依存型アデノウイルスであり、一方、別の態様において、ウイルス由来ベクターは、下記に記載のような、アデノウイルス関連ベクターに由来する。

[0037] １つの態様において、用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、核酸配列が複製され得る細胞への導入のためにその中へ挿入され得る担体分子を意味する。１つの態様において、核酸分子はＲＮＡへ転写されて、これは、いくつかの事例において、次にタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドへ翻訳ざれる。他の事例において、ＲＮＡ配列は、例えば、アンチセンス分子又はリボザイムの産生では、翻訳されない。１つの態様において、発現ベクターは、機能可能的に連結したコーディング配列の特別な宿主細胞における転写と可能ならば翻訳に必要な核酸配列を意味する、多様な「制御配列」を含有することができる。別の態様において、ベクターには、複製起点がさらに含まれる。１つの態様において、ベクターは、シャトルベクターであってよく、それは、１つの態様において、原核細胞と真核細胞のいずれでも増殖し得るか、又は別の態様において、ベクターは、選択される生物のゲノム内へのその組込みを促進するように構築されてよい。ベクターは、他の態様において、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルス、又は人工染色体であってよい。１つの態様において、ベクターは、ウイルスベクターであり、それは、１つの態様において、バクテリオファージ、哺乳動物ウイルス、又は植物ウイルスであってよい。

[0038] １つの態様において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。別の態様において、アデノウイルスは、どの既知の血清型又は亜群であってもよい。
[0039] １つの態様において、アデノウイルスベクターを遺伝子導入ベクターとして使用することのいくつかの利点は、その中サイズのゲノム、操作の容易さ、高力価、広い標的細胞範囲、及び高い感染性である。アデノウイルスゲノムの両端は、ウイルスＤＮＡの複製及びパッケージングに必要なシスエレメントである、１００〜２００塩基対の逆向き反復（ＩＴＲ）を含有する。ゲノムの初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始により類別される異なる転写単位を含有する。Ｅ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムと数個の細胞遺伝子の転写の調節に責任があるタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、及び宿主細胞シャットオフに関与する。ウイルスカプシドタンパク質の大多数が含まれる、後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）により発せられる単一の一次転写産物の重要なプロセシングの後でのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．に位置する）は、感染の後期の間は特に有能であり、このプロモーターより発せられるすべてのｍＲＮＡは、それらを転写に好ましいｍＲＮＡとする５'−トリパルタイトリーダー（ＴＰＬ）配列を保有する。

[0040] 別の態様において、アデノウイルスベクターは、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターであり、これは、別の態様において、無実質（gutless）、破壊された（gutted）、ミニ、完全欠失、高収容、D、又はシュードアデノウイルスと同義であり、これは、別の態様において、ＤＮＡ複製を支援する配列以外のすべてのウイルスコーディング配列を欠失して、それは、１つの態様において、アデノウイルス逆向き末端反復及びパッケージング配列（y）を含む。別の態様において、ヘルパー依存型アデノウイルスは、ウイルスタンパク質を発現しない。１つの態様において、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターは、ベクターＤＮＡを複製してパッケージするのに必要とされるアデノウイルスのシス作用エレメントだけを含む。１つの態様において、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターは、ほぼ５００塩基対の野生型アデノウイルス配列を含む。別の態様において、アデノウイルスベクターは、追加的に、１つの態様においてアデノウイルスカプシドへの効率的なパッケージングに必要とされる、２７．７ｋｂのゲノムサイズの最小要件を満たすスタッファーＤＮＡを含む。１つの態様では、最小反復配列のあるノンコーディング哺乳動物ＤＮＡをスタッファーＤＮＡとして使用する。別の態様において、スタッファーＤＮＡは、１つの態様においてＨＰＲＴ及び／又はＣ３４６コスミド配列である、非哺乳動物のＤＮＡを含む。

[0041] １つの態様において、ヘルパー依存型アデノウイルスは、高効率の in vivo 形質導入、高レベルのトランス遺伝子発現を表示して、長期のトランス遺伝子発現を、１つの態様では、ウイルスタンパク質の残留発現による慢性毒性、又はその組合せを回避することによって維持することが可能である。別の態様において、ヘルパー依存型アデノウイルスは、高力価の産生、広範囲の細胞種の効率的な感染、分裂中及び非分裂中の細胞に感染する能力、又はこれらの組合せを有する。別の態様において、本発明の方法に使用のヘルパー依存型アデノウイルスは、アデノ特異的ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の免疫能を有する宿主における産生（これは、１つの態様において、トランス遺伝子発現の期間を限定して、そして別の態様において、アデノウイルスベクターの数週内でのクリアランスをもたらす）を特徴とする、移植された微小器官への強い適応免疫応答を誘発しない。別の態様において、本発明の方法に使用のヘルパー依存型アデノウイルスは、高い細胞傷害性Ｔ細胞レベル（当該技術分野で知られているように、１つの態様では、陽性ＣＤ８染色によって測定し得る）を誘導せず、そして別の態様において、高いヘルパーＴ細胞レベル（当該技術分野で知られているように、１つの態様では、陽性ＣＤ４染色によって測定し得る）を誘導しない。

[0042] 別の態様において、ヘルパー依存型アデノウイルスは、このベクターのゲノムが宿主細胞染色体へ組み込まれないので、発癌性の形質転換を引き起こし得る生殖系列伝播及び挿入突然変異誘発のリスクがより低い。１つの態様において、ヘルパー依存型アデノウイルスのクローニング収容量はきわめて大きく（１つの態様において、ほぼ３７ｋｂ、別の態様において、ほぼ３６ｋｂ）、遺伝子座全体、多数のトランス遺伝子、及びトランス遺伝子発現を増強、延長、及び調節するための大きなシス作用エレメントの送達を可能にする。

[0043] １つの態様において、本発明の組成物とともに、そしてその方法に使用のヘルパー依存型アデノウイルス系は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Palmer and Ng, 2003（Mol Ther 8：846）と Palmer and Ng, 2004（Mol Ther 10：792）に記載されるものに類似している。１つの態様では、複製コンピテントアデノウイルスを産生するヘルパーアデノウイルスとヘルパー依存型アデノウイルスの間の組換えを最小にする、ヘルパー依存型アデノウイルス系のヘルパーウイルス成分のＥ３領域中へ挿入されるスタッファー配列がある。

[0044] １つの態様において、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターを含んでなる本発明の製剤は、ＥＰＯ及びＩＦＮαの長期の高い in vitro（図１、２、及び６Ｂ）及び in vivo（図６Ａ）発現レベルを明示する。別の態様において、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターを含んでなる本発明の製剤は、アデノウイルス−５を含んでなる微小器官に比較して、増加したパーセントのピークＥＰＯ発現レベルを形質導入後少なくとも１００日間明示する（図３）。理論により束縛されなければ、本発明の微小器官からの遺伝子産物の長期持続性の高レベルに貢献し得る１つの要因は、本発明の製剤内での、組織に対して無毒で非免疫原性であるヘルパー依存型アデノウイルスベクターの使用である。

[0045] 別の態様において、アデノウイルスベクターは、Ｅ１欠失であり、一方、別の態様において、アデノウイルスベクターは、追加的に、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、又はこれらの組合せの欠失を含む。

[0046] 別の態様において、ウイルスベクターは、アデノ関連ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。１つの態様において、ＡＡＶは、アデノウイルス株の混入物として発見されたパルボウイルスである。これは、どの疾患にも関連付けられていない普遍的なウイルス（米国人口の８５％に抗体が存在する）である。それは、その複製がアデノウイルスのようなヘルパーウイルスの存在に依存するので、ディペンドウイルスとしても分類される。少なくとも９種の血清型が単離されていて、その中ではＡＡＶ−２が最もよく特性決定されている。ＡＡＶは、カプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３へ被カプシド化される一本鎖の線状ＤＮＡを有して、直径２０〜２４ｎｍの二十面体ビリオンを形成する。

[0047] １つの態様において、ＡＡＶのＤＮＡは、ほぼ４．７キロベースの長さである。１つの態様において、それは、２つのオープンリーディングフレームを含有して、２つのＩＴＲが外側に位置する。ＡＡＶゲノムには、ｒｅｐとｃａｐという２つの主要遺伝子がある。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルス複製に責任のあるタンパク質をコードし、一方、ｃａｐは、カプシドタンパク質、ＶＰ１−３をコードする。それぞれのＩＴＲはＴ形のヘアピン構造を形成する。これらの末端リピートは、ＡＡＶの染色体組込みに唯一必須なシス成分である。故に、１つの態様において、ＡＡＶは、すべてのウイルスのコーディング配列が除去されて、送達用の遺伝子のカセットに置換されたベクターとして使用することができる。

[0048] １つの態様において、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を発現ベクターとして使用するとき、このベクターは、１つの態様において、４．５ｋｂのＤＮＡ挿入を組み立てるベクター中の余地を残すＡＡＶゲノムの６％にすぎない１４５塩基対のＩＴＲを含む。

[0049] １つの態様において、ＡＡＶは、それが病原性であるとみなされず、どの疾患にも関連しないという点で、安全である。ウイルスのコーディング配列の除去は、ウイルス遺伝子発現に対する免疫反応を最小化するので、ｒＡＡＶは、あるとしてもわずかな炎症応答しか誘発しない。別の態様において、ＡＡＶベクターは二本鎖であり、一方、別の態様において、ＡＡＶベクターは自己相補的であり、それは、１つの態様において、ウイルスの第二鎖ＤＮＡ合成（これは、１つの態様において、初期のトランス遺伝子発現をもたらす）の必要性を回避する。

[0050] 別の態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。レトロウイルスは、被感染細胞において逆転写のプロセスによりそのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡへ変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である。次いで、生じるＤＮＡは、プロウイルスとして細胞の染色体へ安定的に組み込まれテ、ウイルスタンパク質の合成を指令する。この組込みは、ウイルス遺伝子配列のレシピエント細胞とその子孫における保持をもたらす。レトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ（それぞれ、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、及びエンヴェロープ成分をコードする）を含有する。ｇａｇ遺伝子より上流に見出される配列は、ゲノムのビリオンへのパッケージングのためのシグナルを含有する。ウイルスゲノムの５'及び３'端には、２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が存在する。これらは、強いプロモーター及びエンハンサー配列を含有して、宿主細胞ゲノム中の組込みにも必要とされる。

[0051] １つの態様において、レトロウイルスベクターを構築するためには、目的の１以上のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列をコードする核酸をあるウイルス配列の場所にあるウイルスゲノム中へ挿入して、複製欠損であるウイルスを産生する。ビリオンを産生するためには、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲとパッケージング成分のないパッケージング細胞系を構築する。ｃＤＮＡをレトロウイルスＬＴＲとパッケージング配列と一緒に含有する組換えプラスミドをこの細胞系へ導入する（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）とき、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物がウイルス粒子へパッケージされることを可能にして、次いでこれは、培養基へ分泌される。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地を採取して、濃縮してもよく、遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞種に感染することが可能である。しかしながら、組込みと安定的な発現には、宿主細胞の分裂を必要とする。

[0052] 他の態様において、ウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス、又は単純ヘルペスウイルスのようなウイルスに由来する。

[0053] 本発明のある態様において、核酸配列を含んでなるベクターは、裸の組換えＤＮＡ又はプラスミドを含んでよい。構築体の導入は、細胞膜を物理的又は化学的に透過させるどの方法によっても実施してよい。１つの態様において、ベクターは、ミニサークルＤＮＡであり、それは、１つの態様において、細菌の複製起点も抗生物質耐性マーカーも有さない、非ウイルス遺伝子導入のための超コイルＤＮＡ分子である。別の態様において、ミニサークルＤＮＡは、プラスミド産生のプロセスの間の遺伝子送達ベクター由来の細菌の制御領域を含まない。従って、それらは、遺伝子治療に使用する他のプラスミドより小さくて、潜在的に安全である。１つの態様において、ミニサークルＤＮＡは、高収率をもたらし、精製するのが容易であり、確実で持続的なトランス遺伝子発現を提供する。

[0054] 標準組換え技術を使用するベクターの構築については、当該技術分野でよく知られている（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、Maniatis, et al.,「Molecular Cloning, A Laboratory Manual（分子クローニング：実験マニュアル）」（コールドスプリングハーバー、1990）、及び Ausubel, et al., 1994,「Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最新プロトコール）」（ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、1996）を参照のこと）。

[0055] 別の態様において、ベクターは、マーカーポリペプチドをコードする異種核酸配列の挿入物を含む。マーカーポリペプチドは、例えば、ｙＥＣｉｔｒｉｎｅ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤＳ−Ｒｅｄ（赤色蛍光タンパク質）、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ／ＥＧＦＰ、ヒト成長ホルモン、又は当業者に知られている任意数の他のレポータータンパク質を含んでよい。

[0056] 別の態様において、ベクターは、目的の１以上の遺伝子を含んでよい。従って、１つの態様において、本発明のベクターは、１つの態様においてエリスロポエチン又はインターフェロンα２ｂである、目的の遺伝子を含んでよく、それは、１つの態様において、マーカーを発現して、別の態様において、マーカーへインフレームで連結し、マーカーは、１つの態様において、目的の遺伝子産物の同定を可能にして、別の態様において、微小器官により産生される目的の遺伝子産物と微小器官（複数）の外側の宿主細胞により内因的に産生される類似の遺伝子産物の間の識別を可能にする。

[0057] １つの態様では、本発明の治療用ポリペプチドをコードする核酸を含んでなるベクターを微小器官へ導入する。限定されないが、直接的なＤＮＡ取込み技術、並びに、リン酸カルシウム媒介及びＤＥＡＥ−デキストラン媒介の導入法、エレクトロポレーション、又はリポソーム仲介トランスフェクションを利用する、ウイルス、プラスミド、線状ＤＮＡ、又はリポソーム媒介形質導入、受容体媒介取込み及び磁気ポレーションの方法といった、カセット及び／又はベクターを細胞へ導入する、本発明の方法に影響を及ぼすためのいくつかの技術が当該技術分野で知られている（さらなる詳細については、例えば、「Methods in Enzymology（酵素学の方法）」１〜３１７巻、アカデミックプレス、「Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学のプロトコール）」、Ausubel F. M. et al.（監修）Greene Publishing Associates（1989）、及び「Molecular Cloning: A Laboratory Manual（分子クローニング：実験マニュアル）」第２版、Sambrook et al. コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（1989）、又は他の標準実験マニュアルを参照のこと)。

[0058] １つの態様において、核酸コート粒子での衝撃は、裸のＤＮＡ発現構築体を細胞へ移すための方法であり得る。この方法は、ＤＮＡコートされた微小射出体を高速へ加速して、それらを細胞膜に貫通させて、殺傷せずに細胞に入ることを可能にする能力に依存する。小粒子を加速するためのいくつかのデバイスが開発されている。１つのそのようなデバイスは、推進力をもたらす電流を発生させるための高圧電荷に依存する。使用される微小射出体は、タングステン又は金のビーズのような、生物学的に不活性であるか又は生体適合性のある物質を含む。望みの配列の細胞への導入には上記の方法のいずれも活用してよく、そしてそれにより産生される細胞は、本発明の方法を有効にするためのそれらの使用と同様に、本発明の一部とみなしてよいと理解されたい。

[0059] １つの態様において、本発明の製剤及び方法のベクターは、核酸配列を含む。本明細書に使用するように、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と、適宜、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はそれらの模倣体のようなポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを意味する。この用語には、ヌクレオチド類似体より作製されるＲＮＡ又はＤＮＡの類似体と、記載される態様に応用可能であるように、一本鎖（センス又はアンチセンス）及び二本鎖のポリヌクレオチドが同等物として含まれることも理解されたい。この用語には、天然に存在するヌクレオ塩基、糖、及び共有ヌクレオシド間（骨格）連結からなるオリゴヌクレオチド、並びに同様に機能する非天然存在部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような修飾又は置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、増強された細胞取込み、核酸標的への増強されたアフィニティー、及びヌクレアーゼの存在下での増加した安定性といった望ましい特性のために、ネイティブの形態よりしばしば好ましい。

[0060] １つの態様において、用語「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」は、限定されないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列さえも含めてよい分子を意味する。この用語はまた、ＤＮＡ及びＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれも含まれる配列を意味する。

[0061] 核酸は、当該技術分野でよく知られているどの合成又は組換え法によっても生成することができる。核酸は、当該技術分野で知られている技術により生物物理学的又は生物学的な特性を改変させるようにさらに修飾することができる。例えば、核酸は、ヌクレアーゼに対するその安定性を増加させる（例、「エンドキャッピング」）又はその溶解性、又は相補配列に対する結合アフィニティーを変化させるように修飾することができる。これらの核酸は、目的のベクター、発現カセット、プロモーター配列、目的の遺伝子、又はこれらの組合せを含んでよい。別の態様では、その親油性を修飾してよく、それは、その送達に利用される系における変化を反映するものであり、そして１つの態様において、そのような配列が、皮膚又はその層のいずれの内部での保持か又はそれを通る透過に望ましいかどうかによりさらに影響を受ける場合がある。そのような考察は、本発明において、記載の方法及び系において使用するどの化合物にも影響を及ぼす場合がある。

[0062] １つの態様において、ＤＮＡは、当該技術分野で知られている方法によって全体又は部分を４つのヌクレオチドより合成することができる。そのような方法には、Caruthers（1985; Science 230: 281-285）に記載のものが含まれる。ＤＮＡはまた、重複した二本鎖オリゴヌクレオチドを製造すること、ギャップを埋めること、及び末端を連結させることによって合成することができる（概論としては、Sambrook et al.（1989;Molecular Cloning - A Laboratory Manual（分子クローニング：実験マニュアル）第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク）を参照のこと）。別の態様では、不活性化突然変異を野生型ＤＮＡより部位特異的突然変異誘発によって製造してよい（例えば、Zoller et al.(1982; DNA. 1984 Dec; 3(6): 479-88); Zoller (1983); 及び Zoller (1984; DNA. 1984 Dec; 3(6): 479-88); McPherson（1991;Directed Mutagenesis: A Practical Approach（特異的突然変異誘発：実践アプローチ）. オックスフォード大学出版局、ニューヨーク）を参照のこと）。入手したＤＮＡは、当該技術分野で知られている方法によって増幅させることができる。１つの好適な方法は、Saiki et al. (1988; Science. 1988 Jan 29; 239 (4839): 487-491)、Mullis et al., 米国特許第４，６８３，１９５号、及び Sambrook et al. (1989) に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法である。

[0063] 特定の目的を達成するために核酸を修飾する方法は、当該技術分野において、例えば、Sambrook et al. (1989) に開示されている。さらに、本発明の核酸配列には、目的のタンパク質のノンコーディングである、ヌクレオチド配列の１以上の部分が含まれる可能性がある。点突然変異によるか又は誘導修飾（挿入、欠失、及び置換が含まれる）によって、それによりコードされるポリペプチドの活性、半減期、又は産生を高めるように引き起こされるＤＮＡ配列中のバリエーションも、本発明に含まれる。

[0064] 本発明の製剤は、核酸を含んでよく、１つの態様において、又は別の態様において、本発明の方法には、その送達を含めてよく、ここで、別の態様において、核酸は、ベクターの一部である。

[0065] 特別な発現ベクター系と核酸を細胞へ導入する方法の効力については、下記に記載するような当該技術分野で定型的に使用されている標準アプローチによって評価することができる。

[0066] 当業者により理解されるように、タンパク質又はペプチドをコードする核酸配列又は遺伝子の断片又は誘導体は、野生型の遺伝子又は配列全体と同じやり方で依然として機能する可能性がある。同様に、核酸配列の諸形態は、野生型配列と比較してバリエーションを有しても、これらのバリエーションにかかわらず、目的のタンパク質又はペプチド、又はその断片をコードして、同じ生物学的効果を明示する野生型の機能を保持する可能性がある。これらのいずれも、本発明の別々の態様を表す。

[0067] １つの態様において、本発明の製剤及び方法は、遺伝子サイレンシングの応用に使用してよい。１つの態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（これは、少なくとも１つのヌクレオチドよりそれぞれ構成される２以上の化学的に異なる領域を含有するキメラ分子である）の使用を介して、特別な遺伝子の活性又は機能を抑圧又は消失させる。

[0068] １つの態様において、キメラオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ分解に対する増加した抵抗性、増加した細胞取込み、及び／又は標的ポリヌクレオチドへの増加した結合アフィニティーをそのオリゴヌクレオチドに付与するように修飾されている、少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素の基質として役立つ場合があり、そのことは、本発明のこの側面によれば、特定配列の分解を介した遺伝子サイレンシングの手段として役立つ。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動法と、必要ならば、当該技術分野で知られている関連した核酸ハイブリダイゼーション技術によって定型的に検出することができる。

[0069] キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つの態様において、当該技術分野で記載されているように、２以上のオリゴヌクレオチド及び／又は修飾オリゴヌクレオチドの複合構造として形成されてよく（例えば、米国特許第５，０１３，８３０；５，１４９，７９７；５，２２０，００７；５，２５６，７７５；５，３６６，８７８；５，４０３，７１１；５，４９１，１３３；５，５６５，３５０；５，６２３，０６５；５，６５２，３５５；５，６５２，３５６；及び５，７００，９２２号を参照のこと）、そして、別の態様において、リボザイム配列を含んでよい。

[0070] 遺伝子の発現、活性、又は機能の阻害は、別の態様において、遺伝子発現の配列特異的な阻害を提供する低分子干渉ＲＮＡの使用により有効になる。生物中の単一遺伝子に対応する二本鎖／二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の投与により、影響される細胞中のｍＲＮＡの迅速な分解によって特定遺伝子の発現を沈静化することができる。この方法は、遺伝子サイレンシングと呼ばれ、ｄｓＲＮＡは、特異的なＲＮＡ阻害剤（ＲＮＡｉ）として機能する。ＲＮＡｉは、内因性ウイルスやトランスポゾン活性にあるような天然の供給源に由来してよく、また、マイクロインジェクション（Fire et al. (1998) Nature 391: 806-11）により、又は相補ＲＮＡ又は折り返しＲＮＡを産生する遺伝子構築体での形質転換により、又は他のベクターにより（Waterhouse, P.M., et al. (1998). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13959-13964 及び Wang, Z., et al. (2000). J. Biol. Chem. 275, 40174-40179）、細胞へ人工的に導入することもできる（Elbashir SM, et al (2001). Nature 411:494-498）。ＲＮＡｉ媒介性のｍＲＮＡ分解は、１つの態様において、二重鎖又は二本鎖ＲＮＡを含み、また、他の態様では、一本鎖ＲＮＡ、単離ＲＮＡ（部分精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え産生ＲＮＡ）、並びに、１以上のヌクレオチドの付加、欠失、及び／又は改変により、天然に存在するＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡが含まれる。

[0071] １つの態様において、本発明の製剤及び方法の核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。１つの態様において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド（即ち、アミド）結合によって連結されたアミノ酸残基を含む分子を意味して、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質が含まれる。従って、１つの態様において、本発明のポリペプチドは、共有結合したアミノ酸の単一又は多数の鎖を有してよく、ジスルフィド結合を含む鎖内又は鎖間の連結をさらに含有する場合がある。１つの態様において、いくつかのポリペプチドは、マルチユニットの大分子複合体のサブユニットを形成してもよい。１つの態様において、ポリペプチドは、コンホメーション選好性を保有して、三次元構造を明示すると予測することができる。コンホメーション選好性と三次元構造は、通常、ポリペプチドの一次（即ち、アミノ酸）配列、及び／又はジスルフィド結合の存在（又は非存在）、又は他の共有又は非共有の鎖内又は鎖間の相互作用によって規定されるものである。

[0072] １つの態様において、用語「ペプチド」は、ネイティブペプチド（分解産物、人工的に合成したペプチド、又は組換えペプチドのいずれか）、及び／又は、例えば、ペプチドを体内にある間により安定にさせるか、又はペプチドが細胞を通過することをより可能にする修飾を有する場合がある、ペプトイド及びセミペプトイドのようなペプチド模倣体（典型的には、人工的に合成したペプチド）を意味する。このような修飾には、限定されないが、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾が含まれ、限定されないが、ＣＨ_２−ＮＨ、ＣＨ_２−Ｓ、ＣＨ_２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ_２−Ｏ、ＣＨ_２−ＣＨ_２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ又はＣＦ＝ＣＨ、骨格修飾、及び残基修飾が含まれる。ペプチド模倣化合物を製造するための方法は、当該技術分野でよく知られていて、例えば、本明細書で完全に説明するかのように参照により組み込まれる、「Quantitative Drug Design（定量的なドラッグデザイン）」C. A. Ramsden（監修）、17.2章、F. Choplin, Pergamon Press（1992）に詳述されている。

[0073] ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ_２−）、アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）、（ここでＲは、どのアルキルでもよく、例えば、メチルである）、カルバ結合（−ＣＨ_２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ_２−ＣＯ−）（ここでＲは、炭素原子上に本来提示される「正常な」側鎖である）によって置換されてよい。これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合のどこで起きてもよく、いくつか（２〜３）の所で同時に起きてもよい。

[0074] 天然の芳香族アミノ酸、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＰｈｅは、ＴＩＣ、ナフチルエラニン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、又はＯ−メチル−Ｔｙｒのような合成の非天然酸で置換してよい。上記に加えて、本発明のペプチドには、１以上の修飾アミノ酸又は１以上の非アミノ酸モノマー（例、脂肪酸、複合炭水化物、等）も含めてよい。

[0075] １つの態様において、用語「アミノ酸」又は「アミノ酸（複数）」には、２０種の天然に存在するアミノ酸；しばしば in vivo で翻訳後に修飾されるこれらのアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン、及びホスホスレオニンが含まれる）；並びに、他の異常アミノ酸（限定されないが、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシン、及びオルニチンが含まれる）が含まれると理解されたい。さらに、用語「アミノ酸」には、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸をともに含めてよい。

[0076] 本明細書に使用するように、用語「アミノ酸」は、他に具体的に指定しなければ、アミノ酸のＤ又はＬのいずれかの立体異性型を意味する。本発明の範囲内にまた含まれるのは、例えば、精製された野生型の腫瘍サプレッサータンパク質の生物学的活性を有する、同等のタンパク質又は同等のペプチドである。「同等のタンパク質」及び「同等のポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質又はポリペプチドの線状配列からは逸脱するが、その生物学的活性は変化させないアミノ酸置換を有する化合物を意味する。これらの同等物は、１以上のアミノ酸の関連アミノ酸、例えば、類似荷電アミノ酸での置き換えにより、又は側鎖又は官能基の置換又は修飾により、ネイティブ配列からは異なる可能性がある。

[0077] ペプチド又はポリペプチド、又はそれらをコードするＤＮＡ配列は、原核細胞又は真核細胞のような、多様な天然又は非天然の供給源より入手してよい。１つの態様において、供給源の細胞は、野生型、組換え、又は突然変異体であってよい。別の態様において、複数のペプチド又はポリペプチドは、細菌、酵母、又は真菌のような微生物、ウイルス、動物（哺乳動物、無脊椎動物、爬虫類、鳥、及び昆虫が含まれる）、又は植物細胞にとって内因性であってよい。

[0078] 別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、ビリオン粒子の表面外皮、特別な細胞溶解液、組織抽出物のような、より特定の供給源より入手しても、それらは、細胞膜の表面で発現されるポリペプチドに限定してもよい。

[0079] 別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、特別な細胞又は組織型、発生段階、又は疾患の状態又は段階に由来する。１つの態様において、疾患の状態又は段階は癌であり、別の態様において、疾患の状態又は段階は感染症であり、それは別の態様において、ＨＩＶ感染症である。別の態様において、疾患状態は発達障害であり、一方、別の態様において、疾患状態は代謝障害である。

[0080] 本発明のポリペプチドは、どのサイズでもよい。予測され得るように、ポリペプチドは、多種多様な分子量を明示する可能性があり、１５０〜２００キロダルトン（ｋＤ）を超えるものもある。典型的には、ポリペプチドは、約５，０００〜約１００，０００ダルトンに及ぶ分子量を有してよい。なお他のものは、より狭い範囲、例えば、約１０，０００〜約７５，０００ダルトン、又は約２０，０００〜約５０，０００ダルトンに該当する場合がある。代わりの態様において、本発明のポリペプチドは、１〜２５０のアミノ酸残基の長さであってよい。別の態様において、本発明のポリペプチドは、１０〜２００のアミノ酸残基の長さであってよい。代わりの態様において、本発明のポリペプチドは、５０〜１００のアミノ酸残基の長さであってよい。代わりの態様において、本発明のポリペプチは、１〜２５０のアミノ酸残基の長さであってよい。代わりの態様において、本発明のポリペプチドは、１〜２５０のアミノ酸残基の長さであってよい。１つの態様において、ペプチド又はポリペプチドの最大サイズは、それが発現されるベクターにより決定されて、それは１つの態様において、ほぼ２０ｋＤと３７ｋＤの間、２０ｋＤと２５ｋＤの間、２５ｋＤと３０ｋＤの間、３０ｋＤと３７ｋＤの間、又は３５ｋＤと３７ｋＤの間である。別の態様において、ポリペプチドは、３４ｋＤの糖タンパク質である。

[0081] 別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、アゴニストである。別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、アンタゴニストである。別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、抗原である。別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、酵素である。別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、酵素又は他の基質のアクチベータである。別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、酵素又は他の基質の阻害剤である。別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、ホルモンである。別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、調節タンパク質である。調節タンパク質は、遺伝子の発現及び複製、酵素のパフォーマンス、細胞とその環境の間の相互作用、及び多くの他の顕示を支配する数多くの相互作用を命令する。別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、細胞骨格タンパク質である。細胞骨格タンパク質は、細胞のために柔軟な骨組みを形成し、オルガネラや形成体（formed bodies）に付着点を提供して、細胞のパーツ間のコミュニケーションを可能にする。別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、毒素である。別の態様において、本発明の治療用核酸は、１以上の自殺遺伝子をコードする。

[0082] 別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、アゴニスト、アンタゴニスト、抗原、酵素、酵素アクチベータ、酵素阻害剤、酵素基質、ホルモン、調節タンパク質、細胞骨格タンパク質、又は毒素の機能性断片である。「機能性断片」は、ペプチド又はポリペプチドの残りの非存在時にも、ペプチド又はポリペプチドの機能の１以上を遂行することが可能であるペプチド又はポリペプチドの部分を示すことを意味する。１つの態様において、機能性断片は、目的の標的との分子間相互作用に媒介するのに十分である。

[0083] 代わりの態様において、ペプチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はその断片へ結合する。１つの態様において、ＤＮＡ又はＲＮＡ結合ペプチドは、当該技術分野で知られている多くのもののいずれでもよく、限定されないが、β−β−αジンクフィンガータンパク質、核内受容体タンパク質、ループ・シート・ヘリックス型タンパク質、及びＧＡＬ４型タンパク質のようなジンクフィンガータンパク質；Ｃｒｏ及びリプレッサータンパク質、ＬａｃＩプリンリプレッサータンパク質（ＰｕｒＲ）、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ（ＤＮＡ認識領域）、γ−δレコンビナーゼタンパク質（Ｃ末端ドメイン）、Ｈｉｎレコンビナーゼタンパク質、Ｔｒｐリプレッサータンパク質、ジフテリア毒素リプレッサー、カタボライト遺伝子活性化タンパク質（ＣＡＰ）、ホメオドメインタンパク質、ＲＡＰ１タンパク質、Ｐｒｄ対合タンパク質、Ｔｃ３トランスポザーゼタンパク質、ＴＦＩＩＢファミリー、インターフェロン調節因子、転写因子ファミリー、及びＥＴＳドメインファミリーバクテリオファージのようなヘリックス・ターン・ヘリックスタンパク質；並びに、塩基性ジッパータンパク質及びジッパー型タンパク質（ヘリックス・ループ・ヘリックス）のようなロイシンジッパータンパク質が含まれる。別の態様において、ＤＮＡ又はＲＮＡ結合ペプチドは、Ｃｒｅレコンビナーゼファミリー、パピローマウイルス−１ Ｅ２タンパク質、ヒストンファミリー、Ｅｂｎａ１核内タンパク質ファミリー、Ｓｋｎ−１転写因子、高移動度群ファミリー、及びＭＡＤＳボックスファミリーのような他のα−ヘリックスタンパク質；ＴＡＴＡボックス結合タンパク質のようなβ−シートタンパク質；Ｍｅｔリプレッサータンパク質、Ｔｕｓ複製終結タンパク質、組込み宿主因子タンパク質、超好熱菌ＤＮＡ結合タンパク質、Ａｒｃリプレッサー、転写因子Ｔドメインのようなβ−ヘアピン／リボンタンパク質；並びに、Ｒｅｌ相同領域タンパク質及びＳｔａｔファミリーのような他のタンパク質ファミリーであってよい。別の態様において、ＤＮＡ又はＲＮＡ結合ペプチドは、メチルトランスフェラーゼタンパク質、ＰｖｕＩＩエンドヌクレアーゼタンパク質、エンドヌクレアーゼＶタンパク質、ＥｃｏＲＶエンドヌクレアーゼファミリー、ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼファミリー、ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼファミリー、ＤＮＡミスマッチエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩタンパク質、ＤＮＡポリメラーゼＴ７、デイーエヌアーゼＩタンパク質、ＤＮＡポリメラーゼβタンパク質、Ｕｒａｃｉ−ＤＮＡグリコシラーゼ、メチルアデニン−ＤＮＡグリコシラーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、及びトポイソメラーゼＩのような酵素、又はＨＩＶ逆転写酵素のようなウイルスタンパク質であってよい。

[0084] 別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、転写又は翻訳のアクチベータ、又はその断片である。別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、転写又は翻訳のリプレッサー、又はその断片である。別の態様において、ペプチド又はポリペプチドは、受容体又はその断片である。

[0085] １つの態様において、ペプチド又はポリペプチドは、上記に記載のペプチド又はポリペプチドのいずれものコグネイトペプチドを表してよい。「コグネイト」ペプチドは、別の分子と相互作用する、及び／又はそれへ結合する任意のペプチドである。

[0086] 本発明の他の態様によれば、組換え遺伝子産物は、対応する天然のポリヌクレオチドに比較されるような、修飾ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされてよい。

[0087] タンパク質だけでなく、組換え遺伝子産物は、機能性ＲＮＡ分子も含んでよい。
[0088] 本発明の別の態様によれば、本発明の製剤及び方法は、機能性ＲＮＡ分子を産生する微小器官を提供してよい。機能性ＲＮＡ分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなるリボザイム、及びそれへ縮合するリボザイム配列を含んでよい。そのようなリボザイムは、固相オリゴヌクレオチド合成を使用して容易に合成可能である。

[0089] リボザイムは、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的な阻害のためにますます使用されている［Welch et al.,「Expression of ribozymes in gene transfer systems to modulate target RNA levels（標的ＲＮＡレベルを変調させる遺伝子導入系におけるリボザイムの発現）」Curr Opin Biotechnol. 1998 October; 9(5):486-96］。特定の標的ＲＮＡを切断するリボザイムを設計することの可能性は、それらを基礎研究と治療応用の両方で貴重なツールとしてきた。治療分野において、リボザイムは、感染症におけるウイルスＲＮＡ、癌における優性癌遺伝子、及び遺伝障害における特定の体細胞突然変異を標的とするために利用されてきた［Welch et al., 「Ribozyme gene therapy for hepatitis C virus infection（Ｃ型肝炎ウイルス感染症へのリボザイム遺伝子治療）」Clin Diagn Virol. Jul. 15, 1998; 10 (2-3): 163-71］。きわめて注目されるが、ＨＩＶ患者へのいくつかのリボザイム遺伝子治療プロトコールがすでにフェーズ１試験にある。より最近では、トランスジェニック動物研究、遺伝子標的検証、及び経路解明にリボザイムが使用されている。いくつかのリボザイムは、臨床試験の様々な段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ヒト臨床試験において研究された第一号の化学合成リボザイムである。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、血管新生経路における重要成分であるＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮増殖因子受容体）の形成を特異的に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、並びに他の会社は、抗血管新生療法剤の重要性を動物モデルで実証している。ＨＥＰＴＡＺＹＭＥは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するように設計されたリボザイムであり、細胞培養アッセイにおいてＣ型肝炎ウイルスＲＮＡを減少させるのに有効であることがわかった。

[0090] 上記に記載のように、１つの態様において、本発明の製剤及び方法は、治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる治療用製剤を提供する。１つの態様において、用語「治療用」は、必要とする被検者へ提供されるときに、有益な効果を提供する分子に関連する。いくつかの事例において、この分子は、そのような分子の被検者における非存在又は減衰した存在に置き換わるように機能する点で、治療用である。１つの態様において、治療用タンパク質は、必要とされるタンパク質の内因性のヌル又はミスセンス突然変異がある被検者の場合のように、被検者において非存在であるタンパク質である。他の態様において、内因性タンパク質は突然変異していて、非機能性タンパク質を産生し、機能性タンパク質の提供によって補償される。他の態様において、異種タンパク質の発現は、低い内因性レベルに対して相加的であり、所与のタンパク質の累積的に増強される発現をもたらす。他の態様において、該分子は、細胞又は宿主の機能化に不可欠な要素の発現、又は分泌、他をもたらすシグナル伝達カスケードを刺激する。

[0091] １つの態様において、用語「治療用製剤」は、疾患、障害、状態、又は感染の診断に、又は別の態様では治癒に、又は別の態様では緩和に、又は別の態様では治療に、又は別の態様では予防における使用に適用可能な物質について記載する。１つの態様において、本発明の「治療用製剤」は、それが適用される標的の構造又は機能に影響を及ぼすあらゆる物質に関連する。

[0092] 別の態様において、本発明の「治療用製剤」は、疾患又は障害に罹患している被検者へ投与するときに、その症状を緩和する分子である。１つの態様において、本発明の「治療用製剤」は、合成分子であり、又は別の態様では、天然に見出される供給源より単離した天然に存在する化合物である。

[0093] １つの態様において、治療用ポリペプチドは、エリスロポエチンであり、一方、別の態様において、治療用ポリペプチドは、インターフェロンαであり、それは、１つの態様において、インターフェロンα２ｂである。１つの態様において、前記治療用ポリペプチドは、他のあらゆる治療用ポリペプチドである。

[0094] １つの態様において、「治療」は、療法的治療と予防的又は防止的な手段のいずれも意味して、ここでその目的は、上記に記載のような標的とする病的状態又は障害を予防するか又は軽減することである。このように、１つの態様において、治療することには、疾患、障害、又は状態に直接影響を及ぼすか又はそれを治癒すること、抑制すること、阻害すること、防止すること、その重症度を低下させること、その発症を遅延させること、それに関連した症状を抑えること、又はこれらの組合せを含めてよい。このように、１つの態様において、「治療すること」は、特に、進行を遅らせること、退縮を促すこと、退縮を引き起こすこと、退縮を強めること、回復を速めること、代替治療薬の効果を高めるか又はそれに対する抵抗性を弱めること、又はこれらの組合せを意味する。１つの態様において、「予防すること」は、特に、症状の発症を遅らせること、疾患への再発を防ぐこと、再発エピソードの回数又は頻度を減らすこと、症候性エピソード間の潜伏期を増加させること、又はこれらの組合せを意味する。１つの態様において、「抑制すること」又は「阻害すること」は、特に、症状の重症度を低下させること、急性エピソードの重症度を低下させること、症状の回数を低下させること、疾患関連症状の発症を抑えること、症状の潜伏を抑えること、症状を改善すること、二次症状を抑えること、二次感染症を抑えること、患者の生存を延長させること、又はこれらの組合せを意味する。

[0095] １つの態様において、症状は一次であるが、別の態様において、症状は二次である。１つの態様において、「一次」は、特別な疾患の直接的な結果である症状に関連するが、１つの態様において、「二次」は、一次の原因に由来するか又はその結果である症状に関連する。１つの態様において、本発明に使用の化合物は、前記疾患に関連した一次又は二次症状又は二次合併症を治療する。別の態様において、「症状」は、疾患又は病理学的状態のどの徴候でもよい。

[0096] １つの態様において、治療用核酸は治療用ポリペプチドをコードしてよく、これは、１つの態様において、酵素、酵素補因子、細胞傷害タンパク質、抗体、チャネルタンパク質、輸送体タンパク質、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、受容体、ムチン、界面活性剤、アプタマー、又はホルモンを含んでよい。別の態様において、治療用ポリペプチドは、上記に記載のようなカテゴリーの１以上のものであってよい。別の態様において、治療用核酸は、下記に記載のような機能性ＲＮＡをコードしてよい。

[0097] １つの態様において、用語「抗体又は抗体断片」は、インタクトな抗体分子、並びに、エピトープへ結合することが可能であるＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）_２、及びＦｖのようなその機能性断片を意味する。１つの態様において、Ｆａｂ断片は、抗体分子の一価の抗原結合断片を含有する断片を意味し、これは、抗体全体の酵素パパインでの消化により、インタクトな軽鎖と１つの重鎖の部分を生じて産生することができる。１つの態様において、Ｆａｂ'断片は、抗体全体をペプシンで処理した後で還元して、インタクトな軽鎖と重鎖の部分を生じて入手し得る、抗体分子の一部を意味する。抗体分子あたり２つのＦａｂ'断片を入手し得る。１つの態様において、（Ｆａｂ'）_２は、抗体全体を酵素ペプシンで処理することによって後続の還元なしに入手し得る抗体の断片を意味する。別の態様において、Ｆ（ａｂ'）_２は、２つのジスルフィド結合により結合された２つのＦａｂ'断片の二量体である。１つの態様において、Ｆｖは、２つの鎖として発現される軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する、遺伝子工学処理された断片を意味する場合がある。１つの態様において、抗体断片は、遺伝子工学的に融合した単鎖分子として好適なポリペプチドリンカーにより連結した軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する、遺伝子工学処理された分子である、単鎖抗体（「ＳＣＡ」）であってよい。

[0098] これらの断片を作製する方法は、当該技術分野で知られている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Harlow and Lane,「Antibodies: A Laboratory Manual（抗体：実験マニュアル）」コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク、1988 を参照のこと）。

[0099] １つの態様において、抗体は、エピトープを認識するが、これは、別の態様において、抗体のパラトープが結合する抗原上の抗原決定基を意味する。エピトープの決定基は、他の態様において、アミノ酸又は炭水化物側鎖のような分子の化学的に活性な表面基からなる場合があり、そして他の態様において、特定の三次元構造特性を有し、及び／又は他の態様において、特定の電荷特性を有する場合がある。

[00100] １つの態様において、認識されるエピトープは、病原体に由来し、別の態様では、病原性細胞に由来し、又は別の態様では、異常に発現したタンパク質に由来するが、これは、別の態様において、発現の位置、量、又はこれらの組合せに関連する場合がある。

[00101] 抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって入手し得る。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡ由来の可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって製造する。例えば、Larrick and Fry, 方法, 2: 106-10, 1991 を参照のこと。

[00102] １つの態様において、抗体は、殺腫瘍性であり、それによりある種の癌において治療用になる。殺腫瘍活性を保有する抗体については、当該技術分野でも知られていて、そのいずれの使用も本発明の態様を表してよく、ＩＭＣ−Ｃ２２５、ＥＭＤ７２０００、ＯｖａＲｅｘ Ｍａｂ Ｂ４３．１３、抗ガングリオシドＧ（Ｄ２）抗体 ｃｈ１４．１８、ＣＯ１７−１Ａ、トラスツズマブ、ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ、ｓｃ−３２１、ＡＦ３４９、ＢＡＦ３４９、ＡＦ７４３、ＢＡＦ７４３、ＭＡＢ７４３、ＡＢ１８７５、抗Ｆｌｔ−４ＡＢ３１２７、ＦＬＴ４１−Ａ、リツキシマブ、２Ｃ３、ＣＡＭＰＡＴＨ １Ｈ、２Ｇ７、Ａｌｐｈａ ＩＲ−３、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＭＤＸ−４４７、抗ｐ７５ ＩＬ−２Ｒ、抗ｐ６４ ＩＬ−２Ｒ、及び２Ａ１１が含まれる。

[00103] １つの態様では、本発明の「治療用核酸」が、抗高血圧薬、抗うつ薬、抗不安剤、抗凝血剤、抗痙攣薬、血糖降下剤、充血除去薬、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、抗炎症薬、抗精神病剤、認知エンハンサー、コレステロール低下剤、抗肥満剤、自己免疫障害剤、抗インポテンス剤、抗菌剤及び抗真菌剤、催眠剤、抗パーキンソン症剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗新生物薬、バルビルール酸誘導体、鎮静薬、栄養剤、β−ブロッカー、催吐薬、抗催吐薬、利尿薬、抗凝固薬、強心薬、アンドロゲン、コルチコイド、同化促進剤、成長ホルモン分泌促進薬、抗感染症剤、冠血管拡張薬、炭酸脱水酵素阻害剤、抗原虫薬、胃腸剤、セロトニンアンタゴニスト、麻酔薬、血糖低下剤、ドパミン作用剤、抗アルツハイマー病剤、抗潰瘍剤、血小板阻害剤、及びグリコゲンホスホリラーゼ阻害剤として役立つ分子をコードしてよいか、又は「治療用ポリペプチド」がそれらであってよい。

[00104] １つの態様において、本発明の「治療用製剤」は、抗菌性、抗ウイルス性、抗真菌性、又は抗寄生物性である。別の態様において、治療用製剤は、細胞傷害性活性又は抗癌活性を有する。別の態様において、治療用製剤は、免疫刺激性である。別の態様において、治療用製剤は、炎症応答又は免疫応答を阻害する。

[00105] １つの態様では、治療用核酸が、インターフェロン又はインターロイキンのようなサイトカイン、又はそれらの受容体をコードしてよいか、又は治療用ポリペプチドがそれらであってよい。サイトカインの発現又はその適正な発現の不足は、疾患への感受性との関連が示唆されていて、亢進した発現は、多くの感染症に対する抵抗性をもたらす場合がある。サイトカインの発現パターンは、例えば、感染症における、又は自己免疫疾患におけるＴｈ１タイプの発現パターン又はＴｈ２パターンに対する免疫応答の偏向化のように、有益な効果をもたらすように改変してよく、ここで改変された発現パターンは、宿主に対して有益であると証明される場合がある。

[00106] 別の態様では、治療用核酸が、グリコゲンの貯蔵又は分解に関与するような酵素をコードしてよいか、又は治療用ポリペプチドがそれであってよい。別の態様において、治療用タンパク質は、イオン輸送体のような輸送体、例えばＣＦＴＲ、又はグルコース輸送体、又はその欠乏又は不適正な発現が多様な疾患をもたらす他の輸送体を含む。

[00107] 別の態様では、治療用核酸が、癌関連イベントの進行を改変させる、腫瘍サプレッサー又はプロアポトーシス化合物をコードするか、又は治療用ポリペプチドがそれである。

[00108] 別の態様では、本発明の治療用核酸が免疫調節タンパク質をコードしてよいか、又は治療用ポリペプチドがそれであってよい。１つの態様において、免疫調節タンパク質は、インターロイキン１〜１５、インターフェロンα、β又はγ、腫瘍壊死因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、好中球活性化タンパク質（ＮＡＰ）、マクロファージ化学遊走因子、及び活性化因子（ＭＣＡＦ）のようなケモカイン、ＲＡＮＴＥＳ、マクロファージ炎症性ペプチド、ＭＩＰ−１ａ及びＭＩＰ−１ｂ、又は補体成分といった、サイトカイン、ケモカイン、補体、又は成分を含む。

[00109] 別の態様では、本発明の治療用核酸が、増殖因子又は組織促進因子をコードしてよいか、又は治療用ポリペプチドがそれであってよい。１つの態様において、治療用化合物は、骨形成タンパク質、又はＯＰ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−９、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、６０Ａ、又はＶｇｒ−１である。別の態様において、治療用核酸は、神経の再生又は修復を促進するＲＮＡ又はペプチドをコードして、ＮＧＦ、又は他の増殖因子を含めてよい。別の態様において、治療用ポリペプチドは、神経の再生又は修復を促進して、ＮＧＦ、又は他の増殖因子を含めてよい。

[00110] 別の態様では、治療用核酸が、天然又は非天然のインスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、トリプシノーゲン、ケモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、ホルモン、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ２、エラスターゼ、アミラーゼ、血液凝固因子、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、シトクロムｐ４５０酵素、アデノシンデアミナーゼ、血清胸腺因子、胸腺体液因子、サイモポエチン、成長ホルモン、ソマトメジン、共刺激因子、抗体、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、表皮増殖因子、肝造血因子（ヘパトポエチン）、肝臓細胞増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、負の増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、αファミリーのトランスフォーミング増殖因子、βファミリーのトランスフォーミング増殖因子、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、セロトニン、サブスタンスＰ、転写因子、又はこれらの組合せをコードしてよいか、又は治療用ポリペプチドがこれらであってよい。

[00111] 別の態様において、遺伝子は、レポーター遺伝子を含む。１つの態様において、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする。１つの態様において、蛍光タンパク質は、ｙＥＣｉｔｒｉｎｅ又は黄色蛍光タンパク質である。１つの態様において、蛍光タンパク質は、クラゲの緑色蛍光タンパク質、又はその突然変異体又は変異体である。別の態様において、ＧＭＭＯは、特に、レポーター遺伝子又はレポータータンパク質をコードする遺伝子以外のどの遺伝子も含んでよい。

[00112] 別の態様において、レポーター遺伝子は、薬剤抵抗性を付与する。１つの態様において、レポーター遺伝子は、当業者により理解されるように、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、他のような抗生物質に対する抵抗性を付与する。別の態様において、抗生物質抵抗性遺伝子には、ネオマイシン（ｎｅｏ）、ブラスチシジン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン、フレオマイシン、Ｔｎ９１７、ゲンタマイシン、及びブレオマイシンに対する抵抗性を付与するものを含めてよい。ネオマイシン抵抗性遺伝子の例は、Ｇ４１８及びカナマイシンが含まれる様々な抗生物質に対する抵抗性を付与する、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ１１をコードする、トランスポソンＴｎ５のネオマイシン抵抗性遺伝子である。別の態様において、レポーターは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ）であり、クロラムフェニコールに対する抵抗性を付与する。

[00113] １つの態様において、本発明の製剤及び方法は、ウイルス感染症の、又は別の態様では、細菌、寄生虫、又は真菌の感染症、又はこれらの組合せの予防、又は治療的介入のためである。

[00114] 本発明のこの側面によれば、本発明の製剤及び方法は、疾患の予防、又はそれへの治療的介入のためである。１つの態様において、被検者がこのように治療される疾患は、限定されないが、筋ジストロフィー、癌、心臓血管系疾患、高血圧症、感染症、腎疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、クロイツフェルト・ヤコブ病のような神経変性疾患、狼瘡、慢性関節リウマチ、心内膜炎、グレイブス病、又はＡＬＤのような自己免疫疾患、喘息又は嚢胞性線維症のような呼吸系疾患、骨粗鬆症のような骨疾患、関節疾患、肝臓疾患、乾癬又は湿疹のような皮膚の疾患、眼科系疾患、鼻咽喉系疾患、ツーレット症候群、精神分裂病、うつ病、自閉症、又は卒中のような他の神経系疾患、又はグリコゲン貯蔵疾患又は糖尿病のような代謝系疾患を含んでよい。特別なタンパク質の発現、治療用タンパク質の提供、薬物の提供、特別なタンパク質の発現の阻害、等が本発明の製剤により、そして本発明の方法に従って達成され得るどの疾患も本発明の一部としてみなすことが可能であると理解されたい。

[00115] １つの態様において、本発明の製剤及び方法は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含む。１つの態様において、微小器官の細胞へ導入される核酸分子は、該核酸によりコードされる遺伝子産物の細胞中での発現に適した形態にある。従って、１つの態様において、核酸分子には、遺伝子（又はその一部）の転写に必要とされるコーディング配列と調節配列が含まれる。遺伝子産物がタンパク質又はペプチドであるとき、核酸分子には、核酸分子の翻訳に必要とされるコーディング配列と調節配列が含まれ、それには、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、コードされるタンパク質又はペプチドの輸送に必要な配列、例えば、１つの態様において、タンパク質又はペプチドの細胞の表面への輸送、又は分泌のためのＮ末端シグナル配列が含まれる。

[00116] 遺伝子産物の発現を調節するヌクレオチド配列（例、プロモーター及びエンハンサー配列）は、遺伝子産物が発現され得る細胞の種類と遺伝子産物の発現の望まれるレベルに基づいて選択される。例えば、プロモーターへ連結した遺伝子の細胞種特異的な発現を付与することが知られているプロモーターを使用することができる。筋原細胞の遺伝子発現に特異的なプロモーターを目的の遺伝子へ連結させて、その遺伝子産物の筋肉特異的な発現を付与することができる。当該技術分野で知られている筋肉特異的な調節エレメントには、ジストロフィン遺伝子（Klamut et al., (1989) Mol. Cell Biol. 9: 2396）、クレアチニンキナーゼ遺伝子（Buskin and Hauschka, (1989) Mol. Cell Biol. 9:2627）、及びトロポニン遺伝子（Mar and Ordahl, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:6404）からの上流の領域が含まれる。ケラチン遺伝子中の負の応答要素は、転写抑制を仲介する（Jho Sh et al, (2001). J. Biol Chem）。他の細胞種に特異的な調節エレメントが当該技術分野で知られている（例、肝臓特異的な発現のためのアルブミンエンハンサー；膵臓の島細胞特異的な発現のためのインスリン調節エレメント；神経ジストロフィン、神経エノラーゼ、及びＡ４アミロイドプロモーターが含まれる、様々な神経細胞特異的な調節エレメント）。あるいは、ウイルス調節エレメントのような、遺伝子の構成的な発現を多様な異なる細胞種において指令し得る調節エレメンも使用することができる。遺伝子発現を推進するために通常使用されるウイルスプロモーターの例には、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及びシミアンウイルス４０、及びレトロウイルスＬＴＲに由来するものが含まれる。あるいは、それへ連結した遺伝子の誘導発現を提供する調節エレメントも使用することができる。誘導調節エレメント（例、誘導プロモーター）の使用は、遺伝子産物の細胞中での産生の変調を可能にする。真核細胞における使用に潜在的に有用な誘導調節系の例には、ホルモン調節エレメント（例えば、Mader, S. and White, J. H. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607 を参照のこと）、合成リガンド調節エレメント（例えば、Spencer, D. M. et al 1993, Science 262:1019-1024 を参照のこと）、及びイオン化放射線調節エレメント（例えば、Manome, Y. Et al. (1993) Biochemistry 32:10607-10613; Datta, R. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1014-10153 を参照のこと）が含まれる。開発し得る追加の組織特異的系又は誘導調節系も、本発明に従って使用することができる。

[00117] １つの態様において、本発明の調節配列は、ＣＭＶプロモーターを含んでよく、一方、別の態様において、調節配列は、ＣＡＧプロモーターを含んでよい。１つの態様において、ＣＡＧプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス即時−早期エンハンサーと修飾トリβ−アクチンプロモーター及び第一イントロンを結びつける複合プロモーターである。１つの態様において、調節配列は、シミアンウイルス（ＳＶ）−４０ポリアデニル化配列を含んでよく、これは、１つの態様において、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ分子を真核生物においてその３'端で終結させる機序である。１つの態様において、ポリアデノシン（ポリＡ）テールは、ｍＲＮＡ分子をエクソヌクレアーゼから保護して、転写終結、ｍＲＮＡの核からの輸送、及び翻訳に重要である。別の態様において、本発明の製剤は、１以上の調節配列を含んでよい。

[00118] １つの態様において、ＣＭＶ又はＣＡＧプロモーターをＳＶ４０と一緒に含んでなる本発明の製剤は、ＥＰＯ及びＩＦＮαの長期の高い in vitro（図１、５、及び７Ｂ）及び in vivo（図６Ａ）発現レベルを明示する。理論により束縛されなければ、本発明の微小器官からの遺伝子産物の長期持続性の高レベルに貢献し得る１つの要因は、プロモーターとしてのＣＭＶ、又はあるいはＣＡＧの使用であり、これは、構成的な遺伝子発現を促進するときに微小器官外植片において特に有効であり得る。

[00119] １つの態様において、用語「プロモーター」は、１つの態様において、コーディング配列のすぐ上流にあって、遺伝子の基底及び／又は調節転写に重要であるＤＮＡ配列を意味する。１つの態様において、本発明のプロモーターは、目的の遺伝子へ機能的に連結している。別の態様において、プロモーターは、目的の遺伝子の適正な条件下での発現と通常は関連している内因性プロモーターの突然変異体である。

[00120] １つの態様において、本発明の組成物とその方法に使用のプロモーターは、調節可能プロモーターである。別の態様において、調節可能プロモーターは、その特定プロモーターからの、発現を刺激する特定条件の出現又は提供の機能として下流の遺伝子の発現が生じるプロモーターを意味する。いくつかの態様において、そのような条件は、発現を直に始動させることをもたらし、又は他の態様では、発現を妨げるものを取り除く。いくつかの態様において、そのような条件は、発現を停止させるか、又は抑えることをもたらす。

[00121] １つの態様において、そのような条件は、当業者に知られるように、特定の温度、栄養素、栄養素の非存在、金属の存在、又は他の刺激又は環境因子を含んでよい。１つの態様において、調節可能プロモーターは、ガラクトース（例、ＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＧＡＬ１０）、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１））、グルコース（例、アルコールデヒドロゲナーゼＩＩ（ＡＤＨ２））、又はリン酸（例、酸ホスファターゼ（ＰＨＯ５））により調節されてよい。別の態様において、調節可能プロモーターは、当業者に知られるように、熱ショック（熱ショックプロモーター）又はＩＰＴＧ又はテトラサイクリンのような化学品、又はその他のものにより活性化されてよい。どの調節可能プロモーターも、そしてそのような調節の条件も、本発明のベクター、核酸、及び方法に含まれて、その態様を表すと理解されたい。

[00122] １つの態様において、本発明の製剤及び方法は、治療用ポリペプチド又は核酸のレベルを基底レベルに対して少なくとも５％増加させる。別の態様において、治療用ポリペプチド又は核酸のレベルは、基底レベルに対して、少なくとも７％、別の態様において、少なくとも１０％、別の態様において、少なくとも１５％、別の態様において、少なくとも２０％、別の態様において、少なくとも２５％、別の態様において、少なくとも３０％、別の態様において、少なくとも４０％、別の態様において、少なくとも５０％、別の態様において、少なくとも６０％、別の態様において、少なくとも７５％、別の態様において、少なくとも１００％、別の態様において、少なくとも１２５％、別の態様において、少なくとも１５０％増加して、別の態様において、基底レベルに対して少なくとも２００％増加する。

[00123] １つの態様において、本発明の製剤を介した治療用ポリペプチド又は核酸の発現は、「基底レベル」に比較して増加するが、それは、１つの態様において、本発明の治療用製剤が投与されていないし、他のやり方でもそれと接触していない宿主又は細胞培養物において発現される遺伝子のレベルである。

[00124] 別の態様において、本発明の製剤及び方法は、治療用ポリペプチド又は核酸のレベルをほぼ２０００ｎｇ／日へ増加させ、又は別の態様において、１５００ｎｇ／日、又は別の態様において、１０００ｎｇ／日、又は別の態様において、７５０ｎｇ／日、又は別の態様において、５００ｎｇ／日、又は別の態様において、２５０ｎｇ／日、又は別の態様において、１５０ｎｇ／日、又は別の態様において、１００ｎｇ／日、又は別の態様において、７５ｎｇ／日、又は別の態様において、５０ｎｇ／日、又は別の態様において、２５ｎｇ／日へ増加させる。別の態様において、本発明の製剤及び方法は、治療用ポリペプチドのレベルを２０〜７０ｍＵ／ｍＬの間へ増加させ、又は別の態様において、５０〜１００ｍＵ／ｍＬ、又は別の態様において、５〜２０ｍＵ／ｍＬ、又は別の態様において、１００〜２００ｍＵ／ｍＬ、又は別の態様において、１０〜７０ｍＵ／ｍＬ、又は別の態様において、５〜８０ｍＵ／ｍＬへ増加させる。別の態様において、本発明の製剤及び方法は、治療用ポリペプチドのレベルを５００〜１０００ｍＵ／ｍＬの間に、又は別の態様において、２５０〜７５０ｍＵ／ｍＬ、別の態様において、５００〜５０００ｍＵ／ｍＬへ増加させる。

[00125] １つの態様において、本発明の製剤及び方法は、機能性マーカーのレベル（これは、１つの態様において、ヘマトクリットレベルである）を基底レベルに対して少なくとも５％増加させる。別の態様において、機能性マーカーのレベルは、基底レベルに対して少なくとも７％、別の態様において、少なくとも１０％、別の態様において、少なくとも１５％、別の態様において、少なくとも２０％、別の態様において、少なくとも２５％、別の態様において、少なくとも３０％、別の態様において、少なくとも４０％、別の態様において、少なくとも５０％、別の態様において、少なくとも６０％、別の態様において、少なくとも７５％、別の態様において、少なくとも１００％、別の態様において、少なくとも１２５％、別の態様において、少なくとも１５０％増加し、別の態様において、基底レベルに対して少なくとも２００％増加する。

[00126] １つの態様において、本発明の治療用製剤は、「長期持続性」であり、これは、１つの態様において、治療用ポリペプチド又は核酸の分泌、発現、産生、循環、又は存続を増加させることができる製剤へ言及する。１つの態様において、治療用ポリペプチド又は核酸の発現レベルは、基底レベルに対して少なくとも１ヶ月間、又は別の態様において、少なくとも６ヶ月間増加する。別の態様において、ヘマトクリットのレベルは、少なくとも２週間、別の態様において、少なくとも３週間、別の態様において、少なくとも４週間、別の態様において、少なくとも５週間、別の態様において、少なくとも６週間、別の態様において、少なくとも８週間、別の態様において、少なくとも２ヶ月間、別の態様において、少なくとも２ヶ月間、別の態様において、少なくとも２ヶ月間、別の態様において、少なくとも３ヶ月間、別の態様において、少なくとも４ヶ月間、別の態様において、少なくとも５ヶ月間、別の態様において、少なくとも７ヶ月間、別の態様において、少なくとも８ヶ月間、別の態様において、少なくとも９ヶ月間、別の態様において、少なくとも１０ヶ月間、別の態様において、少なくとも１１ヶ月間、又は別の態様において、少なくとも１年間増加する。別の態様において、治療用ポリペプチド又は核酸の発現レベルは、少なくとも４〜６ヶ月間増加する。

[00127] １つの態様において、治療用ポリペプチド又は核酸をコードする核酸配列は、治療用ポリペプチド又は核酸の発現の増加レベルのために、又は別の態様において、治療用ポリペプチド又は核酸の発現の増加期間のために、又は別の態様において、それらの組合せのために最適化される。

[00128] １つの態様において、用語「最適化」は、望まれる変化に言及し、それは、１つの態様において、遺伝子発現における変化であり、別の態様において、タンパク質発現における変化である。１つの態様において、最適化された遺伝子発現は、遺伝子発現の最適化された調節である。別の態様において、最適化された遺伝子発現は、遺伝子発現の増加である。この側面によれば、そして１つの態様において、野生型に比較して、遺伝子発現の２倍乃至１０００倍の増加が考慮される。別の態様において、遺伝子発現の２倍〜５００倍の増加、別の態様において、遺伝子発現の２倍〜１００倍の増加、別の態様において、遺伝子発現の２倍〜５０倍の増加、別の態様において、遺伝子発現の２倍〜２０倍の増加、別の態様において、遺伝子発現の２倍〜１０倍の増加、別の態様において、遺伝子発現の３倍〜５倍の増加が考慮される。

[00129] 別の態様において、最適化された遺伝子発現は、特別な環境条件下での遺伝子発現の増加であってよい。別の態様において、最適化された遺伝子発現は、遺伝子発現の減少を含んでよく、それは、１つの態様において、特別な環境条件下でのみあり得る。

[00130] 別の態様において、最適化された遺伝子発現は、遺伝子発現の増加された期間である。この側面によれば、そして１つの態様において、野生型に比較して、遺伝子発現の期間の２倍乃至１０００倍の増加が考慮される。別の態様において、遺伝子発現の期間の２倍〜５００倍の増加、別の態様において、遺伝子発現の期間の２倍〜１００倍の増加、別の態様において、遺伝子発現の期間の２倍〜５０倍の増加、別の態様において、遺伝子発現の期間の２倍〜２０倍の増加、別の態様において、遺伝子発現の期間の２倍〜１０倍の増加、別の態様において、遺伝子発現の期間の３倍〜５倍の増加が考慮される。別の態様において、遺伝子発現の増加期間は、非ベクター発現対照における遺伝子発現に比較され、又はあるいは、野生型ベクター発現対照における遺伝子発現に比較される。

[00131] 哺乳動物細胞における発現は、１つの態様において、転写サイレンシング、短いｍＲＮＡ半減期、選択的スプライシングのイベント、未熟なポリアデニル化、非効率な核移行、及び稀なｔＲＮＡプールの利用可能性により妨げられる。哺乳動物の発現における多くの問題の根源は、多くの重要な哺乳動物遺伝子の自己発現に含まれるトランス遺伝子をコードするメッセージ内にも見出される。哺乳動物ＲＮＡの最適化には、シス作用エレメントの修飾、そのＧＣ含量の適合化、哺乳動物細胞の非限定的なｔＲＮＡプールに関するコドンの偏りを修飾すること、内部の相同領域を回避すること、及びＲＮＡｉを排除することを含めてよい。

[00132] 故に、１つの態様において、慎重に設計された人工遺伝子に依拠するときは、哺乳動物宿主内での半減期が延長された安定的なメッセージ、構成的な核内輸送、及び高レベルのタンパク産生を期待することができる。

[00133] このように、１つの態様において、遺伝子を最適化することは、コドン使用頻度を宿主遺伝子（これは、１つの態様において、ホモ・サピエンスの遺伝子である）のコドン偏りへ適合させること；きわめて高い（＞８０％）か又はきわめて低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域を調整すること；以下のシス作用配列モチーフ：内部のＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位、及びリボソームエントリー部位；ＡＴリッチ又はＧＣリッチの配列ストレッチ；ＡＲＥ、ＩＮＳ、ＣＲＳ配列エレメント；反復配列及びＲＮＡ二次構造；（隠れた）スプライスドナー及びアクセプタ部位、分岐点の１以上を回避すること；又はこれらの組合せを伴う。１つの態様では、ホモ・サピエンスの細胞における発現のために遺伝子を最適化する。別の態様では、微小器官における発現のために遺伝子を最適化する。別の態様では、皮膚細胞における発現のために遺伝子を最適化する。

[00134] １つの態様において、本明細書に明示するように、ＥＰＯのような最適化された遺伝子は、無実質アデノウイルスベクターより発現される非最適化ＥＰＯとアデノウイルス５ベクターより発現される非最適化ＥＰＯの両方に比較して、増加パーセントのピーク発現レベルを延長された時間の間維持する（図３及び４）。

[00135] １つの態様において、用語「遺伝子」は、特定のタンパク質として発現されることが可能である核酸断片を意味し、コーディング配列に先行する調節配列（５'ノンコーディング配列）とそれに続く調節配列（３'ノンコーディング配列）が含まれる。「ネイティブ遺伝子」は、それ自身の調節配列とともに天然に見出される遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」は、天然で一緒には見出されない調節配列とコーディング配列を含んでなる、ネイティブ遺伝子ではないあらゆる遺伝子を意味する。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列とコーディング配列、又は同じ供給源に由来するが、天然に見出されるものとは異なるやり方で配置されている調節配列とコーディング配列を含んでよい。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中の本来の位置にあるネイティブ遺伝子を意味する。「外来」遺伝子は、通常は宿主生物に見出されないが、遺伝子導入により宿主生物へ導入される遺伝子を意味する。外来遺伝子は、非ネイティブ生物の中へ挿入されたネイティブ遺伝子、又はキメラ遺伝子を含む可能性がある。「トランス遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムへ導入された遺伝子である。

[00136] １つの態様において、治療用核酸は、ＲＮＡ分子（センス又はアンチセンス）、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、又はこれらの組合せ、又は他のあらゆる修飾後ポリペプチドをコードするどの遺伝子でもよい。本発明の１つの態様において、目的の遺伝子は、組織試料において天然で発現されてよい。本発明の別の態様において、組織試料は、少なくとも１つの細胞が、その細胞により天然では発現されないか、又は細胞内で改変された発現プロフィールを有する、目的の遺伝子を発現するように遺伝子工学的に処理してよい。１つの態様では、本発明の治療用核酸が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願番号１０／３７６，５０６に収載されるタンパク質のいずれもコードしてよいか、又は治療用ポリペプチドがそれであってよい。

[00137] １つの態様において、遺伝子修飾された微小器官は、遺伝子修飾された皮膚微小器官である。「皮膚」微小器官は、複数の真皮成分を含んでよく、ここで１つの態様において、真皮は、表皮の下に位置する皮膚の部分である。これらの成分は、皮膚線維芽細胞、上皮細胞、他の細胞種、毛包の基部、神経終末、汗腺及び皮脂腺、並びに血管及びリンパ管を含んでよい。１つの態様において、皮膚微小器官は、脂肪組織を含んでよく、ここで別の態様において、皮膚微小器官は、脂肪組織を含まなくてよい。前記皮膚微小器官を採取し、培養中に維持して、それを移植する方法が含まれる、皮膚微小器官に関するさらなる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願、ＷＯ２００４／０９９３６３に記載されている。

[00138] 別の態様において、本発明は、治療用ポリペプチドを必要とする被検者へ持続期間にわたり提供する方法を提供し、前記方法は、１以上の遺伝子修飾された微小器官を提供する工程（前記微小器官は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含んでなるベクターを含んでなる）；及び、前記遺伝子修飾された微小器官を前記被検者に移植する工程を含んでなり、ここで前記核酸配列は、治療用ポリペプチドをコードして、それにより治療用核酸又はポリペプチドの発現レベルは、基底レベルに対して５％より多く増加して、前記増加は、１ヶ月より多い間維持される。別の態様において、本発明は、治療用ポリペプチドを必要とする被検者へ持続期間にわたり提供する方法を提供し、前記方法は、１以上の遺伝子修飾された微小器官を提供する工程（前記微小器官は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含んでなるベクターを含んでなる）；及び、前記遺伝子修飾された微小器官を前記被検者に移植する工程を含んでなり、ここで前記核酸配列は、治療用ポリペプチドをコードして、ここで前記ベクターは、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターである。別の態様において、本発明は、治療用ポリペプチドを必要とする被検者へ持続期間にわたり提供する方法を提供し、前記方法は、１以上の遺伝子修飾された微小器官を提供する工程（前記微小器官は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含んでなるベクターを含んでなる）；及び、前記遺伝子修飾された微小器官を前記被検者に移植する工程を含んでなり、ここで前記核酸配列は、治療用ポリペプチドをコードして、ここで前記ベクターは、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターである。

[00139] 別の態様において、上記に記載の方法は、治療用核酸を必要とする被検者へ提供し、ここで治療用核酸又はポリペプチドの発現レベルは、基底レベルに対して５％より多く増加して、前記増加は、１時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１８時間、１日、又は２日より多い間維持され、ここで前記ベクターは、ヘルパー依存型アデノウイルスベクター、又はこれらの組合せである。

[00140] １つの態様において、本発明は、上記に記載の治療用製剤を提供し、ここで治療用ポリペプチドは、エリスロポエチンであるか、又はここで治療用核酸は、エリスロポエチンをコードする。別の態様において、本発明は、遺伝子修飾された微小器官を含んでなる長期持続性のエリスロポエチン製剤を提供し、前記微小器官は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含んでなるベクターを含んでなり、ここで前記核酸配列はエリスロポエチンをコードして、それにより前記製剤は、エリスロポエチンレベルを基底レベルに対して５％より多く増加させて、前記増加したエリスロポエチンレベルは、１ヶ月より多い間存続する。別の態様において、本発明は、治療用製剤を必要とする被検者へ提供する方法を提供し、ここで治療用ポリペプチドは、エリスロポエチンであるか、又はここで治療用核酸は、エリスロポエチンをコードする。別の態様において、本発明は、エリスロポエチンを必要とする被検者へ提供する方法を提供する。

[00141] 別の態様において、本発明は、エリスロポエチンを必要とする被検者へ持続期間にわたり送達する方法を提供し、前記方法は、１以上の遺伝子修飾された微小器官を提供する工程（前記微小器官は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含んでなるベクターを含んでなる）；及び、前記遺伝子修飾された微小器官を前記被検者に移植する工程を含んでなり、ここで前記核酸配列は、エリスロポエチンをコードして、それによりエリスロポエチンレベルは、基底レベルに対して５％より多く増加して、前記増加したエリスロポエチンレベルは、１ヶ月より多い間存続する。

[00142] 別の態様において、本発明は、新たな血液細胞の形成を必要とする被検者へ持続期間にわたり誘導する方法を提供し、前記方法は、１以上の遺伝子修飾された微小器官を提供する工程（前記微小器官は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含んでなるベクターを含んでなる）；及び、前記遺伝子修飾された微小器官を前記被検者に移植する工程を含んでなり、ここで前記核酸配列は、エリスロポエチンをコードして、それによりエリスロポエチンレベルは、基底レベルに対して５％より多く増加して、前記増加したエリスロポエチンレベルは、１ヶ月より多い間存続する。

[00143] １つの態様において、エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球系前駆細胞の赤血球への成熟化に関与する糖タンパク質ホルモンである。１つの態様において、エリスロポエチンは、赤血球の循環におけるレベルを調節することに必須である。天然に存在するエリスロポエチンは、腎臓及び肝臓により産生され、血中を循環して、１つの態様では、低酸素状態に応答して、骨髄における赤血球の産生を刺激する。

[00144] １つの態様において、本発明の組成物及び方法のＥＰＯは、ヒト又は動物の尿より、又は別の態様では、血漿より抽出されるＥＰＯに類似したグリコシル化パターンを含んでよい。

[00145] エリスロポエチンをコードする遺伝子の同定、クローニング、及び発現については、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７５６，３４９；５，９５５，４２２；５，６１８，６９８；５，５４７，９３３；５，６２１，０８０；５，４４１，８６８；及び４，７０３，００８号に記載されている。組換えエリスロポエチンプラスミドを含有する哺乳動物細胞の増殖を支援する細胞培地からの組換えエリスロポエチンの精製についての記載は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Lai et al. への米国特許第４，６６７，０１６号に含まれる。エリスロポエチンをコードする遺伝子で形質転換された宿主細胞からのタンパク産物の in vitro 発現を伴う遺伝子工学技術により産生される組換えエリスロポエチンは、慢性腎不全より生じる貧血を治療するために使用されてきた。現在、ＥＰＯは、腎不全の貧血、ジドブジン（ＡＺＴ）治療患者におけるＨＩＶ感染症に関連した貧血、及び癌化学療法に関連した貧血の治療に使用されている。ｒｈｕ−ＥＰＯの投与は、腎機能不全に続発する貧血の治療において定番となっていて、ここでは、徐々にヘマトクリットを回復させて輸血依存性をなくすために、週３回、５０〜７５ｕ／ｋｇの用量が与えられる。

[00146] 真核細胞により産生される多くの細胞表面及び分泌のタンパク質は、１以上のオリゴ糖基で修飾され（グリコシル化と呼ばれる）、このことは、タンパク質の安定性、分泌、及びオルガネラ局在化、並びに生物学的活性に劇的に影響を及ぼす可能性がある。１つの態様において、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列１〜１６５を有する、ヒト尿由来エリスロポエチンと組換えエリスロポエチン（哺乳動物細胞において発現される）は、ともに３つのＮ連結オリゴ糖鎖と１つのＯ連結オリゴ糖鎖を含み、これは、糖タンパク質の全分子量の約４０％を一緒に含む。１つの態様において、非グリコシル化エリスロポエチンは、グリコシル化型に比較して大きく低下した in vivo 活性を有するが、一部の in vitro 活性は保持している。１つの態様において、本発明の組成物のＥＰＯとその方法に使用のＥＰＯは、完全にグリコシル化されているが、一方、別の態様において、それらは、いくつかのグリコシル化残基を含み、一方、別の態様において、それらは、グリコシル化されていない。

[00147] １つの態様において、ＥＰＯ遺伝子は、野生型ＥＰＯ遺伝子であってよく、一方、別の態様において、ＥＰＯ遺伝子は、修飾されてよい。１つの態様において、修飾ＥＰＯ遺伝子は、最適化されてよい。

[00148] １つの態様において、ＥＰＯ遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｘ０２１５８；ＡＦ２０２３１２；ＡＦ２０２３１１；ＡＦ２０２３０９；ＡＦ２０２３１０；ＡＦ０５３３５６；ＡＦ２０２３０６；ＡＦ２０２３０７；又はＡＦ２０２３０８に示されるものに対応するか、又はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＣＡＡ２６０９５；ＡＡＦ２３１３４；ＡＡＦ１７５７２；ＡＡＦ２３１３３；ＡＡＣ７８７９１；又はＡＡＦ２３１３２に示されるものに対応するタンパク配列をコードする核酸配列を有する。別の態様において、ＥＰＯ前駆体遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０００７９９；Ｍ１１３１９；ＢＣ０９３６２８；又はＢＣ１１１９３７に示されるものに対応するか、又はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＰ＿０００７９０；ＡＡＡ５２４００；ＡＡＨ９３６２８；又はＡＡＩ１１９３８に示されるものに対応するタンパク配列をコードする核酸配列を有する。別の態様において、ＥＰＯ遺伝子は、配列番号７に提示されるような核酸配列を有し、一方、別の態様において、ＥＰＯ遺伝子は、配列番号８に提示されるようなアミノ酸配列を有する。別の態様において、ＥＰＯ遺伝子は、配列番号７に提示されるものに相同である核酸を有し、一方、別の態様において、ＥＰＯ遺伝子は、配列番号８に提示されるものに相同であるアミノ酸配列を有する。

[00149] １つの態様において、本発明の製剤は、貧血を有する被検者を治療するために使用してよい。１つの態様において、貧血は、「酸素運搬ヘモグロビンの赤血球中の量の病的欠乏状態」と定義される。貧血の症状には、疲労、日常機能を達成する能力の消失、認知機能の障害、頭痛、眩暈、胸痛及び息切れ、吐気、うつ、疼痛、又はこれらの組合せが含まれる。１つの態様において、貧血は、より不良な予後と死亡率の増加に関連する。

[00150] 貧血は、しばしば、腎臓からのエリスロポエチンの産生減少による腎不全の結果である。別の態様において、貧血は、癌浸潤、リンパ腫又は白血病、又は骨髄置換による、骨髄による赤血球（赤血球系）産生の低下により引き起こされる。貧血の他の原因は、出血又は異常な月経出血のような過度の出血による血液損失；外科療法、放射線療法、化学療法、免疫療法、又はこれらの組合せのような癌療法；癌性骨髄の浸潤又は置換；溶血の増加（これは、１つの態様において、赤血球の分解又は破壊である）；低レベルのエリスロポエチン、又はこれらの組合せを含む。１つの態様において、貧血は、ファンコニ貧血を意味し、これは、１つの態様において、骨髄不全（再生不能性貧血）と、しばしば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）をもたらす遺伝性の貧血である。別の態様において、貧血は、ダイアモンド−ブラックファン貧血、正赤血球性貧血、再生不能性貧血、鉄欠乏性貧血、ビタミン欠乏性貧血、シデロブラスト性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、慢性疾患の貧血、腎臓病及び透析時の貧血、又はこれらの組合せを意味する。別の態様において、本発明の長期持続性ＥＰＯ製剤は、糖尿病の被検者を治療するために使用される。この側面によれば、そして１つの態様において、本発明のＥＰＯ製剤は、特に、インスリン投与、経口血糖低下薬［これは、１つの態様において、スルホン尿素薬（これには、１つの態様において、特に、グルコトロール、グリブリド、グリナーゼ、及びアマリールが含まれる）；グルコファージ、チアゾリジンジオン（特に、レズリン、アクトス、及びアバンジアが含まれる）である］、又はこれらの組合せが含まれる、当該技術分野で知られている、他の糖尿病治療薬とともに使用してよい。別の態様において、本発明の長期持続性ＥＰＯ製剤は、慢性腎臓病に罹患している被検者を治療するために使用され、一方、別の態様において、末期腎疾患に罹患している被検者を治療するために使用される。別の態様において、本発明の製剤は、上記の疾患又は状態に罹患しやすい被検者のために使用される。

[00151] 本発明の製剤及び方法は、貧血の原因にかかわらず、そして貧血の原因が知られていてもいなくても、貧血を治療するために使用してよいと理解されたい。
[00152] １つの態様において、本発明の製剤及び方法は、貧血を治療するのに有効である他の治療薬とともに投与してよい。１つの態様において、他の治療薬には、鉄分サプリメント、ビタミンＢ１２サプリメント、追加のエリスロポエチン供給源、アンドロゲン、Ｇ−ＣＳＦのような増殖因子、又はこれらの組合せが含まれる。別の態様において、本発明の製剤及び方法は、血液や骨髄幹細胞移植組織片のような他の治療法と一緒に投与してよい。

[00153] １つの態様において、本発明は、上記に記載のような治療用製剤を提供し、ここで治療用ポリペプチドは、インターフェロンであるか、又はここで治療用核酸は、インターフェロンをコードし、それは、１つの態様において、インターフェロンαであり、それは、１つの態様において、インターフェロンα２ａである。別の態様において、本発明は、遺伝子修飾された微小器官を含んでなる長期持続性のインターフェロンα製剤を提供し、前記微小器官は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含んでなるベクターを含んでなり、ここで前記核酸配列は、インターフェロンαをコードして、それにより前記製剤は、インターフェロンαレベルを基底レベルに対して５％より多く増加させて、前記増加したインターフェロンαレベルは、１ヶ月より多い間存続する。別の態様において、本発明は、治療用製剤を必要とする被検者へ提供する方法を提供し、ここで治療用ポリペプチドは、インターフェロンであるか、又はここで治療用核酸は、インターフェロンをコードし、それは、１つの態様において、インターフェロンαであり、それは、１つの態様において、インターフェロンα２ａである。別の態様において、本発明は、インターフェロン（それは、１つの態様において、インターフェロンαであり、それは、１つの態様において、インターフェロンα２ａである）である治療用ポリペプチドを必要とする被検者へ提供する方法を提供する。

[00154] １つの態様において、インターフェロンは、抗ウイルス、抗増殖、及び抗炎症効果のような多面的効果を細胞に対して産生することが可能である多機能性サイトカインである。インターフェロンに対するこれらの細胞応答のために、インターフェロンαとインターフェロンβは、多発性硬化症、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、及び癌の数形態のような、ウイルス性、増殖性、及び炎症性の疾患の治療に臨床上有用であることが見出されてきた。インターフェロン療法はまた、他の炎症性疾患、ウイルス性疾患、及び増殖性疾患の治療への潜在的な使用を有するかもしれない。このように、インターフェロンを必要とする被検者は、上記の疾患又は状態の１つ又は全部を有する場合がある。

[00155] インターフェロンの３種の主要クラス：アルファ（α）、ベータ（β）、及びガンマ（γ）がある。その抗ウイルス及び抗腫瘍の特性とは別に、インターフェロンは、マクロファージとナチュラルキラーリンパ球を活性化して、主要組織適合性複合体、糖タンパク質クラスＩ及びＩＩを増強する。インターフェロンαは、白血球（Ｂ細胞及びＴ細胞）により分泌される。インターフェロンβは、線維芽細胞により分泌されて、インターフェロンγは、Ｔ細胞とナチュラルキラーリンパ球により分泌される。

[00156] １つの態様において、治療用ポリペプチドは、インターフェロンαであり、別の態様において、インターフェロンβであり、又は別の態様において、インターフェロンγである。別の態様において、治療用ポリペプチドは、インターフェロンαのどのサブタイプでもよく、限定されないが、１、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１６、１７、又は２１が含まれる。別の態様において、治療用ポリペプチドは、インターフェロンω、ε、κ、又はこれらの相同体である。別の態様において、治療用ポリペプチドは、インターフェロンλ、又はその相同体である。別の態様において、治療用ポリペプチドは、インターフェロンλのどのサブタイプでもよく、限定されないが、インターロイキン（ＩＬ）２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、又はＩＬ２９が含まれる。別の態様において、治療用ポリペプチドは、インターフェロンζ、ν、τ、δ、又はこれらの相同体である。

[00157] １つの態様において、ＩＦＮは、特定の細胞表面受容体複合体へ結合し、それは、１つの態様において、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２の鎖を含んでなるインターフェロンα受容体（ＩＦＮＡＲ）であり、別の態様において、２つのＩＦＮＧＲ１と２つのＩＦＮＧＲ２サブユニットを含むインターフェロンγ受容体（ＩＦＮＧＲ）複合体であり、別の態様において、ＩＬ１０Ｒ２及びＩＦＮＬＲ１を含んでなる受容体複合体である。１つの態様において、インターフェロンは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を通してシグナル伝達する。

[00158] １つの態様において、本発明の製剤及び方法のインターフェロンは、インターフェロンαである。別の態様において、本発明の製剤及び方法のインターフェロンは、インターフェロンα２ｂである。１つの態様において、ＩＦＮα２ｂは、ヒト白血球由来のＩＦＮα２ｂの遺伝子を含んでなる、組換え、非グリコシル化１６５アミノ酸のαインターフェロンのタンパク質である。ＩＦＮα２ｂは、１９，２７１ダルトン（１９．２７１ｋＤａ）の分子量があるＩ型の水溶性インターフェロンである。１つの態様において、ＩＦＮα２ｂは、ＨＰＬＣアッセイにより測定するとき、約２．６ｘ１０^８（２億６０００万）国際単位／ｍｇの比活性を有する。

[00159] １つの態様において、ＩＦＮα２ｂは、より大きならせん状サイトカインスーパーファミリー（これには、成長ホルモン、インターロイキン、いくつかのコロニー刺激因子、及びいくつかの他の調節分子が含まれる）に属するＩ型インターフェロンの１つである。いずれも、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２として知られる細胞表面受容体複合体と相互作用すること、そして様々なシグナル伝達経路を活性化することによって、細胞活性のレギュレーターとして機能する。インターフェロンは、細胞において抗ウイルス及び抗増殖の応答を産生する。

[00160] １つの態様において、本発明の長期持続性ＩＦＮα製剤は、毛様細胞白血病、性病いぼ、カポシ肉腫、慢性非Ａ型、非Ｂ型肝炎、Ｂ型肝炎、又はこれらの組合せの予防又は治療のために使用してよい。別の態様において、本発明の長期持続性ＩＦＮα製剤は、上記の疾患又は状態の１つに罹患しやすいか、又は本明細書に記載のような感染性物質に曝露されたか又は将来曝露される被検者へ投与してよい。別の態様において、本発明の長期持続性ＩＦＮα製剤は、Ｃ型肝炎の予防又は治療に使用してよい。この側面によれば、そして１つの態様において、本発明の製剤は、他のＣ型肝炎治療薬（特に、リバビリン、インターフェロン、ＰＥＧ化インターフェロン、又はこれらの組合せが含まれる）と同時に、又は交替的に投与してよい。

[00161] 別の態様において、長期持続性ＩＦＮα製剤は、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、表在性膀胱癌、皮膚癌（特に、基底細胞癌と悪性黒色腫が含まれる）、腎細胞癌、卵巣癌、低級リンパ球性及び皮膚Ｔ細胞リンパ腫、及び神経膠腫が含まれる、多様な他の細胞増殖障害において単独で、又は化学療法剤と一緒に使用又は評価してよい。別の態様において、長期持続性ＩＦＮα製剤は、肺、結直腸、及び乳房の癌より生じる固形腫瘍の予防又は治療に、単独で、又は化学療法剤と一緒に使用してよい。別の態様において、長期持続性ＩＦＮα製剤は、多発性骨髄腫の予防又は治療に使用してよい。別の態様において、長期持続性ＩＦＮα製剤は、組織球疾患の予防又は治療に使用してよく、それは、１つの態様において、エルドハイム・チェスター病（ＥＣＤ）であり、これは、１つの態様において、身体の結合組織を攻撃して、１つの態様において、弛緩した結合組織に蓄積して、それが肥厚化及び密集化することを引き起こす、組織球の過剰産生により引き起こされる、潜在的に致命的な障害である。別の態様において、長期持続性ＩＦＮα製剤は、重篤な眼のベーチェット病の予防又は治療に使用してよい。

[00162] １つの態様において、インターフェロンα遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｋ０１９００；Ｍ１１００３；又はＭ７１２４６に示されるものに対応する核酸配列を有するか、又はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＡＡ５２７１６；ＡＡＡ５２７２４；又はＡＡＡ５２７１３に示されるものに対応するタンパク配列をコードする。１つの態様において、インターフェロンβ遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｍ２５４６０；ＡＬ３９０８８２；又はＣＨ２３６９４８に示されるものに対応する核酸配列を有するか、又はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＡＣ４１７０２；ＣＡＨ７０１６０；又はＥＡＬ２４２６５に示されるものに対応するタンパク配列をコードする。１つの態様において、インターフェロンγ遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｊ００２１９；ＡＦ５０６７４９；ＮＭ＿０００６１９；又はＸ６２４６８に示されるものに対応する核酸配列を有するか、又はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＡＢ５９５３４；ＡＡＭ２８８８５；ＮＰ＿０００６１０；又はＣＡＡ４４３２５に示されるものに対応するタンパク配列をコードする。別の態様において、インターフェロンα遺伝子は、配列番号９に提示されるような核酸配列を有し、一方、別の態様において、インターフェロンα遺伝子は、配列番号１０に提示されるようなアミノ酸配列を有する。別の態様において、インターフェロンα遺伝子は、配列番号９に提示されるものに相同である核酸を有し、一方、別の態様において、インターフェロンα遺伝子は、配列番号１０に提示されるものに相同であるアミノ酸配列を有する。

[00163] 別の態様において、本発明は、インターフェロンαを必要とする被検者へ持続期間にわたり送達する方法を提供し、該方法は、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した核酸配列を含んでなるベクターを含んでなる、１以上の遺伝子修飾された微小器官を提供する工程；及び、前記遺伝子修飾された微小器官を前記被検者に移植する工程を含んでなり、ここで前記核酸配列はインターフェロンαをコードして、それによりインターフェロンαレベルは、基底レベルに対して５％より多く増加して、前記増加したインターフェロンαレベルは、１ヶ月より多い間存続する。

[00164] １つの態様において、本発明の製剤及び方法は、核酸によりコードされる治療用ポリペプチドの増加した発現レベル、期間、又はこれらの組合せのために最適化された前記核酸を提供する。別の態様において、本発明は、配列番号１に対して８５％より大きい相同性のある核酸配列、そのような核酸配列を含んでなるベクター、及びそのようなベクターを含んでなる細胞を提供する。

[00165] 別の態様において、本発明は、配列番号２に対して８５％より大きい相同性のある核酸配列、そのような核酸配列を含んでなるベクター、及びそのようなベクターを含んでなる細胞を提供する。

[00166] あらゆる核酸配列に言及するときに本明細書において使用する用語「相同性」は、対応するネイティブ核酸配列のヌクレオチドと同一である、候補配列中のヌクレオチドの百分率を示す。

[00167] １つの態様において、用語「相同性」、「相同体」又は「相同な」は、どの場合でも、言及される配列が、１つの態様において、指定の核酸配列と少なくとも７０％の対応を明示することを示す。別の態様において、核酸配列は、指定の配列と少なくとも７２％の対応を明示する。別の態様において、核酸配列は、指定の配列と少なくとも７５％の対応を明示する。別の態様において、核酸配列は、指定の配列と少なくとも７７％の対応を明示する。別の態様において、核酸配列は、指定の配列と少なくとも８０％の対応を明示する。別の態様において、核酸配列は、指定の配列と少なくとも８２％の対応を明示する。別の態様において、核酸配列は、指定の配列と少なくとも８５％の対応を明示する。別の態様において、核酸配列は、指定の配列と少なくとも８７％の対応を明示する。別の態様において、核酸配列は、指定の配列と少なくとも９０％の対応を明示する。別の態様において、核酸配列は、指定の配列と少なくとも９２％の対応を明示する。別の態様において、核酸配列は、指定の配列と少なくとも９５％の対応を明示する。別の態様において、核酸配列は、指定の配列と９５％〜１００％の対応を明示する。同様に、特別な配列との対応への言及には、本明細書に定義される配列への直接対応と、並びに相同性が含まれる。

[00168] 相同性は、配列アライメントについてのコンピュータアルゴリズムによって、当該技術分野で十分記載されている方法によって決定してよい。例えば、核酸配列相同性のコンピュータアルゴリズム解析には、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｕｔｉｌｉｔｙ）、ＧＥＮＰＥＰＴ、及びＴＲＥＭＢＬのパッケージのような、利用可能な任意数のソフトウェアパッケージの利用を含めてよい。

[00169] 相同性を決定する追加の手段は、核酸配列ハイブリダイゼーションの決定によるが、この方法については当該技術分野で十分に記載されている（例えば、「Nucleic Acid Hybridization（核酸ハイブリダイゼーション）」Hames, B. D., 及び Higgins S. J., 監修(1985); Sambrook et al., 1989,「Molecular Cloning, A Laboratory Manual（分子クローニング：実験マニュアル）」（１〜３巻）コールドスプリングハーバーラボラトリー・プレス、ニューヨーク；及び、Ausubel et al., 1989,「Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最新プロトコール）」Greene Publishing Associates 及びウィリー・インターサイエンス、ニューヨークを参照のこと)。１つの態様において、ハイブリダイゼーションの方法は、中等度〜ストリンジェント条件の下で行ってよい。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、１０〜２０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中に４２℃で一晩のインキュベーションである。

[00170] １つの態様において、本発明は、微小器官を含んでなる治療用製剤とその使用の方法を提供する。１つの態様において、治療用微小器官の調製は、（ａ）複数の微小器官外植片をドナー被検者より入手すること（この複数の微小器官外植片のそれぞれは、細胞の集団を含み、複数の微小器官外植片のそれぞれは、それが由来する器官の微小構造を維持すると同時に、微小器官外植片中の不十分な栄養と老廃物の蓄積による細胞毒性と併発する死を最少化するように、十分な栄養素及びガスの微小器官外植片中の細胞への拡散と細胞老廃物の微小器官外植片から外への拡散を可能にするように選択される大きさを有する）；（ｂ）複数の遺伝子修飾された微小器官外植片を入手するように、複数の微小器官外植片を遺伝子修飾すること（前記微小器官は、少なくとも１つのアミノ酸が異なるタンパク質を含んでなり、分泌する）；及び（ｃ）複数の遺伝子修飾された微小器官外植片を複数のレシピエント被検者内に移植することを含む。

[00171] １つの態様において、治療用微小器官の調製は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許ＷＯ０３／００６６６９、ＷＯ０３／０３５８５、及びＷＯ０４／０９９３６３１に記載されるように実施する。

[00172] 微小器官の遺伝子修飾された微小器官への調製及び処理の方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００４／０９９３６３に開示されている。微小器官は、三次元の微小器官中の各細胞への栄養素及びガスの拡散と、細胞老廃物の外植片から外への十分な拡散が保証されるように規定される組織の大きさを含む。１つの態様において、最少培地中にある微小器官の体外（ex vivo）維持は、延長される時間の間継続することができて、このとき、ウイルス又は非ウイルスベクターを使用して所望の遺伝子候補物を微小器官の細胞内に取り込む、制御された体外形質導入が起きて、それにより遺伝子修飾された微小器官を創出する。

[00173] １つの態様では、下記に記載のように、ドリル及びコア針を使用して微小器官を採取する。別の態様では、皮膚をピンと張って固定してコアドリル針の挿入の間にスリットを開放するために真空を利用する採取システムを使用して、微小器官を採取する。別の態様では、皮膚組織を採取するために使用し得るどの道具も、適正なサイズの微小器官を採取するために使用してよく、限定されないが、ＰＣＴ出願ＷＯ０４／０９９３６３に記載される道具及び方法が含まれる。

[00174] 組換え核酸を微小器官内へ取り込んで遺伝子修飾された微小器官又はバイオポンプを産生することは、当該技術分野でよく知られているいくつかの方法を介して達成することができる。核酸構築体を利用して、微小器官細胞に安定的又は一過的に形質導入をすることができる。安定した形質導入において、核酸分子は、微小器官細胞ゲノム内へ組み込まれて、そのままそれは、安定して遺伝される形質を表す。一過性の形質導入では、核酸分子は、形質導入細胞中にエピソームとして維持されて、その細胞によって発現されるが、それは、ゲノムへ組み込まれてはいない。そのようなエピソームは、形質導入細胞が迅速に分裂する細胞であるときは、エピソームの喪失により一過性の発現をもたらす可能性があるか、又は形質導入細胞が非分裂細胞である場合は、長期の発現をもたらす可能性がある。

[00175] 典型的には、核酸配列は、上記に記載のような、その配列の微小器官内への導入の好ましい方法に依存して、特別なベクターの内部へサブクローン化される。所望の核酸断片を特別のベクターへサブクローン化したならば、それは、それにより組換えベクターになる。

[00176] １つの態様では、微小器官を遺伝子修飾の前と後に３２℃でインキュベートし、一方別の態様では、それらを３７℃でインキュベートする。別の態様では、微小器官を３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３８℃、３９℃、４０℃、２８℃、３０℃、３１℃、２５℃、４２℃、又は４５℃でインキュベートする。

[00177] １つの態様では、微小器官を遺伝子修飾の前と後に１０％ ＣＯ_２でインキュベートし、一方別の態様では、それらを５％ ＣＯ_２でインキュベートする。別の態様にでは、微小器官を１２％ ＣＯ_２、１５％ ＣＯ_２、１７％ ＣＯ_２、又は２０％ ＣＯ_２でインキュベートする。別の態様では、微小器官を２％ ＣＯ_２、６％ ＣＯ_２、７％ ＣＯ_２、８％ ＣＯ_２、又は９％ ＣＯ_２でインキュベートする。

[00178] 別の態様では、インキュベーション温度、ＣＯ_２濃度、又はこれらの組合せを、遺伝子修飾の前、間、及び後に、単一の温度又は濃度に保ってよく、一方、別の態様では、インキュベーション温度、ＣＯ_２濃度、又はこれらの組合せを微小器官の遺伝子修飾の前、間、及び後に、異なる点で調整してよい。

[00179] 別の態様では、微小器官を８５〜１００％の湿度（これは、１つの態様において、９５％の湿度であり、別の態様において、９０％の湿度であり、そして別の態様において、９８％の湿度である）でインキュベートする。

[00180] １つの態様において、治療用核酸又はポリペプチドのレベルは、当該技術分野で知られているどの方法でも使用して検出してよい。核酸を細胞へ導入する特別な発現ベクター系と方法の効力は、当該技術分野で定型的に使用されている標準アプローチにより評価することができる。例えば、細胞へ導入されたＤＮＡは、フィルターハイブリダイゼーション技術（例、サザンブロッティング）により検出し得て、導入ＤＮＡの転写により産生されるＲＮＡは、例えば、ノーザンブロッティング、ＲＮアーゼ保護、又は逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出し得る。遺伝子産物は、適正なアッセイによって、例えば、特異抗体を用いるような、産生タンパク質の免疫学的な検出によって、又は酵素アッセイのような、遺伝子産物の機能活性を検出する機能性アッセイによって検出することができる。１つの態様では、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、又はラジオイムノアッセイを使用して、タンパク質を検出してよい。細胞によって発現される目的の遺伝子産物が容易にはアッセイ可能でないならば、はじめに、使用する調節エレメント及びベクターへ連結したレポーター遺伝子を使用して、発現系を最適化することができる。レポーター遺伝子は、容易に検出可能である遺伝子産物をコードして、それにより、その系の効力を評価するために使用し得る。当該技術分野で使用される標準レポーター遺伝子には、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、及びヒト成長ホルモンをコードする遺伝子が含まれる。

[00181] 従って、１つの態様では、治療用ポリペプチド又は核酸の発現レベルを in vitro で測定し、一方、別の態様では、治療用ポリペプチド又は核酸の発現レベルを in vivo で測定する。１つの態様において、ポリペプチド又は核酸の発現レベル（これは、１つの態様において、ＥＰＯレベルであり、別の態様において、ＩＦＮαレベルである）の in vitro 定量は、微小器官による治療剤の in vitro 分泌レベルを定量すること；治療剤の in vitro 産生及び分泌レベルと in vivo 血清レベルの間の関係を推定すること；及び、定量された分泌レベルと推定された関係に基づいて、移植すべき治療用製剤の量を決定することを介して、患者に移植すべき微小器官の数の決定を可能にする。

[00182] 本発明の別の好ましい態様では、ポリヌクレオチド（複数）に、微小器官の細胞の内部で発現される内因性遺伝子、又は微小器官へ導入される追加の組換え遺伝子の転写又は翻訳のいずれかを調節するトランス又はシス作用エンハンサー又はサプレッサーエレメントを含めることもできる。当該技術分野では、哺乳動物細胞において活用することができる、好適な翻訳又は転写の調節エレメントの数多くの例が知られている。

[00183] 例えば、転写調節エレメントは、特異的プロモーターからの転写の活性化に必要であるシス又はトランス作用エレメントを含む［（Carey et al., (1989), J. Mol. Biol. 209: 423-432; Cress et al., (1991), Science 251: 87-90; 及び Sadowski et al., (1988), Nature 335: 5631-564)］。

[00184] 翻訳アクチベータは、カリフラワーモザイクウイルス翻訳アクチベータ（ＴＡＶ）により例示される［例えば、Futterer and Hohn, (1991), EMBO J. 10: 3887-3896 を参照のこと］。この系では、バイシストロニックｍＲＮＡが産生される。即ち、同じプロモーターより同じｍＲＮＡにおいて２つのコーディング領域が転写されるのである。ＴＡＶの非存在時には、第一のシストロンだけがリボソームにより翻訳されるが、ＴＡＶを発現する細胞では、両方のシストロンが翻訳される。

[00185] シス作用調節エレメントのポリヌクレオチド配列は、一般的に実践される遺伝子ノックイン技術を介して微小器官の細胞へ導入することができる。遺伝子ノックイン／アウトの方法論の概説については、例えば、米国特許第５，４８７，９９２、５，４６４，７６４、５，３８７，７４２、５，３６０，７３５、５，３４７，０７５、５，２９８，４２２、５，２８８，８４６、５，２２１，７７８、５，１７５，３８５、５，１７５，３８４、５，１７５，３８３、４，７３６，８６６号、並びに Burke and Olson, Methods in Enzymology, 194:251-270, 1991; Capecchi, Science 244:1288-1292, 1989; Davies et al., Nucleic Acids Research, 20 (11) 2693-2698, 1992; Dickinson et al., Human Molecular Genetics, 2(8):1299-1302, 1993; Duff and Lincoln,「Insertion of a pathogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the human APP gene and expression in ES cells（ヒトＡＰＰ遺伝子を含有する酵母人工染色体への病原性突然変異の挿入とＥＳ細胞中での発現）」, Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders, 1995; Huxley et al., Genomics, 9:742-750 1991; Jakobovits et al., Nature, 362:255-261 1993; Lamb et al., Nature Genetics, 5: 22-29, 1993; Pearson and Choi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:10578-82; Rothstein, Method in Enzymology, 194:281-301, 1991; Schedl et al., Nature, 362: 258-261, 1993; Strauss et al., Science, 259:1904-1907, 1993 を参照のこと。ＷＯ９４／２３０４９、ＷＯ９３／１４２００、ＷＯ９４／０６９０８、及びＷＯ９４／２８１２３も、情報を提供する。

[00186] 組換え産物の産生を専ら評価するには、内因性配列のダウンレギュレーションも望ましいかもしれない。この目的のために、アンチセンスＲＮＡを内因性配列の不活性化の手段として利用してよい。内因性ｍＲＮＡ配列に相補的な配列をコードする外因性ポリヌクレオチド（複数）が微小器官の細胞内で転写される。ダウンレギュレーションは、当該技術分野でよく知られている実践である、遺伝子ノックアウト技術を介しても有効にし得る（「Molecular Cloning: A laboratory Manual（分子クローニング：実験マニュアル）」 Sambrook et al., (1989);「Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最新プロトコール）」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ausubel, R. M., 監修 (1994); Ausubel et al., 「Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最新プロトコール）」, ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、メリーランド州ボルチモア (1989); Perbal,「A Practical Guide to Molecular Cloning（分子クローニングへの実践ガイド）」, ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク (1988))。

[00187] 組換え産物の過剰発現も、望まれるかもしれない。過剰発現は、高いコピー数の１以上のコーディング配列をそれぞれのベクター中に提供することによって達成してよい。これらの外因性ポリヌクレオチド配列は、哺乳動物発現ベクターの好適なプロモーターの転写制御下に置いて、その発現を調節することができる。別の態様では、同じ遺伝子又はいくつかの関連遺伝子の多数のコピーを、ポリペプチド又は核酸の発現を増加させる手段として使用してよい。１つの態様では、ＤＮＡエレメント（これは、１つの態様において、マトリックス関連領域（ＭＡＲ）又はスカフォルド関連領域（ＳＡＲ）である）によって発現を安定化させる。

[00188] １つの態様において、アデノウイルスベクターは、本発明の組成物とその方法に使用のベクターである。ベクターとしてアデノウイルスベクターを使用する態様では、１つの態様においてヘルパー依存型アデノウイルス系を使用して、微小器官を形質転換するための治療用ポリペプチド又は核酸発現性のヘルパー依存型アデノウイルスベクターを調製してよい。１つの態様において、そのようなヘルパー依存型アデノウイルス系は、ヘルパー依存型アデノウイルス、ヘルパーウイルスを含み、本発明の製剤の調製に使用する産生細胞系は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Palmer and Ng, 2003 Mol Ther 8: 846 と Palmer and Ng, 2004 Mol Ther 10: 792 に記載される通りである。

[00189] １つの態様では、ヒト胚性腎細胞よりＡｄ５ ＤＮＡ断片により形質転換されて、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する、２９３と呼称されるヘルパー細胞系を使用して、複製欠損アデノウイルスベクターを産生して増殖させる。別の態様において、ヘルパー細胞系は、ヒトの筋肉細胞、造血細胞、又は他のヒト胚の間葉系細胞又は上皮細胞に由来してよい。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスが許容される他の哺乳動物種の細胞に由来してよい。そのような細胞には、例えば、ヴェロ細胞又は他のサル胚の間葉系細胞又は上皮細胞が含まれる。

[00190] １つの態様では、微小器官を体外である期間の間維持し、これは、数時間〜数ヶ月に及んでよい。１つの態様では、それらを数日間維持して、別の態様では、移植前の数週間維持する。理論により制限されなければ、１つの態様において、前記インキュベーションは、１つの態様において、ウイルスベクター形質導入の結果として存在するウイルスカプシドである、ウイルスタンパク質を細胞が処理して破壊することを可能にする。１つの態様では、カプシドタンパク質のそのような代謝回転が２〜３日以内に起こるので、１つの態様において、ウイルスカプシドタンパク質は、１０日目までに、体外にあるとしてもほとんど残っていない。１つの態様において、ウイルスカプシドの破壊は、本発明の製剤の免疫原性をさらに低下させて、目的の単数又は複数の遺伝子の発現レベルと発現期間を増加させる。別の態様において、前記インキュベーションは、初期ＨＤ−Ａｄベクター誘発性の生来の免疫応答が in vitro で起こることを可能にして、それは、１つの態様において、アデノ遺伝子転写の非存在時には、２４時間以上は存続しない。別の態様において、通常は転写コンピテントの第一世代Ａｄベクターの投与に後続する、後期の適応応答（これは、１つの態様においてリンパ球浸潤を、そして別の態様においてＡｄ特異的ＣＴＬの誘導を主に特徴とする）は、Ｈｄ−Ａｄベクターにより誘発され得ない。

[00191] １つの態様では、体外の微小器官を１．６〜３ｘ１０^９感染粒子（ｉｐ）／ｍｌ、３〜４ｘ１０^１２ウイルス粒子／ｍｌ、又は２ｘ１０^１１ウイルス粒子／ｍｌの投与量でウイルスベクターへ曝露する。別の態様では、体外の微小器官を１ｘ１０^３〜１ｘ１０^１２ウイルス粒子／ｍｌ、別の態様では１ｘ１０^３〜１ｘ１０^９、そして別の態様では１ｘ１０^６〜１ｘ１０^９、そして別の態様では１ｘ１０^６〜１ｘ１０^１２ウイルス粒子／ｍｌの投与量でウイルスベクターへ曝露する。１つの態様において、微小器官内で被検者へ投与されるウイルス粒子／ｇ（被検者の体重）の投与量は、１ｘ１０^３未満、そして別の態様において１ｘ１０^２未満、そして別の態様において１ｘ１０^１ウイルス粒子／ｇ（被検者の体重）未満である。

[00192] １つの態様では、増殖因子を使用して、微小器官中の細胞の数を増加させる。
[00193] １つの態様では、in vitro 発現を移植に先立って評価し得て、発現される組換えタンパク質の in vitro 対 in vivo 相関性試験の可能性を可能にする。

[00194] 本発明のいくつかの態様において、移植すべき遺伝子修飾細胞（複数）が含まれる組織試料の量は、以下の１以上より決定する：類似の被検者についての規制ガイドライン、特定の臨床プロトコール、又は集団統計に基づいてそのような被検者へ定型的に投与される目的の治療剤の対応量、目的のタンパク質のような治療剤の、特に同じ被検者に対する対応量（彼／彼女がそれを注射又は他の経路を介してすでに受けていた場合）、体重、年齢、身体状態、臨床状況のような被検者データ、過去の組織試料由来の薬物動態データ（他の類似の被検者への遺伝子修飾細胞の投与が含まれる）、過去の組織試料に対する応答（その被検者への遺伝子修飾細胞の投与が含まれる）、又はこれらの組合せ。従って、１つの態様では、１以上の微小器官による遺伝子産物の発現のレベルを in vitro で決定し、in vitro 及び in vivo の治療用ポリペプチド又は核酸の発現レベルの間の関係を決定又は推定して、その計算又は推定した関係に基づいて、特別な患者に移植すべき微小器官の数を決定する。治療剤の投与量は、すでに記載のように調整してよい（ＷＯ２００４／０９９３６３）。

[00195] １つの態様において、微小器官又は遺伝子修飾された微小器官は、それらが宿主への移植のために必要とされるまで、指定の期間の間 in vitro で維持してよい。１つの態様では、微小器官又は遺伝子修飾された微小器官を１〜７日の間、１〜８週間の間、又は１〜４ヶ月の間、培養で維持又は保存してよい。別の態様では、組織試料を囲む上清培地に残った治療剤を単離して、同じであるか又は異なる被検者へ注射又は適用することができる。

[00196] あるいは、又は追加的に、遺伝子修飾された微小器官は、当該技術分野で知られている方法［例えば、限定なしに、組織試料から生成した直後又は遺伝子改変の直後の１０％ ＤＭＳＯ含有ＤＭＥＭ中での漸次凍結（０℃、−２０℃、−８０℃、−１９６℃）］によって、低温で保存することができる。

[00197] １つの態様において、本発明の製剤は、所望の部位での微小器官の局在化をもたらす方法又は経路によって、治療されるか又は予防される疾患又は障害によって影響を受ける器官又は系に移植してよい。別の態様において、移植される製剤の位置は、疾患又は障害により影響を受ける器官又は系より遠位にあってよい。従って、１つの態様において、組換えタンパク質は、局所的に放出される一方、別の態様において、組換えタンパク質は、リンパ系へ拡散し、それは、１つの態様において、最終的には、組換えタンパク質の全身分布をもたらす場合がある。このように、本発明は、必要とする被検者のどの部分でも発露される疾患又は障害を治療するために、治療用製剤の様々な濃度での使用を提供する。

[00198] この側面によれば、そして１つの態様において、本発明の製剤は、腫瘍内に移植してよい。別の態様では、腫瘍（これは、１つの態様において、特別な種類の腫瘍の転移に関連する）から遠い部位に製剤を移植してよい。別の態様において、本発明の製剤は、被検者の腎臓へ移植してよく、これは、１つの態様において、被膜下移植である。別の態様では、本発明の製剤を腹腔鏡により移植する。

[00199] １つの態様において、本発明の製剤は、一過性状態の急性治療用に一回移植してよく、また特に進行性、再発性、又は退行性の疾患の場合は、１回より多く移植してよい。１つの態様では、本発明の１以上の製剤を同時に投与してよく、また別の態様では、それらを交互交替的な形式で投与してよい。１つの態様において、交互交替的な形式は、疾患の段階又はフェーズにより決定してよい。

[00200] １つの態様では、微小器官の細胞の少なくとも一部が生きたままであるようなやり方で、微小器官を被検者の所望の場所に移植する。本発明の１つの態様では、少なくとも約５％、本発明の別の態様では、少なくとも約１０％、本発明の別の態様では、少なくとも約２０％、本発明の別の態様では、少なくとも約３０％、本発明の別の態様では、少なくとも約４０％、そして本発明の別の態様では、少なくとも約５０％以上の細胞が被検者への投与の後で生きたままである。その細胞の被検者への投与後の生存期間は、数時間（例、２４時間）〜数日ほどに短くても、数週〜数ヶ月又は数年ほどに長くてもよい。

[00201] レシピエント被検者内への微小器官移植は、組換え産物の持続投与量を提供する。微小器官は、移植に先立って、例えば、移植組織内での血管の形成を促進する、宿主内への効率的な取込みのために調製してよい。故に、組換え産物は、産生に続いて、レシピエントの末梢循環へすぐに送達してよい。あるいは、微小器官は、移植に先立って、宿主内での細胞接着と効率取込みを防ぐように調製してよい。血管形成を防ぐ方法の例には、市販されているシルク又はナイロン製の細胞非透過性、直径制限性の生体用メッシュバッグ、又は例えば、ＧＯＲＥ−ＴＥＸバッグ（Terrill PJ, Kedwards SM, and Lawrence JC. (1991)「The use of GORE-TEX bags for hand burns（ＧＯＲＥ−ＴＥＸバッグの手の熱傷への使用）」Burns 17(2): 161-5）のような他のバッグ、又は細胞接着を妨げる材料（例えば、Ｔｅｆｌｏｎ）でコートした他の有孔膜の内部に微小器官を封入することが含まれる。

[00202] 次いで、微小器官により産生される遺伝子産物は、例えば、化合物（例、薬物、タンパク様の生物医薬品が含まれる）の制御送達用に設計されたポリマーデバイスを介して送達することができる。生物分解性ポリマーと非分解性ポリマーがともに含まれる多様な生体適合性ポリマー（ヒドロゲルが含まれる）を使用して、本発明で考慮する微小器官の遺伝子産物の特定の標的部位での持続放出のための移植組織片を生成することができる。そのような移植組織片の産生は、当該技術分野で一般的に知られている（例えば、「Concise Encyclopedia of Medical & Dental Materials（医科・歯科用材料要覧）」David Williams 監修（ＭＩＴプレス：マサチューセッツ州ケンブリッジ、1990）；Sabel et al．米国特許第４，８８３，６６６号；Aebischer et al．米国特許第４，８９２，５３８号；Aebischer et al．米国特許第５，１０６，６２７号；Lim 米国特許第４，３９１，９０９号；及び Sefton 米国特許第４，３５３，８８８号を参照のこと）。

[00203] 本発明による遺伝子修飾された微小器官の移植は、標準的な外科技術により、又は、微小器官の投与に適したゲージ針を利用する特別仕様シリンジを活用して、哺乳動物の企図される組織領域へ微小器官調製物を注射することにより実効することができる。別の態様では、移植する微小器官のためにカテーテルを利用する。１つの態様において、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０４／０９９３６３に記載の移植法のいずれも使用してよく、本発明の態様として考慮される。

[00204] １つの態様では、微小器官を皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、又は胃内に移植する。１つの態様において、用語「移植」には、分層又は全層の皮膚移植片として移植されることは含まれない。本発明の１つの態様において、移植に活用されるドナー微小器官は、好ましくは、レシピエント哺乳動物（即ち、自己）又は同系哺乳動物の器官組織より調製するが、移植片拒絶又及び／又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を回避するような手段が移植の前に、又はその間に講じられるのであれば、同種異系及び異種の組織も微小器官の調製に活用することができる。本明細書に使用するように、ＧＶＨＤは、移植片対宿主病を意味し、レシピエント宿主に対する移植免疫応答により引き起こされる組織移植（移植片）の結果である。より具体的には、移植片対宿主病は、レシピエントを異物であると認識して、レシピエントの細胞を攻撃するドナーＴリンパ球（Ｔ細胞）によって引き起こされる。移植片拒絶又はＧＶＨＤを予防又は軽減するための数多くの方法が当該技術分野で知られていて、本発明の方法において使用してよい。１つの態様において、宿主による免疫学的攻撃を受ける場合がある（例えば、ブタ−ヒト移植のような異種間の移植を使用する場合）組織内の細胞集団の移植を促進するために、微小器官は、再生可能な非生物分解性又は生物分解性デバイスのような生体適合性の免疫保護化材料へ挿入するか又はそれにより被包化してから、レシピエント被検者へ移植してよい。

[00205] 別の態様において、移植に活用されるドナー微小器官は、好ましくは、レシピエントと適合したヒト白血球抗原（ＨＬＡ）であるドナーより調製し、ここで、１つの態様において、ＨＬＡは、ヒトの主要組織適合性複合体である。１つの態様において、ドナーとレシピエントは、クラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）遺伝子、クラスＩＩ ＭＨＣ遺伝子、又はこれらの組合せについて適合している。１つの態様において、クラスＩ ＭＨＣ遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃを含み、ここで１つの態様において、クラスＩ ＭＨＣ遺伝子の不適合は、移植片拒絶のリスクを増加させ、そして１つの態様において、クラスＩＩ ＭＨＣ遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１を含み、ここで１つの態様において、クラスＩＩ ＭＨＣ遺伝子の不適合は、ＧＶＨＤのリスクを増加させる。別の態様において、ドナーとレシピエントは、ＨＬＡ−ＤＭ及びＨＬＡ−ＤＯの遺伝子について適合している。

[00206] １つの態様では、理学的な方法（これは、１つの態様において、加熱、抗ウイルス剤、細胞によるウイルス代謝回転を刺激する薬剤、等の使用である）のような、当該技術分野で知られている技術により、ウイルスの代謝回転又は体外細胞からの消失を高める。

[00207] １つの態様において、本発明の長期持続性の製剤は、核酸又はポリペプチド発現のレベル及び期間を増加させる一方で、核酸又はポリペプチドの発現のレベルは、無限に上昇したままではない。理論により制限されなければ、１つの態様において、本発明の長期持続性の製剤により発現される核酸又はポリペプチドのレベルは、組換え核酸又はポリペプチドを発現する分化した皮膚線維芽細胞の死の結果として、時間の関数として減少する場合がある。

実験の材料及び方法
材料及び機器のリスト
[00208] 微小器官を増殖させるのに使用した産生培地は、１％グルタミンを含んでなり、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＲＡＦＡ ｌａｂｓ，注射用）及び０．１％アンホテリシンＢ（ＢＭＳ，Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ Ｉ．Ｖ．）を補充したＤＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ培地（高グルコース４，５００ｍｇ／Ｌ及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ；Hi-Clone カタログ番号：ＳＨ３Ａ１４４８．０２）（培地中の最終濃度：２．５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ）を含む。いくつかの実験では、１０％血清代用サプリメント（ＳＳＳ，Irvine Scientific，カタログ番号９９１９３）、１０％自己ヒト血清、又は１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ又はＦＣＳ）を産生培地へ加えた。

皮膚微小器官を採取すること−同心針の方法
[00209] ドナー下腹部領域由来の皮膚部分よりヒト皮膚微小器官を採取した。表皮の採取を防ぐために、角質層を通って真皮へ入る浅いスリット（１〜２ｍｍの深さ）を、微小器官を採取すべき皮膚領域の片側で直線に沿って切って、同様のスリットを第一スリットから３０ｍｍ離して、それと平行に切った。このスリット間の距離は、微小器官の長さを決定して、実験を通して一定であった。

[00210] 滅菌生理食塩水を充填した１ｍｌシリンジ付きの薄ゲージ（典型的には、２２ＧＡ）皮下針を第一スリットで曝露した真皮へ挿入して、採取部位の真皮に沿って反対のスリットへ向かって滑らせて、針は、それが真皮を貫いて反対のスリットで出るように、必要な角度をつけた。

[00211] 次に、ガイド針の長さに沿った外皮を外科用鉗子でつまむ。真皮に埋め込んだ針をやや持ち上げて、それを囲む皮膚の領域を上昇させて、かぎ形状のデバイスを挿入皮下針の点の下で時々使用して、皮膚を持ち上げることに役立てた後でそれをつまむ。出口の点より突出しているガイド針の先端をコア針（直径１〜３ｍｍ，Point Technologies，コロラド州、アメリカ）の鋭い先端へ挿入して、これを市販のドリル（Aesculap Micro Speed ＧＤ ６５０，ＧＤ ６５７のような）により支える。少量の滅菌生理食塩水をそのシリンジからコア針へ注入する。ドリルを作動させてコア針を高速（典型的には、３０００〜７０００ＲＰＭ）で回転させて、回転の間に、ドリルとコア針をガイド針の軸に沿って前方へ手動圧迫して、コア針の内径にほぼ等しい外径を有する３０〜４０ｍｍ長の円柱状の皮膚コア（皮膚微小器官）を切断する。この皮膚微小器官は、通常、ガイド針へ付着したままであり、これをコア針内部より引き出して、産生培地（上記に記載のような）に入れて、コア針を皮膚より外す。

[00212] ピンセットを使用して、１０００μｌの産生培地を含有する２４ウェルプレート中の標識した単一ウェルへ各微小器官を移す。残滓を除去するために、各微小器官につき２回の追加の１０００μｌの培地交換を実施する。次いで、１０００μｌの産生培地に微小器官を含有するプレートを、３２℃、１０％ ＣＯ_２、及び約９５％湿度へ平衡化したインキュベーターへ２４時間の回復期の間移す。

ウイルス形質導入
[00213] 各微小器官を形質導入のために、ウイルスを保存するのにより少ない総液量を必要とする少量ウェルを有する４８ウェルプレートのウェルへ移した。内側の微小器官を乱すことなく、培地を各ウェルから慎重に除去した。前臨床実験の間に、３つの異なるベクターについて試験した：第一世代アデノウイルス（Molecular Medicine）の１．６〜３ｘ１０^９個の感染粒子（ｉｐ）／ｍｌ、ヘルパー依存型アデノウイルス（Baylor）のほぼ３〜４ｘ１０^１２個のウイルス粒子／ｍｌ、又はアデノ関連ウイルス（ペンシルヴェニア大学）のほぼ２ｘ１０^１１個のウイルス粒子／ｍｌ。それぞれ、組換えヒトＥＰＯ遺伝子、最適化組換えヒトＥＰＯ遺伝子、又は最適化ＩＦＮα遺伝子を含んでなり、ＦＣＳを含むか又は含まないＤＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ（Gibco カタログ番号４２４３０−０２５）においてそれぞれ１：１０、１：２５、１：５０、１：１００、１：５００、又は１：１０００で希釈した。４８ウェルプレートの各ウェルを、希釈力価のウイルスの１つの１００μＬで満たした。このプレートをＣＯ_２インキュベーターに入れて、デジタル式マイクロタイターシェーカーでの３００ｒｐｍで２時間の振り混ぜと振り混ぜなしでさらに１６〜２２時間のインキュベーションによって形質導入を支援した。

[00214] 形質導入した微小器官を形質導入後に２４ウェルプレートへ移してから、１ｍＬ産生培地（ＦＣＳを含まない）で３回洗浄して、非形質導入ウイルス粒子を除去した。洗浄後、このバイオポンプを、標準の高湿度ＣＯ_２インキュベーターにおいて、湿度９５％、１０％ ＣＯ_２、及び３２℃で、１ｍＬ産生培地に維持した。ウイルスベクターの除去から７２時間後、産生培地を新鮮培地に置き換えて、消費した培地のアリコートについて、分泌された組換えタンパク質レベルをアッセイした。

体外の微小器官維持
[00215] ３〜４日ごとに、使用済みの産生培地を採取して、バイオポンプの生存能力とともに、分泌される組換えタンパク質のレベルとグルコースレベルを評価した。新鮮な産生培地を２４ウェルプレートへ加えた。

分泌タンパク質の測定
[00216] ヒトＥＰＯ（ｈＥＰＯ）及びＩＦＮαの濃度及び分泌レベルについて、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）キット（Quantikine ヒトエリスロポエチン；R＆D Systems；ヒトインターフェロンα ＥＬＩＳＡキット、PBL Biomedical Laboratories）を製造業者の製品説明書に従って使用してアッセイした。

グルコース測定
[00217] シグマ−アルドリッチ社のＧＡＧＯ２０グルコース（ＧＯ）アッセイキットを製造業者の製品説明書に従って使用して、組織グルコース消費を評価した。

ヘマトクリット測定
[00218] シグマ−アルドリッチ社のＧＡＧＯ２０グルコース（ＧＯ）アッセイキットを製造業者の製品説明書に従って使用して、組織グルコース消費を評価した。

[00219] 遠心分離を使用し、当該技術分野で知られている、米国臨床検査標準委員会（ＮＣＣＬＳ）により推奨される標準法を使用して、ヘマトクリットレベルをアッセイした。ヘマトクリットを定量するために、試験管中の全血を１０〜１５，０００ｘｇで５分間遠心分離して、赤血球細胞をペレットにし（パック赤血球と呼ばれる）、グラフィック読取りデバイスを１０分以内の遠心分離で用いて、毛細管中の試料の全長に対するパック赤血球の柱の比率を測定した。

微小器官移植
[00220] いくつかの実験において、組織グルコース消費をアッセイして微小器官が生存可能であることを確かめた後で、遺伝子修飾又は対照の微小器官を重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに皮下移植した。約２５グラムの重量の雄性及び雌性のＳＣＩＤマウスを１４０μｌの希釈したＫｅｔａｓｅｔ（ケタミンＨＣｌ）（４００μｌのＫｅｔａｓｅｔと６００μｌの生理食塩水）で麻酔して、対照又はＥＰＯ発現性微小器官を微小器官形質導入から１０日後に皮下移植した。

実施例１
ＧＭＭＯにより in vitro で産生されるＥＰＯ及びＩＦＮαのレベル
[00221] 微小器官を上記のように調製して、ＣＡＧプロモーターへ連結した最適化ＩＦＮα遺伝子を発現するヘルパー依存型アデノウイルスベクターで形質導入した。次いで、ＧＭＭＯを培養で維持して、産生されるＩＦＮαのレベルをＥＬＩＳＡによって評価した。最適化ＩＦＮα発現性微小器官は、採取後少なくとも４０日間、１０００ｎｇ／日より多いＩＦＮαを in vitro で産生し（図１）、組換えｈＥＰＯ発現性微小器官は、採取後少なくとも１４２日間、１０００ｎｇ／日より多いｈＥＰＯを in vitro で産生した（図２Ａ〜Ｂ）。

[00222] 最適化ｈＥＰＯをコードする無実質アデノウイルスベクターを含んでなるＧＭＭＯは、ｈＥＰＯをコードするアデノウイルス−５ベクターを含んでなる微小器官に比較して、２００日以上の間、より高い百分率のピーク発現を維持した（図３）。最適化ｈＥＰＯをコードする無実質アデノウイルスベクターを含んでなる微小器官も、非最適化ｈＥＰＯをコードする無実質アデノウイルスベクターを含んでなる微小器官より長い期間の間、より高い百分率のピーク発現を維持した（図４）。最後に、ＣＡＧプロモーターの下流にｈＥＰＯをコードする無実質アデノウイルスベクターを含んでなる微小器官は、ＣＭＶプロモーターの下流にｈＥＰＯをコードする無実質アデノウイルスベクターを含んでなる微小器官に比較して、より高いレベルのｈＥＰＯ発現を示し、これは、形質導入後の日数を関数として、より顕著になった（図５）。

実施例２
ヒトＥＰＯ発現性ＧＭＭＯにより産生されるＥＰＯレベルは、in vitro と移植ＳＣＩＤマウスの血清において維持された
[00223] ＥＰＯ発現性微小器官を上記のように調製した。全９日間の培養の後で、各微小器官により産生されたＥＰＯの量を測定し、この数値を使用して、同等レベルのＥＰＯを発現する微小器官を各マウスに移植することを決定した。１０日目に、２つの微小器官を各ＳＣＩＤマウスに皮下移植すると、１０日後の１回目の測定時には、ＳＣＩＤマウスの血清で測定したレベルは、ベースラインレベルを有意に超えていた。このレベルは、移植後少なくとも２１６日間は高いままであって、ＳＣＩＤマウスのヘマトクリットレベルを少なくとも１５７日間は有意に上昇させた（図６Ａ）。移植したＥＰＯ発現性微小器官と同時に同じドナーより産生したが in vitro で維持した非移植ＥＰＯ発現性微小器官も、高レベルのＥＰＯ産生を継続的に維持した（図６Ｂ）。最適化ｈＥＰＯ遺伝子を含んでなるベクターで形質導入した微小器官は、組換えｈＥＰＯ遺伝子で形質導入したものより高いレベルのＥＰＯを in vivo（図６Ａ）と in vitro（図６Ｂ）でともに産生した。ＥＰＯ非産生微小器官を移植した対照ＳＣＩＤマウスは、移植前に比較して微小器官移植後に、血清ＥＰＯレベルの増加も、ヘマトクリットレベルの有意な変化も示さなかった（図６Ａ）。陽性対照として使用したＥＰＯ発現性アデノウイルス−５を含んでなる微小器官は、ＥＰＯ発現性の最適化又は非最適化無実質アデノウイルスを含んでなる微小器官での１：１００の力価に比較して１：１０の力価で使用した。

実施例３
臨床試験において遺伝子修飾された微小器官を移植したヒトにおいて産生されるＥＰＯレベル
[00224] 臨床試験を、上記に記載のように微小器官を採取して遺伝子修飾する以外は、先に記載のように（Lippin et al., 2005, Blood 106(7): 2280-6，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）実施する。

[00225] 慢性腎疾患のある透析前貧血患者に本発明の持続型の自己ｈＥＰＯ−ＧＭＭＯを移植する第Ｉ相臨床試験をイスラエルで実施する。ＧＭＭＯ−ｈＥＰＯでの単回移植治療は、４〜６ヶ月の有効なＥＰＯ療法を提供することが期待される。第Ｉ／ＩＩ相のＧＭＭＯ ｈＥＰＯ試験の承認は、イスラエル厚生省により承認されて、ハダッサー（Hadassah）医療施設で実施する。必要とされる規制及び臨床上の標準に関するすべての工程は、米国ベースの臨床試験を容易にするために、ＦＤＡに準拠する。

[00226] 計画される臨床試験への準備として、必要とされる前臨床の毒性試験をＳＣＩＤマウスで実施する。上記の試験は、追加の時点を２０日より長くして、既報（Brill-Almon et al. Molecular Therapy 12(2), 274-282）のように実施する。臨床試験用のＨＤ−Ａｄ−ｈＥＰＯベクターは、患者におけるその使用に必須とされるＦＤＡガイドライン（ＧＭＰ）を遵守しているＦＤＡ ＧＭＰ適合施設において調製する。ＧＭＭＯを４〜６ヶ月移植してから、試験の終了時に除去又は切除するか、又はＰＩにより必要とされて倫理委員会の承認がなされるならば延長する。

[00227] 表１に示すように、毒性試験は、同数の雄性及び雌性被検者からなる３群のＳＣＩＤマウスを含む。ＳＣＩＤマウスの高い死亡率のために、各群に多数の動物を含める。

表１．実験デザイン

[00248] 第一群では、各動物に最大１回の皮膚３０ｍｍ ｈＥＰＯ ＧＭＭＯ又はより有望には１００〜１５０ＩＵ ＥＰＯ／日の範囲で分泌するＧＭＭＯの一部を与える。各マウスはほぼ２５グラムの重量であるので、この用量は、マウス（ｋｇ）につき４，０００〜６，０００ＩＵ／日（ヒト患者への移植が提案される最大予測用量の２５倍以上）に等しい。移植組織の大きさは、ＧＭＭＯの小サイズとその取扱い時の衝撃によりＧＭＭＯ全体の少なくとも１／４に概ね相当する。

[00249] 第二群では、各動物に最大１回の皮膚３０ｍｍ ｈＥＰＯ ＧＭＭＯ又はより有望には３００〜４５０ＩＵ ＥＰＯ／日の範囲で分泌するＧＭＭＯの一部を与える。各マウスはほぼ２５グラムの重量であるので、この用量は、マウス（ｋｇ）につき１２，０００〜１８，０００ＩＵ／日（ヒト患者への移植が提案される最大予測用量の８０〜１２０倍）以上に等しい。

[00250] 第三群、対照群では、各動物に３０ｍｍ皮膚非形質導入ＧＭＭＯの１／３（１０ｍｍ）を与える。
[00251] 投薬の根拠：ＧＭＭＯ−ｈＥＰＯ投薬は、ＧＭＭＯによって in vitro で産生されるタンパク質の実際の１日量を測定した後でＧＭＭＯの数又は大きさを調整することによって、移植前に調節する。上記に概説した実験プロトコールでは、臨床試験に用いるものに類似したウイルス力価で微小器官を形質導入して、それによりＧＭＭＯ中の細胞を類似の感染多重度へ曝露する。これらのＧＭＭＯにより産生される分泌ｈＥＰＯの典型的なレベルは、１日につき３００〜１０００ＩＵ／バイオポンプの範囲にある。故に、１．０ｃｍに対応する１／３ ＢＰと２．０ｃｍに対応する２／３ ＢＰより分泌されることが予測されるＥＰＯの最低量は、それぞれほぼ１００ＩＵと２００ＩＵである。この用量は、マウスでは、０．５ｃｍより短い断片を移植することによって低下させてよい。

[00252] 我々のかつての臨床試験の結果に基づけば、網状赤血球の持続産生と生じるヘマトクリットの上昇を引き起こすには、７０ｋｇの患者につきほぼ１５００〜３５００ＩＵ（又は１〜３のＧＭＭＯ）が十分であると予測される。従って、２５グラムのマウスに移植される単一のＧＭＭＯ又はＧＭＭＯの断片より分泌される１００ＩＵのＥＰＯは、ヒト患者に移植することを提起する最高予測用量の少なくとも２５倍以上である。従って、本試験においてＧＭＭＯの少なくとも１／４を使用することは、ＧＭＭＯ−ＥＰＯの毒性学的効果をマウスにおいて試験して臨床用量を裏付けるのに十分な安全余裕を提供する。

[00253] 我々がすでに実証したように、多数のヒト腹部皮膚試料ＧＭＭＯからのｈＥＰＯ分泌レベルは、ほぼ３００〜１０００ＩＵ／日であった。同じ皮膚試料由来のＧＭＭＯからの分泌レベルが類似しているのに対し、異なる皮膚試料間の変動性はより高かった。すでに実証したように、この投薬変動性は、ＧＭＭＯをマウスに移植する前に、移植前の in vitro 分泌レベルを測定することによって対処する。組織学を除く試験の全体は、ＧＬＰの下で行われる。組織学スライドは、専門医師会認定の病理学者により盲検で評価する。実施する検査には以下が含まれる：
[00254] 臨床徴候：毎日
[00255] 体重：隔日
[00256] 臓器重量：心臓、肝臓、腎臓、脾臓、脳、胸腺（見つけることができれば）を最終の犠牲時に定量する。

[00257] 臨床化学：最終の犠牲時。
[00258] 血液学の全体プロフィール：最終の犠牲時。血清ｈＥＰＯレベルとヘマトクリットが含まれる。

[00259] 臨床病理学：最終の犠牲時。
[00260] 組織学に含めるのは：移植部位、肝臓、腎臓、リンパ節、心臓、脾臓、骨髄、及び剖検時に見出されるあらゆる病変。骨髄検査は、最終の犠牲時に実施する。

[00261] 他のすべての臓器を将来の分析用に保存する。
[00262] 細胞の一過性の形質導入又は迅速に代謝回転する細胞が関与する他の方法とは対照的に、本発明の長期持続性のＥＰＯ製剤は、もはや複製しない細胞を含む。故に、このＥＰＯ製剤は、安定した構築体より安定したタンパク質を産生して、すでに特性決定されたタンパク質を産生し続けることが期待される。

Claims (7)

1. 遺伝子修飾された皮膚微小器官を含んでなる長期持続性の治療用製剤の製造方法であって、
   前記微小器官は、複数の真皮成分のみからなって表皮層は全く含まない生体組織であり、
   前記方法は、
   前記微小器官に、１以上の調節配列へ機能可能的に連結した治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなるヘルパー依存型アデノウイルスベクターをin vitroで形質導入するステップであって、前記ヘルパー依存型アデノウイルスベクターは、そのヘルパーウイルス成分のＥ３領域中に挿入されたスタッファーＤＮＡ含む、該ステップと、
   前記形質導入の後、前記修飾された皮膚微小器官を、前記製剤の免疫原性を低下させるために、移植の前にex vivoで維持するステップとを含み、
   前記製剤の移植は、
   ａ．前記治療用ポリペプチドの発現レベルを基底レベルに対して５％より多く増加させ、及び／または
   ｂ．機能性マーカーのレベルを基底レベルに対して５％以上増加させて、
   前記増加したレベルは、１ヶ月より長い間存続する、前記方法。
2. 前記調節配列がＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、またはＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む、請求項１の方法。
3. 前記スタッファーＤＮＡが、最小反復配列のあるノンコーディング哺乳動物ＤＮＡである、請求項１の方法。
4. 前記スタッファーＤＮＡが、ＨＰＲＴ及び／又はＣ３４６コスミド配列である、非哺乳動物ＤＮＡである、請求項１の方法。
5. 前記ヘルパー依存型アデノウイルスベクターが、アデノウイルスカプシドへの効率的なパッケージングに必要とされる２７．７ｋｂのゲノムサイズの最小要件を満たすように、前記スタッファーＤＮＡを含む、請求項１の方法。
6. 前記治療用ポリペプチドがエリスロポエチンまたはインターフェロンλである、請求項１の方法。
7. 前記治療用ポリペプチドが、配列番号１に対して８５％より多く相同である核酸配列によってコードされたエリスロポエチンである、請求項６の方法。

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