JP2017035088A - 狼瘡の同定と治療のための方法及び組成物 - Google Patents

狼瘡の同定と治療のための方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】狼瘡と関連する遺伝子バリエーションの固有の群を提供する。
【解決手段】被検体から得られた生物試料において、狼瘡を発達させるリスクを示す遺伝子シグネチャーの存在を検出することを含み、前記遺伝子シグネチャーがｒｓ２２６９３６８、ｒｓ１１５７４６３７及びｒｓ１０４８９２６５からなる群から選択された１又は複数のＳＮＰのセットを含む、方法。
【選択図】なし

Description

（関連出願についての相互参照）
本出願は、２００７年５月２１日に出願の米国特許出願第６０／９３９１５６号および２００７年１２月１２日に出願の第６１／０１３２８３号の優先権を主張する。これら特許出願とすべての参考文献の内容は、出典明記によってその全体が本明細書中に援用される。
本発明は、概して、狼瘡と関係している遺伝子多型の固有の一群、および狼瘡を発達させるリスクを評価するため、並びに狼瘡の診断と治療のための組成物と方法に関する。
狼瘡は、結合組織を攻撃する抗体を伴う自己免疫性疾患である。この疾患はほぼ１００００００人のアメリカ人、主に２０〜４０歳の女性が罹患していると推定される。狼瘡の主な様式は、全身性のもの(全身性エリテマトーデス；ＳＬＥ)である。全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)は強力な遺伝性並びに環境構成成分を有する慢性自己免疫性疾患である(例としてHochberg MC, Dubois' Lupus Erythematosus. 5th ed., Wallace DJ, Hahn BH, eds. Baltimore: Williams and Wilkins (1997)；Wakeland EK, et al., Immunity 2001;15(3): 397-408；Nath SK, et al., Curr. Opin. Immunol. 2004;16(6): 794-800を参照)。自己抗体はＳＬＥの病因に重要な役割を果たし、疾患の多様な臨床症状は、腎臓、脳および皮膚の炎症を引き起こす血管内の抗体含有免疫複合体の沈着によると共に、溶血性貧血および血小板減少症の一因となる直接的な病原性作用によるものである。ＳＬＥは一般的に、広範囲にわたる臨床特徴を有する自己免疫性結合組織疾患としての特徴があり、特に特定の人種集団からの女性に主に発症する。D' Cruz et al., Lancet (2007), 369:587-596。ＳＬＥは、抗核抗体の産生、循環する免疫複合体および補体系の活性化と関係している。ＳＬＥは、２０から６０歳の７００人に１人の女性に発症する。ＳＬＥは、いずれかの器官系に影響し、重篤な組織損傷を引き起こしうる。ＳＬＥには多くの異なる特異性の自己抗体が存在する。ＳＬＥ患者は、抗ＤＮＡ、抗Ｒｏ及び抗血小板特異性を有する自己抗体を産生する場合が多く、これらの自己抗体は糸球体腎炎、関節炎、漿膜炎、新生児の完全心ブロックおよび血液学的な異常のような疾患の臨床的な特徴を引き起こしうる。また、これらの自己抗体はおそらく中枢神経系障害に関連がある。アーバックル等は、ＳＬＥの臨床上の発症前での自己抗体の発達を記載している(Arbuckle et al. N. Engl. J. Med. 349(16): 1526-1533 (2003))。ＳＬＥを含む狼瘡の最終的な診断は容易でなく、臨床医は多因子性の兆候および症状に基づく分類手法に頼る結果となっている。Gill et al., American Family Physician (2003), 68(11): 2179-2186。
皮膚及び関節の発病から肺、心臓及び腎臓を含む内臓(腎臓疾患が一番の関心事である)へと進行するので、狼瘡を治療しなければ致命的となりうるので、狼瘡を発症するリスクの評価、及び／又は初期かつ正確な診断が特に重要となる。狼瘡は主に相次ぐ再発として現れ、その間の疾患無兆候期間が無いか、僅かである。尿中のタンパク尿の量により測定される腎臓障害は、ＳＬＥにおける病原性に関連する障害の最も急性な領域の一つであり、この疾患の死亡率及び罹患率の少なくとも５０％に上る。
狼瘡などの複雑な自己免疫性疾患の臨床管理において最も困難な試みの一つが患者の疾患の正確かつ早期の同定である。数年間にわたり、ＳＬＥ罹患の一因となる遺伝因子を同定するための多くの連鎖と候補遺伝子の研究が行われている。ＨＬＡクラスIIアレルのＤＲＢｌ ＊０３０１及びＤＲＢｌ ＊１５０１を有するハプロタイプは明らかに、疾患だけでなく核自己抗原に対する抗体の存在に関連している。例として、Goldberg MA, et al., Arthritis Rheum 1976; 19(2): 129-32；Graham RR, et al., Am J Hum Genet 2002; 71(3): 543-53；及びGraham RR, et al., Eur J Hum Genet 2007; 15(8): 823-30を参照のこと。近年、インターフェロン制御因子５(ＩＲＦ５)およびシグナル伝達性転写因子４(ＳＴＡＴ４)の変異体がＳＬＥの有意な危険因子であることが発見された。例として、Sigurdsson S, et al., Am J Hum Genet 2005; 76(3): 528-37；Graham RR, et al., Nat Genet 2006; 38(5): 550-55；Graham RR, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104(16): 6758-63；及びRemmers EF, et al., N Engl J Med 2007; 357(10): 977-86参照。ＳＬＥリスク遺伝子としてＩＲＦ５及びＳＴＡＴ４が同定されたことにより、タイプIインターフェロン経路が疾患病因の中枢であるという考えが裏付けられることとなる。例として、Ronnblom L, et al., J Exp Med 2001; 194(12): F59-63；Baechler EC, et al., Curr Opin Immunol 2004; 16(6): 801-07；Banchereau J, et al., Immunity 2006; 25(3): 383- 92；Miyagi T, et al., J Exp Med 2007; Epublication; Sept 10を参照のこと。
この目的を達成するために、患者における疾患の存在を客観的に同定する、及び／又は分類するために用いることができる分子を基にした診断方法を有することは非常に有利である。遺伝子変異又は多型は、生物のゲノムに存在する遺伝子変異である。多型には単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)がある。例として、Carlson et al., Nature 2004; 429:446-452；Bell, Nature 2004; 429:453-463；Evans & Relling, Nature 2004; 429:464-468を参照のこと。ＳＮＰは、糖尿病(Sladek et al., Nature 2007; 445: 881-828；Zeggini et al., Science 2007; Apr 26；Scott et al., Science 2007; Apr 26；及びSaxena et al., Science 2007; Apr 26)；クローン病(例としてHampe et al., Nat. Genet. 2007; Feb;39(2): 207- 11)；関節リウマチ(例として米国公開特許２００７／００３１８４８)；及び他の炎症性自己免疫性疾患(例として米国特許第６９０００１６号；米国特許第７２０５１０６号)などの深刻な疾患のリスク及び／又は存在と強く相関している。
最近まで、狼瘡などの複雑な疾患に対するリスクを変更する変異についてゲノムを包括的に調べることはできなかった。しかしながら、共通のヒトのバリエーションの莫大な一覧表(Nature 2005; 437(7063): 1299- 320を参照)と、何十万もの変異の費用効率が良くかつ正確な遺伝子タイピングを可能とする技術的前進とが組み合わされて、人類遺伝学が躍進した。初めて、共通の変異がリスクに影響するという仮説を完全に試験するために、全ゲノム相関スキャンを行うことができる。過去２年のうちに、この技術は実証された。例として、Dewan A, et al., Science 2006; 314(5801): 989-92；Nature 2007; 447(7145): 661-78、Matarin M, et al., Lancet neurology 2007; 6(5): 414-20）；Moffatt MF, et al., Nature 2007; 448(7152): 470-73；Plenge RM, et al., N Engl J Med 2007；Saxena R, et al., Science 2007; 316(5829): 1331-36；Scott LJ, et al, Science 2007; 316(5829): 1341-45；Scuteri A, et al., PLoS Genet 2007;3(7): e115を参照のこと。同定された危険因子遺伝子座により、ヒト疾患において調節異常である分子経路に新たな知見が示されている。
しかしながら、狼瘡などの複雑な疾患とのＳＮＰ相関に関する信頼できる情報が著しく欠けているので、このような疾患と関連する多型を同定することが求められ続けていることは明らかである。このような相関は、患者における狼瘡の存在を同定するため、又は疾患を発症させる罹患率を決定するために非常に役立つであろう。さらに、狼瘡などの複雑な疾患とＳＮＰの相関に関する統計学的及び生物学的に有意かつ再現性のある情報は、例えば治療薬がこのような特定の狼瘡患者のサブ集団において治療的利点があるか又はあることが臨床研究で示されている場合に、特定の治療薬による治療により顕著な利益を受けると予測される患者のあるサブセットを同定するための不可欠な要素として利用されうる。
本明細書中に記載の発明は上記の要望の応えるものであり、他の利益を提供するものである。
特許出願及び出版物を含む本明細書において引用されるすべての参考文献は、出典明記によってその全体が援用される。
本発明は、狼瘡の存在、サブタイプ及び／又は患者サブ集団と高い統計学的かつ生物学的有意性をもって相関するＳＮＰなどの一又は複数の遺伝子バリエーションの同定の少なくとも一部に基づき、狼瘡を同定する、及び狼瘡を発症するリスクを評価するための正確、単純かつ迅速な方法及び組成物を提供する。より具体的には、本発明は、狼瘡およびそのサブタイプと関係しているＳＮＰの固有の一群、該ＳＮＰの固有の組合せおよび連鎖不平衡領域、および該疾患に罹患している患者サブ集団の同定に関する。
特に、ＳＮＰの固有の群及び／又は組合せは、狼瘡を発症するリスクにある被検体を表すか、又は疾患又はその症状ないし状態を表す遺伝子プロファイル又はシグネチャーとして用いられうる。本明細書において開示される多型は、狼瘡を発症するリスクを評価するためのバイオマーカとしてだけでなく、診断試薬の設定のための標的としても有用である。ある態様では、ＳＮＰは遺伝子と関係していない。他の態様では、ＳＮＰは遺伝子と関連しており、遺伝子間又は遺伝子内領域に位置し得、より具体的にはコード領域又は非コード領域に位置しうる。本発明のＳＮＰと関連する遺伝子は未知の遺伝子と関連していてもよいし、ＩＴＧＡＭやＢＬＫなどの公知の遺伝子と関連していてもよい。
本明細書中で同定されるＳＮＰにより、本発明の一又は複数のＳＮＰを含む異なる遺伝子シグネチャーを表す狼瘡患者サブ集団の診断及び標的治療を含む、遺伝学的に同定された狼瘡患者の診断及び治療に用いるための、治療薬の開発のための標的が提供される。例えば、一態様では、本明細書において同定された遺伝子バリエーションを含む遺伝子、及びこれら遺伝子に関連する核酸(例えばＤＮＡ又はＲＮＡ)、及びこれら遺伝子にコードされるタンパク質は、治療薬(例えば小分子化合物、抗体、アンチセンス／ＲＮＡｉ薬剤など)の開発のための標的として、又は直接狼瘡の治療のための治療薬(例えば治療用タンパク質など)として使用されうる。
したがって、一態様では、本発明は、狼瘡を発症するリスクを評価するための特有の遺伝子シグネチャーを形成する一又は複数のＳＮＰの群を提供する。一態様では、特有の遺伝子シグネチャーは、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択されるおよそ１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０又は４０〜５０のＳＮＰを含む。
一態様では、特有の遺伝子シグネチャーは、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される一又は複数のＳＮＰ、２以上のＳＮＰ、３以上のＳＮＰ、４以上のＳＮＰ、５以上のＳＮＰ、６以上のＳＮＰ、７以上のＳＮＰ、８以上のＳＮＰ、９以上のＳＮＰ、１０以上のＳＮＰ、１１以上のＳＮＰ、１２以上のＳＮＰ、１３以上のＳＮＰ、１４以上のＳＮＰ、１５以上のＳＮＰ、１６以上のＳＮＰ、１７以上のＳＮＰ、１８以上のＳＮＰ、１９以上のＳＮＰ、２０以上のＳＮＰを含む。一態様では、遺伝子シグネチャーのＳＮＰは表６から選択される。他の態様では、ＳＮＰは、ｒｓ９８８８７３９、ｒｓ１３２７７１１３、ｒｓ７５７４８６５、ｒｓ２２６９３６８、ｒｓ６８８９２３９、ｒｓ２３９１５９２およびｒｓ２１１７７７７０からなる群から選択される。他の態様では、ＳＮＰは、ｒｓ２１８７６６８、ｒｓ１Ｏ４８８６３１、ｒｓ７５７４８６５、ｒｓ９８８８７３９、ｒｓ１３２７７１１３、ｒｓ２４３１６９７、ｒｓ６５６８４３１、ｒｓ１０４８９２６５、ｒｓ２４７６６０１、ｒｓ２２６９３６８、ｒｓ１８０１２７４、ｒｓ４９６３１２８、ｒｓ５７５４２１７、ｒｓ６４４５９７５、ｒｓ３１２９８６０、ｒｓ１０５１６４８７、ｒｓ６８８９２３９、ｒｓ２３９１５９２およびｒｓ２１７７７７０からなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、被検体から得た生体試料において、狼瘡を発症するリスクを示す遺伝子シグネチャーの存在を検出することによって、被検体が狼瘡を発症するリスクにあるか否かを評価する方法であって、このとき該遺伝子シグネチャーは図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される一又は複数のＳＮＰの群を含むものである方法を提供する。一態様では、ＳＮＰの群は、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択されるおよそ１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０又は４０〜５０のＳＮＰを含む。他の態様では、ＳＮＰの群は、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される２以上のＳＮＰ、３以上のＳＮＰ、４以上のＳＮＰ、５以上のＳＮＰ、６以上のＳＮＰ、７以上のＳＮＰ、８以上のＳＮＰ、９以上のＳＮＰ、１０以上のＳＮＰ、１１以上のＳＮＰ、１２以上のＳＮＰ、１３以上のＳＮＰ、１４以上のＳＮＰ、１５以上のＳＮＰ、１６以上のＳＮＰ、１７以上のＳＮＰ、１８以上のＳＮＰ、１９以上のＳＮＰ、２０以上のＳＮＰを含む。他の態様では、ＳＮＰの群は、表６から選択される１から１９のＳＮＰを含む。他の態様では、ＳＮＰの群は、表７から１０に示すいずれかのＢＬＫ ＳＮＰから選択されるＢＬＫ ＳＮＰを含む。他の態様では、ＳＮＰの群は、表７から１０に示すいずれかのＩＴＧＡＭ ＳＮＰから選択されるＩＴＧＡＭ ＳＮＰを含む。他の態様では、ＳＮＰの群はさらに、表７から１０に示すいずれかのＢＬＫ ＳＮＰから選択されるＢＬＫ ＳＮＰを含む。他の態様では、ＳＮＰの群は、以下：ｒｓ２１８７６６８、ｒｓ１０４８８６３１、ｒｓ７５７４８６５、ｒｓ９８８８７３９、ｒｓ１３２７７１１３、ｒｓ２４３１６９７、ｒｓ６５６８４３１、ｒｓ１０４８９２６５、ｒｓ２４７６６０１、ｒｓ２２６９３６８、ｒｓ１８０１２７４、ｒｓ４９６３１２８、ｒｓ５７５４２１７、ｒｓ６４４５９７５、ｒｓ３１２９８６０、ｒｓ１０５１６４８７、ｒｓ６８８９２３９、ｒｓ２３９１５９２およびｒｓ２１７７７７０のＳＮＰの群から選択される一又は複数のＳＮＰを含む。
他の態様では、本発明は、被検体から得た生体試料において、狼瘡を示す遺伝子シグネチャーの存在を検出することによって、被検体における狼瘡の診断方法であって、このとき該遺伝子シグネチャーは図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される一又は複数のＳＮＰの群を含むものである方法を提供する。
他の態様では、本発明は、単離されたポリヌクレオチド又は少なくともおよそ１０ヌクレオチド長であるその断片であって、このとき該ポリヌクレオチド又はその断片が、a) 図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一のヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置での遺伝子バリエーション、又はb) (a)の相補鎖を含むものであるポリヌクレオチド又はその断片を提供する。一態様では、単離されたポリヌクレオチドは、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一のヌクレオチド多型(ＳＮＰ)を含むゲノムＤＮＡである。他の態様では、単離されたポリヌクレオチドは、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一のヌクレオチド多型(ＳＮＰ)を含むＲＮＡである。
一態様では、本発明は、単離されたＰＲＯ関連ポリヌクレオチド又は少なくともおよそ１０ヌクレオチド長であるその断片であって、このとき該ＰＲＯ関連ポリヌクレオチド又はその断片が、a) 図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一のヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置での遺伝子バリエーション、又はb) (a)の相補鎖を含むものであるポリヌクレオチド又はその断片を提供する。一態様では、単離されたポリヌクレオチドは、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一のヌクレオチド多型(ＳＮＰ)を含む遺伝子(及び／又は遺伝子の制御領域)をコードするゲノムＤＮＡである。他の態様では、ＳＮＰは遺伝子をコードしない染色体の領域にある。他の態様では、ＳＮＰは染色体の遺伝子間領域にある。他の態様では、単離されたポリヌクレオチドはプライマーである。他の態様では、単離されたポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドである。
他の態様では、本発明は、(a) 図１から１７及び表１から１０に示す単一のヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置での遺伝子バリエーションを含むポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズする対立遺伝子(アレル)特異的なオリゴヌクレオチド、又は(b) (a)の相補鎖であるオリゴヌクレオチドを提供する。一態様では、ＳＮＰは、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一のヌクレオチド多型(ＳＮＰ)を含む遺伝子(又はその制御領域)をコードするＰＲＯ関連ポリヌクレオチドにある。他の態様では、ＳＮＰは、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一のヌクレオチド多型(ＳＮＰ)を含む遺伝子(又はその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡである。他の態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。他の態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。他の態様では、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドは対立遺伝子特異的なプライマーである。
他の態様では、本発明は、上記のいずれか一のオリゴヌクレオチドと場合によって少なくとも一の酵素を具備するキットを提供する。一態様では、少なくとも一の酵素はポリメラーゼである。他の態様では、少なくとも一の酵素はリガーゼである。
他の態様では、本発明は、上記のいずれかのオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイを提供する。
他の態様では、本発明は、図１から１７及び表１から１０に示す単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置でのポリヌクレオチド内のバリエーションの有無の検出方法であって、(a) 対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドの核酸へのハイブリダイゼーションに適切な条件下でバリエーションに特異的である対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドと、バリエーションを含むと思われる核酸とを接触させ、そして、(b) 対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーションの有無を検出することを含む方法を提供する。一態様では、バリエーションは、図１から１７および表１から１０に示すＳＮＰを含む。一態様では、ポリヌクレオチドは、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチドである。
他の態様では、本発明は、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置でのポリヌクレオチド内のバリエーションを含む核酸の増幅方法であって、(a) 該バリエーションの３'配列の核酸にハイブリダイズするプライマーと核酸とを接触させ、そして(b) プライマーを伸展させて該バリエーションを含む増幅産物を生成することを含む方法を提供する。一態様では、ポリヌクレオチドはＰＲＯ関連ポリヌクレオチドである。
他の態様では、本発明は、哺乳動物の生体試料の遺伝子型の決定方法であって、該生体試料から得た核酸材料において、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置でのポリヌクレオチド内のバリエーションの有無を検出することを含む方法を提供する。一態様では、ポリヌクレオチドはＰＲＯ関連ポリヌクレオチドである。
他の態様では、生体試料は、本発明のポリヌクレオチドを含むことがわかっているか又は含むことが予測されるものであり、このとき該ポリヌクレオチドは、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置にバリエーションを含む。他の態様では、生体試料は疾患組織である。他の態様では、検出には、プライマー伸展アッセイ；対立遺伝子特異的なプライマー伸長アッセイ；対立遺伝子特異的なヌクレオチド取込みアッセイ；対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ；５'ヌクレアーゼアッセイ；分子ビーコンを用いたアッセイ；及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイから選択される工程を実施することが含まれる。
他の態様では、本発明は、哺乳動物の狼瘡のサブ分類方法であって、哺乳動物から得た生体試料において、図１から１７及び表１から１０に示す一又は複数のＳＮＰの存在を検出することを含み、このとき該生体試料が図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択されるＳＮＰを含む少なくとも一のポリヌクレオチドを含むことがわかっているか含むことが予測されるものである方法を提供する。一態様では、ポリヌクレオチドはＰＲＯ関連ポリヌクレオチドである。
他の態様では、検出には、プライマー伸展アッセイ；対立遺伝子特異的なプライマー伸長アッセイ；対立遺伝子特異的なヌクレオチド取込みアッセイ；対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ；５'ヌクレアーゼアッセイ；分子ビーコンを用いたアッセイ；及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイから選択される工程を実施することが含まれる。 他の態様では、本発明は、狼瘡を有する被検体が狼瘡治療薬に応答するか否かを予測するための方法であって、該被検体が図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置でポリヌクレオチド内にバリエーションを含むか否かを決定することを含み、このときバリエーションがある場合に被検体が該治療薬に応答するであろうことが示される方法を提供する。一態様では、ポリヌクレオチドはＰＲＯ関連ポリヌクレオチドである。
他の態様では、本発明は、被検体の狼瘡の診断又は予後の予測の方法であって、被検体から得たポリヌクレオチド内でのバリエーションの存在を検出することを含み、このとき(a) 該生体試料がバリエーションを含むポリヌクレオチドを含むことがわかっているか、又は含むことが予測されるものであり、(b) 該バリエーションが図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択されるＳＮＰを含むか、又はＳＮＰに対応するヌクレオチド位置に位置するものであり、そして(c) バリエーションの存在が被検体での狼瘡の診断又は予後である方法を提供する。
他の態様では、本発明は、被検体における狼瘡の診断又は予後予測の方法であって、被検体から得た生体試料からのＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内でのバリエーションの存在を検出することを含み、このとき(a) 該生体試料がバリエーションを含むＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドを含むことがわかっているか、又は含むことが予測されるものであり、(b) 該バリエーションが図１から１７及び表１から１０に示すＳＮＰを含むか、又はＳＮＰに対応するヌクレオチド位置に位置するものであり、そして(c) バリエーションの存在が被検体での狼瘡の診断又は予後である方法を提供する。
他の態様では、本発明は、被検体における狼瘡の診断又は予後予測における補助方法であって、被検体から得た生体試料からのポリヌクレオチド内でのバリエーションの存在を検出することを含み、このとき(a) 該生体試料がバリエーションを含むポリヌクレオチドを含むことがわかっているか、又は含むことが予測されるものであり、(b) 該バリエーションが図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択されるＳＮＰを含むか、又はＳＮＰに対応するヌクレオチド位置に位置するものであり、そして(c) バリエーションの存在が被検体での狼瘡の状態又は症状の診断又は予後である方法を提供する。
他の態様では、本発明は、被検体における狼瘡の診断又は予後予測における補助方法であって、被検体から得た生体試料からのＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内でのバリエーションの存在を検出することを含み、このとき(a) 該生体試料がバリエーションを含むＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドを含むことがわかっているか、又は含むことが予測されるものであり、(b) 該バリエーションが図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択されるＳＮＰを含むか、又はＳＮＰに対応するヌクレオチド位置に位置するものであり、そして(c) バリエーションの存在が被検体での狼瘡の状態又は症状の診断又は予後である方法を提供する。
他の態様では、ポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内に配列(例えば、図１から１７および表１から１０に示すような)を含む。一態様では、バリエーションは、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択されるＳＮＰを含むゲノムＤＮＡ内にある。一態様では、ＳＮＰは遺伝子をコードしない染色体領域にある。他の態様では、ＳＮＰは遺伝子間領域にある。
他の態様では、ＰＲＯ関連ポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば、図１から１７および表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードする。一態様では、バリエーションは遺伝子(又はその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡ内にあり、このとき該遺伝子(又はその制御領域)は図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択されるＳＮＰを含む。一態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。他の態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。
他の態様では、本発明は、患者サブ集団の狼瘡を治療するために有効な治療薬の同定方法であって、薬剤の有効性を、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される一又は複数のＳＮＰの患者における存在と相関させ、それによって該薬剤が該患者サブ集団の狼瘡を治療するために有効であると同定する方法を提供する。
他の態様では、本発明は、患者サブ集団の狼瘡を治療するために有効な治療薬の同定方法であって、薬剤の有効性を、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される一組のＳＮＰの存在と相関させ、それによって該薬剤が該患者サブ集団の狼瘡を治療するために有効であると同定する方法を提供する。
他の態様では、本発明は、遺伝子バリエーションが、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に存在することがわかっている被検体の狼瘡状態の治療方法であって、状態を治療するために有効な治療薬を被検体に投与することを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、狼瘡状態を有する被検体の治療方法であって、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に遺伝子バリエーションを有する被検体の状態を治療するために有効な治療薬を被検体に投与することを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、狼瘡状態を有する被検体の治療方法であって、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に遺伝子バリエーションをそれぞれ有する少なくとも５人の患者に薬剤が投与される少なくとも一の臨床試験において、該状態を治療するために有効であることが示された治療薬を被検体に投与することを含む方法を提供する。一態様では、少なくとも５人の患者は、少なくとも５人の患者の群につき合計で２以上の異なるＳＮＰを有した。他の態様では、少なくとも５人の患者は、少なくとも５人の患者の群全体で同じＳＮＰを有した。
他の態様では、本発明は、特定の狼瘡患者サブ集団の狼瘡被検体の治療方法であって、このとき該サブ集団は図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択されるＳＮＰに対応するヌクレオチド位置の遺伝子バリエーションとの相関に少なくとも一部特徴があり、該サブ集団のための治療薬として承認されている治療薬の有効量を被検体に投与することを含む方法を提供する。一態様では、サブ集団はループス腎炎を有する。他の態様では、サブ集団は女性である。他の態様では、サブ集団はヨーロッパを起源とする。
他の態様では、本発明は、狼瘡治療薬を製造し、そして、狼瘡を有するか又は有すると思われ、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応する位置に遺伝子バリエーションを有する被検体に該薬剤を投与するための指示書とともに薬剤をパッケージすることを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、狼瘡患者サブ集団における使用のための治療薬を特定する方法であって、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応する位置の遺伝子バリエーションに特徴がある患者サブ集団に治療薬を投与するための指示書を提供することを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、狼瘡患者サブ集団における使用のための治療薬の販売方法であって、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応する位置での遺伝子バリエーションの、該サブ集団の患者における存在に特徴を有する患者サブ集団を治療するための治療薬の使用について聴衆に知らしめることを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、遺伝子バリエーションが図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に存在することがわかっている被検体においてＢ細胞レセプターを介するシグナル伝達を調整する方法であって、Ｂ細胞レセプターを介するシグナル伝達を調整するために有効な治療薬を被検体に投与することを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、遺伝子バリエーションが図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に存在することがわかっている被検体においてＴＨＩ７細胞の分化を調整する方法であって、ＴＨＩ７細胞の分化を調整するために有効な治療薬を被検体に投与することを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、狼瘡を発症するリスクを示す遺伝子シグネチャーを含むＳＮＰの群であって、このときこのＳＮＰの群が図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される一又は複数のＳＮＰを含むものであるＳＮＰの群を提供する。一態様では、ＳＮＰの群は、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択されるおよそ１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０又は４０〜５０のＳＮＰを含む。他の態様では、ＳＮＰの群は、ｒｓ９８８８７３９、ｒｓ１３２７７１１３、ｒｓ７５７４８６５、ｒｓ２２６９３６８、ｒｓ６８８９２３９、ｒｓ２３９１５９２およびｒｓ２１１７７７７０からなる群から選択される一又は複数のＳＮＰを含む。他の態様では、ＳＮＰの群は、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される２以上のＳＮＰ、３以上のＳＮＰ、４以上のＳＮＰ、５以上のＳＮＰ、６以上のＳＮＰ、７以上のＳＮＰ、８以上のＳＮＰ、９以上のＳＮＰ、１０以上のＳＮＰ、１１以上のＳＮＰ、１２以上のＳＮＰ、１３以上のＳＮＰ、１４以上のＳＮＰ、１５以上のＳＮＰ、１６以上のＳＮＰ、１７以上のＳＮＰ、１８以上のＳＮＰ、１９以上のＳＮＰ、２０以上のＳＮＰを含む。他の態様では、ＳＮＰの群は、表６から選択される１から１９のＳＮＰを含む。他の態様では、ＳＮＰの群は、表７から１０に示すいずれかのＢＬＫ ＳＮＰから選択されるＢＬＫ ＳＮＰを含む。他の態様では、ＳＮＰの群は、表７から１０に示すいずれかのＩＴＧＡＭ ＳＮＰから選択されるＩＴＧＡＭ ＳＮＰを含む。他の態様では、ＳＮＰの群はさらに、表７から１０に示すいずれかのＢＬＫ ＳＮＰから選択されるＢＬＫ ＳＮＰを含む。他の態様では、ＳＮＰの群は、以下：ｒｓ２１８７６６８、ｒｓ１０４８８６３１、ｒｓ７５７４８６５、ｒｓ９８８８７３９、ｒｓ１３２７７１１３、ｒｓ２４３１６９７、ｒｓ６５６８４３１、ｒｓ１０４８９２６５、ｒｓ２４７６６０１、ｒｓ２２６９３６８、ｒｓ１８０１２７４、ｒｓ４９６３１２８、ｒｓ５７５４２１７、ｒｓ６４４５９７５、ｒｓ３１２９８６０、ｒｓ１０５１６４８７、ｒｓ６８８９２３９、ｒｓ２３９１５９２およびｒｓ２１７７７７０のＳＮＰの群から選択される一又は複数のＳＮＰを含む。
他の態様では、本発明は、狼瘡を表す遺伝子シグネチャーを含むＳＮＰの群であって、このときこのＳＮＰの群が図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される一又は複数のＳＮＰを含むものであるＳＮＰの群を提供する。
ＳＬＥの全ゲノム相関スキャンの結果から５つの主な遺伝子が特定されることを示す。データは、合計１３１１のＳＬＥ症例と３３４０のコントロールについて、３つの試料系統に分類される５０２０３３のＳＮＰ変異を表す。パネルＡは、予測ヌルＰ値分布に対する観測Ｐ値分布の変位値−変位値プロットを示す。◇はすべてのＰ値を表し、○はＨＬＡ、ＩＲＦ５及びＳＴＡＴ４領域変異体を排除した後のＰ値を表す。パネルＢは、染色体にまとまった複合解析の−ｌｏｇ１０Ｐ値をグラフで表したものである。Ｐ＜１×１０−１３を有する付加的なＨＬＡ領域変異体(Ｎ＝３４)はパネルＢに示されない。 ＢＬＫ／Ｃ８ｏｒｆｌ３領域の関連する変異が変質転換したＢ細胞の発現レベルと相関することを示す。Ａ）ＢＬＫ／Ｃ８ｏｒｆｌ３領域の−ｌｏｇ１０Ｐ値を表す。菱形の色は、ｒｓ１３２７７１１３とのｒ２相関を表す。領域内のすべてのＲｅｆＳｅｑ遺伝子は、コントロール染色体の分析によって定まる領域内のＬＤを示すプロット線より上に表される。注目すべきことには、第８染色体上のこの関連領域は共通の多型性４．２Ｍｂの染色体内逆位内にあり(例としてGiglio et al. Am J Hum Genet 2001;68(4): 874-83及びSugawara et al. Genomics 2003;82(2): 238-44を参照)、示されるようにこの領域を越えて伸展したＬＤの著しく低いレベルと関連していることである。しかしながら、ＳＬＥに対するＢＬＫＩ Ｃ８ｏｒｆｌ３の関連は逆位とは無関係である。２１０人の関係のない健康なＣＥＵ ＨａｐＭａｐ創始者からの形質転換したＢ細胞株におけるＢＬＫ(Ｂ)およびＣ８ｏｒｆｌ３(Ｃ)の発現は、ｒｓ１３２７７１１３での遺伝子型によって階層化されることが示される。差次的発現の有意性は、独立スチューデントのＴ検定を用いて決定された。 ＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸ遺伝子座の範囲内の変異がＳＬＥと関係していることを示す。パネルＡはＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸ領域の−ｌｏｇ１０Ｐ値を表す。菱形の色は、ｒｓ１１５７４６３７とのｒ２相関性を表す。領域内のすべてのＲｅｆＳｅｑ遺伝子は、試験したコントロール染色体によって定まる領域内のＬＤを示すプロットより上に表される。パネルＢは、ＩＴＧＡＭのゲノム構造、保存主要タンパク質ドメイン、及びｒｓ１ １５７４６３とＩＴＧＡＭの２つの非同義性対立遺伝子との相関関係を表す。 ＳＬＥ系列１−３およびスウェーデンの症例の臨床的特徴の頻度を表す。 １３１１の症例と３３４０のコントロールにおける全ゲノムスキャンでの、ＳＬＥと関係している上位５０の遺伝子座を表す。 ＨａｐＭａｐ個体からの２１０の形質転換したＢ細胞株におけるＢＬＫ、Ｃ８ｏｒｆｌおよびコントロール遺伝子の発現レベルを表す。 ＨａｐＭａｐ集団からの形質転換したＢ細胞のＢＬＫの発現を表す。 症例／コントロール系列によって、Ｃ８ｏｒｆｌ３／ＢＬＫ及びＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸ領域変異のＳＬＥとの相関を表す。 ＳＬＥ系列１−３について、Ｃ８ｏｒｆｌ３／ＢＬＫ及びＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸ変異の、１１のＡＣＲ臨床基準との相関を表す。 ５２１のスウェーデンＳＬＥ症例について、Ｃ８ｏｒｆｌ３／ＢＬＫ及びＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸ変異の、１１のＡＣＲ臨床基準との相関を表す。スウェーデン試料では、５２１の症例をＡＣＲ基準に対する相関について試験した。統計的有意差は、２×２分割表およびカイ二乗試験によって評価した。ＡＣＲ基準は相関することが知られており、Ｘ＝０．０５／１１＝０．００４５の単純ボンフェローニ補正は過度に保存されているようであるので、算出したＰ値は多重試験に適さなかった。 系列サイズに対して加重した補正したＺスコアを組合せるために用い、残余ゲノムコントロール膨張因子(λｇｃ)に適用させた式を表す。各々の系列の分散量(σ２)は、ｐ＝症例およびコントロールにおける対立遺伝子頻度として算出した。３つのＳＬＥ系列について組み合わせたＺスコア(Ｚ＊)は、Ｚ１、Ｚ２及びＺ３を、各系列のＳＬＥに対する変異の相関についてのＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴ補正カイ二乗に基づいたＺスコアと同等とし、λ１、λ２及びλ３を、各系列についてＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴ補正を行った後の残余ゲノムコントロール膨張因子(λｇｃ)として算出した。 ループス腎炎サブセットの分析を表す。これは、２０の候補ＳＮＰを含む１１の領域がループス腎炎の少なくとも一のリスク対立遺伝子をおそらく含むと考えられることを示す。 ループス腎炎サブセットの分析を表す。これは、２０の候補ＳＮＰを含む１１の領域がループス腎炎の少なくとも一のリスク対立遺伝子をおそらく含むと考えられることを示す。 連鎖不平衡領域の更なる特徴付け、これらの領域内の特定の遺伝子の識別、およびこれら遺伝子を識別するための判定基準を示す。 連鎖不平衡領域の更なる特徴付け、これらの領域内の特定の遺伝子の識別、およびこれら遺伝子を識別するための判定基準を示す。 雌サブセットの分析を表す。これは、９の候補ＳＮＰを含む６の更なる領域が少なくとも一のリスク対立遺伝子をおそらく含むと考えられることを示す。 連鎖不平衡領域の更なる特徴付け、これらの領域内の特定の遺伝子の識別、およびこれら遺伝子を識別するための判定基準を示す。 メイングループの分析を表す。これは、８の候補ＳＮＰを含む６の更なる領域が少なくとも一のリスク対立遺伝子をおそらく含むと考えられることを示す。 連鎖不平衡領域の更なる特徴付け、これらの領域内の特定の遺伝子、およびこれら遺伝子を識別するための判定基準を示す。 図１２の一部データを基にした、連鎖不平衡領域とそれに含まれるＳＮＰを表す。 図１３の一部データを基にした、連鎖不平衡領域とそれに含まれるＳＮＰを表す。 図１４の一部データを基にした、連鎖不平衡領域とそれに含まれるＳＮＰを表す。
以下のキーは図１２から１７の見出しと対応する。
Figure 2017035088
（発明の詳細な説明）
本発明は、狼瘡の存在、サブタイプ及び／又は患者サブ集団と高い統計学的かつ生物学的有意性をもって相関するＳＮＰなどの一又は複数の遺伝子バリエーションの同定の少なくとも一部に基づき、狼瘡を同定する、及び狼瘡を発症するリスクを評価するための正確、単純かつ迅速な方法及び組成物を提供する。より具体的には、本発明は、狼瘡およびそのサブタイプと関係しているＳＮＰの固有の一群、該ＳＮＰの固有の組合せおよび連鎖不平衡領域、および該疾患に罹患している患者サブ集団の同定に関する。
特に、ＳＮＰの固有の群及び／又は組合せは、狼瘡を発症するリスクにある被検体を表すか、又は疾患又はその症状ないし状態を表す遺伝子プロファイル又はシグネチャーとして用いられうる。本明細書において開示される多型は、狼瘡を発症するリスクを評価するためのバイオマーカとしてだけでなく、診断試薬の設定のための標的としても有用である。いくつかの実施態様では、ＳＮＰは遺伝子と関係していない。他の実施態様では、ＳＮＰは遺伝子と関連しており、遺伝子間又は遺伝子内領域に位置し得、より具体的にはコード領域又は非コード領域に位置しうる。本発明のＳＮＰと関連する遺伝子は未知の遺伝子と関連していてもよいし、ＩＴＧＡＭやＢＬＫなどの公知の遺伝子と関連していてもよい。 本明細書中で同定されるＳＮＰにより、本発明の一又は複数のＳＮＰを含む異なる遺伝子シグネチャーを表す狼瘡患者サブ集団の診断及び標的治療を含む、遺伝学的に同定された狼瘡患者の診断及び治療に用いるための、治療薬の開発のための標的が提供される。例えば、一実施態様では、本明細書において同定された遺伝子バリエーションを含む遺伝子、及びこれら遺伝子に関連する核酸(例えばＤＮＡ又はＲＮＡ)、及びこれら遺伝子にコードされるタンパク質は、治療薬(例えば小分子化合物、抗体、アンチセンス／ＲＮＡｉ薬剤など)の開発のための標的として、又は直接狼瘡の治療のための治療薬(例えば治療用タンパク質など)として使用されうる。
一般的な技術
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内の分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を使用して行う。このような技術は、例えば以下のような文献に完全に明記されている。"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)；"Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)；"Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)；"Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)；"Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates)；"PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al, eds., 1994)。
本発明に用いられるプライマー、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは当分野で公知の標準的な技術によって生成されうる。
特に定義しない限り、本明細書中で用いた技術及び科学的な用語は、本発明が属する分野の通常の技術者によって共通して理解される意味と同じである。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N. Y. 1994), and March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N. Y. 1992)は、本出願において使用する多くの用語に対して一般的な指針を当業者に示す。
Ｉ．定義
本出願を理解するために、以下の定義を適用し、必要な場合はいつでも、単数で使用した用語には複数形も含まれ、その逆もそうである。以下に示すいずれかの定義が出典明記によって本明細書中に援用されるいずれかの文献と矛盾する場合、以下の定義を調節してもよい。
本明細書中で用いる「狼瘡」又は「狼瘡状態」は、一般に、結合組織を攻撃する抗体を伴う自己免疫性疾患又は障害である。狼瘡の主な形態は、全身性のもの、ＳＬＥ及び亜急性皮膚ＳＬＥを含む全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、並びに他のタイプの狼瘡(腎炎、腎外、脳炎、小児性、腎臓以外の、円板状、及び脱毛性を含む)。概して、上掲のD'Cruz et al.を参照。
ここで交換可能に用いる「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの集合化(「アセンブリ」とも言う)の前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識成分との結合によりさらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(一又は複数)の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体支持体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャップ基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。さらにポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み、これらには例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ又は２’−アジド−リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１−２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」とは、短く、少なくとも７ヌクレオチド長であって約２００未満のヌクレオチド長の一本鎖ヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
「プライマー」は、核酸にハイブリダイズし、一般に遊離した３'-ＯＨ基を供給することにより、相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する一本鎖ポリヌクレオチドである。
「ＰＲＯ」なる用語は、連鎖不平衡領域(ＬＤ領域)内に配置する核酸配列によってコードされるいずれかの遺伝子によってコードされるポリペプチドを指し、このときＬＤ領域は図１から１７及び表１から１０に示す情報群に従って決定されるものである。一実施態様では、本発明のＰＲＯは、狼瘡を引き起こすことが当分野で知られているポリペプチドは含まない。一実施態様では、本発明のＰＲＯは、狼瘡と関連していることが当分野で知られているポリペプチド、例えばＩＲＦ５、又は国際公開２００７／０１９２１９の表５から９に示される遺伝子によってコードされるいずれかのポリペプチドは含まない。「ＰＲＯ関連ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯと関連した核酸」なる用語は、近接する配列を含む核酸分子を指し、このとき近接する配列は遺伝子バリエーションを表すような本明細書において同定された位置を含む。一実施態様では、遺伝子変異を表す位置は、近接する配列の５'又は３'の末端に配置する。一実施態様では、近接する配列内の遺伝子バリエーションを表す位値は、その位値の天然に生じる隣接配列を構成する一又は複数のヌクレオチドによって、５'及び／又は３'の領域のいずれかないしは両方に隣接している。一実施態様では、遺伝子変異を表す位置は、図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰに対する位値である。
「遺伝子バリエーション」又は「ヌクレオチドバリエーション」なる用語は、参照配列(例えば、共通して見られる及び／又は野生型の配列、及び／又は主要な対立遺伝子の配列)と比較したときのヌクレオチド配列の変化(例えば、単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)などの一又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失、逆位又は置換)を指す。また、特に明記しない限り、この用語にはヌクレオチド配列の相補鎖内の対応する変化も包含する。一実施態様では、遺伝子変異は体細胞の多型性である。一実施態様では、遺伝子変異は生殖細胞系多型性である。
「単一ヌクレオチド多型」、又は「ＳＮＰ」は、一集団内で異なる対立遺伝子又は代替ヌクレオチドが存在するＲＮＡ又はＤＮＡ分子(例えばポリヌクレオチド)内の一塩基の位置を指す。ＳＮＰ位置(本明細書中ではＳＮＰ、ＳＮＰ部位、ＳＮＰ遺伝子座と交換可能に称される)は対立遺伝子の高度に保存された配列(例えば集団の１／１００又は１／１０００未満のメンバーで異なる配列)の通常前に、又は該配列の後にある。個体は、各々のＳＮＰ位置のある対立遺伝子についてホモ接合でも、ヘテロ接合でもよい。
「アミノ酸バリエーション」なる用語は、参照配列と比較したときのアミノ酸配列の変化(例えば、内部欠失又はＮ−ないしＣ−末端トランケーションなどの一又は複数のアミノ酸の挿入、置換又は欠失)を指す。
「バリエーション」なる用語は、ヌクレオチド変化又はアミノ酸変化を指す。
「ＳＮＰに対応するヌクレオチド位置での遺伝子バリエーション」、「ＳＮＰに対応するヌクレオチド位置でのヌクレオチドバリエーション」なる用語及びその文法上の変形は、ゲノム内のＳＮＰが占める相対的に対応するヌクレオチド位置でのポリヌクレオチド配列内のヌクレオチドバリエーションを指す。また、特に明記しない限り、この用語にはヌクレオチド配列の相補鎖内の対応するバリエーションも包含される。いくつかの実施態様では、ヌクレオチドバリエーションは、ゲノム内のＳＮＰが占める相対的に対応するヌクレオチド位置でのＰＲＯ関連のポリヌクレオチド配列内にある。
「連鎖不平衡領域ＳＮＰ」又は「ＬＤ領域ＳＮＰ」なる用語は、適切な核酸／ゲノムマーカー、例えば座標やＳＮＰによって表される領域などの、ＤＮＡの特定の領域に存在するＳＮＰを指す。一実施態様では、ＬＤ領域は、第一座標(例えば座標Ａ)と第二座標(例えば座標Ｂ)によって表され、両方の座標は同じ染色体を指す。一実施態様では、ＬＤ領域は、第一ＳＮＰ(例えばＳＮＰ Ａ)と第二ＳＮＰ(例えばＳＮＰ Ｂ)によって表される。ゆえに、一実施態様では、ＬＤ領域ＳＮＰは、第一座標から第二座標、又は第一ＳＮＰから第二ＳＮＰの範囲の核酸領域(例えばゲノム領域)に配置するＳＮＰを指す。このようなＬＤ領域およびＬＤ領域ＳＮＰの例は、図１から１７および表１から１０に示される。
「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、基質上でのハイブリダイズ可能なアレイ成分、好ましくはポリヌクレオチドプローブ(例えばオリゴヌクレオチド)の規則正しい整列を意味する。基質は、スライドグラスなどの固体基質、又はニトロセルロースメンブレンなどの半固体基質であってもよい。
「増幅」は、基準核酸配列又はその相補鎖の一又は複数のコピーを製造する過程を意味する。増幅は、一次関数的、又は指数関数的（例えばＰＣＲ）であり得る。「コピー」は、鋳型配列に対して必ずしも完全に相補的又は同一な配列を意味するものではない。例えば、コピーは、例えばデオキシイノシンなどのヌクレオチド類似体、意図的配列変化(鋳型に完全に相補的ではないがハイブリダイズすることができる配列を含むプライマーにより導入された配列変化など)及び／又は増幅中に起こる配列エラーを含みうる。
「アレル特異的オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド変異（一般的に置換）を含む標的核酸の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指す。「アレル特異的ハイブリダイゼーション」は、アレル特異的オリゴヌクレオチドがその標的核酸にハイブリダイズした場合に、アレル特異的オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが特異的にこのヌクレオチド変異に塩基対合することを意味する。特定のヌクレオチド変異についてアレル特異的ハイブリダイゼーションが可能なアレル特異的オリゴヌクレオチドは、その変異に対して「特異的」であるという。
「アレル特異的プライマー」は、プライマーであるアレル特異的オリゴヌクレオチドを意味する。
「プライマー伸長アッセイ」は、ヌクレオチドが核酸に付加され、より長い核酸又は「伸長産物」を生じるアッセイで、直接的又は間接的に検出されるものを意味する。ヌクレオチドは核酸の５'又は３'の末端を伸長するために付加されうる。
「アレル特異的ヌクレオチド取り込みアッセイ」は、（ａ）プライマーがヌクレオチド変異の３'又は５'の領域で標的核酸にハイブリダイズし、（ｂ）ポリメラーゼにより伸長されることにより、ヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチドが伸長産物に取り込まれる、プライマー伸長アッセイを指す。
「アレル特異的プライマー伸長アッセイ」は、アレル特異的プライマーが標的核酸にハイブリダイズして伸長する、プライマー伸長アッセイを指す。
「アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ」は、（ａ）アレル特異的オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズし、（ｂ）ハイブリダイゼーションが直接的又は間接的に検出される、アッセイを指す。
「５’ヌクレアーゼアッセイ」は、アレル特異的オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションにより、ハイブリダイゼーションプローブの核酸分解切断が起こり、その結果検出可能なシグナルが生じる、アッセイを指す。
「分子ビーコンを用いたアッセイ」は、アレル特異的オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションが、遊離オリゴヌクレオチドから出される検出シグナルレベルよりも高い検出シグナルレベルを生じる、アッセイを指す。
「オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ」は、アレル特異的オリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが互いに標的核酸上で隣接してハイブリダイズし、(直接又は介在性ヌクレオチドにより間接的に)共にライゲートし、ライゲーション産物が直接的又は間接的に検出されるアッセイを指す。
「標的配列」、「標的核酸」又は「標的核酸配列」は、一般的に、ヌクレオチド変異が存在すると推測される、又は知られている対象のポリヌクレオチドを指し、増幅により生成される標的核酸などのコピーも含む。
本明細書中で用いる、狼瘡を発症する「リスクにある」被検体は、検出可能な疾患ないしは疾患の症状を有していても有していなくても、そして本明細書中に記載の治療方法の前に検出可能な疾患ないしは疾患の症状を示していても示していなくてもよい。「リスクにある」とは被検体が一又は複数の危険因子を有することを示し、本明細書中に記載され、当分野で公知のように、その危険因子が狼瘡の発症と相関している測定可能なパラメーターである。これらの一又は複数の危険因子を有する被検体は、これらの一又は複数の危険因子のない被検体より、狼瘡を発症する可能性が高い。例えば、ある実施態様では、狼瘡を発症する「リスクにある」被検体は、図１から１７および表１から１０に示されるＳＮＰの一又は複数を含む遺伝子シグネチャーを有する。他の実施態様では、狼瘡を発症する「リスクにある」被検体は、表６に示されるＳＮＰの一又は複数を含む遺伝子シグネチャーを有する。
「検出」は、直接的及び間接的な検出を含む検出する任意の手段を含む。
「診断」なる用語は、分子又は病的状態、疾患又は状態の同定又は分類を指すために用いられる。例えば、「診断」は特定のタイプの狼瘡状態、例えばＳＬＥの同定を指してもよい。また、「診断」は、例えば組織／臓器の関与により(例えばループス腎炎)、分子の特徴により(例えば特定の遺伝子又は核酸領域内の遺伝子バリエーション(一又は複数)に特徴を有する患者サブ集団)、狼瘡の特定のサブタイプの分類を指してもよい。
「診断を補助する」なる用語は、狼瘡の症状や状態の特定のタイプの存在、程度又は他の性質に関する臨床上の決定を支援する方法を指すために用いられる。例えば、狼瘡の診断の補助方法には、個体からの生体試料における一又は複数のＳＮＰの量を測定すること、又は有無を検出することが含まれうる。他の例では、狼瘡の診断の補助方法には、個体からの生体試料における一又は複数のＳＮＰの量を測定すること、又は存在を検出することが含まれうる。
「予後」なる用語は、狼瘡のような自己免疫性疾患の再発、再燃、及び薬剤耐性を含む自己免疫性疾患に起因し得る疾患症状の可能性の予測を指すためにここで用いられる。「予測」なる用語は、患者が薬剤又は一連の薬剤に対して有利又は不利に応答する可能性を指すためにここで用いられる。一実施態様では、予測はそれらの応答の程度に関する。一実施態様では、予測は、例えば特定の治療的薬剤による治療、及び疾患の再発を伴わない一定期間の治療の後に患者が生存しているか改善しているかどうか、及び／又はその可能性に関する。本発明の予測方法は、任意の特定の患者のために最も好適な治療様式を選択することによって、治療決定を臨床的に行うことができる。本発明の予測方法は、患者が、治療投薬計画、例えば特定の治療剤や組み合わせの投与、外科的介入、ステロイド治療などを含む特定の治療投薬計画に有利に応答するかどうか、又は治療投薬計画の後に患者が長期に生存しているかどうかを予測する際の有用なツールである。ＳＬＥの診断は、現在の米国リウマチ学会(American College of Rheumatology)(ＡＣＲ)判定基準に従ってもよい。活動中の疾患は、１つのイギリス諸島狼瘡活動性グループ(British Isles Lupus Activity Group)(ＢＩＬＡＧ)の「Ａ」判定基準又は２つのＢＩＬＡＧ「Ｂ」判定基準によって定められてもよい。ＳＬＥを診断するために用いられるいくつかの兆候、症状又は他の指標(出典：Tan et al. "The Revised Criteria for the Classification of SLE" Arth Rheum 25 (1982))は、頬にわたる発疹などの頬部発疹、円板状(ジスコイド)発疹、又は赤い隆起したパッチ、日光に対する反応のような光線過敏症、結果として生じる皮膚発疹の発症又は増加、鼻又は口内の潰瘍のような口腔内潰瘍(通常痛くない)、関節炎、例として２以上の末梢関節を伴う非びらん性関節炎(関節のまわりの骨が破壊されない関節炎)、漿膜炎、胸膜炎又は心膜炎、尿中の過剰タンパク質などの腎臓疾患(０．５ｇｍ／日より多い又は試験スティックにおいて３＋)および／または細胞性キャスト(尿および／または白血球および／または尿細管細胞から得られる異常な成分)、神経学的兆候、症状又は他の指標、発作(痙攣)、および／または引き起こすことがわかっている代謝性障害又は薬剤がない場合の精神異常、及び溶血性貧血又は白血球減少症(１立方ミリメートルにつき４０００細胞未満の白血球数)又はリンパ球減少症(１立方ミリメートルにつき１５００未満)又は血小板減少(１立方ミリメートルにつき１０００００未満の血小板)などの血液学的兆候、症状又は他の指標であってもよい。白血球減少症及びリンパ球減少症は一般に二以上の原因で検出されるはずである。血小板減少症は一般に、それを誘導することが知られている薬剤がない場合に検出されるはずである。本発明は狼瘡のこれらの兆候、症状又は他の指標に限定されるものではない。
ここで使用される「治療」とは、治療される個体又は細胞の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を意味し、臨床病理経過中又はその前に実施することができる。治療の所望する効果には、疾患又はその状態ないし症状の発症又は再発の予防、疾患の状態ないし症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の低減、疾病の進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び寛解の達成又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の方法及び組成物は疾患又は障害の発達を遅らせるために有用である。
「有効量」とは、所望される治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、必要な用量での有効量を意味する。個体に所望する反応を引き出すための治療薬剤の「治療的有効量」は、病状、年齢、性別、個体の体重、及び抗体の能力等の要因に応じて変わり得る。また、治療的有効量とは、治療薬剤の任意の毒性又は有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量でもある。「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。必ずではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に患者に使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
「個体」、「被検体」又は「患者」は脊椎動物である。特定の実施態様では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、これに限定されないが、霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類を含む）及び齧歯類（例えばマウス及びラット）が含まれる。特定の実施態様では、哺乳動物はヒトである。
本明細書において用いる「患者サブ集団」及びその文法上の変形は、疾患が属する広範な疾患カテゴリーにおいて他の者から患者サブセットを区別する一又は複数の典型的な測定可能な及び／又は識別可能な特徴を有することに特徴がある患者サブセットを指す。このような特徴には、疾患サブカテゴリー(例えばＳＬＥ、ループス腎炎)、性別、生活習慣、病歴、関与する臓器／組織、治療歴などが含まれる。一実施態様では、患者サブ集団は、特定のヌクレオチド位置及び／又は領域における遺伝子バリエーション(例えばＳＮＰ)などの遺伝子シグネチャーに特徴を有する。
本明細書中で用いる「試料」なる用語は、例えば理学的、生化学的、化学的及び／又は生理学的特徴に基づいて特性を示す又は同定される、細胞実体及び／又は他の分子実体を含有する対象とする被検体から得られる、又は対象とする被検体由来の組成物を指す。例えば、「疾患試料」なる表現及びこの変形は、特徴付けられている細胞実体及び／又は分子実体を含むことが予測される、又はそうであることが知られている対象の被検体から得た任意の試料を指す。
「組織又は細胞の試料」は、被検体又は患者の組織から採取された同種の細胞の集まりを意味する。組織又は細胞試料の供給源は、新鮮な、凍結された及び／又は保存されていた臓器や組織の試料又は生検又は吸引による固形組織；血液又はいずれかの血液成分；大脳脊髄液、羊水、腹水又は間質液などの体液；被検体の妊娠期又は発生期の任意の時期の細胞であってもよい。また、組織試料は原発性又は培養した細胞又は細胞株であってもよい。場合によっては、組織又は細胞の試料は罹患組織／臓器から得られる。組織試料は、防腐剤、抗凝血物質、バッファー、固定液、栄養分、抗生物質など天然の組織にはもともと混在していない化合物を含んでもよい。本明細書中で用いる「参照試料」、「参照細胞」、「参照組織」、「コントロール試料」、「コントロール細胞」又は「コントロール組織」は、本発明の方法又は組成物が同定するために用いられている疾患又は状態に罹患していないことがわかっているか、又は考えられている供給源から採取した試料、細胞又は組織を指す。一実施態様では、参照試料、参照細胞、参照組織、コントロール試料、コントロール細胞又はコントロール組織は、本発明の組成物又は方法によって疾患又は状態が同定される被検体又は患者と同じ身体の健康な部分から採取される。一実施態様では、参照試料、参照細胞、参照組織、コントロール試料、コントロール細胞又はコントロール組織は、本発明の組成物又は方法によって疾患又は状態が同定される被検体又は患者でない個体の身体の健康な部分から採取される。
本明細書中の組織試料の「切断部分(切片)」とは、組織試料の一部又は一片、例えば組織試料から切り出した組織又は細胞の一薄片を意味する。本発明が、組織試料の同じ切断部分が形態学的及び分子的レベルで分析されるか、又はタンパク質及び核酸の両方に関して分析される方法を含む場合に、組織試料の複数の切断部分が採取され、本発明に係る分析に供されてもよいと理解される。
「相関」又は「相関する」は、任意の方法で、第一の分析又はプロトコルの成績及び／又は結果を、第二の分析又はプロトコルの成績及び／又は結果と比較することを意味する。例えば、第二のプロトコルを行う際に第一の分析又はプロトコルの結果を用いてもよいし、及び／又は第一の分析又はプロトコルの結果を用いて、第二の分析又はプロトコルを行うかどうかを決定してもよい。遺伝子発現分析又はプロトコルの実施態様に関し、遺伝子発現分析又はプロトコルの結果を用いて、特定の治療投薬計画を実行するかどうかを決定してもよい。
本明細書中で用いられる「標識」なる言葉は、核酸プローブや抗体などの試薬に直接的又は間接的にコンジュゲートないしは融合され、コンジュゲートないしは融合した試薬の検出を容易にする化合物又は組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識又は蛍光性標識)であってもよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
「医薬」は、疾患、障害および／または状態を治療するために活性な薬剤である。一実施態様では、疾患、障害および／または状態は、狼瘡又はその症状又は副作用である。
本発明に従って用いられる場合、特定の治療薬又は治療選択に対する「耐性の増加」なる用語は、薬剤の標準的な用量又は標準的な治療手順に対する応答の減少を意味する。
本発明に従って用いられる場合、特定の治療薬又は治療選択に対する「感受性の減少」なる用語は、薬剤の標準的な用量又は標準的な治療手順に対する応答の減少を意味し、この応答の減少は薬剤の用量や治療の強度を増やすことによって、(少なくとも部分的に)補われうるものである。
「患者応答」は、限定するものではないが以下のものを含む患者に利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価できる。（１）緩徐化及び完全な停止を含む、ある程度の疾患進行の阻害、（２）疾患出現及び／又は症状の数の減少、（３）病変サイズの減少、（４）近接する末梢器官及び／又は組織への疾患細胞浸潤の阻害（すなわち減少、緩徐化又は完全な停止）、（５）疾患の拡がりの阻害（すなわち減少、緩徐化又は完全な停止）、（６）必ずではないが疾患病変の退縮又は除去が生じ得る自己免疫応答の減少、（７）障害と関連する一又は複数の症状の、ある程度の軽減、（８）治療後の無症候期間の増加、及び／又は（９）治療後の特定の時点での死亡率の減少。
「アンタゴニスト」は最も広い意味で用いられ、ＰＲＯなどのポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に阻害又は中和する、もしくはポリペプチドをコード化する核酸の転写又は翻訳を部分的又は完全に阻害するあらゆる分子が含まれる。例示的なアンタゴニスト分子には、これに限定されないが、アンタゴニスト抗体、ポリペプチド断片、オリゴペプチド、有機分子（小分子を含む）及びアンチセンス核酸が含まれる。
「アゴニスト」は最も広い意味で用いられ、ＰＲＯなどのポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に模倣する、もしくはポリペプチドをコード化する核酸の転写又は翻訳を部分的又は完全に増加するあらゆる分子が含まれる。例示的なアゴニスト分子には、これに限定されないが、アゴニスト抗体、ポリペプチド断片、オリゴペプチド、有機分子（小分子を含む）及びＰＲＯ関連ポリヌクレオチド、ＰＲＯポリペプチド及びＰＲＯ−Ｆｃ融合物が含まれる。
「ＰＲＯ又はＰＲＯ関連ポリヌクレオチドを標的とする治療薬」は、ＰＲＯ又はＰＲＯ関連ポリヌクレオチドの発現及び／又は活性に影響する任意の薬剤を意味し、当業者に既知の治療薬並びに後に開発される治療薬を含む、ここで述べられる何れかのＰＲＯアゴニスト又はアンタゴニストを含むが、これに限定されるものではない。
本明細書中で用いる「狼瘡治療薬」、「狼瘡を治療するために有効な治療的薬剤」及びこれらの文法上の変形は、臨床医によって有効な量で施された場合に狼瘡を有する被検体に治療上の有益をもたらすことがわかっているか、臨床上示されるか、又はそうであることが期待される薬剤を指す。一実施態様では、このフレーズには、有効な量で施された場合に狼瘡を有する被検体に治療上の効果をもたらすことが期待される臨床上許容される薬剤として、製造業者によって販売される、さもなくば有資格臨床医によって用いられる任意の薬剤が含まれる。一実施態様では、狼瘡治療薬には、アセチルサルチル酸(例えばアスピリン)、イブプロフェン(モトリン)、ナプロキセン(Naprosyn)、インドメタシン(インドシン)、ナブメトン(Relafen)、トルメチン(Tolectin)を含む非ステロイド性抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)、並びに治療上同等な活性成分(一又は複数)及びその製剤を含む任意の他の実施態様が含まれる。一実施態様では、狼瘡治療薬には、アセトアミノフェン(例えばタイルノール)、副腎皮質ステロイド又は抗マラリア薬(例えばクロロキン、ヒドロキシクロロキン)が含まれる。一実施態様では、狼瘡治療薬には、免疫調節性薬剤(例えばアザチオプリン、シクロホスファミド、メトトレキセート、シクロスポリン)が含まれる。一実施態様では、狼瘡治療薬は、抗Ｂ細胞薬剤(例えば抗ＣＤ２０(例えばリツキシマブ)、抗ＣＤ２２)、抗サイトカイン薬剤(例えば抗腫瘍壊死因子α、抗インターロイキン１レセプター(例えばアナキンラ)、抗インターロイキン１０、抗インターロイキン６レセプター、抗インターフェロンα、抗Ｂ-リンパ球刺激因子)、同時刺激のインヒビター(例えば抗ＣＤ１５４、ＣＴＬＡ４-Ｉｇ(例えばアバタセプト))、Ｂ細胞アネルギーのモジュレーター(例えばＬＪＰ３９４(例えばabetimus))である。一実施態様では、狼瘡治療薬には、ホルモン治療(例えばＤＨＥＡ)および抗ホルモン療法(例えば抗プロラクチン薬剤ブロモクリプチン)が含まれる。一実施態様では、狼瘡治療薬は、免疫吸着を提供する薬剤、抗補体因子(例えば抗Ｃ５ａ)、Ｔ細胞ワクチン、Ｔ細胞レセプターゼータ鎖による細胞形質移入、またはペプチド療法(例えば、抗DNAイディオタイプを標的とするedratide)である。
本明細書中で用いる、「販売承認」がある治療薬、又は「治療薬として承認され」ている治療薬、又はその文法上の変形は、関係政府団体(例えば、連邦、州ないしは地方の管理機関、部門、局)により、特定の疾患(例えば狼瘡)又は患者サブ集団(例えばループス腎炎を有する患者、特定の民族性、性別、生活習慣、疾患リスク性質などを有する患者)の治療のために、ある商業団体(例えば営利団体)によって、及び／又は該団体を介して、及び／又は該団体の代わりに販売されることが承認、許諾、登録又は権限を与えられている(例えば薬剤製剤、医薬の形態の)薬剤を指す。関連する政府独立団体には、例えば、食品・医薬品局(ＦＤＡ)、欧州医薬品審査庁(ＥＭＥＡ)およびその同等団体が含まれる。
「抗体」(Ａｂ)及び「免疫グロブリン」(Ｉｇ)は、類似の構造的特徴を有する糖タンパク質を意味する。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と、一般に抗原特異性を欠く抗体様分子の双方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系では低レベルで、骨髄腫では高レベルで産出される。
「抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は、最も広義で相互に交換可能に使用され、モノクローナル抗体(例えば、全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、所望の生物活性を示す限り二重特異性抗体)が含まれ、さらにある種の抗体断片(ここに詳細に記載されるもの)も含まれ得る。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化及び／又は親和成熟したものであってよい。
「抗ＰＲＯ抗体」又は「ＰＲＯに結合する抗体」は、抗体がＰＲＯをターゲッティングする際に診断用及び／又は治療用の薬剤として有用である程度に十分な親和性を有してＰＲＯを結合することが可能である抗体を指す。好ましくは、関係がなくＰＲＯでないタンパク質への抗ＰＲＯ抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)によって測定するところの、ＰＲＯへの抗体の結合のおよそ１０％未満である。ある実施態様では、ＰＲＯに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭの解離定数(Ｋｄ)を有する。ある実施態様では、抗ＰＲＯ抗体は、異なる種のＰＲＯ間で保存されるＰＲＯのエピトープに結合する。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、実質的にインタクトな形態の抗体を指し、以下に定義するような抗体断片は意味しない。この用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。ある実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。集合的に、Ｆｖの６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ（ａｂ'）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは二価でも二特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134；及びHollinger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134に記載されている。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる可能性がある変異、例えば自然に生じる突然変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」との形容は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。ある実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの、唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
「モノクローナル」との形容は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作製することができ、それらの技術には、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)；Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling et al.: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)；Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5);1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee et al., J. Immounol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004))、並びに、ヒト免疫グロブリン座位の一部又は全部、或るいはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒト又はヒト様抗体を生成する技術(例えば、国際公開第９８／２４８９３号；国際公開第９６／３４０９６号；国際公開第９６／３３７３５号；国際公開第９１／１０７４１号；Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号; Marks et al., Bio.Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照)が含まれる。
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。また次の文献とそこに引用されている文献を参考のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含むもの、及び／又はここに開示されたヒト抗体を作製する任意の技術を使用して製造されたものである。そのような技術には、ファージディスプレイのようなヒト由来組み合わせライブラリーのスクリーニング（Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)及びHoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)参照）；ヒトモノクローナル抗体産生のためのヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株の使用(Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)参照)；及び内因性の免疫グロブリンを産生しない、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）におけるモノクローナル抗体の生成(Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)参照)が含まれる。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト動物由来の抗原結合残基を含むヒト化抗体を除く。
「親和成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じさせる、その一又は複数のＣＤＲにおいて一又は複数の改変を持つものである。一実施態様では、親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られている手順によって生産される。Marks et al., Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和成熟について記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘導は、Barbas et al., Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al., Gene, 169：147-155(1995)；Yelton et al., J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al., J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins et al., J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
「阻止(ブロック)抗体」又は「アンタゴニスト抗体」は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低下させる抗体である。特定の阻止抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を、部分的又は完全に阻害する。
「小分子」又は「有機小分子」は、本明細書において５００ダルトン以下の分子量を有する有機分子と定義される。
「ＰＲＯ結合オリゴペプチド」又は「ＰＲＯに結合するオリゴペプチド」は、ＰＲＯを標的とした診断薬及び／又は治療薬として有用な程度にＰＲＯと十分な親和性で結合可能なオリゴペプチドである。ある実施態様では、関連のない非ＰＯＲタンパク質へのＰＲＯ結合オリゴペプチドの結合の程度は、ＰＲＯへのＰＲＯ結合オリゴペプチドの結合の約１０％より低く、その程度は例えば表面プラズモン共鳴アッセイにより測定される。ある実施態様では、ＰＲＯ結合オリゴペプチドは、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。
「ＰＲＯ結合有機分子」又は「ＰＲＯに結合する有機分子」は、ＰＲＯを標的とした診断薬及び／又は治療薬として有用な程度にＰＲＯと十分な親和性で結合可能な有機分子である。ある実施態様では、関連のない非ＰＯＲタンパク質へのＰＲＯ結合有機分子の結合の程度は、ＰＲＯへのＰＲＯ結合有機分子の結合の約１０％より低く、その程度は例えば表面プラズモン共鳴アッセイにより測定される。ある実施態様では、ＰＲＯ結合有機分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。
標的ポリペプチドに結合する任意の分子の解離定数（Ｋｄ）は、便宜上表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定され得る。そのようなアッセイは、２５℃で、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した標的ポリペプチドＣＭ５チップと共に、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いてもよい。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。標的ポリペプチドを１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。標的ポリペプチドの注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈した結合分子(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。Chen, Y. et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照のこと。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる抗体の結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
「リポソーム」は、例えば薬剤などの剤を哺乳動物に送達するのに有用な、様々な型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤から成る小さいベシクルである。リポソームの成分は、通常生体膜における脂質の配置と同様に、二重層構造に配置される。
本明細書で用いられる単語「標識」は、検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自体（例えば放射性同位元素標識又は蛍光標識）が検出可能であってもよく、酵素的な標識においては検出可能な生成物を生じる基質化合物又は組成物の触媒化学変化であってもよい。検出可能な標識としての機能を果たす放射性核種には、例えばＩ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２及びＰｄ−１０９が含まれる。
核酸、ポリペプチド又は抗体のような「単離された」生物学的分子は、少なくとも１つの自然環境の構成成分から同定及び分離、及び／又は回収されたものである。
本明細書中の「およそ」の値又はパラメーターをいう場合、その値又はパラメーター自体に関する実施態様を含む(記載する)。例えば、「およそＸ」との記載には「Ｘ」の記載が含まれる。
本明細書中に記載される本発明の態様及び実施態様には態様及び実施態様「からなる」及び／又は「から基本的になる」ものが包含されることは理解されるであろう。
ＩＩ．本発明の組成物及び方法を実施するための一般的な技術
本明細書では狼瘡に関連するヌクレオチドバリエーションが提供される。これらのバリエーションは、狼瘡のバイオマーカーを提供し、及び／又は、狼瘡の発症、持続及び／又は進行させやすくする、及び／又は狼瘡の発症、持続及び／又は進行させる。したがって、本明細書において開示される発明は、例えば狼瘡の診断及び治療に関する方法及び組成物の様々な設定に有用である。
遺伝子バリエーションの検出
上記方法のいずれかによると、核酸は、ゲノムＤＮＡ；ゲノムＤＮＡから転写されるＲＮＡ；又はＲＮＡから生成されるｃＤＮＡであってもよい。核酸は、脊椎動物（例えば哺乳動物）に由来してもよい。核酸は、その供給源から直接得られる場合、又はそれがその供給源において見出される核酸のコピーである場合、特定の供給源に「由来する」という。
核酸は、核酸のコピー（例えば増幅により生じるコピー）を含む。例えば、変異を検出するための材料の所望の量を得るために、場合により増幅が望ましいことがある。例えば、ＰＲＯ関連ポリヌクレオチド又はその一部は、核酸材料から増幅され得る。変異がアンプリコン内に存在するかどうか決定するために、アンプリコンを、後述するような変異検査法に供してもよい。
変異は、特定の周知の方法によって検出され得る。この種の方法は、ＤＮＡ塩基配列決定、アレル特異的ヌクレオチド取り込みアッセイ及びアレル特異的プライマー伸長アッセイ（例えばアレル特異的ＰＣＲ、アレル特異的ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）及びｇａｐ−ＬＣＲ）を含むプライマー伸長アッセイ；アレル特異的オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション検定法（例えばオリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ）；切断剤からの保護を核酸デュプレックスのミスマッチ塩基を検出するために用いる切断保護アッセイ；ＭｕｔＳタンパク質結合の分析；変異体及び野生型核酸分子の可動性を比較する電気泳動的解析;、変性こう配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ、例えばMyers et al. (1985) Nature 313:495に記載）；ミスマッチ塩基対のＲＮアーゼ切断の分析；ヘテロ二本鎖ＤＮＡの化学的又は酵素による切断の分析；マススペクトル分析（例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）；遺伝子のビット分析（ＧＢＡ）；５’ヌクレアーゼ・アッセイ（例えばTaqMan（登録商標））；及び分子ビーコンを用いたアッセイを含むが、これに限定されるものではない。これらの方法のいくつかは、以下でより詳細に検討される。
標的核酸変異の検出は、その分野で公知の技術を用いて、標的核酸分子クローニング及び配列決定により達成され得る。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）のような増幅技術を、腫瘍組織のゲノムＤＮＡ標本から直接標的核酸配列を増幅するために用いることができる。増幅された配列の核酸配列が決定され、変異が同定される。増幅技術はその分野で公知であり、例えば、ＰＣＲはSaiki et al., Science 239:487, 1988；米国特許第４６８３２０３号及び同第４６８３１９５号において記載される。
その分野で公知であるリガーゼ連鎖反応もまた、標的核酸配列を増幅するために用いることができる。Wu et al., Genomics 4:560-569 (1989)参照。さらにアレル特異的ＰＣＲとして公知の技術もまた、変異（例えば置換）を検出するために用いることができる。Ruano and Kidd (1989) Nucleic Acids Research 17:8392; McClay et al. (2002) Analytical Biochem. 301:200-206参照。この技術のある実施態様において、アレル特異的プライマーを用いることができ、そのプライマーの３’末端ヌクレオチドは標的核酸における特定の変異に相補的である（すなわち、特異的に塩基対合できる）。特定の変異がない場合、増幅産物は観察されない。Amplification Refractory Mutation System（ＡＲＭＳ）もまた、変異（例えば置換）を検出するために用いることができる。ＡＲＭＳは、例えば、欧州特許出願公開０３３２４３５及びNewton et al., Nucleic Acids Research, 17:7, 1989において記載される。
変異（例えば置換）を検出するために有用な他の方法は（1）単一塩基伸長アッセイなどのアレル特異的ヌクレオチド取り込みアッセイ（Chen et al. (2000) Genome Res. 10: 549-557；Fan et al. (2000) Genome Res. 10: 853-860；Pastinen et al. (1997) Genome Res. 7: 606-614；及びYe et al. (2001) Hum. Mut. 17: 305-316)参照）；（2）アレル特異的ＰＣＲを含むアレル特異的プライマー伸長アッセイ（Ye et al. (2001) Hum. Mut. 17: 305-316；及びShen et al. Genetic Engineering News, vol. 23, Mar. 15, 2003参照）；（3）５’ヌクレアーゼアッセイ（De La Vega et al. (2002) BioTechniques 32：S48-S54（TaqMan（登録商標）アッセイを記載）； Ranade et al. (2001) Genome Res. 11: 1262-1268；及びShi (2001) Clin. Chem. 47:164-172参照)；（4）分子ビーコンを用いるアッセイ（Tyagi et al. (1998) Nature Biotech. 16:49-53；及びMhlanga et al. (2001) Methods 25:463-71参照）；及び、（5）オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ（Grossman et al. (1994) Nuc. Acids Res. 22: 4527-4534；米国特許出願公開ＵＳ２００３／０１１９００４Ａ１；ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１／９２５７９Ａ２；及び米国特許第６０２７８８９号参照）を含むが、これに限定されるものではない。
変異は、ミスマッチ検出法によってもまた検出され得る。ミスマッチは、１００％相補的でないハイブリダイズされた二本鎖核酸である。完全な相補性の欠如は、欠失、挿入、逆転又は置換に起因している場合がある。ミスマッチ検出法の１つの例は、例えば、Faham et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 102:14717-14722 (2005)及びFaham et al., Hum. Mol. Genet. 10:1657-1664 (2001)において記載されるMismatch Repair Detection（ＭＲＤ）アッセイである。他のミスマッチ切断技術の例は、ＲＮアーゼ保護法であり、Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7575, 1985及びMyers et al., Science 230:1242, 1985においてその詳細が記載される。例えば、本発明の方法は、ヒト野生型標的核酸に相補的な標識化されたリボプローブを用いてもよい。組織サンプルの由来される標的核酸及びリボプローブは、共にアニール（ハイブリダイズ）され、二本鎖ＲＮＡ構造におけるいくつかのミスマッチを検出することが可能な酵素ＲＮアーゼＡによってその後消化される。ミスマッチがＲＮアーゼＡによって検出されると、ミスマッチの部位で切断される。したがって、アニールされたＲＮＡ標本が電気泳動的ゲルマトリックスに分離され、ミスマッチが検出されてＲＮアーゼＡによって切断された場合、リボプローブ及びｍＲＮＡもしくはＤＮＡに対して全長二本鎖ＲＮＡより小さいＲＮＡ産物が確認される。リボプローブは、標的核酸の完全長である必要はなく、それが変異を有すると推測される位置を含むならば標的核酸の一部であってもよい。
これと同様の方法で、例えば酵素的もしくは化学的な切断を通して、ミスマッチを検出するためにＤＮＡプローブを用いることができる。Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397, 1988；及びShenk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:989, 1975参照。あるいは、ミスマッチは、マッチする二本鎖と比較して、ミスマッチ二本鎖の電気泳動易動度の変動によって検出することができる。Cariello, Human Genetics, 42:726, 1988参照。変異を含むと推測される標的核酸は、リボプローブ又はＤＮＡプローブのいずれかにより、ハイブリダイゼーションの前に増幅されてもよい。特に標的核酸の変化が、大きな再配列（例えば欠失及び挿入）である場合、その変化はサザンハイブリダイゼーションを用いても検出できる。
標的核酸又は周囲のマーカー遺伝子に対する制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）プローブを、変異（例えば挿入又は欠失）の検出に用いることができる。挿入及び欠失を、標的核酸のクローニング、配列決定及び増幅により検出することができる。一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析もまた、アレルの塩基変化変異体の検出に用いることができる。Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770, 1989及びGenomics, 5:874-879, 1989参照。
本発明の組成物
本発明は、ＳＮＰを含むポリヌクレオチド又はその断片を含む単離されたポリヌクレオチドの組成物を提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドはＰＲＯ関連のポリヌクレオチドである。
特に、本発明は、狼瘡を発症するリスクにある被検体を表すか、又は疾患又はその症状ないし状態を表す遺伝子プロファイル又はシグネチャーとして用いられうるＳＮＰの固有の群及び／又は組合せを含む組成物を提供する。本明細書において開示される多型は、狼瘡を発症するリスクを評価するためのバイオマーカとしてだけでなく、診断試薬の設定のための標的としても有用である。ある実施態様では、ＳＮＰは遺伝子と関係していない。他の実施態様では、ＳＮＰは遺伝子と関連しており、遺伝子間又は遺伝子内領域に位置し得、より具体的にはコード領域又は非コード領域に位置しうる。本発明のＳＮＰと関連する遺伝子は未知の遺伝子と関連していてもよいし、ＩＴＧＡＭやＢＬＫなどの公知の遺伝子と関連していてもよい。
本明細書中で同定されるＳＮＰにより、本発明の一又は複数のＳＮＰを含む異なる遺伝子シグネチャーを表す狼瘡患者サブ集団の診断及び標的治療を含む、遺伝学的に同定された狼瘡患者の診断及び治療に用いるための、治療薬の開発のための標的が提供される。例えば、一実施態様では、本明細書において同定された遺伝子バリエーションを含む遺伝子、及びこれら遺伝子に関連する核酸(例えばＤＮＡ又はＲＮＡ)、及びこれら遺伝子にコードされるタンパク質は、治療薬(例えば小分子化合物、抗体、アンチセンス／ＲＮＡｉ薬剤など)の開発のための標的として、又は直接狼瘡の治療のための治療薬(例えば治療用タンパク質など)として使用されうる。
したがって、一態様では、本発明は、狼瘡を発症するリスクを評価するための特有の遺伝子シグネチャーを形成する一又は複数のＳＮＰの群を提供する。一態様では、特有の遺伝子シグネチャーは、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択されるおよそ１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０又は４０〜５０のＳＮＰを含む。
一態様では、特有の遺伝子シグネチャーは、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される一又は複数のＳＮＰ、２以上のＳＮＰ、３以上のＳＮＰ、４以上のＳＮＰ、５以上のＳＮＰ、６以上のＳＮＰ、７以上のＳＮＰ、８以上のＳＮＰ、９以上のＳＮＰ、１０以上のＳＮＰ、１１以上のＳＮＰ、１２以上のＳＮＰ、１３以上のＳＮＰ、１４以上のＳＮＰ、１５以上のＳＮＰ、１６以上のＳＮＰ、１７以上のＳＮＰ、１８以上のＳＮＰ、１９以上のＳＮＰ、２０以上のＳＮＰを含む。一態様では、遺伝子シグネチャーのＳＮＰは表６から選択される。他の態様では、ＳＮＰは、ｒｓ９８８８７３９、ｒｓ１３２７７１１３、ｒｓ７５７４８６５、ｒｓ２２６９３６８、ｒｓ６８８９２３９、ｒｓ２３９１５９２およびｒｓ２１１７７７７０からなる群から選択される。他の態様では、ＳＮＰは、ｒｓ２１８７６６８、ｒｓ１Ｏ４８８６３１、ｒｓ７５７４８６５、ｒｓ９８８８７３９、ｒｓ１３２７７１１３、ｒｓ２４３１６９７、ｒｓ６５６８４３１、ｒｓ１０４８９２６５、ｒｓ２４７６６０１、ｒｓ２２６９３６８、ｒｓ１８０１２７４、ｒｓ４９６３１２８、ｒｓ５７５４２１７、ｒｓ６４４５９７５、ｒｓ３１２９８６０、ｒｓ１０５１６４８７、ｒｓ６８８９２３９、ｒｓ２３９１５９２およびｒｓ２１７７７７０からなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、少なくともおよそ１０ヌクレオチド長である単離されたポリヌクレオチド(例えばＤＮＡ又はＲＮＡ)又はその断片であって、このとき該ポリヌクレオチド又はその断片が、a) 図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一のヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置での遺伝子バリエーション、又はb) (a)の相補鎖を含むものであるポリヌクレオチド又はその断片を提供する。一実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一のヌクレオチド多型(ＳＮＰ)を含むゲノムＤＮＡである。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される単一のヌクレオチド多型(ＳＮＰ)を含むＲＮＡである。
本発明の一実施態様では、Ｂリンパ球チロシンキナーゼ(ＢＬＫ)及びＣ８ｏｒｆ１３(染色体８ｐ２３．１)の転写開始部位の上流の領域にある遺伝子バリエーションは、米国及びスウェーデンの症例／コントロール系列において疾患リスクと相関しており(ｒｓ１３２７７１１３、ＯＲ＝１．３９、メタＰ＝１×１０−１０)、Ｂ細胞株における変化したｍＲＮＡレベルとも相関している。他の実施態様では、インテグリンαＭ(ＩＴＧＡＭ)及びインテグリンαＸ(ＩＴＧＡＸ)領域(染色体１６ｐ１１．２)内のバリエーションは、組み合わせた試料においてＳＬＥと相関している(ｒｓ１１５７４６３７、ＯＲ＝１．３３、メタＰ＝３×１０−１１)。ＳＬＥでの包括的な全ゲノム相関スキャンでは、本発明者等は、複製により２つの新規の遺伝子座を同定し、確認した。その遺伝子座は、a) ＢＬＫの発現減少とＣ８ｏｒｆ１３の発現増加と相関するプロモーター領域対立遺伝子と、b) ＩＴＧＡＭの２つの共通する非同義の対立遺伝子と強い連鎖不平衡にあるＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸ領域内のＳＮＰ(又はその変異体)である。
一実施態様では、ポリヌクレオチド又はその断片は、少なくともおよそ１０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ１５ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ２０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ３０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ４０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ５０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ６０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ７０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ８０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ９０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ１００ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ１１０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ１３０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ１４０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ１６０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ１７０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ１９０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ２００ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ２５０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ３００ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ３５０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ４００ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ５００ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ６００ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ７００ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ８００ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ９００ヌクレオチド長、あるいは少なくともおよそ１０００ヌクレオチド長、及びあるいは少なくともおよそ完全長コード配列である。これらの実施態様のいずれかでは、完全長ポリヌクレオチド又は断片には、ＳＮＰの天然に生じる連接領域の一部又はすべてが含まれうる。ここでは、「およそ」なる用語は参照した長さの±１０％の長さの参照したヌクレオチド配列を意味する。
他の実施態様では、ポリヌクレオチドの配列は、例えば図１から１７及び表１から１０に示すような、連鎖不平衡領域内の遺伝子バリエーションを含む。一実施態様では、遺伝子バリエーションは遺伝子(又はその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡ内にあり、このとき該遺伝子(又はその制御領域)は図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。他の実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。他の実施態様では、上記いずれかのポリヌクレオチドの相補鎖が提供される。他の実施態様では、上記いずれかのポリヌクレオチドによってコードされるＰＲＯが提供される。
一実施態様では、本明細書において提供される単離されたポリヌクレオチドは、例えば、放射性同位体、蛍光剤又は色素生産性薬剤により検出可能に標識される。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドはプライマーである。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド、例えば対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドである。他の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、例えば、７〜６０ヌクレオチド長、９〜４５ヌクレオチド長、１５〜３０ヌクレオチド長、又は１８〜２５ヌクレオチド長であってもよい。他の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＮＡ、モルフォリノ-ホスホラミデート、ＬＮＡ、又は２'-アルコキシアルコキシであってもよい。本明細書において提供されるオリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子バリエーションの検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。
一実施態様では、本発明は、少なくとも１、２、３、４又は５のＰＲＯ関連ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることができる複数のポリヌクレオチド、図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰの位値に対応するヌクレオチド位置に遺伝子バリエーションを含む各ＰＲＯ関連ポリヌクレオチド、又は該ＰＲＯ関連ポリヌクレオチドの相補鎖を含む組成物を提供する。一実施態様では、アレイ、遺伝子チップ、または遺伝子群(例えば、別々に提供されるか又は混合物として提供される遺伝子又はその断片の群)としてポリヌクレオチドが提供される。他の実施態様では、遺伝子バリエーション(例えば置換)を含むＰＲＯ関連ポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズする対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドが提供される。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰの位値に対応するヌクレオチド位置にある。そのような実施態様では、遺伝子バリエーションは、図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。ＰＲＯ関連ポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズした場合、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドは遺伝子バリエーションと塩基対になるヌクレオチドを含む。他の実施態様では、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドの相補鎖が提供される。他の実施態様では、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド又はその相補鎖を含むマイクロアレイが提供される。他の実施態様では、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド又はその相補鎖は、対立遺伝子特異的なプライマーである。一実施態様では、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドはＰＲＯ関連ポリヌクレオチド内に遺伝子バリエーションを含み、このとき該ＰＲＯ関連ポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば、図１から１７および表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードする。一実施態様では、遺伝子バリエーションは遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡにあり、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域内にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域内にある。他の実施態様では、上記いずれかのポリヌクレオチドの相補鎖が提供される。
対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドは、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドと同一であるが、ただし、遺伝子バリエーションと特異的に塩基対になるヌクレオチドが、野生型のＰＲＯ関連ポリヌクレオチドに存在する対応するヌクレオチドと特異的に塩基対になるヌクレオチドに置換されている、コントロールオリゴヌクレオチドとの結合に用いられうる。このようなオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドが、遺伝子バリエーションを含むＰＲＯ関連ポリヌクレオチドと対応する野生型ヌクレオチドを含むＰＲＯ関連ポリヌクレオチドとを区別することが可能なハイブリダイゼーション条件下で競合的結合アッセイに用いられてもよい。
例えばオリゴヌクレオチドの長さおよび塩基組成に基づく慣例的な方法を用いて、当業者は、(a)対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドが野生型ＰＲＯ関連ポリヌクレオチドと比較して遺伝子バリエーションを含むＰＲＯ関連ポリヌクレオチドに選択的に結合し、(b)コントロールオリゴヌクレオチドが遺伝子バリエーションを含むＰＲＯ関連ポリヌクレオチドと比較して野生型ＰＲＯ関連ポリヌクレオチドに選択的に結合する、適切なハイブリダイゼーション条件に想到することができる。例示的な条件には、高いストリンジェンシーの条件、例えば５５℃で５×標準生理食塩リン酸塩ＥＤＴＡ(ＳＳＰＥ)および０．５％ＮａＤｏｄＳＯ４(ＳＤＳ)でハイブリダイゼーションした後、５５℃又は室温で２×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳにて洗浄するハイブリダイゼーション条件が含まれる。他の実施態様では、野生型ＰＲＯと比較して、アミノ酸バリエーションを含むＰＲＯに選択的に結合する結合剤が提供される。一実施態様では、アミノ酸バリエーションは、図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰ(例えばこれらの図又は表のいずれかの任意の特定のＳＮＰを含む)に対応するヌクレオチド位置での遺伝子バリエーションの任意の結果である。他の実施態様では、結合剤は抗体である。
使用方法
また、本発明は本発明の方法を実施する際に使用するために好適な多様な組成物を提供する。一実施態様では、本発明は、図１から１７及び表１から１０に開示される一又は複数の遺伝子バリエーションを検出するために有用な少なくとも一の核酸分子を含む。このような核酸分子は、例えば、狼瘡の検出、アッセイ及び治療のための本発明の方法において用いられうる。いくつかの実施態様では、核酸分子は本明細書中に記載のような固形基質に接着される。
他の実施態様では、本発明は、本発明の方法に用いられうるアレイを提供する。一実施態様では、本発明のアレイは、一又は複数の遺伝子バリエーションを検出するために有用な個々の又は集合の核酸分子を含む。例えば、本発明のアレイは、一連の別々に配置された個々の対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド、又は対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドの群を含んでもよい。ガラススライドなどの固形基質へ核酸を接着させる技術のいくつかは当分野で周知である。一方法は、アミン基、アミン基の誘導体又は正に電化した他の基などの固形基質に接着することができる反応性部分を包含する修飾した塩基又は類似体を、合成された核酸分子に組み込むことである。次いで、合成された生成物をアルデヒドや他の反応基にてコードしたガラススライドなどの固形基質と接触させる。アルデヒド又は他の反応基は、増幅された生成物上の反応性部分と共有的な結合を形成し、それによりガラススライドに共有結合的に接着されるであろう。また、アミノプロピルシリコン表面化学などの他の方法も当分野で公知である。
上記のいずれかの方法に係る生体試料は、当分野で公知のある方法を用いて採取されうる。生体試料は脊椎動物、特に哺乳動物から採取されうる。腫瘍組織の代表的な切片を得るために組織生検が用いられることが多い。あるいは、腫瘍細胞は、対象とする腫瘍細胞を含むことがわかっているか又はそうであることが予測される組織又は体液の形態で間接的に得られうる。例えば、肺癌病変の試料は、切除術、気管支鏡検査法、細針吸引、気管支のブラッシングによって、又は痰、胸水又は血液から得られてもよい。標的核酸(またはコード化されたポリペプチド)におけるバリエーションは、腫瘍試料から、または、他の身体試料、例えば尿、痰又は血清から検出されてもよい。(癌細胞は腫瘍から剥がれ落ち、その生体試料に現れる。)前記の生体試料をスクリーニングすることによって、癌などの疾患の簡単な早期診断が達成されうる。加えて、療法の経過は、標的核酸(またはコード化されたポリペプチド)におけるバリエーションについて前記の生体試料を試験することによって、より容易にモニターされうる。さらに、腫瘍細胞について組織調製物を濃縮する方法は当分野で公知である。例えば、パラフィン又はクリオスタット切片から組織を単離してもよい。また、癌細胞はフローサイトメトリー又はレーザーキャプチャー法により通常の細胞から分離させてもよい。
被検体又は組織ないし細胞試料が本明細書において開示された遺伝子バリエーションを含むことを決定した後、被検体の狼瘡状態を治療するために、適切な狼瘡治療薬の有効量が被検体に投与されうることが考慮される。本明細書中に記載の多様な病的状態の哺乳動物の診断は熟練した実施者によってなされうる。例えば、哺乳動物の狼瘡の診断又は検出を可能にする診断用技術は当分野で利用できる。
狼瘡治療薬は、ボーラス静脈内投与、又はある期間の連続注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、くも膜下腔内、経口、局所又は吸入の経路などの既知の方法で投与される。場合によって、多様な市販のデバイスを用いてミニポンプ注入により投与されてもよい。
狼瘡治療薬を投与するための有効用量および投与計画は経験的に決定されてもよく、このような測定は当分野の技術の範囲内である。単一又は複数の用量が使用されてもよい。例えば、単独で用いるインターフェロンインヒビターの有効用量又は有効量はおよそ１ｍｇ／ｋｇからおよそ１００ｍｇ／ｋｇ体重又は１日につきそれ以上であってもよい。用量の種間のスケーリングは例えばMordenti et al., Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991)に開示されるような当分野で公知の方法で実施されうる。
狼瘡治療薬がインビボ投与される場合、通常の用量は、投与経路に応じて、およそ１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ哺乳動物体重又は１日につきそれ以上、好ましくはおよそ１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日であってもよい。特定の用量および運搬の方法に関する手引きは以下の文献に示される。例として、米国特許第４６５７７６０号、同第５２０６３４４号、又は同第５２２５２１２号を参照のこと。異なる製剤が異なる処置化合物及び異なる疾患のために効果的であること、及び一つの器官または組織を標的とする投与は例えば他の器官または組織への投与と異なる方法で運搬する必要があることは予測されることである。
更なる療法がこの方法に用いられうることが考慮される。一又は複数の他の療法には、問題の障害のためのステロイド投与、及び他の標準的な治療投薬計画が含まれるがこれらに限定されるものではない。例えば目標とする狼瘡治療薬とは異なる薬剤として他の療法が使用されてもよいことが考えられる。
また、本発明は、生体試料から得られるＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドにおいてバリエーションを検出することによる狼瘡の存在の検出方法を提供する。一実施態様では、生体試料は、狼瘡を有することが疑われる哺乳動物から得られる。
また、本発明は、遺伝子バリエーションが生体試料から得られたＰＲＯ関連ポリヌクレオチド内に存在するか否かを決定することによる生体試料の遺伝子型の決定方法を提供する。一実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰの位置に対応するヌクレオチド位置にある。前記のある実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。他の実施態様では、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば、図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードする。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡであって、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。他の実施態様では、生体試料は、バリエーションを含むＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドを含むことが知られているか又はそうであることが予測される。他の実施態様では、生体試料は、細胞株、例えば一次又は不死化した細胞株である。前記のある実施態様では、遺伝子タイピングは疾患を分類するか又は疾患をサブ分類するための基準を示す。
また、本発明は、生体試料の細胞から得られたＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドにおいてバリエーションを検出することによる、バリエーションを含むＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドを含むことが知られているか又はそうであることが疑われる哺乳動物からの生体試料における細胞の同定方法を提供する。一実施態様では、バリエーションは遺伝子バリエーションである。一実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰの位値に対応するヌクレオチド位置にある。前記のある実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。他の実施態様では、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば、図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードする。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡであって、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。
また、本発明は、哺乳動物から得た生体試料由来のＰＲＯまたはＰＲＯ関連のポリヌクレオチドにおいてバリエーションの存在を検出することによる、哺乳動物の狼瘡の診断方法であって、このとき生体試料がバリエーションを含むＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドを含むことがわかっているか又はそうであることが予測される方法を提供する。また、本発明は、哺乳動物から得た生体試料由来のＰＲＯまたはＰＲＯ関連のポリヌクレオチドにおいてバリエーションの存在を検出することによる、哺乳動物の狼瘡を診断する際の補助方法であって、このとき生体試料がバリエーションを含むＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドを含むことがわかっているか又はそうであることが予測される方法を提供する。一実施態様では、バリエーションは遺伝子バリエーションである。一実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰの位値に対応するヌクレオチド位置にある。前記のある実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。他の実施態様では、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば、図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードする。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡであって、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。
狼瘡を発達させるリスク、及び治療への応答を評価するために、当分野で公知の、本明細書中に記載の様々なアルゴリズムを使用することができる。表現型と関係している変異は、更なる対立遺伝子の用量依存的な様式で相互作用しうる。本発明のいくつかの実施態様では、層別化方式に基づくアルゴリズムは、狼瘡を発達させるリスク、疾患重症度および治療に対する応答を評価するために用いてもよい。狼瘡症例は保持するリスク対立遺伝子の数に応じて層別化されうる。一実施態様では、リスク対立遺伝子は、遺伝子座からコントロールと比較して狼瘡症例において濃縮される対立遺伝子として定められる。例えば、一実施態様では、１８の遺伝子座から合計１９の対立遺伝子が挙げられる場合、リスク対立遺伝子の最大数は３８となる。本明細書中に記載のように、リスク対立遺伝子の数と三分位数の分布によって層別化された狼瘡症例が決定されうる。次いで、狼瘡症例の三分位値は、疾患重症度、リスクおよび治療に対する応答の相違について調べられてもよい。他の実施態様では、被検体がＰＲＯまたはＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内にバリエーションを含むか否かを決定することによって、狼瘡を有する被検体が、ＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドを標的とする治療薬に応答するか否かを予測する方法であって、このときＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドにおいてバリエーションが存在した場合に、被検体が治療薬に応答することが示される方法が提供される。一実施態様では、バリエーションは遺伝子バリエーションである。一実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰの位置に対応するヌクレオチド位置にある。前記のある実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。他の実施態様では、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードする。一実施態様では、遺伝子バリエーションは遺伝子(又はその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡ内にあり、このとき該遺伝子(又はその制御領域)は図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。
また、本発明は、被検体又は該被検体から得た試料における、図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰの位置に対応するヌクレオチド位置での遺伝子バリエーションの有無の検出方法であって、(a) 核酸とポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション複合体の形成に適切な条件下で、被検体又は試料内の核酸を、上記いずれかのポリヌクレオチドと接触させ、そして、(b) 該ポリヌクレオチドがヌクレオチド位置で核酸と特異的に塩基対合するか否かを検出することによる方法も包含する。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰの位値に対応するヌクレオチド位置にある。前記のある実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードする。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡにあり、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。
また、本発明は、ＰＲＯに関連する核酸における遺伝子バリエーションの有無の検出方法であって、(a) 対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドの核酸へのハイブリダイゼーションに適切な条件下で、核酸を、遺伝子バリエーションに特異的である対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドに接触させ、そして、(b) 対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーションの有無を検出することを含む方法を提供する。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰの位値に対応するヌクレオチド位置にある。前記のある実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードする。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡにあり、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。他の実施態様では、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドは対立遺伝子六位的なプライマーである。
また、本発明は、ＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドにおけるバリエーションの被検体での有無を検出することによる、狼瘡を発達させる被検体の素因の評価方法であって、このときＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドにおいてバリエーションが存在する場合に被検体が狼瘡を発達させ易くなることが示される方法を提供する。一実施態様では、バリエーションは遺伝子バリエーションである。一実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰの位値に対応するヌクレオチド位置にある。前記のある実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードする。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡにあり、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。
一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。
また、本発明は、哺乳動物の狼瘡のサブ分類方法であって、哺乳動物から得た生体試料において、図１から１７及び表１から１０のいずれかに示す単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置にＰＲＯ関連のポリヌクレオチドのバリエーションの存在を検出することを含み、このとき該生体試料がバリエーションを含むＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドを含むことがわかっているか含むことが予測されるものである方法を提供する。一実施態様では、バリエーションは遺伝子バリエーションである。一実施態様では、バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＰＲＯ関連ポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば、図１から１７および表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードする。一実施態様では、遺伝子バリエーションは遺伝子(又はその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡ内にあり、このとき該遺伝子(又はその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。一実施態様では、サブ分類は、組織／臓器の関与(例えばループス腎炎)、性別及び／又は民族性により特徴付けされる。
本発明の検出方法の一実施態様では、検出には、プライマー伸展アッセイ；対立遺伝子特異的なプライマー伸長アッセイ；対立遺伝子特異的なヌクレオチド取込みアッセイ；対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ；５'ヌクレアーゼアッセイ；分子ビーコンを用いたアッセイ；及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイから選択される工程を実施することが含まれる。
また、本発明は、患者サブ集団の狼瘡を治療するために有効な治療薬の同定方法であって、薬剤の有効性を、患者サブ集団内の単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置での遺伝子バリエーションの存在と比較することを含み、このときＳＮＰが、図１から１７及び表１から１０に示すＳＮＰの中の一つであることによって、該薬剤が該患者サブ集団の狼瘡を治療するために有効であると同定される方法を提供する。一実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰの位置に対応するヌクレオチド位置にある。前記のある実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば、図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードする。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡであって、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。
本発明の方法は、適切な場合及び必要に応じて、適切な臨床的介入処置を決定するために有用な情報を提供する。したがって、本発明の方法の一実施態様では、方法はさらに、本明細書に開示されるＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドにおけるバリエーションの有無の評価の結果に基づいて、臨床的介入処置を含む。例えば、適切な介入は、本発明の方法によって得られた遺伝学的情報に基づいた、その当時の任意の予防的又は治療的な工程の予防的および治療的な処置又は調整(一又は複数)を伴ってもよい。
当業者に明らかなように、本発明の任意の方法では、バリエーションの存在の検出が疾患の特徴(例えば疾患の存在又はサブタイプ)を確実に示すのに対して、バリエーションの非検出は、疾患の相互の特徴を示すことによって参考にもなるであろう。
また、本発明は、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチド又はその断片を含む核酸の増幅方法であって、このときＰＲＯ関連のポリヌクレオチド又はその断片は遺伝子バリエーションを含む方法を提供する。一実施態様では、方法は、(a) 該遺伝子バリエーションの５'又は３'配列にハイブリダイズするプライマーと核酸とを接触させ、そして(b) プライマーを伸展させて該遺伝子バリエーションを含む増幅産物を生成することを含む方法を提供する。一実施態様では、方法はさらに、遺伝子バリエーションの５'又は３'配列にハイブリダイズする第二のプライマーと増幅産物とを接触させ、そして第二プライマーを伸展させて第二の増幅産物を生成することを含む。前記のある実施態様では、方法はさらに、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅産物および第二増幅産物を増幅することを含む。
いくつかの実施態様では、遺伝子バリエーションは本発明のＳＮＰの位置に対応するヌクレオチド位置にある。前記のある実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば、図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードする。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡであって、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。
本発明の更なる方法には、哺乳動物からの組織又は細胞試料を入手すること、本明細書に開示されるバリエーションの有無について組織又は細胞を試験すること、そして該組織又は細胞試料におけるバリエーションの有無の決定によって、該哺乳動物に適切な治療薬の有効量を投与することを含む、哺乳動物の狼瘡の治療方法が包含される。場合によって、前記方法には、有効量の標的とする狼瘡治療薬と、場合によって第二の治療薬(例えばステロイドなど)を前記哺乳動物に投与することを含む。
一実施態様では、有効量のＰＲＯのアンタゴニスト又はアゴニストを被検体に投与することを含む、狼瘡の治療方法が提供される。一実施態様では、被検体は、ＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドにおけるバリエーションを表す。一実施態様では、バリエーションは遺伝子バリエーションである。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰの位値に対応するヌクレオチド位置にある。前記のある実施態様では、遺伝子バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば、図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードする。一実施態様では、遺伝子バリエーションは遺伝子(又はその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡ内にあり、このとき該遺伝子(又はその制御領域)は図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。
また、本発明は、遺伝子バリエーションが図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に存在することがわかっている被検体の狼瘡状態の治療方法であって、該状態を治療するために有効な治療薬を該被検体に投与することを含む方法を提供する。一実施態様では、バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、バリエーションは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードするＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内のＳＮＰである。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡにあり、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。
また、本発明は、狼瘡状態を有する被検体の治療方法であって、図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に遺伝子バリエーションを有する被検体の状態を治療するために有効であることがわかっている治療薬を被検体に投与することを含む方法を提供する。一実施態様では、バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、バリエーションは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードするＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内のＳＮＰである。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡにあり、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。
また、本発明は、狼瘡状態を有する被検体の治療方法であって、図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に遺伝子バリエーションをそれぞれ有する少なくとも５人の患者に薬剤が投与される少なくとも一の臨床試験において、該状態を治療するために有効であることが示された治療薬を被検体に投与することを含む方法を提供する。一実施態様では、バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、バリエーションは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードするＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内のＳＮＰである。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡにあり、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。一実施態様では、少なくとも５人の患者は、少なくとも５人の患者の群につき合計で２以上の異なるＳＮＰを有した。一実施態様では、少なくとも５人の患者は、少なくとも５人の患者の群全体で同じＳＮＰを有した。
また、本発明は、特定の狼瘡患者サブ集団の狼瘡被検体の治療方法であって、このとき該サブ集団は図１から１７及び表１から１０に挙げるＳＮＰに対応するヌクレオチド位置の遺伝子バリエーションとの相関に少なくとも一部特徴があり、該サブ集団のための治療薬として承認されている治療薬の有効量を被検体に投与することを含む方法を提供する。一実施態様では、バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、バリエーションは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードするＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内のＳＮＰである。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡにあり、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。一実施態様では、サブ集団はヨーロッパを起源とする。一実施態様では、本発明は、狼瘡治療薬を製造し、そして、狼瘡を有するか又は有すると思われ、図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応する位置に遺伝子バリエーションを有する被検体に該薬剤を投与するための指示書とともに薬剤をパッケージすることを含む方法を提供する。一実施態様では、バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、バリエーションは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードするＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内のＳＮＰである。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡにあり、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。
また、本発明は、狼瘡患者サブ集団における使用のための治療薬を特定する方法であって、図５から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応する位置の遺伝子バリエーションに特徴がある患者サブ集団に治療薬を投与するための指示書を提供することを含む方法を提供する。一実施態様では、バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、バリエーションは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードするＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内のＳＮＰである。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡにあり、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。一実施態様では、サブ集団はヨーロッパを起源とする。
また、本発明は、狼瘡患者サブ集団における使用のための治療薬の販売方法であって、図５から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応する位置での遺伝子バリエーションの、該サブ集団の患者における存在に特徴を有する患者サブ集団を治療するための治療薬の使用について聴衆に知らしめることを含む方法を提供する。一実施態様では、バリエーションは図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、バリエーションは、連鎖不平衡領域内の配列(例えば図１から１７及び表１から１０に示すような)によってコードされるＰＲＯをコードするＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内のＳＮＰである。一実施態様では、遺伝子バリエーションは、遺伝子(またはその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡにあり、このとき該遺伝子(またはその制御領域)は図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰを含む。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子の非コード領域にある。一実施態様では、ＳＮＰは遺伝子のコード領域にある。治療薬の使用を含む上記いずれかの方法の実施態様では、前記薬剤には本明細書に開示される狼瘡治療薬が含まれる。
また、本発明は、遺伝子バリエーションが図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に存在することがわかっている被検体においてＢ細胞レセプターを介するシグナル伝達を調整する方法であって、Ｂ細胞レセプターを介するシグナル伝達を調整するために有効な治療薬を被検体に投与することを含む方法を提供する。
また、本発明は、遺伝子バリエーションが図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に存在することがわかっている被検体においてＴＨＩ７細胞の分化を調整する方法であって、ＴＨＩ７細胞の分化を調整するために有効な治療薬を被検体に投与することを含む方法を提供する。
キット
本発明の一実施態様では、キットが提供される。一実施態様では、キットには本明細書中に記載のいずれかのポリヌクレオチドが場合によって酵素とともに具備される。一実施態様では、酵素は、ヌクレアーゼ、リガーゼ及びポリメラーゼから選択される少なくとも一の酵素である。
一実施態様では、本発明は、本発明の組成物と、被検体のゲノムが本明細書に開示される遺伝子バリエーションを含むか否かを決定することによって狼瘡を検出するための該組成物の使用についての指示書とを具備するキットを提供する。一実施態様では、本発明の組成物は、少なくとも１、２、３、４又は５のＰＲＯ関連ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることができる複数のポリヌクレオチド、図１から１７及び表１から１０のいずれかに示すＳＮＰの位値に対応するヌクレオチド位置に遺伝子バリエーションを含む各ＰＲＯ関連ポリヌクレオチド、又は該ＰＲＯ関連ポリヌクレオチドの相補鎖を含む。一実施態様では、本発明の組成物は、ＰＲＯの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドを含む。一実施態様では、本発明の組成物は、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチドの少なくとも一部に結合して、重合(例えば増幅)に影響することができる核酸プライマーを含む。一実施態様では、本発明の組成物は、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチド(又はその相補鎖)(又は対応する遺伝子産物)を特異的に検出する結合剤(例えばプライマー、プローブ)を含む。一実施態様では、本発明の組成物は、ＰＲＯの少なくとも一部に特異的に結合する結合剤を含む。一実施態様では、本発明は、治療薬を、本明細書に開示されるＰＲＯ関連のポリヌクレオチドにバリエーションを有する狼瘡患者を治療するための該薬剤の使用についての指示書と組み合わせて含む、製造品を提供する。
上記又は先に提案した適用に用いるために、本発明によってキット又は製造品も提供される。このようなキットは、バイアル、チューブなどのような一又は複数の収容手段を厳密な管理下で保持するために区分されている運搬手段を含んでもよく、この収容手段のそれぞれが本方法に用いられる分離した成分の一つを含む。例えば、収容手段のうちの一つは、検出可能に標識されているか又は標識されうるプローブを含んでもよい。このようなプローブは、ＰＲＯ関連のポリヌクレオチドに特異的なポリヌクレオチドであってもよい。キットが標的核酸を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キットは、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチド(一又は複数)を収容する容器、及び／又は酵素、蛍光又は放射性の標識などのリポーター分子に結合した、アビジン又はストレプトアビジンなどのビオチン-結合タンパク質のようなレポーター手段を含む容器を有してもよい。
典型的に、本発明のキットは、上記の容器と、商業的および使用者の観点からみて望ましい物質、例えばバッファ、希釈液、フィルター、針、注射器および使用のための指示書を有するパッケージ挿入物を収容する一ないし複数のその他の容器とを具備する。特定の治療または非治療的用途に該組成物が使用されることを示すために容器上にラベルがあってもよく、またそのラベルは上記のようなインビボの使用またはインビトロの使用の何れかについての指導を示すものであってもよい。
本発明のキットは多くの実施態様を有する。典型的な実施態様は、容器と、該容器上のラベルと、該容器内に収容される組成物を具備するキットであり、この場合の組成物はＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドについての検出薬剤を含み、該容器上のラベルは、該組成物を用いて少なくとも一種類の哺乳動物細胞においてＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドの存在を評価することができることと、少なくとも一種類の哺乳動物細胞においてＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドの存在を評価するための検出薬剤の使用についての指示書を示すものである。さらに、キットは、組織試料を調整して組織試料の同一片に抗体およびプローブを適用するための一組の指示書と材料を具備しうる。例えば、キットは、容器と、該容器上のラベルと、該容器内に収容される組成物を具備してもよく、この場合の組成物はストリンジェントな条件下でＰＲＯ関連のポリヌクレオチドの相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、該容器上のラベルは、該組成物を用いて少なくとも一種類の哺乳動物細胞においてＰＲＯ関連のポリヌクレオチドの存在を評価することができることと、少なくとも一種類の哺乳動物細胞においてＰＲＯ関連のＲＮＡ又はＤＮＡの存在を評価するためのポリヌクレオチドの使用についての指示書を示すものである。
キットの他の任意の成分には、一ないし複数のバッファ(例えばブロックバッファ、洗浄バッファ、基質バッファなど)、酵素標識によって化学的に変化する基質などの他の試薬(例えば色素原)、エピトープ探索溶液、コントロール試料(ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロール)、コントロールスライド(一ないし複数)などがある。
販売方法
また、本発明には、狼瘡治療薬、又はその薬学的に許容可能な組成物の販売方法であって、標的とする相手に対し、採取した試料が本明細書に開示される遺伝子バリエーションの存在を示す狼瘡を有する患者又は患者の集団の治療に、本薬剤又は本薬剤の薬学的組成物の使用を促す、指示する、及び／又は明確に述べることを含む方法が包含される。
宣伝は、通常、スポンサーが特定されてメッセージが制御される非個人的媒体を通した有料の通信である。本発明の目的のために行われる販売には、公報、広告、製品の提供、後援、引受業務、及び販売促進が含まれる。この用語はまた、多くの対象者に訴えて、本発明の購入、後援、又は承認の好ましいパターンに向かって、説得、通知、促進、動機付け又はそれ以外の方法で行動させるようにつくられた、いずれかの活字媒体に登場するスポンサーによる情報の公示を含む。
本発明の診断方法の販売はいずれの手段で行ってもよい。これらのメッセージを伝えるために使用される販売媒体の例には、テレビ、ラジオ、映画、雑誌、新聞、インターネット及び看板が含まれ、電波媒体に登場するメッセージであるコマーシャルも含まれる。
使用される販売の種類は、多くの要因、例えば、病院、保険会社、診療所、医師、看護師、及び患者等の標的とする相手の性質、並びに経費検討、及び医薬と診断の販売を規定する関連の法律及び規則に応じて決定される。サービスのやりとり、及び／又はユーザーの人口統計及び所在地のようなその他のデータによって規定されるユーザーの特徴に基づいて、販売を個別化又はカスタマイズしてもよい。
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。先に一般的な記述が示されていれば、様々な他の実施態様が実施されうると理解される。
実施例１−３において引用した(数によって示す)文献についての書誌的情報は実施例３の後に示す。実施例４−６において引用した(数によって示す)文献についての書誌的情報は実施例６の後に示す。
実施例１ 全身性エリテマトーデスにおける全ゲノム相関スキャンの材料と方法
この実施例は、１３１１のＳＬＥ症例および３３４０のコントロールを含む多くの試料においてＳＬＥについての全ゲノムスキャンを実行するために用いた材料と方法を記述する。ヒトゲノムの約８５％にわたって共通のバリエーションをキャプチャした５０００００の変異に対して、２４を遺伝子タイピングし、ＳＬＥとの相関について試験した。
被検体
ＳＬＥ症例試料は以下の集団から遺伝子タイピングを行った。ａ) ＮＩＨ／ＮＩＡＭＳが資金供給した管理機関である自己免疫性バイオマーカー協力ネットワーク(ＡＢＣｏＮ：Autoimmune Biomarkers Collaborative Network)25から３３８被検体、ｂ) 複数自己免疫性疾患遺伝子共同体(ＭＡＤＧＣ：Multiple Autoimmune Disease Genetics Consortium)26から１４１被検体、ｃ) カリフォルニアサンフランシスコ大学(ＵＣＳＦ)狼瘡遺伝子プロジェクト10, 27から６１３被検体、及びｄ) ピッツバーグメディカルセンター大学(ＵＰＭＣ)28から３３５被検体とファインスタインメディカルリサーチ研究所で集められた８試料。すべてのＳＬＥ症例は自称白人であった。ＳＬＥの診断(米国リウマチ学会(ＡＣＲ)規定の判定基準29の４以上の達成)は、医療記録検査(９４％)又は治療するリウマチ専門医(６％)による文書による判定基準よってすべての症例で確認された。臨床データを検討し、各々の機関で表にした。図４は、ＳＬＥの各１１のＡＣＲ分類判定基準のための計数およびパーセンテージを示す29。
合計３５８３のコントロール試料を相関分析で試験した。このプロジェクトの一部として、自称の民族性、性別および年齢に基づいて、１８６１のコントロール試料を選別し、次いでニューヨーク癌プロジェクト(ＮＹＣＰ)収集30から遺伝子タイピングを行った。加えて、１７２２の自称の白色人種コントロール試料からの遺伝子型データは、公的に利用できるｉＣｏｎｔｒｏｌＤＢデータベース<www.illumina.com/pages.ilmn?ID=231>から入手した。
複製のために、７９３人のスウェーデンのＳＬＥ患者(このすべての患者はＡＣＲによって定められるＳＬＥの分類判定基準のうちの４以上を満たした)および８５７の健康なスウェーデンのコントロール個体の独立した集団からのＤＮＡ試料を遺伝子タイピングした。患者は、ルンド、ウプサラ、カロリンスカ(Solna)およびウーメオ大学病院7のリウマチ専門病棟にいた。すべての共同している機関の施設内倫理委員会がこれらの試験を承認し、すべての参加者はインフォームドコンセントを受けた。
遺伝子タイピング
ＮＹＣＰからのコントロール試料(Ｎ＝１８６１)は、ファインスタイン研究所のIllumina HumanHap550遺伝子タイピングビーズチップ31にて遺伝子タイピングされた。１４６５の試料(４６４症例、１００１コントロール)はＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ１チップにて遺伝子タイピングされ、１８７５の試料(１０１５症例、８６０コントロール)はＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ３チップにて遺伝子タイピングされた。これら１４５２のコントロール試料の遺伝子型データは、ｉＣｏｎｔｒｏｌＤＢに提出され、公開前に公的に利用できるようになった。ＨｕｍａｎＨａｐ５５０ビーズチップを用いて遺伝子タイピングされた１７２２の白色人種の試料の更なる、独立した一群は、ｉＣｏｎｔｒｏｌＤＢ<www.illumina.com/pages.ilmn?ID=231>の試験６６および６７から入手した。症例試料は、一連のフェーズでファインスタイン研究所で遺伝子タイピングされた。系列１はＡＢＣｏＮおよびＭＡＤＧＣからの４７９症例からなり、系列２はＵＣＳＦからの６１３症例を含み、系列３はＵＰＭＣおよびファインスタイン研究所からの３８７症例を含む。両方のＨｕｍａｎＨａｐ５５０バージョンに存在する５４５０８０の単一ヌクレオチド多型性(ＳＮＰ)は分析を進めた。チップに対して８０％未満の平均コールレートを有する症例およびコントロール試料は再度遺伝子タイピングされた。
スウェーデンの複製集団では、Perkin-Elmerの試薬とUppsala <www.genotyping.se>のＳＮＰテクノロジープラットフォームでの蛍光偏光検出による均質な単一塩基プライマー伸展アッセイを用いて、ＳＮＰ ｒｓ１１５７４６３７およびｒｓ１３２７７１１３が遺伝子タイピングされた32。試料の遺伝子型コールレートは９６％であり、再現性は４．６％の遺伝子型の二重アッセイによると１００％であった。２０人の三世代ＣＥＰＨ家系はこの試験試料と並行して遺伝子タイピングされ、いずれのＳＮＰに関してもメンデル遺伝からの偏差は観察されなかった。
データ品質フィルター
９５％以下平均コールレートを有する(Ｎ＝４２)か又は個々の報告された性別が観察された性別と一致しない試料(Ｎ＝２１)を分析から除いた。ゲノム全体の状態による識別(ＩＢＳ)を各々の試料について推定し、曖昧な相関については試料を調べた。重複していると推定される組合せ又は１世代−３世代の血縁関係(1st-3rd degree relatives)から１試料を除いた(Ｐｉ＿ｈａｔ＞０．１０及びＺ１≧０．１５、Ｎ＝１６１)。３つのこれら組合せは症例とコントロールとを含んでいたので、コントロールを除いた。コントロール中ＨＷＥ Ｐ≦１×１０−６(Ｎ＝２８１９)又は１％未満の症例の頻度(Ｎ＝２１６４４)を有するＳＮＰを分析から除いた。５％より大きい欠測率(missingness)を有するＳＮＰ(Ｎ＝６０７４)は除いた。ＳＮＰは、症例とコントロールとの間の欠測率における有意差について試験された。Ｐ≦１×１０−５を有するＳＮＰ(Ｎ＝７６４６)を取り除いた。また、ＳＮＰは、例えばＡＢＣｏＮ試料と他のすべての症例との間のバッチ効果についても試験した。Ｐ＜１×１０−９を有するＳＮＰ(Ｎ＝１３)を除いた。
集団の外れ値をＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴ33を用いて検出した。上位１０のいずれかの主成分に従って平均から６の標準偏差を超える試料を分析から除いた(Ｎ＝１４１)。３３４０の残りのコントロール試料からのデータを、各々のＳＬＥ症例系列に比例してランダムに割り当てたところ、２．５以下のコントロール：症例比率となった(表１)。
系列１は４１１の症例および１０４７のコントロールからなり、系列２は５９５の症例および１５１６のコントロールを含み、系列３は３０５の症例および７７７のコントロールを含んだ。全体的に見て、９３％の症例は女性であり、６２％のコントロールは女性であった。男性と女性との間で、対立遺伝子頻度の有意な違いは認められなかった。
少なくとも一系列において２％より大きい欠測データであり、その欠測データが症例とコントロールとの間で不均一である(欠測差異、Ｐ＜１×１０−３)ＳＮＰを除いた(Ｎ＝３３２３)。Ｘ染色体の偽常染色体領域内のＳＮＰは有意な相関を示さず(Ｎ＝１３)、更なる分析に用いなかった。試料およびマーカーフィルタリングは、ソフトウエアプログラムＰＬＩＮＫ34内の分析的モジュールを用いて実施された。各々の系列について、合計５０２０３３のＳＮＰを以降の分析に進めた。
データ分析
ＳＬＥ罹患率に対するすべてのＳＮＰの相関は、２×２分割表を用いて算出した。次いで、各試料系列についてゲノムコントロールインフレーション因子(λｇｃ)を算出した。ゲノムコントロールインフレーション因子は、大部分の分布が帰無仮説(λｇｃ＝１．０)に一致するか否かを反映するカイ二乗中央値に基づく測定基準である。λｇｃ値＞１は、体系的な技術上の不自然な結果又は集団層別化の存在による平均カイ二乗相関統計値の上昇を示す。技術上の不自然な結果を最小限にするために質の低いデータを除いた後、各系列についてインフレーションの証拠を示した。系列１、２および３についてそれぞれ１．１４、１．１８および１．１１。集団層別化の存在を修正するために、各系列の主成分は、ＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴにおいてＳＮＰのサブセットを用いて算出した。ＳＮＰは第６染色体(２４−３６Ｍｂ)、第８染色体(８−１２Ｍｂ)、第１１染色体(４２−５８Ｍｂ)、及び第１７染色体(４０−４３Ｍｂ)上の構造的な変化のために異常なＬＤパターンの領域にあるので、症例ＭＡＦ＜２％(５０１１)、コントロールＨＷＥ Ｐ≦１×１０−４(１７９２)又は欠測データ＞１％(５０４１４)のＳＮＰを除去した。残りの４４０２０２のＳＮＰを用いて主成分を算出した。各々の系列において、初めの４つの主成分を用いて、すべての５０２０３３のＳＮＰのための相関統計値を調節した。集団層別化の調節の後、各々の系列のλｇｃは１．０に近づいた(表１を参照)。各々の系列の修正相関統計値は、λｇｃを組み込んでいるＺ値の加重結合と組み合わせた(図１２)。上位５０の遺伝子座を図５に示す。さらに、各系列のＱＣフィルターを通過させたすべてのＳＮＰの統計値と組み合わせた相関統計値を表にまとめた(示していない)。
最も相関する変異についての３つの症例−コントロール研究間の不均一性を試験するために、ＰＬＩＮＫに組み入れられるＢｒｅｓｌｏｗ−Ｄａｙ試験を各々３つの領域において最も相関が良いＳＮＰ：ＨＬＡ ＤＲＢ、ＳＴＡＴ４、ＩＲＦ５、ＢＬＫおよびＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸについて行った。有意な不均一性は検出されなかった(それぞれＰ＞０．２)。
Mantel-Haenszel不均一性試験とStata 9.2 (www.stata.com/)に組み入れた結合オッズ比を用いて、個々のＳＮＰとサブ表現型との相関を結合データセットのために算出した(図９)。ＡＣＲ判定基準は相関していることがわかっており、α＝０．０５／１１＝０．００４５の単純ボンフェローニ補正が非常に保存されているようであるので、算出したＰ値は多重試験で調節しなかった。
遺伝子発現分析
公的に利用できるデータセット(ＧＥＮＥＶＡＲプロジェクト、www.sanger.ac.uk/humgen/genevar/)からの２１０の関係のない、健康なＨａｐＭａｐ個体からのエプスタインバーウイルス形質転換Ｂ細胞株の遺伝子発現測定値を、ＳＬＥと有意に相関しているバリエーションに対する相関性について調べた36。具体的には、北欧及び西欧起源の米国住民(ＣＥＵ)６０、ヨルバ族(ＹＲＩ)６０、北京の中国漢民族(ＣＨＢ)４５、及び東京の日本人(ＪＰＴ)４５からの、ＢＬＫ(ＧＩ＿３３４６９９８１−Ｓ)、Ｃ８ｏｒｆ１３ (ＧＩ＿３２６９８７７２−Ｓ)、ＩＴＧＡＭ(ＧＩ＿６００６０１３−Ｓ)、ＩＴＧＡＸ (ＧＩ＿３４４５２１７２−Ｓ)、ＡＣＴＢ (βアクチン、ＧＩ＿５０１６０８８−Ｓ)、及びＧＡＰＤＨ (ＧＩ＿７６６９４９１−Ｓ)のプローブからの４測定値の平均蛍光強度を調べた。ＢＬＫ、Ｃ８ｏｒｆ１３、ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢの発現データはｒｓ１３２７７１１３遺伝子型(ＨａｐＭａｐ (www.hapmap.org)から入手)によって階層化され、差次的発現の有意性は、等しい分散量を呈する両側ｔ検定によって測定された。同様に、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢの発現データは、ｒｓ１１５７４６３７での遺伝子型によって階層化され、ｔ検定を用いて有意性について試験された。ＧＥＮＥＶＡＲプロジェクトによって示されるように、ＨａｐＭａｐ集団に対してログスケールで正規化した発現データは、平均蛍光強度と類似の結果となった。
４００のＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞の独立した一群におけるシス遺伝子バリエーションに対するＢＬＫおよびＣ８ｏｒｆ１３発現の相関は、近年公開された試験(www.sph.umich.edu/csg/liang/asthma/ )の調査とデータ検索によって入手した37。具体的には、Dixon et al.によって記載されるように、ＢＬＫ(プローブ２０６２５５＿ａｔ)およびＣ８ｏｒｆ１３(プローブ２２６６１４＿ｓ＿ａｔ)の発現レベルに対するｒｓ１３２７７１１３(ｒｓ４８４０５６８)のプロキシの相関を測定した37。
実施例２ 新規の罹患遺伝子座としてのＣ８ｏｒｆ１３／ＢＬＫ及びＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸの同定
全ゲノム相関分析
イルミナ(Illumina)チップ上の合計５０２０３３の多型ＳＮＰは品質管理フィルター(quality control filter)を通過し、３つの症例−コントロール系列を用いた段階的な様式でＳＬＥに対する相関について試験された(表１)。結合相関統計値は、ＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴ修正カイ二乗検定統計値から変換したＺスコアを加算して算出され、系列サイズについて加重され、各々の系列の残留λｇｃで調節した(方法を参照)。
ヌル分布のＰ値と比較したときの観察されたメタ分析Ｐ値の比較を図１に示す。分布の後部でヌル分布からの有意な偏差が観察され(図１Ａ中の黒菱形)、これは陽性の相関があることを示唆する。３つの認められたリスク遺伝子座についてＳＬＥとの強い相関が見られた。ＨＬＡ クラスII領域では、ｒｓ２１８７６６８はＤＲＢ１＊０３０１対立遺伝子38のほぼ完全な予測因子であり、組合せ分析において最も強くＳＬＥと相関した変異であった(Ｐ＝３×１０−２１)。更なる１５７のＨＬＡ領域ＳＮＰ(これらの多くはＤＲＢｌ＊０３０１対立遺伝子と相関している)は５×１０−７未満の観察Ｐ値を有していた(図１Ｂ)。インターフェロン調節因子５(ＩＲＦ５)の十分に確認されたリスクハプロタイプに連鎖した変異と強い相関が観察された(例えば、ｒｓ１０４８８６３１、Ｐ＝２×１０−１１)7-9。加えて、ＳＴＡＴ４との相関も観察された(ｒｓ７５７４８６５、Ｐ＝９×１０−１４)。ＳＬＥおよび関節リウマチとのＳＴＡＴ４相関が近年報告された10。ここでのＳＬＥデータセットは従来の報告のものと重複しており10、先の分析に含まれなかった更なる３４１の症例と２９０５のコントロールを含む。さらに、ここで報告される上位のＳＴＡＴ４ ＳＮＰのＰ値は、集団層別化に対して修正された。
カイ予測対観察分析からＨＬＡ、ＩＲＦ５及びＳＴＡＴ４のバリエーションを除いた後、ヌル分布からのＰ値の偏差は除去できなかったことから(図１Ａ、丸)、更なるＳＬＥ遺伝子座の存在が示唆される。図１Ｂに示すように、Ｂリンパ系チロシンキナーゼ(ＢＬＫ)遺伝子の近く、そしてインテグリンαＭ(ＩＴＧＡＭ)およびインテグリンαＸ(ＩＴＧＡＸ)遺伝子を含む領域にある複数のＳＮＰは、組合せ分析においてＳＬＥと非常に相関していた。これらの遺伝子又は領域はいずれも、ＳＬＥ罹患率に事前に関係していなかった。
ＢＬＫ／Ｃ８ｏｒｆ１３
第８染色体の短腕(８ｐ２３.１)上のいくつかの変異はＳＬＥと相関した(図２、表２、図８)。ｒｓ１３２７７１１３の「Ａ」対立遺伝子は、コントロールと比べて米国ＳＬＥ症例において非常に多かった(Ｐ＝８×１０−８、組合せＯＲ＝１．３９、９５％Ｃ．Ｉ．＝１．２６−１．５４)。この初めの観察を確認するために、スウェーデンからの７９３のＳＬＥ症例と８５７の一致コントロールの独立集団をｒｓ１３２７７１１３についてタイピングし、ＳＬＥに対する少数の「Ａ」対立遺伝子の信憑性のある相関も観察された(Ｐ＝３．６×１０−４、ＯＲ＝１．３３、９５％Ｃ．Ｉ．＝１．１３−１．５５；表２)。米国及びスウェーデンの試料を用いたｒｓ１３２７７１１３のメタ分析ではＰ＝１．４×１０−１０が示され、これは相関Ｐ＜５×１０−８の正確な全ゲノム有意閾値を上回るものである39。
ｒｓ１３２７７１１３は、反対方向で転写される２つの遺伝子、Ｂ細胞レセプターの下流のシグナルを伝達するｓｒｃファミリーチロシンキナーゼであるＢＬＫと、未知の機能の普遍的に発現される遺伝子であるＣ８ｏｒｆ１３との間にマップされる(図２)。ｒｓ１３２７７１１３を有する連鎖不平衡(ＬＤ)にあるＢＬＫ又はＣ８ｏｒｆ１３のコード領域変異は知られていない。
共通の遺伝子バリエーションは、シス遺伝子発現のレベルと相関することが示されている8, 36, 37, 40。関連のプロモーターＳＮＰがＢＬＫおよび／またはＣ８ｏｒｆ１３のｍＲＮＡ発現に影響するか否かを決定するために、２１０の関係のないＨａｐＭａｐ試料からのエプスタイン-バーウイルス形質転換Ｂリンパ球細胞株から生成される遺伝子発現データセットを対象とした36。ｒｓ１３２７７１１３の「Ａ」対立遺伝子はＢＬＫのｍＲＮＡ発現のレベル低減と著しく相関した(図２Ｂ)。Ａ対立遺伝子のホモ接合体は、Ｇ対立遺伝子のホモ接合体より５０％以下の低減した発現を示し、Ａ／Ｇヘテロ接合体は中間のレベルであった。興味深いことに、Ｃ８ｏｒｆ１３遺伝子の発現もリスクハプロタイプと相関していたが、逆方向であった。ｒｓ１３２７７１１３のＡ対立遺伝子は形質転換細胞株のＣ８ｏｒｆ１３の発現の上昇と相関していたのに対して、Ｇ対立遺伝子は発現の低減と有意に相関していた(図２Ｃ)。また、Ａ／Ｇヘテロ接合体は中間の発現レベルを示した。多くのコントロールｍＲＮＡ(例えばβアクチン、ＧＡＰＤＨ)の発現は、ｒｓ１３２７７１１３の遺伝子型に応じて細胞株において変化しておらず(図６)、すべてのＨａｐＭａｐ集団においてＢＬＫ発現の一致した対立遺伝的な差異が観察された(図７)。これらの結果は、４００のＨａｐＭａｐでない形質転換Ｂ細胞株における全ゲノムＳＮＰと遺伝子発現の独立したデータセットを分析することによって確認された37。このデータセットでは、ｒｓ１３２７７１１３(ｒｓ４８４０５６８、ｒ２＝０．７７)に相関したマーカーは、ＢＬＫの発現減少(Ｐ＝８．９×１０−２７、プローブ２０６２５５＿ａｔ)とＣ８ｏｒｆ１３の発現増加(Ｐ＝４．６×１０−３５、プローブ２２６６１４＿ｓ＿ａｔ)の両方と相関した。
ＩＲＦ１、ＰＰＡＲＧおよびインターフェロン刺激応答成分のモチーフを含む、複数の保存された転写因子結合部位はＢＬＫおよびＣ８ｏｒｆ１３の５'領域に位置する。しかしながら、ｒｓ１３２７７１１３及び相関した変異(ｒ２＞０．５)はいずれも公知の転写因子結合部位や公知の機能的な核酸モチーフを変更しなかった。発明者等は、ｒｓ１３２７７１１３又はｒｓ１３２７７１１３と強く相関したバリエーションがＢＬＫ及びＣ８ｏｒｆ１３のｍＲＮＡ発現のレベルを変更すると結論づけた。
ＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸ
また、第１６染色体上のインテグリンα鎖遺伝子のクラスター内の変異はＳＬＥと有意に相関していた(図３、表２)。３つのＳＬＥ系列全体にわたって、ｒｓ１１５７４６３７の「Ｃ」対立遺伝子の再現可能な相関が観察された(Ｐ＝５×１０−７、ＯＲ＝１．３０、９５％Ｃ．Ｉ．＝１．１７−１．４５)。重要なことに、ｒｓ１１５７４６３７の「Ｃ」対立遺伝子はスウェーデンの複製系列において同様に強く濃縮されており(Ｐ＝４×１０−７、ＯＲ＝１．５９、９５％Ｃ．Ｉ．＝１．３３−１．９１；表２)、メタ分析は組合せＰ＝３×１０−１１を示した。発明者等は、ｒｓ１１５７４６３７に連鎖したバリエーションが確認されたＳＬＥリスク対立遺伝子を示すこと、そして、ＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸ遺伝子座がＳＬＥ病因に寄与することを結論づけた。
ｒｓ１１５７４６３７は、ＩＴＧＡＭ及びＩＴＧＡＸの５'部位を含むいくつかの遺伝子をコードする１５０ｋｂ以下をカバーする相関したＳＮＰの大きな塊の一部である(図３Ａ)。ＩＴＧＡＭ及びＩＴＧＡＸはＥＢＶ形質転換Ｂ細胞内で検出可能なレベルで発現されるが、ｒｓ１１５７４６３７はいずれかの遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルと有意に相関していなかった(データは示さない)。潜在的な興味として、ＳＮＰ ｒｓ１１５７４６３７はＩＴＧＡＭの２つの非同義性変異と相関している。コントロール群では、Ｐｒｏ１１４６Ｓｅｒ変異(ｒｓ１１４３６７８、Ｐ＝２．５×１０−５)は、疾患関連のｒｓ１１５７４６３７変異に、０．８５のｒ２で相関した。ｒｓ１１４３６７８の「Ｃ」対立遺伝子と１１４６Ｓｅｒ対立遺伝子は、１８．２％のコントロール染色体にてハプロタイプを形成し、「Ｃ」対立遺伝子は、１１４６Ｓｅｒ対立遺伝子を欠いている異なる２％のハプロタイプも存在している。二つ目の非同義性対立遺伝子(ｒｓ１１４３６８３、Ａｌａ８５８Ｖａｌ)は現在の試験では直接遺伝子タイピングされなかったが、Ｐｒｏ１１４６Ｓｅｒと高い相関がある(ＨａｐＭａｐ ＣＥＵではｒ２＝０.８５)。ＩＴＧＡＭ非同義性変異又は更なる対立遺伝子(一又は複数)がＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸ領域内の相関の基礎となっているか否かを決定するためには更なる試験が必要であろう。
ＳＬＥ臨床形質との相関
最後に、組合せ症例系列１−３を用いて(図９、方法の項を参照)、上位２つのＳＮＰ、つまりｒｓ１１５７４６３７(ＢＬＫ)及びｒｓ１３２７７１１３(ＩＴＧＡＭ)と、個々のＡＣＲ判定基準の存在との間の相関を調べた。最も強い相関は、ｒｓ１１５７４６３７少数対立遺伝子と関節炎の存在との逆相関であった、ＯＲ＝０．７３(９５％ＣＩ＝０．５９−０．９１、Ｐ＝０．００４５)。両方の変異は、血液学的な判定基準と僅かに相関していた。ｒｓ１１５７４６３７、ＯＲ＝１．２１(９５％ＣＩ＝１．００−１．４７、Ｐ＝０．０４)及びｒｓ１３２７７１１３、ＯＲ＝１．２３(９５％ＣＩ＝１．０３−１．４６、Ｐ＝０．０２)。他の有意な相関は観察されなかった。
考察
ここでは、ＳＬＥに実施した包括的な全ゲノム相関試験の結果を記載する。１３１１もの多くのＳＬＥ症例群と、３３４０ものさらに多くのコントロール群を試験することによって、ＳＬＥリスクに寄与する主な対立遺伝子を検出した。ＨＬＡ領域、ＩＲＦ５およびＳＴＡＴ４において観察された強力なシグナルは、実験のためのポジティブコントロールとして役立ち、これらの遺伝子座がこの疾患の最も重要な遺伝学的因子の一つであることが確認される。
ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼＢＬＫはＳＬＥの興味深い新規な候補遺伝子である。ＢＬＫの発現は、Ｂリンパ球系に非常に限局している41。マウスのＢＩｋ発現は、周期の後期の(cycling late)プロＢ細胞において初めに観察され、Ｂ細胞の発達中には存続し、その後プラズマＢ細胞において下方制御される42。Ｂｌｋのノックアウトマウスは全体の表現型を示さず43、ヒトＢ細胞での機能的な試験は行われていない。理論に縛られるものではないが、ＢＬＫはＢ細胞レセプターの下流のシグナルを伝達するチロシンキナーゼの一つであり、ノックアウトにおいて表現型を欠くのであれば、おそらくＢＬＫはマウスにおいて重複した役割を有するであろう。Ｂ細胞レセプター結合キナーゼの役割において重要な種相違の先例がある。例えば、ヒトのブラットンチロシンキナーゼ(ＢＴＫ)欠損は、Ｘ連鎖の無ガンマグロブリン血症とびＢ細胞の完全な欠失を引き起こす44。しかしながら、マウスのＢｔｋの欠損は軽度の表現型と相関しており、機能的に傷害している成熟Ｂ細胞が産生される45。
Ｂ細胞レセプターによるシグナル伝達は、Ｂ細胞発達の間に変更するレセプター、欠失及びアネルギーの誘導による、Ｂ細胞レパートリーの確率に重要である46, 47。ここで示されるように、ＢＬＫのリスク対立遺伝子は形質転換Ｂ細胞株のＢＬＫ ｍＲＮＡの発現低減と相関している。理論に縛られるものではないが、ＢＬＫのタンパク質レベルが変更するとＢ細胞の耐性メカニズムが影響を受け、これが個体の全身性自己免疫状態の素因になるかもしれない。近年、狼瘡のＮＺＭ２４１０モデルマウスの主要な遺伝子座の一つであるＬｙ１０８について類似のメカニズムが示された48。したがって、本発明の一実施態様では、当業者は、本明細書中に示す情報を用いて、普遍的に発現される遺伝子Ｃ８ｏｒｆ１３の発現に対するリスクハプロタイプの影響を評価することができる。
このスキャンにおいて同定された二つ目の遺伝子座はＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸである。ＩＴＧＡＸはＩＴＧＡＸの５'部位に拡がる領域内の相関の強いＬＤに基づいて検討しないが、データから、ＩＴＧＡＭは領域内の関連遺伝子でありうることが示唆される。ＩＴＧＡＭ(ＣＤ１１ｂ、Ｍａｃ−１、補体レセプタータイプ３としても知られる)は、樹状細胞、マクロファージ、単球および好中球を含む様々な骨髄細胞型によって発現される、非常に特徴的なインテグリンα鎖分子である49-51。ＩＴＧＡＭは、ＩＴＧＢ２(ＣＤ１８)とヘテロダイマーと形成し、免疫系の細胞種間の接着、および内皮への骨髄性細胞の接着を媒介する52。ＩＴＧＡＭを欠損しているマウスは、狼瘡を含む自己免疫53-55の様々なモデルにおいて疾患の進行と炎症の亢進を示し、近年のデータから、ＩＴＧＡＭは通常、自己免疫の誘導と連鎖している経路であるＴｈ１７分化56を抑制するように機能しうることが示唆される。興味深いことに、活動性ＳＬＥ患者の好中球ではＣＤ１１ｂの発現が亢進されることが報告されている57。２つの高く相関した非同義性対立遺伝子を有するＩＴＧＡＭのリスク対立遺伝子は、タンパク質の機能及び／又はタンパク質の発現の調節を変更し、それによって全身性自己免疫に寄与しやすくしうる。
まとめるとと、現在のデータにより、ＳＬＥについての２つの新規な罹患遺伝子座、つまり第８染色体上のＢＬＫ／Ｃ８ｏｒｆ１３と第１６染色体上のＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸが同定される。これら２つの遺伝子座内の最も可能性のある候補遺伝子はＢＬＫおよびＩＴＧＡＭである。これら遺伝子の同定により、ＳＬＥの遺伝学的基準に重要な新規な見解が示され、更に治療のための潜在的な新規な標的が示唆される。
実施例３ 全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)における全ゲノム相関スキャンとＳＬＥと相関する新規の遺伝子座の同定
この実施例では、最初のデータセットは、イルミナＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ１チップとイルミナＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ３チップからの遺伝子型とともに、実施例１および２に記載の全ゲノム相関試験からの症例とコントロールからなる。イルミナＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ１チップからのデータセットは、４６４の症例および１９６２のコントロールの各々において５５５３５２個のＳＮＰからなる。イルミナＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ３チップからのデータセットは、９７１の症例および１６２１のコントロールの各々において５６１４６６個のＳＮＰからなる。各々のデータセットについて、品質管理フィルターを実施例１および２に記載の様式と同様に適応した。ＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ１チップからの結果のデータセットは、４２２の症例および１８８１のコントロールの各々において５３４５２３個のＳＮＰからなる。ＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ３チップからの結果として生じるデータセットは、９２９の症例および１５５８のコントロールの各々において５４９２７３個のＳＮＰからなる。
イルミナＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ１チップからの上記データセットを、イルミナＨｕｍａｎＨａｐ５５０ｖ３チップからの上記データセットと混合(merge)した。結果として生じたデータセットは、１３５１の症例および３４３９のコントロールの各々において５６４３０７個のＳＮＰからなる。このデータセットは、コントロールとして用いた、ＣＧＥＭＳの胸部及び前立腺の癌研究からの遺伝子型(４５２７の試料の各々における５５３８２０個のＳＮＰ)と混合(merge)した。結果として生じたデータセットは、１３５１の症例および７９６６のコントロールの各々において５７００９９個のＳＮＰからなる。品質管理フィルターを実施例１および２に記載の様式と同様に適応した。結果として生じたデータセットは、１３５１の症例および７９６６のコントロールの各々において４４６８５６個のＳＮＰからなる。
上記のデータセットを用いて、プログラムＩＭＰＵＴＥ(www, stats .ox . ac.uk/~marchini/software/gwas/impute .html)による、第二相ＨａｐＭａｐにおける各多型のＣＥＵ ＳＮＰについての遺伝子型確率帰属させた。推奨される有効個体数(−Ｎｅ１１４１８)を用いた。
ＳＬＥ状態と各々の帰属させたＳＮＰとの間の相関は、プログラムSNPTEST (www.stats.ox.ac.uk/~marchini/software/gwas/snptest.html)によって算出した。集団外れ値は除いた。集団外れ値は、実施例１および２に記載のものと同様な様式で、プログラムＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴによって決定した。相加的及び一般的な頻度論的モデルを試験した。
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実施例４ １３１０のＳＬＥ症例および７８５９のコントロールにおける全ゲノム相関スキャン
方法：ＳＬＥ症例とコントロールでの試料情報と遺伝子タイピング
ＳＬＥ症例試料の選別と遺伝子タイピングは先に記載された(1)。簡単にいうと、ａ) ＮＩＨ／ＮＩＡＭＳが資金供給した管理機関である自己免疫性バイオマーカー協力ネットワーク(ＡＢＣｏＮ：Autoimmune Biomarkers Collaborative Network)(2)の３３８被検体、ｂ) 複数自己免疫性疾患遺伝子共同体(ＭＡＤＧＣ：Multiple Autoimmune Disease Genetics Consortium)(3)の１４１被検体(ＡＢＣＯＮ＋ＭＡＤＧＣ＝症例系列１)、ｃ) カリフォルニアサンフランシスコ大学(ＵＣＳＦ)狼瘡遺伝子プロジェクト(4, 5)の６１３被検体(症例系列２)、及びｄ) ピッツバーグメディカルセンター大学(ＵＰＭＣ)(6)の３３５被検体とファインスタインメディカルリサーチ研究所で集められた８試料(症例系列３)、からのＤＮＡ試料をイルミナ５５０Ｋアレイを用いて遺伝子タイピングした。ＡＵ ＳＬＥ症例は自己報告による欧州起源の北米人である。ＳＬＥの診断(米国リウマチ学会(ＡＣＲ)規定の判定基準(7)の４以上の達成)は、医療記録検査(９４％)又は治療するリウマチ専門医(６％)による文書による判定基準よってすべての症例で確認された。これらの症例系列の臨床データは至る所で発表されていた(4, 3, 2, 6, 5)。
イルミナ５５０Ｋアレイを用いて遺伝子タイピングした合計８１４７のコントロール試料を相関分析において調べた。３つの起源をコントロールに用いた(すべて欧州起源の北米人)。ニューヨーク健康プロジェクト(ＮＹＨＰ：New York Health Project)集団からの１８６１試料(8)、公的に利用できるｉＣｏｎｔｒｏｌＤＢデータベース(www.illumina.com/pages.ilmn?ID=231)からの１７２２試料、及び、公的に利用できる罹患率の癌遺伝学的マーカー(ＣＧＥＭＳ：Cancer Genetics Markers of Susceptibility)プロジェクト(http://cgems.cancer.gov/)からの４５６４試料。ＮＹＨＰ試料の遺伝子タイピングは先に記載された(1)。
遺伝子型データ品質フィルター
試料とＳＮＰフィルタリングは、後述するように、ソフトウェアプログラムＰＬＩＮＫ(9)およびＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴ(10)内の分析的モジュールを用いて実行した。
a) ＳＬＥ症例、ＮＹＣＰ試料及びｉＣｏｎｔｒｏｌＤＢ試料
記載されるように、イルミナ５５０Ｋ ＳＮＰアレイ、バージョン１(ＨＨ５５０ｖ１)を用いて４６４の症例および１９６２のコントロールを遺伝子タイピングし、イルミナ５５０Ｋ ＳＮＰアレイ、バージョン３(ＨＨ５５０ｖ３)を用いて９７１の症例および１６２１のコントロールを遺伝子タイピングした(1)。報告された性別が観察された性別と一致しなかった試料(ＨＨ５５０ｖ１：１０、ＨＨ５５０ｖ３：１１)、および５％より大きな欠測(missing)遺伝子型を有する試料(ＨＨ５５０ｖ１：２５、ＨＨ５５０ｖ３：２１)を分析から除外した。ＳＬＥ症例とコントロールとの間の曖昧な相関は、すべての起こりうるペアワイズ試料組合せについてゲノム全体の状態による識別(ＩＢＳ)を推定して決定した。重複又は１世代−３世代の血縁関係(1st-3rd degree relatives)であると推定される各組の試料は除いた(Ｐｉ＿ｈａｔ≧０．１０およびＺ１≧０．１５；ＨＨ５５０ｖ１：８８、ＨＨ５５０ｖ３：７３)。コントロール中ＨＷＥ Ｐ≦１×１０−６を有するＳＮＰ(ＨＨ５５０ｖ１ : ３１７６、ＨＨ５５０ｖ３: ２２４０)又は５％より大きな欠測データを有するＳＮＰ(ＨＨ５５０ｖ１ : １２６０５、ＨＨ５５０ｖ３: ７１３７)は除いた。症例とコントロールとの間の欠測データの頻度における有意差についてＳＮＰを試験し、ＰＬＩＮＫに用いた差次的欠測率においてＰ≦１×１０−５を有するＳＮＰを除いた(ＨＨ５５０ｖ１：５０２７、ＨＨ５５０ｖ３：２８０４)。また、ＳＮＰは、性別間での有意な対立遺伝子頻度差異についても試験した。すべてのＳＮＰはコントロールではＰ≧１×１０−９を有した。データは、(例えばＡＢＣｏＮ試料と他のすべての症例との間の)バッチ効果の存在について試験し、Ｐ＜１×１０−９の対立遺伝子頻度差異を有するＳＮＰ(Ｎ＝１３)を除いた(ＨＨ５５０ｖ１: １８、ＨＨ５５０ｖ３: １０)。ヘテロ接合のハプロイド遺伝子型を有する変異は欠測(missing)に対して設定した(ＨＨ５５０ｖ１：２３０５、ＨＨ５５０ｖ３：８７５)。さらに、少数の対立遺伝子頻度＜０．０００１を有する変異を除いた(ＨＨ５５０ｖ１：９７、ＨＨ５５０ｖ３：５７)。
b) ＣＧＥＭＳ試料
２２７７の前立腺癌試料と、別に、２２８７の乳癌試料について、ヘテロ接合のハプロイド遺伝子型は欠測(missing)に対して設定した(前立腺：２７１７、胸部：０)。報告された性別が観察された性別と一致しなかった試料(前立腺：１、乳：２)、および５％より大きな欠測(missing)データを有する試料(前立腺：１５、乳：１)を分析から除外した。上記の通り、曖昧な相関については試料を試験し、重複又は１世代−３世代の血縁関係(1st-3rd degree relatives)であると推定される各組から一つの試料を除いた(Ｐｉ＿ｈａｔ≧０．１０およびＺ１≧０．１５；前立腺：１２、胸部：７)。ＭＡＦ＜０．０００１を有するＳＮＰ(前立腺：３２５４、胸部：２１６６)を除いた。
c) すべての試料
すべてのＳＬＥ症例およびコントロールからなる混合(merge)したデータセットに更なるデータ品質フィルターを適用した。５％より大きい欠測データを有するＳＮＰ(Ｎ＝６５４２１)及び５％より大きい欠測データを有する試料(Ｎ＝０)を除いた。二重の試料に対する試験はＭＡＦ≧０．４５を有する９５７個の独立したＳＮＰを用いて行い、二重の試料は見られなかった。コントロール中ＨＷＥ Ｐ≦１×１０−６を有するＳＮＰ(Ｎ２１７４)及び２％より大きな欠測データを有するＳＮＰ(Ｎ＝５５２２)は除いた。発明者等は、症例とコントロールとの間の欠測データの割合における有意差についてＳＮＰを試験し、過剰な欠測データ差を有するＳＮＰを除いた(Ｐ≦１×１０−５、Ｎ＝１６０８０)。ＳＮＰを性別間の有意差について試験し、すべてのＳＮＰはコントロール中Ｐ≧１×１０−９を有した。また、ＳＮＰは、特に、ＣＧＥＭＳ乳癌試料と他の全てのコントロールとの間、そして、ＣＧＥＭＳ前立腺癌試料と他の全てのコントロールとの間のバッチ効果の存在について調べ、Ｐ＜１×１０−９を有するＳＮＰ(Ｎ＝７３)を除いた。上記の品質フィルターの適用の後、４８０８３１個のＳＮＰが残った。
症例およびコントロールは、ＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴを用いて集団外れ値の存在について試験した。症例中ＭＡＦ＜２％(Ｎ＝１６０６８)、コントロール中ＨＷＥ Ｐ≦１×１０−４(Ｎ＝９７７)、又は１％より大きな欠測データ(Ｎ＝１７０２９)を有するＳＮＰ、第６染色体(２４−３６Ｍｂ)、第８染色体(８−１２Ｍｂ)、第１１染色体(４２−５８Ｍｂ)および第１７染色体(４０−４３Ｍｂ)上の構造的バリエーションによる異常なＬＤパターンの領域内のＳＮＰ、及び、染色体Ｘの偽常染色体領域内のＳＮＰ(Ｎ＝１２)は、集団外れ値を検出するためのバリエーションの主成分(ＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴ)を決定するために除いた。上位１０のいずれかの主成分に従って平均から６の標準偏差を超える試料を分析から除いた(Ｎ＝１４８)。
最終的なデータセットは、１３１０の症例、７８５９のコントロールおよび４８０８３１個のＳＮＰを有し、ゲノムコントロールインフレーション因子(λｇｃ)(11)は上記のデータ品質フィルターの適用の後には１．０６であった。
観察されない遺伝子型の帰属(Imputing)
ヒトゲノムに多くの連鎖不平衡が存在することにより、特定の状態のタイピングされないバリエーションが、高い信頼性をもって推測される。ＩＭＰＵＴＥ（一連の公知のハプロタイプ(ＨａｐＭａｐ第II相ハプロタイプ、www.hapmap.org)に基づく全ゲノム症例−コントロール研究において観察されない遺伝子型を帰するためのプログラム）を分析に用いた(www.stats.ox.ac.uk/~marchini/software/gwas/impute.html)。
ＧＮＥ症例およびＮＹＣＰ、ｉＤＢおよびＣＧＥＭＳのコントロールの帰属(Imputing)
品質管理フィルターの後、１３１０のＧＮＥ症例、３３４４のＮＹＣＰおよびｉＤＢのコントロール、４５１５のＣＧＥＭＳコントロールおよび４４６８５６個のＳＮＰとなった。プログラムＩＭＰＵＴＥ(ｖ０.３.１)は、含まれたＣＥＵハプロタイプ、凡例、およびＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ ３５に整列配置されるマップファイルを用いて実行した。有効集団サイズは１１４１８の推奨された値にセットした。ストランドファイル(strand file)は用いず、ＩＭＰＵＴＥにおいて調べるストランドアラインメント(strand alignment)を用いた。症例、ＮＹＣＰおよびｉＤＢコントロールおよびＣＧＥＭＳコントロール別々に帰属させ、各染色体を全体として別々に帰属させた。２５６２７０８個のＳＮＰを帰属させた。
ＳＮＰＴＥＳＴ(ｖ１.１.３)を用いて、実際の遺伝子型及び帰属の遺伝子型の両方について相関試験を行った。すでに遺伝子タイピングされたＳＮＰについては、実際の遺伝子型を用いた。相関試験は、遺伝子型の不確定性を十分に考慮するための「-proper」オプションを有する、相加的遺伝子効果についてのコクラン−アーミテッジ検定とした。０．５０を超える情報スコア(すなわちfrequentist_add_proper_info＞０．５０)を有するＳＮＰのみを残した(２４８１９０７のＳＮＰ[９７％])。
結果。１３１０の症例および７８５９のコントロールの分析におけるＳＬＥと相関する(Ｐ＜１×１０−５)ＳＬＥ遺伝子座の重複しないリストを表１に示す。上記の２３０００００個のＳＮＰの分析から、±１００ｋｂ間隔で最も低いＰ値を有する単一の変異を表すことによって、一覧(rank ordered list)を生成した。
表１：１３１０の症例および７８５９のコントロールの分析におけるＳＬＥと相関する遺伝子座(Ｐ≦１×１０−５)。上記の２３０００００個のＳＮＰの分析から、±１００ｋｂ間隔で最も低いＰ値を有する単一の変異を表すことによって、一覧(rank ordered list)を生成した。ＳＮＰ(ｄｂＳＮＰ ｉｄ)、染色体、位置(ｂｕｉｌｄ ３５のヒトゲノム内の塩基対位置)、ＳＬＥ症例およびコントロールにおける少数の対立遺伝子頻度、ＳＮＰＴＥＳＴからのＰ値(相加的モデル(additive model)条件下、帰属精度について修正)、帰属情報スコア(帰属精度の推定)およびオッズ比(９５％の信頼区間)を示す。
Figure 2017035088
実施例５ ＧＮＥ相関スキャンにおける報告されたＳＬＥリスク遺伝子のメタ分析
方法
確認されたＳＬＥ遺伝子座についてのＳＬＥ文献と判定基準の調査
確認されたＳＬＥリスク遺伝子座について、合計１６の対立遺伝子が下記の判定基準の一つを満たした(表２)。
1) Ｐ≦１×１０−５の少なくとも２つの独立した報告を有するＳＬＥリスク遺伝子座。
Ｐ≦１×１０−５を有する重複しないＳＬＥコホートにおいて２つの独立した報告を有する遺伝子座について文献を調べた。文献検索は２００８年４月前の刊行物を表す。同じ方向の効果を有するＳＬＥに相関を示す同一の変異(又はｒ２＞０．３を有する代わりのもの)を必要とした。ＨＬＡ−ＤＲＢｌ＊０３０１(ＨＬＡ−ＤＲ３、(18, 19))、ＨＬＡ−ＤＲＢｌ＊１５０１(ＨＬＡ−ＤＲ２、(18, 19))、タンパク質チロシンホスファターゼ非レセプタータイプ２２(ＰＴＰＮ２２、(20, 21))、インターフェロン制御因子５(ＩＲＦ５、(22, 23))、シグナル伝達性転写因子４(ＳＴＡＴ４、(5, 21))、Ｂリンパ球チロシンキナーゼ(ＢＬＫ、(21, 1))及びインテグリンαＭ(ＩＴＧＡＭ、(1, 24))を含む合計７つの対立遺伝子が要件を満たした。ここに記載される１３１０のＳＬＥ症例および７８５９のコントロールの全ゲノム相関スキャンにおける同一対立遺伝子又は最も良好な代替物(ｒ２＞０．８５)について分析を進めた(表２)。
2) Ｐ≦１×１０−５の１つの報告を有するＳＬＥリスク遺伝子座。
２００８年４月現在のある一つの刊行物において報告されたＰがＰ≦１×１０−５であるＳＬＥリスク遺伝子座について文献検索を実行し、合計１８の遺伝子座が同定された。
１３の遺伝子座では、上記の１３１０のＳＬＥ症例及び７８５９のコントロールの全ゲノムスキャンにおいて、同一変異又はほぼ完全な代替物(ｒ２＞０．９)を遺伝子タイピングした(表４)。後述する方法を用いたメタ分析を１３の遺伝子座について実行し、このうちの８つの遺伝子座はＰ≦５×１０−８に達した。全ゲノム有意性を達成している遺伝子座(遺伝子座内の単一遺伝子によって標識される)には以下が含まれる。下垂体腫瘍−形質転換タンパク質１(ＰＴＴＧ１)、ＡＰＧ５自己貪食５様(ＡＴＧ５)、ＣＴＤ-結合ＳＲ様タンパク質ｒＡ９(ＫＩＡＡ１５４２)、ユビキチンコンジュゲート酵素Ｅ２Ｌ３(ＵＢＥ２Ｌ３)、セリン／スレオニンキナーゼを含有しているＰＸドメイン(ＰＸＫ)、ＩｇＧのＦｃ断片、低親和性IIa、レセプター(ＦＣＧＲ２Ａ)、腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー４(ＴＮＦＳＦ４)、およびアンキリンリピート１を有するＢ細胞骨格タンパク質(ＢＡＮＫ１)。メタ分析の全ゲノム有意性を達成している変異について分析を進めた(表５、表２)。残りの５つの遺伝子座では、１３１０のＳＬＥ症例及び７８５９のコントロールのＳＬＥ全ゲノム相関スキャンにおいて、報告された変異又はほぼ完全な代替物(ｒ２＞０．９)の遺伝子タイピングを行わなかった(表２)。しかしながら、インターロイキン１レセプター結合キナーゼ１(ＩＲＡＫ１)における変異は観察Ｐ≦１×１０−４を有しており、分析を進めた(表１)。
メタ分析
各々の系列についての修正相関統計値を、コホートサイズについて加重したＺスコアの加算によって結合した。
表２ このＧＷＡＳの１３１０のＳＬＥ症例および７８５９のコントロールにおける１６の確認されたＳＬＥリスク対立遺伝子の相関統計値。対立遺伝子はＰ値の順に並べる。
Figure 2017035088
表３ Ｐ≦１×１０−５を有する同じＳＮＰ(またはｒ２＞０．３を有する代替物)による少なくとも２の独立した報告を有するＳＬＥリスク遺伝子座。
Figure 2017035088
表４ メタ分析が可能であったＰ≦１×１０−５を有する、一度だけ報告されたＳＬＥリスク遺伝子座。８の遺伝子座はメタＰ≦５×１０−８を有した。
Figure 2017035088
表５ メタ分析が可能でなかったＰ≦１×１０−５を有する、一度だけ報告されたＳＬＥリスク遺伝子座。ＩＲＡＫ１のみは、発明者等のＧＮＥ ＧＷＡＳにおいてＰ≦１×１０−５であるＳＮＰを有した。
Figure 2017035088
実施例６ 概要
ＳＬＥリスク遺伝子座の概要
ＳＬＥリスク遺伝子座は、a) １３１０のＳＬＥ症例および７８５９のコントロールの分析、及びb) 既に報告されたＳＬＥリスク遺伝子座によるメタ分析、の２つの主な方法を用いて同定した。
ＳＬＥリスクに対して強い相関がある変異(Ｐ＜１×１０−６)の重複しない一覧を表６に示す。
ＳＬＥリスクおよび治療に対する応答を評価するためのアルゴリズム
表現型と相関する変異は、相加的な対立遺伝的用量に依存した様式で相互作用することが知られている(38, 39)。ある例示的な実施態様では、以下のアルゴリズムを用いて、狼瘡へのリスク、重症度および治療への応答を評価することができる。狼瘡症例は、保持するリスク対立遺伝子の数に基づいて群内で階層化されてもよい。この例示的な実施態様では、リスク対立遺伝子は、その遺伝子座からのコントロールと比較して狼瘡症例において濃縮された対立遺伝子として定義される。例えば表６では、１８の遺伝子座から合計１９の対立遺伝子があり、リスク対立遺伝子の最大可能な数は３８となる。リスク対立遺伝子の数および結果として生じる分布の三分位数によって階層化される狼瘡症例を決定してもよい。次いで、狼瘡症例の三分位数は、重症度、リスク及び治療への応答における差異について調べてもよい。
表６：狼瘡リスク遺伝子座
Figure 2017035088
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実施例７ 配列決定概要
方法
１９２人のＳＬＥ患者および９６人の健常対照者からのゲノムＤＮＡを、再配列決定の前に全ゲノム増幅した。ゲノムＤＮＡは、Ｂリンパ系キナーゼ(ＢＬＫ)、インテグリンαＭ(ＩＴＧＡＭ)およびインテグリンαＸ(ＩＴＧＡＸ)のすべてのエキソンと選択した非コード領域(エキソン１のプロモーター領域-上流の２．５ｋｂ)の再配列決定を行った。
最初の対立遺伝子コーリングは、「Polymorphic」によって提供されるソフトウェアによって実行した。すべてのコード多型性並びに共通の非コード対立遺伝子は手動で検証して対立遺伝子コールを確認し、遺伝子タイピングファイルを作成して、相関およびハプロタイプ分析に用いた。
ＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸの変異は、表７および９および表８および１０に示す。表７および９の変異は、データベースｄｂＳＮＰ ｂｕｉｌｄｌ２９に存在しない。表８および１０の変異は、ＩＴＧＡＭ／ＩＴＧＡＸおよびＢＬＫの配列決定によって発見した。
表７：ＩＴＧＡＭおよびＩＴＧＡＸエキソンおよびプロモーター領域の変異。
Figure 2017035088
表８：ＩＴＧＡＭおよびＩＴＧＡＸエキソンおよびプロモーター領域の変異。
Figure 2017035088
表９：ＢＬＫエキソンおよびプロモーター領域の変異。
Figure 2017035088
表１０：ＢＬＫエキソンおよびプロモーター領域の変異。
Figure 2017035088
実施例８
被検体及び研究計画
ＳＬＥについての全ゲノム相関試験を行った。１０７９のＳＬＥ症例および１４１１のコントロールについて、イルミナＨｕｍａｎＨａｐ５５０遺伝子タイピングビーズチップにより遺伝子タイピングを行った(５５５３５２ＳＮＰ)。ＳＬＥ症例は３つの異なるコホートから得た。コントロール試料は、市販のＨＬＡタイピング、民族性、性別および年齢に基づいて選択した。ＨＬＡ ＤＲ２およびＤＲ３ハプロタイプの頻度がＳＬＥに見られるのと一致するように、ほとんどのコントロール(２７７を除く)を選択した。
イルミナＨｕｍａｎＨａｐ５５０には３つのバージョンがある。バージョン１とバージョン３に共有するＳＮＰの数は５４５０８０であり、これらのＳＮＰのみを分析した。バージョン１は、すべてのコホート１およびコホート２の試料と１００１のコントロール試料に用いた。バージョン３は、すべてのコホート３の試料と４１０のコントロール試料に用いた。
平均コールレート(call rate)が８０％未満のチップは再試行した。すべての再試行が完了した後、９０％未満のコールレートを有する試料を除いた。
初めに、試料を分析のために２つの群に分けた。第一群(グループ１)は、すべてのコホート１およびコホート２の試料(４６６症例)と７２４のコントロール試料からなる。第二群(グループ２)は、すべてのコホート３試料(６１３症例)と残りの６８７のコントロール試料からなる。
グループ１のフィルタリング
遺伝子型により決定される性別と臨床記録との間の一致について試料を調べた。１０の試料(３症例、７コントロール)において不一致があったので、これらを更なる分析に用いなかった。
次いで、プログラムＳＴＲＵＣＴＵＲＥを用いてインターコンチネンタル混合(intercontinental admixture)について試料を試験した(オンラインリンクは頭に「.html」を付けて「pritch.bsd.uchicago.edu/structure」を入力するとアクセス可能である)(基本的にPritchard et al., Genetics (2000), 155:945-959；Falush et al., Genetics (2003), 164:1567-1587；Falush et al., Molecular Ecology Notes (2007)、doi: 10.1111/j.l471-8286.2007.01758.xに記載される)。ＨｕｍａｎＨａｐ５５０には、ＨａｐＭａｐプロジェクトのＣＥＵ、ＹＲＩおよびＣＨＢ＋ＪＰＴ集団に対するパーセント−起源を決定するための仮想である、２７６個のＳＮＰの「ＤＮＡテストパネル」が含まれる。(これらのＳＮＰを用いてはＣＨＢおよびＪＰＴを判別できない)。ＤＮＡテストパネルの２７６個のＳＮＰのうちの２７４個は、すべてのＨａｐＭａｐ集団において遺伝子タイピングされた。残りのグループ１(４６３症例、７１７コントロール)と、ＨａｐＭａｐプロジェクトの各々の血統(すなわち、ユタからのＣＥＰＨ試料(ＣＥＵ)２０、ヨルバ族試料(ＹＲＩ)３０、漢民族試料(ＣＨＢ)４５および日本試料(ＪＰＴ)４４)からの１の試料とからなるセットにおいてこれら２７４個のＳＮＰについての遺伝子タイピングによりＳＴＲＵＣＴＵＲＥを行った。ＨａｐＭａｐ試料はポジティブコントロールとして含め、クラスター化アルゴリズムの補助に用いた。３つの集団とすれば、３００００のバーンイン工程の後に１０００００のＭａｒｋｏｖ−Ｃｈａｉｎモンテカルロ工程により、事前の集団情報がない混合起源モデルと相関対立遺伝子頻度モデルを用いて、同じパラメータによりＳＴＲＵＣＴＵＲＥを別々に３回行った。３回の実行は、各試料について起源(ancestry)の係数が非常に類似しており、各ＨａｐＭａｐ試料はその地理的起源に対して９３．０％より大きな起源であった。各ＣＥＵ試料は ９７．０％より大きなＣＥＵ起源であった。３回の実行のいずれかにおいて９０．０％より小さなＣＥＵ起源であった試料(２８症例、２４コントロール)は更なる分析に用いなかった。
残りの試料(４３５症例、６９３コントロール)について、９５％未満のコールレートを有するＳＮＰ(２３２７５個のＳＮＰ(４％))は更なる分析に用いなかった。次いで、コントロールにおいて０．００１以下のハーディワインベルグ確率を有するＳＮＰ(１５６２２個のＳＮＰ(３％))は更なる分析に用いなかった。
グループ２のフィルタリング
遺伝子型により決定される性別と臨床記録との間の一致について試料を明確に調べなかった。
９５％未満のコールレートを有するＳＮＰ(３４９９８個のＳＮＰ(６％))は更なる分析に用いなかった。
上記の通り、次いで、ＳＴＲＵＣＴＵＲＥを用いてインターコンチネンタル混合(intercontinental admixture)について試料を試験した。３回の実行のいずれかにおいて９０．０％より小さなＣＥＵ起源であった試料(２１症例、２４コントロール)は更なる分析に用いなかった。
残りの試料(５９２症例、６６３コントロール)について、コントロールにおいて０．００１以下のハーディワインベルグ確率を有するＳＮＰ(２２２０２個のＳＮＰ(４％))は更なる分析に用いなかった。
グループ１および２の統合
グループ１および２は最終的な分析のために統合した。
グループ１の残りの試料(４３５症例、６９３コントロール)をグループ２の残りの試料(５９２症例、６６３コントロール)と統合して、最終グループ(１０２７症例、１３５６コントロール)とした。グループ１およびグループ２に残っているＳＮＰ(４９６４５８個のＳＮＰ)のみをさらに分析した。
性別が矛盾しないすべての試料(１０７６症例、１４０４コントロール)を調べ、重複しているか又は同族(related)であるか否かをみた。まず最初に、試料のすべての対を、ゲノム全体に広がる８００個のＳＮＰ全体と比較した。次いで、重複及び同族の候補を５４００００＋ＳＮＰ全体にわたって調べた。３群の外れ値を検出した。第一群(２０対)は各対の間で９５％より大きな同一性があり、重複と思われた。第二群(１７対)は、各対間で６７〜７７％の同一性があり、同族と思われた。第三群(５対)は、各対間で５８〜６３％の同一性があり、同族と思われた。(試料間の平均同一性は５１〜５５％であった)。 最終的に、３９の試料(２９症例、１０コントロール)が最終グループから除かれた。
ミトコンドリアＤＮＡのＳＮＰ(１９個のＳＮＰ)更なる分析に用いなかった。
結果として生じたメイングループ(９９８症例、１３４６コントロール、４９６４３９個のＳＮＰ)が以降の分析に用いられた。
また、メイングループの特定のサブセットについて同じ分析を行った。
サブセット１：女性のみ(９０７症例、９６７コントロール)、およびサブセット２：ループス腎炎を有する症例、とすべてのコントロール(２８６症例、１３４６コントロール)を有する症例。
分析と結果
メイングループのＡＵ ＳＮＰは、基本的にPrice et al., Nature Genetics (2006), 38:904 - 909に記載されるプログラムであって、集団層別化を修正するＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴを用いて分析した(オンラインリンクは頭に「.htm」を付して「genepath.med.harvard.edu/~reich/EIGENSTRAT」を入力するとアクセス可能である)。上位１０の主成分を用いて、５ラウンドの外れ値を除き、その後層別化を修正した。次いで、ＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴカイ二乗統計値を算出し、χ２分布の片側確率は自由度(degree of freedom)を１としたマイクロソフトエクセルのＣＨＩＤＩＳＴ機能によって算出した。
一番の候補領域を決定するために、初めに、発明者等は、Ｐ値閾値を用いて候補ＳＮＰの数を減らした。サブセット１(女性)およびサブセット２(腎炎)では、Ｐ＞２．０×１０−５を有するＳＮＰは更なる分析に用いず、メイングループ(９９８症例、１３４６コントロール)では、Ｐ＞７．０×１０−５を有するＳＮＰは更なる分析に用いなかった。女性サブセットでは、１９個のＳＮＰが残った。腎炎サブセットでは、３５個のＳＮＰが残った。メイングループでは、４７個のＳＮＰが残った。次いで、各ＳＮＰを含む連鎖不平衡(ＬＤ)領域は、ＨｅｌｉｘＴｒｅｅプログラム(オンラインリンクは頭に「.html」を付して「www.goldenhelix.com/pharmhelixtreefeatures」を入力することによってアクセス可能である) (Golden Helix, Montana, USA)を用いてＬＤプロットを調べることによって決定した。ＥＭアルゴリズムを用いて、症例とコントロールの遺伝子型のみを用いてＤ'とｒ２を算出した。Ｄ'≧０．９以下を境界として、領域を目視により描写した。
各領域を描写した後、各領域内の遺伝子は人為的な(art-established)ゲノムブラウザにより調べた(例えば、ＵＣＳＣゲノムブラウザ、基本的にKuhn et al., Nucleic Acids Res. (2007), 35(database issue): D668-73に記載される；オンラインリンクは頭に「.edu」を付して「genome.ucsc」を入力することによってアクセス可能である、２００６年３月アセンブリ)。ＩＲＩＳ研究(Abbas et al., Genes and Immunity (2005), 6:319-331、このオンライン副教材を含む)にて決定される免疫特異的な遺伝子発現を調べた。一番の候補領域は、例えば、領域内の免疫特異的な遺伝子の存在によって識別した。腎炎サブセットでは、２０個の候補ＳＮＰを含む１１の領域が、ＳＬＥの少なくとも一のリスク対立遺伝子を含む可能性があるものとして選択された(図１２)。女性サブセットでは、９個の候補ＳＮＰを含む６の更なる領域が選択された(図１３)。メイングループでは、８個の候補ＳＮＰを含む６の更なる領域が選択された(図１４)。３７個の候補ＳＮＰを含む合計２３の領域が選択された。ＳＮＰについて最も強力な結果を得た試験グループの下にＳＮＰを挙げたので、試験グループ間の重複ヒット(duplicate hit)が示されない点に留意する必要がある。加えて、ＭＨＣ領域内のヒットは含まれなかった。図１２−１４のデータに基づいて正確に描かれたＬＤ領域が決定され、それぞれ図１５−１７にまとめた。

Claims (72)

  1. 被検体が狼瘡を発達させるリスクにあるか否かの評価方法であって、被検体から得た生体試料において、狼瘡を発達させるリスクを示す遺伝子シグネチャーの存在を検出することを含み、このとき該遺伝子シグネチャーが図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される一又は複数のＳＮＰの群を含むものである方法。
  2. 前記のＳＮＰの群が、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択されるおよそ１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０又は４０〜５０のＳＮＰを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記のＳＮＰの群が、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される２以上のＳＮＰ、３以上のＳＮＰ、４以上のＳＮＰ、５以上のＳＮＰ、６以上のＳＮＰ、７以上のＳＮＰ、８以上のＳＮＰ、９以上のＳＮＰ、１０以上のＳＮＰ、１１以上のＳＮＰ、１２以上のＳＮＰ、１３以上のＳＮＰ、１４以上のＳＮＰ、１５以上のＳＮＰ、１６以上のＳＮＰ、１７以上のＳＮＰ、１８以上のＳＮＰ、１９以上のＳＮＰ、２０以上のＳＮＰを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記のＳＮＰの群が、表６から選択される１から１９のＳＮＰを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記のＳＮＰの群が、表７から１０に示すいずれかのＢＬＫ ＳＮＰから選択されるＢＬＫ ＳＮＰを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記のＳＮＰの群が、表７から１０に示すいずれかのＩＴＧＡＭ ＳＮＰから選択されるＩＴＧＡＭ ＳＮＰを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記のＳＮＰの群がさらに、表７から１０に示すいずれかのＢＬＫ ＳＮＰから選択されるＢＬＫ ＳＮＰを含む、請求項６に記載の方法。
  8. ＳＮＰの群が、以下のｒｓ２１８７６６８、ｒｓ１０４８８６３１、ｒｓ７５７４８６５、ｒｓ９８８８７３９、ｒｓ１３２７７１１３、ｒｓ２４３１６９７、ｒｓ６５６８４３１、ｒｓ１０４８９２６５、ｒｓ２４７６６０１、ｒｓ２２６９３６８、ｒｓ１８０１２７４、ｒｓ４９６３１２８、ｒｓ５７５４２１７、ｒｓ６４４５９７５、ｒｓ３１２９８６０、ｒｓ１０５１６４８７、ｒｓ６８８９２３９、ｒｓ２３９１５９２およびｒｓ２１７７７７０のＳＮＰの群から選択される一又は複数のＳＮＰを含む、請求項１に記載の方法。
  9. 被検体における狼瘡の診断方法であって、被検体から得た生体試料において、狼瘡を示す遺伝子シグネチャーの存在を検出することを含み、このとき該遺伝子シグネチャーが図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される一又は複数のＳＮＰの群を含むものである方法。
  10. (a) 少なくともおよそ１０ヌクレオチド長であるＰＲＯ関連のポリヌクレオチド又はその断片であって、このとき該ＰＲＯ関連のポリヌクレオチド又はその断片が図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置に遺伝子バリエーションを含むもの、又はb) (a)の相補鎖を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  11. 遺伝子バリエーションが、図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)を含む遺伝子(又は制御領域)をコードするゲノムＤＮＡにある、請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  12. ＳＮＰが遺伝子の非コード領域にある、請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  13. ＳＮＰが遺伝子のコード領域にある、請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  14. 単離されたポリヌクレオチドがプライマーである、請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  15. 単離されたポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  16. (a) 図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置に遺伝子バリエーションを含むＰＲＯ関連のポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズする対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド、又は(b) (a)の相補鎖であるオリゴヌクレオチド。
  17. ＳＮＰは、図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)を含む遺伝子(又はその制御領域)をコードするゲノムＤＮＡにある、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
  18. ＳＮＰが遺伝子の非コード領域にある、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
  19. ＳＮＰが遺伝子のコード領域にある、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
  20. 対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドが対立遺伝子特異的なプライマーである、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
  21. 請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドと、場合によって少なくとも一の酵素を含むキット。
  22. 少なくとも一の酵素がポリメラーゼである、請求項２１に記載のキット。
  23. 少なくとも一の酵素がリガーゼである、請求項２１に記載のキット。
  24. 請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ。
  25. 図１から１７及び表１から１０に示す単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置でのＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内のバリエーションの有無の検出方法であって、(a) 対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドの核酸へのハイブリダイゼーションに適切な条件下でバリエーションに特異的である対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドと、バリエーションを含むと思われる核酸とを接触させ、そして、(b) 対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーションの有無を検出することを含む方法。
  26. バリエーションが、図１から１７および表１から１０に示すＳＮＰを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 図１から１７及び表１から１０に示す単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置でのＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内のバリエーションを含む核酸の増幅方法であって、(a) 該バリエーションの３'配列の核酸にハイブリダイズするプライマーと核酸とを接触させ、そして(b) プライマーを伸展させて該バリエーションを含む増幅産物を生成することを含む方法。
  28. バリエーションが、図１から１７および表１から１０に示すＳＮＰを含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 哺乳動物の生体試料の遺伝子型の決定方法であって、該生体試料から得た核酸材料において、図１から１７及び表１から１０に示す単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置でのＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内のバリエーションの有無を検出することを含む方法。
  30. バリエーションが、図１から１７および表１から１０に示すＳＮＰを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 生体試料は、バリエーションを含むＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドを含むことがわかっているか又は含むことが予測される、請求項２９に記載の方法。
  32. 生体試料が疾患組織である、請求項２９に記載の方法。
  33. 検出には、プライマー伸展アッセイ；対立遺伝子特異的なプライマー伸展アッセイ；対立遺伝子特異的なヌクレオチド取込みアッセイ；対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ；５'ヌクレアーゼアッセイ；分子ビーコンを用いたアッセイ；及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイから選択される工程を実施することが含まれる、請求項２９に記載の方法。
  34. 哺乳動物の狼瘡のサブ分類方法であって、哺乳動物から得た生体試料において、図１から１７及び表１から１０に示す単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置でのＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内のバリエーションの存在を検出することを含み、このとき該生体試料がバリエーションを含むＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドを含むことがわかっているか含むことが予測されるものである方法。
  35. バリエーションが遺伝子バリエーションである、請求項３４に記載の方法。
  36. バリエーションが図１から１７及び表１から１０に示すＳＮＰを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 検出には、プライマー伸展アッセイ；対立遺伝子特異的なプライマー伸長アッセイ；対立遺伝子特異的なヌクレオチド取込みアッセイ；対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ；５'ヌクレアーゼアッセイ；分子ビーコンを用いたアッセイ；及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイから選択される工程を実施することが含まれる、請求項３４に記載の方法。
  38. 狼瘡を有する被検体が狼瘡治療薬に応答するか否かを予測するための方法であって、該被検体が図１から１７及び表１から１０に示す単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)の位置に対応するヌクレオチド位置でＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内にバリエーションを含むか否かを決定することを含み、このときバリエーションがある場合に被検体が該治療薬に応答するであろうことが示される方法。
  39. バリエーションが遺伝子バリエーションである、請求項３８に記載の方法。
  40. バリエーションが図１から１７及び表１から１０に示すＳＮＰを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 被検体の狼瘡の診断又は予後の予測の方法であって、被検体から得た生体試料由来のＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内でのバリエーションの存在を検出することを含み、
    このとき(a) 該生体試料がバリエーションを含むＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドを含むことがわかっているか、又は含むことが予測されるものであり、
    (b) 該バリエーションが図１から１７及び表１から１０に示すＳＮＰを含むか、又はＳＮＰに対応するヌクレオチド位置に位置するものであり、そして(c) バリエーションの存在が被検体での狼瘡の診断又は予後である方法。
  42. 被検体における狼瘡の診断又は予後予測における補助方法であって、被検体から得た生体試料由来のＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチド内でのバリエーションの存在を検出することを含み、
    このとき(a) 該生体試料がバリエーションを含むＰＲＯ又はＰＲＯ関連のポリヌクレオチドを含むことがわかっているか、又は含むことが予測されるものであり、
    (b) 該バリエーションが図１から１７及び表１から１０に示すＳＮＰを含むか、又はＳＮＰに対応するヌクレオチド位置に位置するものであり、そして(c) バリエーションの存在が被検体での狼瘡の状態又は症状の診断又は予後である方法。
  43. ＰＲＯ関連のポリヌクレオチドは、連鎖不平衡領域内の配列によってコードされるＰＲＯをコードする、請求項４１又は４２に記載の方法。
  44. 連鎖不平衡領域は図１から１７及び表１から１０に示すものの一つである、請求項４３に記載の方法。
  45. バリエーションが遺伝子又はその制御領域をコードするゲノムＤＮＡにあり、このときそれぞれの遺伝子又はその制御領域が図１から１７及び表１から１０に示すＳＮＰを含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
  46. ＳＮＰが遺伝子の非コード領域にある、請求項４５に記載の方法。
  47. ＳＮＰが遺伝子のコード領域にある、請求項４５に記載の方法。
  48. 患者サブ集団の狼瘡を治療するために有効な治療薬の同定方法であって、薬剤の有効性を、患者サブ集団の単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置での遺伝子バリエーションの存在と相関させることを含み、このときＳＮＰが図１から１７及び表１から１０に挙げるものの一つであり、それによって該薬剤が該患者サブ集団の狼瘡を治療するために有効であると同定される方法。
  49. 遺伝子バリエーションが、図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に存在することがわかっている被検体の狼瘡状態の治療方法であって、状態を治療するために有効な治療薬を被検体に投与することを含む方法。
  50. 狼瘡状態を有する被検体の治療方法であって、図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に遺伝子バリエーションを有する被検体の状態を治療するために有効な治療薬を被検体に投与することを含む方法。
  51. 狼瘡状態を有する被検体の治療方法であって、図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に遺伝子バリエーションをそれぞれ有する少なくとも５人の患者に薬剤が投与される少なくとも一の臨床試験において、該状態を治療するために有効であることが示された治療薬を被検体に投与することを含む方法。
  52. 少なくとも５人の患者は、少なくとも５人の患者の群につき合計で２以上の異なるＳＮＰを有していた、請求項５１に記載の方法。
  53. 少なくとも５人の患者は、少なくとも５人の患者の群全体で同じＳＮＰを有していた、請求項５１に記載の方法。
  54. 特定の狼瘡患者サブ集団の狼瘡被検体の治療方法であって、このとき該サブ集団は図１から１７及び表１から１０に挙げるＳＮＰに対応するヌクレオチド位置の遺伝子バリエーションとの相関に少なくとも一部特徴があり、該サブ集団のための治療薬として承認されている治療薬の有効量を被検体に投与することを含む方法。
  55. サブ集団はループス腎炎を有する、請求項５４に記載の方法。
  56. サブ集団は女性である、請求項５４に記載の方法。
  57. サブ集団はヨーロッパを起源とする、請求項５４に記載の方法。
  58. 狼瘡治療薬を製造し、そして、狼瘡を有するか又は有すると思われ、図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応する位置に遺伝子バリエーションを有する被検体に該薬剤を投与するための指示書とともに薬剤をパッケージすることを含む方法。
  59. 狼瘡患者サブ集団における使用のための治療薬を特定する方法であって、図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応する位置の遺伝子バリエーションに特徴がある患者サブ集団に治療薬を投与するための指示書を提供することを含む方法。
  60. 狼瘡患者サブ集団における使用のための治療薬の販売方法であって、図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応する位置での遺伝子バリエーションの、該サブ集団の患者における存在に特徴を有する患者サブ集団を治療するための治療薬の使用について聴衆に知らしめることを含む方法。
  61. 遺伝子バリエーションが図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に存在することがわかっている被検体においてＢ細胞レセプターを介するシグナル伝達を調整する方法であって、Ｂ細胞レセプターを介するシグナル伝達を調整するために有効な治療薬を被検体に投与することを含む方法。
  62. 遺伝子バリエーションが図１から１７及び表１から１０に挙げる単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に対応するヌクレオチド位置に存在することがわかっている被検体においてＴＨＩ７細胞の分化を調整する方法であって、ＴＨＩ７細胞の分化を調整するために有効な治療薬を被検体に投与することを含む方法。
  63. 狼瘡を発達させるリスクを示す遺伝子シグネチャーを含むＳＮＰの群であって、このときこのＳＮＰの群が図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される一又は複数のＳＮＰを含むものであるＳＮＰの群。
  64. 前記のＳＮＰの群が、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択されるおよそ１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０又は４０〜５０のＳＮＰを含む、請求項６３に記載のＳＮＰの群。
  65. 前記のＳＮＰの群が、ｒｓ９８８８７３９、ｒｓ１３２７７１１３、ｒｓ７５７４８６５、ｒｓ２２６９３６８、ｒｓ６８８９２３９、ｒｓ２３９１５９２およびｒｓ２１１７７７７０からなる群から選択される一又は複数のＳＮＰを含む、請求項６３に記載のＳＮＰの群。
  66. 前記のＳＮＰの群が、図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される２以上のＳＮＰ、３以上のＳＮＰ、４以上のＳＮＰ、５以上のＳＮＰ、６以上のＳＮＰ、７以上のＳＮＰ、８以上のＳＮＰ、９以上のＳＮＰ、１０以上のＳＮＰ、１１以上のＳＮＰ、１２以上のＳＮＰ、１３以上のＳＮＰ、１４以上のＳＮＰ、１５以上のＳＮＰ、１６以上のＳＮＰ、１７以上のＳＮＰ、１８以上のＳＮＰ、１９以上のＳＮＰ、又は２０以上のＳＮＰを含む、請求項６３に記載のＳＮＰの群。
  67. 前記のＳＮＰの群が、表６から選択される１から１９のＳＮＰを含む、請求項６３に記載のＳＮＰの群。
  68. 前記のＳＮＰの群は、表７から１０に示すいずれかのＢＬＫ ＳＮＰから選択されるＢＬＫ ＳＮＰを含む、請求項６３に記載のＳＮＰの群。
  69. 前記のＳＮＰの群は、表７から１０に示すいずれかのＩＴＧＡＭ ＳＮＰから選択されるＩＴＧＡＭ ＳＮＰを含む、請求項６３に記載のＳＮＰの群。
  70. 前記のＳＮＰの群はさらに、表７から１０に示すいずれかのＢＬＫ ＳＮＰから選択されるＢＬＫ ＳＮＰを含む、請求項６９に記載のＳＮＰの群。
  71. 前記のＳＮＰの群は、ｒｓ２１８７６６８、ｒｓ１０４８８６３１、ｒｓ７５７４８６５、ｒｓ９８８８７３９、ｒｓ１３２７７１１３、ｒｓ２４３１６９７、ｒｓ６５６８４３１、ｒｓ１０４８９２６５、ｒｓ２４７６６０１、ｒｓ２２６９３６８、ｒｓ１８０１２７４、ｒｓ４９６３１２８、ｒｓ５７５４２１７、ｒｓ６４４５９７５、ｒｓ３１２９８６０、ｒｓ１０５１６４８７、ｒｓ６８８９２３９、ｒｓ２３９１５９２およびｒｓ２１７７７７０のＳＮＰの群から選択される一又は複数のＳＮＰを含む、請求項６３に記載のＳＮＰの群。
  72. 狼瘡を表す遺伝子シグネチャーを含むＳＮＰの群であって、このときこのＳＮＰの群が図１から１７及び表１から１０に示すいずれかのＳＮＰから選択される一又は複数のＳＮＰを含むものであるＳＮＰの群。
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