BRPI0811930B1 - métodos e kit diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um indivíduo. - Google Patents

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Abstract

métodos e kit para diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um indivíduo é fornecido conjunto único de variações genéticas associadas ao lúpus. também são fornecidos métodos para a detecção destas variações genéticas e para avaliação do risco de desenvolvimento de lúpus, bem como para o diagnóstico e tratamento de lúpus.

Description

A presente invenção refere-se, de forma geral, a um conjunto único de polimorfismos genéticos associados ao lúpus, e às composições e aos métodos para avaliação do risco de desenvolvimento de lúpus, bem como para o diagnóstico e tratamento de lúpus.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
O lúpus é uma doença autoimune que envolve anticorpos que atacam o tecido conjuntivo. Estima-se que a doença afete aproximadamente 1 milhão de americanos, basicamente mulheres entre as idades de 20-40. A forma principal de lúpus é aquela sistêmica (lúpus eritematoso sistêmico; SLE). O lúpus eritematoso sistêmico (SLE) é uma doença autoimune crônica com fortes componentes genético, bem como ambientais (veja, por exemplo, Hochberg M.C., Dubois' Lupus Erythematosus. 5a Edição, Wallace DJ, Hahn B.H., eds. Baltimore: Williams e Wilkins (1997); Wakeland E.K., e outros, Immunity 2001; 15(3): 397-408; Nath S.K., e outros, Curr. Opin. Immunol. 2004; 16(6): 794-800). Autoanticorpos têm um papel importante role na patogênese do SLE, e as manifestações clínicas diversas da doença são consequência de deposição de complexos imunes contendo anticorpo nos vasos sanguíneos, o que leva à inflamação no rim, cérebro e pele, juntamente com efeitos patogênicos diretos de autoanticorpos que contribuem para a anemia hemolítica e trombocitopenia. O SLE é geralmente caracterizado como um distúrbio autoimune do tecido conjuntivo com uma ampla gama de características clínicas, que afeta predominantemente mulheres, especialmente de certos grupos étnicos. D'Cruz e outros, Lancet (2007), 369: 587-596. O SLE
Petição 870190078213, de 13/08/2019, pág. 5/21 está associado à produção de anticorpos antinucleares, complexos imunes circulantes, e à ativação do sistema complemento. O SLE possui uma incidência de cerca de 1 em 700 mulheres entre as idades de 20 e 60. O SLE pode afetar qualquer sistema orgânico e pode causar dano tecidual severo.
Numerosos autoanticorpos de diferentes especificidades estão presentes no SLE. Os pacientes com SLE frequentemente produzem autoanticorpos que possuem especificidade anti-DNA, anti-Ro e antiplaquetária e que são capazes de iniciar características clínicas da doença, por exemplo, glomerulonefrite, artrite, serosite, bloqueio cardíaco completo em recém nascidos, e a10 normalidades hematológicas. Esses autoanticorpos também estão possivelmente relacionados a distúrbios do sistema nervoso central. Arbuckle e outros descrevem o desenvolvimento de autoanticorpos antes do início clínico de SLE (Arbuckle e outros N. Engl. J. Med. 349(16): 1.526-1.533 (2003)). O diagnóstico definitivo de lúpus, incluindo SLE, não é fácil, o que faz com que 15 os clínicos se utilizem de uma abordagem de classificação multifatorial baseada em sinais e sintomas. Gill e outros, American Family Physician (2003), 68(11): 2.179-2.186.
O lúpus não-tratado pode ser fatal à medida que progride do ataque à pele e articulações aos órgãos internos, incluindo pulmão, coração e 20 rins (com a doença renal sendo a principal preocupação) tornando, dessa forma, o diagnóstico precoce e preciso e/ou a avaliação do risco de desenvolvimento de lúpus particularmente crítico. O lúpus aparece principalmente como uma série de crises, com períodos intervenientes de pouca ou nenhuma manifestação da doença. A lesão renal, medida pela quantidade de pro25 teinúria na urina, é uma das áreas mais agudas de lesão associada à patogenicidade no SLE, e é responsável por pelo menos 50% da mortalidade e morbidade da doença.
Um dos desafios mais difíceis na conduta clínica de doenças autoimunes complexas como o lúpus é a identificação precisa e precoce da 30 doença em um paciente. Ao longo dos anos, foram feitos muitos estudos de ligação e de genes candidatos para identificar os fatores genéticos que contribuem para a suscetibilidade ao SLE. Haplótipos que carregam os alelos
HLA da Classe II DRB1 *0301 e DRB1 *1501 estão nitidamente associados à doença, assim como a presença de anticorpos para autoantígenos nucleares. Veja, por exemplo, Goldberg M.A., e outros, Arthritis Rheum. 1976;
19(2): 129-32; Graham R.R., e outros, Am. J. Hum. Genet. 2002; 71(3): 5435 53; e Graham R.R., e outros, Eur. J. Hum. Genet. 2007; 15(8): 823-30). Mais recentemente, foram descobertas variantes do Fator Regulador de Interferon (IRF5) e Transdutor de Sinal e Ativador de Transcrição 4 (STAT4) que são fatores de risco significativos para o SLE. Veja, por exemplo, Sigurdsson S., e outros, Am. J. Hum. Genet. 2005; 76(3): 528-37; Graham R.R., e outros, 10 Nat. Genet. 2006; 38(5): 550-55; Graham R.R., e outros, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 2007; 104(16): 6.758-63; e Remmers E.F., e outros, N. Engl. J.
Med. 2007; 357(10): 977-86. A identificação de IRF5 e STAT4 como genes de risco para o SLE dá apoio ao conceito de que a via de interferon do Tipo I é crucial para a patogênese da doença. Veja, por exemplo, Ronnblom L., e 15 outros, J. Exp. Med. 2001; 194(12): F59-63; Baechler E.C., e outros, Curr.
Opin. Immunol. 2004; 16(6):801-07; Banchereau J., e outros, Immunity 2006; 25(3): 38.392; Miyagi T., e outros, J. Exp. Med. 2007; publicação eletrônica; setembro de 10.
Para essa finalidade, seria altamente vantajoso ter métodos di20 agnósticos de base molecular que possam ser usados para identificar objetivamente a presença de e/ou classificar a doença em um paciente. Variações genéticas, ou polimorfismos, são variações genéticas que estão presentes no genoma de um organismo. Polimorfismos incluem polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). Veja, por exemplo, Carlson e outros, Nature 2004; 429: 25 446-452; Bell, Nature 2004; 429: 453-463; Evans & Relling, Nature 2004;
429: 464-468. SNPs foram fortemente correlacionados ao risco e/ou presença de doenças sérias, tais como diabetes (Sladek e outros, Nature 2007;
445: 881-828; Zeggini e outros, Science 2007; 26 de abril; Scott e outros, Science 2007; 26 de abril; e Saxena e outros, Science 2007; 26 de abril);
doença de Crohn (por exemplo, Hampe e outros, Nat. Genet. 2007; Fevereiro; 39(2): 20.711); artrite reumatoide (por exemplo, Publicação de Patente U.S. N° 2007/0031848); e outras doença inflamatórias autoimunes (por e4 xemplo, Patente U.S. 6.900.016; Patente U.S. 7.205.106).
Até recentemente, não era possível examinar de forma abrangente o genoma em busca de variantes que modificam o risco para doenças complexas como, por exemplo, lúpus. No entanto, a geração de um catálogo 5 extensivo de variações humanas comuns (veja, por exemplo, Nature 2005;
437 (7.063): 1.299-320), acoplada aos avanços tecnológicos que permitem uma genotipagem com custo compensador e precisa de centenas de milhares de variantes, criou uma revolução na genética humana. Pela primeira vez, é possível efetuar varreduras de associação poderosas de todo o ge10 noma para testar mais plenamente a hipótese de que variantes comuns influenciam o risco. Nos últimos dois anos, essa tecnologia tem sido altamente validada. Veja, por exemplo, Dewan A., e outros, Science 2006; 314 (5801): 989-92; Nature 2007; 447 (7.145): 661-78, Matarin M., e outros, Lancet neurology 2007; 6(5): 414-20; Moffatt M.F., e outros, Nature 2007; 448 (7.152): 15 470-73; Plenge R.M., e outros, N. Engl. J. Med. 2007; Saxena R, e outros,
Science 2007; 316 (5.829): 1.331-36; Scott L.J., e outros, Science 2007; 316 (5.829): 1.341-45; Scuteri A., e outros, PLoS Genet. 2007; 3(7): e115. Os loci de risco identificados estão fornecendo novas idéias sobre as vias moleculares desreguladas na doença humana.
No entanto, existe ainda uma ausência de informações confiáveis sobre associações de SNP com doenças complexas, tais como lúpus e, dessa forma, está claro que persiste a necessidade de identificar polimorfismos associados a estas doenças. Essas associações beneficiariam enormemente a identificação da presença de lúpus em pacientes ou a determi25 nação de suscetibilidade para o desenvolvimento da doença. Além disso, informações estatística e biologicamente significativas e reprodutíveis em relação à associação de um SNP com uma doença complexa como, por exemplo, lúpus, poderíam ser utilizadas como um componente integral em esforços para identificar subconjuntos específicos de pacientes que supos30 tamente se beneficiariam significativamente com o tratamento com um agente terapêutico em particular, por exemplo, quando o agente terapêutico é ou ter demonstrado em estudos clínicos ser de benefício terapêutico nesta sub5 população específica de pacientes com lúpus.
A invenção aqui descrita atende às necessidades acima descritas e fornece outros benefícios.
Todas as referências aqui citadas, incluindo pedidos de patente e publicações, são incorporadas por referência em sua totalidade.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção fornece métodos precisos, simples e rápidos e composições para a identificação de lúpus, e para avaliação do risco de desenvolvimento de lúpus, com base, pelo menos em parte, na identificação de uma ou mais variações genéticas, por exemplo, SNPs, que estão correlacionadas com alta significância estatística e biológica com a presença, subtipos e/ou subpopulações de pacientes de lúpus. Mais especificamente, a invenção está relacionada à identificação de um conjunto único de SNPs, às combinações únicas destes SNPs e às regiões de desequilíbrio de ligação que estão associadas ao lúpus e seus subtipos, e às subpopulações de pacientes que sofrem de lúpus.
Em particular, o conjunto e/ou combinações únicas de SNPs podem ser usadas como um perfil genético ou uma assinatura indicativa de um indivíduo em risco para o desenvolvimento de lúpus, ou indicativa da doença ou sintoma ou condição deste. Os polimorfismos aqui descritos são úteis como biomarcadores para avaliação do risco de desenvolvimento de lúpus, bem como para alvos para o projeto de reagentes diagnósticos. Em alguns aspectos, o SNP não está associado a um gene. Em outros aspectos, o SNP está associado a um gene, e pode estar localizado em uma região intergênica ou intragênica e, mais particularmente, pode estar localizado em uma região codificadora ou não-codificadora. Os genes associados a um SNP da presente invenção podem estar associados a um gene desconhecido, ou podem estar associados a um gene conhecido, por exemplo, ITGAM ou BLK.
Os SNPs aqui identificados fornecem alvos para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para uso no diagnóstico e tratamento de pacientes com lúpus geneticamente identificados, incluindo o diagnóstico e tratamento dirigido de subpopulações de pacientes com lúpus que exibem uma assinatura genética distinta que compreende um ou mais dos SNPs da presente invenção. Por exemplo, em um aspecto, os genes que contêm as variações genéticas aqui identificadas e o ácido nucléico (por exemplo, DNA ou RNA) associado a esses genes, e proteínas codificadas por esses genes, podem ser usados como alvos para o desenvolvimento de agentes terapêuticos (por exemplo, compostos de pequena molécula, anticorpos, agentes antissenso/RNAi etc.) ou usados diretamente como agentes terapêuticos (por exemplo, proteínas terapêuticas etc.) para o tratamento de lúpus.
Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece um conjunto de um ou mais SNPs que formam uma assinatura genética única para avaliação do risco de desenvolvimento de lúpus. Em um aspecto, a assinatura genética única compreende cerca de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40 ou 40-50 SNPs selecionados de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10.
Em um aspecto, a assinatura genética única compreende um ou mais SNPs, 2 ou mais SNPs, 3 ou mais SNPs, 4 ou mais SNPs, 5 ou mais SNPs, 6 ou mais SNPs, 7 ou mais SNPs, 8 ou mais SNPs, 9 ou mais SNPs, 10 ou mais SNPs, 11 ou mais SNPs, 12 ou mais SNPs, 13 ou mais SNPs, 14 ou mais SNPs, 15 ou mais SNPs, 16 ou mais SNPs, 17 ou mais SNPs, 18 ou mais SNPs, 19 ou mais SNPs, ou 20 ou mais SNPs selecionados de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em um aspecto, os SNPs da assinatura genética são selecionados da Tabela 6. Em outro aspecto, os SNPs são selecionados do grupo que consiste em rs9888739, rs13277113, rs7574865, rs2269368, rs6889239, rs2391592 e rs21177770. Em outro aspecto, os SNPs são selecionados do grupo que consiste em rs2187668, rs10488631, rs7574865, rs9888739, rs13277113, rs2431697, rs6568431, rs10489265, rs2476601, rs2269368, rs1801274, rs4963128, rs5754217, rs6445975, rs3129860, rs10516487, rs6889239, rs2391592 ers2177770.
Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para avaliar se um indivíduo apresenta risco para o desenvolvimento de lúpus por detecção, em uma amostra biológica obtida do referido indivíduo, da presença de uma assinatura genética indicativa do risco de desenvolvimento de lúpus, em que a referida assinatura genética compreende um conjunto de um ou mais SNPs selecionados de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 117 e nas Tabelas 1-10. Em um aspecto, o conjunto de SNPs compreende cerca de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40 ou 40-50 SNPs selecionados de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em outro aspecto, o conjunto de SNPs compreende 2 ou mais SNPs, 3 ou mais SNPs, 4 ou mais SNPs, 5 ou mais SNPs, 6 ou mais SNPs, 7 ou mais SNPs, 8 ou mais SNPs, 9 ou mais SNPs, 10 ou mais SNPs, 11 ou mais SNPs, 12 ou mais SNPs, 13 ou mais SNPs, 14 ou mais SNPs, 15 ou mais SNPs, 16 ou mais SNPs, 17 ou mais SNPs, 18 ou mais SNPs, 19 ou mais SNPs, ou 20 ou mais SNPs selecionados de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em outro aspecto, o conjunto de SNPs compreende 1-19 SNPs selecionados da Tabela 6. Em outro aspecto, o conjunto de SNPs compreende um SNP de BLK selecionado de qualquer um dos SNPs de BLK apresentados nas Tabelas 7-10. Em outro aspecto, o conjunto de SNPs compreende um SNP de ITGAM selecionado de qualquer um dos SNPs de ITGAM apresentados nas Tabelas 7-10. Em outro aspecto, o conjunto de SNPs ainda compreende um SNP de BLK selecionado de qualquer um dos SNPs de BLK apresentados nas Tabelas 7-10. Em outro aspecto, o conjunto de SNPs compreende um ou mais SNPs selecionados do seguinte grupo de SNPs: rs2187668, rs10488631, rs7574865, rs9888739, rs13277113, rs2431697, rs6568431, rs10489265, rs2476601, rs2269368, rs1801274, rs4963128, rs5754217, rs6445975, rs3129860, rs10516487, rs6889239, rs2391592 e rs2177770.
Em outro aspecto, a invenção fornece métodos de diagnóstico de lúpus em um indivíduo por detecção, em uma amostra biológica obtida do referido indivíduo, da presença de uma assinatura genética indicativa de lúpus, em que a referida assinatura genética compreende um conjunto de um ou mais SNPs selecionados de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10.
Em outro aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado ou fragmento deste que possui pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento, em que o polinucleotídeo ou fragmento deste compreende: a) uma variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10, ou (b) o complemento de (a). Em um aspecto, o polinucleotídeo isolado é um DNA genômico que compreende um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em outro aspecto, o polinucleotídeo isolado é um RNA que compreende um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10.
Em um aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado PRO-associado ou fragmento deste que possui pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento, em que o polinucleotídeo PRO-associado ou fragmento deste compreende: a) uma variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10, ou (b) o complemento de (a). Em um aspecto, o polinucleotídeo isolado é um DNA genômico que codifica um gene (e/ou região reguladora do gene) que compreende um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em outro aspecto, o SNP está em uma região de um cromossomo que não codifica um gene. Em outro aspecto, o SNP está em uma região intergênica de um cromossomo. Em outro aspecto, o polinucleotídeo isolado é um iniciador. Em outro aspecto, o polinucleotídeo isolado é um oligonucleotídeo.
Em outro aspecto, a invenção fornece um oligonucleotídeo que é: (a) um oligonucleotídeo alelo-específico que hibridiza para uma região de um polinucleotídeo que compreende uma variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) como apresentada nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10, ou (b) o complemento de (a). Em um aspecto, o SNP está em um polinucleotídeo PRO-associado que codifica um gene (ou sua região reguladora) que compreende um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em outro aspecto, o SNP está em um DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora) que compreende um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 110. Em outro aspecto, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em outro aspecto, o SNP está em uma região codificadora do gene. Em outro aspecto, o oligonucleotídeo alelo-específico é um iniciador alelo-específico.
Em outro aspecto, a invenção fornece um kit que compreende qualquer um dos oligonucleotídeos acima e, opcionalmente, pelo menos uma enzima. Em um aspecto, a (pelo menos uma) enzima é uma polimerase. Em outro aspecto, a (pelo menos uma) enzima é uma ligase.
Em outro aspecto, a invenção fornece um microarranjo que compreende qualquer um dos oligonucleotídeos acima.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método de detecção da ausência ou presença de uma variação em um polinucleotídeo em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 110, o método compreendendo: (a) o contato do ácido nucléico suspeito de compreender a variação com um oligonucleotídeo alelo-específico que é específico para a variação sob condições adequadas à hibridização do oligonucleotídeo alelo-específico para o ácido nucléico; e (b) detecção da ausência ou presença de hibridização alelo-específica. Em um aspecto, a variação compreende um SNP apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em um aspecto, o polinucleotídeo é um polinucleotídeo PRO-associado.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método de amplificação de um ácido nucléico que compreende uma variação em um polinucleotídeo em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10, o método compreendendo: (a) o contato do ácido nucléico com um iniciador que hibridiza para o ácido nucléico em uma sequência 3' da variação, e (b) a extensão do iniciador para gerar um produto de amplificação que compreenda variação. Em um aspecto, o polinucleotídeo é um polinucleotídeo PRO-associado.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método de determinação do genótipo de uma amostra biológica de um mamífero, o método compreendendo a detecção, em material de ácido nucléico derivado da amostra biológica, da ausência ou presença de uma variação em um polinucleotídeo em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 110. Em um aspecto, o polinucleotídeo é um polinucleotídeo PRO-associado.
Em outro aspecto, a amostra biológica sabidamente compreende ou é suspeita de compreender um polinucleotídeo da presente invenção, em que o polinucleotídeo compreende uma variação em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 117 e nas Tabelas 1-10. Em outro aspecto, a amostra biológica é um tecido doente. Em outro aspecto, a detecção compreende a realização de um processo selecionado de um ensaio de extensão de iniciador; um ensaio de extensão de iniciador alelo-específico; um ensaio de incorporação de nucleotídeo alelo-específico; um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo aleloespecífico; um ensaio de 5’ nuclease; um ensaio que emprega sinalizadores moleculares; e um ensaio de ligação de oligonucleotídeo.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método de subclassificação de lúpus em um mamífero, o método compreendendo a detecção da presença de um ou mais dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10, em uma amostra biológica derivada do mamífero, em que a amostra biológica sabidamente compreende ou é suspeita de compreender pelo menos um polinucleotídeo que compreende um SNP selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em um aspecto, o polinucleotídeo é um polinucleotídeo PRO-associado.
Em outro aspecto, a detecção compreende a realização de um processo selecionado de um ensaio de extensão de iniciador; um ensaio de extensão de iniciador alelo-específico; um ensaio de incorporação de nucleotídeo alelo-específico; um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo aleloespecífico; um ensaio de 5’ nuclease; um ensaio que emprega sinalizadores moleculares; e um ensaio de ligação de oligonucleotídeo.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método para prever se um indivíduo com lúpus irá responder a um agente terapêutico para lúpus, o método compreendendo a determinação de se o indivíduo apresenta uma variação em um polinucleotídeo em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10, em que a presença de uma variação indica que o indivíduo irá responder ao agente terapêutico. Em um aspecto, o polinucleotídeo é um polinucleotídeo PRO-associado.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método de diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um indivíduo, o método compreendendo a detecção da presença de uma variação em um polinucleotídeo derivado de uma amostra biológica obtida do indivíduo, em que: (a) a amostra biológica que sabidamente compreende, ou é suspeita de compreender, um polinucleotídeo que compreende a variação; (b) a variação compreende ou está localizada em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um SNP selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10; e (c) a presença da variação é um diagnóstico ou prognóstico de lúpus no indivíduo.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método de diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um indivíduo, o método compreendendo a detecção da presença de uma variação em um polinucleotídeo PRO ou PROassociado derivado de uma amostra biológica obtida do indivíduo, em que: (a) a amostra biológica que sabidamente compreende, ou é suspeita de compreender, um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado que compreende a variação; (b) a variação compreende ou está localizada em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um SNP apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10; e (c) a presença da variação é um diagnóstico ou prognóstico de lúpus no indivíduo.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método para o auxílio no diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um indivíduo, o método compreendendo a detecção da presença de uma variação em um polinucleotídeo derivado de uma amostra biológica obtida do indivíduo, em que: (a) a amostra biológica sabidamente compreende, ou é suspeita de compreender, um polinucleotídeo que compreende a variação; (b) a variação compreende ou está localizada em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um SNP selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10; e (c) a presença da variação é um diagnóstico ou prognóstico de uma condição ou sintoma de lúpus no indivíduo.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método para o auxílio no diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um indivíduo, o método compreendendo a detecção da presença de uma variação em um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado derivado de uma amostra biológica obtida do indivíduo, em que: (a) a amostra biológica sabidamente compreende, ou é suspeita de compreender, um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado que compreende a variação; (b) a variação compreende ou está localizada em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um SNP selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10; e (c) a presença da variação é um diagnóstico ou prognóstico de uma condição ou sintoma de lúpus no indivíduo.
Em outro aspecto, o polinucleotídeo compreende uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em um aspecto, a variação está no DNA genômico que compreende um SNP selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em um aspecto, o SNP está em uma região cromossômica que não codifica um gene. Em outro aspecto, o SNP está em uma região intergênica.
Em outro aspecto, o polinucleotídeo PRO-associado codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequi líbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em um aspecto, a variação está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em um aspecto, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em outro aspecto, o SNP está em uma região codificadora do gene.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método de identificação de um agente terapêutico eficaz para tratar lúpus em uma subpopulação de pacientes, o método compreendendo a correlação da eficácia do agente com a presença no paciente de um ou mais dos SNPs selecionados de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10 identificando, dessa forma, o agente como eficaz para tratar lúpus na referida subpopulação de pacientes.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método de identificação de um agente terapêutico eficaz para tratar lúpus em uma subpopulação de pacientes, o método compreendendo a correlação da eficácia do agente com a presença de uma combinação dos SNPs selecionados de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10 identificando, dessa forma, o agente como eficaz para tratar lúpus na referida subpopulação de pacientes.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de uma condição de lúpus em um indivíduo no qual uma variação genética está sabidamente presente em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um agente terapêutico eficaz para tratar a condição.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que possui uma condição de lúpus, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um agente terapêutico eficaz para tratar a condição em um indivíduo que possui uma variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que possui uma condição de lúpus, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um agente terapêutico comprovadamente eficaz para tratar a referida condição em pelo menos um estudo clínico em que o agente foi administrado a pelo menos cinco indivíduos humanos que tinham uma variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em um aspecto, os (pelo menos) cinco indivíduos tinham dois ou mais SNPs diferentes no total para o grupo de pelo menos cinco indivíduos. Em outro aspecto, os (pelo menos) cinco indivíduos tinham o mesmo SNP para todo o grupo de pelo menos cinco indivíduos.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo com lúpus de uma subpopulação específica de pacientes com lúpus, em que a subpopulação é caracterizada, pelo menos em parte, por associação com variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um SNP selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10, e em que o método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico que é aprovado como um agente terapêutico para a referida subpopulação. Em um aspecto, a subpopulação possui nefrite lúpica. Em outro aspecto, a subpopulação é do sexo feminino. Em outro aspecto, a subpopulação é de ascendência européia.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método que compreende a fabricação de um agente terapêutico para lúpus, e a embalagem do agente com instruções sobre como administrar o agente a um indivíduo que possui, ou que supostamente possui, lúpus, e que possui uma variação genética em uma posição que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figu15 ras 1-17 e nas Tabelas 1-10.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método de especificação de um agente terapêutico para uso em uma subpopulação de pacientes com lúpus, o método compreendendo o fornecimento de instruções para administrar o agente terapêutico a uma subpopulação de pacientes caracterizada por uma variação genética em uma posição que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método para a comercialização de um agente terapêutico para uso em uma subpopulação de pacientes com lúpus, o método compreendendo a informação a uma audiênciaalvo sobre o uso do agente terapêutico para o tratamento da subpopulação de pacientes caracterizada pela presença, em pacientes desta subpopulação, de uma variação genética em uma posição que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método para a modulação da sinalização por meio do receptor de célula B em um indivíduo no qual uma variação genética está sabidamente presente em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um agente terapêutico eficaz para modular a sinalização por meio do receptor de célula B.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método para a modulação da diferenciação de células Th17 em um indivíduo no qual uma variação genética está sabidamente presente em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 110, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um agente terapêutico eficaz para modular a diferenciação de células Th17.
Em outro aspecto, a invenção fornece um conjunto de SNPs que compreende uma assinatura genética indicativa do risco de desenvolvimento de lúpus, em que o referido conjunto de SNPs compreende um ou mais SNPs selecionados de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 117 e nas Tabelas 1-10. Em um aspecto, o conjunto de SNPs compreende 5 cerca de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40 ou 40-50 SNPs selecionados de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em outro aspecto, o conjunto de SNPs compreende um ou mais SNPs selecionados do grupo que consiste em rs9888739, rs13277113, rs7574865, rs2269368, rs6889239, rs2391592 e rs21177770. Em outro aspecto, o conjunto de SNPs 10 compreende 2 ou mais SNPs, 3 ou mais SNPs, 4 ou mais SNPs, 5 ou mais
SNPs, 6 ou mais SNPs, 7 ou mais SNPs, 8 ou mais SNPs, 9 ou mais SNPs, ou mais SNPs, 11 ou mais SNPs, 12 ou mais SNPs, 13 ou mais SNPs, 14 ou mais SNPs, 15 ou mais SNPs, 16 ou mais SNPs, 17 ou mais SNPs, 18 ou mais SNPs, 19 ou mais SNPs, ou 20 ou mais SNPs selecionados de qual15 quer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em outro aspecto, o conjunto de SNPs compreende 1-19 SNPs selecionados da Tabela 6. Em outro aspecto, o conjunto de SNPs compreende um SNP de BLK selecionado de qualquer um dos SNPs de BLK apresentados nas Tabelas 7-10. Em outro aspecto, o conjunto de SNPs compreende um SNP de 20 ITGAM selecionado de qualquer um dos SNPs de ITGAM apresentados nas
Tabelas 7-10. Em outro aspecto, o conjunto de SNPs ainda compreende um SNP de BLK selecionado de qualquer um dos SNPs de BLK apresentados nas Tabelas 7-10. Em outro aspecto, o conjunto de SNPs compreende um ou mais SNPs selecionados do seguinte grupo de SNPs: rs2187668, 25 rs10488631, rs7574865, rs9888739, rs13277113, rs2431697, rs6568431, rs10489265, rs2476601, rs2269368, rs1801274, rs4963128, rs5754217, rs6445975, rs3129860, rs10516487, rs6889239, rs2391592 e rs2177770.
Em outro aspecto, a invenção fornece um conjunto de SNPs que compreende uma assinatura genética indicativa de lúpus, em que o referido 30 conjunto de SNPs compreende um ou mais SNPs selecionados de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 descreve os resultados de uma varredura da associação de todo o genoma no SLE que identifica 5 genes principais. Os dados representam 502.033 variantes de SNP tipados em 3 séries de amostras, para um total de 1.311 casos de SLE e 3.340 controles. O Painel A mostra um gráfico de quantil-quantil da distribuição de valores P observados vs a distribuição nula do valor P esperada. Os diamantes representam todos os valores P, e os círculos representam valores P após a exclusão das variantes da região HLA, IRF5 e STAT4. O Painel B é uma representação gráfica dos valores P —logio da análise combinada organizados por cromossomo. Variantes adicionais da região HLA (N = 34) com P < 1 x 10'13 não são mostradas no Painel B.
A Figura 2 mostra que variantes associadas da região BLK/C8orf13 se correlacionam com níveis de expressão em células B transformadas. A) Os valores P -logio da região BLK/C8orf13 são exibidos. A cor dos diamantes representa as correlações de r2 com rs13277113. Todos os genes de RefSeq na região são exibidos acima de um gráfico que mostra o LD na região como determinada por análise de cromossomos de controle. Vale observar que essa região associada no cromossomo se situa dentro de uma inversão polimórfica comum intracromossômica de 4,2 Mb (veja, por exemplo, Giglio e outros Am. J. Hum. Genet. 2001; 68(4): 874-83 e Sugawara e outros Genomics 2003; 82(2): 238-44), e está associada a níveis anormalmente baixos de LD estendido através da região, como mostrado. No entanto, a associação de BLK/C8orf13 com o SLE é independente da inversão. A expressão de BLK (B) e C8orf13 (C) em linhagens de células B transformadas de 210 fundadores saudáveis não-relacionados CEU HapMap é mostrada estratificada por genótipo em rs13277113. A significância da expressão diferencial foi determinada usando testes T de Student não pareados.
A Figura 3 mostra que variantes dentro do lócus ITGAM/ITGAX estão associados ao SLE. O Painel A mostra os valores P -logio da região ITGAM/ITGAX. A cor dos diamantes representa as correlações de r2 com rs11574637. Todos os genes de RefSeq na região são exibidos acima de um gráfico que mostra o LD na região, como determinado pelos cromossomos de controle estudados. O Painel B descreve a estrutura genômica de ITGAM, os domínios conservados de proteína principais, e o relacionamento entre rs11574637 e dois alelos não sinônimos de ITGAM.
- 5 A Figura 4 descreve a frequência de características clínicas nas
Séries 1-3 de SLE e nos casos da Suécia.
A Figura 5 descreve os 50 loci principais associados ao SLE em uma varredura de todo o genoma em 1.311 casos e 3.340 controles.
A Figura 6 descreve os níveis de expressão de genes de BLK, 10 C8orfl e de controle em 210 linhagens de células B transformadas de indivíduos HapMap.
A Figura 7 descreve a expressão de BLK em células B transformadas de populações HapMap.
A Figura 8 descreve a associação de variantes da região 15 C8orf13/BLK e ITGAM/ITGAX com SLE por séries de casos/controle.
A Figura 9 descreve a associação de variantes de C8orf13/BLK e ITGAM/ITGAX com os 11 critérios clínicos da ACR para as Séries 1-3 de SLE.
A Figura 10 descreve a associação de variantes de C8orf13/BLK e ITGAM/ITGAX com os 11 critérios clínicos da ACR para 521 casos da Su20 écia de SLE. Nas amostras da Suécia, 521 casos foram examinados quanto a uma associação com os critérios da ACR. A significância estatística foi avaliada por tabelas de contingência 2 x 2 e um teste qui-quadrado. Os valores P calculados não foram ajustados quanto a múltiplos testes, já que os critérios da ACR são sabidamente correlacionados, e uma correção de Bon25 ferroni simples de X = 0,05/11 = 0,0045 provavelmente seria excessivamente conservadora.
A Figura 11 descreve a fórmula usada para combinar pontuações Z corrigidas ponderadas para tamanho da série e ajustadas para o fator de inflação de controle genômico residual (Xgc). A variância (σ2) de cada 30 série foi calculada, em que p = a frequência de alelo em casos e controles. A pontuação Z combinada para as 3 sÉries de SLE (Z*) foi calculada, em que Z1, Z2, e Z3 igualam a pontuação de Z com base no qui-quadrado corrigido por EIGENSTRAT para a associação de uma variante ao SLE de cada série, e em que λ1, λ2 e λ3 é o fator de inflação de controle genômico residual (Àgc) após correção por EIGENSTRAT para cada série.
A seguinte chave se aplica aos cabeçalhos nas Figuras 12-17:
#do SNP Numeração arbitrária de SNP em um subconjunto de pacientes/grupo de estudo específico
# da Região Numeração arbitrária de regiões de desequilíbrio de ligação nos subconjuntos de pacientes específicos
ID do SNP Número do SNP rslD
EIGP Valor P da estatística de qui-quadrado de EIGENSTRAT.
P em Principal Valor P para esses SNP no Grupo Principal
P em mulheres Valor P para esse SNP no subconjunto de mulheres
Coordenada Par de bases de SNP em seu cromossomo
cM CentiMorgans do início do cromossomo
MAP CEU Frequência Menor de Alelos de SNP amostras HapMap CEU
região antes do SNP 0 SNP imediatamente antes da região de desequilíbrio de ligação (LD) que contém o SNP indicado sob SNP ID.
SNP após região 0 SNP imediatamente após a região de LD
Por que genes (região) escolhidos Lógica para essa região que está sendo escolhida como uma região relevante
1o gene na região 0 primeiro dos genes na região indicada, listado em ordem por coordenada (par de bases).
Descrição (Descr.) Descrição do gene do HUGO Comitê de Nomenclatura de Genes
IRIS Proporção da maior média imune / maior média não imune; do estudo ÍRIS
SNP da região de LD Qualquer SNP localizado em uma região de desequilíbrio de ligação delineada por (i) coordenada A e coordenada B, ou (ii) SNP A e SNP B, inclusive.
As Figuras 12 (A) e (B), em conjunto, apresentam uma análise de um subconjunto de nefrite lúpica, que mostra 11 regiões que contêm 20 SNPs candidatos que provavelmente contêm pelo menos um alelo de risco para nefrite lúpica. (C) e (D), em conjunto, fornecem caracterização adicional . 5 de regiões de desequilíbrio de ligação, identidade de certos genes dentro dessas regiões e critérios para a identificação destes genes.
A Figura 13 (A) descreve da análise de um subconjunto de mulheres, que mostra 6 regiões adicionais que contêm 9 SNPs candidatos que provavelmente contêm pelo menos um alelo de risco. (B) fornece caracteri10 zação adicional de regiões de desequilíbrio de ligação, identidade de certos genes dentro dessas regiões e critérios para a identificação destes genes.
A Figura 14 (A) descreve a análise do Grupo Principal, que mostra 6 regiões adicionais que contêm 8 SNPs candidatos que provavelmente contêm pelo menos um alelo de risco. A Figura 14 (B) fornece a caracteriza15 ção adicional de regiões de desequilíbrio de ligação, certos genes dentro dessas regiões e critérios para a identificação destes genes.
A Figura 15 descreve a delineação de regiões de desequilíbrio de ligação, e SNPs nelas contidos, com base em certos dados da Figura 12.
A Figura 16 descreve a delineação de regiões de desequilíbrio de ligação, e SNPs nelas contidos, com base em certos dados da Figura 13.
A Figura 17 descreve a delineação de regiões de desequilíbrio de ligação, e SNPs nelas contidos, com base em certos dados da Figura 14. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A invenção fornece métodos precisos, simples e rápidos e com25 posições para a identificação de lúpus, e para avaliação do risco de desenvolvimento de lúpus, com base, pelo menos em parte, na identificação de uma ou mais variações genéticas, por exemplo, SNPs, que estão correlacionadas com alta significância estatística e biológica com a presença, subtipos e/ou subpopulações de pacientes de lúpus. Mais especificamente, a inven30 ção está relacionada à identificação de um conjunto único de SNPs, combinações únicas destes SNPs, e regiões de desequilíbrio de ligação que estão associadas ao lúpus e seus subtipos, e subpopulações de pacientes que sofrem do mesmo.
Em particular, o conjunto e/ou combinações únicas de SNPs podem ser usadas como um perfil genético ou uma assinatura indicativa de um indivíduo em risco para o desenvolvimento de lúpus, ou indicativa da doença 5 ou sintoma ou condição desta. Os polimorfismos aqui descritos são úteis como biomarcadores para avaliação do risco de desenvolvimento de lúpus, bem como para alvos para o projeto de reagentes diagnósticos. Em algumas modalidades, o SNP não está associado a um gene. Em outras modalidades, o SNP está associado a um gene, e pode estar localizado em uma regi10 ão intergênica ou intragênica e, mais particularmente, pode estar localizado em uma região codificadora ou não-codificadora. Os genes associados a um SNP da presente invenção podem estar associados a um gene desconhecido, ou podem estar associados a um gene conhecido, por exemplo, ITGAM ou BLK.
Os SNPs aqui identificados fornecem alvos para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para uso no diagnóstico e tratamento de pacientes com lúpus geneticamente identificados, incluindo o diagnóstico e tratamento dirigido de subpopulações de pacientes com lúpus que exibem uma assinatura genética distinta que compreende um ou mais dos SNPs da pre20 sente invenção. Por exemplo, em uma modalidade, os genes que contêm as variações genéticas aqui identificadas, e o ácido nucléico (por exemplo, DNA ou RNA) associado a esses genes, e proteínas codificadas por esses genes, podem ser usados como alvos para o desenvolvimento de agentes terapêuticos (por exemplo, compostos de pequena molécula, anticorpos, agentes 25 antissenso/RNAi etc.) ou usados diretamente como agentes terapêuticos (por exemplo, proteínas terapêuticas etc.) para o tratamento de lúpus.
Técnicas gerais
A prática da presente invenção irá empregar, a menos que indicado de forma diferente, técnicas convencionais de biologia molecular (inclu30 indo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que fazem parte do conhecimento da técnica. Estas técnicas são explicadas em sua totalidade na literatura, por exemplo, em Molecular Cio ning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (Sambrook e outros, 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel e outros, eds., 1987, e atualizações periódicas); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis e outros, eds., 1994).
Iniciadores, oligonucleotídeos e polinucleotídeos empregados na presente invenção podem ser gerados usando técnicas-padrão conhecidas na técnica.
A menos que definido de forma diferente, os termos técnicos e científicos aqui usados possuem os mesmos significados comumente entendidos por aqueles versados na técnica à qual essa invenção pertence. Singleton e outros, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a Edição, J. Wiley & Sons (Nova York, N.Y. 1994), e March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4a Edição, John Wiley & Sons (Nova York, N.Y. 1992), dão àqueles versados na técnica um guia geral para muitos dos termos usados no presente pedido.
I. DEFINIÇÕES
Com o objetivo de interpretar esse relatório descritivo, as seguintes definições serão aplicadas, e sempre que adequado, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa. Caso alguma definição apresentada abaixo conflita com qualquer documento aqui incorporado por referência, prevalecerá a definição apresentada abaixo.
O termo lúpus ou condição lúpus, como aqui usado, é uma doença ou distúrbio autoimune que, em geral, envolve anticorpos que atacam o tecido conjuntivo. A forma principal de lúpus é aquela sistêmica, o lúpus eritematoso sistêmico (SLE), incluindo SLE cutâneo e SLE cutâneo subagudo, bem como outros tipos de lúpus (incluindo nefrite, extra-renal, cerebrite, pediátrico, não renal, discoide e alopecia). Veja, geralmente, D'Cruz e outros, supra.
O termo polinucleotídeo ou ácido nucléico, como aqui usado de forma intercambiável, refere-se aos polímeros de nucleotídeos de qual quer comprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado em um polímero por DNA ou RNA polimerase. Polinucleotídeo pode compreen5 der nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, a modificação à estrutura do nucleotídeo pode ser feita antes ou depois da montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Polinucleotídeo pode ainda ser modificado após polimerização, por exemplo, por conjugação 10 com um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, caps, a substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações inter-nucleotídeos como, por exemplo, aquelas com ligações sem carga (por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos etc.) e com ligações com car15 ga (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos etc.), aquelas que contêm porções pendentes como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos sinalizadores, poli-L-lisina etc.), aquelas com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno etc.), aquelas que contêm quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos 20 etc.), aquelas que contêm alquilantes, aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucléicos alfa anoméricos etc.), bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Além disso, qualquer um dos grupos hidroxil normalmente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos de pro25 teção padronizados, ou ativados para preparar ligações adicionais aos nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados a suportes sólidos. O terminal OH 5' e 3’ pode ser fosforilado ou substituído com aminas ou porções de grupos orgânicos de cobertura (cap) de 1 a 20 átomos de carbono. Outros grupos hidroxil também podem ser derivatizados em grupos de proteção pa30 dronizados. Os polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que geralmente são conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-2'-O-alila, 2'-flúor- ou 2'-azido-ribose, análogos carbocíclicos de açúcar, açúcares α-anoméricos, açúcares epiméricos como, por exemplo, açúcares de arabinose, xiloses ou lixoses, piranose, açúcares de furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos abásicos de nucleosídeo como, por exemplo, metil ribosida. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Esses grupos de ligação alternativos incluem, sem limitação, modalidades nas quais o fosfato é substituído por P(O)S (tioato), P(S)S (ditioato), (O)NR 2 (amidato), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2 (formacetal), em que cada R ou R’ é independentemente H ou alquil substituído ou não substituído (C 1-20) contendo opcionalmente uma éter ligação (--O--), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição precedente se aplica a todos polinucleotídeos aqui citados, incluindo RNA e DNA.
O termo oligonucleotídeo, como aqui usado, refere-se aos polinucleotídeos de fita simples, curtos, que possuem comprimento de pelo menos cerca de sete nucleotídeos e menos do que cerca de 250 nucleotídeos de comprimento. Os oligonucleotídeos podem ser sintéticos. Os termos oligonucleotídeo e polinucleotídeo não são mutuamente exclusivos. A descrição acima para polinucleotídeos é igual e totalmente aplicável aos oligonucleotídeos.
O termo iniciador refere-se a um polinucleotídeo de fita simples que é capaz de hibridizar para um ácido nucléico e permitir a polimerização de um ácido nucléico complementar, geralmente por fornecimento de um grupo 3'—OH livre.
O termo PRO refere-se a um polipeptídeo codificado por qualquer gene codificado por uma sequência de ácidos nucléicos localizada dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (região de LD), em que a região de LD é determinada de acordo com informações apresentadas nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em uma modalidade, um PRO da invenção não inclui um polipeptídeo conhecido na técnica por causar lúpus. Em uma modalidade, um PRO da invenção não inclui um polipeptídeo conhecido na técnica como estando associado ao lúpus, por exemplo, IRF5, ou qualquer poli peptídeo codificado por um gene indicado nas Tabelas 5-9 de WO 2007/019219. O termo polinucleotídeo PRO-associado ou ácido nucléico PRO-associado refere-se a uma molécula de ácido nucléico que compreende uma sequência contígua, em que a sequência contígua compreende uma posição aqui identificada como exibindo variação genética. Em uma modalidade, a posição que exibe variação genética está localizada na extremidade 5' ou 3' da sequência contígua. Em uma modalidade, a posição que exibe variação genética na sequência contígua é flanqueada, nas suas regiões 5' e/ou 3', ou em ambas, por um ou mais nucleotídeos que constituem a sequência de flanqueamento de ocorrência natural da posição. Em uma modalidade, uma posição que exibe variação genética é uma posição que corresponde a um SNP indicado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 110.
O termo variação genética ou variação de nucleotídeo referese a uma alteração em uma sequência de nucleotídeos (por exemplo, uma inserção, eliminação, inversão ou substituição de um ou mais nucleotídeos, por exemplo, um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP)) em relação a uma sequência de referência (por exemplo, uma sequência comumente encontrada e/ou do tipo selvagem e/ou a sequência de um alelo importante). O termo também engloba a alteração correspondente no complemento da sequência de nucleotídeos, a menos que indicado de forma diferente. Em uma modalidade, uma variação genética é um polimorfismo somático. Em uma modalidade, uma variação genética é um polimorfismo de linhagem germinativa.
Um polimorfismo de nucleotídeo único, ou SNP, refere-se a uma posição de base única em uma molécula de RNA ou DNA (por exemplo, um polinucleotídeo), na qual diferentes alelos, ou nucleotídeos alternativos, existem em uma população. A posição de SNP (aqui denominado de forma intercambiável SNP, sítio de SNP, lócus de SNP) é normalmente precedida e seguida por sequências altamente conservadas do alelo (por exemplo, sequências que variam em menos de 1/100 ou 1/1.000 membros das populações). Um indivíduo pode ser homozigoto ou heterozigoto para um alelo em cada posição de SNP.
O termo variação de aminoácido refere-se a uma alteração em uma sequência de aminoácidos (por exemplo, uma inserção, substituição ou eliminação de um ou mais aminoácidos, por exemplo, uma eliminação interna ou um truncamento do terminal N ou C) em relação a uma sequência de referência.
O termo variação refere-se a uma variação de nucleotídeo ou uma variação de aminoácido.
Os termos uma variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um SNP, uma variação de nucleotídeo em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um SNP, e variantes gramaticais destes, referem-se a uma variação de nucleotídeo em uma sequência de polinucleotídeos na posição de nucleotídeo relativa correspondente ocupada pelo SNP no genoma. O termo também engloba a variação correspondente no complemento da sequência de nucleotídeos, a menos que indicado de forma diferente. Em algumas modalidades, a variação de nucleotídeo está em uma sequência do polinucleotídeo PRO-associado na posição de nucleotídeo relativa correspondente ocupada pelo SNP no genoma.
O termo SNP da região de desequilíbrio de ligação, ou SNP da região de LD refere-se a um SNP presente em uma região de DNA específica, por exemplo, região delineada por marcadores de ácido nucléico/genômicos apropriados, por exemplo, coordenadas ou SNPs. Em uma modalidade, uma região de LD é delineada por uma primeira coordenada (por exemplo, coordenada A) e uma segunda coordenada (por exemplo, coordenada B), ambas as coordenadas se referindo ao mesmo cromossomo. Em uma modalidade, uma região de LD é delineada por um primeiro SNP (por exemplo, SNP A) e um segundo SNP (por exemplo, SNP B). Dessa forma, em uma modalidade, um SNP da região de LD refere-se a um SNP localizado em uma região de ácido nucléico (por exemplo, região genômica) que varia entre uma primeira coordenada até uma segunda coordenada, ou um primeiro SNP até um segundo SNP. Exemplos destas regiões de LD e SNPs da região de LD são mostrados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 110.
O termo arranjo ou microarranjo refere-se a um arranjo ordenado de elementos hibridizáveis do arranjo, de preferência, sondas de polinucleotídeo (por exemplo, oligonucleotídeos), em um substrato. O substrato pode ser um substrato sólido, por exemplo, uma lâmina de vidro, ou um substrato semissólido, por exemplo, uma membrana de nitrocelulose.
O termo amplificação refere-se ao processo de produção de uma ou mais cópias de uma sequência de ácidos nucléicos de referência ou seu complemento. A amplificação pode ser linear ou exponencial (por exemplo, PCR). Uma cópia não significa necessariamente complementaridade ou identidade de sequências perfeitas, em relação à sequência-modelo. Por exemplo, as cópias podem incluir análogos de nucleotídeos, tais como desoxiinosina, alterações intencionais de sequências (por exemplo, alterações de sequências introduzidas por meio de um iniciador que compreende uma sequência que é hibridizável, mas não totalmente complementar, ao modelo) e/ou erros de sequências que ocorrem durante a amplificação.
O termo oligonucleotídeo alelo-específico refere-se a um oligonucleotídeo que hibridiza para uma região de um ácido nucléico-alvo que compreende uma variação de nucleotídeo (geralmente uma substituição). O termo hibridização alelo-específica significa que, quando um oligonucleotídeo alelo-específico é hibridizado para seu ácido nucléico-alvo, um nucleotídeo no oligonucleotídeo alelo-específico especificamente faz pareamento de bases com a variação de nucleotídeo. Um oligonucleotídeo alelo-específico capaz de hibridização alelo-específica com relação a uma variação de nucleotídeo em particular é dito como sendo específico para aquela variação.
O termo iniciador alelo-específico refere-se a um oligonucleotídeo alelo-específico que é um iniciador.
O termo ensaio de extensão de iniciador refere-se a um ensaio em que nucleotídeos são adicionados a um ácido nucléico, resultando em um ácido nucléico mais longo, ou produto de extensão, que é detectado direta ou indireta mente. Os nucleotídeos podem ser adicionados para estender a extremidade 5' ou 3' do ácido nucléico.
O termo ensaio de incorporação de nucleotídeo alelo-especí fico refere-se a um ensaio de extensão de iniciador em que um iniciador é: (a) hibridizado para o ácido nucléico-alvo em uma região que está 3' ou 5' de uma variação de nucleotídeo e (b) estendido por uma polimerase, incorporando, dessa forma, no produto de extensão um nucleotídeo que é complementar à variação de nucleotídeo.
O termo ensaio de extensão de iniciador alelo-específico refere-se a um ensaio de extensão de iniciador em que um iniciador alelo-específico é hibridizado para um ácido nucléico-alvo e estendido.
O termo ensaio de hibridização de oligonucleotídeo alelo-específico refere-se a um ensaio em que: (a) um oligonucleotídeo alelo-específico é hibridizado para um ácido nucléico-álvo e (b) a hibridização é detectada direta ou indiretamente.
O termo ensaio de 5’ nuclease refere-se a um ensaio em que a hibridização de um oligonucleotídeo alelo-específico para um ácido nucléicoalvo permite a divagem nucleolítica da sonda hibridizada, resultando em um sinal detectável.
O termo ensaio que emprega sinalizadores moleculares referese a um ensaio em que a hibridização de um oligonucleotídeo aleloespecífico para um ácido nucléico-alvo resulta em um nível de sinal detectável que é maior do que o nível de sinal detectável emitido pelo oligonucleotídeo livre.
O termo ensaio de ligação de oligonucleotídeo refere-se a um ensaio em que um oligonucleotídeo alelo-específico e um segundo oligonucleotídeo são hibridizados adjacentes entre eles em um ácido nucléico-alvo e ligados juntos (direta ou indiretamente por meio de nucleotídeos intervenientes), e o produto de ligação é detectado direta ou indiretamente.
O termo sequência-alvo, ácido nucléico-alvo ou sequência de ácidos nucléicos-alvo refere-se geralmente a uma sequência de polinucleotídeos de interesse na qual uma variação de nucleotídeo é suspeita ou sabidamente reside, incluindo cópias deste ácido nucléico-alvo gerado por amplificação.
Como aqui usado, um indivíduo em risco para o desenvolví mento de lúpus pode ou não ter doença ou sintomas de doença detectáveis e pode ou não ter doença ou sintomas de doença detectáveis exibidos, antes dos métodos de tratamento aqui descritos. Em risco denota que um indivíduo possui um ou mais fatores de risco, que são parâmetros mensuráveis que estão relacionados ao desenvolvimento de lúpus, como aqui descrito e conhecido na técnica. Um indivíduo que possui um ou mais desses fatores de risco, possui um a probabilidade maior de desenvolver lúpus do que um indivíduo sem um ou mais desses fatores de risco fator. Por exemplo, em algumas modalidades, um indivíduo em risco de desenvolvimento de lúpus possui uma assinatura genética que compreende um ou mais dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em outra modalidade, um indivíduo em risco para o desenvolvimento de lúpus possui uma assinatura genética que compreende um ou mais dos SNPs apresentados na Tabela 6.
O termo detecção inclui qualquer significado de detectar, incluindo a detecção direta e indireta.
O termo diagnóstico é aqui usado para se referir à identificação ou classificação de um estado molecular ou patológico, doença ou condição. Por exemplo, diagnóstico pode se referir à identificação de um tipo particular de condição de lúpus, por exemplo, SLE. Diagnóstico também pode se referir à classificação de um subtipo particular de lúpus, por exemplo, pó envolvimento de tecido/órgão (por exemplo, nefrite lúpica), por características moleculares (por exemplo, uma subpopulação de pacientes caracterizada de variações genéticas em um gene ou uma região de ácido nucléico em particular).
O termo auxílio no diagnóstico é aqui usado para se referir aos métodos que ajudam na produção de uma determinação clínica em relação à presença, grau ou outra natureza, de um tipo particular de sintoma ou condição de lúpus. Por exemplo, um método de auxílio no diagnóstico de lúpus pode compreender a medida da quantidade ou a detecção da presença ou ausência de um ou mais SNPs em uma amostra biológica de um indivíduo. Em outro exemplo, um método de auxílio no diagnóstico de lúpus pode compreender a medida da quantidade ou a detecção da presença de um ou mais
SNPs em uma amostra biológica de um indivíduo.
O termo prognóstico é aqui usado para se referir à previsão da probabilidade de sintomas de doença atribuíveis a um distúrbio autoimune, incluindo, por exemplo, recorrência, crises e resistência farmacológica, de uma doença autoimune como, por exemplo, lúpus. O termo previsão é aqui usado para se referir à probabilidade de que um paciente responderá favorável ou desfavoravelmente a um fármaco ou a um conjunto de fármacos. Em uma modalidade, a previsão está relacionada à extensão daquelas respostas. Em uma modalidade, a previsão está relacionada a se e/ou à probabilidade de que um paciente irá sobreviver ou melhorar após tratamento, por exemplo, tratamento com um agente terapêutico em particular, e por certo período de tempo sem recorrência da doença. Os métodos preditivos da invenção podem ser usados clinicamente para a tomada de decisões de tratamento pela escolha das modalidades de tratamento mais apropriadas para qualquer paciente em particular. Os métodos preditivos da presente invenção são ferramentas valiosas para prever se um paciente provavelmente responderá favoravelmente a um regime de tratamento como, por exemplo, certo regime terapêutico, incluindo, por exemplo, a administração de certo agente ou combinação terapêutica, intervenção cirúrgica, tratamento com esteroide etc., ou se a sobrevida de longo prazo do paciente, após um regime terapêutico. O diagnóstico de SLE pode ser de acordo com os critérios atuais do American College of Rheumatology (ACR). A doença ativa pode ser definida por um dos critérios A do British Isles Lupus Activity Group's (BILAG) ou dois critérios B do BILAG. Alguns sinais, sintomas ou outros indicadores usados para diagnosticar SLE adaptados de: Tan e outros The Revised Criteria for the Classification of SLE Arth. Rheum. 25 (1982) podem ser erupção malar, por exemplo, erupção sobre as bochechas, erupção discoide ou placas vermelhas elevadas, fotossensibilidade como, por exemplo, reação à luz solar, resultando no desenvolvimento ou aumento da erupção cutânea, úlceras orais como, por exemplo, úlceras no nariz ou na boca, normalmente indolores, artrite como, por exemplo, artrite não-erosiva que envolve duas ou mais articulações periféricas (artrite em que os ossos em tor no das articulações na são destruídos), serosite, pleurite ou pericardite, distúrbio renal como, por exemplo, proteína excessiva na urina (acima de 0,5 g/dia ou 3+ nas fitas de teste) e/ou grumos celulares (elementos anormais derivados da urina e/ou células brancas e/ou células do túbulo renal), sinais neurológicos, sintomas ou outros indicadores, ataques (convulsões) e/ou psicose na ausência de fármacos ou distúrbios metabólicos que sabidamente causam esses efeitos, e sinais hematológicos, sintomas, ou outros indicadores como, por exemplo, anemia hemolítica ou leucopenia (contagem de células brancas abaixo de 4.000 células por milímetro cúbico) ou linfopenia (menos de 1.500 linfócitos por milímetro cúbico) ou trombocitopenia (menos de 100,000 plaquetas por milímetro cúbico). A leucopenia e a linfopenia geralmente devem ser detectadas em duas ou mais ocasiões. A trombocitopenia geralmente deve ser detectada na ausência de fármacos que sabidamente a induzem. A invenção não se limita a esses sinais, sintomas ou outros indicadores de lúpus.
Como aqui usado, o termo tratamento refere-se à intervenção clínica em um a tentativa de alterar a evolução natural do indivíduo ou da célula tratada, e pode ser realizado antes ou durante a evolução da patologia clínica. Efeitos desejáveis do tratamento incluem a prevenção da ocorrência ou recorrência de uma doença ou uma condição, ou sintoma desta, o alívio de uma condição ou sintoma da doença, a diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, a diminuição da taxa de progressão da doença, a melhora ou atenuação do estado de doença e a obtenção de remissão ou prognóstico melhorado. Em algumas modalidades, os métodos e as composições da invenção são úteis em tentativas de retardar o desenvolvimento de uma doença ou um distúrbio.
Uma quantidade eficaz refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e pelos períodos de tempo necessários, para se obter o resultado terapêutico ou profilático desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico pode variar de acordo com fatores como, por exemplo, o estado de doença, a idade, o sexo e o peso do indivíduo, e a habilidade do anticorpo para despertar uma resposta desejada no indivíduo.
Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é aquela na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do agente terapêutico são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma quantidade profilaticamente eficaz refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e pelos períodos de tempo necessários, para se obter o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, já que uma dose profilática é usada nos indivíduos antes ou em um estágio anterior da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
Um indivíduo, pessoa ou paciente é um vertebrado. Em certas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Mamíferos incluem, sem limitação, primatas (incluindo primatas humanos e não humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas modalidades, um mamífero é um ser humano.
O termo subpopulação de pacientes, e variações gramaticais deste, como aqui usado, refere-se a um subconjunto de pacientes caracterizado por terem uma ou mais características mensuráveis e/ou identificáveis distintas que distingue o subconjunto de pacientes de outros na categoria de doença mais ampla à qual pertence. Estas características incluem subcategorias da doença (por exemplo, SLE, nefrite lúpica), sexo, estilo de vida, historia de saúde, órgãos/tecidos envolvidos, história de tratamento etc. Em uma modalidade, uma subpopulação de pacientes é caracterizada por assinaturas genéticas, incluindo variações genéticas em posições e/ou regiões de nucleotídeos em particular (por exemplo, SNPs).
O termo amostra, como aqui usado, refere-se a uma composição que é obtida ou derivada de um indivíduo de interesse que contém uma entidade celular e/ou outra entidade molecular que deve ser caracterizada e/ou identificada, por exemplo, com base em características físicas, bioquímicas, químicas e/ou fisiológicas. Por exemplo, a frase amostra da doença e variações desta refere-se a qualquer amostra obtida de um indivíduo de interesse que suposta ou sabidamente contém a entidade celular e/ou molecular que deve ser caracterizada.
O termo amostra de tecido ou célula significa uma coleção de células similares obtidas de um tecido de um indivíduo ou paciente. A fonte da amostra de tecido ou célula pode ser tecido sólido como, por exemplo, de uma amostra ou biópsia ou aspirado de órgão ou tecido fresco, congelado e/ou preservado; sangue ou quaisquer constituintes do sangue; líquidos corporais, por exemplo, líquido cefalorraquidiano, líquido amniótico, líquido peritoneal ou líquido intersticial; células de qualquer fase da gestação ou do desenvolvimento do indivíduo. A amostra de tecido também pode ser células ou linhagens de células primárias ou cultivadas. Opcionalmente, a amostra de tecido ou célula é obtida de um tecido/órgão doente. A amostra de tecido pode conter compostos que não estão naturalmente misturados com o tecido na natureza como, por exemplo, conservantes, anticoagulantes, tampões, fixadores, nutrientes, antibióticos, ou semelhantes. Os termos amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle, como aqui usados, referemse a uma amostra, célula ou tecido obtido de uma fonte que sabidamente ou supostamente não está afetado pela doença ou condição para a qual um método ou composição da invenção está sendo usado para identificar. Em uma modalidade, a amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle é obtido de uma parte saudável do corpo do mesmo indivíduo ou paciente no qual uma doença ou condição está sendo identificada com o uso de uma composição ou um método da invenção. Em uma modalidade, uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle é obtido de uma parte saudável do corpo de um indivíduo que não é o indivíduo ou paciente no qual uma doença ou condição está sendo identificada com o uso de uma composição ou um método da invenção.
Para os objetivos desse relatório descritivo, um corte de uma amostra de tecido significa uma parte ou pedaço único de uma amostra de tecido, por exemplo, uma fatia fina de tecido ou células cortada de uma amostra de tecido. Entende-se que múltiplos cortes de amostras de tecido podem ser retirados e submetidos à análise de acordo com a presente invenção, desde que seja subentendido que a presente invenção compreende um método pelo qual o mesmo corte de amostra de tecido é analisado no nível tanto morfológico quanto molecular, ou é analisado com relação tanto quanto às proteínas quanto aos ácidos nucléicos.
O termo correlação ou que correlaciona significa a comparação, de qualquer forma, do desempenho e/ou resultados de uma primeira análise ou protocolo com o desempenho e/ou resultados de uma segunda análise ou protocolo. Por exemplo, pode-se usar os resultados de uma primeira análise ou protocolo na realização de um segundo protocolo e/ou pode-se usar os resultados de uma primeira análise ou protocolo para determinar se uma segunda análise ou protocolo deve ser realizado. Com relação à modalidade de análise ou protocolo da expressão gênica, pode-se usar os resultados da análise ou protocolo da expressão gênica para determinar se um regime terapêutico específico deve ser realizado.
A palavra marcador, quando aqui usada, refere-se a um composto ou a uma composição que é conjugada ou fundida direta ou indiretamente a um reagente como, por exemplo, uma sonda de ácido nucléico ou um anticorpo, e facilita a detecção do reagente ao qual está conjugada ou fundida. O próprio marcador pode ser detectável (por exemplo, marcadores de radioisótopo ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável.
Um medicamento é um fármaco ativo para tratar uma doença, distúrbio e/ou condição. Em uma modalidade, a doença, distúrbio e/ou condição é lúpus ou seus sintomas ou efeitos colaterais.
O termo resistência aumentada a um agente terapêutico ou opção de tratamento em particular, quando usado de acordo com a invenção, significa resposta diminuída a uma dose-padrão do fármaco ou a um protocolo de tratamento padronizado.
O termo sensibilidade diminuída a um agente terapêutico ou opção de tratamento em particular, quando usado de acordo com a inven ção, significa uma resposta diminuída a uma dose-padrão do agente ou a um protocolo de tratamento padronizado, em que a resposta diminuída pode ser compensada (pelo menos parcialmente) pelo aumento da dose de agente, ou da intensidade de tratamento.
A resposta do paciente pode ser avaliada com o uso de qualquer ponto final que indique um benefício para o paciente, incluindo, sem limitação, (1) inibição, em algum grau, da progressão da doença, incluindo redução da velocidade e interrupção completa; (2) redução no número de episódios e/ou sintomas da doença; (3) redução do tamanho da lesão; (4) inibição (ou seja, redução, redução da velocidade e interrupção completa) da infiltração de células da doença em órgãos e/ou tecidos periféricos adjacentes; (5) inibição (ou seja, redução, redução da velocidade e interrupção completa) da disseminação da doença; (6) diminuição da resposta autoimune, que pode, mas não necessariamente, resultar na regressão ou remoção da lesão da doença; (7) alívio, em algum grau, de um ou mais sintomas associados ao distúrbio; (8) aumento da duração da apresentação sem doença após tratamento; e/ou (9) diminuição da mortalidade em certo ponto do tempo após o tratamento.
O termo antagonista é usado em seu sentido mais amplo, e inclui qualquer molécula que inibe ou neutraliza parcial ou totalmente uma atividade biológica de um polipeptídeo, por exemplo, PRO, ou que inibe parcial ou totalmente a transcrição ou tradução de um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo. Moléculas antagonistas exemplares incluem, sem limitação, anticorpos, fragmentos de polipeptídeo, oligopeptídeos, moléculas orgânicas (incluindo pequenas moléculas) e ácidos nucléicos antissenso antagonistas.
O termo agonista é usado em seu sentido mais amplo, e inclui qualquer molécula que mimetize parcialmente ou totalmente uma atividade biológica de um polipeptídeo, por exemplo, PRO, ou que aumente a transcrição ou tradução de um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo. Moléculas agonistas exemplares incluem, sem limitação, anticorpos, fragmentos de polipeptídeo, oligopeptídeos, moléculas orgânicas (incluindo pequenas mo léculas), polinucleotídeos associados ao PRO, polipeptídeos de PRO, e fusões PRO-Fc agonistas.
Um agente terapêutico que tem como alvo um PRO ou um polinucleotídeo PRO-associado significa qualquer agente que afete a expressão e/ou atividade de PRO ou um de polinucleotídeo PRO-associado incluindo, sem limitação, qualquer um dos agonistas ou antagonistas de PRO aqui descritos, incluindo os agentes terapêuticos que já são conhecidos na técnica, bem como aqueles que serão desenvolvidos mais tarde.
Um agente terapêutico para o lúpus, um agente terapêutico eficaz para tratar lúpus, e variações gramaticais destes, como aqui usados, referem-se a um agente que, quando fornecido em uma quantidade eficaz, sabidamente fornece, demonstrou clinicamente que fornece ou é esperado pelos médicos que forneça um benefício terapêutico em um indivíduo que possui lúpus. Em uma modalidade, a frase inclui qualquer agente que seja comercializado por um fabricante, ou de algum outro modo usado por médicos credenciados, como um agente clinicamente aceito que, quando fornecido em uma quantidade eficaz, fornecería um efeito terapêutico em um indivíduo que possui lúpus. Em uma modalidade, um agente terapêutico para lúpus compreende um fármaco anti-inflamatório não esteroide (NSAID), que inclui ácido acetilsalicílico (por exemplo, aspirina), ibuprofeno (Motrin), naproxeno (Naprosyn), indometacina (Indocin), nabumetona (Relafen), tolmetin (Tolectin), e quaisquer outras modalidades que compreendam um ingrediente ativo terapeuticamente equivalente e formulação deste. Em uma modalidade, um agente terapêutico para lúpus compreende acetaminofeno (por exemplo, Tylenol), corticosteroides, ou antimaláricos (por exemplo, cloroquina, hidroxicloroquina). Em uma modalidade, um agente terapêutico para lúpus compreende um fármaco imunomodulador (por exemplo, azatioprina, ciclofosfamida, metotrexato, ciclosporina). Em uma modalidade, um agente terapêutico para lúpus é um agente anti-célula B (por exemplo, anti-CD20 (por exemplo, rituximab), anti-CD22), um agente anti-citocina (por exemplo, fator anti-necrose tumoral a, antirreceptor de interleucina-1 (por exemplo, anakinra), anti-interleucina 10, antirreceptor de interleucina 6, anti-interferon alfa, estimulador anti-linfócito B), um inibidor da co-estimulação (por exemplo, anti-CD154, CTLA4-lg (por exemplo, abatacept)), um modulador da anergia de célula B (por exemplo, LW 394 (por exemplo, abetimus)). Em uma modalidade, um agente terapêutico para lúpus compreende tratamento hormonal (por exemplo, DHEA), e terapia anti-hormonal (por exemplo, o agente anti-prolactina bromocriptina). Em uma modalidade, um agente terapêutico para lúpus é um agente que fornece imunoadsorção, é um fator anticomplemento (por exemplo, anti-C5a), vacinação de células T, transfecção de células com cadeia zeta de receptor de célula T, ou terapias peptídicas (por exemplo, edratida que visa idiótipos anti-DNA).
Um agente terapêutico que possua aprovação para comercialização, ou que tenha sido aprovado como agente terapêutico, ou variações gramaticais dessas frases, como aqui usadas, refere-se a um agente (por exemplo, na forma de uma formulação do fármaco, medicamento) que é aprovado, licenciado, registrado ou autorizado por um órgão governamental relevante (por exemplo, órgão, departamento, escritório federal, estadual ou municipal) para ser vendido por uma entidade comercial para o tratamento de um distúrbio em particular (por exemplo, lúpus) ou uma subpopulação de pacientes (por exemplo, pacientes com nefrite lúpica, pacientes de uma etnia, sexo, estilo de vida, perfil de risco para doença em particular etc.). Um órgão governamental relevante inclui, por exemplo, o FDA (Food and Drug Administration, European Medicines Evaluation Agency (EMEA), e equivalentes destas.
Os termos anticorpos (Abs) e imunoglobulinas (Igs) referemse às glicoproteínas que possuem características estruturais similares. Enquanto os anticorpos exibem especificidade de ligação para um antígeno específico, as imunoglobulinas incluem tanto anticorpos quanto outras moléculas semelhantes a anticorpos que geralmente não possuem especificidade de antígeno. Polipeptídeos desse último tipo são produzidos, por exemplo, em níveis baixos pelo sistema linfático e em níveis aumentados por mielomas.
Os termos anticorpo e imunoglobulina são usados de forma intercambiável no sentido mais amplo e incluem anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos monoclonais de comprimento total ou intactos), anticorpos policlonais, anticorpos monovalentes, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, desde que exibam a atividade biológica desejada) e podem também incluir certos fragmentos de anticorpo (como aqui descritos com mais detalhe). Um anticorpo pode ser quimérico, humano, humanizado e/ou amadurecido por afinidade.
O termo anticorpo anti-PRO ou um anticorpo que se liga ao PRO refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar ao PRO com afinidade suficiente, de tal forma que o anticorpo seja útil como um agente diagnóstico e/ou terapêutico tendo como alvo PRO. De preferência, o grau de ligação de um anticorpo anti-PRO a uma proteína não PRO não-relacionada é menos do que cerca de 10% da ligação do anticorpo ao PRO medida, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga ao PRO possui uma constante de dissociação (Kd) de < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, <1 nM ou < 0,1 nM. Em certas modalidades, um anticorpo anti-PRO se liga a um epitopo de PRO que está conservado entre PROs de diferentes espécies.
Os termos anticorpo de comprimento total, anticorpo intacto e anticorpo inteiro são aqui usados de forma intercambiável para se referirem a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, e não a fragmentos de anticorpo como definidos abaixo. Os termos se referem particularmente a um anticorpo com cadeias pesadas que contêm a região Fc.
Fragmentos de anticorpo compreendem uma porção de um anticorpo intacto, de preferência, compreendendo a região de ligação de antígeno deste. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos·, anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticorpo.
A digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, denominados fragmentos Fab, cada um com um único sítio de ligação de antígeno, e um fragmento Fc residual, cujo nome reflete sua habilidade para cristalizar facilmente. O tratamento com pepsina gera um fragmento F(ab')2 que possui dois sítios de combinação de antígeno e ainda é capaz de entrecruzamento com antígeno.
Fv é um fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de ligação de antígeno completo. Em uma modalidade, uma espécie de Fv de duas cadeias consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em íntima associação nãocovalente. Coletivamente, as seis CDRs de um Fv conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, até mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um antígeno) possui a habilidade para reconhecer e se ligar ao antígeno, embora e uma afinidade menor do que o sítio de ligação inteiro.
O fragmento Fab contém os domínios variáveis da cadeia pesada e leve e também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab pela adição de poucos resíduos no terminal carbóxi do domínio CH1 da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui usada para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes abriga um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas de dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo também são conhecidos.
Fv de cadeia única ou fragmentos de anticorpo scFv compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes e uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo scFv ainda compreende um vinculador polipeptídico entre os domínios VH e VL, o que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Para uma revisão sobre scFv, veja Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova York, pp. 269-315 (1994).
O termo diacorpos refere-se aos pequenos fragmentos de anti corpo com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). Utilizando-se um vinculador que seja muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. Diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Diacorpos são descritos mais detalhadamente, por exemplo, em EP 404,097; WO 93/1161; Hudson e outros (2003) Nat. Med. 9:129-134; e Hollinger e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6.444-6.448 (1993). Triabodies e tetrabodies também são descritos em Hudson e outros (2003) Nat. Med. 9: 129-134.
O termo anticorpo monoclonal, como aqui usado, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto quanto a possíveis mutações, por exemplo, mutações de ocorrência natural, que possam estar presentes em quantidades menores. Dessa forma, o modificador monoclonal indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos distintos. Em certas modalidades, um anticorpo monoclonal tipicamente inclui um anticorpo que compreende uma sequência polipeptídica que se liga a um alvo, em que a sequência polipeptídica de ligação-alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma sequência polipeptídica de ligação a um único alvo entre diversas sequências polipeptídicas. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um clone único entre diversos clones, por exemplo, uma coleção de clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinante. Deve-se entender que a sequência de ligação-alvo selecionada pode ainda ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade pelo alvo, para humanizar a sequência de ligação-alvo, para aumentar sua produção em uma cultura de células, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecífico etc., e que um anticorpo que compreende a sequência de ligação-alvo alterada também seja um anticorpo monoclonal dessa invenção. Em contraste com preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante em um antígeno. Além de sua especificidade, as preparações de anticorpo monoclonal são vantajosas pelo fato de tipicamente não serem contaminadas por outras imunoglobulinas.
O modificador monoclonal indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como necessitando da produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por diversas técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler e outros, Nature, 256: 495 (1975); Harlow e outros, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a Edição 1988); Hammerling e outros, em: Monoclonal Antibodies e T- Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (veja, por exemplo, Patente U.S. N° 4.816.567), tecnologias de exibição em fago (veja, por exemplo, Clackson e outros, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks e outros, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu e outros, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee e outros, J. Mol. Biol. 340(5): 1.073-1.093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12.467-12.472 (2004); e Lee e outros, J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004) e tecnologias para a produção de anticorpos humanos ou semelhantes a humanos em animais que possuem partes ou todos os loci da imunoglobulina humana ou genes que codificam sequências de imunoglobulina humana (veja, por exemplo, WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 91/10741; Jakobovits e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2.551 (1993); Jakobovits e outros, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann e outros, Year in Immunol. 7: 33 (1993); Patentes U.S. Nos 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016; Marks e outros, Bio. Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg e outros, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812813 (1994); Fishwild e outros, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) e Lonberg e Huszar, Intern. Rev.
Immunol. 13: 65-93 (1995).
Os anticorpos monoclonais aqui usados especificamente incluem anticorpos quiméricos nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou que pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos destes anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. N° 4.816.567; e Morrison e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6.855-9.855 (1984)).
Formas humanizadas de anticorpos não humanos fpor exemplo, murídeos) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) na qual resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) como, por exemplo, de camundongo, rato, coelho ou primata não humano, que possui a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região framework (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações podem ser feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente tudo de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana, e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana, o anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante (Fc)de imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, veja Jones e outros, Nature
321: 522-525 (1986); Riechmann e outros, Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Veja também os seguintes artigos de revisão e referências neles citadas: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1.035-1.038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994).
Um anticorpo humano é aquele que compreende uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou que foi feito com o uso de qualquer uma das técnicas para a produção de anticorpos humanos, como aqui descrito. Estas técnicas incluem a pesquisa de bibliotecas combinatórias derivadas de seres humanos, por exemplo, bibliotecas de exibição em fago (veja, por exemplo, Marks e outros, J Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) e Hoogenboom e outros, Nucl. Acids Res., 19: 4.133-4.137 (1991)); com o uso de linhagens de células de mieloma humano e de heteromieloma camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (veja, por exemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3.001 (1984); Brodeur e outros, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 55-93 (Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1987); e Boerner e outros, J. Immunol., 147: 86 (1991)); e geração de anticorpos monoclonais em animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes de produzir um repertório inteiro de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena (veja, por exemplo, Jakobovits e outros, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2.551 (1993); Jakobovits e outros, Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann e outros, Year in Immunol., 7: 33 (1993)). Essa definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígeno de um animal não humano.
Um anticorpo amadurecido por afinidade é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs deste que resultam em um aumento da afinidade do anticorpo pelo antígeno, comparado com um anticorpo parente que não possui aquela alteração. Em uma modalidade, um anticorpo amadurecido por afinidade possui afinidades nanomolares ou até mesmo picomolares pelo antígeno-alvo. Anticorpos amadurecidos por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Marks e outros Bio/Technology 10: 779-783 (1992) descrevem a maturação por afinidade por embaralhamento de domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos HVR e/ou framework é descrita por: Barbas e outros Proc. Nat. Acad. Sei. USA 91: 3.809-3.813 (1994); Schier e outros Gene 169: 147-155 (1995); Yelton e outros J. Immunol. 155: 1.994-2.004 (1995); Jackson e outros, J. Immunol. 154(7): 3.310-9 (1995); e Hawkins e outros, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992).
Um anticorpo de bloqueio ou um anticorpo antagonista é aquele que inibe ou reduz uma atividade biológica do antígeno ao qual se liga. Certos anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas inibem parcial ou completamente a atividade biológica do antígeno.
Uma pequena molécula ou pequena molécula orgânica é aqui definida como uma molécula orgânica que possui um peso molecular abaixo de cerca de 500 Dáltons.
Um oligopeptídeo de PRO-ligação ou um oligopeptídeo que se liga ao PRO é um oligopeptídeo que é capaz de se ligar ao PRO com afinidade suficiente para que o oligopeptídeo seja útil como um agente diagnóstico e/ou terapêutico que tem como alvo PRO. Em certas modalidades, o grau da ligação de um oligopeptídeo de PRO-ligação a uma proteína não PRO não-relacionada é menor do que cerca de 10% da ligação do oligopeptídeo de PRO-ligação ao PRO, como medida, por exemplo, por um ensaio de ressonância de plasmônio de superfície. Em certas modalidades, um oligopeptídeo de PRO-ligação possui uma constante de dissociação (Kd) de < 1 μΜ, <100 nM, < 10 nM, <1 nM ou < 0,1 nM.
Uma molécula orgânica de PRO-ligação ou uma molécula orgânica que se liga ao PRO é uma molécula orgânica diferente de um oligopeptídeo ou anticorpo, como aqui definidos, que é capaz de se ligar ao PRO com afinidade suficiente para que a molécula orgânica seja útil como um agente diagnóstico e/ou terapêutico que tem como alvo PRO. Em certas modalidades, o grau da ligação de uma molécula orgânica de ligação ao
PRO a uma proteína não PRO não-relacionada é menor do que cerca de 10% da ligação da molécula orgânica de ligação ao PRO ao PRO, como medido, por exemplo, por um ensaio de ressonância de plasmônio de superfície. Em certas modalidades, uma molécula orgânica de ligação ao PRO 5 possui uma constante de dissociação (Kd) de < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM ou < 0,1 nM.
A constante de dissociação (Kd) de qualquer molécula que se liga a um polipeptídeo-alvo pode ser medida convenientemente com o uso de um ensaio de ressonância de plasmônio de superfície. Estes ensaios po10 dem empregar um BIAcore®-2000 ou um BIAcore®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C com chips CM5 de polipeptídeo-alvo imobilizado a aproximadamente 10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, chips biossensores de dextrana carboximetilada (CM5, BIAcore Inc.) são ativados com cloridrato de /V-etil-/V'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e Λ/15 hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fabricante. O polipeptídeo-alvo é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, até 5 pg/ml (aproximadamente 0,21 μΜ), antes da injeção em uma taxa de fluxo de 5 μΙ/minuto para obter aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de polipeptídeo-alvo, 1 M de etanolamina 20 é injetado pra bloquear grupos não-reagidos. Para medidas cinéticas, diluições seriais de duas vezes da molécula de ligação (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com Tween 20 0,05% (PBST) a 25°C em uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 μΙ/min. As taxas de associação (kon) e as taxas de dissociação (kOff) são calculadas usando um modelo de ligação de Lang25 muir simples um para um (Software de Avaliação BIAcore versão 3.2) por ajuste simultâneo dos sensogramas de associação e de dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como a proporção koff/kon. Veja, por exemplo, Chen, Y., e outros, (1999) J. Mol. Biol. 293: 865881. Caso a taxa de associação de um anticorpo exceda 106 M‘1 s’1 pelo en30 saio de ressonância de plásmon de superfície acima, então a taxa de associação poderá ser determinada usando uma técnica de extinção fluorescência que mede o aumento ou a diminuição da intensidade de emissão de fluo rescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de bande de 16 nm de band-pass') a 25°C de um anticorpo de 20 nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno medidas em um espectrômetro como, por exemplo, um espectrofotômetro equipado com parada de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLMAminco série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta agitada.
Um lipossomo é uma pequena vesícula composta por vários tipos de lipídios, fosfolipídeos e/ou tensoativos que é útil para a liberação de um agente, por exemplo, um fármaco, a um mamífero. Os componentes do lipossomo estão comumente dispostos em uma formação em bicamadas, similar ao arranjo lipídico de membranas biológicas.
A palavra marcador, quando aqui usada, refere-se e um composto ou composição detectável. O marcador pode ser detectável por si próprio (por exemplo, marcadores de radioisótopo ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição do substrato, o que resulta em um produto detectável. Radionuclídeos que podem servir como marcadores detectáveis incluem, por exemplo, 1-131, 1-123, 1-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu67, Bi-212 e Pd-109.
Uma molécula biológica isolada, por exemplo, um ácido nucléico, polipeptídeo ou anticorpo, é aquela que foi identificada e separada e/ou recuperada de pelo menos um componente de seu ambiente natural.
Referência a cerca de um valor ou parâmetro, inclui aqui (e descreve) modalidades que são dirigidas àquele valor ou parâmetro por si. Por exemplo, a descrição que se refere a cerca de X inclui a descrição de X.
Entende-se que aspecto e modalidades da invenção aqui descrita incluem que consiste e/ou que consiste basicamente em aspectos e modalidades.
II. TÉCNICAS GERAIS PARA REALIZAR AS COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DA INVENÇÃO
São aqui fornecidas variações de nucleotídeos associadas ao lúpus. Essas variações fornecem biomarcadores para o lúpus e/ou predispõem ou contribuem para o desenvolvimento, persistência e/ou progressão de lúpus. Consequentemente, a invenção aqui descrita é útil em vários cenários, por exemplo, em métodos e composições relacionadas ao diagnóstico e terapia de lúpus.
Detecção de variações genéticas
O ácido nucléico, de acordo com qualquer um dos métodos acima, pode ser DNA genômico; RNA transcrito a partir de DNA genômico; ou cDNA gerado a partir de RNA. O ácido nucléico pode ser derivado de um vertebrado, por exemplo, um mamífero. Um ácido nucléico é dito como sendo derivado de uma fonte em particular caso seja obtido diretamente daquela fonte ou caso seja uma cópia de um ácido nucléico encontrado naquela fonte.
Ácido nucléico inclui cópias do ácido nucléico, por exemplo, cópias que resultam de amplificação. A amplificação pode ser desejável em certos casos, por exemplo, a fim de obter uma quantidade desejada de material para a detecção de variações. Por exemplo, um polinucleotídeo PROassociado ou porção deste pode ser amplificado a partir de material de ácido nucléico. Os amplicons podem então ser submetidos a um método de detecção de variação, tais como aqueles descritos abaixo, para determinar se uma variação está presente no amplicon.
Variações podem ser detectadas por certos métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, esses métodos incluem, sem limitação, sequenciamento de DNA; ensaios de extensão de iniciador, incluindo ensaios de incorporação de nucleotídeo alelo-específico e ensaios de extensão de iniciador alelo-específico (por exemplo, PCR alelo-específica, reação em cadeia de ligação (LCR) alelo-específica, e gap-LCR); ensaios de hibridização de oligonucleotídeo alelo-específico (por exemplo, ensaios de ligação de oligonucleotídeo); ensaios de proteção de divagem nos quais a proteção de agentes de divagem é usada para detectar bases não combinadas em duplexes de ácido nucléico; análise de ligação da proteína MutS; análise eletroforética que compara a mobilidade da variante e moléculas de ácido nucléico do tipo selvagem; eletroforese em gel por gradiente de desnaturação (DGGE, como, por exemplo, em Myers e outros (1985) Nature 313: 495); análise de divagem de RNase em pares de bases não combinados; análise de divagem química ou enzimática de DNA heteroduplexos; espectrometria de massa (por exemplo, MALDI-TOF); análise bit genética (GBA); ensaios de 5’ nuclease (por exemplo, TagMan®); e ensaios que empregam sinalizadores moleculares. Alguns desses métodos serão discutidos com mais detalhes abaixo.
A detecção de variações em ácidos nucléicos-alvo pode ser obtida por clonagem molecular e sequenciamento dos ácidos nucléicos-alvo com o uso de metodologias bem conhecidas na técnica. Alternativamente, técnicas de amplificação como, por exemplo, a reação em cadeia de polimerase (PCR), podem ser usadas para amplificar sequências de ácidos nucléicos-alvo diretamente de uma preparação de DNA genômico de tecido tumoral. A sequência de ácidos nucléicos das sequências amplificadas pode então ser determinada e as variações nela presentes identificadas. Metodologias de amplificação são bem conhecidas na técnica, por exemplo, a reação em cadeia de polimerase é descrita em Saiki e outros, Science 239: 487, 1988; Patentes U.S. Nos 4.683.203 e 4.683.195.
A reação em cadeia de ligase, que é conhecida na técnica, também pode ser usada para amplificar sequências de ácidos nucléicos-alvo. Veja, por exemplo, Wu e outros, Genomics 4: 560-569 (1989). Além disso, uma técnica conhecida como PCR alelo-específica também pode ser usada para detectar variações (por exemplo, substituições). Veja, por exemplo, Ruano e Kidd (1989) Nucleic Acids Research 17: 8.392; McClay e outros (2002) Analytical Biochem. 301: 200-206. Em certas modalidades dessa técnica, é usado um iniciador alelo-específico em que o nucleotídeo do terminal 3' do iniciador é complementar a (ou seja, capaz de efetuar pareamento de bases especificamente com) uma variação em particular no ácido nucléico-alvo. Se a variação em particular não estiver presente, não será observado um produto de amplificação. O sistema de amplificação refratária de mutações (ARMS) também pode ser usado para detectar variações (por exemplo, substituições). ARMS é descrito, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente Européia N° 0332435, e em Newton e outros, Nucleic Acids Research, 17: 7, 1989.
Outros métodos úteis para a detecção de variações (por exemplo, substituições) incluem, sem limitação, (1) ensaios de incorporação de nucleotídeo alelo-específico, por exemplo, ensaios de extensão de base única (veja, por exemplo, Chen e outros (2000) Genome Res. 10: 549-557; Fan e outros (2000) Genome Res. 10: 853-860; Pastinen e outros (1997) Genome Res. 7: 606-614; e Ye e outros (2001) Hum. Mut. 17: 305-316); (2) ensaios de extensão de iniciador alelo-específico (veja, por exemplo, Ye e outros (2001) Hum. Mut. 17: 305-316; e Shen e outros Genetic Engineering News, vol. 23, 15 de março de 2003), incluindo PGR alelo-especifica; (3) ensaios de 5' nuclease (veja, por exemplo, De La Vega e outros (2002) BioTechniques 32: S48-S54 (que descreve o ensaio TaqMan®); Ranade e outros (2001) Genome Res. 11: 1.262-1.268; e Shi (2001) Clin. Chem. 47: 164172); (4) ensaios que empregam sinalizadores moleculares (veja, por exemplo, Tyagi e outros (1998) Nature Biotech. 16: 49-53; e Mhlanga e outros (2001) Methods 25: 463-71); e (5) ensaios de ligação de oligonucleotídeo (veja, por exemplo, Grossman e outros (1994) Nuc. Acids Res. 22: 4.5274.534; Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2003/0119004 A1; Publicação Internacional PCT N° WO 01/92579 A2; e Patente U.S. N° 6.027.889).
Variações também podem ser detectadas por métodos de detecção de não coincidências (mismatch). Não combinações são dúplices hibridizados de ácido nucléico que não são 100% complementares. A ausência de complementaridade total pode ser causada por eliminações, inserções, inversões ou substituições. Um exemplo de um método de detecção de não coincidência é o ensaio de Detecção de Reparo de Não Combinação (MRD) descrito, por exemplo, em Faham e outros, Proc. Natl Acad. Sei. USA 102: 14.717-14.722 (2005) e Faham e outros, Hum. Mol. Genet. 10: 1.6571.664 (2001). Outro exemplo de uma técnica de divagem de não coincidência é o método de proteção de RNase, que é descrito em detalhes em Winter e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 7.575, 1985, e Myers e outros, Sei ence 230: 1.242, 1985. Por exemplo, um método da invenção pode envolver o uso uma ribossonda (ribo-probe) marcada que é complementar ao ácido nucléico-alvo humano do tipo selvagem. A ribossonda e o ácido nucléicoalvo derivados da amostra de tecido são anelados (hibridizados) juntos e subsequentemente digeridos com a enzima RNase A, que é capaz de detectar algumas não coincidências em uma estrutura de duplexo de RNA. Caso uma não coincidência seja detectada por RNase A, ela cliva o sítio da não coincidência. Dessa forma, quando a preparação de RNA anelado é separada em uma matriz de gel de eletroforese, caso uma não coincidência tenha sido detectada e clivada por RNase A, será observado um produto de RNA que é menor do que o RNA duplex de comprimento total para a ribossonda e o mRNA ou DNA. A ribossonda não precisa ter o comprimento total do ácido nucléico-alvo, mas pode ser uma porção do ácido nucléico-alvo, desde que englobe a posição suspeita de ter uma variação.
De forma similar, sondas de DNA podem ser usadas para detectar não coincidências, por exemplo, por meio de divagem enzimática ou química. Veja, por exemplo, Cotton e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 4.397, 1988; e Shenk e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72: 989, 1975. Alternativamente, não coincidências podem ser detectadas por mudanças na mobilidade eletroforética de duplexes não combinados em relação aos duplexes combinados. Veja, por exemplo, Cariello, Human Genetics, 42: 726, 1988. Com ribossondas ou com sondas de DNA, a ácido nucléico-alvo suspeito de compreender uma variação pode ser amplificado antes da hibridização. Alterações no ácido nucléico-alvo também podem ser detectadas com o uso de hibridização Southern, especialmente se as alterações são rearranjos grosseiros, por exemplo, eliminações e inserções.
Sondas de polimorfismo por restrição do comprimento de fragmento (RFLP) para o ácido nucléico-alvo ou genes marcadores circundantes podem ser usadas para detectar variações, por exemplo, inserções ou eliminações. Inserções e eliminações também podem ser detectadas por clonagem, sequenciamento e amplificação de um ácido nucléico-alvo. A análise de polimorfismo de conformação de fitas simples (SSCP) também pode ser usada para detectar variantes de alteração de base de um alelo. Veja, por exemplo, Orita e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2.766-2.770, 1989, e Genomics, 5: 874-879, 1989.
Composições da invenção
A invenção fornece composições de polinucleotídeos isolados que compreendem um polinucleotídeo ou fragmento deste que compreende um SNP. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é um polinucleotídeo PROassociado.
Em particular, a invenção fornece composições que compreendem conjuntos e/ou combinações de SNPs únicas que podem ser usadas como um perfil genético ou uma assinatura indicativa de um indivíduo em risco para o desenvolvimento de lúpus, ou indicativa da doença ou sintoma ou condição deste. Os polimorfismos aqui descritos são úteis como biomarcadores para avaliação do risco de desenvolvimento de lúpus, bem como para alvos para o projeto de reagentes diagnósticos. Em algumas modalidades, o SNP não está associado a um gene. Em outras modalidades, o SNP está associado a um gene, e pode estar localizado em uma região intergênica ou intragênica e, mais particularmente, pode estar localizado em uma região codificadora ou não-codificadora. Os genes associados a um SNP da presente invenção podem estar associados a um gene desconhecido, ou podem estar associados a um gene conhecido, por exemplo, ITGAM ou BLK.
Os SNPs aqui identificados fornecem alvos para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para uso no diagnóstico e tratamento de pacientes com lúpus geneticamente identificados, incluindo o diagnóstico e tratamento dirigido de subpopulações de pacientes com lúpus que exibem uma assinatura genética distinta que compreende um ou mais dos SNPs da presente invenção. Por exemplo, em uma modalidade, os genes que contêm as variações genéticas aqui identificadas, e o ácido nucléico (por exemplo, DNA ou RNA) associado a esses genes, e proteínas codificadas por esses genes, podem ser usados como alvos para o desenvolvimento de agentes terapêuticos (por exemplo, compostos de pequena molécula, anticorpos, agentes antissenso/RNAi etc.) ou usados diretamente como agentes terapêuticos (por exemplo, proteínas terapêuticas etc.) para o tratamento de lúpus.
Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece um conjunto de um ou mais SNPs que formam uma assinatura genética única para avaliação do risco de desenvolvimento de lúpus. Em um aspecto, a assinatura genética única compreende cerca de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40 ou 40-50 SNPs selecionados de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10.
Em um aspecto, a assinatura genética única compreende 1 ou mais SNPs, 3 ou mais SNPs, 3 ou mais SNPs, 4 ou mais SNPs, 5 ou mais SNPs, 6 ou mais SNPs, 7 ou mais SNPs, 8 ou mais SNPs, 9 ou mais SNPs, 10 ou mais SNPs, 11 ou mais SNPs, 12 ou mais SNPs, 13 ou mais SNPs, 14 ou mais SNPs, 15 ou mais SNPs, 16 ou mais SNPs, 17 ou mais SNPs, 18 ou mais SNPs, 19 ou mais SNPs, ou 20 ou mais SNPs selecionados de qualquer um dos SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em um aspecto, os SNPs da assinatura genética são selecionados da Tabela 6. Em outro aspecto, os SNPs são selecionados do grupo que consiste em rs9888739, rs13277113, rs7574865, rs2269368, rs6889239, rs2391592 e rs21177770. Em outro aspecto, os SNPs são selecionados do grupo que consiste em rs2187668, rs10488631, rs7574865, rs9888739, rs13277113, rs2431697, rs6568431, rs10489265, rs2476601, rs2269368, rs1801274, rs4963128, rs5754217, rs6445975, rs3129860, rs10516487, rs6889239, rs2391592 e rs2177770.
Em outra modalidade, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado (por exemplo, DNA ou RNA) ou fragmento deste que possui pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento, em que o polinucleotídeo ou fragmento deste compreende: a) uma variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um daqueles SNPs apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10, ou (b) o complemento de (a). Em uma modalidade, o polinucleotídeo isolado é um DNA genômico que compreende um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um daqueles SNPs apresentados em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em outra modalidade, o polinucleotídeo isolado é um RNA que compreende um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) selecionado de qualquer um daqueles apresentados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10.
Em uma modalidade da invenção, a variação genética na região acima do sítio de iniciação da transcrição de tirosina quinase linfoide B(BLK) e C8orf13 (cromossomo 8p23.1) está associada ao risco de doença nas séries de casos/controle dos E.U.A. e da Suécia (rs13277113, OR = 1,39, meta P = 1 x 10’10), e também aos níveis alterados de mRNA em linhagens de células B. Em outra modalidade, as variantes na região de integrina alfa M (ITGAM) e integrina alfa X (ITGAX) (cromossomo 16p11.2) estão associadas ao SLE na amostra combinada (rs11574637, OR = 1,33, meta P = 3 x 1041). Em uma varredura de associação abrangente de todo o genoma no SLE, os presentes inventores identificaram e depois confirmaram por meio de replicação dois novos loci genéticos: a) um alelo da região promotora que se correlaciona com expressão reduzida de BLK e expressão aumentada de C8orf13 e b) SNPs (ou variantes) dentro da região ITGAM/ITGAX que estão em forte desequilíbrio de ligação com dois alelos comuns não sinônimos de ITGAM.
Em uma modalidade, o polinucleotídeo ou fragmento deste possui pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 15 nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 40 nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, alternativa mente pelo menos cerca de 60 nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 80 nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 90 nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 110 nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 120 nu cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo cleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 130 numenos cerca de 140 numenos cerca de 150 numenos cerca de 160 numenos cerca de 170 numenos cerca de 180 numenos cerca de 190 numenos cerca de 200 numenos cerca de 250 numenos cerca de 300 numenos cerca de 350 numenos cerca de 400 numenos cerca de 450 numenos cerca de 500 numenos cerca de 600 numenos cerca de 700 numenos cerca de 800 numenos cerca de 900 nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 1.000 nucleotídeos de comprimento e, alternativamente, aproximadamente o comprimento da sequência codificadora de comprimento total. Em qualquer uma dessas modalidades, o fragmento ou polinucleotídeo de comprimento total também pode incluir parte ou toda a região de flanqueamento de ocorrência natural de um SNP. Nesse contexto, o termo cerca de significa o comprimento da sequência de nucleotídeos citada mais ou menos 10% daquele comprimento citado.
Em outra modalidade, a sequência do polinucleotídeo compreende uma variação genética dentro de uma região de desequilíbrio de ligação, por exemplo, como apresentada em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene. Em outra modalidade, é fornecido o complemento de qualquer um dos polinucleotídeos acima. Em outra modalidade, é fornecido um PRO codificado por qualquer um dos polinucleotídeos acima.
Em uma modalidade, um polinucleotídeo isolado aqui fornecido é marcado de forma detectável, por exemplo, com um radioisótopo, um agente fluorescente ou um agente cromogênico. Em outra modalidade, um polinucleotídeo isolado é um iniciador. Em outra modalidade, um polinucleotídeo isolado é um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo aleloespecífico. Em outra modalidade, um oligonucleotídeo pode ter, por exemplo, de 7-60 nucleotídeos de comprimento, 9-45 nucleotídeos de comprimento, 15-30 nucleotídeos de comprimento ou 18-25 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade, um oligonucleotídeo pode ser, por exemplo, PNA, morfolino-fosforamidatos, LNA, ou 2'-alcoxialcóxi. Os oligonucleotídeos aqui fornecidos são úteis, por exemplo, como sondas de hibridização para a detecção de variações genéticas.
Em uma modalidade, a invenção fornece uma composição que compreende diversos polinucleotídeos capazes de hibridizar especificamente para pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 polinucleotídeos associados ao PRO, cada polinucleotídeo PRO-associado compreendendo uma variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10, ou complementos destes polinucleotídeos associados ao PRO. Em uma modalidade, os polinucleotídeos são fornecidos como um arranjo, chip gênico ou conjunto de genes (por exemplo, um conjunto de genes ou fragmentos destes, fornecidos separadamente ou como uma mistura). Em outra modalidade, é fornecido um oligonucleotídeo alelo-específico que hibridiza para uma região de um polinucleotídeo PRO-associado que compreende uma variação genética (por exemplo, uma substituição). Em uma modalidade, a variação genética está em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade desse tipo, a variação genética compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. O oligonucleotídeo alelo-específico, quando hibridizado para a região do polinucleotídeo PROassociado, compreende um nucleotídeo que efetua pareamento de bases 5 com a variação genética. Em outra modalidade, é fornecido o complemento de um oligonucleotídeo alelo-específico. Em outra modalidade, é fornecido um microarranjo que compreende um oligonucleotídeo alelo-específico ou seu complemento. Em outra modalidade, um oligonucleotídeo aleloespecífico ou seu complemento é um iniciador alelo-específico. Em uma 10 modalidade, o oligonucleotídeo alelo-específico compreende uma variação genética em uma sequência do polinucleotídeo PRO-associado, em que o polinucleotídeo PRO-associado codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modali15 dade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas ΙΙΟ. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do ge20 ne. Em outra modalidade, é fornecido o complemento de qualquer um dos polinucleotídeos acima.
Um oligonucleotídeo alelo-específico pode ser usado em conjunto com um oligonucleotídeo de controle que é idêntico ao oligonucleotídeo alelo-específico, exceto que o nucleotídeo que efetua pareamento de bases 25 especificamente com a variação genética está substituído com um nucleotídeo que efetua pareamento de bases especificamente com o nucleotídeo correspondente presente no polinucleotídeo PRO-associado do tipo selvagem. Estes oligonucleotídeos podem ser usados em ensaios ligação competitiva sob condições de hibridização que permitem que os oligonucleotídeos 30 façam a distinção entre um polinucleotídeo PRO-associado que compreende uma variação genética e um polinucleotídeo PRO-associado que compreende o do tipo selvagem nucleotídeo correspondente.
Com o uso de métodos de rotina baseados, por exemplo, no comprimento e composição de bases dos oligonucleotídeos, aqueles versados na técnica podem chegar às condições de hibridização adequadas sob as quais (a) um oligonucleotídeo alelo-específico irá preferentemente se ligar a um polinucleotídeo PRO-associado que compreende uma variação genética em relação a um polinucleotídeo PRO-associado do tipo selvagem, e (b) o oligonucleotídeo de controle irá preferentemente se ligar a um polinucleotídeo PRO-associado do tipo selvagem em relação a um polinucleotídeo PRO-associado que compreende uma variação genética. Condições exemplares incluem condições de alta estringência, por exemplo, condições de hibridização de 5 x solução salina fosfato EDTA padrão (SSPE) e NaDodSO4 0,5% (SDS) a 55°C, seguida por lavagem com 2 X SSPE e SDS 0,1% a 55°C ou temperatura ambiente. Em outra modalidade, é fornecido um agente de ligação que se liga preferentemente a um PRO que compreende uma variação de aminoácido, em relação a um PRO do tipo selvagem. Em uma modalidade, a variação de aminoácido é qualquer resultante de uma variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10 (incluindo, por exemplo, qualquer SNP específico em qualquer uma dessas Figuras ou Tabelas). Em outra modalidade, o agente de ligação é um anticorpo. Métodos de uso
A invenção também fornece diversas composições adequadas ao uso na realização dos métodos da invenção. Em uma modalidade, a invenção compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico útil para a detecção de uma ou mais variações genéticas, como descritas nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Uma molécula de ácido nucléico desse tipo pode ser usada nos métodos da presente invenção, por exemplo, para a detecção de, ensaio para, e tratamento de lúpus. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico é anexada a um substrato sólido, como aqui descrito.
Em outra modalidade, a invenção fornece arranjos que podem ser usados nos métodos da presente invenção. Em uma modalidade, um arranjo da invenção compreende moléculas individuais ou coleções de mo léculas de ácido nucléico úteis para a detecção de uma ou mais variações genéticas. Por exemplo, um arranjo da invenção pode compreender uma série de oligonucleotídeos alelo-específicos individuais colocados separadamente ou conjuntos de oligonucleotídeos alelo-específicos. Várias meto5 dologias são bem conhecidas na técnica para a adesão de ácidos nucléicos a um substrato sólido como, por exemplo, uma lâmina de vidro. Método é a incorporação de bases ou análogos modificados que contêm uma porção reativa que é capaz de adesão a um substrato sólido, por exemplo, um grupo amina, um derivado de um grupo amina, ou outro grupo com uma carga 10 positiva, em moléculas de ácido nucléico que são sintetizadas. O sintetizado é então contatado com um substrato sólido, por exemplo, uma lâmina de vidro, revestido com um aldeído ou outro grupo reativo. O aldeído ou outro grupo reativo formará uma ligação covalente com a porção reativa no produto amplificado, que se tornará anexado covalentemente à lâmina de vidro.
Outros métodos, tais como aqueles que utilizam química de superfície amino propril silican, também são conhecidos na técnica.
Uma amostra biológica, de acordo com qualquer um dos métodos acima, pode ser obtida usando certos métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Amostras biológicas podem ser obtidas de animais ver20 tebrados e em particular, mamíferos. Biópsias de tecido são frequentemente usadas para se obter um pedaço representativo de tecido tumoral. Alternativamente, células tumorais podem ser obtidas indiretamente na forma de tecidos ou líquidos que sabidamente ou supostamente contêm as células tumorais de interesse. Por exemplo, amostras de lesões de câncer de pulmão 25 podem ser obtidas por ressecção, broncoscopia, aspiração com agulha fina, escovações brônquicas ou de escarro, líquido pleural ou sangue. Variações em ácidos nucléicos-alvo (ou polipeptídeos codificados) podem ser detectadas de uma amostra de tumor ou de outras amostras corporais como, por exemplo, urina, escarro ou soro (as células cancerosas se desprendem de 30 tumores e aparecem nessas amostras corporais). Analisando-se essas amostras corporais, pode ser obtido um diagnóstico precoce simples para doenças como, por exemplo, o câncer. Além disso, o progresso da terapia po de ser monitorado mais facilmente testando-se essas amostras corporais quanto às variações em ácidos nucléicos-alvo (ou polipeptídeos codificados). Adicionalmente, são conhecidos na técnica métodos para o enriquecimento de uma preparação de tecido quanto às células tumorais. Por exemplo, o tecido pode ser isolado de cortes de parafina ou criostato. As células cancerosas também podem ser separadas de células normais por citometria de fluxo ou microdissecção por captura a laser.
Subsequente à determinação de que um indivíduo, ou de que a amostra de tecido ou célula compreende uma variação genética aqui descrita, contempla-se que uma quantidade eficaz de um agente terapêutico para lúpus apropriado pode ser administrada ao indivíduo para tratar a condição de lúpus no indivíduo. O diagnóstico em mamíferos das várias condições patológicas aqui descritas pode ser feito por aqueles versados na técnica. Estão disponíveis na técnica metodologias diagnosticas que permitem, por exemplo, o diagnóstico ou a detecção de lúpus em um mamífero.
Um agente terapêutico para lúpus pode ser administrado de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa como um bolo ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo, por vias intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinhal, subcutânea, intra- articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica ou por inalação. Opcionalmente, a administração pode ser realizada por meio de infusão com minibomba usando vários dispositivos comercialmente disponíveis.
Dosagens e posologias eficazes para a administração de agentes terapêuticos para lúpus podem ser determinadas empiricamente, e estas determinações fazem parte dos ensinamentos da técnica. Podem ser empregadas dosagens únicas ou múltiplas. Por exemplo, uma dosagem ou quantidade eficaz de inibidor de interferon usada isoladamente pode variar de cerca de 1 mg/kg até cerca de 100 mg/kg de peso corporal ou mais por dia. O escalonamento de dosagens interespécies pode ser realizado de uma forma conhecida na técnica, por exemplo, como descrito em Mordenti e outros, Pharmaceut. Res., 8: 1.351 (1991).
Quando é empregada a administração in vivo de um agente te rapêutico para lúpus, as quantidades normais de dosagem podem variar de cerca de 10 ng/kg até 100 mg/kg de peso corporal do mamífero ou mais por dia, de preferência, cerca de 1 pg/kg/dia até 10 mg/kg/dia, dependendo da via de administração. Diretrizes sobre dosagens e métodos de liberação específicos são fornecidas na literatura; veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 4.657.760, 5.206.344 ou 5.225.212. Antecipa-se que diferentes formulações serão eficazes para diferentes compostos de tratamento e diferentes distúrbios, e que a administração dirigida a um órgão ou tecido, por exemplo, pode necessitar de liberação de uma forma diferente daquela para outro órgão ou tecido.
Contempla-se ainda que podem ser empregadas terapias adicionais nos métodos. Essas outras terapias podem incluir, sem limitação, a administração de esteroides e de outros regimes de tratamento padronizados para o distúrbio em questão. Contempla-se que estas outras terapias podem ser empregadas como um agente separado de, por exemplo, um agente terapêutico dirigido ao lúpus.
A invenção também fornece métodos de detecção da presença de lúpus por detecção de uma variação em um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado derivado de uma amostra biológica. Em uma modalidade, a amostra biológica é obtida de um mamífero suspeito de ter lúpus.
A invenção também fornece métodos de determinação do genótipo de uma amostra biológica detectando-se se uma variação genética está presente em um polinucleotídeo PRO-associado derivado da amostra biológica. Em uma modalidade, a variação genética está em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade desse tipo, a variação genética compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em outra modalidade, o polinucleotídeo PROassociado codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene. Em outra modalidade, a amostra biológica sabidamente compreende, ou é suspeita de compreender, um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado que compreende a variação. Em outra modalidade, a amostra biológica é uma linhagem de células, por exemplo, uma linhagem de células primárias ou imortalizadas. Em uma modalidade desse tipo, a genotipagem fornece uma base para a classificação ou subclassificação da doença.
A invenção também fornece métodos de identificação de células em uma amostra biológica de um mamífero que sabidamente compreendem, ou suspeitas de compreender, um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado que compreende uma variação, por detecção da variação em um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado derivado das células da amostra biológica. Em uma modalidade, a variação é uma variação genética. Em uma modalidade, a variação genética está em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 117 e Tabelas 110. Em uma modalidade desse tipo, a variação genética compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em outra modalidade, o polinucleotídeo PRO-associado codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene.
A invenção também fornece métodos de diagnóstico de lúpus em um mamífero por detecção da presença de uma variação em um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado derivado de uma amostra biológica obtida do mamífero, em que a amostra biológica sabidamente compreende, ou é suspeita de compreender, um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado que compreende a variação. A invenção também fornece métodos para auxiliar no diagnóstico de lúpus em um mamífero por detecção da presença de uma variação em um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado derivado de uma amostra biológica obtida do mamífero, em que a amostra biológica sabidamente compreende, ou é suspeita de compreender, um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado que compreende a variação. Em uma modalidade, a variação é uma variação genética. Em uma modalidade, a variação genética está em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade desse tipo, a variação genética compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em outra modalidade, o polinucleotídeo PRO-associado codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene.
Vários algoritmos conhecidos na técnica e aqui descritos podem ser usados para avaliação do risco de desenvolvimento de lúpus e da resposta à terapia. As variantes associadas a um fenótipo podem interagir de uma forma aditiva, alélica dose-dependente. Em algumas modalidades da invenção, um algoritmo baseado em um esquema de estratificação pode ser usados para avaliar o risco de desenvolvimento de lúpus, a gravidade da doença e a resposta à terapia. Os casos de lúpus podem ser estratificados em grupos baseados no número de alelos de risco carregados. Em uma modalidade, o alelo de risco é definido como o alelo enriquecido em casos de lúpus em relação aos controles dos loci. Por exemplo, em uma modalidade, quando um total de 19 alelos de 18 loci são listados, então o número máximo possível de alelos de risco será igual a 38. Como aqui descrito, os casos de lúpus estratificados pelo número de alelos de risco e tereis da distribuição resultante podem ser determinados. Os tereis de casos de lúpus podem então ser examinados quanto às diferenças na gravidade da doença, risco e resposta à terapia. Em outra modalidade, é fornecido um método para prever se um indivíduo com lúpus responderá a um agente terapêutico que tem como alvo um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado determinando se o indivíduo apresenta uma variação em um polinucleotídeo PRO ou PROassociado, em que a presença de uma variação em um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado indica que o indivíduo irá responder ao agente terapêutico. Em uma modalidade, a variação é uma variação genética. Em uma modalidade, a variação genética está em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em uma tal modalidade, a variação genética compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em outra modalidade, o polinucleotídeo PRO-associado codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene.
A invenção também engloba métodos de detecção da ausência ou presença em um indivíduo, ou amostra dele obtida, de uma variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10: (a) pelo contato do ácido nucléico no indivíduo ou amostra com qualquer um dos polinucleotídeos descritos acima sob condições adequadas à formação de um complexo de hibridização entre o ácido nucléico e o polinucleotídeo; e (b) detectando-se se o polinucleotídeo efetua pareamento de bases especificamente com o ácido nucléico na posição de nucleotídeo. Em uma modalidade, a variação genética está em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 15 17 e Tabelas 1-10. Em uma tal modalidade, a variação genética compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o polinucleotídeo PRO-associado codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 10 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região 15 codificadora do gene.
A invenção também fornece métodos de detecção da ausência ou presença de uma variação genética em um ácido nucléico associado a um PRO: (a) pelo contato do ácido nucléico com um oligonucleotídeo aleloespecífico que é específico para a variação genética sob condições adequa20 das à hibridização do oligonucleotídeo alelo-específico para o ácido nucléico; e (b) detecção da ausência ou presença de hibridização alelo-específica. Em uma modalidade, a variação genética está em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma tal modalidade, a variação genética 25 compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o polinucleotídeo PRO-associado codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA 30 genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene. Em outra modalidade, um oligonucleotídeo alelo-específico é um iniciador alelo-específico.
A invenção também fornece métodos para avaliar a predisposição de um indivíduo ao desenvolvimento de lúpus por detecção da presença ou ausência no indivíduo de uma variação em um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado, em que a presença de uma variação em um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado indica que o indivíduo está predisposto ao desenvolvimento de lúpus. Em uma modalidade, a variação é uma variação genética. Em uma modalidade, a variação genética está em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em uma modalidade desse tipo, a variação genética compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em outra modalidade, o polinucleotídeo PROassociado codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene.
A invenção também fornece métodos de subclassificação de lúpus em um mamífero, o método compreendendo a detecção da presença de uma variação em um polinucleotídeo PRO-associado em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10 em uma amostra biológica derivada do mamífero, em que a amostra biológica sabidamente compreende, ou é suspeita de compreender, um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado que compreende a variação. Em uma modalidade, a variação é uma variação genética. Em uma modalidade, a variação compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Ta belas 1-10. Em uma modalidade, o polinucleotídeo PRO-associado codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene. Em uma modalidade, a subclassificação é caracterizada por envolvimento de tecido/órgão (por exemplo, nefrite lúpica), sexo e/ou etnia.
Em uma modalidade dos métodos de detecção da invenção, a detecção compreende a realização de um processo selecionado de um ensaio de extensão de iniciador; um ensaio de extensão de iniciador aleloespecífico; um ensaio de incorporação de nucleotídeo alelo-específico; um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo alelo-específico; um ensaio de 5’ nuclease; um ensaio que emprega sinalizadores moleculares; e um ensaio de ligação de oligonucleotídeo.
A invenção também fornece métodos de identificação de um agente terapêutico eficaz para tratar lúpus em uma subpopulação de pacientes, o método compreendendo a correlação da eficácia do agente com a presença de uma variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) na subpopulação de pacientes, em que o SNP é um daqueles listados nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10 identificando, dessa forma, o agente como eficaz para tratar lúpus na referida subpopulação de pacientes. Em uma modalidade, a variação genética está em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade desse tipo, a variação genética compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o polinucleotídeo PRO-associado codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de liga ção (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 117 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região nãocodificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene.
Os métodos da invenção fornecem informações úteis para a determinação de etapas apropriadas de intervenção clínica, se e quando adequado. Portanto, em uma modalidade de um método da invenção, o método ainda compreende uma etapa de intervenção clínica baseadas nos resultados da avaliação da presença ou ausência de uma variação em um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado, como aqui descrito. Por exemplo, a intervenção adequada pode envolver etapas profiláticas e de tratamento, ou ajusteis) de quaisquer etapas profiláticas ou de tratamento atuais, com base em informações genéticas obtidas por um método da invenção.
Como seria evidente para aqueles versados na técnica, em qualquer método da invenção, embora a detecção de presença de uma variação indicaria positivamente uma característica de uma doença (por exemplo, presença ou subtipo de uma doença), a não-detecção de uma variação também seria informativa por fornecimento da caracterização recíproca da doença.
A invenção também fornece métodos de amplificação de um ácido nucléico que compreende um polinucleotídeo PRO-associado ou fragmento deste, em que o polinucleotídeo PRO-associado ou fragmento deste compreende uma variação genética. Em uma modalidade, o método compreende (a) o contato do ácido nucléico com um iniciador que hibridiza para uma sequência 5' ou 3' da variação genética, e (b) a extensão do iniciador para gerar um produto de amplificação que compreenda variação genética. Em uma modalidade, o método ainda compreende o contato do produto de amplificação com um segundo iniciador que hibridiza para uma sequência 5' ou 3' da variação genética, e a extensão do segundo iniciador para gerar um segundo produto de amplificação. Em uma modalidade desse tipo, o método ainda compreende a amplificação do produto de amplificação e segundo produto de amplificação, por exemplo, por reação em cadeia de polimerase.
Em algumas modalidades, a variação genética está em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um SNP da presente invenção. Em uma modalidade desse tipo, a variação genética compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o polinucleotídeo PRO-associado codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene.
Métodos adicionais da invenção incluem métodos de tratamento de lúpus em um mamífero, que compreende as etapas de obtenção de tecido ou uma amostra de células do mamífero, o exame do tecido ou das células quanto à presença ou ausência de uma variação como aqui descrita e, mediante a determinação da presença ou ausência da variação na referida amostra de tecido ou célula, a administração de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico apropriado ao referido mamífero. Opcionalmente, os métodos compreendem a administração de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico dirigido ao lúpus e, opcionalmente, um segundo agente terapêutico (por exemplo, esteroides etc.) ao referido mamífero.
Em uma modalidade, é fornecido um método de tratamento de lúpus, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um antagonista ou agonista de PRO. Em uma modalidade, o indivíduo exibe variação em um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado. Em uma modalidade, a variação é uma variação genética. Em uma modalidade, a variação genética está em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade desse tipo, a variação genética compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o polinucleotídeo PRO-associado codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene.
A invenção também fornece métodos de tratamento de uma condição de lúpus em um indivíduo no qual uma variação genética está sabidamente presente em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) listado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um agente terapêutico eficaz para tratar a condição. Em uma modalidade, a variação compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, a variação é um SNP em um polinucleotídeo PRO-associado que codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 110. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene.
A invenção também fornece métodos de tratamento de um indivíduo que possui uma condição de lúpus, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um agente terapêutico que sabidamente é eficaz para tratar a condição em um indivíduo que possui uma variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) listado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em uma modalidade, a variação compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabeles 1-10. Em uma modalidade, a variação é um SNP em um polinucleotídeo PRO-associado que codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região nãocodificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene.
A invenção também fornece métodos de tratamento de um indivíduo que possui uma condição de lúpus, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um agente terapêutico que demonstrou previamente ser eficaz para tratar a referida condição em pelo menos um estudo clínico em que o agente foi administrado a pelo menos cinco indivíduos humanos 20 que tinham uma variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) listado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em uma modalidade, a variação compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, a variação é um SNP em um polinucleotídeo PRO25 associado que codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas 7 c belas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apre30 sentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene. Em uma modalida de, os (pelo menos) cinco indivíduos tinham dois ou mais SNPs diferentes no total para o grupo de pelo menos cinco indivíduos. Em uma modalidade, os (pelo menos) cinco indivíduos tinham o mesmo SNP para todo o grupo de pelo menos cinco indivíduos.
A invenção também fornece métodos de tratamento de um indivíduo com lúpus que é de uma subpopulação específica de pacientes com lúpus que compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico que é aprovado como um agente terapêutico para a referida subpopulação, em que a subpopulação é caracterizada, pelo menos em parte, por associação com variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um SNP listado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 110. Em uma modalidade, a variação compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, a variação é um SNP em um polinucleotídeo PRO-associado que codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene. Em uma modalidade, a subpopulação é de ascendência européia. Em uma modalidade, a invenção fornece um método que compreende a fabricação de um agente terapêutico para lúpus, e a embalagem do agente com instruções sobre como administrar o agente a um indivíduo que possui, ou que supostamente possui, lúpus, e que possui uma variação genética em uma posição que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) listado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10. Em uma modalidade, a variação compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, a variação é um SNP em um polinucleotídeo PRO-associado que codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene.
A invenção também fornece métodos de especificação de um agente terapêutico para uso em uma subpopulação de pacientes com lúpus, o método compreendendo o fornecimento de instruções para administrar o agente terapêutico a uma subpopulação de pacientes caracterizada por uma variação genética em uma posição que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) listado na Figura 5-10. Em uma modalidade, a variação compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, a variação é um SNP em um polinucleotídeo PRO-associado que codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas ΙΙΟ. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene. Em uma modalidade, a subpopulação é de ascendência européia.
A invenção também fornece métodos para a comercialização de um agente terapêutico para uso em uma subpopulação de pacientes com lúpus, o método compreendendo a informação a uma audiência-alvo sobre o uso do agente terapêutico para o tratamento da subpopulação de pacientes caracterizada pela presença, em pacientes desta subpopulação, de uma variação genética em uma posição que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) listado na Figura 5-10. Em uma modalidade, a variação compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e
Tabelas 1-10. Em uma modalidade, a variação é um SNP em um polinucleotídeo PRO-associado que codifica um PRO que é codificado por uma sequência dentro de uma região de desequilíbrio de ligação (por exemplo, como apresentado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10). Em uma modalidade, a variação genética está no DNA genômico que codifica um gene (ou sua região reguladora), em que o gene (ou sua região reguladora) compreende um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10. Em uma modalidade, o SNP está em uma região não-codificadora do gene. Em uma modalidade, o SNP está em uma região codificadora do gene. Em uma modalidade de qualquer um dos métodos acima que compreendem o uso de um agente terapêutico, esse agente compreende um agente terapêutico para lúpus, como aqui descrito.
A invenção também fornece métodos para a modulação da sinalização por meio do receptor de célula B em um indivíduo no qual uma variação genética está sabidamente presente em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) listado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um agente terapêutico eficaz para modular a sinalização por meio do receptor de célula B.
A invenção também fornece métodos para a modulação da diferenciação de células Th17 em um indivíduo no qual uma variação genética está sabidamente presente em uma posição de nucleotídeo que corresponde a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) listado nas Figuras 1-17 e nas Tabelas 1-10, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um agente terapêutico eficaz para modular a diferenciação de células Th17.
Kits
Em uma modalidade da invenção, são fornecidos kits. Em uma modalidade, um kit compreende qualquer um dos polinucleotídeos aqui descritos, opcionalmente com uma enzima. Em uma modalidade, a enzima é pelo menos uma enzima selecionada de uma nuclease, uma ligase e uma polimerase.
Em uma modalidade, a invenção fornece um kit que compreende uma composição da invenção, e instruções da utilização da composição para detectar lúpus determinando se o genoma de um indivíduo compreende uma variação genética aqui descrita. Em uma modalidade, a composição da invenção compreende diversos polinucleotídeos capazes de hibridizar especificamente para pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 polinucleotídeos associados ao PRO, cada polinucleotídeo PRO-associado compreendendo uma variação genética em uma posição de nucleotídeo que corresponde à posição de um SNP apresentado em qualquer uma das Figuras 1-17 e Tabelas 1-10, ou complementos destes polinucleotídeos associados ao PRO. Em uma modalidade, a composição da invenção compreende polinucleotídeos que codificam pelo menos uma porção de um PRO. Em uma modalidade, a composição da invenção compreende iniciadores de ácido nucléico capazes de se ligar a e efetuar polimerização (por exemplo, amplificação) de pelo menos uma porção de um polinucleotídeo PRO-associado. Em uma modalidade, a composição da invenção compreende um agente de ligação (por exemplo, iniciador, sonda) que detecta especificamente um polinucleotídeo PROassociado (ou complemento deste) (ou produto gênico correspondente). Em uma modalidade, a composição da invenção compreende um agente de ligação que se liga especificamente a pelo menos uma porção de um PRO. Em uma modalidade, a invenção fornece um artigo fabricado que compreende um agente terapêutico, combinado com instruções sobre a utilização do agente para tratar um paciente com lúpus que possui uma variação em um polinucleotídeo PRO-associado, como aqui descrito.
Para uso nas aplicações descritas ou sugeridas acima, também são fornecidos kits ou artigos fabricados pela invenção. Estes kits podem compreender um meio de transporte que é compartimentalizado para receber em confinamento fechado um ou mais recipientes como, por exemplo, frascos, tubos, e semelhantes, cada um dos recipientes compreendendo um dos elementos separados para ser usado no método. Por exemplo, um dos recipientes pode compreender uma sonda que é ou pode ser marcada de forma detectável. Esta sonda pode ser um polinucleotídeo específico para um polinucleotídeo PRO-associado. Quando o kit utiliza hibridização de ácido nucléico para detectar o ácido nucléico-alvo, o kit também pode ter recipientes que contêm nucleotídeo(s) para amplificação da sequência de ácidos nucléicos-alvo e/ou um recipiente que compreende um meio repórter, por exemplo, uma proteína de ligação de biotina, por exemplo, avidina ou estreptavidina, ligado a uma molécula repórter como, por exemplo, um marcador enzimático, florescente ou de radioisótopo.
O kit da invenção tipicamente compreenderá o recipiente descrito acima e um ou mais outros recipientes que compreendem materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringa e bulas com instruções para uso. UM rótulo pode estar presente no recipiente para indicar que a composição é usada para uma terapia específica ou aplicação não terapêutica, e também pode indicar instruções para o uso in vivo ou in vitro, tais como aqueles descritos acima.
Os kits da invenção possuem diversas modalidades. Uma modalidade típica é um kit que compreende um recipiente, um rótulo no referido recipiente, e uma composição contida dentro do referido recipiente; em que a composição inclui um agente de detecção para um polinucleotídeo PRO ou PRO-associado, o rótulo no referido recipiente indicando que a composição pode ser usada para avaliar a presença do polinucleotídeo PRO ou PROassociado em pelo menos um tipo de célula de mamífero, e instruções para a utilização do agente de detecção para avaliação da presença do polinucleotídeo PRO ou PRO-associado em pelo menos um tipo de célula de mamífero. O kit pode ainda compreender um conjunto de instruções e materiais para a preparação de uma amostra de tecido e aplicação de anticorpo e sonda no mesmo corte de uma amostra de tecido. Por exemplo, um kit pode compreender um recipiente, um rótulo no referido recipiente e uma composição contida no referido recipiente; em que a composição inclui um polinucleotídeo que hibridiza para um complemento de um polinucleotídeo PROassociado sob condições estringentes, o rótulo no referido recipiente indicando que a composição pode ser usada para avaliar a presença de um polinucleotídeo PRO-associado em pelo menos um tipo de célula de mamífero, e instruções para utilização do polinucleotídeo para avaliação da presença de RNA ou DNA PRO-associado em pelo menos um tipo de célula de mamífero.
Outros componentes opcionais no kit incluem um ou mais tampões (por exemplo, tampão de bloqueio, tampão de lavagem, tampão de substrato etc.), outros reagentes como, por exemplo, substrato (por exemplo, cromógeno) que seja quimicamente alterado por um marcador enzimático, solução de recuperação de epitopo, amostras de controle (controles positivos e/ou negativos), lâmina(s) de controle (s) etc.
Métodos de comercialização
A invenção aqui descrita também engloba um método para a comercialização de um agente terapêutico para lúpus ou de uma composição farmaceuticamente aceitável deste, que compreende a promoção para, instrução e/ou especificação para uma audiência-alvo, do uso do agente ou composição farmacêutica deste para o tratamento de um paciente ou população de pacientes com lúpus, do qual uma amostra foi obtida, que mostra a presença de uma variação genética, como aqui descrita.
A promoção comercial geralmente é uma comunicação paga por meio de um meio não pessoal no qual o patrocinador é identificado e a mensagem é controlada. Promoção comercial, para os objetivos desse relatório descritivo, inclui publicidade, relações públicas, colocação do produto, patrocínios, financiamentos e promoção de vendas. Esse termo também inclui notícias de informações públicas patrocinadas que aparecem em qualquer um dos meios de comunicação impressos destinados a uma audiência de massa para persuadir, informar, promover, motivar ou de algum modo modificar o comportamento em direção a um padrão favorável à compra, apoio ou aprovação da invenção aqui apresentada.
A promoção comercial do método diagnóstico aqui apresentado pode ser obtida por qualquer meio. Exemplos de meios de promoção comercial usados para divulgar essas mensagens incluem televisão, rádio, filmes, revistas, jornais, a Internet e propagandas, incluindo comerciais, que são mensagens divulgadas em meios de comunicação por radiodifusão.
O tipo de promoção comercial usado dependerá de muitos fatores, por exemplo, da natureza da audiência-alvo a ser atingida, por exemplo, hospitais, empresas de seguro, clínicas, médicos, enfermeiras e pacientes, bem como considerações quanto aos custos e às leis regulamentadoras relevantes que governam a comercialização de medicamentos e produtos diagnósticos. A promoção comercial pode ser individualizada ou personalizada com base em caracterizações de usuários definidas por interação de serviços e/ou outros dados, tais como dados demográficos e localização geográfica.
A seguir serão apresentados exemplos dos métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras modalidades podem ser praticadas, considerando a descrição geral fornecida acima.
EXEMPLOS
As informações bibliográficas para as referências citadas (e representadas por números) nos Exemplos 1-3 são fornecidas ao final do Exemplo 3. As informações bibliográficas para as referências citadas (e representadas por números) nos Exemplos 4-6 são fornecidas ao final do Exemplo 6.
Exemplo 1 Materiais e métodos para uma varredura de associação ampla do genoma no lúpus eritematoso sistêmico
Esse Exemplo descreve materiais e métodos utilizados para realizar uma varredura ampla do genoma para SLE em uma grande amostra que compreende 1.311 casos de SLE e 3.340 controles. Das mais de 500.000 variantes, que capturaram variações comuns em aproximadamente 85% do genoma humano, 24 foram genotipadas e testadas quanto a uma associação ao SLE.
Indivíduos
Amostras de casos de SLE foram genotipadas a partir das seguintes coleções: a) 338 indivíduos do Autoimmune Biomarkers Collaborative Network (ABCoN), um repositório fundado pelo NIH/NIAMS, 25 b) 141 indivíduos do Multiple Autoimmune Disease Genetics Consortium (MADGC), 26 c) 613 indivíduos do University of California San Francisco (UCSF) Lupus Genetics Project 10,27 e d) 335 indivíduos do University of Pittsburgh Medical Center (UPMC) 28 mais 8 amostras coletadas no The Feinstein Institute for Medical Research. Todos os casos de SLE eram de indivíduos que se autodefiniram como caucasianos. O diagnóstico de SLE (cumprimento de quatro ou mais dos critérios definidos pelo American College of Rheumatology (ACR)29) foi confirmado em todos os casos por revisão do prontuário médico (94%) ou por meio de documentação escrita de critérios por reumatologistas assistentes (6%). Os dados clínicos foram revisados e tabulados em cada instituição. A Figura 4 mostra as contagens e percentagens para cada um dos onze critérios de classificação do ACR para SLE.29
Um total de 3583 amostras de controle foi examinado nas análises de associação. Como parte desse projeto, 1861 amostras de controle foram selecionadas e depois genotipadas pela coleção do Nova York Cancer Project (NYCP) 30, com base em etnia auto-informada, sexo e idade. Além disso, dados de genótipo de 1722 amostras de controle de indivíduos auto-descritos como caucasianos foram obtidos da base de dados disponível publicamente iControlDB <www.illumina.com/paqes.ilmn?ID=231>.
Para replicação, amostras de DNA de uma coleção independente de 793 pacientes suecos com SLE (todos atendiam a quatro ou mais dos critérios de classificação para SLE definidos pela ACR) e 857 indivíduos de controle suecos saudáveis, foram genotipadas. Os pacientes eram de clínicas de reumatologia nos Hospitais Universitários de Lund, Uppsala, Karolinska (Solna) e Umea. 7 Os Institutional Review Boards de todas essas instituições colaboradoras aprovaram esses estudos, e todos os participantes deram autorização informada.
Genotipagem
Amostras de controle do NYCP (N = 1861) foram genotipadas no Illumina HumanHap550 Genotyping BeadChip 31 no Feinstein Institute. 1465 amostras (464 casos, 1001 controles) foram genotipadas no chip HumanHap550v1 e 1875 amostras (1015 casos, 860 controles) foram genotipadas no chip HumanHap550v3. Os dados de genótipo de 1452 dessas amostras de controle foram submetidos ao iControlDB e tomados publicamente disponíveis antes da publicação. Um conjunto adicional, independente, de 1722 amostras de caucasianos genotipado usando o BeadChip HumanHap550 foi obtido dos Estudos 66 e 67 do iControlDB <www.illumina.com/paqes.ilmn?ID=231>. As amostras dos casos foram genotipadas no Feinstein Institute em fases seriais; a Série 1 consistiu nos 479 casos de ABCoN e MADGC, a Série 2 incluía os 613 casos de UCSF e a Série 3 era composta por 387 casos de UPMC e do Feinstein Institute. Os 545.080 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) presentes em ambas as versões de HumanHap550 prosseguiram na análise. Amostras de casos e de controle com taxas de chamada médias < 80% através do chip foram re-genotipadas.
Na coleção de replicação sueca, os SNPs rs 11574637 e rs 13277113 foram genotipados usando ensaios homogêneos de extensão de iniciador de base única com detecção de polarização de fluorescência na Plataforma de Tecnologia de SNP em Uppsala <www.genotvping.se> e reagentes de Perkin-Elmer. 32 A taxa de chamada de genótipo nas amostras foi de 96% e a reprodutibilidade foi de 100% de acordo com ensaios em duplicata de 4,6% dos genótipos. Um pedigree CEPH de três gerações com 20 membros foi genotipado em paralelo com as amostras de estudo, e nenhum desvio da hereditariedade mendeliana foi observado para qualquer um dos SNPs.
Filtros da qualidade dos dados
Amostras com uma taxa de chamada média de < 95% (N = 42) ou quando o sexo relatado do indivíduo era discordante do sexo observado (N = 21) foram excluídas da análise. A identidade por estado (IBS) através do genoma foi estimada para cada amostra, e as amostras foram examinadas quanto à relação críptica. Uma amostra de cada par estimada como sendo duplicata ou parentes de 1°-3° grau foi removida (Pi_hat > 0,10 e Z1 > 0,15, N = 161). Três desses pares eram compostos tanto por um caso quanto por um controle; o controle foi removido. SNPs com uma frequência em casos de < 1% (N = 21.644) ou um HWE P < 1 x 10 6 em controles (N = 2.819) foram removidos da análise. SNPs com omissão > 5% (N = 6.074) foram removidos. SNPs foram testados quanto à probabilidade de uma diferença significante em omissão entre casos e controles; SNPs com P < 1 x 10'5 (N = 7.646) foram removidos. SNPs também foram testados quanto aos efeitos de batelada: por exemplo, entre amostras de ABCoN e todos os outros casos; SNPs com P < 1 x 10’9 (N=13) foram removidos.
Valores singulares da população foram detectados usando EIGENSTRAT 33. As amostras com mais de 6 desvios-padrão da média ao longo dos 10 componentes principais foram excluídas da análise (N = 141). Os dados das 3.340 amostras de controle restantes foram distribuídos aleatoriamente a cada série de casos de SLE proporcionalmente, resultando em uma proporção controle:caso de aproximadamente 2.5 (Tabela 1).
A Série 1 consistiu em 411 casos e 1.047 controles, Série 2 era composta por 595 casos e 1.516 controles e a Série 3 era composta por 305 casos e 777 controles. No geral, 93% dos casos eram mulheres e 62% dos controles eram mulheres. Não foram observadas diferenças significantes nas frequências de alelos entre homens e mulheres.
SNPs com > 2% de dados ausentes em pelo menos uma série e em que os dados ausentes eram distribuídos desigualmente entre casos e controles (omissão diferencial, P < 1 x 10’3) foram removidos (N = 3.323). SNPs na região pseudo-autossômica do cromossomo X (N=13) não mostraram associação significante e foram excluídos de análise posterior. As filtragens da amostra e de marcador foram realizadas usando módulos analíticos dentro do programa de computador PLINK 34. Para cada série, um total de 502.033 SNPs avançou para as análises seguintes.
Análise de dados
A associação de todos os SNPs à suscetibilidade ao SLE foi calculada usando tabelas de contingência 2x2. Um fator de inflação de controle genômico (Xgc) foi então calculado para cada série de amostras.35 O fator de inflação de controle genômico é uma métrica com base no qui-quadrado mediano que reflete se o maior volume da distribuição está de acordo com a hipótese nula (Àgc = 1,0). Um valor de Xgc > 1 indica uma elevação da estatística da associação do qui-quadrado médio em função de artefatos técnicos sistêmicos ou da presença de estratificação da população. Após remoção de dados de baixa qualidade para minimizar artefatos técnicos, foram observadas evidências de inflação para cada série: 1,14, 1,18 e 1,11, respectivamente, para as Séries 1, 2 e 3. Para corrigir a presença de estratificação da população, os componentes principais para cada série foram calculados com o uso de um subconjunto de SNPs em EIGENSTRAT. SNPs com MAF do caso < 2% (5.011), HWE do controle P < 1 x 10'4 (1.792), ou dados ausentes > 1% (50.414) foram removidos, assim como o foram SNPs em regiões de padrões de LD anormais em função de variação estrutural nos cromossomos 6 (de 24-36 Mb), 8 (8-12 Mb), 11 (42-58 Mb) e 17 (40-43 Mb). Os 440.202 SNPs restantes foram usados para calcular os componentes principais. Em cada série, os 4 primeiros componentes principais foram usados para ajustar a estatística de associação para todos os 502.033 SNPs. Após ajuste quanto à estratificação da população, o 7gc para cada série se aproximou de 1,0 (veja a Tabela 1). A estatística de associação corrigida para cada série foi combinada pela mescla ponderada do escore Z que incorpora Xgc (Figura 12). Os 50 loci principais são mostrados na Figura 5. Adicionalmente, a estatística para todos os SNPs que passam por filtros de QC de cada série e as estatísticas de associação combinadas foram resumidas em uma tabela (não mostrada).
Para testar a heterogeneidade entre os três estudos de casocontrole para as variantes mais associadas, o teste de Breslow-Day implementado em PLINK foi executado para o SNP com a melhor associação em cada uma dessas regiões: HLA DRB, STAT4, IRF5, BLK e ITGAM/ITGAX. Não foi detectada heterogeneidade significante (cada P > 0,2).
As associações entre SNPs individuais e subfenótipos foram calculadas para o conjunto de dados combinados (Figura 9), usando o teste de heterogeneidade de Mantel-Haenszel e razão de chances combinada implementados em Stata 9.2 (www.stata.com/). Os valores P calculados não foram ajustados para testes múltiplos, já que os critérios da ACR sabidamente estão correlacionados e provavelmente uma correção de Bonferroni simples de α = 0,05/11 = 0,0045 seria muito conservadora.
Análise da expressão oênica
Medidas da expressão gênica linhagens de células B transformadas com vírus de Epstein-Barr de 210 indivíduos HapMap saudáveis, não-relacionados, de um conjunto de dados disponível publicamente (projeto GENEVAR, www.sanger.ac.uk/humgen/genevar/) foram examinados quanto a uma correlação com variantes significativamente associadas com SLE. 36 Especificamente, foi examinada a intensidade de fluorescência mediana de 4 medidas de sondas para BLK (Gl 33469981-S), C8orf13 (Gl 32698772-S), ITGAM (GI_6006013-S), ITGAX (Gl_34452172-S), ACTB (beta-actina, Gl 5016088-S), e GAPDH (Gl 7669491-S) de 60 residentes americanos com ascendência do norte e oeste da Europa (CEU), 60 iorubas (YRI), 45 indivíduos chineses da etnia Han de Pequim (CHB) e 45 indivíduos japoneses de Tóquio (JPT). Os dados de expressão para BLK, C8orf13, GAPDH e ACTB foram estratificados por genótipo rs 13277113 (obtido do HapMap (www.hapmap.org)), e a significância da expressão diferencial foi medida por um teste T de 2 caudas, presumindo uma variância igual. Similarmente, os dados de expressão para ITGAM, ITGAX, GAPDH e ACTB foram estratificados por genótipo em rs 11574637 e testados quanto à significância usando um teste T. Os dados de expressão normalizados em uma escala através das populações HapMap, como descrito pelo projeto GENEVAR, geraram resultados similares para a intensidade de fluorescência mediana.
A associação da expressão de BLK e C8orf13 com variação genética cis em um conjunto independente de 400 células B transformadas por EBV foi obtida pelo exame e coleta de dados de um estudo publicado recentemente (www.sph.umich.edu/csg/liang/asthma/). 37 Especificamente, a associação de um representante de rs13277113 (rs4840568) com os níveis de expressão de BLK (sonda 206255_at) e C8orf13 (sonda 226614_s_at) foi medida como descrito por Dixon e outros 37
Exemplo 2 Identificação de C8orf13/BLK e ITGAM/ITGAX como novos loci de suscetibilidade
Análise de associação de todo o genoma
Um total de 502.033 SNPs polimórficos nos chips de Illumina passou por filtros de qualidade controle e e foi testado quanto à associação ao SLE de forma estagiada usando 3 séries de caso-controle (Tabela 1). Uma estatística combinada de associação foi calculada por adição dos escores Z convertidos da estatística por qui-quadrado do teste de EIGENSTRAT corrigido, ponderada para tamanho de série e ajustada para o 7gc residual de cada série veja Métodos).
Uma comparação dos valores P da meta-análise observados em relação aos valores P para uma distribuição nula é mostrada na Figura 1. Foi observado um desvio significante da distribuição nula na cauda da distribuição (Figura 1A, diamantes pretos), o que indica a presença de associações positivas verdadeiras. Uma forte associação ao SLE foi observada para três loci de risco estabelecidos. Na região da HLA Classe II, rs2187668, está um previsor quase perfeito do DRB1*0301 alelo 38,e foi a variante mais fortemente associada ao SLE na análise combinada (P = 3 x 10'21). Um adicional de 157 SNPs da região HLA, muitos dos quais estavam correlacionados ao alelo DRB1*0301, teve valores P observados de menos de 5 x 10‘7 (Figura 1B). Foi observada uma forte associação com variantes ligadas ao haplótipo de risco bem validado do Fator Regulador de Interferon 5 (IRF5) (por exemplo, rs10488631, P = 2 x 10’11).7-9 Além disso, foi observada uma associação com STAT4 (rs7574865, P = 9 x 10'14). Uma associação de tanto SLE quanto com artrite reumatoide foi relatada recentemente.10 O conjunto de dados de SLE aqui se sobrepôs com àquele do relato anterior 10, e inclui um adicional de 341 casos e 2.905 controles que não foram incluídos na análise prévia. Além disso, os valores P para os principais SNPs de STAT4 aqui relatados foram corrigidos para a estratificação da população.
Após remoção de variantes em HLA, IRF5 e STAT4 do qui esperado vs. análise observada, o desvio de valores P da distribuição nula não foi eliminado (Figura 1A, círculos), o que sugere a presença de loci de SLE adicionais. Como mostrado na Figura 1B, múltiplos SNPs próximos ao gene de tirosina quinase linfoide B (BLK) e em uma região que contém os genes de integrina alfa M (ITGAM) e integrina alfa X (ITGAX) estavam altamente associados ao SLE na análise combinada. Nenhum desses genes ou regiões foi implicado previamente na suscetibilidade ao SLE. 5/-K/C8orf13
Diversas variantes no braço curto do cromossomo 8 (8p23.1) foram associadas ao SLE (Figura 2, Tabela 2, Figura 8). O alelo A de rs13277113 estava altamente enriquecido nos casos dos U.S. de SLE em relação aos controles (P = 8 x 10'8, OR combinado = 1.39, 95% C.I. = 1,261,54). Para confirmar essa observação inicial, uma coleção independente de 793 casos de SLE e 857 controles compatíveis da Suécia foi tipada para rs13277113, e também foi observada uma associação convincente do alelo A menos ao SLE (P = 3,6 x 10'4, OR = 1,33, 95% C.l. = 1,13-1,55; Tabela 2). Uma meta-análise de rs13277113 usando tanto as amostras dos U.S. quanto as da Suécia mostrou um P = 1,4 x 1010, o que ultrapassa o rigoroso limiar de significância de todo o genoma da associação P < 5 x 10’8. 39 rs13277113 está mapeado no intervalo entre dois genes transcritos em direções opostas: BLK— uma tirosina quinase da família src que sinaliza abaixo do receptor de célula B, e C8orf13 — um gene expresso ubiquitariamente de função desconhecida (Figura 2). Nenhuma variante da região codificadora de BLK ou C8orf13 conhecida está em desequilíbrio de ligação (LD) com rs13277113.
A variação genética comum demonstrou estar correlacionada com os níveis de expressão gênica cis. 81 36, 37, 40 Para determinar se os SNPs promotores associados podem influenciar a expressão de mRNA de BLK e/ou C8orf13, um conjunto de dados de expressão gênica gerado por linhagens de células de linfócitos B transformadas com o vírus de EpsteinBarr das 210 amostras de HapMap não-relacionadas foi pesquisado.36 Curiosamente, o alelo de risco A de rs13277113 estava associado a níveis menores de expressão de mRNA de BLK (Figura 2B). Homozigotos para o alelo A mostraram níveis de expressão aproximadamente 50% menores do que homozigotos para o alelo G, e os heterozigotos A/G tinham níveis intermediários. Curiosamente, a expressão do gene de C8orf13 também estava correlacionada com o haplótipo de risco, mas na direção oposta. O alelo A de rs13277113 estava associado a uma expressão de C8orf13 maior nas linha gens transformadas, enquanto o alelo G estava significativamente associado à expressão menor (Figura 2C). Novamente, heterozigotos A/G mostraram níveis intermediários de expressão. A expressão de diversos mRNAs de controle (por exemplo, beta-actina, GAPDH) não variou nas linhagens de células com base em genótipo em rs13277113 (Figura 6), e diferenças alélicas consistentes na expressão de BLK foram observadas em todas as populações HapMap (Figura 7). Esses resultados foram confirmados por análise de um conjunto independente de dados da expressão gênica e SNPs de todo o genoma em 400 linhagens de células B transformadas não HapMap. 37 Nesses conjunto de dados, um marcador correlacionado ao rs13277113 (rs4840568, r2 = 0,77) foi associado tanto à expressão diminuída de BLK (P = 8,9 x IO’27, sonda 206255_at) quanto à expressão aumentada de C8orf13 (P = 4,6 x 10'35, sonda 226614_s_at).
Múltiplos sítios de ligação conservados de fator de transcrição, incluindo motivos para IRF1, PPARG e um elemento de resposta estimulada por interferon, estão localizados na região 5' de BLK e C8orf13. No entanto, nem rs13277113 nem variantes correlacionadas (r2 > 0,5) alterou sítios de ligação conhecidos de fator de transcrição ou outros motivos funcionais de ácido nucléico conhecidos. Foi concluído que rs13277113, ou uma variação fortemente associada ao rs13277113, altera o nível de expressão de mRNA de BLK e C8orf13.
ITGAM/ITGAX
Variantes dentro de um cluster de genes da cadeia de alfa integrina no cromossomo 16 também foram associadas significativamente ao SLE (Figura 3, Tabela 2). A associação reprodutível do alelo C de rs11574637 foi observada através da 3 séries de SLE (P = 5 x 10-7, OR = 1,30, 95% C.I. = 1,17-1,45). Significativamente, o alelo C de rs11574637 mostrou um forte enriquecimento similar à série de replicação da Suécia (P = 4 x 10’7, OR = 1,59, 95% C.l. = 1,33-1.91; Tabela 2), e a meta-análise mostrou um P = 3 x 1011 combinado. Concluímos que a variação ligada ao rs11574637 marca um alelo de risco para SLE confirmado, e que o lócus ITGAM/ITGAX contribui para a patogênese do SLE.
rs11574637 é parte de um grande bloco de SNPs correlacionados que cobrem aproximadamente 150 kb de vários genes codificadores, incluindo ITGAM e a porção 5' de ITGAX (Figura 3A). Tanto ITGAM quanto ITGAX são expressos em níveis detectáveis em células B transformadas com EBV, no entanto, rs11574637 não apresentou uma correlação significativa com níveis de expressão de mRNA de nenhum desses genes (dados não mostrados). De interesse potencial, SNP rs11574637 está correlacionado com 2 variantes de ITGAM não sinônimas. Na população de controle, uma variante Pro1146Ser (rs1143678, P = 2,5 x 105) foi correlacionada com um r2 de 0,85 com a variante associada à doença rs11574637. O alelo C rs1143678 e o alelo 1146Ser formam um haplótipo em 18,2% dos cromossomos de controle; o alelo C também está presente em um haplótipo separado de 2% desprovido do alelo 1146Ser. Um Segundo alelo não sinônimo (rs1143683, Ala858Val) não foi genotipado diretamente no presente estudo, mas está altamente correlacionado com Pro1146Ser (r2 = 0,85 em HapMap CEU). Serão necessários estudos adicionais para determinar se as variantes não sinônimas de ITGAM ou alelo(s) adicional (adicionais) estão subjacentes à associação dentro da região ITGAM/ITGAX.
Associações com características clínicas de SLE
Finalmente, foram examinadas as associações entre os dois SNPs principais, rs11574637 (BLK) e rs13277113 (ITGAM), e a presença de critérios da ACR individuais, usando a séries de casos combinados 1-3 (Figura 9, e veja Métodos). A associação mais forte foi um relacionamento inverso entre o alelo menor rs11574637 e a presença de artrite, OR = 0,73 (Cl de 95% = 0,59-0,91, P = 0,0045). Ambas as variantes foram associadas modestamente aos critérios hematológicos: rs11574637, OR = 1,21 (Cl de 95% = 1,00-1,47, P = 0,04) e rs13277113, OR = 1,23 (Cl de 95% = 1,03-1,46, P = 0,02). Não foram observadas outras associações significantes.
Discussão
O presente esforço descreve os resultados de um estudo abrangente da associação de todo o genoma ao SLE. Pelo estudo de um grande número de casos de SLE — 1.311 — e um grupo ainda maior de controles — 3.340, foram detectados os alelos principais que contribuem para o risco ao SLE. Os sinais mais fortes observados na região HLA, IRF5 e STAT4 serviram como controles positivos para o experimento, e confirmaram que esses loci estão entre os fatores genéticos mais importantes nessa doença.
A tirosina quinase da família src BLK é um novo gene candidato interessante para o SLE. A expressão de BLK é altamente restrita à linhagem de linfócitos B. 41 A expressão de Blk no camundongo é observada inicialmente em pró-células B em ciclagem tardia, continua por todo o desenvolvimento da célula B, e é subsequentemente infra-regulada na células B 10 plasmática.42 Um camundongo knockout para Blk não possui fenótipo grosseiro 43, e estudos funcionais em células B humanas ainda não foram realizados. Sem se prender a uma teoria, BLK é uma das tirosina quinases que transduz sinais abaixo do receptor de célula B, e talvez tenha um papel re•7 dundante no camundongo, considerando a ausência de um fenótipo nos t -15 knockouts. Esse é um precedente para diferenças importantes entre espécies no papel de quinases associadas ao receptor de célula B. Por exemplo, a deficiência de tirosina quinase de Bruton (BTK) em seres humanos leva à agamaglobulinemia ligada ao X, e a uma ausência completa de células B. 44 No entanto, a deficiência de Btk no camundongo está associada a um fenó20 tipo bem mais leve, com a produção de células B maduras que são funcionalmente deficientes. 45
A sinalização por meio do receptor de célula B é importante para estabelecer o repertório de células B por meio da indução de anergia, eliminação e edição do receptor durante o desenvolvimento de células B. 46,47 25 Como aqui mostrado, o alelo de risco em BLK está associado à expressão reduzida do mRNA de BLK em linhagens de células B transformadas. Sem se prender a uma teoria, os níveis de proteína alterados de BLK podem influenciar mecanismos tolerância em células B, predispondo os indivíduos à autoimunidade sistêmica. Foi demonstrado recentemente um mecanismo 30 similar para Ly108, um dos principais loci genéticos no modelo em camundongo NZM2410 para lúpus. 48 Consequentemente, em uma modalidade da invenção, aqueles versados na técnica poderão usar as informações aqui fornecidas para avaliar o efeito do risco haplótipo sobre a expressão do gene C8orf13 expresso ubiquitariamente.
Um segundo lócus identificado nessa varredura é ITGAM/ITGAX. Embora ITGAX não seja excluído de considerações com base no forte LD na região que se estende até dentro da porção 5' de ITGAX, os dados sugerem que ITGAM pode ser o gene relevante na região. ITGAM (também conhecido como CD11 b, Mac-1, e o receptor de complemento do tipo 3) é uma molécula da cadeia alfa de integrina bem caracterizada que é expressa por vários tipos de células mieloides, incluindo células dendríticas, macrófagos, monócitos e neutrófilos. 49-51 ITGAM forma um heterodímero com ITGB2 (CD 18), e medeia a adesão entre tipos de células no sistema imunológico, e a adesão de células mieloides ao endotélio. 52 Camundongos deficientes em ITGAM mostram progressão aumentada da doença e inflamação em vários modelos de autoimunidade, 53-55 incluindo lúpus, e dados recentes sugerem que ITGAM pode funcionar normalmente para suprimir a diferenciação de Th17, 56 uma via que foi vinculada à indução de autoimunidade. De interesse, a expressão de CD11b foi relatada como estando elevada nos neutrófilos de pacientes com SLE ativo. 57 O alelo de risco para ITGAM com seus dois alelos não sinônimos altamente correlacionados podem predispor à função e/ou regulação alterada da expressão da proteína contribuindo, dessa forma, para a autoimunidade sistêmica.
Em resumo, os dados atuais identificam dois novos loci de suscetibilidade para SLE: BLK/C8orf13 no cromossomo 8 e ITGAM/ITGAX no cromossomo 16. Os genes candidatos mais prováveis dentro desses dois loci são BLK e ITGAM. A identificação desses genes fornece novas abordagens importantes para a base genética de SLE e também sugere novos alvos potenciais para terapia.
Exemplo 3 - Uma varredura de associação ampla do genoma no lúpus eritematoso sistêmico (SLE) e identificação de novos loci correlacionados ao SLE
Nesse exemplo, o conjunto de dados inicial consistiu nos casos e nos controles do estudo de associação de todo o genoma descrito acima nos Exemplos 1 e 2, com genótipos dos chips HumanHap550v1 de Illumina e chips HumanHap550v3 de Illumina. O conjunto de dados dos chips HumanHap550v1 de Illumina consistiu em 555.352 SNPs em cada um dos 464 casos e 1.962 controles. O conjunto de dados dos chips HumanHap550v3 de Illumina consistiu em 561.466 SNPs em cada um dos 971 casos e 1.621 controles. Para cada conjunto de dados, foram aplicados filtros de controle de qualidade similarmente à forma descrita acima nos Exemplos 1 e 2. O conjunto de dados resultante dos chips HumanHap550v1 consistiu em 534.523 SNPs em cada um dos 422 casos e 1.881 controles. O conjunto de dados resultante dos chips HumanHap550v3 consistiu em 549.273 SNPs em cada um dos 929 casos e 1.558 controles.
O conjunto de dados acima dos chips HumanHap550v1 de Illumina foi mesclado com o conjunto de dados acima dos chips HumanHap550v3 de Illumina. O conjunto de dados resultante consistiu em 564.307 SNPs em cada um dos 1.351 casos e 3.439 controles. Esse conjunto de dados foi mesclado com genótipos dos estudos de câncer de mama e próstata CGEMS: 553.820 SNPs em cada uma das 4.527 amostras, usadas como controles. O conjunto de dados resultante consistiu em 570.099 SNPs em cada um dos 1.351 casos e 7.966 controles. Foram aplicados filtros de controle de qualidade similarmente à forma descrita acima nos Exemplos 1 e 2. O conjunto de dados resultante consistiu em 446.856 SNPs em cada um dos 1.351 casos e 7.966 controles.
O conjunto de dados acima foi usado para imputar probabilidades de genótipo para cada SNP polimórfico CEU no HapMap de Fase II, por meio do programa IMPUTE (www. stats.ox.ac.uk/~marchini/software/gwas/impute.html). Foi usado o tamanho da população efetiva recomendado (-Ne 11.418).
A associação entre o estado de SLE e cada SNP imputado foi calculada com o programa SNPTEST (www.stats.ox.ac.uk/~marchini/software/gwas/snptest.html). Os valores singulares da população foram excluídos; eles foram determinados com o programa EIGENSTRAT, de forma similar àquela descrita acima nos Exemplos e 2. Foram testados modelos frequentistas tanto aditivos quanto gerais. Exemplo 4 — Varredura da associação de todo o qenoma em 1.310 casos de SLE e 7.859 controles
Métodos: Informações de amostras e genotipagem de casos de SLE e controles
A seleção e genotipagem das amostras de casos de SLE foram descritas previamente (1). Resumidamente, amostras de DNA de (a) 338 indivíduos do Autoimmune Biomarkers Collaborative Network (ABCoN), um repositório fundado pelo NIH/NIAMS (2), (b) 141 indivíduos do Multiple Autoimmune Disease Genetics Consortium (MADGC) (3), (ABCON + MADGC = série de casos 1), (c) 613 indivíduos do University of California San Francisco (UCSF) Lupus Genetics Project (4, 5) (série de casos 2) e d) 335 indivíduos do University of Pittsburgh Medical Center (UPMC) (6) mais 8 amostras coletadas no The Feinstein Institute for Medical Research (série de casos 3) foram genotipadas usando o arranjo Illumina de 550 K. Todos os casos de SLE eram de norte-americanos de ascendência européia , como determinado por autodeclaração. O diagnóstico de SLE (cumprimento de quatro ou mais dos critérios definidos pelo American College of Rheumatology (ACR) (7)) foi confirmado em todos os casos por revisão do prontuário médico (94%) ou por meio de documentação escrita de critérios por reumatologista assistentes (6%). Dados clínicos para essa série de casos formam apresentados em outra seção (4, 3, 2, 6, 5).
Um total de 8.147 amostras de controle genotipadas usando o arranjo Illumina de 550 K foram examinadas nas análises de associação. Três fontes foram usadas para controles (todos norte-americanos de ascendência européia): 1.861 amostras da coleção do New York Health Project (NYHP) (8); 1.722 amostras da base de dados disponível publicamente iControlDB (www.illumina.com/pages.ilmn9ID=231); e 4.564 amostras do projeto disponível publicamente Cancer Genetics Markers of Ssusceptibility (CGEMS) (http://cqems.cancer.qovf). A genotipagem das amostras do NYHP foi descrita previamente (1).
Filtros de qualidade dos dados de qenotipaoem
A coleta de amostras e a filtragem do SNP foram feitas com o uso de módulos analíticos dentro dos programas de computador PLINK (9) e EIGENSTRAT (10), como descrito abaixo.
a) Casos de SLE, amostras do NYCP e amostras do iControlDB
O arranjo de SNP de 550 K Illumina, versão 1 (HH550v1) foi usado para genotipar 464 casos e 1.962 controles, e o arranjo de SNP de 550 K Illumina, versão 3 (HH550v3) foi usado para genotipar 971 casos e 1.621 controles como descrito (1). Amostras nas quais o sexo relatado não combinava com o sexo observado (HH550v1: 10, HH550v3: 11) e amostras com > 5% genótipos ausentes (HH550v1: 25, HH550v3: 21) foram excluídas da análise. A relação críptica entre os casos de SLE e os controles foi determinada pela estimativa da identidade-por-estado (IBS) através do genoma para todas as combinações possíveis de amostras pareadas. Uma amostra de cada par estimado como sendo duplicatas ou parentes de 1°-3° grau foi excluída (Pi_hat > 0,10 e Z1 > 0,15; HH550v1: 88, HH550v3: 73). SNPs com HWE P < 1 x 10'6 em controles (HH550v1: 3.176, HH550v3: 2.240) e SNPs com > 5% de dados ausentes (HH550v1: 12.605, HH550v3: 7.137) foram removidos. Os SNPs foram testados quanto a uma diferença significante na frequência de dados ausentes entre casos e controles, e SNPs com P < 1 x 10’5 no teste de omissão diferencial implementado em PLINK foram removidos (HH550v1: 5.027, HH550v3: 2.804). Os SNPs também foram testados quanto a uma frequência significante de diferença de alelo entre os sexos; todos os SNPs tiveram P > 1 x 10’9 em controles. Os dados foram examinados quanto à presença de efeitos de batelada (por exemplo, entre amostras de ABCoN e todos os outros casos), e SNPs com uma diferença da frequência de alelo com um P < 1 x 10’9 foram excluídos (HH550v1: 18, HH550v3: 10). Variantes com genótipos haploides heterozigotos foram classificados como ausentes (HH550v1: 2.305, HH550v3: 875). Além disso, variantes com uma frequência menor de alelo < 0,0001 foram removidos (HH550v1: 97, HH550v3: 57)
b) Amostras de CGEMS
Para as 2.277 amostras de câncer de próstata e, separadamente, 2.287 amostras de câncer de mama, genótipos haploides heterozigotos foram classificados como ausentes (próstata: 2.717, mama: 0). Amostras nas quais o sexo relatado não combinava com o sexo observado (próstata: 0, mama: 2) e amostras com > 5% de dados ausentes (próstata: 15, mama: 1) foram excluídas. As amostras foram testadas quanto à relação críptica, como descrito acima, e uma amostra foi removida de cada par estimado como sendo duplicatas ou parentes de 1°-2° grau (Pi_hat > 0,10 e Z1 >0,15; próstata: 12, mama: 7). SNPs com um MAF < 0,0001 (próstata: 3.254, mama: 2.166) foram removidos.
c) Todas as amostras
Filtros de qualidade dos dados adicionais foram aplicados ao conjunto de dados mesclado que consiste em todos os casos de SLE e controles. SNPs com > 5% de dados ausentes (N = 65.421) e amostras com > 5% de dados ausentes (N = 0) foram removidas. Foi feito um teste para amostras em duplicata usando 957 SNPs independentes com MAF > 0,45, e não foi encontrada nenhuma amostra em duplicata . SNPs com HWE P < 1 x 10’6 em controles (N = 2.174) e SNPs com > 2% de dados ausentes (N = 5.522) foram removidos. Foram testados os SNPs quanto a uma diferença significante na proporção de dados ausentes entre casos e controles e foram removidos SNPs com dados ausentes excesso diferencial (P < 1 x 10'5, N = 16.080). Os SNPs foram testados quanto a uma diferença significante entre sexos e todos os SNPs tiveram P > 1 x 10’9 em controles. Os SNPs também foram examinados quanto à presença de efeitos de batelada; em particular, entre amostras de câncer de mama de CGEMS e todas os outros controles, e entre amostras de câncer de próstata de CGEMS e todos os outros controles, e foram removidos SNPs com P < 1 x 10’9 (N = 73). Após aplicação dos filtros de qualidade acima , 480.831 SNPs permaneceram.
Os casos e os controles foram testados quanto à presença de valores singulares da população usando EIGENSTRAT. SNPs com MAF < 2% em casos (N = 16.068), HWE P < 1 x 10’4 em controles (N = 977), ou >
1% de dados ausentes (N = 17.029); SNPs em regiões de padrões anormais de LD em função de variação estrutural nos cromossomos 6 (de 24-36 Mb), 8 (8-12 Mb), 11 (42-58 Mb) e 17 (40-43 Mb); e SNPs na região pseudoautossômica do cromossomo X (N = 12) foram excluídas com o objetivo de determinar os componentes principais (EIGENSTRAT) da variação para detectar valores singulares da população. Amostras com mais de 6 desviospadrão da média, ao longo de qualquer um dos 10 componentes principais foram removidas (N = 148).
O conjunto de dados final tinha 1.310 casos, 7.859 controles e 480.831 SNPs, e o fator de inflação de controle genômico (Àgc) (11) foi de 1,06 após a aplicação dos filtros de qualidade dos dados acima.
Imputação de qenótipos não observados
O intenso desequilíbrio de ligação presente no genoma humano permite a inferência de variantes não tipadas em certas situações um grau de confiança elevada. IMPUTE, um programa para imputar genótipos não observados em estudos de caso-controle de todo o genoma com base em um conjunto de haplótipos conhecidos (haplótipos de HapMap Fase II, www.hapmap.org), foi usado na análise (www.stats.ox.ac.uk/—marchini/ software/ gwas/impute.html).
Imputação dos casos de GNE e controles de NYCP, iDB e CGEMS
Após os filtros de qualidade controle, havia 1.310 casos do GNE, 3.344 controles de NYCP e iDB , 4.515 controles de CGEMS e 446.856 SNPs. O programa IMPUTE (versão 0.3.1) foi executado com o haplótipo CEU incluído, legenda e arquivos de mapas alinhados ao NCBI Build 35. O tamanho da população efetiva foi ajustado ao valor recomendado de 11.418. Não foi usado nenhum arquivo de fitas; a verificação do alinhamento de fitas em IMPUTE foi acionado. Casos, controles de NYCP e iDB e controles de CGEMS foram imputados separadamente, e cada cromossomo foi imputado separadamente em sua totalidade. 2.562.708 SNPs foram imputados.
SNPTEST (versão 1.1.3) foi usado para efetuar os testes de associação tanto nos genótipos reais quanto nos imputados. Para SNPs que já estavam genotipados, foram usados os genótipos reais. O teste de associa ção foi o teste de Cochran-Armitage para um efeito genético aditivo, com a opção -adequada para considerar completamente a incerteza dos genótipos. Somente os SNPs com uma pontuação de informação acima de 0,50 (ou seja, frequentist_add properjnfo > 0,50) foram mantidos (2.481.907 SNPs [97%]).
Resultados. Uma lista não redundante de loci de SLE associados ao SLE (P < 1 x 10’5) na análise de 1.310 casos e 7.859 controles é apresentada na Tabela 1. A lista da classificação ordenada foi gerada por exibição da variante única com o menor valor P em um intervalo de +/- 100 kb do gerado por exibição da variante única com o menor valor P em um intervalo +/- de 100 kb da análise de 2,3 milhões de SNPs, como descrito acima. Tabela 1: Loci associados ao SLE (P < 1 x 10'5) na análise de 1.310 casos e 7.859 controles. A lista da classificação ordenada foi gerada por exibição da variante única com o menor valor P em um intervalo de +/-100 kb da análise de 2,3 milhões de SNPs, como descrito. O SNP (Id do dbSNP), Cromossomo, posição (posição do par de bases no build 35 do genoma humano), frequência menor de alelo nos casos de SLE e controles, valor P de SNPTEST (sob um modelo aditivo, correção para a precisão da imputação), A Pontuação da Informação de Imputação (uma estimativa da precisão da imputação) e Razão de Chances (com intervalos de confiança de 95%) são mostrados.
Frequência de alelo
Razão de Chances (intervalo de confiança de 95%) 1,76 (1,58-1,97) 0,59 (0,52-0,66) 1,49(1,36-1,64) 0,71 (0,56-0,91) 1,31 (1,2-1,44) 0,78 (0,72-0,86) 0,79 (0,72-0,86) 1,37(1,15-1,63) 1,26 (1,15-1,39) 0,5 (0,3-0,84) 0,79 (0,71-0,89) 0,76 (0,68-0,85) 0,81 (0,74-0,89) 1,35(1,19-1,53) 0,7 (0,6-0,83) 1,22(1,12-1,33) 0,72 (0,62-0,83) 1,3(1,16-1,46)
Pontuação da Informação de Imputação o o_ CD σ> d 0,97 cd CD o‘ CD cd o 1,00 CM cd o CM o CD CD o 0,57 0,90 0,96 CO CD o o o_ T— CO CD o o o 0,91 0,99
Q_ 2.49E-24 2.37E-20 cd — 1 LU m IO T— ΤΙ LU O 3.80E-09 1.21E-07 2.34E-07 2.54E-07 ZO-399‘8 CO o 1 LU CO O_ T- 1.10E-06 CD O 1 LU CO CD_ — 2.38E-06 2.77E-06 3,01 E-06 3.50E-06 3.55E-06 CO o 1 LU
Controles (N=7.859) T το o“ 0,230 0,029 I 0,278 0,251 CM o' 0,064 0,238 o o o o — o 0,148 o CM o 0,157 0,054 00 CO o 6Z0‘0 0,196
Casos (N=1.310) 0,190 0,175 CO o CO CD 0,041 0,335 0,300 0,531 0,086 0,283 CO o o o 0,205 0,187 0,313 0,121 CO o o 0,389 0,107 0,158
Posição (Build 35) 32713862 128257124 191769248 31236781 11389894 150437964 27983196 141630291 169943930 71637413 82621870 203332363 42061217 65520176 98289410 159812556 114015850 o 00 'cr CO 00
Cromossomo CD CM CD T— CO LO CM CM 14 CM CM 00 m CO
SNP rs2187668 rs13236009 rs11889341 rs6565228 rs2736345 rs6889239 rs2391592 rs2177770 rs12039904 rs4591368 rs 12882608 rs3024493 rs11678272 rs874952 rs2053482 rs2431697 rs6679677 rs 12445476
I ο 1CÜ Ο
Frequência de alelo
Razão de Chances (intervalo de confiança de 95%) 1,26(1,14-1,39) 0,8 (0,73-0,88) tf? o' 1 O o' co — o' 0,79 (0,71-0,87) 0,81 (0,73-0,9) 0,5 (0,34-0,74) 0,75 (0,66-0,86) 0,82 (0,75-0,89) 1,22(1,12-1,33) 0,7 (0,57-0,85) 1,31 (1,15-1,48) 0,76 (0,67-0,86) 1,21 (1,1-1,32) 1,29(1,11-1,5) 0,67 (0,55-0,81) 0,83 (0,76-0,9)
Pontuação da Informação de Imputação 0,99 0,92 σ> 00 o 1,00 0,92 0,61 0,96 1,00 o o_ 0,75 0,94 0,89 0,94 o 00 o' 0,84 0,94
0. 4.43E-06 4.47E-06 4.54E-06 4.84E-06 5.17E-06 90_389‘G 5.69E-06 5.77E-06 5.84E-06 5.97E-06 co o ώ co' 6.65E-06 6,93E-06 8.02E-06 8.63E-06 9.64E-06
Controles (N=7.859) 0,252 0,304 0,001 0,187 0,185 0,026 co o o' 0,312 0,377 0,040 0,168 o' 0,346 co o o' 0,040 0,368
Casos (N=1.310) 0,212 0,353 0,003 0,225 0,218 0,013 0,112 0,356 0,425 0,056 0,134 0,149 0,390 0,110 0,059 ST r— o'
Posição (Build 35) 232216137 158447777 39720893 67523377 14822843 85247083 180300843 34246756 106695307 o CO O O CO T— 107837653 49429182 40285103 29655999 114612099 7398076
Cromossomo ID 00 co CXI 00 co co co CXJ T“ co CD 17
SNP rs2208384 rs6879995 rs 10502821 rs3790565 rs2024831 rs2066943 rs 12986652 rs 1196592 rs7759216 rs 17484292 rs1579289 rs11970105 rs10082917 rs7006016 rs11757479 rs4968210
Exemplo 5 Meta-análise de loci de risco de SLE relatados na varredura de associação de GNE
Métodos
Exame da literatura de SLE e critérios para loci de SLE confirmados
Um total de 16 alelos satisfazia a um dos critérios descritos abaixo para loci de risco de SLE confirmados (Tabela 2).
1) Loci de risco de SLE com pelo menos 2 relatos independente de P < 1 x IO'5.
A literatura foi examinada para loci com 2 relatos independente em grupo de SLE não superpostos com a P < 1 x 10'5. A pesquisa na literatura representa publicações antes de abril de 2008. Era necessária variante idêntica (ou aproximada com r2 > 0,3) que mostra associação ao SLE com a mesma direção se efeito. Um total de 7 alelos satisfez às exigências, incluindo HLA-DRB 1 *0301 (HLA-DR3, (18, 19)), HLA-DRB 1 * 1501 (HLA-DR2, (18, 19)), Não-receptor de Proteína Tirosina Fosfatase tipo 22 (PTPN22, (20, 21)), Fator Regulador de Interferon 5 (IRF5, (22, 23)), Transdutor de Sinal e Ativador de Transcrição 4 (STAT4, (5, 21)), tirosina quinase linfoide B (BLK, (21, 1)) e integrina alfa M (ITGAM, (1, 24)). O alelo idêntico ou melhor aproximado (r2 > 0,85) nos 1.310 casos de SLE e 7.859 controles da varredura da associação de todo o genoma aqui descrita prosseguiu para a análise (Tabela 2).
2) Loci de risco de SLE com um único relato de P < 1 x 10’5.
Foi realizada uma pesquisa na literatura por loci de risco de SLE com um P relatado <1 x 10‘5 em uma única publicação até abril de 2008, e foi identificado um total de 18 loci.
Em 13 dos loci, a variante idêntica ou aproximada quase perfeita (r2 > 0,9) foi genotipada nos 1310 casos de SLE e 7.859 controle da varredura do genoma descrita acima (Tabela 4). Uma meta-análise com o uso da metodologia abaixo foi realizada para os 13 loci, e 8 dos loci obtiveram um P < 5 x 10' . Os loci (marcados por um único gene dentro do lócus) que obtiveram significância de todo o genoma incluem: Proteína de Transformação de Tumor da Pituitária 1 (PTTG1), APG5 autofagia 5-like (ATG5), proteína de ligação de CTD SR-like rA9 (K1AA1542), Enzima de conjugação de ubiquitina E2L3 (UBE2L3), domínio PX contendo serina/treonina quinase (PXK), fragmento Fc de IgG, lia de baixa afinidade, Receptor (FCGR2A), Superfamília 4 de Fator de Necrose Tumoral (ligante) (TNFSF4), e proteína scaffold 5 de célula B com repetições de anquirina 1 (BANK1). A variante que alcança significância em todo o genoma na meta-análise avançou para análise (Tabela 5, Tabela 2). Nos 5 loci restantes, a variante relatada ou quase perfeita (r2 > 0,9) não foi genotipada nos 1.310 casos de SLE e 7.859 controles da varredura da associação de SLE de todo o genoma (Tabela 2). No entanto, 10 uma variante na quinase 1 associada ao receptor de interleucina-1 (IRAKI) teve um P observado <1 x 10’4 e avançou na análise (Tabela 1).
Meta-análise
A estatística de associação corrigida para cada série foi combinada pela soma dos escores Z ponderados para o tamanho do grupo.
Tabela 2. Associação estatística para 16 alelos de risco para SLE confirmados nos GWAS de 1.310 casos de SLE e 7.859 controles. Os alelos estão ordenados pelo valor P.
Razão de chances (Cl de 95%) 1,76(1,58-1,97) 1,68(1,50-1,89) 1,48(1,34-1,64) 1,46(1,31-1,63) 1,30(1,19-1,43) 0,82 (0,75-0,89) 1,22(1,12-1,32)
Valor P 10 CM Ó T- X IO o’ σ> Ó x— X x— ó v— X IO CM’ Td t— X CO CM~ X- X χ— <o õ t— X CO_ co’ <0 ó T— X IO LO
Frequência do alelo Controle x— V“ o' 0,109 0,235 0,127 0,242 0,438 0,376
Caso 0,190 0,170 0,312 0,175 0,294 0,389 0,423
Alelo menor O H < O <
Posição* (Mb) 32,714 128,18 co 191,79 o 31,221 11,387 159,81 co 106,69 IO 169,96
SNP rs2187668 rs1048863 X- rs7574865 rs9888739 rs1327711 CO rs2431697 rs6568431 rs1048926
Cromossomo CM cq T- cm CL CD 7q32.1 2q32.2 16p11.2 8p23.1 5q33.3 6q21
Lócus HLA-DR3 IRF5 STAT4 ITGAM BLK PTTG1 ATG5
100
Tabela 2. -continuação-
Razão de chances (Cl de 95%) 1,24(1,09-1,30) 1,35(1,18-1,54) 1,29(1,15-1,45) 1 0,86 (0,79-0,94) 0,87 (0,80-0,96) 1,15(1,04-1,27) 1,13(1,03-1,23) 1,10(0,98-1,24) 0,93 (0,85-1,01)
Valor P to Ò T— X co CO b T- X σ> co- m Ô x— X x— X“ b χ— X Χ“ CO b X- X X- co CO b T“ X co' 0,010 0,092 0,096
Frequência do alelo Controle 0,238 σ> co o o X- x— o 0,500 0,333 0,192 0,281 X“ o' 0,304
Caso 0,278 0,116 0,175 0,463 0,303 0,215 0,305 0,160 0,288
O O < E O < 1— <£ I— H 0 < <
Posição* (Mb) co 114,09 o 152,71 X- σ> CN co ιο co 0,580 20,264 58,345 32,509 103,10 co
SNP LO rs2476601 rs2269368 rs1801274 rs4963128 rs5754217 rs6445975 rs3129860 rs1051648
Cromossomo 1g25.1 1p13.2 Xq28 1q23.3 iq io x— Q. x— x— 22q11.21 3p14.3 6p21.32
Lócus TNFSF4 PTPN22 IRAKI FCGR2A KIAA154 CN UBE2L3 PXK HLA-DR2 BANK1
As posições são do NCBI Build 35.
101
Tabela 3. Loci de risco de SLE com pelo menos 2 relatos independentes com o mesmo SNP (ou aproximados com r2 > 0,3) com P< 1 x 10'5.
GNE GWAS r2 para o alelo no Relato 1 o o_ 1,00 0,97 0,87 1,00 0,86
SNP o co CD CM <A IO o IO co rs3129860 rs2187668 rs10488631 I rs13277113 rs9888739
Refers, adicionais v~ (o' cm o' CM V* CM
Relato 2 i Refer. V* CM s> 'X— V- o' CM ££ (1)
Valor P <D b T— X CM m“ <31 Ô 3— X 00 cm' b t— X O t— 1,0 x 10’5 co b X b r~ X in cm' b T— X o CO
Ε .P φ t— ro tr o °· o « oj — θ ro m_ o c — o o_ t— o o τ— O o I 1,00 1,00 0,33
Alelo O CO CO 'T CM CO L— m CO co IO ω u. DRB1*1501 DRB1*0301 rs2004640 rs6985109 rs11574637
Relato 1 Refer. O' CM 5? co' CM CO CM
Valor P ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________I ID Ô x— X CD 05 Ó X o ▼— m Ô X CD o X CD T” co Ô t— X CM IO o b X CD~ CM CM b T“ X σ> co
Alelo o CO CO CM CO o CO 00 LO <0 DRB1M501 DRBV0301 rs2004640 rs13277113 rs1143679
Cromos. CM CO T— CL T- CM CM CO σ CM CM CO t— CM CL CO 6p21.32 7q32.1 8p23.1 CM Q. CO t—
Lócus cm cm 5 0. E <z> HLA-DR2 HLA-DR3 IRF5 BLK ITGAM
102
Tabela 4. Loci de risco de SLE reltado apenas uma vez com P < 1 x 10’5 e nos quais a meta-análise foi possível. 8 loci tiveram uma meta de P < 5 x 10'8.
ω < 0 LU z 0 Q- Φ φ ό τ— X co ΙΟ οι Ó τ— X cm o b X- X O X“ σ> b τ— X co_ CO b X“ X CD X- co b τ— X oj co 5,1 χ 10’6 10 b T— X o CM co b τ— X CD_ co co b τ— X co co’
0. 1— _ο > (0 b Τ— X co co <0 ό τ— X ιη id CO b X“ X X- CO m b T” X Xt co o ΤΟ o b X“ X χ— CD b x— X cd co oj o o ID τ— o’ ID CD O_ o oo o co CDθ’ ID OJθ'
ο φ φ ° ο Φ Jp φ ω CL 0Í ΓΧ. Ο c ο ο_ Τ“ ο ο_ τ— o GJ T“ o CD τ— o o_ τ— o o_ τ— τΟ o’ o O- τ— o o_ T~ O O_ τ— o O- T~ o o_ τ— O O- T—
CL ζ ω ο co Τ“ co CM CO Τ“ CO CO co ID CO <n CO CXI τ— CO co CD CO L T“ CXJ ID ID CO ID OJ ID S CO L— CM τ- Ο co τ— 52 ID CD CXI CD CO O τ— CO co co τ— ID O vCO 1— co τΟ CXI CXI o CXI co 1— τΟ) CD ID τΟ τ— CO L— CD τ— oo OJ CXI oo co k— ID CXI τ- Ο CXI co 1— OJ o co co 52
o +-» Φ Φ or φ ο C Έ £ φ CZ CM s. CM CM s CO
CL ι- Ο Φ ο Ò X- X Ο χ- CO b x— X x— O Ó T” X o co co b T“ X ID σ> b x— X X- b τ— X co co’ IO b X- X CD X“ o b τ— X co b x— X X- X- b τ— X OJ τ— 0> b τ— X id b τ— X CM T— co b τ— X OJ cm’
Ο φ < σ> co Τ co CM CO T co co co ID CD co 1— co CXI τ— CO co OJ CO k T~ CXJ ID ID CO L ID σ> ID s co 1— cxj τ— o co τ— CO o oj CD co o CXJ τ— CO co CD τ— ID O τ— CO I— co τ— o CXI CXI cxj co T— CD O CO ID τ— o τ— CO CO τ— co OJ CXI co co L. ID CM τ- Ο CM CO t. OJ o oo co co U-
Cromossomo CO co co ΙΟ τ— CM CT co 10 in X- Q. X- X“ T“ CXI T“ τ- Φ CXJ CXJ co τ- Ο. co co co CXJ o- ID CXI o- cxi CT CO ID CXJ CT τ— CO τ— CXI CL τ— cxi τ— σ cq CXJ co τ— CT CM v— cq τ— CM CO
ω Ξ! ο Ό <3 Ό g CM co 5 s co CXJ LU CO $ or 0 O LL Í2 g $ CQ CXJ 1 δ 5 ÜJ o 00 CO o: &
GNE GWAS: GWAS de 1.310 casos de SLE e 7.859 controles.
103 co CD c φ CL <
Φ >
(Λ Ο
CL ,0
Ο »CD
C φ (Λ 'CD
C cd
I
CD φ
Ε
CD co 'cd
Ζ5 σ· co ο c φ
ΙΟ
Ó
X
VI φ > φ
Ο LU ω Ε
______ GNE GWAS* Valor Ρ m Ó ▼— X T“ 1 1 1 1
SNP rs2269368 1 1 1 I
Valor Ρ io b r— X T— T— CO ó T“ X o_ CO CO Ó T~ X CO co 0,84 CO Ô T“ X CM
Melhor SNP** rs2269368 rs3820099 rs9332628 rs3892357 rs12720356
Relato Referência CM 00, CO CO c\T eo οζ õí CM
Valor P <o ó t— X CO o> ó t— X co” co Ó T- X in m b X CD co Ó T“ X <N cxí
Alelo rs10127175 rs3093061 rs3917815 rs11568821 rs2304256
o E o CO CO o E 2 O co CM cr X 1g23.2 1q24.2 2q37.3 19p13.2
Lócus IRAKI CRP SELP PDCD1 TYK2
CO φ
Ο Ο σ> ιη co φ
LL1 co ο co CD
Ο ID co ZJ ο _Ο φ φ Ο σ CD c
CL
L—
Ο C φ Ε ο Ε ο ο □ζ ω ο
CL ζ ω ο χζ φ
104
Exemplo 6 - Sumário
Resumo de loci de risco de SLE
Loci de risco de SLE foram identificados usando dois métodos primários: a) análise de 1.310 casos de SLE e 7.859 controles, e b) uma meta-análise com loci de risco de SLE relatados previamente.
Uma lista não-redundante das variantes com forte associação ao risco para SLE (P < 1 x 10’6) é fornecida na Tabela 6.
Algoritmo para avaliação do risco para SLE e resposta à terapia
Variantes associadas a um fenótipo sabidamente interagem de forma aditiva, dose alélica-dependente (38, 39). Em uma modalidade exemplar, o seguinte algoritmo pode ser usado para avaliar o para o lúpus, a gravidade da doença e a resposta à terapia. Os casos de lúpus podem ser estratificados em grupos com base no número de alelos de risco carregados. Nessa modalidade exemplar, o alelo de risco é definido como o enriquecido no alelo em casos de lúpus em relação aos controles dos loci. Por exemplo na Tabela 6, há um total de 19 alelos de 18 loci, tornando o número máximo possível de alelos de risco igual a 38. Os casos de lúpus estratificados pelo número de alelos de risco e tereis da distribuição resultante podem ser determinados. Os tereis de casos de lúpus podem então ser examinados quanto às diferenças na gravidade da doença, no risco e na resposta à terapia.
Tabela 6: Loci de risco para o lúpus
Lócus Cromossomo SNP Posição* (Mb) Valor P Fonte
HLA-DR3 6p21.32 rs2187668 32,714 9,5 x 10’25 Tabela 2
IRF5 7q32.1 rs10488631 128,188 1,4 x 10’19 Tabela 2
STAT4 2q32.2 rs7574865 191,790 2,5 x 10‘14 Tabela 2
ITGAM 16p11.2 rs9888739 31,221 2,3 x 10’11 Tabela 2
BLK 8p2á.1 rs13277113 11,387 1,7 x 108 Tabela 2
PTTG1 5g33.3 rs2431697 159,813 3,3 x 10-6 Tabela 2
ATG5 6g21 rs6568431 106,695 5,5 x W6 Tabela 2
TNFSF4 1g25.1 rs 10489265 169,968 8,7 x W6 Tabela 2
PTPN22 1 p13.2 rs2476601 114,090 8,9 x W6 Tabela 2
IRAKI Xq28 rs2269368 152,711 1,1 x 10'5 Tabela 2
105
Tabela 6: -continuação-
Lócus Cromossomo SNP Posição* (Mb) Valor P Fonte
FCGR2A 1q23.3 rs1801274 158,293 4,1 x W4 Tabela 2
KIAA 1542 11p15.5 rs4963128 0,580 3,1 x 10'3 Tabela 2
UBE2L3 22q11.21 rs5754217 20,264 6,4 x 10’3 Tabela 2
PXK 3p14.3 rs6445975 58,345 0,01 Tabela 2
HLA-DR2 6p21.32 rs3129860 32,509 0,092 Tabela 2
BANK1 4q24 rs 10516487 103,108 0,096 Tabela 2
TNIPI 5 rs6889239 150,438 2,2 x 10-8 Tabela 1
JAZF1 7 rs2391592 27,983 2,3 x 10'7 Tabela 1
LRP 1B 2 rs2177770 141,630 2,5 x 10’7 Tabela 1
* Posição comossômica da variante em pares de bases em NCBI Build 35 (Hg17, maio de 2004) do genoma humano (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/release notes.html#b35)
Exemplo 7 - Resumo do sequenciamento
Métodos
DNA genômico de 192 pacientes com SLE e 96 controles saudáveis cujos genomas foram amplificados antes do ressequenciamento. O DNA genômico foi ressequenciado de todos os éxons e foram selecionadas 10 regiões não-codificadoras (2,5 kb da região promotora acima do éxon 1) em Quinase Linfoide B (BLK), Integrina Alfa M (ITGAM) e Integrina Alfa X (ITGAX).
A chamada inicial dos alelos foi realizada pelo software fornecido por Polymorphic. Todos os polimorfismos codificadores, bem como os ale15 los não codificadores comuns, foram verificados manualmente para confirmar as chamadas de alelos, e criar os arquivos de genotipagem, usados para a análise de associação e haplótipo.
As variantes de ITGAM/ITGAX são fornecidas nas Tabelas 7 e 9 e nas Tabelas 8 e 10. As variantes das Tabelas 7 e 9 não estão presentes 20 na base de dados dbSNP build 129. As variantes das Tabelas 8 e 10 foram descobertas por sequenciamento de ITGAM/ITGAX e BLK.
106
Tabela 7: Variantes de éxons e região promotora de ITGAM e ITGAX.
Controles 0,005 0,005 0,174 0,62 0,005 NaN NaN
SOSBQ 0,0026 0,0026 0,175 0,652 0,0026 0,434 0,201
Alelo < 0 0 0 0 0 O
Posição 31192218 31192220 31243375 31244226 I 31248726 31250691 31250736
Cromos. CD T“ CD CD T“ CO CD CD T“ CD
Alelo menor 0 o < 0 Inserção [GAGTGTGTGC] o
Q exon8_Glu246Arg exon8_Glu247Lys 237T>Cex17 186G>A_ex20 exon26 Gly1003Glu 3' UTR; inserção de 10 bp Λ σ> CXI CO ro r— D) C T3 O O c o c 0
107
Frequência do alelo Controles 0,677 0,109 co o o' 0,109 0,115 0,823 0,021 0,844 0,823 NaN 0,172 0,635 0,005
Casos 0,736 τ- ο 0,155 0,16 x— o' 0,827 o 0,914 0,825 0,246 0,178 0,738 0,026
Alelo O < < O o O c O O l— 0 < 0
Posição 31180630 31184312 31190665 31195622 31196897 31244389 31248925 31250109 31250506 31250744 31250887 31251154 31251171
o E o <n o E 2 O co x— CO CO X- CO CO X“ CO x— CO CO X- CO X- CO X“ CO CO X- CO X-
Alelo menor I— < < o o H <£ I— H I— 0 0 o
Q rs3764327 rs1143679 rs35314490 rs9939679 rs11861251 rs1143683 rs41321249 rs7188189 rs1143678 rs4594268 rs9933520 rs3087796 rs41523147
108
Tabela 8: -continuação-
Frequência do alelo Controles 0,661 0,115 0,271 0,031 0,102
Casos 0,729 0,16 0,348 0,042 0,176
Alelo 0 O 0 H
Posição 31251270 31274819 31282036 31292149 31251462- 31251462
Cromossomo CD T“ CO x— CO r— CO T- CO T—
Alelo menor -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 o 0 1— Inserção [CTTTA]
Q rs4597342 rs11574633 rs2230429 rs12448775 rs41419150
ons e região promotora de BLK. Frequência do alelo Controles 0,005 0,12 o' 0,798 0,818
Casos 0,021 τ- ο 0,516 0,829 0,882
Alelo H I— Q <
Posição 11387925 11404452 11443842 11451476 11456175
Cromossomo co co CO co co
Alelo menor 1— 1— 1— I— 0
Tabela 9: Variantes de éx Q 1120_C>T 434_C>T ex5_112T>C ex9_121 T>C ex11_6G>A
109
Tabela 9: -continuação-
110
Tabela 10: Variantes de éxons e região promotora de BLK.
Frequência do alelo Controles o 0,781 0,234 0,776 0,307 0,917 0,214 0,328 0,328 0,307 0,307 0,021 o 0,521 0,224 0,776
Casos 0,838 0,84 0,238 0,861 0,38 0,937 0,327 0,416 0,413 0,384 0,369 0,016 0,005 0,555 0,359 0,846
Alelo 0 < 0 O < 0 < < Q |— < < 1— l— 0
Posição 11389466 11386986 11404502 11388088 11455795 O T- T- 11388429 11452981 11453006 11456182 11456183 11442984 11443008 11459540 11389322 X- CO T“ CO CO CO T- T-
Cromossomo co co co co co co CO co co CO co co CO co co co
Alelo menor < Q 0 F- < O < < O H 1— < < 0 H 0
Q rs2250788 rs2251056 rs2409782 rs2736344 rs2898289 rs4629826 rs4840568 rs4841557 rs4841558 rs4841561 rs4841561 rs55758736 rs56185487 rs7843987 rs922483 rs9694294
111
Exemplo 8
Indivíduos e design do estudo
Foi feito um estudo da associação de todo o genoma para SLE. 1.079 casos de SLE e 1.411 controles foram genotipadas com o BeadChip de Genotipagem HumanHap550 de Illumina (555.352 SNPs). Os casos de SLE foram de três grupos distintos. Amostras de controle foram escolhidas com base em na tipagem de HLA disponível, etnia, sexo e idade. A maioria dos controles (todos, com exceção de 277) foi escolhida de tal forma que a frequência de haplótipos de HLA DR2 e DR3 combinasse com aquela encontrada no SLE.
Havia três versões do HumanHap550 de Illumina. O número de SNPs compartilhados entre a versão 1 e a versão 3 é de 545.080; somente esses SNPs foram analisados. A Versão 1 foi usada para todas as amostras do grupo 1 e grupo 2 e para 1.001 amostras de controle. A Versão 3 foi usada para todas as amostras do grupo 3 e 410 amostras de controle.
Chips com taxas de chamada médias < 80% foram refeitos. Após todas as releituras estarem completas, amostras com < 90% de taxas de chamada foram removidas.
As amostras foram inicialmente divididas em dois grupos para análise. O primeiro grupo (Grupo 1) consistiu em todas as amostras do grupo 1 e do grupo 2 (466 casos) e 724 amostras de controle. O segundo grupo (Grupo 2) consistiu em todas as amostras do grupo 3 (613 casos) e as 687 amostras de controle restantes.
Filtragem no Grupo 1
As amostras foram verificadas quanto à concordância entre genótipo- sexo e registros clínicos determinados; foi encontrada uma discrepância em 10 amostras (3 casos, 7 controles), que foram removidas da análise posterior.
As amostras foram então testadas quanto à mistura intercontinental usando o programa STRUCTURE (o link online pode ser acessado em pritch.bsd.uchicago.edu/structure com .html como sufixo) (basicamente como descrito em Pritchard e outros, Genetics (2000), 155: 945-959; Fa
112 lush e outros, Genetics (2003), 164: 1.567-1.587; Falush e outros, Molecular Ecology Notes (2007), doi:10.1111/j.1471-8286.2007.01758.x). O HumanHap550 inclui um Painel de Teste de DNA de 276 SNPs que são ideais para a determinação do percentual de ancestralidade para as populações CEU, YRI e CHB + JPT do projeto HapMap (CHB e JPT não podiam ser discriminados usando esses SNPs). 274 dos 276 SNPs no Painel de Teste de DNA foram genotipados em todas as populações HapMap; STRUCTURE foi executado com genótipos para esses 274 SNPs no conjunto que consiste nas amostras do Grupo 1 restantes (463 casos, 717 controles) mais uma amostra de cada pedigree no projeto HapMap (ou seja, 20 amostras CEPH de Utah (CEU), 30 amostras ed iorubas (YRI), 45 amostras de chineses da etnia Han (CHB) e 44 amostras de japoneses (JPT)). As amostras de HapMap foram incluídas como controles positivos e para ajudar no algoritmo de agrupamento. STRUCTURE foi executado independentemente três vezes com os mesmos parâmetros: usando o modelo de mistura de ancestralidade e o modelo de alelo-frequência correlacionados, sem informações prévias da população, presumindo três populações, com 30.000 etapas burn-in , seguidas por 100.000 etapas de Markov-Chain Monte Carlo. As três rodadas tiveram coeficientes de ancestralidade muitos similares para cada amostra, e cada amostra de HapMap teve > 93,0% de ancestralidade para sua origem geográfica; cada amostra de CEU teve > 97,0% de ancestralidade para CEU. Amostras que tinham < 90,0% de ancestralidade para CEU em qualquer uma das três rodadas (28 casos, 24 controles) foram removidas de análise posterior.
Para as amostras restantes (435 casos, 693 controles), SNPs com taxas de chamada < 95% (23,275 SNPs (4%)) foram removidos de análise posterior. A seguir, SNPs com probabilidade de Hardy-Weinberg < 0,001 em controles (15.622 SNPs (3%)) foram removidos de análise posterior. Filtragem no Grupo 2
As amostras não foram verificadas explicitamente quanto à concordância entre genótipo- sexo e registros clínicos determinados.
SNPs com taxas de chamada < 95% (34.998 SNPs (6%)) foram
113 removidos de análise posterior.
As amostras foram então testadas quanto à mistura intercontinental usando STRUCTURE, como descrito acima. Amostras que tinham < 90,0% de ancestralidade de CEU em qualquer uma das três rodadas (21 casos, 24 controles) foram removidas de análise posterior.
Para as amostras restantes (592 casos, 663 controles), SNPs com probabilidade de Hardy-Weinberg < 0,001 em controles (22.202 SNPs (4%)) foram removidas de análise posterior.
Combinação dos Grupos 1 e 2
Os Grupos 1 e 2 foram combinados para a análise final.
As amostras restantes (435 casos, 693 controles) no Grupo 1 foram combinadas com as amostras restantes (592 casos, 663 controles) no Grupo 2 para gerar o Grupo Final (1.027 casos, 1.356 controles). Somente os SNPs restantes tanto no Grupo 1 quanto no Grupo 2 (496.458 SNPs) foram posteriormente analisados.
Todas as amostras sem discrepâncias de sexo (1.076 casos, 1.404 controles) foram verificadas para ver se elas poderíam ser duplicatas ou relacionadas. Inicialmente, todos os pares de amostras foram comparados através de 800 SNPs espalhados pelo genoma. Candidatos a duplicatas e a relacionados foram então verificados por todos os 540.000+ SNPs. Foram detectados três grupos de valores singulares. O primeiro grupo (20 pares) tinha > 95% de identidade entre cada par e foi considerado como de duplicatas. O segundo grupo (17 pares) tinha 67-77% de identidade entre cada par e foi considerado como de relacionados. O terceiro grupo (5 pares) tinha 58-63% de identidade entre cada par e foi considerado como de relacionados (a identidade média entre as amostras foi de 51-55%.) No geral, 39 amostras (29 casos, 10 controles) foram removidas do Grupo Final.
SNPs no DNA mitocondrial (19 SNPs) foram removidos de análise posterior.
O Grupo Principal resultante (998 casos, 1.346 controles, 496.439 SNPs) foi usado na análise abaixo.
A mesma análise também foi realizada em subconjuntos especí114 ficos do Grupo Principal:
Subconjunto 1: somente mulheres (907 casos, 967 controles) e Subconjunto 2: casos com nefrite lúpica e todos os controles (286 casos, 1.346 controles) Análise e Resultados
Todos os SNPs no Grupo Principal foram analisados usando EIGENSTRAT, que é um programa que está descrito basicamente em Price e outros, Nature Genetics (2006), 38: 904 - 909 (o link online pode ser acessado em genepath.med.harvard.edu/—reich/EIGENSTRAT com .htm como sufixo), que também corrige a estratificação da população. Os 10 componentes principais foram usados para remover valores singulares por 5 rodadas, e depois corrigir a estratificação. A estatística de qui-quadrado de EIGENSTRAT foi então calculada, e a probabilidade de uma cauda da distribuição do qui-quadrado foi calculada com a função CHIDIST CHIDIST do programa Excel da Microsoft com um grau de liberdade.
Para determinar as principais regiões candidatas, primeiro reduziu-se o número de SNPs candidatos utilizando um limiar do valor P: para o Subconjunto 1 (mulheres) e Subconjunto 2 (nefrite), SNPs com um P > 2,0 x 10' 5 foram removidos de análise posterior, e para o Grupo Principal (998 casos, 1.346 controles), SNPs com um P > 7,0 x 10'5 foram removidos de análise posterior. No subconjunto de mulheres, 19 SNPs permaneceram. No subconjunto de nefrite, 35 SNPs permaneceram. No Grupo Principal, 47 SNPs permaneceram. A seguir, a região de desequilíbrio de ligação (LD) que contém cada SNP foi determinada por exame de gráficos de LD utilizando o programa HelixTree (o link online pode ser acessado em www.goldenhelix.com/pharmhelixtreefeatures com .html como sufixo) (Golden Helix, Montana, EUA). O algoritmo EM foi usado para calcular D' e r2 usando somente os genótipos dos casos e de controles. As regiões foram delineadas a olho nu, usando D' > aproximadamente 0,9 como limites.
Após cada região ter sido delineada, os genes em cada região foram verificados com um navegador de genoma estabelecido na técnica (por exemplo, o Navegador de Genoma UCSC, descrito basicamente em
115
Kuhn e outros, Nucleic Acids Res. (2007), 35 (exemplar de base de dados):D668-73; o link online pode ser acessado em genoma.ucsc com .edu como sufixo, montagem de março de 2006). A expressão gênica imuno-específica, como determinada no estudo IRIS (Abbas e outros, Genes and Immunity (2005), 6: 319-331, incluindo seu material suplementar online), foi examinada. As principais regiões candidatas foram identificadas, por exemplo, pela presença de genes imuno-específicos em uma região. No subconjunto de nefrite, 11 regiões que contêm 20 SNPs candidatos foram escolhidas como provavelmente contendo pelo menos um alelo de risco para SLE (Figura 12). No subconjunto de mulheres, foram escolhidas 6 regiões adicionais que contêm 9 SNPs candidatos (Figura 13). No Grupo Principal, foram escolhidas 6 regiões adicionais que contêm 8 SNPs candidatos (Figura 14). Foi escolhido um total de 23 regiões que contêm 37 SNPs candidatos. Deve-se observar que os SNPs foram listados sob o grupo de estudo que teve o resultado mais forte para os SNPs e, dessa forma, hits em duplicata entre os grupos de estudo não são mostrados. Além disso, hits na região MHC não foram incluídos. As regiões de LD delineadas com base nos dados das Figuras 12-14 foram determinadas, e estão resumidas nas Figuras 15-17, respectivamente.
Listagem de Referência
1. Hochberg M.C. The epidemiology of systemic lupus erythematosus. Em: Wallace D.J., Hahn B.H., eds. Dubois' Lupus Erythematosus. 5a Edição. Baltimore: Williams and Wilkins; 1997.
2. Wakeland E.K., Liu K., Graham R.R., Behrens T.W. Delineating the genetic basis of systemic lupus erythematosus. Immunity 2001; 15(3): 397-408.
3. Nath S.K., Kilpatrick J., Harley J.B. Genetics of human systemic lupus erythematosus: the emerging picture. Curr. Opin. Immunol. 2004; 16(6): 794-800.
4. Goldberg M.A., Arnett F.C., Bias W.B., Shulman L.E. Histocompatibility antigens in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 1976; 19(2): 129-32.
5. Graham R.R., Ortmann W.A., Langefeld C.D., e outros Visualizing human
116 leukocyte antigen class II risk haplotypes in human systemic lupus erythematosus. Am. J. Hum. Genet. 2002; 71(3): 543-53.
6. Graham R.R., Ortmann W., Rodine P., e outros Specific combinations of HLA-DR2 and DR3 class II haplotypes contribute graded risk for disease susceptibility and autoantibodies in human SLE. Eur. J. Hum. Genet. 2007; 15(8): 823-30.
7. Sigurdsson S., Nordmark G., Goring H.H., e outros Polymorphisms in the tyrosine kinase 2 and interferon regulatory factor 5 genes are associated with systemic lupus erythematosus. Am. J. Hum. Genet. 2005; 76(3): 528-37.
8. Graham R.R., Kozyrev S.V., Baechler E.C., e outros A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRES) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus. Nat. Genet. 2006; 38(5): 550-55.
9. Graham R.R., Kyogoku C., Sigurdsson S., e outros Three functional vari- ants of IFN regulatory factor 5 (IRF5) define risk and protective haplotypes for human lupus. Proc. Natl. Acad. Sc/'. U.S.A. 2007; 104(16): 6.758-63.
10. Remmers E.F., Plenge R.M., Lee A.T., e outros STAT4 and the risk of rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. N. Engl. J. Med. 2007; 357(10): 977-86.
11. Ronnblom L., Alm G.V. A pivotal role for the natural interferon alphaproducing cells (plasmacytoid dendritic cells) in the pathogenesis of lupus. J. Exp. Med. 2001; 194(12): F59-63.
12. Baechler E.C., Gregersen P.K., Behrens T.W. The emerging role of interferon in human systemic lupus erythematosus. Curr. Opin. Immunol.
2004; 16(6): 801-07.
13. Banchereau J., Pascual V. Type I interferon in systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases. Immunity 2006; 25(3): 383-92.
14. Miyagi T., Gil M.P., Wang X., Louten J., Chu W.M., Biron C.A. High basal STAT4 balanced by STAT1 induction to control type 1 interferon effects in natural killer cells. J. Exp. Med. 2007; Publicação eletrônica; 10 de setembro.
15. A haplotype map of the human genome. Nature 2005; 437 (7063):
117
1.299-320.
16. Dewan A., Liu M., Hartman S., e outros HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science 2006; 314 (5801): 989-92.
17. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls. Nature 2007; 447 (7.145): 661-78.
18. Matarin M., Brown W.M., Scholz S., e outros A genome-wide genotyping study in patients with ischaemic stroke: initial analysis and data release. Lancet neurology 2007; 6(5): 41.420.
19. Moffatt M.F., Kabesch M., Liang L., e outros Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma. Nature 2007; 448 (7.152): 470-73.
20. Plenge R.M., Seielstad M., Padyukov L., e outros TRAF1-05 as a Risk Locus for Rheumatoid Arthritis -- A Genomewide Study. N. Engl. J. Med. 2007.
21. Saxena R., Voight B.F., Lyssenko V., e outros Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels. Science 2007; 316(5829): 1.331-36.
22. Scott L.J., Mohlke K.L., Bonnycastle L.L., e outros A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants. Science 2007; 316 (5.829): 134-145.
23. Scuteri A., Sanna S., Chen W.M., e outros Genome-Wide Association Scan Shows Genetic Variants in the FTO Gene Are Associated with ObesityRelated Traits. PLoS Genet 2007; 3 (7):e 115.
24. Pe'er I., de Bakker P.I., Mailer J., Yelensky R., Altshuler D., Daly M.J. Evaluating and improving power in whole-genome association studies using fixed marker sets. Nat. Genet. 2006; 38(6): 663-67.
25. Bauer J.W., Baechler E.C., Petri M., e outros Elevated serum levels of interferon-regulated chemokines are biomarkers for active human systemic lupus erythematosus. PLoS medicine 2006; 3 (12): e491.
26. Criswell L.A., Pfeiffer K.A., Lum R.F., e outros Analysis of families in the multiple autoimmune disease genetics consortium (MADGC) collection: the PTPN22 620W allele associates with multiple autoimmune phenotypes. Am.
118
J. Hum. Genet. 2005; 76 (4): 561-71.
27. Seligman V.A., Suarez C., Lum R., e outros The Fcgamma receptor 11IA158F allele is a major risk factor for the development of lupus nephritis among Caucasians but not non-Caucasians. Arthritis Rheum. 2001; 44 (3): 618-25.
28. Demirci F.Y., Manzi S., Ramsey-Goldman R., e outros Association of a common interferon regulatory factor 5 (IRF5) variant with increased risk of systemic lupus erythematosus (SLE). Ann. Hum. Genet. 2007; 71 (Pt 3): 308-11.
29. Hochberg M.C. Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 1997; 40 (9): 1725.
30. Mitchell M.K., Gregersen P.K., Johnson S., Parsons R., Vlahov D. The New York Cancer Project: rationale, organization, design, and baseline characteristics. J. Urban Health 2004; 81 (2): 301-10.
31. Gunderson K.L., Steemers F.J., Ren H., e outros Whole-genome genotyping. Methods Enzymol. 2006; 410: 359-76.
32. Hsu T.M., Chen X., Duan S., Miller R.D., Kwok P.Y. Universal SNP genotyping assay with fluorescence polarization detection. Biotechniques 2001; 31(3): 560.
33. Price A.L., Patterson N.J., Plenge R.M., Weinblatt M.E., Shadick N.A., Reich D. Principal components analysis corrects for stratification in genomewide association studies. Nat. Genet. 2006; 38 (8): 904-09.
34. Purcell S., Neale B., Todd-Brown K., e outros PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Am. J. Hum. Genet. 2007; 81 (3): 559-75.
35. Devlin B., Roeder K., Wasserman L. Genomic control for association studies: a semiparametric test to detect excess-haplotype sharing. Biostatistics 2000; 1 (4): 369-87.
36. Stranger B.E., Nica A.C., Forrest M.S., e outros Population genomics of human gene expression. Nat. Genet. 2007; 39 (10): 1.217-24.
37. Dixon A.L., Liang L., Moffatt M.F., e outros A genome-wide association
119 study of global gene expression. Nat. Genet. 2007; 39 (10): 1.202-7.
38. de Bakker P.I., McVean G., Sabeti P.C., e outros A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC. Nat. Genet. 2006; 38(10): 1.166-72.
39. Hirschhorn J.N., Daly M.J. Genome-wide association studies for common diseases and complex traits. Nature reviews 2005; 6 (2): 95-108.
40. Cheung V.G., Spielman R.S., Ewens K.G., Weber T.M., Morley M., Burdick J.T. Mapping determinants of human gene expression by regional and genome-wide association. Nature 2005; 437 (7.063): 1.365-69.
41. Dymecki S.M., Zwollo P., Zeller K., Kuhajda F.P., Desiderio SV. Structure and developmental regulation of the B-lymphoid tyrosine kinase gene blk. J. Biol. Chem. 1992; 267 (7): 4.815-23.
42. Wasserman R., Li Y.S., Hardy R.R. Differential expression of the blk and ret tyrosine kinases during B lineage development is dependent on Ig rearrangement. J. Immunol. 1995; 155 (2): 644-51.
43. Texido G., Su I.H., Mecklenbrauker L, e outros The B-cell-specific Srcfamily kinase Blk is dispensable for B-cell development and activation. Mol. Cell. Biol. 2000; 20 (4): 1.227-33.
44. Tsukada S., Saffran D.C., Rawlings D.J., e outros Deficient expression of a B cell cytoplasmic tyrosine kinase in human X-linked agammaglobulinemia. Cell 1993; 72 (2): 279-90.
45. Khan W.N., Alt F.W., Gerstein R.M., e outros Defective B cell development and function in Btk-deficient mice. Immunity 1995; 3 (3): 283-99.
46. Cornall R.J., Goodnow C.C. B cell antigen receptor signalling in the balance of tolerance and immunity. Novartis Foundation symposium 1998; 215:21-30.
47. Nemazee D., Weigert M. Revising B cell receptors. J. Exp. Med. 2000; 191 (11): 1.813-7.
48. Kumar K.R., Li L., Yan M., e outros Regulation of B cell tolerance by the lupus susceptibility gene Ly108. Science 2006; 312 (5.780): 1.665-9.
49. Abbas AR, Baldwin D, Ma Y, e outros Immune response in silico (IRIS): immune-specific genes identified from a compendium of microarray expres
120 sion data. Genes Immun. 2005; 6 (4): 319-31.
50. Hynes R.O. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell 1992; 69(1): 11-25.
51. Lu H., Smith C.W., Perrard J., e outros LFA-1 is sufficient in mediating neutrophil emigration in Mac-l-deficient mice. J. Clin. Invest. 1997; 99 (6): 1.340-50.
52. Dunne J.L., Collins R.G., Beaudet A.L., Ballantyne C.M., Ley K. Mac-1, but not LFA-1, uses intercellular adhesion molecule-1 to mediate slow leukocyte rolling in TNF-alphainduced inflammation. J. Immunol. 2003; 171 (11): 6.105-10 e Tabelas 1-6.
53. Hammerberg C., Katiyar S.K., Carroll M.C., Cooper K.D. Activated complement component 3 (C3) is required for ultraviolet induction of immunosuppression and antigenic tolerance. J. Exp. Med. 1998; 187 (7): 1.133-38.
54. Sohn J.H., Bora P.S., Suk H.J., Molina H., Kaplan H.J., Bora N.S. Tolerance is dependent on complement C3 fragment iC3b binding to antigenpresenting cells. Nat. Med. 2003; 9(2): 206-12.
55. Watts G.M., Beurskens F.J., Martin-Padura I., e outros Manifestations of inflammatory arthritis are critically dependent on LFA-1. J. Immunol. 2005; 174 (6): 3.668-75.
56. Ehirchiou D., Xiong Y., Xu G., Chen W., Shi Y., Zhang L. CD 11b facilitates the development of peripheral tolerance by suppressing Th17 differentiation. J. Exp. Med. 2007; 204 (7): 1.519-24.
57. Buyon J.P., Shadick N., Berkman R., e outros Surface expression of Gp 165/95, the complement receptor CR3, as a marker of disease activity in systemic Lupus erythematosus. Clin. Immunol. Immunopathol. 1988; 46 (1): 141-49.
58. Giglio S., Broman K.W., Matsumoto N., e outros Olfactory receptor-gene clusters, genomic- inversion polymorphisms, and common chromosome rearrangements. Am. J. Hum. Genet. 2001; 68 (4): 874-83.
59. Sugawara H., Harada N., Ida T., e outros Complex low-copy repeats associated with a common polymorphic inversion at human chromosome 8p23. Genomics 2003; 82 (2): 238-44.
121
Listagem de Referências
1. G. Hom e outros, N. Engl. J. Med. 358, 900 (2008).
2. J. W. Bauer e outros, PLoS Med 3, e491 (2006).
3. L. A. Criswell e outros, Am. J. Hum. Genet. 76, 561 (2005).
4. V. A. Seligman e outros, Arthritis Rheum. 44, 618 (2001).
5. E. F. Remmers e outros, N. Engl. J. Méd. 357, 977 (2007).
6. F. Y. Demirci e outros, Ann. Hum. Genet. 71, 308 (2007).
7. M. C. Hochberg, Arthritis Rheum. 40, 1.725 (1997).
8. Μ. Κ. Mitchell, Ρ. Κ. Gregersen, S. Johnson, R. Parsons, D. Vlahov, J. Urban Health 81,301 (2004).
9. S. Purcell e outros, Am. J. Hum. Genet. 81, 559 (2007).
10. A. L. Price e outros, Nat. Genet. 38, 904 (2006).
11. B. Devlin, K. Roeder, L. Wasserman, Biostatistics 1, 369 (2000).
12. R. R. Graham e outros, Arthritis research 3, 299 (2001).
13. M. C. Hochberg, Arthritis and Rheumatism 40, 1725 (1997).
14. C. Wellcome Trust Case Control, Nature 447, 661 (2007).
15. S. Purcell.
16. S. Purcell e outros, American Journal of Human Genetics 81, 559 (2007).
17. A. L. Price e outros, Nat. Genet. 38, 904 (2006).
. K. Hartung, Baur, M.P., Coldewey, R., Fricke, M., Kalden, J.R., Lakomek, H.J., Peter, H.H., Schendel, D., Schneider, P.M., Seuchter, S.A., Stangel, W„ Deicher, H.R.G., J. Clin. Invest. 90, 1.346 (1992).
19. Z. Yao e outros, Eur. J. Immunogenet. 20, 259 (1993).
20. Y. H. Lee e outros, Rheumatology (Oxford) 46, 49 (2007).
21. J. B. Harley e outros, Nat. Genet. 40, 204 (2008).
22. S. Sigurdsson e outros, Am. J. Hum. Genet. 76, 528 (2005).
23. R. R. Graham e outros, Nat. Genet. 38, 550 (2006).
24. S. K. Nath e outros, Nat. Genet. 40, 152 (2008).
25. C. Kyogoku e outros, Am. J. Hum. Genet. 75, 504 (2004).
26. J. B. Harley, K. L. Moser, P. M. Gaffney, T. W. Behrens, Curr. Opin. Immunol. 10, 690 (1998).
27. Μ. M. Fernando e outros, PLoS Genet. 3, e192 (2007).
122
28. R. R. Graham e outros, Proc. Natl. Acad Sci USA 104, 6.758 (2007).
29. D. S. Cunninghame Graham e outros, Nature Genetics 40, 83 (2008).
30. S. V. Kozyrev e outros, Nat. Genet. 40, 211 (2008).
31. T. Oishi e outros, J. Hum. Genet. 53, 151 (2008).
32. C. O. Jacob e outros, Arthritis Rheum. 56, 4.164 (2007).
33. J. C. Edberg e outros, Hum. Mol. Genet. 17, 1.147 (2008).
34. L. Prokunina e outros, Nat. Genet. 32, 666 (2002).
35. S. Paabo, Nature 421,409 (2003).
36. K. A. Frazer e outros, Nature 449, 851 (2007).
37. P. I. de Bakker e outros, Nat. Genet. 37, 1.217 (2005).
38. J. Mailer e outros, Nat. Genet. 38, 1.055 (2006).
39. G. Lettre e outros, Nat. Genet. 40, 584 (2008).

Claims (30)

1. Método para avaliar se um indivíduo está sob risco de desenvolvimento de lúpus, caracterizado pelo fato de que compreende
a) a detecção em uma amostra biológica obtida do indivíduo da presença de uma assinatura genética indicativa do risco de desenvolvimento de lúpus, em que a referida assinatura genética compreende a presença de um alelo de timidina (T) de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) rs7574865 na posição 11 da SEQ ID NO:1; e
b) determinar que o indivíduo está sob risco para o desenvolvimento de lúpus quando a assinatura genética está presente.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a assinatura genética compreende ainda um ou mais do grupo consistindo em:
a presença de um alelo de citosina (C) do SNP rs10488631 na posição 11 da SEQ ID NO:2, a ausência de um alelo de timidina (T) do SNP rs4963128 na posição 11 da SEQ ID NO:3, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs2269368 na posição 11 da SEQ ID NO:4, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs5754217 na posição 11 da SEQ ID NO:5, a ausência de um alelo de adenosina (A) do SNP rs1801274 na posição 11 da SEQ ID NO:6, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs9888739 na posição 11 da SEQ ID NO:7, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs6568431 na posição 11 da SEQ ID NO:8, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs3129860 na posição 11 da SEQ ID NO:9, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs2187668 na posição 11 da SEQ ID NO:10, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs13277113
Petição 870190078213, de 13/08/2019, pág. 6/21 na posição 11 da SEQ ID NO:11, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs2476601 na posição 11 da SEQ ID NO:12, a ausência de um alelo de adenosina (A) do SNP rs10516487 na posição 11 da SEQ ID NO:13, a presença de um alelo de citosina (C) do SNP rs10489265 na posição 11 da SEQ ID NO:14, a presença de um alelo de guanina (A) do SNP rs6445975 na posição 11 da SEQ ID NO:15, e a ausência de um alelo de citosina (C)do SNP rs2431697 na posição 11 da SEQ ID NO:16.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a assinatura genética compreende ainda a presença de um alelo adenosina (A) do SNP rs1143679 na posição 11 da SEQ ID NO:17.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a assinatura genética compreende ainda a ausência de um alelo de timidina (T) do SNP rs4963128 na posição 11 da SEQ ID NO:3 e a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs2269368 na posição 11 da SEQ ID NO:4.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a assinatura genética compreende ainda um ou mais do grupo consistindo em:
a presença de um alelo de citosina (C) do SNP rs10488631 na posição 11 da SEQ ID NO:2, a ausência de um alelo de timidina (T) do SNP rs4963128 na posição 11 da SEQ ID NO:3, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs2269368 na posição 11 da SEQ ID NO:4, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs5754217 na posição 11 da SEQ ID NO:5, a ausência de um alelo de adenosina (A) do SNP rs1801274 na posição 11 da SEQ ID NO:6, e
Petição 870190078213, de 13/08/2019, pág. 7/21 a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs1143679 na posição 11 da SEQ ID NO:17.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a assinatura genética compreende ainda um ou mais do grupo consistindo em:
a ausência de um alelo de timidina (T) do SNP rs4963128 na posição 11 da SEQ ID NO:3, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs2269368 na posição 11 da SEQ ID NO:4, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs5754217 na posição 11 da SEQ ID NO:5, a ausência de um alelo de adenosina (A) do SNP rs1801274 na posição 11 da SEQ ID NO:6, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs6568431 na posição 11 da SEQ ID NO:8, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs2476601 na posição 11 da SEQ ID NO:12, e a ausência de um alelo de adenosina (A) do SNP rs10516487 na posição 11 da SEQ ID NO:13.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a assinatura genética compreende ainda:
a ausência de um alelo de timidina (T) do SNP rs4963128 na posição 11 da SEQ ID NO:3, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs2269368 na posição 11 da SEQ ID NO:4, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs5754217 na posição 11 da SEQ ID NO:5, a ausência de um alelo de timidina (T) do SNP rs1801274 na posição 11 da SEQ ID NO:6, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs6568431 na posição 11 da SEQ ID NO:8, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs2476601 na
Petição 870190078213, de 13/08/2019, pág. 8/21 posição 11 da SEQ ID NO:12, e a ausência de um alelo de adenosina (A) do SNP rs10516487 na posição 11 da SEQ ID NO:13.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende a realização de um processo selecionado de um ensaio de extensão de iniciador; um ensaio de extensão de iniciador alelo-específico; um ensaio de incorporação de nucleotídeo alelo-específico; um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo alelo-específico; um ensaio de nuclease 5'; um ensaio que emprega sinalizadores moleculares; e um ensaio de ligação de oligonucleotídeo.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende a realização de um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo alelo-específico.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende a realização de um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo alelo-específico.
11. Método de diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende
a) a detecção em uma amostra biológica obtida a partir do indivíduo da presença de uma assinatura genética indicativa do risco de desenvolvimento de lúpus, em que a referida assinatura genética compreende a presença de um alelo de timidina (T) de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) rs7574865 na posição 11 da SEQ ID NO:1; e
b) o diagnóstico ou prognóstico de lúpus no indivíduo quando a assinatura genética está presente.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a assinatura genética compreende ainda um ou mais do grupo consistindo em:
a presença de um alelo de citosina (C) do SNP rs10488631 na posição 11 da SEQ ID NO:2, a ausência de um alelo de timidina (T) do SNP rs4963128 na posição 11 da SEQ ID NO:3,
Petição 870190078213, de 13/08/2019, pág. 9/21 a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs2269368 na posição 11 da SEQ ID NO:4, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs5754217 na posição 11 da SEQ ID NO:5, a ausência de um alelo de adenosina (A) do SNP rs1801274 na posição 11 da SEQ ID NO:6, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs9888739 na posição 11 da SEQ ID NO:7, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs6568431 na posição 11 da SEQ ID NO:8, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs3129860 na posição 11 da SEQ ID NO:9, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs2187668 na posição 11 da SEQ ID NO:10, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs13277113 na posição 11 da SEQ ID NO:11, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs2476601 na posição 11 da SEQ ID NO:12, a ausência de um alelo de adenosina (A) do SNP rs10516487 na posição 11 da SEQ ID NO:13, a presença de um alelo de citosina (C) do SNP rs10489265 na posição 11 da SEQ ID NO:14, a presença de um alelo de guanina (A) do SNP rs6445975 na posição 11 da SEQ ID NO:15, e a ausência de um alelo de citosina (C) do SNP rs2431697 na posição 11 da SEQ ID NO:16.
13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a assinatura genética compreende ainda a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs1143679 na posição 11 da SEQ ID NO:17.
14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a assinatura genética compreende ainda a ausência de um alelo de timidina (T) do SNP rs4963128 na posição 11 da SEQ ID NO:3 e a
Petição 870190078213, de 13/08/2019, pág. 10/21 presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs2269368 na posição 11 da SEQ ID NO:4.
15. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a assinatura genética compreende ainda um ou mais do grupo consistindo em:
a presença de um alelo de citosina (C) do SNP rs10488631 na posição 11 da SEQ ID NO:2, a ausência de um alelo de timidina (T) do SNP rs4963128 na posição 11 da SEQ ID NO:3, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs2269368 na posição 11 da SEQ ID NO:4, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs5754217 na posição 11 da SEQ ID NO:5, a ausência de um alelo de adenosina (A) do SNP rs1801274 na posição 11 da SEQ ID NO:6, e a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs1143679 na posição 11 da SEQ ID NO:17.
16. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a assinatura genética compreende ainda um ou mais do grupo consistindo em:
a ausência de um alelo de timidina (T) do SNP rs4963128 na posição 11 da SEQ ID NO:3, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs2269368 na posição 11 da SEQ ID NO:4, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs5754217 na posição 11 da SEQ ID NO:5, a ausência de um alelo de adenosina (A) do SNP rs1801274 na posição 11 da SEQ ID NO:6, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs6568431 na posição 11 da SEQ ID NO:8, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs2476601 na posição 11 da SEQ ID NO:12, e
Petição 870190078213, de 13/08/2019, pág. 11/21 a ausência de um alelo de adenosina (A) do SNP rs10516487 na posição 11 da SEQ ID NO:13.
17. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a assinatura genética compreende ainda:
a ausência de um alelo de timidina (T) do SNP rs4963128 na posição 11 da SEQ ID NO:3, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs2269368 na posição 11 da SEQ ID NO:4, a presença de um alelo de timidina (T) do SNP rs5754217 na posição 11 da SEQ ID NO:5, a ausência de um alelo de timidina (T) do SNP rs1801274 na posição 11 da SEQ ID NO:6, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs6568431 na posição 11 da SEQ ID NO:8, a presença de um alelo de adenosina (A) do SNP rs2476601 na posição 11 da SEQ ID NO:12, e a ausência de um alelo de adenosina (A) do SNP rs10516487 na posição 11 da SEQ ID NO:13.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende a realização de um processo selecionado de um ensaio de extensão de iniciador; um ensaio de extensão de iniciador alelo-específico; um ensaio de incorporação de nucleotídeo alelo-específico; um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo alelo-específico; um ensaio de nuclease 5'; um ensaio que emprega sinalizadores moleculares; e um ensaio de ligação de oligonucleotídeo.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende a realização de um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo alelo-específico.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende a realização de um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo alelo-específico.
21. Kit para avaliar se um indivíduo está sob risco de desenvol
Petição 870190078213, de 13/08/2019, pág. 12/21 vimento de lúpus pelo o método como definido na reivindicação 1, ou para diagnosticar ou prognosticar lúpus num indivíduo pelo método como definido na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma enzima e uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de SEQ ID NO:1 com uma timidina (T) na posição 11.
22. Kit de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a composição compreende uma ou mais molécula(s) de ácido nucleico do grupo consistindo em:
uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 2 com uma citosina (C) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 3 com uma timidina (T) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 4 com uma timidina (T) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 5 com uma timidina (T) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 6 com uma adenosina (A) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 7 com uma timidina (T) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 8 com uma adenosina (A) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 9 com uma adenosina (A) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 10 com uma timidina (T) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 11 com uma adenosina (A) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 12 com uma adenosina (A) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 13 com uma adenosina (A) na posição 11,
Petição 870190078213, de 13/08/2019, pág. 13/21 uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 14 com uma citosina (C) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 15 com uma guanina (A) na posição 11, e uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 16 com uma citosina (C) na posição 11.
23. Kit de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 17 com uma adenosina (A) na posição 11.
24. Kit de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 3 com uma timidina (T) na posição 11, e uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 4 com uma timidina (T) na posição 11.
25. Kit de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda uma ou mais molécula(s) de ácido nucleico do grupo consistindo em:
uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 2 com uma citosina (C) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 3 com uma timidina (T) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 4 com uma timidina (T) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 5 com uma timidina (T) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 6 com uma adenosina (A) na posição 11, e uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 17 com uma adenosina (A) na posição 11.
26. Kit de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais molécula(s) de ácido nucleico do grupo consistindo em:
Petição 870190078213, de 13/08/2019, pág. 14/21 uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 3 com uma timidina (T) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da
SEQ ID NO: 4 com uma timidina (T) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 5 com uma timidina (T) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da
SEQ ID NO: 6 com uma adenosina (A) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da
SEQ ID NO: 8 com uma adenosina (A) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 12 com uma adenosina (A) na posição 11, e uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 13 com uma adenosina (A) na posição 11.
27. Kit de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 3 com uma timidina (T) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da
SEQ ID NO: 4 com uma timidina (T) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 5 com uma timidina (T) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da
SEQ ID NO: 6 com uma adenosina (A) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da
SEQ ID NO: 8 com uma adenosina (A) na posição 11, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 12 com uma adenosina (A) na posição 11, e uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 13 com uma adenosina (A) na posição 11.
28. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 27, caracterizado pelo fato de que a enzima é uma polimerase.
Petição 870190078213, de 13/08/2019, pág. 15/21
29. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 27, caracterizado pelo fato de que a enzima é uma ligase.
30. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 27, caracterizado pelo fato de que a(s) molécula(s) de ácido nucleico é(são) ca-
5 da uma ligada(s) a um marcador.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX343167B (es) * 2007-05-21 2016-10-26 Genentech Inc * Metodos y composiciones para identificar y tratar lupus.
JP2012503985A (ja) * 2008-09-26 2012-02-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド ループスの治療、診断、モニタリング方法
US20100105061A1 (en) * 2008-10-29 2010-04-29 University Of Southern California Autoimmune genes identified in systemic lupus erythematosus (sle)
AU2010220397A1 (en) * 2009-03-03 2011-07-28 Merck Serono S.A. BANK1 related SNPS and SLE and/or MS susceptibility
KR101953075B1 (ko) * 2009-10-07 2019-02-27 제넨테크, 인크. 루푸스의 치료, 진단 및 모니터링 방법
RU2570390C2 (ru) * 2010-03-01 2015-12-10 Алексион Фармасьютикалз Инк. Способы и композиции для лечения болезни дего
US20140112913A1 (en) * 2011-02-10 2014-04-24 Genqual Corporation Methods of prognosing and administering treatment for inflammatory disorders
US20130317006A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Amy Yasko Use of polymorphisms for identifying individuals at risk of developing autism
WO2015081052A1 (en) 2013-11-27 2015-06-04 Yasko Amy Use of polymorphisms for identifying individuals at risk of developing autism
JP2018518203A (ja) * 2015-06-24 2018-07-12 オックスフォード バイオダイナミックス リミテッド エピジェネティックな染色体相互作用
CN110459312B (zh) * 2018-05-07 2024-01-12 深圳华大生命科学研究院 类风湿性关节炎易感位点及其应用
EP4076671A4 (en) * 2019-12-18 2024-04-17 Childrens Hospital Philadelphia NOVEL PHARMACOPOTENTIAL TARGETS FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES SUCH AS SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSOS (SLE) AND METHODS OF DIAGNOSIS AND TREATMENT USING THE SAME
KR20240021336A (ko) 2022-08-09 2024-02-19 심재홍 수액 채취장치의 냉각기 구조

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4657760A (en) * 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683203A (en) 1984-04-14 1987-07-28 Redco N.V. Immobilized enzymes, processes for preparing same, and use thereof
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
IE61148B1 (en) 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
US5661016A (en) * 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) * 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5633425A (en) * 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
KR100654645B1 (ko) 1995-04-27 2007-04-04 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2255774C (en) 1996-05-29 2008-03-18 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
KR20080059467A (ko) 1996-12-03 2008-06-27 아브게닉스, 인크. 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체
JP2004507226A (ja) 2000-05-30 2004-03-11 ピーイー　コーポレイション　（エヌワイ） ライゲーションおよび増幅の組み合わせを用いて標的核酸を検出するための方法
US6900016B1 (en) 2000-09-08 2005-05-31 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with inflammatory autoimmune disease, methods of detection and uses thereof
US20070037144A1 (en) 2000-10-20 2007-02-15 Jay Wohlgemuth Leukocyte expression profiling
US7205106B1 (en) * 2001-07-20 2007-04-17 Roche Molecular Systems, Inc. Association of polymorphisms in IL4-related genes with autoimmune disease
JP2003061677A (ja) * 2001-08-28 2003-03-04 Olympus Optical Co Ltd 全身性エリテマトーデスの感受性遺伝子およびその使用
US20030119004A1 (en) 2001-12-05 2003-06-26 Wenz H. Michael Methods for quantitating nucleic acids using coupled ligation and amplification
US7022476B2 (en) * 2002-02-26 2006-04-04 New York Society For Ruptured And Crippled Maintaining The Hospital For Special Surgery Human FcγRIIB gene polymorphisms for assessing development of systemic lupus erythematosus and compositions for use thereof
MXPA04008477A (es) * 2002-03-01 2005-10-26 Ravgen Inc Metodos para deteccion de trastornos geneticos.
WO2004083403A2 (en) * 2003-03-18 2004-09-30 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with rheumatoid arthritis, methods of detection and uses thereof
WO2005086872A2 (en) * 2004-03-10 2005-09-22 Celera, An Applera Corporation Business Ptpn22 polymorphisms in diagnosis and therapy
WO2006097463A2 (en) * 2005-03-15 2006-09-21 Ares Trading S.A. Compositions and methods for treating and diagnosing inflammatory disorders
PT2327792E (pt) 2005-08-05 2013-11-21 Genentech Inc Métodos e composições para a detecção de distúrbios autoimunes
US20070269827A1 (en) * 2006-05-18 2007-11-22 Oklahoma Medical Research Foundation Predicting and Diagnosing Patients With Autoimmune Disease
MX343167B (es) * 2007-05-21 2016-10-26 Genentech Inc * Metodos y composiciones para identificar y tratar lupus.
JP2012503985A (ja) * 2008-09-26 2012-02-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド ループスの治療、診断、モニタリング方法

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