JP2016537967A - 哺乳動物の網膜幹細胞の生産方法及び適用 - Google Patents
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Abstract
Description
単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)を生産する方法
本発明は、単離された哺乳動物pRSCsを生産するためのin vitro方法を提供する。本発明の方法の利点は、細胞移植又はグラフティングの前に細胞分画又は細胞精製の必要なしに、被験体の眼への細胞移植又はグラフティングに好適であるのに十分な量及び質の単離された哺乳動物原始的網膜幹細胞を生産できることを含む。
一実施形態では、補充物(複数可)あり又はなしの1つ以上の規定された培地は、以下を含む: DMEM/F12若しくは同等の培地; グルタミン若しくはL-アラニル-L-グルタミン(GlutaMAX(登録商標)); StemPro(登録商標) hESC補充物若しくは同等物; ウシ血清アルブミン若しくは同等物; 塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF-塩基性)若しくは同等物; 並びに2-メルカプトエタノール若しくは同等物。
本発明はさらに、単離された哺乳動物の網膜神経節細胞(RGCs)を生産するためのin vitro方法を提供する。この方法は、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された原始的網膜幹細胞(pRSCs)を培養し、単離pRSCsの単層培養物を生産し、増殖させるステップ、及び単離pRSCsの培養物を、Wnt、Notch、又はVEGFRシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、単離pRSCsを単離哺乳動物RGCsに分化させるステップを含む。一実施形態では、細胞は、固体支持体上で培養され得る。固体支持体は、例えばMatrigel(登録商標)又は基底膜又は同等物で被覆され得る。Matrigel(登録商標)又は基底膜は、増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)又は増殖因子が低減された基底膜であってもよい。本発明の一実施形態では、細胞は、2週間を超えて培養され、成長及び増殖させてもよい。
本発明はまた、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まないin vitroにおける化学的に規定された条件下で、単離哺乳動物pRSCsから単離哺乳動物光受容細胞を生産する方法であって、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子を補充した神経誘導培地中で、哺乳動物由来の解離されたpRSCsを培養し、増殖させるステップを含む、方法を提供する。例えば、十分な時間、神経誘導培地中で、解離されたpRSCsを培養し、増殖させるステップは、目に見える形態的変化又は光受容細胞特異的マーカーの発現なしに、pRSCsを光受容細胞系列の運命に誘導し得る。一実施形態では、細胞は、固体支持体上で培養され得る。固体支持体は、例えばMatrigel(登録商標)又は基底膜又は同等物で被覆され得る。Matrigel(登録商標)又は基底膜は、増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)又は増殖因子が低減された基底膜であってもよい。本発明の一実施形態では、細胞は、約6日間培養され、成長及び増殖させてもよい。
本発明はさらに、フィーダー細胞又はフィーダー馴化培地を含まない、in vitroにおける単離された哺乳動物pRSCsから非神経の単離された哺乳動物の網膜色素上皮(RPE)を生産する方法を提供する。場合により、この方法は、フィーダー細胞及びフィーダー馴化培地を含まない、in vitroにおける単離された哺乳動物pRSCsから単離された哺乳動物の網膜色素上皮細胞(RPEs)を得るために使用し得る。本発明の一実施形態では、この方法は、ニコチンアミド若しくは同等物、又はアクチビンA若しくは同等物、又はその両方を補充したRPE誘導培地中で哺乳動物に由来するpRSCsの単層を培養するステップ、及び続いて、N1培地補充物若しくは同等物、タウリン若しくは同等物、ヒドロコルチゾン若しくは同等物、又はトリヨードサイロニン若しくは同等物を補充した培養培地中でpRSCsを培養し、哺乳動物pRSCsを、フィーダー細胞又はフィーダー馴化培地を含まずに、in vitroにおいて単離された哺乳動物のpRSCから哺乳動物RPE又はRPEsに分化させるステップを含む。例えば、哺乳動物pRSCsは、pRSCsをRPE運命に向かって方向付けるために十分な時間、SMADシグナル伝達阻害の非存在下で、ニコチンアミド又はアクチビンA又はその両方を有する培地中で培養されてよい。
本発明はさらに、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない、in vitroにおける規定された細胞培養条件下で、単離されたヒト胚性幹細胞(hESCs)、単離されたヒト多能性幹細胞(hPSCs)、又は単離されたヒト人工多能性幹細胞(iPSCs)から、単離されたヒトの原始的網膜幹細胞(hpRSCs)を生産する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清の非存在下で、StemPro hESC SFM培地(Invitrogen)又はその同等物中で、増殖因子が低減されたMatrigel(BD Bioscience)又はその同等物で被覆された固体支持体上で、コンフルエント近くまで、好ましくは約80%の細胞コンフルエンスまで、単離hESCs、単離hPSCs、又は単離ヒトiPSCsを培養するステップ、(b)ほぼコンフルエントに増殖するために十分な時間、塩基性FGF(bFGF)を補充したプライミング培地中で培養するステップ、(c)Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の小分子阻害剤の組み合わせを補充したプライミング培地中で培養し、単離hESCs、単離hPSCs、又は単離ヒトiPSCsを単離ヒト原始的網膜幹細胞に分化させるステップを含む。
本発明はさらに、被験体から、哺乳動物の原始的網膜幹細胞(hpRSCs)、より分化した網膜始原細胞、網膜ニューロン、網膜神経節細胞、光受容細胞前駆細胞、又は網膜色素上皮(RPE)を生成する方法であって、該被験体由来の人工多能性幹細胞(iPSC)の生産、及び本発明の方法によるiPSCからのpRSCsの生成、及び/又は追加的に本発明の方法による分化のさらなる誘導を必要とする方法を提供する。
本発明はさらに、それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、患者の眼に、原始的網膜幹細胞、網膜神経節細胞、光受容細胞、網膜色素上皮細胞及び/又はそれらの組合せを投与することを含む方法を提供する。原始的網膜幹細胞、網膜神経節細胞、光受容細胞、網膜色素上皮細胞は、被験体における網膜変性を治療するために十分な量で投与されてよく、本発明の方法によって生産されてよい。
本発明はさらに、ヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)、ヒト原始的網膜神経節細胞(hpRGCs)、ヒト光受容細胞又はヒト網膜色素上皮細胞(hRPEs)の、必要とする患者又は被験体への送達方法であって、例えばBSS/HAMC(約0.5/0.5% w/w)ヒドロゲル溶液中の、hpRSCs、hpRGCs、ヒト光受容細胞又はhRPEsの単一細胞懸濁液が、被験者の網膜下腔に投与される、方法を提供する。
本発明は、本発明の方法によって生産された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(hpRSCs)と好適な担体とを含む組成物を提供する。
方法
細胞培養及び分化
ヒト胚性幹細胞、H9(WA9, WiCell)及びHuES9(http://grants.nih.gov/stem_cells/registry/current.htm?id=40)(継代25〜40)を、増殖因子が低減されたMatrigel(BD Biosciences)で被覆されたプレート上で、StemPro hESC SFM培地(Invitrogen)中でフィーダーフリーの、無血清条件下で培養した。ヒト初代胎児網膜始原細胞を、インフォームドコンセント及びIRB承認を持って得られた17週のヒト胎児網膜から単離し、以前45に記載された手順に従って培養した。未分化hESCsが培養において約80%コンフルエンスに達した後、培地を、20ng/ml bFGFを補充した無血清N2B27プライミング培地(DMEM/F12、N2、B27、0.2% BSA、2mM L-GlutaMAX、0.1mM MEM非必須アミノ酸、及び0.1mM β-メルカプトエタノール)に1〜2日間切り替えた。hESCsのほぼコンフルエントな単層培養物を、小分子阻害剤(5μM SB431542、50nM LDN193189、及び1μM IWP2)を補充したN2B27プライミング培地中でさらに培養した。培地を、6日間毎日変えた。hESC由来のhpRSCsは、この無血清の阻害剤を補充したプライミング培地中で維持し、増殖させてもよい。hpRSCsからRGC分化を誘導するために、細胞を、1μM IWP2、10μM DAPT、及び200nM PD173074を含む小分子阻害剤の新しい組み合わせを補充したプライミング培地中で2週を超えて培養した。光受容細胞前駆細胞の分化のために、解離したhpRSCsを、Matrigel被覆プレート上に播種し、以前18に記載されたように、かつ1μM IWP2、10μM DAPT、及び100nM プルモルファミンを補充した神経誘導培地中で6日間培養した。その後、培養物を、500nM レチノイン酸及び100μM タウリンを補充した神経誘導培地にさらに1週間シフトさせた。RPE分化のために、10mM ニコチンアミド及び100ng/ml アクチビンAを補充したRPE誘導培地(GMEM、10% ノックアウト血清代替物(knockout serum replacement)、0.1mM MEM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、及び0.1mM β-メルカプトエタノール)を、hpRSCsの単層培養物に1週間添加した。その後、RPE前駆細胞を、N1及びTHT(タウリン、ヒドロコルチゾン、トリヨードサイロニン)46を補充した、MEM改変培地、5%ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、0.1mM MEM非必須アミノ酸、及び1mM ピルビン酸ナトリウムからなる、RPE培地中で成熟させた。
全RNAをRNeasyキット(Qiagen)を用いて細胞から抽出し、cDNAをiScript cDNA合成キット(Bio-Rad)を用いて逆転写した(両者とも製造業者の説明書に従った)。転写産物を、40サイクル増幅し、それらのレベルを、遺伝子特異的プライマー(表1)及びPower SYBR Green PCRマスターミックスを用いて、7500リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)で定量した。測定を3重で実施し、β-アクチンレベルに対して正規化した。
この研究で作製された遺伝子発現データ(hfRPC及びhpRSC)、GEOデータベース47から得られた遺伝子発現データ(HuES9、GSM100174848)を正規化し、Cluster3.0/Tree Viewソフトウェアパッケージ49を使用して平均連結階層的クラスタリング(average linkage hierarchical clustering)に供した。最高発現及び最低発現を有するサンプル間の最小log2=1.5の距離に基づいて、4359個の遺伝子を用いた。サンプル間の総距離(類似性)を、非中心(uncentered)ピアソン相関係数として算出した。ヒートマップにおける各遺伝子について、赤色及び青色は、それぞれ、他の細胞と比較した高発現及び低発現を示す。個々の経路の分析について、TGFβスーパーファミリー、Wnt経路、Notch経路、hESC多能性、ヘッジホッグ経路、及びFGF経路における遺伝子のサブセットを、以前の研究50〜54に基づいて選択した。クラスタリングを、遺伝子のそれぞれのサブセットを用いて同じパラメータを用いて別々に行った。
細胞を、4%パラホルムアルデヒドで20分間固定し、0.3%トリトンX-100-PBSで5分間2回透過処理し、5%正常ロバ血清及び0.3%トリトンX-100%を含むPBS溶液中でブロッキングし、続いて、4℃で一次抗体溶液中で一晩インキュベートした。PBS中で3回洗浄した後、細胞をAlexa蛍光結合二次抗体と共にさらに90分間インキュベートした。PBS中ですすぎ、洗浄した後、細胞核を、100ng/ml ヘキスト33342で10分間対比染色した。一次抗体及びそれらの作業希釈液は以下の通りであった: ヒツジ抗ChxlO(1:300、Exalpha)、ウサギ抗Pax6(1:600、Covance)、ヤギ抗Lhx2(1:200、Santa Cruz)、ウサギ抗リカバリン(1:2000、Millipore)、マウス抗ロドプシン(1:250、Millipore)、ウサギ抗赤/緑オプシン(1:300、Millipore)、ヤギ抗OPN1SW(1:300、Santa Cruz)、及びウサギ抗GFP(1:1000、Invitrogen)若しくはニワトリ抗GFP(1:400、Invitrogen)。マウス抗HSA抗体は、ヒト特異的マーカーTRA-1-85(1:100、R&D Systems)、ヒト核抗原(1:300、Millipore)、及びヒトミトコンドリア(1:100、Millipore)に対するモノクローナル抗体の混合物である。使用した二次抗体は、対応するAlexa-488、-555、-633、又は-647蛍光標識抗体(1:1000、Invitrogen)であった。標識された細胞を、レーザー走査共焦点顕微鏡(Olympus)を用いて画像化した。各抗体の特異的免疫反応性を、同じ条件下で、陽性対照として適当な網膜組織を用いた免疫染色によって確認した。
ラットの眼への網膜下移植は、以前55に記載された方法から適合させた。簡単に述べると、hpRSCsを、StemPro Accutase(Invitrogen)を用いて単一細胞に解離させ、平衡塩溶液(BSS、Alcon)のみ、又はBSS/HAMC(0.5/0.5% w/w)ヒドロゲル溶液56のいずれかにおいて5×104/μLの密度まで濃縮した。HAMCヒドロゲル溶液を調製するために、ヒアルロン酸ナトリウム(HA、1400〜1800kDa、製薬グレード150、Novamatrix)を、0.1% w/vにて水(HyClone、細胞培養グレード、Thermo Scientific)に溶解させ、0.22μmのチューブトップバキュームフィルター(Corning)を通して濾過することによって、滅菌した。次いで、溶液を、0.22μmのPVDFフィルター(Millex GV、Millipore)でチューブを覆うことにより滅菌条件下で凍結乾燥した。メチルセルロース(MC、100kDa、Methocel A4M Premium、Dow Chemical)を、氷浴中で攪拌することにより、0.3% w/vで水に溶解し、その後、HAと同様に、滅菌濾過し、凍結乾燥した。滅菌HA及びMC粉末を、バイオセーフティーキャビネット内でBSSに再懸濁し(例えば、0.5%/0.5%HAMCについて、30mg HA及び30mg MCを6mL BSS中に溶解する)、次いで懸濁液をボルテックスし、4℃に一晩置いて可溶化させ、使用前に再度ボルテックスした。ガラスマイクロピペットを用いて、懸濁液中の1〜2μlのhpRSCs(5〜10×104細胞)を、ヌードラット又はRCSラットのいずれかの網膜下腔にゆっくり注入した。移植後の異なる時点に、動物を屠殺し、眼を摘出し、組織凍結媒体中に包埋し、凍結切片にし(cryoslice)、上に記載したように共免疫染色した。動物の処置は、カリフォルニア大学サンディエゴ校の施設内動物管理使用委員会の承認を得て、その監督の下で行った。
小分子を用いた、hESCsからのhpRSCsの誘導
脊椎動物の胚発生の初期段階の間、眼領域特定化(eye field specification)が、Wnt及びBMPシグナル伝達勾配の影響下で誘導される16、17。以前の研究は、Wntシグナル伝達の勾配が初期発生時に前脳及び中脳のアイデンティティの確立に重要であることを示している。Wntシグナル伝達の下方制御は、眼領域が存在する前脳の形成をもたらす。したがって、強力なWnt阻害剤であるDkk1、及びBMPアンタゴニストであるノギンでの、hESC由来胚様体の処理は、眼領域の発生を促進する3、19。加えて、SB431542(トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の選択的かつ強力な阻害剤)及びLDN193189(BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の選択的阻害剤、ノギンアナログ)への曝露による二重のSMAD阻害の下で、hESCsは、PAX6及びLHX2を強く発現する前脳/眼領域の前駆体となる可能性がある20、21。したがって、本発明者らは、小分子阻害剤IWP2(Inhibitor of Wnt Production-2、Dkk1アナログ)22、LDN193189、及びSB431542(以後、それぞれ、IWP、LDN、及びSBと称する)を用いた、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害の下で、hESCsのhpRSCsへの分化を誘導するための化学的に規定された培養プロトコールを開発した。多能性hESCsを、Matrigel被覆プレート上に播種し、フィーダーフリーかつ無血清条件下でコンフルエンス近くまで培養した。その後、培養物を、IWP-LDN-SB小分子カクテルを補充したhpRSCプライミング培地に1週間切り替えた。この処理の下で、hESCsの大部分は、密に詰まった細胞に変換された。hpRSCsの大規模な誘導が、重要な初期の眼領域転写因子の免疫細胞化学的標識によって確認された3、23。細胞の90%超が、眼領域始原細胞によって発現される2つの重要な転写因子であるPAX6及びLHX2の両方について陽性であった(図1b)。大部分のhESC由来hpRSCsはまた、原始的神経上皮幹細胞の典型的なマーカーであるネスチンを発現した(図1c)。加えて、hESC由来hpRSCsは、Ki67の強発現によって証明されるように、増殖活性を保持した(図1c)。hpRSCsの誘導は、PAX6、RX、LHX2、SIX3、及びSIX6を含む典型的な初期の眼領域転写因子遺伝子の発現を評価するためのリアルタイムPCRによってさらに確認された。本発明者らは、誘導の6日後に、hpRSCsにおけるこれらの網膜始原細胞マーカーの20倍〜1200倍を超える増加した発現を見出した(図1d)。これらの遺伝子の発現レベルは、培養中に少なくとも2回の継代にわたって維持された。
hpRSCアイデンティティーの全体的な見解を得て、その親細胞、未分化hESC、及びよりコミット(commit)した網膜始原細胞と比較したその分子的特徴を調べるために、本発明者らは、マイクロアレイによって、hpRSCトランスクリプトームを、hESCs、及びヒトの17週胎児網膜始原細胞(hfRPCs)のものと比較した。データは、hpRSCsが、多能性hESCsから神経網膜運命に拘束されたhfRPCsへの分化過程内の過渡的な状態にあることを示した(図2a)。重要なhESC多能性転写因子、例えばPOU5F1(OCT4)、NANOG、KLF4、及びTBX3の顕著な下方制御がhpRSCsで観察された。興味深いことに、胚性幹細胞における幹細胞性だけでなく、いくつかの組織系統を規定する2つの転写因子である24〜26、LIN28及びSALL4は、hESCsにおけるのと同様のレベルでhpRSCsにおいて発現されたが、hfRPCsでは顕著に低減したレベルで発現された(図2b、e)。さらに、上昇したSOX2発現はhpRSCsでのみ検出され(図2b)、hpRSCsの原始的神経外胚葉状態を示す27。眼領域形成に関連した公知の分子的特徴と一致して23、hpRSCsは、TGF-βスーパーファミリーにおけるいくつかの遺伝子、例えばSMAD1、SMAD2、TGFβ3、BMP3、BMP6、TGFBR1、及びBMPR1Bの低下した発現を示した(図2c)。注目すべきことに、in vivoにおいてRPE発生に十分かつ不可欠である28、BMP4及びBMP7は、hpRSCsにおいて、hfRPCsにおけるよりも高い発現レベルを有した。以前の研究17、29と一致して、眼領域では通常抑制されているが、後方の境界を越えて上昇するWNT4及びWNT11の発現は、hpRSCsにおいて減少した(図2d)。同様に、眼領域形成において重要であることが知られている30、SRFP1(内因性Wnt阻害物質)及びFZD3/5(Wntシグナル伝達タンパク質の受容体)は、hpRSCsで強く発現された(図2d)。さらに、hpRSC及びhfRPCトランスクリプトームのペアワイズ比較分析は、眼領域特定化の間のhpRSCsの過渡的状態を確認した。OTX2、RAX、LHX2、SIX3、及びSIX6を含む典型的な初期の眼領域転写因子遺伝子のセットは、全て、網膜形成(retinogenesis)を通じて活性なままであるPAX6を除いて、hpRSCsにおいて、hfRPCsにおけるよりも顕著に発現された(図2e)。網膜神経形成を促進することが知られている31、FGFR1/2/3及びFGF3/8を含めた、FGFシグナル伝達経路のメンバーの下方制御も観察され(図7a)、hpRSCsはRPE又は神経網膜となるようにまだコミットしていないことを示唆する。データは、hESCsからのhpRSCsの誘導が眼領域特定化を再現(recapitulate)し得ること、及びhpRSCsは網膜亜系統分化へ入る準備ができていることを実証する。
hESC由来hpRSCsが、培養において異なる網膜亜系統細胞型を生じる可能性を有するかどうかを調べるために、本発明者らは、初期眼発生の誘導のきっかけ(inductive cue)を模倣する小分子ベースのアプローチを取った。本発明者らは、hpRSCsの分化を、in vitroで特定の網膜細胞運命に向かって方向付けた。網膜神経節細胞(RGCs)は、網膜ニューロンの主要なタイプであり、網膜から脳のいくつかの領域に視覚信号を伝達する際に重要な役割を果たす。本発明者らは、まず、hESC由来hpRSCsが、化学的に規定された条件下でRGCsに分化するように指示され得るかどうかを試験した。以前の結果は、Notch及びVEGFRシグナル伝達の阻害が、RGC特定化のために重要であることを実証した32、33。本発明者らの転写プロファイリング分析は、Notch及びVEGFRシグナル伝達経路のいくつかのメンバー、例えば、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、DLL1、DLL3、HES5、及びHES1の発現が、hpRSCsにおいて顕著に上方制御されたことを示した(図7b)。したがって、本発明者らは、Wnt、Notch、及びVEGFRシグナル伝達の活性をそれぞれ阻害することができるIWP2、DAPT、及びPD173074を含む小分子阻害剤のカクテルを調合した。その処理は、hpRSCsをRGC運命に迅速にコミットした。これら3つの小分子阻害剤の存在下での誘導の2週後、細胞の大部分は、RGCsのマーカーであるTUJ1及びBRN3両方ついて陽性であった(図3a)。定量的PCR分析は、誘導の最初の6日後に、RGC前駆細胞特異的転写因子遺伝子、例えばBRN3A、BRN3B、ISL-1、及びMATH5の顕著な上方制御を示した(図3b)。
光受容細胞は、網膜における主要な細胞型であり、視覚シグナル伝達の開始を担っている。hpRSCsは、hESCs及びhfRPCSよりも高いレベルで、いくつかのヘッジホッグ(HH)シグナル伝達遺伝子、例えばGLI2、GLI3、及びスムーズンド(SMO)を発現し(図7c)、hpRSCsが、光受容細胞に向かって分化するように傾いたことを示唆する。したがって、本発明者らは、以前の研究7に基づいて、改変したin vitro光受容細胞分化法を開発し、小分子を利用して分化過程を方向付けた。hpRSCsからの光受容細胞運命の拘束は、2ステッププロセスで達成されている7。最初の段階において、ALK4/5/7、GSK-3、Notch、及びWntシグナル伝達活性をそれぞれ抑制するための小分子阻害剤SB、CHIR99021、DAPT及びIWP2で、並びにShhシグナル伝達経路の小分子活性化因子であるプルモルファミンで、hpRSCsを処理した34。以前35記載されたように、この最初の段階において、頑強な細胞成長及び増殖が観察されたが、光受容細胞特異的マーカーの発現は観察されなかった。第二段階において、培養物を、以前の報告7に記載されているように、レチノイン酸及びタウリンを補充した培地にシフトさせ、これは、1週間後、いくつかの細胞における細胞突起の伸長を含めた形態的変化を誘導した。これらの分化した細胞の運命を同定するために、本発明者らは、免疫細胞化学により光受容細胞特異的マーカーの発現を調べた。最初の誘導後14日目までに、パン光受容細胞(pan-photoreceptor)マーカーであるリカバリン(図4a)、錐体細胞特異的マーカーであるOPN1SW若しくは青オプシン(図4b)、並びに桿体細胞特異的マーカーであるロドプシン(図4c)が検出された。in vitroでhpRSCsから分化した光受容細胞が、桿体光受容細胞及び錐体光受容細胞の両方のマーカーである36、ヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質(IRBP)も発現するかどうかを決定するために、本発明者らは、IRBP-GFPレンチウイルスをhpRSCsに感染させ、形質導入した細胞を光受容細胞運命に向かって分化させた。このアプローチは、トランスジェニックマウスにおいて、並びにヒト、マウス、及びニワトリの網膜外植片において、光受容細胞を特異的に標識することが示されている37、38。分化の12日後、GFP陽性細胞が現れ始めた。16日目までに、GFPを発現する光受容細胞のクラスターが、はっきりと見えた(図4d)。さらなる成熟後、hpRSC由来の光受容細胞は、外節(outer segment)と類似した、短い内部突起及び長い伸長した外部突起などの典型的な形態的特徴を示した(図4d、挿入図)。
RPE、神経網膜と脈絡毛細管枝(choriocapillaris)の間の細胞の単層は、初期の眼杯の外側の層に現れる、最初にコミットした網膜細胞型である28。hESC由来hpRSCsが、神経網膜細胞だけでなく、非神経RPE細胞にも分化できるかどうかを試験するために、本発明者らは、hpRSCsの接着単層培養物から小分子阻害剤を除き(withdraw)、以前に記載されたように39、RPE開始培地にシフトさせた。SMADシグナル伝達阻害の除去及びアクチビンAの添加は、アクチビンA及びBMP活性がRPE特定化に必要とされるため、RPE運命に向かってhpRSCsを方向付けるのに重要である28、39、40。12日間のRPE分化後、全トランスレチノールの11-シスレチナールへの変換及び視覚色素再生に必要なRPE特異的イソメラーゼであるRPE65の低い発現レベル、並びに多角形のアクチン束の形成が、上皮様細胞の内側に観察された(図4e)。RPE65の増加した発現(図4f)及びRPEの色素沈着(図4g)は、培養におけるさらなる成熟後に現れた。
本発明者らは、次に、hESC由来hpRSCsの、齧歯類の眼の網膜下腔に移植された後の、生存し、光受容細胞へ分化する能力を決定した。ヒト細胞の免疫拒絶を回避するために、本発明者らは、移植のための無胸腺ヌードラットを使用した。約50,000個のhpRSCsでの移植の6週後、移植されたヒト細胞は、レシピエントの眼の網膜下組織で観察されたが、ヒト特異的抗原(HSA)陽性細胞の数は限られ、瘢痕組織に囲まれていることが多かった(図8a)。細胞が凝集する傾向を克服し、網膜下移植後の細胞生存率を増加させるために、本発明者らは、生理食塩水の代わりに、ヒアルロン酸及びメチルセルロース(HAMC)からなるヒドロゲル中で細胞を送達することを選択した。最近、HAMCヒドロゲルを用いた、マウス眼由来の網膜始原細胞の移植が、移植された細胞の生存、分布、及び分化を改善できることが実証されている41、42。本発明者らは、HAMC(0.5/0.5% w/w)ヒドロゲルと混合したhpRSCsを、ヌードラットの網膜下腔へ注入した。移植6週後に、増加した数の移植ヒト細胞が生存し、網膜下領域にわたって広く分布した(図8b)。したがって、続く移植実験について、本発明者らは、他に指定しない限り、HAMCヒドロゲル中のhpRSCsを送達した。神経網膜は新生動物ではまだ発生中であるため、それは、移植されたhpRSCsの融合及び分化のための許容される環境を提供し得る。この仮説を検証するために、本発明者らは、新生ヌードラットの網膜下腔にGFPタグ化hpRSCsを注入し、移植6日後に、外顆粒層(outer nuclear layer、ONL)及び内顆粒層(inner nuclear layer、INL)を含めた、神経網膜におけるGFP発現hpRSCsの顕著な融合を観察した(図5)。ONLに融合したGFP陽性細胞の一部は、典型的な光受容細胞マーカーリカバリンと共局在した(図5a、e、f)。注目すべきことに、多くの移植されたGFP陽性細胞は、非コミットhpRSCsのマーカーであるネスチンを発現し続け(図5b、d、f)、これらの細胞が、特定の網膜細胞運命にまだコミットされていなかったことを示す。次に、本発明者らは、網膜変性の動物モデルである王立外科医師会(Royal College of Surgeons、RCS)ラットにおいて、hpRSCsが、光受容細胞などの所望の細胞型に分化する能力を有するかどうかを試験した。RCSラットは、Mer受容体チロシンキナーゼ中に突然変異を有し、これは、RPE食作用の欠損を介して光受容細胞変性を引き起こす43、44。本発明者らは、hpRSCsを、生後21日目(P21)でRCSラットの網膜下腔に注入し、2ヶ月後に分化及び融合を調べた。移植された眼の凍結切片を、HSAに対する抗体と、光受容細胞マーカーであるリカバリン(図6a)若しくは赤/緑オプシン(図6b)のいずれかに対する抗体とで共免疫染色した。移植されたヒト細胞の層は、ONLに隣接する領域において検出された。多くのリカバリン陽性及び赤/緑オプシン陽性細胞はまた、HSAについて陽性であった(図6)。二重陽性標識細胞の存在は、いくつかの移植されたhpRSCsが、変性網膜において光受容細胞運命にコミットすることを示した。
ここで、本発明者らは、未分化hESCsからin vivo網膜発生の過程を再現する小分子ベースのアプローチを使用して、化学的に規定された培養条件下でhpRSCsを生産した。hESC由来hpRSCsは、眼領域の神経上皮細胞の典型的な特徴を示した。誘導は、未分化hESCsにおけるノーダル(Nodal)、BMP、及びWntシグナル伝達の相乗的阻害によって迅速かつ効率的な方法で達成された。hESC由来hpRSCsは、増殖し、典型的な初期の眼領域転写因子(すなわち、PAX6、LHX2、RAX、OTX2、及びSIX3)並びに幹細胞性因子(すなわち、SOX2、LIN28、SALL4、及びSTAT3)を活発に発現した。特定の分化のきっかけ(differentiation cue)が提供されると、これらの原始的網膜幹細胞は、神経細胞運命、例えばRGC若しくは光受容細胞、又は非神経RPEのいずれかにコミットするように方向付けられ得る。さらに、本発明者らは、移植されたhpRSCsが、融合し、生存し、in vivoで所望の細胞型に分化できたことを実証した。心強いことに、いくつかの移植されたhpRSCsは、網膜変性のモデルであるRCSラット(光受容細胞はP14に開始して失われ、ラットが3ヶ月齢の時までに完全になくなる)において、移植2ヶ月後に、残存しているONL中において光受容細胞に見かけ上分化した。さらに、本発明者らは、これまでに本発明者らが調べた移植動物において、移植されたhpRSCsからのいかなる腫瘍形成も観察しなかった。本発明者らの結果は、臨床試験に適したスケールアップした方法で、in vitroでhpRSCsを誘導し、増殖することが実現可能であることを示唆している。加えて、この小分子ベースの方法を使用して、患者iPSC由来hpRSCsだけでなく、より分化した網膜始原細胞若しくは網膜ニューロンを作製でき、このことは、網膜変性の病因の根底にある分子的及び細胞的事象を調べるための「ディッシュ中の疾患(disease in a dish)」モデリングにとって重要な意味を持つ。
Claims (99)
- 単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(primitive retinal stem cells、pRSCs)を生産するためのin vitro方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された胚性幹細胞(embryonic stem cells、ESCs)を培養し、単離ESCsの培養物を生産し、増殖させるステップ、及び
(b)そのように増殖させた単離ESCsの培養物を、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、(b)の単離ESCsを原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物pRSCsを生産するステップ
を含む、方法。 - 単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)を生産するためのin vitro方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された多能性幹細胞(pluripotent stem cells、PSCs)を培養し、単離PSCsの培養物を生産し、増殖させるステップ、及び
(b)そのように増殖させた単離PSCsの培養物を、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、単離PSCsを原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物pRSCsを生産するステップ
を含む、方法。 - 単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)を生産するためのin vitro方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cells、iPSCs)を培養し、単離iPSCsの培養物を生産し、増殖させるステップ、及び
(b)そのように増殖させた単離iPSCsの培養物を、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、単離iPSCsを原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物pRSCsを生産するステップ
を含む、方法。 - ステップ(a)において、そのように生産された単離ESCsの培養物が、単層培養物である、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)において、そのように生産された単離PSCsの培養物が、単層培養物である、請求項2に記載の方法。
- ステップ(a)において、そのように生産された単離iPSCsの培養物が、単層培養物である、請求項3に記載の方法。
- ステップ(b)において、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上が、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の組み合わせである、請求項1、2又は3に記載の方法。
- ステップ(a)において、そのように生産された培養物が、ステップ(b)の前にコンフルエンシー近くまで増殖される、請求項1、2又は3に記載の方法。
- 哺乳動物が、ヒト、サル、クマ、ラット、マウス、ミンク、ウサギ、モルモット、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ又はウシである、請求項1、2又は3に記載の方法。
- 単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)が、典型的な初期眼領域転写因子であるPAX6、LHX2、RAX、OTX2、SIX3及び/又はSIX6の発現について陽性である、請求項1、2又は3に記載の方法。
- 幹細胞性因子SOX2、及びSTAT3の発現について陽性である、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)をさらに含む、請求項1、2又は3に記載の方法。
- Ki67の発現について陽性である、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞をさらに含む、請求項1、2又は3に記載の方法。
- Wntシグナル伝達の阻害剤が、以下からなる群から選択されるWntシグナル伝達の小分子阻害剤である、請求項1、2又は3に記載の方法: Wnt生産-1の阻害剤(Inhibitor of Wnt Production-1、IWP-1)、Wnt生産-2の阻害剤(Inhibitor of Wnt Production-2、IWP2)、JW55、JW74、オカダ酸、トートマイシン(tautomycin)、SB239063、SB203580、ADP-HPD、2-[4-(4-フルオロフェニル)ピペラジン-1-イル]-6-メチルピリミジン-4(3H)-オン、PJ34、カンビノール(cambinol)、スリンダク(sulindac)、3289-8625、ディシェベルド(Dishevelled)タンパク質を阻害するように設計された一連のアナログについてのスキャフォールドA、ディシェベルドタンパク質を阻害するように設計された一連のアナログについてのスキャフォールドB、J01-017a、NSC668036、フィリピン(filipin)、IC261、PF670462、ボスチニブ(Bosutinib)、PHA665752、イマチニブ(Imatinib)、ICG-001、エタクリン酸、エタクリン酸誘導体、PKF115-584、PNU-74654、PKF118-744、CGP049090、PKF118-310、ZTM000990、BC21、GDC-0941、Rp-8-Br-cAMP、LGK974、C59、Ant 1.4Br/Ant 1.4CI、ニクロサミド(niclosamide)、アピクラレン(apicularen)、バフィロマイシン(bafilomycin)、XAV939、IWR1、ピルビニウム(pyrvinium)、NSC668036、2,4-ジアミノ-キナゾリン、クエルセチン(quercetin)、及びPKF115-584、並びにそれらの同等物及び組み合わせ。
- Wntシグナル伝達の阻害剤が、Wnt生産-2(Wnt Production-2)の小分子阻害剤又はDkk1アナログである、請求項1、2又は3に記載の方法。
- TGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤が、以下からなる群から選択されるTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤である、請求項1、2又は3に記載の方法: SB431542(4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド)、A 83-01(3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド)、SJN 2511(2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン)、D 4476(4-[4-(2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾジオキシン-6-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド)、LY 364947(4-[3-(2-ピリジニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-キノリン)、SB 525334(6-[2-(1,1-ジメチルエチル)-5-(6-メチル-2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-4-イル]キノキサリン)、SD 208(2-(5-クロロ-2-フルオロフェニル)-4-[(4-ピリジル)アミノ]プテリジン)、及びLDN-193189(4-(6-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリン)並びにそれらの同等物及び組み合わせ。
- TGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤が、トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の小分子阻害剤である、請求項1、2又は3に記載の方法。
- TGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤が、BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の小分子阻害剤又はノギン(noggin)アナログである、請求項1、2又は3に記載の方法。
- Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の組み合わせが、(a)Wnt生産-2の1つ以上の阻害剤又はDkk1アナログ; (b)トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の1つ以上の阻害剤; 及び(c)BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の1つ以上の阻害剤又はノギンアナログの組み合わせであり、ここで、該組み合わせは、少なくとも2つのシグナル伝達経路の阻害剤又は好ましくは3つ全てのシグナル伝達経路の阻害剤を含む、請求項7に記載の方法。
- 阻害剤が、小分子である、請求項21に記載の方法。
- Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の阻害剤の組み合わせが、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)の少なくとも2つ、好ましくは3つ全ての組み合わせ、若しくは同等の組み合わせであり、ここで、該組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じるか、又は、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)の少なくとも2つ、好ましくは3つ全てを含む組み合わせ、若しくは同等の組み合わせであり、ここで、該組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じる、請求項21に記載の方法。
- ステップ(a)の培養細胞が、固体支持体上で培養される、請求項1、2又は3に記載の方法。
- 固体支持体が、増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)で被覆されているか、又は増殖因子が低減された基底膜で被覆されている、請求項24に記載の方法。
- 単離された哺乳動物の網膜神経節細胞(retinal ganglion cells、RGCs)を生産するためのin vitro方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された原始的網膜幹細胞(pRSCs)を培養し、単離pRSCsの培養物を生産し、増殖させるステップ、及び
(b)そのように培養された単離pRSCsを、Wnt、Notch、又はVEGFRシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、単離pRSCsを単離哺乳動物RGCsに分化させ、それによって単離哺乳動物RGCsを生産するステップ
を含む、方法。 - ステップ(a)において、そのように培養されたpRSCsが、固体支持体上で増殖される、請求項26に記載の方法。
- 固体支持体が、Matrigel(登録商標)又は基底膜で被覆されている、請求項27に記載の方法。
- Matrigel(登録商標)又は基底膜が、増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)又は増殖因子が低減された基底膜である、請求項28に記載の方法。
- ステップ(b)において、Wnt、Notch、又はVEGFRシグナル伝達の阻害剤の1つ以上が、Wnt、Notch、及びVEGFRシグナル伝達の阻害剤の組み合わせであり、ここで、該組み合わせは、少なくとも2つのシグナル伝達経路の阻害剤、又は好ましくは3つ全てのシグナル伝達経路の阻害剤を含む、請求項26に記載の方法。
- Wnt、Notch、又はVEGFRシグナル伝達の阻害剤が、小分子阻害剤である、請求項30に記載の方法。
- Wnt、Notch、及びVEGFRシグナル伝達の阻害剤の組み合わせが、それぞれ、IWP2、DAPT、及びPD173074である、請求項30に記載の方法。
- RGC前駆細胞特異的転写因子遺伝子の上方制御が、BRN3A、BRN3B、ISL-1及びMATH5のいずれか1つ以上を含む、請求項26に記載の方法。
- 培養物中の細胞の大部分が、RGCsのマーカーについて陽性である、請求項26に記載の方法。
- 培養物中の細胞の大部分が、RGCsのマーカーについて陽性であり、さらに、TUJ1及びBRN3について陽性である、請求項34に記載の方法。
- 単離された哺乳動物pRSCsから、単離された哺乳動物光受容細胞を生産する方法であって、
(a)TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子を含む神経誘導培地中で、目に見える形態的変化又は光受容細胞特異的マーカーの発現なしに、pRSCsを光受容細胞系列の運命に誘導するために十分な時間、哺乳動物由来の解離されたpRSCsを培養し、増殖させるステップ、及び
(b)次いで、レチノイン酸又はタウリン又はその両方を含む神経誘導培地中でステップ(a)のpRSCsを培養し、増殖させ、哺乳動物pRSCsを光受容細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物光受容細胞を生産するステップ
を含み、ここで、培養培地は、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない、方法。 - 単離された哺乳動物pRSCsから、単離された哺乳動物光受容細胞を生産する方法であって、
(a)TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子を含む神経誘導培地中で、目に見える形態的変化又は光受容細胞特異的マーカーの発現なしに、pRSCsを光受容細胞系列の運命に誘導するために十分な時間、哺乳動物由来の解離されたpRSCsを培養し、増殖させるステップ、及び
(b)ステップ(a)の培養され増殖されたpRSCsを、レチノイン酸又はタウリン又はその両方と接触させ、哺乳動物pRSCsを光受容細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物光受容細胞を生産するステップ
を含み、ここで、培養培地は、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない、方法。 - ステップ(a)において、そのように培養されたpRSCsが、固体支持体上で増殖される、請求項37に記載の方法。
- 固体支持体が、Matrigel(登録商標)又は基底膜で被覆されている、請求項38に記載の方法。
- Matrigel(登録商標)又は基底膜が、増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)又は増殖因子が低減された基底膜である、請求項39に記載の方法。
- ステップ(a)において、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤の1つ以上が、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5及び-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch及びWntシグナル伝達の阻害剤の組み合わせであり、ここで、該組み合わせは、少なくとも2つのシグナル伝達経路の阻害剤、又は好ましくは4つ全てのシグナル伝達経路の阻害剤を含む、請求項36に記載の方法。
- ステップ(a)において、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子が、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5及び-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch及びWntシグナル伝達の阻害剤、並びにヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子の組み合わせであり、ここで、該組み合わせは、少なくとも2つのシグナル伝達経路のモジュレーター、又は好ましくは5つ全てのシグナル伝達経路のモジュレーターを含む、請求項36に記載の方法。
- TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤が、小分子阻害剤である、請求項36に記載の方法。
- ヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子が、小分子活性化因子である、請求項36に記載の方法。
- 単離された哺乳動物の光受容細胞が、ロドプシン、ロドプシンキナーゼ及び/又はトランスムチン(transmucin)について陽性である、請求項36に記載の方法。
- TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5及び-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch及びWntシグナル伝達の阻害剤、並びにヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子が、それぞれ、SB431542(CAS番号301836-41-9)若しくは同等物、CHIR99021(CAS番号252917-06-9)若しくは同等物、DAPT(CAS番号208255-80-5)若しくは同等物、IWP2(CAS番号686770-61-6)若しくは同等物、並びにプルモルファミン(purmorphamine、CAS番号483367-10-8)若しくは同等物である、請求項42に記載の方法。
- 非神経の単離された哺乳動物の網膜色素上皮(retinal pigment epithelium、RPE)又は単離された哺乳動物の網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cells、RPEs)を生産する方法であって、
(a)SMADシグナル伝達阻害剤の非存在下で、ニコチンアミド又はアクチビンA又はその両方を含む培養培地中で、pRSCsをRPEの運命に向かって方向付けるために十分な時間、哺乳動物由来のpRSCsを培養するステップ、及び
(b)N1培地補充物、タウリン、ヒドロコルチゾン、又はトリヨードサイロニンの1つ以上を含む培養培地中でpRSCsを培養し、哺乳動物pRSCsを哺乳動物RPE又はRPEsに分化させ、それによって単離哺乳動物RPE又はRPEsを生産するステップ
を含み、ここで、培地は、フィーダー細胞又はフィーダー馴化培地を含まない、方法。 - 非神経の単離された哺乳動物の網膜色素上皮(RPE)又は単離された哺乳動物の網膜色素上皮細胞(RPEs)を生産する方法であって、
(a)SMADシグナル伝達阻害剤の非存在下で、ニコチンアミド又はアクチビンA又はその両方を含む培養培地中で、pRSCsをRPEの運命に向かって方向付けるために十分な時間、哺乳動物由来のpRSCsを培養するステップ、及び
(b)ステップ(a)においてそのように培養されたpRSCsを、N1培地補充物、タウリン、ヒドロコルチゾン、又はトリヨードサイロニンの1つ以上と接触させ、哺乳動物pRSCsを哺乳動物RPE又はRPEsに分化させ、それによって単離哺乳動物RPE又はRPEsを生産するステップ
を含み、ここで、培地は、フィーダー細胞又はフィーダー馴化培地を含まない、方法。 - ステップ(b)において、培養培地が、N1培地補充物、タウリン、ヒドロコルチゾン、及びトリヨードサイロニンを含むRPE培養培地である、請求項47に記載の方法。
- RPE又はRPEsが、RPE65を発現し、多角形のアクチン束を形成し、着色している、請求項47に記載の方法。
- 哺乳動物が、ヒト、サル、クマ、ラット、マウス、ミンク、ウサギ、モルモット、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ又はウシである、請求項26、36又は47に記載の方法。
- 単離されたヒト胚性幹細胞(human embryonic stem cells、hESCs)から、単離されたヒト原始的網膜幹細胞(human primitive retinal stem cells、hpRSCs)を生産する方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清の非存在下で、培養培地を用いて、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに、好ましくは80%の細胞コンフルエンスまで増殖するために十分な時間、単離されたhESCsを培養するステップ、
(b)そのように増殖させた単離hESCsを、塩基性FGF(bFGF)を含む培養培地中で、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに増殖するために十分な時間培養するステップ、
(c)ステップ(b)の単離hESCsを、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤の組み合わせを含む培養培地を用いて、固体支持体上で培養し、単離hESCsを単離ヒト原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離hpRSCsを生産するステップ
を含む、方法。 - 単離されたヒト多能性幹細胞(human pluripotent stem cells、hPSCs)から、単離されたヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)を生産する方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清の非存在下で、培養培地を用いて、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに、好ましくは80%の細胞コンフルエンスまで増殖するために十分な時間、単離されたhPSCsを培養するステップ、
(b)そのように増殖させた単離hPSCsを、bFGFを含む培養培地中で、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに増殖するために十分な時間培養するステップ、
(c)ステップ(b)の単離hPSCsを、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤の組み合わせを含む培養培地を用いて、固体支持体上で培養し、単離hPSCsを単離ヒト原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離hpRSCsを生産するステップ
を含む、方法。 - 単離されたヒト人工多能性幹細胞(iPSCs)から、単離されたヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)を生産する方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清の非存在下で、培養培地を用いて、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに、好ましくは80%の細胞コンフルエンスまで増殖するために十分な時間、単離されたヒトiPSCsを培養するステップ、
(b)そのように増殖させた単離iPSCsを、bFGFを含む培養培地中で、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに増殖するために十分な時間培養するステップ、
(c)ステップ(b)の単離iPSCsを、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤の組み合わせを含む培養培地を用いて、固体支持体上で培養し、単離iPSCsを単離ヒト原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離hpRSCsを生産するステップ
を含む、方法。 - ステップ(c)におけるWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の小分子阻害剤の組み合わせが、SB 431542、LDN193189及びIWP2(Inhibitor of Wnt Production-2)の組み合わせ; SB 431542、ノギンアナログ及びIWP2の組み合わせ; SB 431542、LDN193189及びDkk1アナログの組み合わせ; SB 431542、ノギンアナログ及びDkk1アナログの組み合わせ; 又は同等の組み合わせであり、ここで、該組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じる、請求項52、53又は54に記載の方法。
- SB 431542、LDN193189及びIWP2の組み合わせが、5μM SB 431542、50nM LDN193189、及び1μM IWP2を含む、請求項55に記載の方法。
- 単離されたヒト原始的網膜幹細胞が、典型的な初期眼領域転写因子であるPAX6、LHX2、RAX、OTX2、SIX3及び/又はSIX6について陽性である、請求項52、53又は54に記載の方法。
- 単離されたヒト原始的網膜幹細胞が、幹細胞性因子SOX2、ネスチン及びSTAT3の発現について陽性である、請求項57に記載の方法。
- 単離されたヒト原始的網膜幹細胞が、Ki67の発現について陽性である、請求項57に記載の方法。
- 単離されたヒト原始的網膜幹細胞が、hESC多能性転写因子、POU5F1(OCT4)、NANOG、KLF4及びTBX3遺伝子、並びにTBF-βスーパーファミリー遺伝子、SMAD1、SMAD2、TGFβ3、BMP3、BMP6、TGFBR1、及びBMPR1Bの転写を下方制御する、請求項57に記載の方法。
- 単離されたヒト原始的網膜幹細胞が、BMP4及びBMP7遺伝子、並びにOTX2、RAX、LHX2、SIX3、及びSIX6遺伝子の転写を上方制御する、請求項57に記載の方法。
- 単離されたヒト原始的網膜幹細胞が、SRFP1及びFZD3/5遺伝子の転写について陽性である、請求項57に記載の方法。
- 単離されたヒト原始的網膜幹細胞が、FGFR1/2/3及びFGF3/8遺伝子の転写を下方制御する、請求項57に記載の方法。
- それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼に原始的網膜幹細胞(pRSCs)を投与するステップを含み、ここで、pRSCsは、請求項1、2、3、52、53又は54に記載の方法によって生産される、方法。
- それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、
(a)被験体から組織又は細胞サンプルを得て、それから単離されたPSCs又は単離されたiPSCsを得る又は生産するステップ、
(b)ステップ(a)の単離PSCs又は単離iPSCsを培養して、請求項2、3、53又は54に記載の方法によって生産するステップ、
(c)被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼に原始的網膜幹細胞(pRSCs)を投与するステップ
を含む、方法。 - それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼に哺乳動物の網膜神経節細胞(RGCs)を投与するステップを含み、ここで、RGCsは、請求項26に記載の方法によって生産される、方法。
- それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、
(a)被験体から組織又は細胞サンプルを得て、それから単離されたPSCs又は単離されたiPSCsを得る又は生産するステップ、
(b)ステップ(a)の単離PSCs又は単離iPSCsを培養して、単離されたpRSCsを生産するステップ、
(c)単離pRSCsを培養して、請求項26に記載の方法によって、単離されたRGCsを生産するステップ、
(d)被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼にステップ(c)において生産された哺乳動物の網膜神経節細胞(RGCs)を投与するステップ
を含む、方法。 - それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼に哺乳動物の光受容細胞を投与するステップを含み、ここで、哺乳動物の光受容細胞は、請求項36に記載の方法によって生産される、方法。
- それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、
(a)被験体から組織又は細胞サンプルを得て、それから単離されたPSCs又は単離されたiPSCsを得る又は生産するステップ、
(b)ステップ(a)の単離PSCs又は単離iPSCsを培養して、単離されたpRSCsを生産するステップ、
(c)単離pRSCsを培養して、請求項36に記載の方法によって、単離された光受容細胞を生産するステップ、
(d)被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼にステップ(c)の光受容細胞を投与するステップ
を含む、方法。 - それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼に哺乳動物の網膜色素上皮細胞(RPEs)を投与するステップを含み、ここで、RPEsは、請求項47に記載の方法によって生産される、方法。
- それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、
(a)被験体から組織又は細胞サンプルを得て、それから単離されたPSCs又は単離されたiPSCsを得る又は生産するステップ、
(b)ステップ(a)の単離PSCs又は単離iPSCsを培養して、単離されたpRSCsを生産するステップ、
(c)単離pRSCsを培養して、請求項47に記載の方法によって、単離されたRPEsを生産するステップ、
(d)被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼にステップ(c)の哺乳動物網膜色素上皮細胞(RPEs)を投与するステップ
を含む、方法。 - 投与される細胞が、マトリックス中若しくはマトリックス上にあるか、又は患者の眼への送達の前にマトリックスと混合される、請求項64、66、68又は70に記載の方法。
- マトリックスが、ヒアルロン酸及びメチルセルロース又はそれらの塩及び誘導体を含むヒドロゲル、生物活性ペプチドを有するヒドロゲル、移植された細胞の細胞生存性及び機能性を支持する生体適合性ポリマー又は生体適合性ポリマーの混合物、人工生体模倣マトリックス、組織又は器官マトリックスに由来する生物活性足場、コラーゲン及びN-イソプロピルアクリルアミド共重合体に基づく生合成細胞外マトリックス、又は接着分子、ラミン、増殖因子、形態形成因子、生存因子、細胞外マトリックス若しくは断片若しくは誘導体で修飾された足場である、請求項72に記載の方法。
- 細胞が、被験体の眼の網膜下腔に投与される、請求項64、66、68又は70に記載の方法。
- 網膜変性が、加齢性黄斑変性症(AMD)、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性症、緑内障、網膜血管疾患、眼のウイルス感染、又は公知若しくは未知の病因の他の網膜/眼疾患と関連している、請求項64、66、68又は70に記載の方法。
- 被験体がヒトである、請求項64、66、68又は70に記載の方法。
- それを必要とする被験体にヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)を送達する方法であって、被験体の網膜下腔に、マトリックス溶液又はマトリックス懸濁液中の、請求項1、2、3、52、53又は54に記載の方法によって生産されたhpRSCsの単層又は単一細胞懸濁液を投与するステップを含む、方法。
- それを必要とする被験体にヒト原始的網膜神経節細胞(hpRGCs)を送達する方法であって、被験体の網膜下腔に、マトリックス溶液又はマトリックス懸濁液中の、請求項26に記載の方法によって生産されたhpRGCsの単層又は単一細胞懸濁液を投与するステップを含む、方法。
- それを必要とする被験体にヒト光受容細胞を送達する方法であって、被験体の網膜下腔に、マトリックス溶液又はマトリックス懸濁液中の、請求項36に記載の方法によって生産されたヒト光受容細胞の単層又は単一細胞懸濁液を投与するステップを含む、方法。
- それを必要とする被験体にヒト網膜色素上皮細胞(hRPEs)を送達する方法であって、被験体の網膜下腔に、マトリックス溶液又はマトリックス懸濁液中の、請求項47に記載の方法によって生産されたhRPEsの単層又は単一細胞懸濁液を投与するステップを含む、方法。
- 網膜変性に罹患している被験体を治療するための多能性幹細胞の使用に関連した腫瘍を予防又は阻害する方法であって、
(a)単離された多能性幹細胞を、請求項1、2、3、52、53又は54に記載の方法によって、単離されたヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)に誘導するステップ、及び
(b)(a)において生産された単離hpRSCsを被験体に投与するステップ
を含む、方法。 - 網膜変性に罹患している被験体を治療するための多能性幹細胞の使用に関連した腫瘍を予防又は阻害する方法であって、
(a)単離された多能性幹細胞を、請求項1、2、3、52、53又は54に記載の方法によって、単離されたhPRSCsに誘導するステップ、
(b)単離hPRSCsを、請求項26に記載の方法によって生産される、単離されたヒト原始的網膜神経節細胞(hpRGCs)にさらに分化させるステップ、
(c)(b)において生産された単離hpRGCsを被験体に投与するステップ
を含む、方法。 - 網膜変性に罹患している被験体を治療するための多能性幹細胞の使用に関連した腫瘍を予防又は阻害する方法であって、
(a)単離された多能性幹細胞を、請求項1、2、3、52、53又は54に記載の方法によってhPRSCsに誘導するステップ、
(b)単離hPRSCsを、請求項36に記載の方法によって生産される、単離されたヒト光受容細胞にさらに分化させるステップ、
(c)(b)において生産された単離ヒト光受容細胞を被験体に投与するステップ
を含む、方法。 - 網膜変性に罹患している被験体を治療するための多能性幹細胞の使用に関連した腫瘍を予防又は阻害する方法であって、
(a)単離された多能性幹細胞を、請求項1、2、3、52、53又は54に記載の方法によってhPRSCsに誘導するステップ、
(b)単離hPRSCsを、請求項47に記載の方法によって生産される、単離されたヒト網膜色素上皮(hRPE)又は単離されたヒト網膜色素上皮細胞(hRPEs)にさらに分化させるステップ、
(c)(b)において生産された単離hRPE又はhRPEsを被験体に投与するステップ
を含む、方法。 - 網膜変性が、加齢性黄斑変性症(AMD)、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性症、緑内障、網膜血管疾患、眼のウイルス感染、又は公知若しくは未知の病因の他の網膜/眼疾患と関連している、請求項81、82、83又は84に記載の方法。
- 請求項1、2、3、52、53又は54に記載の方法によって生産された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(hpRSCs)と好適な担体とを含む組成物。
- 請求項26に記載の方法によって生産された哺乳動物の網膜神経節細胞(RGCs)と好適な担体とを含む組成物。
- 請求項36に記載の方法によって生産された哺乳動物の光受容細胞と好適な担体とを含む組成物。
- 請求項47に記載の方法によって生産された哺乳動物の網膜色素上皮(RPE)又は哺乳動物の網膜色素上皮細胞(RPEs)と好適な担体とを含む組成物。
- 哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)を生産するためのキットであって、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地若しくは血清を含まない化学的に規定された培地中で哺乳動物由来の胚性幹細胞(ESCs)、多能性幹細胞(PSCs)若しくは人工多能性幹細胞(iPSC)を培養するための説明書、並びにWntシグナル伝達若しくはTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤、又はWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の両方の阻害剤の使用のための説明書を含む、キット。
- Wntシグナル伝達若しくはTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤、又はWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の両方の小分子阻害剤をさらに含む、請求項90に記載のキット。
- Wntシグナル伝達の小分子阻害剤が、C22H18N402S3の化学式を有するWnt生産-2の阻害剤(Inhibitor of Wnt Production-2、IWP2; CAS番号686770-61-6)又はN-(6-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-2-[(4-オキソ-3-フェニル-6,7-ジヒドロチエノ[3,2-d]ピリミジン-2-イル)スルファニル]アセトアミドであるか、又はそれを含む、請求項91に記載のキット。
- TGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤が、トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の小分子阻害剤である、請求項91に記載のキット。
- トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の小分子阻害剤が、C22H16N403の化学式を有するSB431542(CAS番号301836-41-9)又は4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミドであるか、又はそれを含む、請求項93に記載のキット。
- TGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤が、BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の小分子阻害剤又はノギンアナログである、請求項91に記載のキット。
- BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の小分子阻害剤又はノギンアナログが、C25H22N6の化学式を有するLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)又は4-(6-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリンであるか、又はそれを含む、請求項95に記載のキット。
- Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の両方の小分子阻害剤が、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)の組み合わせ、若しくは同等の組み合わせであり、ここで、この組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じるか、又は、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)を含む組み合わせ、若しくは同等の組合せであり、ここで、この組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じる、請求項91に記載のキット。
- 哺乳動物に由来する胚性幹細胞(ESCs)、多能性幹細胞(PSCs)又は人工多能性幹細胞(iPSC)をさらに含む、請求項90又は91に記載のキット。
- 化学的に規定された培養培地及び/又は補充物をさらに含む、請求項90、91又は98に記載のキット。
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