CN106609255B - 含pj34和视网膜色素上皮细胞的细胞悬液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含PJ34和视网膜色素上皮细胞的细胞悬液及其应用，属于生物技术领域。本发明含PJ34和视网膜色素上皮细胞的细胞悬液为单细胞悬液，其含有分子化合物PJ34以及视网膜色素上皮细胞，所述的分子化合物PJ34浓度为0.3μM，所述的视网膜色素上皮细胞的浓度为1～2×105个细胞/5微升。所述的细胞悬液为视网膜退行性疾病移植用细胞悬液。与现有技术相比，本发明证实PJ34可以抑制由RPE变性导致的感光细胞的死亡，因此，在移植RPE细胞治疗视网膜变性的同时，联合PJ34抑制或延缓感光细胞变性，可以有效延缓视网膜变性进程。本发明为临床利用细胞移植技术治疗视网膜变性提供新的思路和理论依据，推动细胞移植治疗视网膜变性疾病的转化科学研究。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种含PJ34和视网膜色素上皮细胞的细胞悬液及其应用。
背景技术
视网膜变性疾病是全球首要的致盲原因。在该疾病中，视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)的损伤和功能异常导致光感受器细胞变性，最终影响病人视力直至失明。由于RPE和光感受器细胞的不可再生，至今在临床上缺乏对这类疾病的有效治疗措施。
恢复视网膜变性疾病病人视力的最根本和最理想的手段就是用正常的细胞替代视网膜中受损的细胞。目前，关于视网膜变性疾病的细胞治疗，已取得了一些进展，比如人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)来源的RPE细胞移植在治疗RCS(RoyalCollege of Surgeons)大鼠视网膜变性研究中获得了成功。最近，有研究组首次将hESC来源的RPE细胞移植于两名视网膜变性病人眼内。虽然术后4个月病人视力并没有非常显著的提高，与人类的要求还有很大差距，但移植后对宿主眼无副作用，此项研究首次证实了hESC来源的RPE细胞应用于人类视网膜变性疾病的临床研究的可行性和安全性。该结论让人欣喜，hESC来源的RPE细胞移植将会成为视网膜移植领域的热点，将会逐步由实验室走上临床。应该看到这项技术还未能在人体开展全面研究，距离人类的要求还有很大差距，移植后达到较好的视力改善将是未来研究的重点，也是目前国际生物医学研究领域的热门课题和重要挑战之一。
那么，临床上用hESC来源的RPE细胞移植治疗视网膜变性疾病，效果并不理想的原因可能是因为在视网膜变性疾病中，RPE细胞和感光细胞都发生了变性，RPE细胞的移植能替代患者病变的RPE细胞，但由于移植的RPE细胞在进入宿主后需要一定的时间去迁移、整合入宿主残存的RPE细胞中，所以，外源的RPE细胞发挥作用的时间要晚于移植时间，这样对于移植时正在发生的感光细胞变性的保护作用不大。所以，单纯移植RPE细胞可能不足以很好地治疗视网膜变性。
因此，需要一种移植RPE细胞的方法，一方面能够改善移植细胞的微环境，促进移植细胞的整合，迁移并替代损伤死亡的细胞；另一方面能够抑制宿主细胞的死亡，为移植细胞发挥作用争取时间；最终，能够更好的抑制视网膜退行性病变，恢复病人的视觉功能。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种含PJ34和视网膜色素上皮细胞的细胞悬液及其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种含PJ34和视网膜色素上皮细胞的细胞悬液，其特征在于，所述的细胞悬液为单细胞悬液，其含有分子化合物PJ34以及视网膜色素上皮细胞，所述的分子化合物PJ34浓度为0.3μM，所述的视网膜色素上皮细胞的浓度为1～2×105个细胞/5微升。
所述的细胞悬液的溶剂为磷酸盐缓冲液。
所述的视网膜色素上皮细胞为来源于干细胞的视网膜色素上皮细胞。
所述的视网膜色素上皮细胞具体为ARPE19细胞。
所述的细胞悬液为视网膜退行性疾病移植用细胞悬液。
所述的细胞悬液用于制备治疗视网膜退行性疾病的药剂。
所述的视网膜退行性疾病主要指RPE损伤导致的视网膜变性。
本发明为考察含PJ34和视网膜色素上皮细胞的细胞悬液对视网膜退行性疾病的治疗效果，将含PJ34和视网膜色素上皮细胞的细胞悬液进行视网膜下腔注射移植，通过形态学和功能学检测含PJ34和视网膜色素上皮细胞的细胞悬液移植对模型大鼠视网膜病变进程的干预作用。具体方案如下：
a、用完全培养基培养ARPE19细胞；
b、GFP标记ARPE19细胞；
c、向视网膜退行性病变模型大鼠眼内移植PJ34和标记的ARPE19细胞；
d、在不同时间点分别通过形态学和功能学检测联合治疗对模型大鼠视网膜病变进程的干预作用。
优选的，步骤a中所述培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行；所述完全培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清、青霉素及链霉素，其中血清体积含量为10％，青霉素浓度为100U/ml，链霉素浓度为100ug/ml。
优选的，步骤b中所述标记为用病毒lenti包装的GFP感染ARPE19细胞。
优选的，步骤c中所述视网膜退行性病变大鼠模型为出生21天的RCS大鼠，其RPE细胞Mertk基因突变导致视网膜退行性病变；所述移植为视网膜下腔注射的方法；所述PJ34和标记的ARPE19细胞为将PJ34(0.3mM)溶解在标记的ARPE19细胞的单细胞悬液中，细胞密度为1～2×105个细胞/5微升，溶剂采用磷酸盐缓冲液，移植时大鼠每只眼睛注射5微升细胞悬液。
优选的，步骤d中所述不同时间点是指细胞治疗后的每周进行检测；所述形态学检测为通过石蜡切片和冰冻切片以及免疫荧光染色和苏木素伊红染色检测视网膜核层厚度和视网膜各细胞的变化；所述功能学检测为视觉电生理检测，测定大鼠的视觉功能。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、本发明首次发现PJ34可抑制由RPE变性所引起的感光细胞的变性。PJ34作为PAR活性的特异性抑制剂，可以有效抑制感光细胞的PAR活性进而抑制其凋亡。
2、在移植RPE细胞治疗视网膜变性的同时，利用PJ34抑制或延缓感光细胞变性，有效延缓了视网膜变性进程。由于RPE细胞中没有Par活性，因此，本发明使用的PJ34对其没有作用，不会产生负面影响。
3、本发明中分子化合物PJ34浓度为0.3μM，该浓度是通过浓度梯度实验检测得到的，为最少的试剂浓度发挥最大的保护作用，如果浓度降低，则其保护作用减弱；若上调，保护作用不会加大。
4、本发明为临床利用细胞移植技术治疗视网膜变性提供新的思路和理论依据，推动细胞移植治疗视网膜变性疾病的转化科学研究。
附图说明
图1为ARPE19细胞和GFP标记图；
图2为本发明RCS大鼠与正常SD大鼠在视觉功能及视网膜核层对比图、视网膜下腔注射方法示意图；
图3为ARPE19和PJ34联合应用对视网膜凋亡的作用；
图4为本发明联合治疗分别在视觉功能与核层厚度对退行性病变的干预示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
本实施例考察联合应用PJ34和ARPE19对视网膜退行性疾病进行细胞治疗的效果。
本实施例中，所述联合应用为使用含PJ34和视网膜色素上皮细胞的细胞悬液，通过视网膜下腔注射的方法进行移植。其中所述细胞悬液为单细胞悬液，其含有分子化合物PJ34以及视网膜色素上皮细胞，所述分子化合物PJ34浓度为0.3μM，所述的视网膜色素上皮细胞的浓度为1～2×105个细胞/5微升。
本实施例中，考察含PJ34和视网膜色素上皮细胞的细胞悬液对视网膜退行性疾病的治疗效果的具体方案，包括如下步骤：
a.用完全培养基培养ARPE19细胞，如图1A；完全培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清、青霉素及链霉素，其中血清体积含量为10％，青霉素浓度为100U/ml，链霉素浓度为100ug/ml。
b.用病毒lenti包装的绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)感染ARPE19细胞，得到GFP标记的ARPE19细胞，图1B；
c.向视网膜退行性病变模型大鼠眼内移植含PJ34和视网膜色素上皮细胞的细胞悬液；
本步骤中所述视网膜退行性病变大鼠模型为出生21天的RCS大鼠，其RPE细胞Mertk基因突变导致视网膜退行性病变，和正常的SD大鼠相比，表现为视觉功能在出生3周后开始下降，如图2A；通过免疫荧光染色鉴定，RCS大鼠Recoverin阳性的外核层细胞减少，核层厚度降低，如图2B，图2B中，ONL表示外核层(outer nuclear layer)、INL表示内核层(inner plexiform layer)，GCL表示神经节细胞层(ganglion cell layer)。所述移植采用的是视网膜下腔注射的方法，如图2C；所述含PJ34和视网膜色素上皮细胞的细胞悬液为将PJ34(0.3μM)溶解在ARPE19细胞的单细胞悬液中，细胞密度为1～2×105个细胞/5微升，每只眼睛注射2微升，此为联合移植组；再以单独细胞溶剂PBS、仅含有ARPE19细胞的细胞悬液，以及PJ34作为对照组，分别通过视网膜下腔注射的方法移植的模型大鼠中。
d.移植两周后，联合移植组(即含PJ34和视网膜色素上皮细胞的细胞悬液移植)比ARPE19单独移植组中感光细胞的凋亡明显减少，见图3；
e.在不同时间点分别通过形态学和功能学检测联合治疗对模型大鼠视网膜病变进程的干预作用；
本步骤中所述不同时间点是指细胞治疗后的1周直到第6周；分别在视觉功能与核层厚度两方面进行检测。在移植治疗1周后，联合移植组比单纯ARPE19移植组的视网膜感光细胞存活及视功能方面有明显改善，并且这种改善在治疗6周后仍存在，同时核层厚度统计在联合移植组与单独移植相比有更好的保护，如图4所示。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照较佳实施案例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或这等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (3)
1.一种单细胞悬液，其特征在于，所述单细胞悬液包含浓度为0.3μM的分子化合物PJ34以及浓度为1～2×105个细胞/5微升的视网膜色素上皮细胞ARPE19，余量为磷酸盐缓冲液。
2.一种如权利要求1所述单细胞悬液在制备治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的单细胞悬液的应用，其特征在于，所述的视网膜退行性疾病指RPE损伤导致的视网膜变性。
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