JP2016530270A - スクリーニング方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、がんの治療における使用のための新規化合物の同定のためのスクリーニング方法を開示する。【選択図】なし

Description

本発明は、がんの治療に有用な化合物を同定するためのスクリーニング方法、及び本発明の方法によって同定される化合物に関する。
ＦｏｘＭ１は、フォークヘッドファミリーに属する転写因子である。ＦｏｘＭ１はまた、Ｔｒｉｄｅｎｔ（マウスの場合）、ＨＦＨ−１１（ヒトの場合）、ＷＩＮ又はＩＮＳ−１（ラットの場合）、ＭＰＰ−２（ヒトｃＤＮＡの一部）又はＦＫＨＬ−１６として文献中で知られている。フォークヘッドファミリーは、フォークヘッド又はウィングドヘリックスドメインと呼ばれる保存されたＤＮＡ結合ドメインによって定義される多数の転写因子を含む。ＦＯＸＭ１遺伝子は、保存されたフォークヘッドＤＮＡ結合ドメインとのホモログのための縮重プライマーを用いたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりクローニングされた(W. Korver, J. Roose, H. Clevers, Nucleic Acids Res. 25 (1997) 1715-1719)。ＦｏｘＭ１遺伝子は、その最も緊密に関連するフォークヘッドメンバーのうちの五つ、すなわちＦｏｘＡ３（ＨＮＦ−３γ）、ＦｏｘＣ１（ｆｋｈ−１）、ＦｏｘＦ２（ＦＲＥＡＣ−２）、ＦｏｘＫ１（ＩＬＦ）及びＦｏｘＮ２（ＨＴＬＦ）と、ＤＮＡ結合ドメインにおいて４５％の同一性を示すフォークヘッド転写因子ファミリーのメンバーをコードすることが判明した。ＦｏｘＭ１のＣ末端領域は、２２１アミノ酸のオープンリーディングフレームをコードする、ＭＰＰ−２と呼ばれるヒトｃＤＮＡの一部との相同性（７６％同一）を有することが見出された。ＭＰＰ−２は、ＭＰＭ−２反応性リン酸化タンパク質−２の略で、ホスホセリンープロリンに依存的にリン酸化される有糸分裂タンパク質上のエピトープに特異的に結合するＭＰＭ−２モノクローナル抗体を用いたリンパ芽球由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした後に同定された。ＦｏｘＭ１は、コンセンサス部位ＴＡＡＡＣＡを通じてインビトロでＤＮＡと結合する。このモチーフは、フォークヘッドファミリーの他のメンバーによって認識されるコア配列を共有する。特に、交互の向きでのこのようなモチーフの反復はしばしば、ＦｏｘＭ１のために選択された結合配列内において特徴付けられた。
ヒトＦｏｘＭ１遺伝子は、１２ｐ１３−３染色体バンド（テロメア位置）上で約２５ｋｂに及ぶ１０−エクソン構造である(W. Korver, J. Roose, H. Clevers, Nucleic Acids Res. 25 (1997) 1715-1719)。エクソンＶａ及びエクソンＶＩＩＩａという二つのエクソンはそれぞれ、エクソンＡ１（又はラットエクソン６）及びエクソンＡ２とも呼ばれ、選択的にスプライシングされる(H. Ye, T.F. Kelly, U. Samadani, L. Lim, S. Rubio, D.G. Overdier, K.A. Roebuck, R.H. Costa, Mol. Cell Biol. 17 (1997) 1626-1641)。エクソンＶａは、ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端部分内に１５アミノ酸挿入をコードし、他のフォークヘッド転写因子ファミリーメンバーには見られないものである。エクソンＶＩＩａは、タンパク質のＣ末端内に３８アミノ酸挿入を有する。ヒトＦｏｘＭ１におけるエクソンＶａ及びエクソンＶＩＩａのディファレンシャルスプライシングは、転写物の三つのクラス、すなわち、両方の選択的エクソンを含むクラスＡ、選択的エクソンを含まないクラスＢ、エクソンＶａのみが保持されるクラスＣを生じさせる(H. Ye, T.F. Kelly, U. Samadani, L. Lim, S. Rubio, D.G. Overdier, K.A. Roebuck, R.H. Costa, Mol. Cell Biol. 17 (1997) 1626-1641)。Ｃ末端トランス活性化ドメインにおけるエクソンＶＩＩａの挿入が原因でＦｏｘＭ１Ａが転写的に不活性であるのに対し、ＦｏｘＭ１Ｂ及びＦｏｘＭ１Ｃは何れも転写的に活性である。ＦｏｘＭ１Ａにおけるトランス活性化ドメインのこの混乱は、転写不活性化につながるだけでなく、この変異体は、機能的トランス活性化ドメインが存在しない状態で正常なＤＮＡ結合活性を保持していることから、ドミナントネガティブ変異体としての作用をも生じさせられるかもしれない (H. Ye, T.F. Kelly, U. Samadani, L. Lim, S. Rubio, D.G. Overdier, K.A. Roebuck, R.H. Costa, Mol. Cell Biol. 17 (1997) 1626-1641)。
ＦｏｘＭ１は、神経、胃腸及び生殖器起源のものを含む幅広い範囲の腫瘍タイプにおいて過剰発現される(Bektas et al., supra; Nakamura et al., 2004, Oncogene 23: 2385-400; Pilarsky et al., 2004, Neoplasia .Q: 744-50; Liu et al., 2006, Cancer Res 66: 3593-602参照）。ＦｏｘＭ１のこの発現パターンは、細胞周期の進行に必要な遺伝子をトランス活性化するＦｏｘＭ１の能力に起因する(Wang et al.,2002, Proc Nat. Acad Sci US A 99:16881-6)。ヒトの基底細胞癌に見られるＦｏｘＭ１Ｂの増大した核染色は、ＦｏｘＭ１が、ヒトのがんにおける細胞増殖に必要であることを示す(Teh et al., 2002, Cancer Res. 62: 4773-80)。しかし、腫瘍進行の確立又は助長及び疾患管理におけるＦｏｘＭ１の詳細な役割は完全には解明されていない。
ＥＰ ２ ２９８ ８９６は、ＦｏｘＭ１Ｂタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ分子、及び腫瘍増殖阻害のためのｓｉＲＮＡ分子の使用を開示している。
国際公開第２０１１／１２７２９７号は、乳がんの治療のためのＦｏｘＭ１阻害剤とハーセプチンを含む組成物を開示している。該阻害剤は、例えば、ＦｏｘＭ１特異的ｓｉＲＮＡ、又はチオストレプトン等のチアゾール抗生物質である。
本発明が解決しようとする問題点は、がんの治療のための新規化合物を提供することであった。
第一の態様において、本発明は、がんの予防又は治療における使用のためのＦｏｘＭ１遺伝子（スプライシングモディファイヤー）の選択的スプライシングを誘導する化合物であって、転写的に不活性なＦｏｘＭ１変異体を誘導する化合物を提供する。
特定の実施態様において、転写的に不活性なＦｏｘＭ１変異体はＦｏｘＭ１Ａである。
特定の実施態様において、ＦｏｘＭ１遺伝子は、ヒトＦｏｘＭ１遺伝子である。
特定の実施態様において、がんは、肝臓、前立腺、脳、乳房、肺、結腸、膵臓、皮膚、子宮頸部、卵巣、口、血液及び神経系のがんから成る群より選択される。
特定の実施態様において、がんの予防又は治療における使用のためのＦｏｘＭ１スプライシングモディファイヤーは式Ｉ：
（Ｉ）
[上式中、Ｒ１は、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキルから選択され、この三つの置換基はすべて、Ｃ１−７アルキル、Ｃ１−７アルコキシ、Ｃ１−７ハロアルコキシ、Ｃ１−７ハロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ＮＯ２で置換されていてもよく；
Ｒ２は、ヘテロシクロアルキル、ＮＲ’Ｒ’’で置換されていてもよいＣ１−７アルコキシ、又はヒドロキシ、ＮＲ’Ｒ’’−Ｃ１−７アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−７アルキル、Ｃ３−８シクロプロピル、ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−７アルコキシ−Ｃ１−７アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−７アルコキシ−Ｃ１−７アルキル、ハロゲン又はアザスピロシクロアルキル、アザビシクロアルキル、ＮＲ‘Ｒ’‘で置換されていてもよいＣ２−７アルキニルで置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、又はＣ１−７アルキルで置換されていてもよいヘテロアリールであり；
Ｒ３は、ハロゲン、Ｃ１−７アルキルであり；
Ｒ｀及びＲ｀｀は、水素、Ｃ１−７アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−７アルキルから独立して選択される]
の化合物である。
特定の実施態様において、がんの予防又は治療における使用のためのＦｏｘＭ１スプライシングモディファイヤーは、式（Ｉ）の化合物であり、式中、Ｒ１は、アリール又はヘテロアリールであり、何れの置換基もＣ１−７アルキル、Ｃ１−７ハロアルキル、ハロゲン、Ｃ１−７アルコキシ、ＮＲ’Ｒ’’で置換されていてもよく、Ｒ２は、ヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルであり、何れの置換基もＣ１−７アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−７アルキル、ハロ−Ｃ１−７アルキルで置換されていてもよく、Ｒ３は、Ｃ１−７アルキルである。
特定の実施態様において、本発明は式（Ｉ）の化合物に関し、式中：
Ｒ１は、フェニル、イミダゾ［１，２−ａ］ピラジニル、ピラゾロ［１，５−ａ］ピラジニル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、１，３−ベンゾオキサゾリル、インダゾリルである。
特定の実施態様において、がんの予防又は治療における使用のためのＦｏｘＭ１スプライシングモディファイヤーは、式（Ｉ）の化合物であり、式中、Ｒ２は、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、ピリジニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、ピロリジニルである。
本発明は、がんの予防又は治療用医薬の調製のための、本発明の化合物の使用を更に提供する。
更なる態様では、本発明は、本発明の化合物を含む薬学的製剤を提供する。
更なる態様では、本発明は、本発明の化合物の有効量を、それを必要としている対象に投与することを含む、がんの予防又は治療のための方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、がんの予防又は治療のための化合物のスクリーニング方法であって：
ａ）ＦｏｘＭ１遺伝子を発現している増殖細胞を試験化合物と接触させること、
ｂ）工程ａ）の細胞中の、ＦｏｘＭ１の変異体ＦｏｘＭ１Ａを測定すること
を含み、コントロールと比較したＦｏｘＭ１Ａ変異体のレベルの増加が、がんの予防又は治療のための化合物であることを示唆している方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、がんの予防又は治療のための化合物のスクリーニング方法であって：
ａ）ＦｏｘＭ１遺伝子を発現している増殖細胞を試験化合物と接触させること、
ｂ）工程ａ）の細胞中の、ＦｏｘＭ１の変異体ＦｏｘＭ１Ｂ及び／又は変異体ＦｏｘＭ１Ｃを測定すること
を含み、コントロールと比較した変異体ＦｏｘＭ１Ｂ及び／又は変異体ＦｏｘＭ１Ｃのレベルの低下が、がんの予防又は治療のための化合物であることを示唆している方法を提供する。
本発明の方法の特定の実施態様において、細胞は、線維芽細胞である。
本発明の方法の特定の実施態様において、ＦｏｘＭ１の変異体はＲＮＡのレベルで測定される。
本発明の方法の特定の実施態様において、ＦｏｘＭ１の変異体はタンパク質のレベルで測定される。
線維芽細胞におけるＦｏｘＭ１のＦｏｘＭ１Ａへの選択的スプライシングの誘導。ヒト線維芽細胞を、異なる用量の化合物１−４とともに２４時間インキュベートし、ＦｏｘＭ１Ａ ＲＮＡ（エクソンＡ２を含む）及びＦｏｘＭ１Ｂ／Ｃ（エクソンＡ２を含まない）ｍＲＮＡ発現の変化をＲＴ−ｑＰＣＲにより評価した。用量反応曲線をヒルの結合方程式にフィットさせ、ＥＣ５０を推定した。図１Ａ：ＦｏｘＭ１Ａ ｍＲＮＡのアップレギュレーション；図１Ｂ：ＦｏｘＭ１Ｂ／Ｃ ｍＲＮＡのダウンレギュレーション；図１Ｃ：ＦｏｘＭ１ＡアップレギュレーションのＥＣ５０値とＦｏｘＭ１Ｂ／ＣダウンレギュレーションのＥＣ５０値の相関関係。データは、４つの独立した観測値の平均値±ＳＥＭを表す。 化合物による増殖停止及び細胞死の誘導。線維芽細胞におけるＦｏｘＭ１のＦｏｘＭ１Ａへの選択的スプライシング。ヒト線維芽細胞を、異なる用量の化合物１−４とともに５日間（１２０時間）インキュベートし、細胞インピーダンス（セルインデックス）の変化をオンラインで評価した。データは、各ウェルの開始値に対して正規化した後のデルタセルインデックスとして表す。７２、９６及び１２０時間の時点（矢印参照）のデータを定量化のために平均した。図２Ａ：化合物２の用量増加に伴う線維芽細胞の増殖曲線。相対的に低い用量は増殖を明らかに鈍化させ、＞１μＭの用量は、細胞に対して毒性であったことに注目されたい；図２Ｂ：無処理コントロールの％として表した、化合物１−４によるセルインデックスの用量依存的低下。７５％のカットオフ値（ＥＣ７５％、破線）は、増殖及び細胞生存に対する有意な影響が観察された濃度を定義した。データは、４つの独立した観測値の平均値±ＳＥＭを表す。 ＦｏｘＭ１Ａへの選択的スプライシングの誘導は、線維芽細胞におけるセルインデックスに対する影響と相関する。ＦｏｘＭ１変異体のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションのＥＣ５０値は、図１及び２で得られたセルインデックスのＥＣ７５％と相関していた。図３Ａ：ＥＣ７５％（セルインデックス）とＥＣ５０（ＦｏｘＭ１Ｂ／Ｃ）の相関；図３Ｂ：ＥＣ７５％（セルインデックス）とＥＣ５０（ＦｏｘＭ１Ａ）の相関。データは、４つの独立した観測値の平均値±ＳＥＭを表す。 ＦｏｘＭ１Ａタンパク質のアップレギュレーションは筋芽細胞における細胞傷害性と相関する。ヒト筋芽細胞を、増殖条件下（血清の存在下）で５日間、化合物３（０．１、１及び１０μＭ）で処理し、全タンパク質抽出物をＳＤＳ ＰＡＧＥにより、ＦｏｘＭ１Ａ及びアクチンタンパク質レベルについてはウェスタンブロットにより分析した。図４Ａ：化合物３（０．１、１及び１０μＭ）での処理なし（コントロール）又は処理ありの試料からの、ＦｏｘＭ１Ａ及びアクチンのウェスタンブロット；図４Ｂ：アクチンのタンパク質レベル（細胞数の代わり）；図４Ｃ：ＦｏｘＭ１Ａのタンパク質レベル；図４Ｄ：ＦｏｘＭ１Ａ／アクチン比。データは、３つの独立した観測値の平均値±ＳＥＭを表す。統計的比較は、一方向ＡＮＯＶＡに続いてダネットのポストホックテストにより実施した。＊，ｐ＜０．０５、＊＊，ｐ＜０．０１、＊＊＊，ｐ＜０．００１。 ＦｏｘＭ１Ａタンパク質に変化なし。また、非増殖の筋芽細胞における細胞傷害性なし。ヒト筋芽細胞を、分化条件下（血清の非存在下）で５日間、化合物３（０．１、１及び１０μＭ）で処理し、全タンパク質抽出物をＳＤＳ ＰＡＧＥにより、ＦｏｘＭ１Ａ及びアクチンタンパク質レベルについてはウェスタンブロットにより分析した。図５Ａ：化合物３（０．１、１及び１０μＭ）での処理なし（コントロール）又は処理ありの試料からの、ＦｏｘＭ１Ａ及びアクチンのウェスタンブロット。ＦｏｘＭ１Ａタンパク質が検出不能であることに注目；図５Ｂ：アクチンのタンパク質レベル。データは、３つの独立した観測値の平均値±ＳＥＭを表す。統計的比較は、一方向ＡＮＯＶＡに続いてダネットのポストホックテストにより実施した。 ＦｏｘＭ１Ａタンパク質のアップレギュレーションは乳がん細胞における細胞傷害性と相関する。ヒトＢＴ４７４乳がん細胞を、増殖条件下（血清の存在下）で１日又は２日間、１０μＭの化合物２で処理し、全タンパク質抽出物をＳＤＳ ＰＡＧＥにより、ＦｏｘＭ１Ａ及びアクチンタンパク質レベルについてはウェスタンブロットにより分析した。図６Ａ：化合物２（１０μＭ）での処理なし（コントロール）又は１日（薄い灰色）若しくは２日（濃い灰色）間の処理ありの試料からの、ＦｏｘＭ１Ａ及びアクチンのウェスタンブロット；図６Ｂ：アクチンのタンパク質レベル（細胞数の代わり）；図６Ｃ：ＦｏｘＭ１Ａのタンパク質レベル；Ｄ：ＦｏｘＭ１Ａ／アクチン比。データは、３つの独立した観測値の平均値±ＳＥＭを表す。統計的比較は、一方向ＡＮＯＶＡに続いてダネットのポストホックテストにより実施した。＊，ｐ＜０．０５、＊＊＊，ｐ＜０．００１。
用語「ＦｏｘＭ１ポリペプチド」は、本明細書において、任意の動物（例えば、ヒトを含む哺乳動物種）由来の天然ＦｏｘＭ１ポリペプチド及びＦｏｘＭ１変異体を指すために用いられる。ヒトＦｏｘＭ１Ａポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１に示され、ヒトＦｏｘＭ１Ｂのアミノ酸配列は、配列番号２に示され、またＦｏｘＭ１Ｃポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３に示される。
三つのＦｏｘＭ１変異体のヌクレオチド配列は、配列番号４（ＦｏｘＭ１Ａ）、配列番号５（ＦｏｘＭ１Ｂ）及び配列番号６（ＦｏｘＭ１Ｃ）に示される。
用語「ＦｏｘＭ１遺伝子のスプライシングを修飾する化合物」は、本明細書において、転写的に不活性な形態（特にＦｏｘＭ１Ａ）が生成されるようにＦｏｘＭ１スプライシングを修飾することにより、及び転写的に活性なＦｏｘＭ１変異体（特にＦｏｘＭ１Ｂ及びＦｏｘＭ１Ｃ）の生成を抑制することにより、ＦｏｘＭ１ポリペプチドの転写的に不活性な形態の生成に、特にＦｏｘＭ１Ａ変異体の生成につながる化合物を指すために使用される。
用語「化合物」は、本明細書において、本発明のアッセイに関連して記載する「試験化合物」又は「薬物候補化合物」の文脈で使用される。そのため、こうした化合物は、合成的に若しくは天然起源から得られる有機又は無機化合物を含む。該化合物は、比較的低い分子量により特徴付けられる無機化合物又は有機化合物、例えば、ポリヌクレオチド、脂質又はホルモン類似体を含む。他の生体高分子有機試験化合物は、約２個から約４０個のアミノ酸を含むペプチド及び約４０個から約５００個のアミノ酸を含むより大きなポリペプチド、例えば、抗体又は抗体コンジュゲートを含む。
生体物質中のポリペプチドの検出及び／又は測定のための方法は、当技術分野では周知であり、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡ、又は様々なプロテオミクス手法を含むがこれらに限定されない。ポリペプチドを測定する方法の一例は、ＥＬＩＳＡである。この種のタンパク質定量は、特異抗原を捕捉可能な抗体及び捕捉された抗原を検出可能な二次抗体に基づく。前述のアッセイは、Harlow, E.及びLane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
生体物質中のＲＮＡの検出及び／又は測定のための方法は当技術分野では周知であり、ノーザンブロッティング、ＲＮＡプロテクションアッセイ、ＲＴ ＰＣＲを含むがこれらに限定されない。好適な方法は、Michael R. Green、Joseph SambrookによるMolecular Cloning: A Laboratory Manual(第四版) Peter MacCallum (c) 2012, 2,028 pp, ISBN 978-1-936113-42-2に記載されている。
用語「本発明の化合物」は、ＦｏｘＭ１遺伝子のスプライシングを修飾する化合物、特に式（Ｉ）の化合物並びにその立体異性体、互変異性体、溶媒和物及び塩（例えば、薬学的に許容される塩）を指す。
用語「薬学的に許容される塩」は、生物学的に又はそれ以外の理由で望ましくないものではない塩を指す。薬学的に許容される塩は、酸付加塩及び塩基付加塩の両方を含む。
用語「薬学的に許容される酸付加塩」は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸等の無機酸、並びに有機酸の脂肪族酸、環状脂肪族、芳香族、芳香脂肪族、複素環式、カルボン酸及びスルホン酸のクラスから選択される有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン（ｍａｌｏｎｅｉｃ）酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、グルタミン酸、アンスラニル酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、エンボン酸（ｅｍｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸及びサリチル酸で形成された塩で、薬学的に許容されるものを指す。
用語「薬学的に許容される塩基付加塩」は、有機又は無機塩基で形成された塩で薬学的に許容されるものを指す。許容される無機塩基の例は、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩及びアルミニウム塩を含む。薬学的に許容される有機非毒性塩基から誘導される塩は、第一級、第二級及び第三級アミン、天然の置換アミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂を含む置換アミン類（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン（ｈｙｄｒａｂａｍｉｎｅ）、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン類、ピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｚｉｎｅ）、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン及びポリアミン樹脂類等）の塩を含む。
用語「アルコキシ」は、Ｒ’がアルキル基である式−Ｏ−Ｒ’の基を指す。アルコキシ部分の例は、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ及びｔｅｒｔ−ブトキシを含む。
用語「アルコキシアルキル」は、アルキル基の少なくとも一つの水素原子がアルコキシ基で置換されているアルキル基を指す。例示的なアルコキシアルキル基は、２−メトキシエチル、３−メトキシプロピル、１−メチル−２−メトキシエチル、１−（２−メトキシエチル）−３−メトキシプロピル及び１−（２−メトキシエチル）−３−メトキシプロピルを含む。
用語「アルキル」は、１から１２個の炭素原子から成る、一価直鎖状又は分枝鎖状飽和炭化水素基を指す。特定の実施態様では、アルキルは、１から７個の炭素原子を有し、更に特定の実施態様では１から４個の炭素原子を有する。アルキルの例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチルを含む。
用語「アルキニル」は、一つ、二つ又は三つの三重結合を含む２から７個の炭素原子から成る、一価直鎖状又は分枝鎖状飽和炭化水素基を指す。特定の実施態様では、アルキニルは、一つ又は二つの三重結合を含む２から４個の炭素原子を有する。アルキニルの例は、エチニル、プロピニル、プロパ−２−イニル、イソプロピニル、ｎ−ブチニル及びイソ−ブチニルを含む。
用語「アリール」は、６から１０個の炭素環原子を含む、一価芳香族炭素環式の単環又は二環系を指す。アリール部分の例は、フェニル及びナフチルを含む。
用語「シクロアルキル」は、３から１０個の環炭素原子から成る、一価飽和単環式又は二環式炭化水素基を指す。特定の実施態様において、シクロアルキルは、３から８個の環炭素原子から成る、一価飽和単環式炭化水素基を指す。二環式とは、一又は複数の炭素原子を共有する二つの飽和炭素環から成ることを意味する。特定のシクロアルキル基は単環式である。単環式シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブタニル、シクロペンチル、シクロヘキシル又はシクロヘプチルである。二環式シクロアルキルの例は、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル又はビシクロ［２．２．２］オクタニルである。
用語「ハロアルコキシ」は、アルコキシ基の少なくとも一つの水素原子が、同じか異なるハロゲン原子、特にフルオロ原子（fluoro atom）で置換されているアルコキシ基を指す。ハロアルコキシの例は、モノフルオロ−、ジフルオロ−又はトリフルオロ−メトキシ、−エトキシ又は−プロポキシ、例えば３，３，３−トリフルオロプロポキシ、２−フルオロエトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、フルオロメトキシ又はトリフルオロメトキシを含む。用語「ペルハロアルコキシ」は、アルコキシ基のすべての水素原子が、同じか異なるハロゲン原子で置換されているアルコキシ基を指す。
用語「ハロアルキル」は、アルキル基の少なくとも一つの水素原子が、同じか異なるハロゲン原子、特にフッ素原子で置換されているアルキル基を指す。ハロアルキルの例は、モノフルオロ−、ジフルオロ−又はトリフルオロ−メチル、−エチル又は−プロピル、例えば３，３，３−トリフルオロプロピル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、フルオロメチル又はトリフルオロメチルを含む。用語「ペルハロアルキル」は、アルキル基のすべての水素原子が、同じか異なるハロゲン原子で置換されているアルキル基を指す。
用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１、２、３又は４個のヘテロ原子を含み、残りの環原子が炭素である５から１２個の環原子から成る、一価芳香族複素環式の単環又は二環系を指す。ヘテロアリール部分の例は、ピラゾロ［１，５−ａ］ピラジニル、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル又はキノキサリニルを含む。
用語「ヘテロシクロアルキル」は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２又は３個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子が炭素である３から９個の環原子から成る、一価の飽和又は部分不飽和の単環又は二環系を指す。特定の実施態様では、ヘテロシクロアルキルは、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１、２又は３個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子が炭素である４から７個の環原子から成る、一価飽和単環式環系である。単環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、アジリジニル、オキシラニル、アゼチジニル、オキセタニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ−チエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル又はオキサゼパニルである。二環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、キヌクリジニル、８−オキサ−３−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、３−オキサ−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル又は３−チア−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニルである。部分不飽和ヘテロシクロアルキルの例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロ−オキサゾリル、テトラヒドロ−ピリジニル又はジヒドロピラニルである。
用語「ヒドロキシアルキル」は、アルキル基の少なくとも一つの水素原子がヒドロキシ基で置換されているアルキル基を指す。ヒドロキシアルキルの例は、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、２，３−ジヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチルエチル、２，３−ジヒドロキシブチル、３，４−ジヒドロキシブチル又は２−（ヒドロキシメチル）−３−ヒドロキシプロピルを含む。
「任意選択の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」又は「任意選択的に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」という用語は、続いて記載される事象又は状況が生じ得るが生じる必要がないこと、また、その記載が、事象又は状況が生じる場合と生じない場合の両方を含むことを意味する。
用語「置換されている（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」とは、特定の基が、一又は複数の置換基を有することを言う。任意の基が複数の置換基を有することができ、且つ種々の可能な置換基が提供される場合、置換基は独立して選択され、同じである必要はない。用語「無置換の（ｕｎｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」は、特定の基が置換基を有さないことを意味する。用語「置換されていてもよい（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」は、特定の基が、無置換であるか、又は可能な置換基の群から独立して選択される一又は複数の置換基で置換されていることを意味する。置換基の数を示す場合、用語「一又は複数の」は、一つの置換基から可能な限りの数の置換まで、すなわち、置換基による水素１個の置換からすべての水素の置換までを意味する。
薬学的組成物及び投与
別の実施態様は、本発明の化合物及び治療上不活性な担体、希釈剤若しくは賦形剤を含有する薬学的組成物又は医薬、並びにそのような組成物及び医薬を調製するための、本発明の化合物の使用方法を提供する。一実施例では、式Ｉの化合物は、周囲温度で、適切なｐＨ及び所望の純度で、生理学的に許容される担体、すなわち、用いる用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性の担体と混合することによりガレヌス（galenical）投与形態に製剤化されうる。製剤のｐＨは主に、特定の用途及び化合物の濃度に依存するが、好ましくは約３から約８までの範囲である。一実施例では、式Ｉの化合物は、酢酸緩衝液中ｐＨ５で製剤化される。別の実施態様において、式Ｉの化合物は無菌である。該化合物は、例えば、固体又は非晶質組成物として、凍結乾燥製剤として、又は水溶液として保存されてもよい。
組成物は、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）にかなう方式で製剤化され、用量化され、投与される。この観点において考慮すべき要因は、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。投与される化合物の「有効量」は、このような考慮事項によって決まり、ＦｏｘＭ１遺伝子スプライシングの修飾をするために必要な最小量である。例えば、このような量は、正常な細胞又は哺乳動物全体に毒性である量より少ないであろう。
本発明の化合物は、経口、局所（口腔及び舌下を含む）、直腸内、膣内、経皮、非経口、皮下、腹腔内、肺内、皮内、髄腔内及び硬膜外及び鼻腔内、並びに、必要に応じて局所治療、病巣内投与を含む任意の適切な方法により投与されうる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。
本発明の化合物は、例えば、錠剤、粉末、カプセル、溶液、分散液、懸濁液、シロップ、スプレー、坐薬、ジェル、乳液、パッチ等の任意の簡便な投与形態で投与され得る。このような組成物は、薬学的調製物における一般的な成分、例えば、希釈剤、担体、ｐＨ調整剤、甘味料、増量剤及び追加の活性剤を含有しうる。
典型的な製剤は、本発明の化合物と担体又は賦形剤とを混合することにより調製される。適切な担体及び賦形剤は当業者に周知であり、例えば、 Ansel, Howard C., et al., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004; Gennaro, Alfonso R., et al. Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; 及びRowe, Raymond C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Chicago, Pharmaceutical Press, 2005に詳細な記載がある。製剤はまた、薬剤（すなわち、本発明の化合物又はその薬学的組成物）を見栄え良く提供するため又は薬学的製品（すなわち、医薬）の製造を補助するための一又は複数の緩衝液、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、平滑剤、乳化剤、懸濁化剤、保存料、酸化防止剤、不透明化剤、流動促進剤、加工助剤、着色料、甘味料、香料、香味料、希釈剤及びその他既知の添加剤も含みうる。
適切な経口投与形態の一例は、約９０ｍｇから３０ｍｇの無水ラクトース、約５から４０ｍｇのクロスカルメロースナトリウム、約５から３０ｍｇのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）Ｋ３０及び約１から１０ｍｇのステアリン酸マグネシウムを配合した本発明の化合物を約２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ又は５００ｍｇ含有する錠剤である。粉末成分は最初に混ぜ合わせ、次にＰＶＰの溶液と混合する。得られた組成物は、乾燥させ、顆粒化し、ステアリン酸マグネシウムと混合し、一般的な装置を使用して錠剤の形態に圧縮することができる。エアロゾル製剤の一例は、例えばリン酸緩衝液等の適切な緩衝液中に例えば５から４００ｍｇの本発明の化合物を溶解させ、必要に応じて等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）、例えば塩化ナトリウム等の塩を添加することによって調製されうる。この溶液を、不純物及び混入物を除去するために、例えば０．２ミクロンのフィルターを用いて濾過してもよい。
したがって、ある実施態様は、式Ｉの化合物又はその立体異性体若しくは薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物を含む。更なる実施態様は、薬学的に許容される担体又は賦形剤と共に式Ｉの化合物又はその立体異性体若しくは薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物を含む。
別の実施態様は、過剰増殖性疾患の治療における使用のための式Ｉの化合物を含む薬学的組成物を含む。別の実施態様は、がんの治療における使用のための式Ｉの化合物を含む薬学的組成物を含む。
特定の実施態様では、本発明の化合物によって治療されるがんは、白血病、急性骨髄性白血病、結腸がん、胃がん、黄斑変性、急性単球白血病、乳がん、肝細胞癌、錐体杆体変性、胞巣状軟部肉腫、骨髄腫、皮膚黒色腫、前立腺炎、膵炎、膵臓がん、網膜炎、腺癌、咽頭扁桃炎、腺様嚢胞癌、白内障、網膜変性、消化管間質腫瘍、ウェグナー肉芽腫症、肉腫、筋障害、前立腺腺癌、ホジキンリンパ腫、卵巣がん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、腎細胞癌、移行上皮癌、結腸直腸がん、慢性リンパ球性白血病、未分化大細胞型リンパ腫、腎臓がん、乳がん、子宮頸がんである。
特定の態様において、本発明に従って予防及び／又は治療されるがんは、基底細胞癌、杯細胞異形成又は悪性神経膠腫、肝臓、乳房、肺、前立腺、子宮頸部、子宮、結腸、膵臓、腎臓、胃、膀胱、卵巣又は脳のがんである。
特定の態様において、本発明に従って予防及び／又は治療されるがんは、限定されないが、頭頚部、眼、口、喉、食道、食道、胸部、骨、肺、腎臓、結腸、直腸又は他の胃腸管の器官、胃、脾臓、骨格筋、皮下組織、前立腺、乳房、卵巣、睾丸又は他の生殖器、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓及び脳又は中枢神経系のがんを含む。
本発明に従って予防及び／又は治療されうるがんの具体例は、限定されないが、次のものを含む：腎がん、腎臓がん、多形神経膠芽腫、転移性乳がん、乳癌；乳房肉腫；神経線維腫；神経線維腫症；小児腫瘍；神経芽細胞腫；悪性黒色腫；上皮の癌；白血病（例えば、限定されないが、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（例えば、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病及び骨髄異形成症候群）、慢性白血病（例えば、限定されないが、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病））；真性多血症；リンパ腫（例えば、限定されないが、ホジキン病、非ホジキン病）；多発性骨髄腫（例えば、限定されないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化症骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫及び髄外性形質細胞腫）；ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症；意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症；良性単クローングロブリン血症；Ｈ鎖病；骨がん及び結合組織肉腫（例えば、限定されないが、骨肉腫、骨髄腫骨疾患、多発性骨髄腫、コレステリン腫誘導性骨肉腫、骨のページェット病、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫（血管内皮腫）、線維肉腫、カポシ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘種、横紋筋肉腫及び滑膜肉腫）；脳腫瘍（例えば、限定されないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起神経膠腫、非グリア腫瘍、聴神経腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫及び原発性脳リンパ腫）；乳がん（例えば、限定されないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、乳管内癌、髄様乳がん、粘液性乳がん、管状乳がん、乳頭状乳がん、ページェット病（若年性ページェット病を含む）及び炎症性乳がん）；副腎がん（例えば、限定されないが、クロム親和性細胞腫及び副腎皮質癌）；甲状腺がん（例えば、限定されないが、乳頭状又は濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん及び甲状腺未分化がん）；膵臓がん（例えば、限定されないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍及びカルチノイド又は膵島細胞腫瘍）；下垂体がん（例えば、限定されないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症及び尿崩症）；眼のがん（例えば、限定ないが、眼内黒色腫（例えば、虹彩黒色腫、脈絡膜悪性黒色腫及び毛様体黒色腫）及び網膜芽細胞腫）；膣がん（例えば、扁平上皮癌、腺癌及び黒色腫）；外陰がん（例えば、扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫及びページェット病）；子宮頸がん（例えば、限定されないが、扁平上皮癌及び腺癌）；子宮がん（例えば、限定されないが、子宮内膜癌及び子宮肉腫）；卵巣がん（例えば、限定されないが、卵巣上皮癌、境界腫瘍、胚細胞腫瘍及び間質腫瘍）；子宮頸癌；食道がん（例えば、限定されないが、扁平上皮がん、腺癌、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、いぼ状癌及び燕麦細胞（小細胞）癌）；胃がん（例えば、限定されないが、腺癌、菌状（ポリープ状）、潰瘍性、表在拡大型、びまん性拡大型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫及び癌肉腫）；結腸がん；ＫＲＡＳ変異型結腸直腸がん；結腸癌；直腸がん；肝臓がん（例えば、限定されないが、肝細胞癌及び肝芽細胞腫）、胆嚢がん（例えば、腺癌）；胆管癌（例えば、限定されないが、乳頭状、結節状及びびまん性）；肺がん（例えば、ＫＲＡＳ変異型非小細胞肺がん、非小細胞肺がん、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌及び小細胞肺がん）；肺癌；精巣がん（例えば、限定されないが、生殖細胞腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的（定型）、精母細胞、非精上皮腫、胎生期癌、奇形癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍））、前立腺がん（例えば、限定されないが、アンドロゲン非依存性前立腺がん、アンドロゲン依存性前立腺がん、腺癌、平滑筋肉腫及び横紋筋肉腫）；陰茎（ｐｅｎａｌ）がん；口腔がん（例えば、限定されないが、扁平上皮癌）；基底がん；唾液腺がん（例えば、限定されないが、腺癌、粘表皮癌及び腺様嚢胞癌）；咽頭がん（例えば、限定されないが、扁平上皮がん及びいぼ状がん）；皮膚がん（例えば、限定されないが、基底細胞癌、扁平上皮癌及び黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫）；腎臓がん（例えば、限定されないが、腎細胞がん、腺癌、グラヴィッツ腫瘍、線維肉腫、移行上皮がん（腎盂及び／又は子宮））；腎癌；ウィルムス腫瘍；膀胱がん（例えば、限定されないが、移行上皮癌；扁平上皮がん、腺癌、癌肉腫）。更に、がんは、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌及び乳頭腺癌を含む。
特定の実施態様では、本発明に従って予防及び／又は治療されうるがんは、次のものを含む：小児固形腫瘍、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、神経線維腫、上皮の癌、悪性黒色腫、子宮頸癌、結腸癌、肺癌、腎性癌、乳癌、乳房肉腫、転移性乳がん、ＨＩＶ関連カポシ肉腫、前立腺がん、アンドロゲン非依存性前立腺がん、アンドロゲン依存性前立腺がん、神経線維腫症、肺がん、非小細胞肺がん、ＫＲＡＳ変異型非小細胞肺がん、悪性黒色腫、黒色腫、結腸がん、ＫＲＡＳ変異型結腸直腸がん、多形神経膠芽腫、腎がん、腎臓がん、膀胱がん、卵巣がん、肝細胞癌、甲状腺癌、横紋筋肉腫、急性骨髄性白血病及び多発性骨髄腫。
特定の実施態様において、本発明に従って予防及び／又は治療されるがん及び疾患で関連するものは、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巣癌、莢膜細胞腫、男性胚細胞腫、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮内膜過形成、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、頭頚部がん、鼻咽頭癌、咽頭癌、肝芽細胞腫、カポシ肉腫、黒色腫、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽細胞腫、膵臓癌、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、膠芽細胞腫、シュワン腫、乏突起神経膠腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症（ｐｈａｋｏｍａｔｏｓｅｓ）に関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するもの）又はメイグス症候群である。特定の実施態様では、がんは、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、乏突起神経膠腫要素と星状細胞腫要素との混合型、上衣腫、髄膜腫、下垂体腺腫、原始神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫又はＣＮＳ胚細胞腫瘍である。
特定の実施態様では、本発明に従って治療されるがんは、聴神経腫、未分化星状細胞腫、及び多形神経膠芽腫又は髄膜腫である。
他の特定の実施態様では、本発明に従って治療されるがんは、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、若年性毛様細胞性星状細胞腫、髄芽腫、視神経膠腫、原始神経外胚葉性腫瘍又は横紋筋肉腫様腫瘍である。
化合物３の調製
工程Ａ：アセトン（２００ｍＬ）中１Ｈ−ピラゾール−３，５−ジカルボン酸ジエチル（１０．０ｇ、４７ｍｍｏｌ）及びクロロアセトン（３．７６ｍＬ、４７ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（７．２ｇ、５２ｍｍｏｌ）を添加した。３０℃で６時間加熱後、混合物を濃縮し、揮発性物質を除去した。残留物をＥｔＯＡｃに取り、水で洗浄した。有機物をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して１−（２−オキソプロピル）−１Ｈ−ピラゾール−３，５−ジカルボン酸ジエチルを明褐色の固体として得、それを次の工程でそのまま使用した。MS m/z 269.1 [M+H]+
工程Ｂ：酢酸（３００ｍＬ）中１−（２−オキソプロピル）−１Ｈ−ピラゾール−３，５−ジカルボン酸ジエチル（〜４７ｍｍｏｌ）の溶液に、酢酸アンモニウム（７２ｇ、９４０ｍｍｏｌ）を添加した。４８時間還流後、混合物を最小体積まで濃縮し、水で希釈した。沈殿物を濾過し、水とＭｅＣＮで洗浄し、４−ヒドロキシ−６−メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−カルボン酸エチルを褐色の固体として得た（６．７ｇ、６４％）。MS m/z 222.1 [M+H]+
工程Ｃ：ＰＯＣｌ３（８０ｍＬ）中４−ヒドロキシ−６−メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−カルボン酸エチル（７．１８ｇ、３２．５ｍｍｏｌ）の混合物を１５時間還流した。暗色混合物を濃縮し、ＭｅＣＮで洗浄し、４−クロロ−６−メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−カルボン酸エチル（５．１９７ｇ）をオフホワイトの固体として得た。濾液を濃縮し、クロマトグラフィーにかけて更に１．４２ｇの生成物（６．６１７ｇ、８５％）を得た。 MS m/z 240.1 [M+H]+, 242.1 [M+2+H]+
工程Ｄ：ＤＭＦ（１００ｍＬ）中４−クロロ−６−メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−カルボン酸エチル（５．１９７ｇ、２１．７ｍｍｏｌ）、ＭｅＢ（ＯＨ）２（３．９０ｇ、６５．１ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（１４．８ｇ、１０７．５ｍｍｏｌ）及びＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（４５６ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の混合物を脱気し、Ｎ２下で１５時間加熱した。混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、ＤＭＦの大部分を除去し、水で洗浄した。残留物を、クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中２％−５％ＭｅＯＨ）にかけ、４，６−ジメチルピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−カルボン酸エチルを黄色固体として得た（３．９０ｇ、８２％）。MS m/z 220.1 [M+H]+; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 8.54 (1H, s), 7.49 (1H, s), 4.36 (2H, q, J=7.2 Hz), 2.70 (3H, s), 2.42 (3H, s), 1.34 (3H, t, J = 7.2Hz)
工程Ｅ：−７８℃の、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中酢酸ｔ−ブチル（１．６３ｍＬ、１２．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＬＤＡ（１．５Ｍ、０．９７ｍＬ、１４．５ｍｍｏｌ）を添加した。０．５時間後、該溶液を、−３０℃の、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中４，６−ジメチルピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−カルボン酸エチル（１．３３ｇ、６．０７ｍｍｏｌ）の溶液にカニューレ挿入した。１時間後、該混合物を、飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、ｐＨを５−６に調整し、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機物を乾燥させ、濃縮した。残留物を、クロマトグラフィー（２％−４％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）にかけ、ｔ−ブチル ３−（４，６−ジメチルピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−イル）−３−オキソプロパノアートを黄色油として得た（１．６９６ｇ、９７％）。MS m/z 290.2 [M+H]+; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 8.57 (1H, s), 7.50 (1H, s), 4.02 (2H, s), 2.70 (3H, s), 2.43 (3H, s), 1.38 (9H, s)
工程Ｆ：ＥｔＯＨ（３０ｍｍｏｌ）中ｔ−ブチル ３−（４，６−ジメチルピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−イル）−３−オキソプロパノアート（４．８６ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）の溶液を蓋をした管の中で１２０℃で加熱した。１時間後、該溶液を室温まで冷却し、揮発性物質を除去し、エチル ３−（４，６−ジメチルピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−イル）−３−オキソプロパノアートを黄色固体として得た（４．４４ｇ、９８％）。MS m/z 262.2 [M+H]+
工程Ｇ：２−アミノ−５−フルオロ−ピリジン（１３４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、エチル ３−（４，６−ジメチルピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−イル）−３−オキソプロパノアート（２６１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＰＰＴ（１２．６ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の混合物を１３０℃で加熱した。８時間後、該混合物を室温まで冷却し、クロマトグラフィーにかけ、２−（４，６−ジメチルピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−イル）−７−フルオロ−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オンを黄色固体として得た（２２０ｍｇ、７１％）。MS m/z 310.2 [M+H]+; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 8.97-8.95 (1H, m), 8.55 (1H, s), 8.16-8.12 (1H, m), 7.87-7.85 (1H, m), 7.56 (1H, s), 7.03 (1H, s), 2.73, (3H, s), 2.43 (3H, s)
工程Ｈ：ＤＭＡ（１．０ｍＬ）中２−（４，６−ジメチルピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−２−イル）−７−フルオロ−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン（３０９ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びピペラジン（１．１ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を１２０℃で加熱した。１５時間後、揮発性物質を除去し、残留物をＭｅＣＮで洗浄し、表題化合物を黄色固体として得た（３１３ｍｇ、８０％）。M.P.254-256℃; MS m/z 390.4 [M+H]+; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 8.55 (1H, s), 8.27 (1H, d, J = 2.7 Hz), 8.12 (1H, dd, J = 2.8 Hz, 9.7 Hz), 7.71 (1H, d, J = 9.7 Hz), 7.54 (1H, s), 6.95 (1H, s), 3.25 (4H, m), 2.72 (3H, s), 2.51 (4H, m, obscured by DMSO-d6), 2.43 (3H, s), 2.25 (3H, s)
本明細書で開示される更なる化合物は、適切な出発物質、試薬及び反応条件を代わりに使うことにより、上記の例に従って調製されうる。
国際公開第２０１３／１１９９１６号は、ＦｏｘＭ１スプライシング修飾によるがんの予防又は治療のために使用されうる更なる化合物を開示している。国際公開第２０１３／１１９９１６号は、参照により本明細書に含まれる。
用語「Ｍ．Ｐ．」は「融点（ｏＣ）」、用語「ＭＳ」は「質量分析ピーク m/z [M+H]+, [M+2+H]+, [M-H]- 又は [M+2-H]-」、用語「Ｄ」は、「分解／分解された」を表す。
実施例１：化合物がＦｏｘＭ１のＦｏｘＭ１Ａへの選択的スプライシングを誘導する
ＦｏｘＭ１のスプライシングの効果を調べるため、用量反応範囲の（ｉｎ ｄｏｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）化合物１−４を用いてヒト線維芽細胞を２４時間処理し、Δ９エクソンを含む（ＦｏｘＭ１Ａ）か又は含まない（ＦｏｘＭ１Ｂ／Ｃ）ｍＲＮＡの存在をＲＴ−ｑＰＣＲにより解析した。得られた用量反応曲線は、ヒルの結合方程式にフィットさせた。図１Ａは、全化合物がエクソン９を含むＦｏｘＭ１Ａ ｍＲＮＡの発現を増加させたことを示し、化合物１、２、３及び４のＥＣ５０値はそれぞれ０．２４６、０．０１６、１．２１０及び０．０６８μＭと算出された。それに応じて、エクソン９（Δ９バージョン）を欠くＦｏｘＭ１Ｂ／Ｃアイソフォーム）のｍＲＮＡは低下し、化合物１、２、３及び４のＥＣ５０値はそれぞれ０．７２４、０．０１４、３．５４１及び０．１０４μＭであった。ＦｏｘＭ１ＡのアップレギュレーションとＦｏｘＭ１Ｂ／Ｃのダウンレギュレーションに関するＥＣ５０値の相関分析は、同一線からの明らかなずれがない見事な線形相関（ｒ２＝０．９９２）を明らかにした（図１Ｃ）。データは、ＦｏｘＭ１ＡのアップレギュレーションとＦｏｘＭ１Ｂ／Ｃのダウンレギュレーションとの密接且つ直接的な関数関係を示す。
実施例２：ＦｏｘＭ１Ａへの選択的スプライシングが細胞傷害性を誘導する
細胞増殖及び生存に対する変異ＦｏｘＭ１発現の効果を調査するため、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅプラットフォームで用量反応範囲の化合物１−４を用いてヒト線維芽細胞を１２０時間処理し、増殖速度及び細胞死をオンラインでモニターした。図２Ａに示す通り、化合物２は、５日間で用量０．１及び０．３μＭで増殖に穏やかな効果を及ぼしたのに対し、＞１μＭの用量では強い毒性を誘導した。低下するセルインデックスの定量測定値を、増殖の減速と細胞死の誘導のための読み出しとして定義するために、無処理コントロールに対してセルインデックスを７５％に低下させた化合物の濃度である、７５％のカットオフ値が予測された（ＥＤ７５％）。７２、９６及び１２０時間でのセルインデックスの定量は、全化合物が、高用量でＥＤ７５％に達したことを明らかにした（図２Ｂ）。データは、ＦｏｘＭ１のＦｏｘＭ１Ａへの選択的スプライシングの誘導が増殖の減速及び細胞死を誘導したことを示す。
実施例３：ＦｏｘＭ１の選択的スプライシングが細胞傷害性に相関する
セルインデックスの低下に関するＥＤ７５％の、ＦｏｘＭ１Ｂ／Ｃ低下に関するＥＣ５０との相関関係は見事な線形相関を示した（ｒ２＝０．９６３）。したがって、〜１０倍の活性の変化は、ＥＤ７５％を達成するためには、ＦｏｘＭ１Ｂ／Ｃ低下に関するＥＣ５０を１０倍上回る濃度が必要であることを示した（図３Ａ）。同様に、セルインデックスの低下についてのＥＤ７５％もＦｏｘＭ１Ａ誘導に関するＥＣ５０と相関があり、見事な線形相関（ｒ２＝０．９５１）及び１０から１５倍の活性の変化を示すが、ＥＤ７５％に達するためには、ＦｏｘＭ１Ａの誘導に関するＥＣ５０を１０倍から１５倍上回る濃度が必要であることを示した（図３Ｂ）。データは、ＦｏｘＭ１Ｂ／ＣからＦｏｘＭ１ＡへのＦｏｘＭ１のスプライシングの＞９０の変化が、細胞増殖及び生存の測定値としてのセルインデックスの有意な低下を誘導するために必要であることを示す。
実施例４：ＦｏｘＭ１Ａタンパク質の増加が細胞傷害性と相関する
ＦｏｘＭ１のＦｏｘＭ１Ａへの選択的スプライシングがタンパク質レベル及び細胞死の有意な変化をもたらすのかどうかを評価するために、ヒト初代筋芽細胞を増殖条件下で処理してＦｏｘＭ１発現を調節し、その結果を評価した。増殖条件下では、ＦｏｘＭ１Ａがウェスタンブロットにより検出可能であったが、低濃度であった（図４Ａ）。１０μＭまでの用量の化合物３での処理は、細胞数の直接マーカーであるアクチンのタンパク質レベルを強力に低下させたが、ＦｏｘＭ１Ａのタンパク質レベルは増加させた（図４Ａ）。タンパク質レベルの定量分析は、アクチンがコントロールと比較して６倍低下しており（図４Ｂ）、これに対しＦｏｘＭ１Ａレベルは、同じ試料中で５倍近く増加した（図４Ｃ）。アクチンに正規化した場合、ＦｏｘＭ１Ａタンパク質レベルは、最も高い用量で３０倍増加した（図４Ｄ）。データは、増殖している筋芽細胞においては、ＦｏｘＭ１Ａへの選択的スプライシングがＦｏｘＭ１Ａタンパク質を増加させ、細胞死を誘導すること示す。
実施例５：非増殖条件ではＦｏｘＭ１Ａタンパク質に変化なし
ＦｏｘＭ１のＦｏｘＭ１Ａへの選択的スプライシングが増殖していない細胞中にも存在するかどうかを評価するために、同一のヒト初代筋芽細胞を分化させ、非増殖条件下でもＦＯＸＭ１の発現が存在し、同様に調節されうるかどうかを調査した。分化条件下では、ＦｏｘＭ１Ａは、ウェスタンブロットにより検出不可能であった（図５Ａ）。１０μＭまでの用量の化合物３での処理は、細胞数のマーカーであるアクチンのタンパク質レベルの低下を全く示さなかった（図５Ａ）。タンパク質レベルの定量分析は、アクチンがコントロールと比較して変化しなかったことを示し（図５Ｂ）、一方、アクチンに正規化したＦｏｘＭ１Ａレベルは検出不可能であった。データは、ＦｏｘＭ１Ａ発現が増殖細胞に限られ、ＦｏｘＭ１Ａへの選択的スプライシングは増殖していない細胞における細胞死を誘導しないことを示す。
実施例６：ＦｏｘＭ１Ａタンパク質の増加が乳がん細胞における細胞傷害性を誘導する
ＦｏｘＭ１のＦｏｘＭ１Ａへの選択的スプライシングによるＦｏｘＭ１Ａタンパク質の増加ががん条件において細胞死を誘導するかどうかを評価するため、ヒト乳がん細胞（ＢＴ４７４）を処理してＦｏｘＭ１発現を調節し、ＦｏｘＭ１Ａタンパク質レベルを処理の１日目及び２日目に評価した。コントロール条件下での１日目及び２日目には、ＦｏｘＭ１Ａがウェスタンブロットにより検出可能であったが、低濃度であった（図６Ａ）。１０μＭの化合物２での処理は、１日目はアクチンタンパク質をわずかに減少させたことを除いてＦｏｘＭ１Ａタンパク質に対し何の効果も及ぼさなかったが、２日目には、同時に起こるＦｏｘＭ１Ａタンパク質レベルの増加とともにアクチンタンパク質を強力に減少させた（図６Ａ）。タンパク質レベルの定量分析は、アクチンが、１０μＭでの化合物２での処理により１日目に１８％、２日目には９０％超低減されたことを示した（図６Ｂ）一方、ＦｏｘＭ１Ａレベルは同じ試料において３倍近く増加した（図６Ｃ）。アクチンに正規化した場合、ＦｏｘＭ１Ａタンパク質レベルは、１０μＭの化合物２での処理により２８倍増加した（図６Ｄ）。データは、乳がん細胞においては、ＦｏｘＭ１Ａへの選択的スプライシングがＦｏｘＭ１Ａタンパク質を増加させ、細胞死を誘導すること示す。
方法
リアルタイム定量ＰＣＲを用いたＦｏｘＭ１スプライスバリアントの発現レベルのモニタリング
１ｃｍ２当たり１００００個の線維芽細胞を、様々な用量の化合物（０．０１−１０μＭ）で２４時間処理した。ＲＮＡ抽出を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）のＡｍｂｉｏｎ（登録商標）Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴＴＭキットに記載の指示に従って実施した。ＲＮＡ試料を、更なる解析まで−２０℃で凍結させた。内部標準のＧＡＰＤＨと一緒に、ＦｏｘＭ１Ａ又はＦｏｘＭ１Ｂ／Ｃの相対的発現レベルを、ワンステップ多重逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて測定した。ＦｏｘＭ１Ａ又はＦｏｘＭ１Ｂ／Ｃの発現レベルの相対的定量にはＴａｑＭａｎ（登録商標）ＦＡＭプローブを使用し、ヒトＧＡＰＤＨレベルの相対的定量にはＴａｑＭａｎ（登録商標）ＶＩＣプローブを使用した。増幅法の忠実度を、定量ＰＣＲのΔΔＣＴ相対的定量法を用いて決定した。
線維芽細胞の増殖及び毒性に対する効果のリアルタイムモニタリング
１ｃｍ２当たり１００００個の線維芽細胞を、様々な用量の化合物（０．１−１０μＭ）を用いて、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｅ プレート−１６フォーマットで５日間処理した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中に置かれたｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ−ＤＰインスツルメントに移し、すべてのウェルのバックグラウンドインピーダンス測定値を記録した。線維芽細胞をウェルに播種し、細胞の拡散及び安定化も促進するために約５時間インキュベートした。細胞が付着して広がるときの膜の下面を覆う金の微小電極のインピーダンスの変化を測定し、３０分毎に１２０時間（５日間）にわたり記録した。インピーダンスを、セルインデックス（ＣＩ）と呼ばれる相対且つ無次元パラメーターにより表した。セルインデックス値＝Ｚｔ−Ｚｉ／１５［Ｏｈｍ］；式中、Ｚｉ＝実験開始時の初期インピーダンス、及びＺｔ＝実験中の個々の時点(A.K. Bosserhoff, L. Ellmann, S. Kuphal.S: Melanoblasts in culture as an in vitro system to determine molecular changes in melanoma. 2011. Experimental Dermatology, 20, 435-440)。最初の６時間で得られた値は、処理に対する応答において細胞の付着能力の違いがある場合にそれが原因で観察される変動を考慮して、勾配計算から破棄された。
ヒト筋芽細胞又は乳がん細胞の培養及びウェスタンブロット分析
ヒト筋芽細胞はＥＣＡＣＣから、ＢＴ４７４細胞はＡＴＣＣから入手し、供給元のプロトコールに従って培養した。実験の目的のために、ヒト筋芽細胞を５日間培養し、様々な用量の化合物（０．１−１０μＭ）で処理した。ＢＴ４７４細胞を最大２日間培養し、１０μＭの化合物で処理した。ウェスタンブロット分析のため、５日間処理した筋芽細胞又は２日間処理したＢＴ４７４細胞を、１００ｍＭジチオスレイトール含有の沸騰しているＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に溶解した。ＳＤＳ ＰＡＧＥブロットは、ウサギ抗ＦｏｘＭ１抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：１０００）、ヤギ抗アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：２００００）及びＡｌｅｘａ６８０／８００二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Probes、１：１００００）でプローブした。Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステム（Ｌｉｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で蛍光検出し、ＦｏｘＭ１Ａ強度をアクチンに対して正規化した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて分析された。

Claims (17)

  1. 転写的に不活性なＦｏｘＭ１変異体を誘導する、がんの予防又は治療における使用のためのＦｏｘＭ１遺伝子のスプライシングを修飾する化合物。
  2. 転写的に不活性なＦｏｘＭ１変異体がＦｏｘＭ１Ａである、請求項１に記載の化合物。
  3. ＦｏｘＭ１遺伝子がヒトＦｏｘＭ１遺伝子である、請求項１又は２に記載の化合物。
  4. がんが、肝臓、前立腺、脳、乳房、肺、結腸、膵臓、皮膚、子宮頸部、卵巣、口、血液及び神経系のがんから成る群より選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
  5. 式Ｉ：
    （Ｉ）
    ［上式中、Ｒ１は、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキルから選択され、この三つの置換基はすべて、Ｃ１−７アルキル、Ｃ１−７アルコキシ、Ｃ１−７ハロアルコキシ、Ｃ１−７ハロアルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ＮＯ２で置換されていてもよく；
    Ｒ２は、ヘテロシクロアルキル、ＮＲ’Ｒ’’で置換されていてもよいＣ１−７アルコキシ、又はヒドロキシ、ＮＲ’Ｒ’’−Ｃ１−７アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−７アルキル、Ｃ３−８シクロプロピル、ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−７アルコキシ−Ｃ１−７アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−７アルコキシ−Ｃ１−７アルキル、ハロゲン又はアザスピロシクロアルキル、アザビシクロアルキル、ＮＲ’Ｒ’’で置換されていてもよいＣ２−７アルキニルで置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、又はＣ１−７アルキルで置換されていてもよいヘテロアリールであり；
    Ｒ３は、ハロゲン、Ｃ１−７アルキルであり；
    Ｒ｀及びＲ｀｀は、水素、Ｃ１−７アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−７アルキルから独立して選択される］
    を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
  6. Ｒ１がアリール又はヘテロアリールであって、何れの置換基もＣ１−７アルキル、Ｃ１−７ハロアルキル、ハロゲン、Ｃ１−７アルコキシ、ＮＲ’Ｒ’’で置換されていてもよく、
    Ｒ２がヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルであって、何れの置換基もＣ１−７アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−７アルキル、ハロ−Ｃ１−７アルキルで置換されていてもよく、
    Ｒ３がＣ１−７アルキルである、
    請求項５に記載の化合物。
  7. Ｒ１が、フェニル、イミダゾ［１，２−ａ］ピラジニル、ピラゾロ［１，５−ａ］ピラジニル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、１，３−ベンゾオキサゾリル、インダゾリルである、
    請求項５又は６に記載の化合物。
  8. Ｒ２が、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、ピリジニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、ピロリジニルである、請求項５から７のいずれか一項に記載の化合物。
  9. がんの予防又は治療用医薬の調製のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物の使用。
  10. 請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物を含む薬学的製剤。
  11. 請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物の有効量を対象に投与することを含む、がんの予防又は治療のための方法。
  12. がんの予防又は治療のための化合物のスクリーニングの方法であって、
    ｃ）ＦｏｘＭ１遺伝子を発現している増殖細胞を試験化合物と接触させること、
    ｄ）工程ａ）の細胞中のＦｏｘＭ１の変異体であるＦｏｘＭ１Ａを測定すること
    を含み、コントロールと比較したＦｏｘＭ１Ａ変異体のレベルの増加が、がんの予防又は治療のための化合物であることを示唆している方法。
  13. がんの予防又は治療のための化合物のスクリーニングの方法であって、
    ｃ）ＦｏｘＭ１遺伝子を発現している増殖細胞を試験化合物と接触させること、
    ｄ）工程ａ）の細胞中のＦｏｘＭ１の変異体ＦｏｘＭ１Ｂ及び／又は変異体ＦｏｘＭ１Ｃを測定すること
    を含み、コントロールと比較した変異体ＦｏｘＭ１Ｂ及び／又は変異体ＦｏｘＭ１Ｃのレベルの低下が、がんの予防又は治療のための化合物であることを示唆している方法。
  14. 細胞が線維芽細胞である、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. ＦｏｘＭ１変異体がＲＮＡレベルで測定される、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ＦｏｘＭ１変異体がタンパク質レベルで測定される、請求項１２又は１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 上に記載の発明。
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