CN105392790A - 筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定用于治疗癌症的新化合物的筛选方法。

Description

筛选方法
发明领域
本发明涉及一种鉴定在治疗癌症中有用的化合物的筛选方法及通过本发明的方法鉴定的化合物。
发明背景
FoxM1是Forkhead(叉头)家族的一种转录因子。它在文献中也称作Trident(三齿)(在小鼠中)，HFH-11(在人中)，WIN或INS-1(在大鼠中)，MPP-2(部分人cDNA)或FKHL-16。Forkhead家族包含多种通过称作Forkhead或翼状螺旋域的保守DNA结合域定义的转录因子。FoxM1基因是通过用简并引物对cDNA文库筛选具有保守ForkheadDNA结合域的同源物而克隆的(W.Korver,J.Roose,H.Clevers,NucleicAcidsRes.25(1997)1715-1719)。揭示了FoxM1基因编码一个Forkhead转录因子家族成员，它展现DNA结合域中与五个它的最接近相关Forkhead成员(即FoxA3(HNF-3γ)，FoxC1(fkh-1)，FoxF2(FREAC-2)，FoxK1(ILF)和FoxN2(HTLF))的45％同一性。发现FoxM1C端区与编码称作MPP-2的221个氨基酸的可读框的人部分cDNA具有同源性(76％同一性)。MPP-2代表MPM-2反应性磷蛋白-2，而且是用特异性结合以磷酸丝氨酸-脯氨酸依赖性方式磷酸化的有丝分裂蛋白质上的表位的MPM-2单克隆抗体筛选成淋巴细胞衍生cDNA文库后鉴定的。FoxM1在体外经由共有位点TAAACA结合DNA。这种基序分享受到Forkhead家族其它成员识别的核心序列。特别地，这些基序以可变取向的重复常常表现在FoxM1的选定结合序列内。
人FoxM1基因是一种10个外显子的结构，跨越12p13-3染色体带(端粒位置)上的大约25kb(W.Korver,J.Roose,H.Clevers,NucleicAc-idsRes.25(1997)1715-1719)。分别称作外显子Va和VIIa，也称作外显子A1(或大鼠外显子6)和A2的两个外显子是可变剪接的(H.Ye,T.F.Kelly,U.Samadani,L.Lim,S.Rubio,D.G.Overdier,K.A.Roebuck,R.H.Costa,Mol.CellBiol.17(1997)1626-1641)。外显子Va编码DNA结合域的C端部分内的15个氨基酸的插入，而且在任何其它Forkhead转录因子家族成员中没有看到。外显子VIIa代表该蛋白质的C端内的38个氨基酸的插入。人FoxM1中外显子Va和VIIa的差异剪接产生三类转录物，A类含有所有两种可变外显子，B类不含可变外显子，而C类只保留外显子Va(H.Ye,T.F.Kelly,U.Samadani,L.Lim,S.Rubio,D.G.Overdier,K.A.Roebuck,R.H.Costa,Mol.CellBiol.17(1997)1626-1641)。FoxM1B和FoxM1C均有转录活性，而由于外显子VIIa在C端反式激活域中的插入，FoxM1A无转录活性。FoxM1A中反式激活域的这种破坏不仅导致转录失活，它可能还引起这种变体作为显性-负面变体起作用，因为它在功能性反式激活域缺失下保留了正常DNA结合活性(H.Ye,T.F.Kelly,U.Samadani,L.Lim,S.Rubio,D.G.Overdier,K.A.Roebuck,R.H.Costa,Mol.CellBiol.17(1997)1626-1641)。
FoxM1在多种肿瘤类型中过表达，包括神经，胃肠，和生殖起源的那些(Bektasetal.,supra；Nakamuraetal.,2004,Oncogene23:2385-400；Pilarskyetal.,2004,Neoplasia.Q:744-50；Liuetal.,2006,CancerRes66:3593-602)。FoxM1的这种表达样式归于FoxM1反式激活细胞周期行进需要的基因的能力(Wangetal.,2002,Proc.Nat.Acad.Sci.USA99:16881-6)。在人基细胞癌中发现的升高的核FoxM1B染色提示FoxM1是人癌症中的细胞增殖需要的(Tehetal.,2002,CancerRes.62:4773-80)。然而，FoxM1在建立或推动肿瘤行进和疾病管理中的详细作用尚未完全阐明。
EP2298896公开了抑制FoxM1B蛋白质表达的siRNA分子及该siRNA分子用于抑制肿瘤生长的用途。
WO2011/127297公开了用于治疗乳腺癌的包含FoxM1抑制剂和Herceptin的组合物。抑制剂为例如FoxM1特异性siRNA或噻唑抗生素诸如硫链丝菌肽。
本发明要解决的问题是提供治疗癌症的新化合物。
发明概述
在第一个方面，本发明提供用于预防或治疗癌症的诱导FoxM1基因可变剪接的化合物(剪接修饰剂)，其中该化合物诱导无转录活性的FoxM1变体。
在一个特定实施方案中，所述无转录活性的FoxM1变体为FoxM1A。
在一个特定实施方案中，所述FoxM1基因为人FoxM1基因。
在一个特定实施方案中，所述癌症选自下组：肝，前列腺，脑，乳腺，肺，结肠，胰腺，皮肤，宫颈，卵巢，口，血液和神经系统的癌症。
在一个特定实施方案中，所述用于预防或治疗癌症的FoxM1剪接修饰剂为式I的化合物：
其中R1选自芳基，杂芳基，杂环烷基，这三种取代基均是任选用C1-7烷基，C1-7烷氧基，C1-7卤代烷氧基，C1-7卤代烷基，卤素，羟基，氰基，NO2取代的；
R2为C1-7烷氧基，任选用下述取代：杂环烷基，NR’R”，杂环烷基，任选用下述取代：羟基，NR’R”-C1-7烷基，羟基-C1-7烷基，C3-8环丙基，杂环烷基，C1-7烷氧基-C1-7烷基，羟基-C1-7烷氧基-C1-7烷基，卤素或氮杂螺环烷基，氮杂双环烷基，C2-7炔基，任选用下述取代：NR’R”，或杂芳基，任选用下述取代：C1-7烷基，
R3为卤素，C1-7烷基，
R’和R”独立选自氢，C1-7烷基，羟基-C1-7烷基。
在一个特定实施方案中，所述用于预防或治疗癌症的FoxM1剪接修饰剂为式(I)的化合物，其中R1为芳基或杂芳基，这两种取代基均是任选用C1-7烷基，C1-7卤代烷基，卤素，C1-7烷氧基，NR’R”取代的，R2为杂芳基或杂环烷基，这两种取代基均是任选用C1-7烷基，羟基-C1-7烷基，卤代-C1-7烷基取代的，R3为C1-7烷基。
在一个特定实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中：
R1为苯基，咪唑并[1,2-a]吡嗪基，吡唑并[1,5-a]吡嗪基，咪唑并[1,2-a]吡啶基，1,3-苯并口恶唑基，吲唑基。
在一个特定实施方案中，所述用于预防或治疗癌症的FoxM1剪接修饰剂为式(I)的化合物，其中R2为哌啶基，吗啉基，哌嗪基，吡啶基，1,2,3,6-四氢吡啶基，吡咯烷基。
本发明进一步提供了本发明的化合物制备用于预防或治疗癌症的药物的用途。
在又一个方面，本发明提供了一种药物配制剂，其包含本发明的化合物。
在又一个方面，本发明提供了一种预防或治疗癌症的方法，其包括对有需要的受试者施用有效量的本发明的化合物。
在又一个方面，本发明提供了一种筛选用于预防或治疗癌症的化合物的方法，其包括：
a)使增殖中的表达FoxM1基因的细胞与测试化合物接触，
b)测量步骤a)的细胞中的FoxM1变体FoxM1A，其中与对照相比升高水平的FoxM1A变体指示预防或治疗癌症的化合物。
在又一个方面，本发明提供了一种筛选用于预防或治疗癌症的化合物的方法，其包括：
a)使增殖中的表达FoxM1基因的细胞与测试化合物接触，
b)测量步骤a)的细胞中的FoxM1变体FoxM1B和/或变体FoxM1C，其中与对照相比降低水平的变体FoxM1B和/或变体FoxM1C指示预防或治疗癌症的化合物。
在本发明方法的一个特定实施方案中，所述细胞为成纤维细胞。
在本发明方法的一个特定实施方案中，在RNA水平上测量FoxM1变体。
在本发明方法的一个特定实施方案中，在蛋白质水平上测量FoxM1变体。
附图简述
图1。成纤维细胞中FoxM1朝向FoxM1A的可变剪接的诱导。将人成纤维细胞与不同剂量的化合物1-4一起温育24小时，并通过RT-qPCR评估FoxM1ARNA(含有外显子A2)和FoxM1B/C(缺少外显子A2)mRNA表达的变化。将剂量响应曲线拟合Hill结合方程以估算EC50。图1A，FoxM1AmRNA的上调；图1B，FoxM1B/CmRNA的下调；图1C，FoxM1A上调和FoxM1B/C下调的EC50值的相关性。数据代表4次独立观察的均值±SEM。
图2。化合物对增殖阻滞和细胞死亡的诱导。成纤维细胞中朝向FoxM1A的可变FoxM1剪接。将人成纤维细胞与不同剂量的化合物1-4一起温育5天(120小时)，并在线评估细胞阻抗(细胞指数)的变化。数据表述成针对每个孔的起始值标准化后的Δ细胞指数。对72，96和120小时时间点(见箭)时的数据取平均值进行量化。图2A，渐增剂量的化合物2下成纤维细胞的生长曲线，注意，较低的剂量明显减缓增殖，而大于1μM的剂量对细胞有毒；图2B，化合物1-4对细胞指数的剂量依赖性降低，表述成未处理对照的％。75％处的截留(EC75％，虚线)定义为观察到有意义的对增殖和细胞存活的影响的浓度。数据代表4次独立观察的均值±SEM。
图3。成纤维细胞中朝向FoxM1A的可变剪接的诱导与对细胞指数的影响有关。关联图1和2中获得的FoxM1变体上调或下调的EC50值和细胞指数的EC75％。图3A，EC75％(细胞指数)与EC50(FoxM1B/C)的相关性；图3B，EC75％(细胞指数)与EC50(FoxM1A)的相关性。数据代表4次独立观察的均值±SEM。
图4。成肌细胞中FoxM1A蛋白质的上调与细胞毒性有关。将人成肌细胞在增殖性条件下(在血清存在下)用化合物3(0.1，1和10μM)处理5天，并通过SDS-PAGE和Western印迹对总蛋白质提取物分析FoxM1A和肌动蛋白蛋白质水平。图4A，来自未用(对照)或用化合物3(0.1，1和10μM)处理的样品的FoxM1A和肌动蛋白Western印迹；图4B，肌动蛋白的蛋白质水平(细胞数的替代品)；图4C，FoxM1A的蛋白质水平；图4D，FoxM1A/肌动蛋白之比。数据代表3次独立观察的均值±SEM。通过单向ANOVA继以Dunnet氏事后检验实施了统计学比较。*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001。
图5。非增殖中的成肌细胞中无FoxM1A蛋白质变化和无细胞毒性。将人成肌细胞在分化性条件下(在血清缺失下)用化合物3(0.1，1和10μM)处理5天，并通过SDS-PAGE和Western印迹对总蛋白质提取物分析FoxM1A和肌动蛋白蛋白质水平。图5A，来自未用(对照)或用化合物3(0.1，1和10μM)处理的样品的FoxM1A和肌动蛋白Western印迹。注意，FoxM1A蛋白质检测不到；图5B，肌动蛋白的蛋白质水平。数据代表3次独立观察的均值±SEM。通过单向ANOVA继以Dunnet氏事后检验实施了统计学比较。
图6。乳腺癌细胞中FoxM1A蛋白质的上调与细胞毒性有关。将人BT474乳腺癌细胞在增殖性条件下(在血清存在下)用化合物2(10μM)处理1或2天，并通过SDS-PAGE和Western印迹对总蛋白质提取物分析FoxM1A和肌动蛋白蛋白质水平。图6A，来自未用(对照)或用化合物2(10μM)处理1天(浅灰色)或2天(深灰色)的样品的FoxM1A和肌动蛋白Western印迹；图6B，肌动蛋白的蛋白质水平(细胞数的替代品)；图6C，FoxM1A的蛋白质水平；D，FoxM1A/肌动蛋白之比。数据代表3次独立观察的均值±SEM。通过单向ANOVA继以Dunnet氏事后检验实施了统计学比较。*，p<0.05，***，p<0.001。
发明详述
术语“FoxM1多肽”在本文中用于指来自任何动物(例如哺乳动物)物种(包括人)的天然FoxM1多肽，和FoxM1变体。Seq.Id.No.1中给出了人FoxM1A多肽的氨基酸序列，Seq.Id.No.2中给出了人FoxM1B的氨基酸序列，而Seq.Id.No.3中给出了FoxM1C多肽的氨基酸序列。
Seq.Id.No.4(FoxM1A)，Seq.Id.No.5(FoxM1B)和Seq.Id.No.6(FoxM1C)中列出了三种FoxM1变体的核苷酸序列。
术语“修饰FoxM1基因剪接的化合物”在本文中用于指通过修饰FoxM1剪接使得无转录活性形式(特别是FoxM1A)生成，及通过阻抑有转录活性FoxM1变体(特别是FoxM1B和FoxM1C)生成，导致无转录活性形式的FoxM1多肽生成，特别是FoxM1A变体生成的化合物。
术语“化合物”在本文中在结合本发明的测定法描述的“测试化合物”或“药物候选化合物”的语境中使用。如此，这些化合物包含合成衍生的或来自天然来源的有机或无机化合物。化合物包括无机或有机化合物，诸如多核苷酸，脂质或激素类似物，特征在于相对较低的分子量。其它生物聚合有机测试化合物包括包含约2至约40个氨基酸的肽和包含约40至约500个氨基酸的更大多肽，诸如抗体或抗体缀合物。
用于检测和/或测量生物学材料中的多肽的方法是本领域公知的，而且包括但不限于Western印迹，流式细胞术，ELISA或RIA，或各种蛋白质组学技术。测量多肽的方法的一个例子是ELISA。这种类型的蛋白质量化基于能够捕捉特定抗原的抗体，和能够检测捕捉到的抗原的第二抗体。上文提到的测定法描述于Harlow,E.andLane,D.Antibodies:ALaboratoryManual,(1988),ColdSpringHarborLaboratoryPress。
用于检测和/或测量生物学材料中的RNA的方法是本领域公知的，而且包括但不限于Northern印迹，RNA保护测定法，RT-PCR。合适的方法描述于MolecularCloning:ALaboratoryManual(FourthEdition)ByMichaelR.Green,JosephSambrook,PeterMacCallum2012,2,028pp,ISBN978-1-936113-42-2。
术语“本发明的化合物”指修饰FoxM1基因剪接的化合物，特别是式(I)的化合物，及其立体异构体，互变异构体，溶剂合物，和盐(例如药学可接受盐)。
术语“药学可接受盐”表示并非生物学或其它方面不想要的盐。药学可接受盐包括酸和碱加成盐二者。
术语“药学可接受酸加成盐”表示那些与无机酸(诸如氢氯酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，碳酸，磷酸)和有机酸(选自脂肪族，环脂肪族，芳香族，芳香脂肪族，杂环，羧基，和磺酸基类有机酸，诸如甲酸，乙酸，丙酸，乙醇酸/羟基乙酸，葡糖酸，乳酸，丙酮酸，草酸，苹果酸，马来酸/顺丁烯二酸，丙二酸，琥珀酸，延胡索酸/反丁烯二酸，酒石酸，柠檬酸，天冬氨酸，抗坏血酸，谷氨酸，氨茴酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，双羟萘酸，苯基乙酸，甲磺酸，乙磺酸，对甲苯磺酸，和水杨酸)形成的药学可接受盐。
术语“药学可接受碱加成盐”表示那些与有机或无机碱形成的药学可接受盐。可接受无机碱的例子包括钠，钾，铵，钙，镁，铁，锌，铜，锰，和铝盐。自药学可接受有机无毒碱衍生的盐包括伯，仲，和叔胺，取代的胺(包括天然发生的取代的胺)，环胺和碱离子交换树脂(诸如异丙胺，三甲胺，二乙胺，三乙胺，三丙胺，乙醇胺，2-二乙基氨基乙醇，氨基丁三醇，二环己基胺，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，咖啡因，普鲁卡因，哈胺，胆碱，甜菜碱，乙二胺，葡糖胺，泛影葡胺，可可碱，嘌呤，哌嗪，哌啶，N-乙基哌啶，和多胺树脂)的盐。
术语“烷氧基”表示式-O-R’的基团，其中R’为烷基基团。烷氧基模块的例子包括甲氧基，乙氧基，异丙氧基，和叔丁氧基。
术语“烷氧基烷基”表示如下的烷基基团，其中该烷基基团的至少一个氢原子已经用烷氧基基团替换。例示性烷氧基烷基基团包括2-甲氧基乙基，3-甲氧基丙基，1-甲基-2-甲氧基乙基，1-(2-甲氧基乙基)-3-甲氧基丙基，和1-(2-甲氧基乙基)-3-甲氧基丙基。
术语“烷基”表示1至12个碳原子的单价线性或分支饱和烃基团。在特定的实施方案中，烷基具有1至7个碳原子，而且在更加特定的实施方案中，1至4个碳原子。烷基的例子包括甲基，乙基，丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，或叔丁基。
术语“炔基”表示包含一个，两个或三个三键的2至7个碳原子的单价线性或分支饱和烃基团。在特定的实施方案中，炔基具有2至4个碳原子且包含一个或两个三键。炔基的例子包括乙炔基，丙炔基，丙-2-炔基，异丙炔基，正丁炔基，和异丁炔基。
术语“芳基”表示包含6至10个碳环原子的单价芳香族碳环单或双环环系。芳基模块的例子包括苯基和萘基。
术语“环烷基”表示3至10个环碳原子的单价饱和单环或双环烃基团。在特定的实施方案中，环烷基表示3至8个环碳原子的单价饱和单环烃基团。双环表示由共同具有一个或多个碳原子的两个饱和碳环组成。特定的环烷基基团是单环。单环环烷基的例子是环丙基，环丁基，环戊基，环己基或环庚基。双环环烷基的例子是双环[2.2.1]庚基，或双环[2.2.2]辛基。
术语“卤代烷氧基”表示其中烷氧基基团的至少一个氢原子已经被相同或不同卤素原子(特别是氟原子)替换的烷氧基基团。卤代烷氧基的例子包括单氟-，二氟-或三氟-甲氧基，-乙氧基或-丙氧基，例如3,3,3-三氟丙氧基，2-氟乙氧基，2,2,2-三氟乙氧基，氟甲氧基，或三氟甲氧基。术语“全卤代烷氧基”表示其中烷氧基基团的所有氢原子已经被相同或不同卤素原子替换的烷氧基基团。
术语“卤代烷基”表示其中烷基基团的至少一个氢原子已经被相同或不同卤素原子(特别是氟原子)替换的烷基基团。卤代烷基的例子包括单氟-，二氟-或三氟-甲基，-乙基或-丙基，例如3,3,3-三氟丙基，2-氟乙基，2,2,2-三氟乙基，氟甲基，或三氟甲基。术语“全卤代烷基”表示其中烷基基团的所有氢原子已经被相同或不同卤素原子替换的烷基基团。
术语“杂芳基”表示包含1，2，3或4个选自N，O和S的杂原子，其余环原子为碳的5至12个环原子的单价芳香族杂环单或双环环系。杂芳基模块的例子包括吡唑并[1,5-a]吡嗪基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，咪唑基，口恶唑基，噻唑基，三唑基，口恶二唑基，噻二唑基，四唑基，吡啶基，吡嗪基，吡唑基，哒嗪基，嘧啶基，三嗪基，氮杂卓，二氮杂卓，异口恶唑基，苯并呋喃基，异噻唑基，苯并噻吩基，吲哚基，异吲哚基，异苯并呋喃基，苯并咪唑基，苯并口恶唑基，苯并异口恶唑基，苯并噻唑基，苯并异噻唑基，苯并口恶二唑基，苯并噻二唑基，苯并三唑基，嘌呤基，喹啉基，异喹啉基，喹唑啉基，或喹口恶啉基。
术语“杂环烷基”表示包含1，2，或3个选自N，O和S的环杂原子，其余环原子为碳的3至9个环原子的单价饱和或部分未饱和单或双环环系。在特定的实施方案中，杂环烷基是包含1，2，或3个选自N，O和S的环杂原子，其余环原子为碳的4至7个环原子的单价饱和单环环系。单环饱和杂环烷基的例子是氮杂环丙烷基，氧杂环丙烷基，氮杂环丁烷基，氧杂环丁烷基，吡咯烷基，四氢呋喃基，四氢噻吩基，吡唑烷基，咪唑烷基，口恶唑烷基，异口恶唑烷基，噻唑烷基，哌啶基，四氢吡喃基，四氢噻喃基，哌嗪基，吗啉基，硫代吗啉基，1,1-二氧-硫代吗啉-4-基，氮杂环庚烷基，二氮杂环庚烷基，高哌嗪基，或氧杂氮杂环庚烷基。双环饱和杂环烷基的例子是8-氮-双环[3.2.1]辛基，奎宁环基，8-氧-3-氮-双环[3.2.1]辛基，9-氮-双环[3.3.1]壬基，3-氧-9-氮-双环[3.3.1]壬基，或3-硫-9-氮-双环[3.3.1]壬基。部分未饱和杂环烷基的例子是二氢呋喃基，咪唑啉基，二氢口恶唑基，四氢吡啶基，或二氢吡喃基。
术语“羟基烷基”表示其中烷基基团的至少一个氢原子已经被羟基基团替换的烷基基团。羟基烷基的例子包括羟基甲基，2-羟基乙基，2-羟基丙基，3-羟基丙基，1-(羟基甲基)-2-甲基丙基，2-羟基丁基，3-羟基丁基，4-羟基丁基，2,3-二羟基丙基，2-羟基-1-羟基甲基乙基，2,3-二羟基丁基，3,4-二羟基丁基或2-(羟基甲基)-3-羟基丙基。
术语“任选”表示后面描述的事件或情形可以但不需要发生，而且描述包括事件或情形发生的情况和它不发生的情况。
术语“取代的”表示指定基团携带一个或多个取代基。在任何基团可携带多个取代基且提供多种可能的取代基的情况中，取代基是独立选择的且不需要相同。术语“未取代的”表示指定基团不携带取代基。术语“任选取代的”表示指定基团是未取代的或用一个或多个独立选自可能取代基组的取代基取代的。在指出取代基的数目时，术语“一个或多个”表示一个取代基至最高可能数目的取代，即用取代基替换一个氢至替换所有氢。
药物组合物和施用
另一个实施方案提供含有本发明的化合物和治疗惰性载剂，稀释剂或赋形剂的药物组合物或药物，以及使用本发明的化合物制备此类组合物和药物的方法。在一个例子中，式I的化合物可以通过于环境温度以适宜pH和以期望的纯度与生理学可接受载剂(即在采用的剂量和浓度对接受者无毒的载剂)混合来配制成盖伦施用形式。配制剂的pH主要取决于特定用途和化合物的浓度，但是优选约3至约8的任何地方的范围。在一个例子中，在pH5的乙酸盐缓冲液中配制式I的化合物。在另一个实施方案中，式I的化合物是无菌的。例如，可以作为固体或无定形组合物，冻干配制剂或水溶液保存化合物。
以与优良医学实践一致的方式配制，定剂量，和施用组合物。在这个背景中考虑的因素包括治疗的特定病症，治疗的特定哺乳动物，患者个体的临床状况，病症的起因，药剂的投递部位，施用的方法，施用的进度表，和医学从业人员知道的其它因素。要施用的化合物的“有效量”会由此类考量决定，而且是修饰FoxM1基因剪接必需的最小量。例如，此类量可以低于对正常细胞或作为整体的哺乳动物有毒的量。
可以通过任何合适手段来施用本发明的化合物，包括口服，表面(包括口腔和舌下)，直肠，阴道，透皮，胃肠外，皮下，腹膜内，肺内，皮内，鞘内和硬膜外和鼻内，以及需要局部治疗时的损害内施用。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。
可以以任何方便的施用形式施用本发明的化合物，例如片剂，粉剂，胶囊剂，溶液，分散体，悬浮液，糖浆剂，喷雾剂，栓剂，凝胶，乳剂，贴剂，等。此类组合物可以含有药物制剂中常规的成分，例如稀释剂，载剂，pH调节剂，增甜剂，填充剂，和别的活性剂。
通过混合本发明的化合物和载剂或赋形剂来制备典型的配制剂。合适的载剂和赋形剂是本领域技术人员公知的且详细描述于例如Ansel,HowardC.,etal.,Ansel’sPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems.Philadelphia:Lippincott,Williams&Wilkins,2004；Gennaro,AlfonsoR.,etal.Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy.Philadelphia:Lippincott,Williams&Wilkins,2000；和Rowe,RaymondC.HandbookofPharmaceuticalExcipients.Chicago,PharmaceuticalPress,2005。配制剂还可以包括一种或多种缓冲剂，稳定剂，表面活性剂，湿润剂，润滑剂，乳化剂，悬浮剂，防腐剂，抗氧化剂，遮光剂，助流剂，操作助剂，着色剂，增甜剂，芳香剂，调味剂，稀释剂和其它已知添加剂来提供药物(即本发明的化合物或其药物组合物)的上佳呈现或帮助制造药学产品(即药物)。
合适的口服剂量形式的一个例子是如下的片剂，其含有约25mg，50mg，100mg，250mg，或500mg本发明的化合物，与约90-30mg无水乳糖，约5-40mg交联甲羧纤维素钠，约5-30mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K30，和约1-10mg硬脂酸镁配合。首先将粉状组分混合在一起，然后与PVP溶液混合。可以使用常规设备将所得组合物干燥，制粒，与硬脂酸镁混合并压制成片剂形式。气雾剂配制剂的一个例子可以通过在合适的缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲液)中溶解本发明的化合物(例如5-400mg)，在需要时添加张力剂(例如盐，诸如氯化钠)来制备。可以将溶液过滤(例如使用0.2微米滤器)以去除杂质和污染物。
因此，一个实施方案包括包含式I化合物或其立体异构体或药学可接受盐的药物组合物。又一个实施方案包括包含式I化合物或其立体异构体或药学可接受盐，连同药学可接受载剂或赋形剂的药物组合物。
另一个实施方案包括包含式I化合物的药物组合物，其用于治疗过度增殖性疾病。另一个实施方案包括包含式I化合物的药物组合物，其用于治疗癌症。
在具体的实施方案中，用本发明的化合物治疗的癌症为白血病，急性髓样白血病，结肠癌，胃癌，黄斑变性，急性单核细胞性白血病，乳腺癌，肝细胞癌，锥-视杆营养不良，泡状软组织肉瘤，骨髓瘤，皮肤黑素瘤，前列腺炎，胰腺炎，胰腺癌，视网膜炎，腺癌，增殖腺炎，腺样囊性癌，白内障，视网膜变性，胃肠基质瘤，韦格纳(Wegener)氏肉芽肿病，肉瘤，肌病，前列腺腺癌，霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤，卵巢癌，非霍奇金氏淋巴瘤，多发性骨髓瘤，慢性髓样白血病，急性成淋巴细胞性白血病，肾细胞癌，移行细胞癌，结直肠癌，慢性淋巴细胞性白血病，间变性大细胞淋巴瘤，肾癌，乳腺癌，宫颈癌。
在具体的实施方案中，依照本发明预防和/或治疗的癌症为基细胞癌，杯形细胞化生，或恶性胶质瘤，肝，乳腺，肺，前列腺，宫颈，子宫，结肠，胰腺，肾，胃，膀胱，卵巢，或脑的癌症。
在具体的实施方案中，依照本发明预防和/或治疗的癌症包括但不限于头，颈，眼，口，喉，咽，食道，胸，骨，肺，肾，结肠，直肠或其它胃肠道器官，胃，脾，骨骼肌，皮下组织，前列腺，乳腺，卵巢，睾丸或其它生殖器官，皮肤，甲状腺，血，淋巴结，肾，肝，胰腺，和脑或中枢神经系统的癌症。
依照本发明预防和/或治疗的癌症的具体例子包括但不限于下述：肾癌(renalcancer)，肾癌(kidneycancer)，多形性成胶质细胞瘤，转移性乳腺癌；乳腺癌；乳腺肉瘤；神经纤维瘤；神经纤维瘤病；儿科肿瘤；成神经细胞瘤；恶性黑素瘤；表皮癌；白血病，诸如但不限于急性白血病，急性淋巴细胞性白血病，急性髓细胞性白血病，诸如成髓细胞性，前髓细胞性，髓单核细胞性，单核细胞性，红白血病白血病和骨髓增生异常综合征，慢性白血病，诸如但不限于慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病，慢性淋巴细胞性白血病，毛细胞性白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤，诸如但不限于霍奇金氏病疾病，非霍奇金氏病；多发性骨髓瘤，诸如但不限于郁积型多发性骨髓瘤，非分泌型骨髓瘤，骨硬化性骨髓瘤，浆细胞性白血病，孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症；意义未确定的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨癌和结缔组织肉瘤，诸如但不限于骨肉瘤，骨髓瘤骨病，多发性骨髓瘤，胆脂瘤诱发的骨骨肉瘤，骨的佩吉特(Paget)氏病，骨肉瘤，软骨肉瘤，尤因(Ewing)氏肉瘤，恶性巨细胞瘤，骨的纤维肉瘤，脊索瘤，骨膜肉瘤，软组织肉瘤，血管肉瘤(angiosarcoma，hemangiosarcoma)，纤维肉瘤，卡波西(Kaposi)氏肉瘤，平滑肌肉瘤，脂肪肉瘤，淋巴管肉瘤，神经鞘瘤，横纹肌肉瘤，和滑膜肉瘤；脑瘤，诸如但不限于胶质瘤，星形细胞瘤，脑干胶质瘤，室管膜瘤，少突神经胶质瘤，非胶质瘤的肿瘤，听神经瘤，颅咽管瘤，髓母细胞瘤，脑(脊)膜瘤，松果体瘤，成松果体细胞瘤，和原发性脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于腺癌，小叶(小细胞)癌，导管内癌，髓样乳腺癌，粘液性乳腺癌，管状乳腺癌，乳头状乳腺癌，佩吉特氏病(包括青少年佩吉特氏病)和炎性乳腺癌；肾上腺癌，诸如但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，诸如但不限于乳头状或滤泡性甲状腺癌，髓样甲状腺癌和间变性甲状腺癌；胰腺癌，诸如但不限于胰岛素瘤，胃泌素瘤，胰升糖素瘤，舒血管肠肽瘤，促生长素抑制素分泌性肿瘤，和类癌或胰岛细胞瘤；垂体癌，诸如但不限于库兴(Cushing)氏病，促乳素分泌性肿瘤，肢端肥大症，和尿崩症；眼癌，诸如但不限于眼黑素瘤，诸如虹膜黑素瘤，脉络膜黑素瘤，和睫状体黑素瘤，和成视网膜细胞瘤；阴道癌，诸如鳞状细胞癌，腺癌，和黑素瘤；外阴癌，诸如鳞状细胞癌，黑素瘤，腺癌，基细胞癌，肉瘤，和佩吉特氏病；宫颈癌，诸如但不限于鳞状细胞癌，和腺癌；子宫癌，诸如但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，诸如但不限于卵巢上皮癌，交界瘤，生殖细胞瘤，和基质瘤；宫颈癌；食道癌，诸如但不限于，鳞癌，腺癌，腺样囊性癌，粘液表皮样癌，腺鳞癌，肉瘤，黑素瘤，浆细胞瘤，疣状癌，和燕麦形细胞(小细胞)癌；胃癌，诸如但不限于腺癌，真菌样生长(息肉样)，溃疡性，浅表扩散，弥漫性扩散，恶性淋巴瘤，脂肪肉瘤，纤维肉瘤，和癌肉瘤；结肠癌；KRAS突变型结直肠癌；结肠癌；直肠癌；肝癌，诸如但不限于肝细胞癌和肝母细胞瘤，胆囊癌，诸如腺癌；胆管癌，诸如但不限于乳头状，结节性，和弥漫性；肺癌(lungcancer)，诸如KRAS突变型非小细胞肺癌，非小细胞肺癌，鳞状细胞癌(表皮样癌)，腺癌，大细胞癌和小细胞肺癌；肺癌(lungcarcinoma)；睾丸癌，诸如但不限于生殖细胞瘤，精原细胞瘤，间变性，经典(典型)，精母细胞性，非精原细胞瘤，胚胎性癌，畸胎癌，绒毛膜癌(卵黄囊瘤)，前列腺癌，诸如但不限于，雄激素不依赖性前列腺癌，雄激素依赖性前列腺癌，腺癌，平滑肌肉瘤，和横纹肌肉瘤；阴茎癌；口腔癌，诸如但不限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌，诸如但不限于腺癌，粘液表皮样癌，和腺样囊性癌；咽癌，诸如但不限于鳞状细胞癌，和疣状；皮肤癌，诸如但不限于基细胞癌，鳞状细胞癌和黑素瘤，浅表扩散性黑色素瘤，结节性黑色素瘤，雀斑样痣恶性黑素瘤，肢端雀斑样痣黑素瘤；肾癌(kidneycancer)，诸如但不限于肾细胞癌，腺癌，肾上腺样瘤，纤维肉瘤，移行细胞癌(肾盂和/或子宫)；肾癌(renalcarcinoma)；维尔姆斯(Wilms)瘤；膀胱癌，诸如但不限于移行细胞癌，鳞状细胞癌，腺癌，癌肉瘤。另外，癌症包括粘液肉瘤，骨源性肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，间皮瘤，滑膜瘤，成血管细胞瘤，上皮癌，囊腺癌，支气管源性癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌和乳头状腺癌。
在某些实施方案中，可以依照本发明预防和/或治疗的癌症包括下述：儿科实体瘤，尤因氏肉瘤，维尔姆斯瘤，成神经细胞瘤，神经纤维瘤，表皮癌，恶性黑素瘤，宫颈癌，结肠癌，肺癌(lungcarcinoma)，肾癌(renalcarcinoma)，乳腺癌，乳腺肉瘤，转移性乳腺癌，HIV相关卡波西氏肉瘤，前列腺癌，雄激素不依赖性前列腺癌，雄激素依赖性前列腺癌，神经纤维瘤病，肺癌(lungcancer)，非小细胞肺癌，KRAS突变型非正小细胞肺癌，恶性黑素瘤，黑素瘤，结肠癌，KRAS突变型结直肠癌，多形性成胶质细胞瘤，肾癌(renalcancer)，肾癌(kidneycancer)，膀胱癌，卵巢癌，肝细胞癌，甲状腺癌，横纹肌肉瘤，急性髓样白血病，和多发性骨髓瘤。
在某些实施方案中，依照本发明预防和/或治疗的癌症和与其有关的疾患为乳腺癌，肺癌，胃癌，食道癌，结直肠癌，肝癌，卵巢癌，泡膜细胞瘤，男性细胞瘤，宫颈癌，子宫内膜癌，子宫内膜增生，子宫内膜异位症，纤维肉瘤，绒毛膜癌，头和颈癌，鼻咽癌，喉癌，肝母细胞瘤，卡波西氏肉瘤，黑素瘤，皮肤癌，血管瘤，海绵状血管瘤，成血管细胞瘤，胰腺癌，成视网膜细胞瘤，星形细胞瘤，成胶质细胞瘤，许旺(Schwann)细胞瘤，少突胶质瘤，髓母细胞瘤，成神经细胞瘤，横纹肌肉瘤，骨源性肉瘤，平滑肌肉瘤，尿道癌，甲状腺癌，维尔姆斯瘤，肾细胞癌，前列腺癌，与瘢痣病，水肿(诸如与脑瘤有关的)，或梅格斯(Meigs)氏综合征有关的异常血管增殖。在具体的实施方案中，癌症为星形细胞瘤，少突胶质瘤，少突胶质瘤和星形细胞瘤要素的混合，室管膜瘤，脑(脊)膜瘤，垂体腺瘤，原始性神经外胚层瘤，髓母细胞瘤，原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤，或CNS生殖细胞瘤。
在具体的实施方案中，依照本发明治疗的癌症为听神经瘤，间变性星形细胞瘤，多形性成胶质细胞瘤，或脑(脊)膜瘤。
在其它具体实施方案中，依照本发明治疗的癌症为脑干胶质瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，青少年毛细胞性星形细胞瘤，髓母细胞瘤，视神经胶质瘤，原始性神经外胚层瘤，或横纹肌样瘤。
化合物3的制备
步骤A：对1H-吡唑-3,5-二羧酸二乙酯(10.0g，47mmol)和氯丙酮(3.76mL，47mmol)在丙酮(200mL)中的溶液添加碳酸钾(7.2g，52mmol)。于30℃加热6小时后，浓缩混合物以去除挥发物。在EtOAc中取得残余物并用水清洗。在MgSO4上干燥有机物并浓缩以给出1-(2-氧丙基)-1H-吡唑-3,5-二羧酸二乙酯，为浅棕色固体，直接用于下一步，MSm/z269.1[M+H]+。
步骤B：对1-(2-氧丙基)-1H-吡唑-3,5-二羧酸二乙酯(约47mmol)在乙酸(300mL)中的溶液添加乙酸铵(72g，940mmol)。回流48小时后，将混合物浓缩至最小体积并用水稀释。将沉淀物过滤，用水和MeCN清洗以给出4-羟基-6-甲基吡唑并[1,5-a]吡嗪-2-羧酸乙酯，为褐色固体(6.7g，64％)，MSm/z222.1[M+H]+。
步骤C：将4-羟基-6-甲基吡唑并[1,5-a]吡嗪-2-羧酸乙酯(7.18g，32.5mmol)在POCl3(80mL)中的混合物回流15小时。浓缩深色混合物并用MeCN清洗以给出4-氯-6-甲基吡唑并[1,5-a]吡嗪-2-羧酸乙酯(5.197g)，为灰白色固体。浓缩滤出液并层析以给出另1.42g产物(6.617g，85％)，MSm/z240.1[M+H]+，242.1[M+2+H]+。
步骤D：将4-氯-6-甲基吡唑并[1,5-a]吡嗪-2-羧酸乙酯(5.197g，21.7mmol)，MeB(OH)2(3.90g，65.1mmol)，K2CO3(14.8g，107.5mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(456mg，0.65mmol)在DMF(100mL)中的混合物脱气并在N2下加热15小时。在旋转蒸发仪上浓缩混合物以去除大部分DMF并用水清洗。将残余物层析(含2％至5％MeOH的CH2Cl2)以给出4,6-二甲基吡唑并[1,5-a]吡嗪-2-羧酸乙酯，为黄色固体(3.90g，82％)，MSm/z220.1[M+H]+；1HNMR(500MHz，DMSO-d6)：δ8.54(1H，s)，7.49(1H，s)，4.36(2H，q，J＝7.2Hz)，2.70(3H，s)，2.42(3H，s)，1.34(3H，t，J＝7.2Hz)。
步骤E：于-78℃对乙酸叔丁酯(1.63mL，12.1mmol)在THF(50mL)中的溶液添加LDA(1.5M，0.97mL，14.5mmol)。0.5小时后，于-30℃将该溶液用插管加至4,6-二甲基吡唑并[1,5-a]吡嗪-2-羧酸乙酯(1.33g，6.07mmol)在THF(100mL)中的溶液。1小时后，用饱和NH4Cl淬灭混合物，调至pH5-6并用EtOAc萃取。干燥并浓缩组合的有机物。将残余物层析(2％至4％MeOH/CH2Cl2)以给出3-(4,6-二甲基吡唑并[1,5-a]吡嗪-2-基)-3-氧丙酸叔丁酯，为黄色油(1.696g，97％)，MSm/z290.2[M+H]+；1HNMR(500MHz，DMSO-d6)：δ8.57(1H，s)，7.50(1H，s)，4.02(2H，s)，2.70(3H，s)，2.43(3H，s)，1.38(9H，s)。
步骤F：将3-(4,6-二甲基吡唑并[1,5-a]吡嗪-2-基)-3-氧丙酸叔丁酯(4.86g，16.8mmol)在EtOH(30mmol)中的溶液在带盖的管中于120℃加热。1小时后，将溶液冷却至室温并去除挥发物以给出3-(4,6-二甲基吡唑并[1,5-a]吡嗪-2-基)-3-氧丙酸乙酯，为黄色固体(4.44g，98％)，MSm/z262.2[M+H]+。
步骤G：将2-氨基-5-氟-吡啶(134mg，1.2mmol)，3-(4,6-二甲基吡唑并[1,5-a]吡嗪-2-基)-3-氧丙酸乙酯(261mg，1.0mmol)和PPT(12.6mg，0.05mmol)的混合物于130℃加热。8小时后，将混合物冷却至室温并层析以给出2-(4,6-二甲基吡唑并[1,5-a]吡嗪-2-基)-7-氟-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮，为黄色固体(220mg，71％)。MSm/z310.2[M+H]+；1HNMR(500MHz，DMSO-d6)：δ8.97-8.95(1H，m)，8.55(1H，s)，8.16-8.12(1H，m)，7.87-7.85(1H，m)，7.56(1H，s)，7.03(1H，s)，2.73，(3H，s)，2.43(3H，s)。
步骤H：将2-(4,6-二甲基吡唑并[1,5-a]吡嗪-2-基)-7-氟-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(309mg，1.0mmol)和哌嗪(1.1mL，10mmol)在DMA(1.0mL)中于120℃加热。15小时后，去除挥发物并用MeCN清洗残余物以给出标题化合物，为黄色固体(313mg，80％)。M.P.254-256℃；MSm/z390.4[M+H]+；1HNMR(500MHz，DMSO-d6)：δ8.55(1H，s)，8.27(1H，d，J＝2.7Hz)，8.12(1H，dd，J＝2.8Hz，9.7Hz)，7.71(1H，d，J＝9.7Hz)，7.54(1H，s)，6.95(1H，s)，3.25(4H，m)，2.72(3H，s)，2.51(4H，m，因DMSO-d6而模糊)，2.43(3H，s)，2.25(3H，s)。
本文中公开的别的化合物可以依照上述例子通过替换适宜起始材料，试剂和反应条件来制备。
WO2013/119916公开了可用于通过FoxM1剪接修饰来预防或治疗癌症的别的化合物。通过援引在此收录WO2013/119916。
术语“M.P.”代表“熔点(℃)”，术语“MS”代表“质谱峰m/z[M+H]+，[M+2+H]+，[M-H]-或[M+2-H]-”，术语“D”代表“分解”。
实施例
实施例1：化合物诱导FoxM1朝向FoxM1A的可变剪接
为了调查对FoxM1剪接的影响，在剂量响应中将人成纤维细胞用化合物1-4处理24小时，并通过RT-qPCR分析包括(FoxM1A)或排除(FoxM1B/C)外显子9的mRNA的存在。将所得剂量响应曲线拟合Hill结合方程。图1A显示所有化合物提高包括外显子9的FoxM1AmRNA的表达，化合物1，2，3和4的EC50值分别计算为0.246，0.016，1.210和0.068μM。相应地，缺少外显子9的FoxM1B/C同等型(Δ9型式)的mRNA下降，化合物1，2，3和4的EC50值分别为0.724，0.014，3.541和0.104μM。FoxM1A上调和FoxM1B/C下调的EC50值的相关性分析揭示了卓越的线性相关性(r2＝0.992)，相对于恒等式线无明显位移(图1C)。数据提示FoxM1A上调和FoxM1B/C下调的密切且直接的函数关系。
实施例2：朝向FoxM1A的可变剪接诱导细胞毒性
为了调查FoxM1表达改变对细胞增殖和存活的影响，在xCELLigence平台上在剂量响应中将人成纤维细胞用化合物1-4处理120小时，在线监测增殖速率和细胞死亡。如图2A中所示，化合物2在0.1和0.3μM的剂量在5天时间过程上对增殖具有温和影响，而它在≥1μM的剂量诱导强毒性。为了给降低细胞指数(作为减缓增殖和诱导细胞死亡的读出)定义一项定性度量，评估75％截留(ED75％)，其代表化合物将细胞指数降低至未处理对照的75％的浓度。量化72，96和120小时时的细胞指数揭示了所有化合物在较高剂量达到ED75％(图2B)。数据提示诱导FoxM1朝向FoxM1A的可变剪接诱导增殖减缓和细胞死亡。
实施例3：FoxM1可变剪接与细胞毒性有关
细胞指数降低的ED75％与FoxM1B/C降低的EC50的相关性揭示了卓越的线性相关性(r2＝0.963)。由此，活性的约10倍位移指示达到ED75％需要浓度超出FoxM1B/C降低的EC5010倍(图3A)。类似地，细胞指数降低的ED75％与FoxM1A诱导的EC50有关，同样显示卓越的线性相关性(r2＝0.951)，而且活性的10至15倍位移指示达到ED75％需要浓度超出FoxM1A诱导的EC5010至15倍(图3B)。数据提示诱导有意义的细胞指数降低(作为细胞增殖和存活的度量)需要自FoxM1B/C至FoxM1A的FoxM1剪接的大于90的位移。
实施例4：FoxM1A蛋白质升高与细胞毒性有关
为了评估FoxM1朝向FoxM1A的可变剪接是否导致蛋白质水平和细胞死亡中有意义的变化，在增殖性条件下处理人原代成肌细胞以调控FoxM1表达并评估它的后果。在增殖性条件下，通过Western印迹检测到FoxM1A，但是处于低浓度(图4A)。以直至10μM的剂量用化合物3处理强烈降低肌动蛋白(细胞数目的一项直接标志物)的蛋白质水平，但是提高FoxM1A的蛋白质水平(图4A)。蛋白质水平的定量分析指示肌动蛋白与对照相比降低6倍(图4B)，而FoxM1A水平在相同样品中升高接近5倍(图4C)。当针对肌动蛋白标准化时，FoxM1A蛋白质水平在最高剂量升高30倍(图4D)。数据提示在增殖中的成肌细胞中，朝向FoxM1A的可变剪接提高FoxM1A蛋白质且诱导细胞死亡。
实施例5：非增殖性条件中FoxM1A蛋白质无变化
为了评估并非增殖中的细胞中是否也存在FoxM1朝向FoxM1A的可变剪接，使相同人原代成肌细胞分化以调查在那些条件下FoxM1表达是否也存在且能类似地调控。在分化性条件下，通过Western印迹检测不到FoxM1A(图5A)。以直至10μM的剂量用化合物3处理没有显示肌动蛋白(作为细胞数目的标志物)的蛋白质水平的任何降低(图5A)。蛋白质水平的定量分析指示肌动蛋白与对照相比没有改变(图5B)，而针对肌动蛋白标准化的FoxM1A水平检测不到。数据提示FoxM1A表达局限于增殖中的细胞，而且朝向FoxM1A的可变剪接在并非增殖中的细胞中没有诱导细胞死亡。
实施例6：在乳腺癌细胞中FoxM1A蛋白质升高诱导细胞毒性
为了评估在癌症条件中朝向FoxM1A的FoxM1可变剪接所致FoxM1A蛋白质升高是否诱导细胞死亡，处理人乳腺癌细胞(BT474)以调控FoxM1表达，并在处理第1和2天评估FoxM1A蛋白质水平。在对照条件下第1和2天，通过Western印迹检测得到FoxM1A，但是处于低浓度(图6A)。以10μM用化合物2处理对FoxM1A蛋白质不具有任何影响但在第1天略微降低肌动蛋白蛋白质，但在第2天强烈降低肌动蛋白蛋白质，伴随着FoxM1A蛋白质水平升高(图6A)。蛋白质水平的定量分析指示肌动蛋白通过以10μM用化合物2处理在第1天降低18％，在第2天降低超过90％(图6B)，而相同样品中的FoxM1A水平升高接近3倍(图6C)。当针对肌动蛋白标准化时，FoxM1A蛋白质水平通过以10μM用化合物2处理升高28倍(图6D)。数据提示在乳腺癌细胞中，朝向FoxM1A的可变剪接提高FoxM1A蛋白质且诱导细胞死亡。
方法
使用实时定量PCR监测FoxM1剪接变体的表达水平
以10000个细胞每cm2将成纤维细胞用不同剂量的化合物(0.01-10μM)处理24小时。遵照Cells-to-CTTM试剂盒(Applied)中提到的指令实施RNA提取。于-20℃冷冻RNA样品直至进一步分析。使用一步多路逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)测量FoxM1A或FoxM1B/C连同GAPDH(作为内部对照)的相对表达水平。使用FAM探针进行FoxM1A或FoxM1B/C表达水平的相对量化，并使用VIC探针进行人GAPDH水平的相对量化。使用定量PCR的ΔΔCt相对量化方法测定扩增方法的保真度。
监测对成纤维细胞细胞增殖以及毒性的实时影响
以xCELLigenceE板-16格式以10000个细胞每cm2将成纤维细胞用不同剂量的化合物(0.1-10μM)处理5天。将板转移到放置在37℃，5％CO2温箱中的xCELLigenceRTCA-DP仪器上，并记录所有孔的背景阻抗测量。将成纤维细胞接种入孔中，并温育大约5小时以推动细胞的平静蔓延和稳定化。在120小时(5天)里每30分钟测量并记录随着细胞附着和蔓延，覆盖膜的下面的金微电极处的阻抗的变化。阻抗由称作细胞指数(CI)的相对且无量纲的参数代表。细胞指数值＝Zt-Zi/15[Ohm]；其中Zi＝实验开始时的初始阻抗且Zt＝实验期间的各个时间点(A.K.Bosserhoff,L.Ellmann,S.Kuphal.S:Melanoblastsincultureasaninvitrosystemtodeterminemolecularchangesinmelanoma.2011.ExperimentalDermatology,20,435-440)。自斜率计算排除最初6个小时中获得的值以考虑观察到的任何变化，它是细胞附着能力响应处理的差异所致的，如果有的话。
人成肌细胞或乳腺癌细胞培养和Western印迹分析
自ECACC获取人成肌细胞，自ATCC获得BT474细胞，并依照供应商的方案培养。对于实验目的，将人成肌细胞培养5天，并用不同剂量的化合物(0.1-10μM)处理。将BT474细胞培养长至2天，并以10μM用化合物处理。对于Western印迹分析，在沸腾的含有100mM二硫苏糖醇的Laemmli缓冲液(Bio-Rad)中裂解处理5天的成肌细胞的细胞或处理2天的BT474的细胞。用家兔抗FoxM1抗体(CellSignalingTechnology，1:1000)，山羊抗肌动蛋白(SantaCruzBiotechnology，1:20000)和Alexa680/800二抗(MolecularProbes，1:10,000)探查SDS-PAGE印迹。用Odyssey成像系统(LicorBiosciences)获取荧光，将FoxM1A强度针对肌动蛋白标准化。使用GraphPad软件分析数据。

Claims (17)

1.一种用于预防或治疗癌症的修饰FoxM1基因剪接的化合物，其中所述化合物诱导无转录活性的FoxM1变体。
2.权利要求1的化合物，其中所述无转录活性的FoxM1变体为FoxM1A。
3.权利要求1或2的化合物，其中所述FoxM1基因为人FoxM1基因。
4.权利要求1至3的化合物，其中所述癌症选自下组：肝，前列腺，脑，乳腺，肺，结肠，胰腺，皮肤，宫颈，卵巢，口，血液和神经系统的癌症。
5.权利要求1至4的化合物，其具有式I：
其中R1选自芳基，杂芳基，杂环烷基，这三种取代基均是任选用C1-7烷基，C1-7烷氧基，C1-7卤代烷氧基，C1-7卤代烷基，卤素，羟基，氰基，NO2取代的；
R2为C1-7烷氧基，任选用杂环烷基取代，NR’R”，杂环烷基，任选用羟基，NR’R”-C1-7烷基，羟基-C1-7烷基，C3-8环丙基，杂环烷基，C1-7烷氧基-C1-7烷基，羟基-C1-7烷氧基-C1-7烷基，卤素或氮杂螺环烷基，氮杂双环烷基，任选用NR’R”取代的C2-7炔基取代，或杂芳基，任选用C1-7烷基取代，
R3为卤素，C1-7烷基，
R’和R”独立选自氢，C1-7烷基，羟基-C1-7烷基。
6.权利要求5的化合物，其中：
R1为芳基或杂芳基，这两种取代基均是任选用C1-7烷基，C1-7卤代烷基，卤素，C1-7烷氧基，NR’R”取代的，
R2为杂芳基或杂环烷基，这两种取代基均是任选用C1-7烷基，羟基-C1-7烷基，卤代-C1-7烷基取代的，
R3为C1-7烷基。
7.权利要求5或6的化合物，其中：
R1为苯基，咪唑并[1,2-a]吡嗪基，吡唑并[1,5-a]吡嗪基，咪唑并[1,2-a]吡啶基，1,3-苯并口恶唑基，吲唑基。
8.权利要求5至7的化合物，其中R2为哌啶基，吗啉基，哌嗪基，吡啶基，1,2,3,6-四氢吡啶基，吡咯烷基。
9.权利要求1至8的化合物制备用于预防或治疗癌症的药物的用途。
10.一种药物配制剂，其包含权利要求1至8的化合物。
11.一种预防或治疗癌症的方法，其包括对受试者施用有效量的权利要求1至8的化合物。
12.一种筛选用于预防或治疗癌症的化合物的方法，其包括：
c)使增殖中的表达FoxM1基因的细胞与测试化合物接触，
d)测量步骤a)的细胞中的FoxM1变体FoxM1A，其中与对照相比升高水平的FoxM1A变体指示预防或治疗癌症的化合物。
13.一种筛选用于预防或治疗癌症的化合物的方法，其包括：
c)使增殖中的表达FoxM1基因的细胞与测试化合物接触，
d)测量步骤a)的细胞中的FoxM1变体FoxM1B和/或变体FoxM1C，其中与对照相比降低水平的变体FoxM1B和/或变体FoxM1C指示预防或治疗癌症的化合物。
14.权利要求12或13的方法，其中所述细胞为成纤维细胞。
15.权利要求12至14的方法，其中在RNA水平上测量FoxM1变体。
16.权利要求12或15的方法，其中在蛋白质水平上测量FoxM1变体。
17.说明书中描述的发明。
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