EA029155B1 - Соединения для лечения спинальной мышечной атрофии - Google Patents

Соединения для лечения спинальной мышечной атрофии Download PDF

Info

Publication number
EA029155B1
EA029155B1 EA201491617A EA201491617A EA029155B1 EA 029155 B1 EA029155 B1 EA 029155B1 EA 201491617 A EA201491617 A EA 201491617A EA 201491617 A EA201491617 A EA 201491617A EA 029155 B1 EA029155 B1 EA 029155B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
pyridin
pyrano
compound
patient
gene
Prior art date
Application number
EA201491617A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491617A1 (ru
Inventor
Чан-Сун Ли
Соонгиу Чой
Гари Митчелл Карп
Хироо КОЯМА
Хасан РАТНИ
Original Assignee
ПиТиСи ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК.
Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ПиТиСи ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК., Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical ПиТиСи ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК.
Publication of EA201491617A1 publication Critical patent/EA201491617A1/ru
Publication of EA029155B1 publication Critical patent/EA029155B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/04—Ortho-condensed systems
    • C07D491/044—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring
    • C07D491/052—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring the oxygen-containing ring being six-membered

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

В изобретении предложены соединения, композиции на их основе и их применение при лечении спинальной мышечной атрофии.

Description

изобретение относится к способу, который способствует включению экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется по гену 8ΜΝ2, включающему контактирование клетки человека с соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, который способствует включению экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую по гену 8ΜΝ2, включающему контактирование клетки человека с соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой, что способствует экспрессии минигена 8ΜΝ2, описанного в настоящем документе или в международной публикации под номером \УО 2009/151546 или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833, каждая из которых в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки. В одном варианте осуществления изобретения минигеном является миниген, описанный в примерах международной пуб- 23 029155
ликации под номером АО 2009/151546 или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833. В другом варианте осуществления минигеном является миниген, описанный в биологическом примере 1 ниже. Клетка человека может контактировать с соединением формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его формой ίη νίίτο и/или ίη νίνο, например, в животном, не принадлежащем к человеческому роду, или в человеке. В конкретном варианте осуществления изобретения клеткой человека является клетка от человека или в человеке. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клеткой человека является клетка от человека или в человеке, страдающем 8ΜΑ. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клеткой человека является клетка от человека или в человеке, страдающем 8ΜΑ, где 8ΜΑ вызывается инактивирующей мутацией или делецией в гене 8ΜΝ1 в обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена 8ΜΝ1. В другом варианте осуществления клеткой человека является клетка, полученная от человека, страдающего 8ΜΑ. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка человека получена из клеточной линии, например, ΟΜ03813, 0Μ00232, ΟΜ09677 и/или ΟΜ23240 (приобретенной в С.опе11 1п5111и1е). В одном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам, которые способствуют включению экзона 7 8ΜΝ1 в РНК, транскрибируемую по гену 8ΜΝ1, включающим контактирование клетки человека с соединением формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формой. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам, которые способствуют включению экзона 7 8ΜΝ1 в РНК, транскрибируемую по гену 8ΜΝ1, включающим контактирование клетки человека с соединением формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формой.
В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам, которые способствуют включению экзона 7 8ΜΝ1 в РНК, транскрибируемую по гену 8ΜΝ1, включающим контактирование клетки человека с соединением формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формой, что модулирует экспрессию минигена 8ΜΝ1, описанного в международной публикации под номером АО2009/151546 или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833, каждая из которых в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки. В одном варианте осуществления изобретения минигеном является миниген, описанный в примерах международной публикации под номером АО2009/151546 или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833. Клетка человека может контактировать с соединением формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формой ίη νίίτο и/или ίη νίνο, например, в животном, не принадлежащем к человеческому роду, или в человеке. В конкретном варианте осуществления изобретения клеткой человека является клетка от человека или в человеке. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клеткой человека является клетка от человека или в человеке, страдающем 8ΜΑ. В одном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формой.
В одних конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, которые способствуют включению экзона 7 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2 в РНК, транскрибируемую по генам 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, включающим контактирование клетки человека с соединением формулы (I) или его формой. Клетка человека может контактировать с соединением формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формой ίη νίίτο и/или ίη νίνο, например, в животном, не принадлежащем к человеческому роду, или в человеке. В конкретном варианте осуществления изобретения клеткой человека является клетка от человека или в человеке. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клеткой человека является клетка от человека или в человеке, страдающем 8ΜΑ. В одном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу модулирования включения экзона 7 8ΜΝ2 в РНК, транскрибируемую по гену 8ΜΝ2, включающему введение в модель животного с 8ΜΑ, не принадлежащего к человеческому роду, соединения формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формы. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу модулирования включения экзона 7 8ΜΝ2 в РНК, транскрибируемую по гену 8ΜΝ2, включающему введение в модель животного с 8ΜΑ, не принадлежащего к человеческому роду, соединения формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формы, что модулирует экспрессию минигена 8ΜΝ2, описанного в настоящем документе или в международной публикации под номером АО 2009/151546 или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833, каждая из которых в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки. В одном варианте осуществления изобретения минигеном является миниген, описанный в примерах международной публикации под номером АО 2009/151546 или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833. В другом варианте осуществления минигеном является миниген, описанный в биологическом примере 1, ниже. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (I) или его формой.
В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, который способствует включению экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется по гену 8ΜΝ2, включающему введение в модель животного с 8ΜΑ, не принадлежащего к человеческому роду, соединения формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формы. В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, который способствует включению экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, транскриби- 24 029155
руемую по гену 8М№, включающему введение в модель животного с ЗМА, не принадлежащего к человеческому роду, соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы, что усиливает экспрессию минигена 8М№, описанного в настоящем документе или в международной публикации под номером АО 2009/151546 или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833, каждая из которых в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки. В одном варианте осуществления изобретения минигеном является миниген, описанный в примерах международной публикации под номером АО 2009/151546 или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833. В другом варианте осуществления минигеном является миниген, описанный в биологическом примере 1, ниже. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу, который способствует включению экзона 7 ЗМШ в РНК, транскрибируемую по гену 8МШ, включающему введение в модель животного с ЗМА, не принадлежащего к человеческому роду, соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, который способствует включению экзона 7 ЗМШ в РНК, транскрибируемую по гену 8МШ, включающему введение в модель животного с ЗМА, не принадлежащего к человеческому роду, соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы, что модулирует экспрессию минигена ЗМШ, описанного в настоящем документе или в международной публикации под номером АО 2009/151546 или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833, каждая из которых в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки. В одном варианте осуществления изобретения минигеном является миниген, описанный в примерах международной публикации под номером АО 2009/151546 или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой.
В одних конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу, который способствует включению экзона 7 ЗМШ и ЗМШ в РНК, транскрибируемую по генам ЗМШ и ЗМШ, включающему введение в модель животного с ЗМА, не принадлежащего к человеческому роду, соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу увеличения количества белка Зтп, включающему контактирование клетки человека с соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу увеличения количества белка Зтп, включающему контактирование клетки человека с соединением формулы (11а1) или формулы (111а1), что способствует включению экзона 7 ЗМШ в мРНК, которая транскрибируется с гена ЗМШ. В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу увеличения количества белка Зтп, включающему контактирование клетки человека с соединением формулы (11а1) или формулы (111а1), что способствует включению экзона 7 ЗМШ и/или ЗМШ в мРНК, транскрибируемую с гена ЗМШ и/или ЗМШ. Клетка человека может контактировать с соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой ίη νίίΓΟ и/или ίη νίνο, например, в животном, не принадлежащем к человеческому роду, или в человеке. В конкретном варианте осуществления изобретения клеткой человека является клетка от человека или в человеке. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клеткой человека является клетка от человека или в человеке, страдающем ЗМА. В другом конкретном варианте осуществления изобретения клеткой человека является клетка от человека или в человеке, страдающем ЗМА, где ЗМА вызывается инактивирующей мутацией или делецией в гене ЗМШ в обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена ЗМШ. В другом варианте осуществления клеткой человека является клетка, полученная от человека, страдающего ЗМА. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка человека получена из клеточной линии, например, ОМ03813, 0М00232, ОМ09677 и/или ОМ23240 (приобретенной в Сопе11 ПъШШе). В одном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу увеличения количества белка Зтп, включающему введение в модель животного с ЗМА, не принадлежащего к человеческому роду, соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу увеличения количества белка Зтп, включающему введение в модель животного с ЗМА, не принадлежащего к человеческому роду, соединения формулы (11а1) или формулы (111а1), что способствует включению экзона 7 ЗМШ в мРНК, транскрибируемую с гена ЗМШ, например, в клеточном или бесклеточном исследовании, например, описанном в биологических примерах ниже. В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу увеличения количества белка Зтп, включающему введение в модель животного с ЗМА, не принадлежащего к человеческому роду, соединения формулы (11а1) или формулы (111а1), что способствует включению экзона 7 ЗМШ и/или ЗМШ в мРНК, транскрибируемую с гена ЗМШ и/или ЗМШ, например, в клеточном или бесклеточном исследовании.
В одном варианте осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) повышает экспрессию минигена, описанного в настоящем документе или в международной публикации
- 25 029155
под номером \УО 2009/151546 или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833, каждая из которых в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) повышает экспрессию минигена, описанного в примерах международной публикации под номером \УО 2009/151546 или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833. В другом конкретном варианте осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) повышает экспрессию минигена, описанного в биологическом примере 1 ниже. В одном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы для получения лекарственного средства, которое способствует включению экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ2. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы для получения лекарственного средства, которое способствует включению экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется с гена 8ΜΝ2, таким образом повышая экспрессию белка 8тп у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении. В конкретном варианте осуществления соединение формулы (I) или его форма способствуют включению экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ2, в исследовании, описанном в настоящем документе (см., например, биологические примеры ниже). В конкретном варианте осущетвления изобретения соединение является соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы для получения лекарственного средства, которое способствует включению экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы для получения лекарственного средства, которое способствует включению экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, повышая, таким образом, экспрессию белка 8тп у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам, которые способствуют включению экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется по гену 8ΜΝ2 у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, включающим введение пациенту-человеку эффективного количества соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, который способствует включению экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется по гену 8ΜΝ2, у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, включающему введение пациенту-человеку эффективного количества соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы, что способствует включению экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ2, что определено в исследовании, описанном в настоящем документе (см., например, биологические примеры ниже). В одних конкретных вариантах осуществления изобретения эффективное количество соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы вводят пациенту-человеку в виде фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель, инертный наполнитель или разбавитель. В конкретном варианте осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма способствуют включению экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ2, в исследовании, описанном в настоящем документе (см., например, биологические примеры ниже). В конкретном варианте осуществления изобретения пациентом-человеком является человек, страдающий 8ΜΑ. В другом конкретном варианте осуществления изобретения пациентом-человеком является человек, страдающий 8ΜΑ, где 8ΜΑ вызывается инактивирующей мутацией или делецией в гене 8ΜΝ1 в обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена 8ΜΝ1. В одном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его формой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам, которые способствуют включению экзона 7 8ΜΝ1 в мРНК, которая транскрибируется по гену 8ΜΝ1, у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, включающим введение пациенту-человеку эффективного количества соединения формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его формы. В конкретном варианте осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его форма способствуют включению экзона 7 8ΜΝ1 в мРНК, которая транскрибируется по гену 8ΜΝ1, в исследовании, описанном в международной публикации под номером \УО 2009/151546 или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833. В одних конкретных вариантах осуществления изобретения эффективное количество соединения формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его формы вводят пациенту-человеку в виде фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель, инертный наполнитель или разбавитель. В конкретном варианте осуществления изобретения пациентом-человеком является человек, страдающий 8ΜΑ. В одном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (I) или его формой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу, который способствует включению экзона 7 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, у пациента-человека, нуж- 26 029155
дающегося в таком лечении, включающему введение пациенту-человеку эффективного количества соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы. В конкретном варианте осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма способствуют включению экзона 7 8ΜΝ1 в мРНК, которая транскрибируется по гену 8ΜΝ1 в исследовании(ях), описанном(ых) в международной публикации под номером \УО 2009/151546 или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833 (см., например, примеры в этих публикациях), каждая из которых в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки. В одних конкретных вариантах осуществления изобретения эффективное количество соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы вводят пациенту-человеку в виде фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель, инертный наполнитель или разбавитель. В конкретном варианте осуществления изобретения пациентом-человеком является человек, страдающий 8ΜΑ. В другом конкретном варианте осуществления изобретения пациентом-человеком является человек, страдающий 8ΜΑ, где 8ΜΑ вызывается инактивирующей мутацией или делецией в гене 8ΜΝ1 в обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена 8ΜΝ1. В одном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам повышения экспрессии белка 8ти у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, включающим введение пациенту-человеку эффективного количества соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу повышения экспрессии белка 8тп у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, включающему введение пациенту-человеку эффективного количества соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы, что способствует включению экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ2. В другом конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу повышения экспрессии белка 8тп у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, включающему введение пациенту-человеку эффективного количества соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы, что способствует включению экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2. В одних конкретных вариантах осуществления изобретения эффективное количество соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы вводят пациенту-человеку в виде фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель, инертный наполнитель или разбавитель. В конкретном варианте осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма способствуют включению экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в исследовании, описанном в настоящем документе (см., например, биологические примеры ниже), или в международной публикации под номером \УО 2009/151546, или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833 (см., например, примеры в этих публикациях), каждая из которых в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки.
В конкретном варианте осуществления изобретения пациентом-человеком является человек, страдающий 8ΜΑ. В другом конкретном варианте осуществления изобретения пациентом-человеком является человек, страдающий 8ΜΑ, где 8ΜΑ вызывается инактивирующей мутацией или делецией теломерной копии гена 8ΜΝ1 в обеих хромосомах, что приводит к потере функции гена 8ΜΝ1. В одном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы для получения лекарственного средства, которое повышает экспрессию белка 8тп у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении. В конкретном варианте осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма способствуют включению экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ2, что определено в исследовании, описанном в настоящем документе (см., например, биологические примеры ниже). В другом варианте осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма способствуют включению экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, что определено в исследовании, описанном в настоящем документе (см., например, биологические примеры ниже), или в международной публикации под номером \УО 2009/151546, или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833 (см., например, примеры в этих публикациях), каждая из которых в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения спинальной мышечной атрофии (8ΜΑ), включающим введение пациенту эффективного количества соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения 8ΜΑ у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, включающему введение пациенту эффективного количества соединения формулы (11а1) или формулы (111а 1) или его формы. В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения 8ΜΑ у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество соединения формулы (11а1) или фор- 27 029155
мулы (111а1) или его формы и фармацевтически приемлемый носитель, инертный наполнитель или разбавитель. В одном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения δΜΑ у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, включающий введение пациенту эффективного количества соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы, что способствует включению экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена δΜΝ2. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения δΜΑ у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы, что способствует включению экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена δΜΝ2, и фармацевтически приемлемый носитель, инертный наполнитель или разбавитель. В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения δΜΑ у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы, что способствует включению экзона 7 δΜΝ1 и/или δΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, и фармацевтически приемлемый носитель, инертный наполнитель или разбавитель. В конкретном варианте осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма способствуют включению экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена δΜΝ2, в исследовании, описанном в настоящем документе (смотри, например, биологические примеры ниже). В другом варианте осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма способствуют включению экзона 7 δΜΝ1 и/или δΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, что определено в исследовании, описанном в настоящем документе (смотри, например, биологические примеры ниже), или в международной публикации под номером АО 2009/151546, или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833 (см., например, примеры в этих публикациях), каждая из которых в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы в производстве лекарственного средства для лечения δΜΑ у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении. В конкретном варианте осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма способствуют включению экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется с гена δΜΝ2, что определено в исследовании, описанном в настоящем документе (см., например, биологические примеры ниже). В другом варианте осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма способствуют включению экзона 7 δΜΝ1 и/или δΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, что определено в исследовании, описанном в настоящем документе (см., например, биологические примеры ниже), или в международной публикации под номером АО 2009/151546, или в публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833 (см., например, примеры в этих публикациях), каждая из которых в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение является соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой.
В варианте осуществления применения или способа, предусмотренного в настоящем документе, соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или их форма используются в сочетании с одним или несколькими дополнительными агентами. Соединение(я) формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма могут вводиться субъекту или контактировать с клеткой до, одновременно или после введения субъекту либо контакта клетки с дополнительным(ми) агентом(ами). Соединение(я) формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма и дополнительный(ые) агент(ы) могут вводиться субъекту либо контактировать с клеткой в одной композиции или в различных композициях. В конкретных вариантах осуществления соединение(я) формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форму применяют в сочетании с замещением гена δΜΝ1 (используя, например, вирусные вектора доставки генов). В других конкретных вариантах осуществления соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или их форму применяют в сочетании с заменой клеток, с использованием дифференцированных стволовых клеток δΜΝ1+/+ и/или δΜΝ2+/+. В других конкретных вариантах осуществления соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или их форма используются в сочетании с заменой клеток, с использованием дифференцированных стволовых клеток δΜΝ 1+/+. В других конкретных вариантах осуществления соединения формулы (I) или их форма используются в сочетании с заменой клеток, с использованием дифференцированных стволовых клеток δΜΝ2+/+. В другом конкретном варианте осуществления изобретения соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или их форма используются в сочетании с акларубицином. В другом конкретном варианте осуществления изобретения соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или их форма используются в сочетании с активатором транскрипции, таким как ингибитор деацетилазы гистонов ("НОЛС") (например, бутираты, вальпроевая кислота и гидроксимочевина), и стабилизаторами мРНК (например, ингибитор мРНК декэппинга КО3039 от фирмы КерНдеи).
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению соединений
- 28 029155
формулы (11а1) или формулы (111а1) или их формы в сочетании с поддерживающей терапией, включая респираторную поддержку, кормление и реабилитационную помощь.
В некоторых вариантах осуществления изобретения лечение 8ΜΑ соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой (самостоятельно или в сочетании с дополнительным агентом) имеет терапевтический эффект или благоприятный эффект. В конкретном варианте осуществления изобретения лечение 8ΜΑ с помощью соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы (самостоятельно или в сочетании с дополнительным агентом) приводит к одному, двум или более следующим эффектам: (ί) уменьшает или облегчает тяжесть 8ΜΑ; (ίί) задерживает начало 8ΜΑ; (ίίί) ингибирует прогрессирование 8ΜΑ; (ιν) снижает уровень госпитализации субъекта; (ν) снижает продолжительность госпитализации субъекта; (νί) повышает выживаемость субъекта; (νίί) улучшает качество жизни субъекта; (νίίί) уменьшает число симптомов, связанных с 8ΜΑ; (ίχ) уменьшает или облегчает тяжесть симптома(ов), связанного(ых) с 8ΜΑ; (х) сокращает продолжительность симптома, связанного с 8ΜΑ; (χί) предотвращает рецидив симптома, связанного с 8ΜΑ; (χίί) подавляет развитие или наступление симптома 8ΜΑ; и/или (χίίί) подавляет прогрессирование симптома, связанного с 8ΜΑ.
Симптомы 8ΜΑ включают мышечную слабость, плохой мышечный тонус, слабый крик, слабый кашель, вялость или склонность к падениям, затруднения при сосании или глотании, затрудненное дыхание, накопление секрета в легких или горле, сжатые кулаки с потливостью рук, дрожание/вибрация речи, голова часто наклонена набок, даже в положении лежа, ноги, как правило, слабее, чем руки, ноги часто принимают позицию "лягушачьи лапки", трудности с кормлением, повышенная восприимчивость дыхательных путей к инфекциям, слабость кишечника/мочевого пузыря, вес ниже, чем нормальный, неспособность сидеть без поддержки, неспособность ходить, неспособность ползать, и гипотония, арефлексия и множественные врожденные контрактуры (артрогрипоз), связанные с повреждением клеток передних рогов спинного мозга.
В конкретном варианте осуществления изобретения лечение 8ΜΑ с помощью соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы (самостоятельно или в сочетании с дополнительным агентом) приводит к одному, двум или более следующим эффектам: (ί) уменьшение потери мышечной силы; (ίί) увеличение мышечной силы; (ίίί) снижение мышечной атрофии; (ιν) уменьшение потери двигательной функции; (ν) увеличение двигательных нейронов; (νίί) уменьшение потери двигательных нейронов; (νίίί) защита 8ΜN-дефицитных моторные нейронов от дегенерации; (ίχ) увеличение двигательной функции; (х) увеличение легочной функции; и/или (χί) уменьшение потери легочной функции.
В другом варианте осуществления лечение 8ΜΑ с помощью соединения формулы (11а 1) или формулы (111а1) или его формы (самостоятельно или в сочетании с дополнительным агентом) приводит к функциональной способности или помогает сохранить функциональную способность у грудного ребенка или у ребенка ясельного возраста сидеть прямо. В другом варианте осуществления лечение 8ΜΑ с помощью соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы (самостоятельно или в сочетании с дополнительным агентом) приводит к функциональной способности или помогает сохранить функциональную способность у грудного ребенка или у ребенка ясельного возраста, ребенка или взрослого человека стоять без посторонней помощи. В другом варианте осуществления лечение 8ΜΑ с помощью соединения формулы или его формы (самостоятельно или в сочетании с дополнительным агентом) приводит к функциональной способности или помогает сохранить функциональную способность у грудного ребенка или у ребенка ясельного возраста, ребенка или взрослого человека ходить без посторонней помощи. В другом варианте осуществления лечение 8ΜΑ с помощью соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы (самостоятельно или в сочетании с дополнительным агентом) приводит к функциональной способности или помогает сохранить функциональную способность у грудного ребенка или у ребенка ясельного возраста, ребенка или взрослого человека бегать без посторонней помощи. В другом варианте осуществления лечение 8ΜΑ с помощью соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы (самостоятельно или в сочетании с дополнительным агентом) приводит к функциональной способности или помогает сохранить функциональную способность у грудного ребенка или у ребенка ясельного возраста, ребенка или взрослого человека дышать без посторонней помощи. В другом варианте осуществления лечение 8ΜΑ с помощью соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы (самостоятельно или в сочетании с дополнительным агентом) приводит к функциональной способности или помогает сохранить функциональную способность у грудного ребенка или у ребенка ясельного возраста, ребенка или взрослого человека переворачиваться во время сна без посторонней помощи. В другом варианте осуществления лечение 8ΜΑ с помощью соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы (самостоятельно или в сочетании с дополнительным агентом) приводит к функциональной способности или помогает сохранить функциональную способность у грудного ребенка или у ребенка ясельного возраста, ребенка или взрослого человека глотать без посторонней помощи.
В некоторых вариантах осуществления изобретения праймер и/или зонд, описанные далее в биологических примерах (например, 8ΜΝ праймеры, такие как 8Е0 ГО № 1, 7, 8, 11 или 13 и/или 8Е0 ГО № 2, 9 или 12, и 8ΜΝ зонды, такие как 8Е0 ГО № 3 или 10), используют в исследовании, таком как ОТ-ПЦР, ОТ-кПЦР, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке", ПЦР, кПЦР, амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блоттинг или блоттинг по Саузерну, чтобы определить, способствует ли соединение
- 29 029155
формулы (I) или его форма включению экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления изобретения используют праймер и/или зонд, описанные далее в биологических примерах (например, 8ΜΝ праймеры, такие как 8Ер ГО № 1, 7, 8, 11 или 13 и/или 8Ер ГО № 2, 9 или 12, и 8ΜΝ зонды, такие как 8Ер ГО № 3 или 10), в исследовании, таком как ОТ-ПЦР, ОТ-кПЦР, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке", ПЦР, кПЦР, амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блоттинг или блоттинг по Саузерну, или фармацевтический или аналитический набор, как описано ниже, для оценки ответной реакции пациента на соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форму.
Вариантом осуществления применения является применение соединения формулы (Ша1) или формулы (Ша2)
Еь Еь
(Ша1) или (Ша2)
г
или его формы.
Вариантом осуществления применения является применение соединения формулы (Па1)
или его формы.
Вариантом осуществления применения является применение соединения формулы (Ша1)
или его формы.
Группа больных
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его форму, или его фармацевтическую композицию вводят субъекту, страдающему 8МА. В других вариантах осуществления соединение формулы (I) или его форму вводят субъекту, предрасположенному или восприимчивому к 8МА. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его форму, или его фармацевтическую композицию вводят пациенту-человеку, страдающему 8МА, где 8МА вызывается инактивирующей мутацией или делецией в гене δМN 1 в обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена δМN 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъекта-человека генотипируют до введения соединения формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его формы, или содержащей его фармацевтической композиции, чтобы определить, имеет ли субъект инактивирующую мутацию или делецию в теломерной копии гена δМN 1 в обеих хромосомах, приводящие к потере функции гена δМN 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форму или его фармацевтическую композицию вводят субъекту, страдающему 8МА 0 типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форму или его фармацевтическую композицию вводят субъекту, страдающему 8МА 1 типа. В других вариантах осуществления соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его форму, или его фармацевтическую композицию вводят субъекту, страдающему 8МА 2 типа. В других вариантах осуществления соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его форму, или его фармацевтическую композицию вводят субъекту, страдающему 8МА 3 типа. В некото- 30 029155
рых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1), или его форму, или его фармацевтическую композицию вводят субъекту, страдающему 8ΜΑ 4 типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения пациентом-человеком является пациент, страдающий 8ΜΑ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1), или его форму, или его фармацевтическую композицию вводят субъекту, в отношении которого будет или вероятно будет оказано благоприятное воздействие от включения экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2. В одних конкретных вариантах осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1), или его форму, или его фармацевтическую композицию вводят субъекту, в отношении которого будет или вероятно будет оказано благоприятное воздействие от повышения экспрессии белка 8тп.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1), или его форму, или его фармацевтическую композицию вводят человеку возраста в диапазоне от около 0 месяцев до 6 месяцев, от около 6 до 12 месяцев, от около 6 до около 18 месяцев, от около 18 до около 36 месяцев, от около 1 до около 5 лет, от около 5 до около 10 лет, от около 10 до около 15 лет, от около 15 до около 20 лет, от около 20 до около 25 лет, от около 25 до 30 лет, от около 30 до около 35 лет, от около 35 до около 40 лет, от около 40 до около 45 лет, от около 45 до около 50 лет, от около 50 до около 55 лет, от около 55 до около 60 лет, от около 60 до около 65 лет, от около 65 до около 70 лет, от около 70 до около 75 лет, от около 75 до около 80 лет, от около 80 до около 85 лет, от 85 до 90 лет, от около 90 до около 95 лет или от около 95 до около 100 лет.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (I), или его форму, или его фармацевтическую композицию вводят грудному ребенку. В других вариантах осуществления соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его форму, или его фармацевтическую композицию вводят ребенку ясельного возраста. В других вариантах осуществления соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его форму, или его фармацевтическую композицию вводят ребенку. В других вариантах осуществления соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его форму, или его фармацевтическую композицию вводят взрослому человеку. В других вариантах осуществления соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его форму, или его фармацевтическую композицию вводят человеку преклонного возраста.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его форму, или содержащую его фармацевтическую композицию вводят пациенту для профилактики возникновения 8ΜΑ у пациента с риском развития 8ΜΑ. В других вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его формы, или содержащей его фармацевтической композиции вводят пациенту для профилактики возникновения 8ΜΑ у пациента с риском развития 8ΜΑ. В других вариантах осуществления профилактически эффективное количество соединения формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его формы, или содержащей его фармацевтической композиции вводят пациенту для профилактики возникновения 8ΜΑ у пациента с риском развития 8ΜΑ. В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество соединения формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его формы, или содержащей его фармацевтической композиции вводят пациенту для профилактики возникновения 8ΜΑ у пациента с риском развития 8ΜΑ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его форму, или его фармацевтическую композицию вводят пациенту, страдающему 8ΜΑ, для лечения или уменьшения интенсивности 8ΜΑ. В других вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его формы, или содержащей его фармацевтической композиции вводят пациенту, страдающему 8ΜΑ, для лечения или уменьшения интенсивности 8ΜΑ. В других вариантах осуществления профилактически эффективное количество соединения формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его формы, или содержащей его фармацевтической композиции вводят пациенту, страдающему 8ΜΑ, для профилактики развития 8ΜΑ. В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество соединения формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его формы, или содержащей его фармацевтической композиции вводят пациенту, страдающему 8ΜΑ, для лечения или уменьшения интенсивности 8ΜΑ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят субъекту, страдающему 8ΜΑ. В других вариантах осуществления соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форму вводят субъекту, предрасположенному или восприимчивому к 8ΜΑ. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят человеку-субъекту, страдающему 8ΜΑ, где 8ΜΑ вызывается инактивирующей мутацией или делецией в гене 8ΜΝ1 в обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена 8ΜΝ1. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъекта-человека генотипируют до введения соединения формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его формы, или содержащего его лекарственного средства, чтобы определить, имеет ли субъект инактивирующую мутацию или делецию в теломерной копии гена 8ΜΝ1 в обеих хромосомах, приводящую к потере функции гена 8ΜΝ1. В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1), или его форму, или содер- 31 029155
жащее его лекарственное средство вводят субъекту, страдающему §МЛ 0 типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят субъекту, страдающему §МЛ 1 типа. В других вариантах осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят субъекту, страдающему §МЛ 2 типа. В других вариантах осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят субъекту, страдающему §МЛ 3 типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят субъекту, страдающему §МЛ 4 типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения пациентом-человеком является пациент, страдающий §МЛ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят субъекту, в отношении которого будет или вероятно будет оказано благоприятное воздействие от включения экзона 7 §МЫ1 и/или §МЫ2 в мРНК, транскрибируемую с гена §МЫ1 и/или §МЫ2. В одних конкретных вариантах осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят субъекту, в отношении которого будет или вероятно будет оказано благоприятное воздействие от повышения экспрессии белка 8ши.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят человеку возраста в диапазоне от около 0 месяцев до около 6 месяцев, от около 6 до около 12 месяцев, от около 6 до около 18 месяцев, приблизительно от 18 до около 36 месяцев, от около 1 до около 5 лет, от около 5 до около 10 лет, от около 10 до около 15 лет, от около 15 до около 20 лет, от около 20 до около 25 лет, от около 25 до около 30 лет, от около 30 до около 35 лет, от около 35 до около 40 лет, от около 40 до около 45 лет, от около 45 до около 50 лет, от около 50 до около 55 лет, от около 55 до около 60 лет, от около 60 до около 65 лет, от около 65 до около 70 лет, от около 70 до около 75 лет, от около 75 до около 80 лет, от около 80 до около 85 лет, около от 85 до около 90 лет, от около 90 до около 95 лет или от около 95 до около 100 лет.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят грудному ребенку. В других вариантах осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят ребенку ясельного возраста. В других вариантах осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят ребенку. В других вариантах осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят взрослому человеку. В других вариантах осуществления соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят человеку, преклонного возраста.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят пациенту для профилактики возникновения §МЛ у пациента с риском развития §МЛ. В других вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (11а1) или формулы (111а1), или его формы, или содержащего его лекарственного средства вводят пациенту для профилактики возникновения §МЛ у пациента с риском развития §МЛ. В других вариантах осуществления профилактически эффективное количество соединения формулы (11а1) или формулы (111а1), или его формы, или содержащего его лекарственного средства вводят пациенту для профилактики возникновения §МЛ у пациента с риском развития §МЛ. В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество соединения формулы (11а1) или формулы (111а1), или его формы, или содержащего его лекарственного средства вводят пациенту для профилактики возникновения §МЛ у пациента с риском развития §МЛ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), или его форму, или содержащее его лекарственное средство вводят пациенту, страдающему §МЛ, для лечения или уменьшения интенсивности §МЛ. В других вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (11а1) или формулы (111а1), или его формы, или содержащего его лекарственного средства вводят пациенту, страдающему §МЛ, для лечения или уменьшения интенсивности §МЛ. В других вариантах осуществления профилактически эффективное количество соединения формулы (11а1) или формулы (111а1), или его формы, или содержащего его лекарственного средства вводят пациенту для профилактики возникновения §МЛ у пациента с риском развития §МЛ. В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество соединения формулы (11а1) или формулы (111а1), или его формы, или содержащего его лекарственного средства вводят пациенту, страдающему §МЛ, для лечения или уменьшения интенсивности §МЛ.
Способ введения
При введении пациенту соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форму предпочтительно вводят в качестве компонента композиции, которая необязательно включает фармацевтически приемлемый носитель, инертный наполнитель или разбавитель. Композиция может быть введена перорально или любым другим удобным способом, например путем инфузии или болюсной инъекции, путем
- 32 029155
абсорбции через эпителиальные или слизистые выстилки (например, слизистую оболочку полости рта, ректальную и слизистую оболочку кишечника) и могут быть введены вместе с другим биологически активным агентом. Введение может быть системным или местным. Для введения соединения известны и могут быть использованы различные системы доставки, например инкапсуляция в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы и капсулы.
Способы введения включают, но ими не ограничиваются, парентеральный, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный, пероральный, сублингвальный, интраназальный, интрацеребральный, интравагинальный, трансдермальный, ректальный, путем ингаляции или местное введение, в частности в уши, нос, глаза или нанесение на кожу. Способ введения остается на усмотрение врача. В большинстве случаев введение обеспечит высвобождение соединения в кровоток. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение вводят перорально.
Дозировка и лекарственные формы
Количество соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы, которое будет эффективным при лечении 8ΜΑ, зависит, например, от способа введения, типа 8ΜΑ, общего состояния здоровья субъекта, этнической принадлежности, возраста, веса и пола субъекта, питания, времени и тяжести 8ΜΆ, и должно определяться в соответствии с мнением лечащего врача и в зависимости от состояния каждого пациента или субъекта.
В одних конкретных вариантах осуществления изобретения "эффективное количество", "профилактически эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" в контексте введения соединения формулы (11а1) или формулы (111а1), или его формы, или композиции, или лекарственного средства относится к количеству соединения формулы (11а1) или формулы (111а1), которое обладает терапевтическим эффектом или благоприятным эффектом. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения "эффективное количество", "профилактически эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" в контексте введения соединения формулы (11а1) или формулы (111а1), или его формы, или его композиции, или лекарственного средства приводит к одному, двум или более следующим эффектам: (ί) уменьшает или облегчает тяжесть 8ΜΑ; (ίί) задерживает начало 8ΜΑ; (ίίί) ингибирует прогрессирование 8ΜΑ; (ίν) снижает уровень госпитализации субъекта; (ν) снижает продолжительность госпитализации субъекта; (νί) повышает выживаемость субъекта; (νΐΐ) улучшает качество жизни субъекта; (νΐΐ) уменьшает число симптомов, связанных с 8ΜΑ; (ίχ) уменьшает или облегчает тяжесть симптома(ов), связанного(ых) с 8ΜΑ; (х) сокращает продолжительность симптома, связанного с 8ΜΑ; (χΐ) предотвращает рецидив симптома, связанного с 8ΜΑ; (χΐΐ) подавляет развитие или наступление симптома 8ΜΑ; и/или (χίίί) подавляет прогрессирование симптома, связанного с 8ΜΑ. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффективное количество соединения формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его формы является количеством, эффективным для повышения включения экзона 7 8ΜΝ2 в 8ΜΝ2 мРНК, которая транскрибируется с гена 8ΜΝ2, и увеличения уровней белка 8тп, продуцируемого на основе гена 8ΜΝ2, и, таким образом, вызывая желаемый положительный эффект у пациента, нуждающегося в таком лечении. В некоторых случаях желаемый эффект может быть определен путем анализа или количественного определения: (1) включения экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется с гена 8ΜΝ2; или (2) уровней белка 8тп, продуцируемого на основе гена 8ΜΝ2. Неограничивающие примеры эффективных количеств соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы описаны в настоящем документе.
Например, эффективное количество может соответствовать количеству, необходимому для лечения 8ΜΑ у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, или количеству, необходимому для повышения включения экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется по гену 8ΜΝ2, у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, или количеству, необходимому для повышения уровня белка 8тп, продуцируемого на основе гена 8ΜΝ2, у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении. В конкретном варианте осуществления изобретения пациентом-человеком является пациент, страдающий 8ΜΑ.
Обычно эффективное количество будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,001 до около 500 мг/кг/день для пациента или субъекта, имеющего массу в диапазоне от приблизительно 1 до около 200 кг. Предположительно типичный взрослый человек имеет средний вес в диапазоне между около 70 и около 100 кг.
В объеме настоящего описания "эффективное количество" соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы для применения в производстве лекарственного средства, при подготовке фармацевтического набора или в способе лечения 8ΜΑ у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, включает количество в диапазоне от приблизительно 0,001 до около 35000 мг. В конкретном варианте осуществления изобретения пациентом-человеком является пациент, страдающий 8ΜΑ.
Композиции, описанные в настоящем документе, получены для введения субъекту любым способом доставки лекарственного средства, известного в данной области. Неограничивающие объем изобретения примеры включают пероральный, окулярный, ректальный, офтальмический, буккальный, местный, назальный, офтальмический, подкожный, внутримышечный, внутривенный (болюс и вливание), интрацеребральный, трансдермальный и пульмональный способы введения.
- 33 029155
Фармацевтические композиции
Варианты осуществления, описанные в настоящем документе, включают использование соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы в фармацевтической композиции. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение описывает применение соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы в фармацевтической композиция для лечения 8ΜΆ у пациента-человека, нуждающегося в таком лечении, включающее введение эффективного количества соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы в смеси с фармацевтически приемлемым инертным наполнителем. В конкретном варианте осуществления изобретения пациентом-человеком является пациент, страдающий 8ΜΆ.
Соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма может необязательно быть в виде композиции, содержащей соединение или его форму и дополнительный носитель, инертный наполнитель или разбавитель. Другие варианты осуществления, описанные в настоящем документе, включают фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество соединения формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формы и фармацевтически приемлемый носитель, инертный наполнитель или разбавитель. В конкретном варианте осуществления изобретения фармацевтические композиции являются подходящими для применения в ветеринарии и/или для введения человеку. Фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, могут быть в любой форме, которая обеспечивает введение композиции субъекту.
В конкретном варианте осуществления и в этом контексте термин "фармацевтически приемлемый носитель, инертный наполнитель или разбавитель" обозначает носитель, инертный наполнитель или разбавитель, одобренный регулятивным органом федерального правительства или правительства штата, или перечисленный в фармакопее США или другой одобренной фармакопее для применения на животных и, в частности, на человеке. Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полный и неполный)), инертному наполнителю или носителю, с которым вводят терапевтический агент. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая полученные из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Вода является специфическим носителем для внутривенного введения фармацевтических композиций. Физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, в частности для инъецируемых растворов.
Типичные композиции и лекарственные формы включают один или несколько инертных наполнителей. Подходящие инертные наполнители хорошо известны специалистам в области фармации, и неограничивающие примеры подходящих инертных наполнителей включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицерин моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Является ли конкретный инертный наполнитель подходящим для включения в фармацевтическую композицию или лекарственную форму, зависит от различных факторов, хорошо известных в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, способ, которым лекарственная форма будет введена пациенту, и конкретные активные ингредиенты в лекарственной форме. Кроме того, настоящее изобретение относится к безводным фармацевтическим композициям и лекарственным формам, содержащим одно или несколько соединений формулы (11а1) или формулы (111а1) или их форму, как описано в настоящем документе. Композиции и стандартные лекарственные формы могут принимать форму растворов или сиропов (необязательно с ароматизатором), суспензий (необязательно с ароматизатором), эмульсий, таблеток (например, жевательные таблетки), пилюль, капсул, гранул, порошка (необязательно для восстановления), композиций с корригированным вкусом и запахом или препаратов с замедленным высвобождением и тому подобное.
Фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, которые пригодны для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных лекарственных форм, таких как, но ими не ограничиваются, таблетки, каплеты, капсулы, гранулы, порошки и жидкости. Такие лекарственные формы содержат заранее определенное количество активных ингредиентов и могут быть получены методами фармации, хорошо известным специалистам в данной области техники.
Примеры инертных наполнителей, которые могут быть использованы в пероральных лекарственных формах, описанных в настоящем документе, включают, но ими не ограничиваются, связующие вещества, наполнители, разрыхлители и смазывающие вещества.
Биомаркеры.
В некоторых вариантах осуществления количество мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, используется в качестве биомаркера 8ΜΆ. В некоторых вариантах осуществления количество мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, используется в качестве биомаркера 8ΜΆ. В других вариантах осуществления количество мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, используется в качестве биомаркера для пациента, страдающего 8ΜΆ, подвергаемого лечению с помощью соединения, например, описанного в настоящем до- 34 029155
кументе. В других вариантах осуществления количество мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, используется в качестве био маркера для пациента, страдающего 8ΜΑ, подвергаемого лечению с помощью соединения, например, описанного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления изменение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и соответствующее изменение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, является биомаркером для пациента, которого лечат соединением, например, описанным в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления пациентом является больной с 8ΜΑ.
В конкретном варианте осуществления увеличение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и соответствующее уменьшение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, после введения соединения (например, соединения формулы (I), описанного в настоящем документе), означает, что соединение может быть эффективным для лечения 8ΜΑ. В другом конкретном варианте осуществления уменьшение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ2, и соответствующее увеличение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ2, после введения соединения (например, соединения формулы (11а1) или формулы (111а1), описанного в настоящем документе), означает, что соединение не будет эффективным для лечения 8ΜΑ. В соответствии с этими вариантами осуществления 8ΜΝ праймер(ы) и/или 8ΜΝ зонд, описанные далее, могут быть использованы в анализах, таких как ПЦР (например, кПЦР) и ОТ-ПЦР (например, ОТ-кПЦР или ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке"), для оценки и/или количественного определения мРНК, которая транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или гена 8ΜΝ2 и включает или не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены 8ΜΝ праймеры и/или 8ΜΝ зонды (например, прямой праймер, имеющий нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО № 1, 7, 8, 11 или 13; и/или обратный праймер, имеющий нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО № 9 или 12; и/или 8ΜΝ зонд, такой как 8ЕЦ ГО № 3 или 10) для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих или кодируемые 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 человека. Эти праймеры могут быть использованы в качестве праймеров, например, в ОТ-ПЦР (такой как ОТ-ПЦР, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР, как описано в настоящем документе или известно специалистам в данной области), ПЦР (такая как кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, и в качестве зондов при гибридизации, например, Нозерн-блоттинге и/или блоттинге по Саузерну. Используемая в биологических примерах в настоящем документе ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" представляет собой полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией, которая осуществляется в течение определенного количества циклов амплификации (или до тех пор, пока не будут израсходованы исходные вещества) с последующим количественным анализом каждого ДНК-продукта с использованием, например, гельэлектрофоретического разделения, окрашивания флуоресцентным красителем, количественного анализа с использованием флуоресценции и тому подобное.
8ЕЦ ГО № 1 гибридизируется с ДНК или РНК, содержащей нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 22-40 экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2; 8ЕЦ ГО № 2 гибридизируется с ДНК или РНК, содержащей нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 4-26 последовательности, кодирующей люциферазу светляков; 8ЕЦ ГО № 7 гибридизируется с нуклеотидной последовательностью (например, смысловой цепью ДНК), содержащей нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 32-54 экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и нуклеотидам 1-48-го экзона 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2; 8ЕЦ ГО № 8 гибридизируется с нуклеотидными последовательностями (например, смысловая цепь ДНК), содержащими нуклеотиды, соответствующие, по порядку, нуклеотидам 87-111 экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и нуклеотидам 1-3 экзона 8 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2; 8ЕЦ ГО № 9 гибридизируется с нуклеотидными последовательностями (например, антисмысловой цепью ДНК или РНК), содержащими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 39-62 экзона 8 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2; 8ЕЦ ГО № 11 гибридизируется с нуклеотидными последовательностями (например, смысловая цепь ДНК), содержащими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 43-63 экзона 6 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2; 8ЕЦ ГО № 12 гибридизируется с нуклеотидными последовательностями (например, антисмысловая цепь ДНК или РНК), содержащими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 51-73 экзона 8 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2; и 8ЕЦ ГО № 13 гибридизируется с нуклеотидными последовательностями (например, смысловая цепь ДНК), содержащими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 22-46 экзона 6 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2.
Соответственно, олигонуклеотид, соответствующий 8ЕЦ ГО № 9, 11, 12 и/или 13, может быть использован в реакции амплификации для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих или кодируемых 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 человека, лишенным экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 человека, и нуклеиновой кислоты, кодирующей или кодируемой 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 человека, и включает экзон 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 человека. В отличие от этого, олигонуклеотид, соответствующий 8ЕЦ ГО № 8, в сочетании с обратным праймером (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12) может быть использован для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих или кодируемых 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 человека, лишенным экзона 7 8ΜΝ1
- 35 029155
и/или 8ΜΝ2 человека, и олигонуклеотид, соответствующий 8ЕЦ ГО № 1 и 7, в сочетании с обратным праймером (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12) может быть использован для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих или кодируемых 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 человека, и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2.
8ЕЦ ГО № 3 гибридизируется с нуклеотидными последовательностями (например, смысловая цепь ДНК), содержащими нуклеотиды, соответствующие, по порядку, нуклеотидам 50-54 экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 человека и нуклеотиды 1-21 экзона 8 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 человека; и 8ЕЦ ГО № 10 гибридизируется с нуклеотидными последовательностями (например, смысловая цепь ДНК), содержащими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 7-36 экзона 8 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 человека. 8ЕЦ ГО № 3 используется в качестве зонда для обнаружения мРНК, которая транскрибируется с минигена и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, описанные в настоящем документе или описанные в международной публикации \УО 2009/151546 или публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833 (каждая из которых в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), и для обнаружения мРНК, которая транскрибируется с 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 человека и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2. Кроме того, 8ЕЦ ГО № 10 используется в качестве зонда для обнаружения мРНК, которая транскрибируется с минигена и включает или не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и обнаружения мРНК, которая транскрибируется с 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 человека, описанных в настоящем документе или описанных в международной публикации под номером \УО 2009/151546 или публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833, каждая из которых в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки.
В конкретном варианте осуществления праймер и/или зонд, описанные в биологических примерах далее (например, 8ΜΝ праймеры, такие как 8ЕЦ ГО № 1, 7, 11 или 13 и/или 8ЕЦ ГО № 2, 9 или 12, и/или 8ΜΝ зонды, такие как 8ЕЦ ГО № 3 или 10), используются в анализе, таком как ОТ-ПЦР, ОТ-кПЦР, ОТПЦР с детекцией "по конечной точке", ПЦР, кПЦР, амплификация по типу катящегося кольца и в зависимости от обстоятельств Нозерн-блоттинг или блоттинг по Саузерну (например, такой анализ, как описан в биологических примерах далее), чтобы определить, способствует ли соединение (например, соединение формулы (I) или его форма) включению экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2.
В другом варианте осуществления праймер и/или зонд, описанные в биологических примерах далее (например, 8ΜΝ праймеры, такие как 8ЕЦ ГО № 1, 7, 11 или 13 и/или 8ЕЦ ГО № 9 или 12, и/или 8ΜΝ зонды, такие как 8ЕЦ ГО № 3 или 10), используются в анализе, таком как ОТ-ПЦР, ОТ-кПЦР, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке", ПЦР, кПЦР, амплификация по типу катящегося кольца и в зависимости от обстоятельств Нозерн-блоттинг или блоттинг по Саузерну (например, такой анализ, как описан в биологических примерах далее), для оценки количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента. В конкретном варианте осуществления пациентом является больной с 8ΜΑ.
В другом варианте осуществления праймер и/или зонд, описанные в биологических примерах далее (например, 8ΜΝ праймеры, такие как 8ЕЦ ГО № 1, 7, 11 или 13, и/или 8ЕЦ ГО № 9 или 12, и/или 8ΜΝ зонды, такие как 8ЕЦ ГО № 3 или 10), используются в анализе, таком как ОТ-ПЦР, ОТ-кПЦР, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке", ПЦР, кПЦР, амплификация по типу катящегося кольца и в зависимости от обстоятельств Нозерн-блоттинг или блоттинг по Саузерну (например, такой анализ, как описан в биологических примерах далее), для контроля реакции пациента на соединение (например, соединение формулы (I) или его форма). В конкретном варианте осуществления пациентом является больной с 8ΜΑ.
Образец (например, пробы крови, образец мононуклеаров периферической крови или образец ткани, такой как кожа, или образец мышечной ткани) у пациента может быть получен с использованием методов, известных специалистам в данной области, и праймеры и/или зонды, описанные в биологических примерах ниже, могут быть использованы в анализах (например, ПЦР, ОТ-ПЦР, ОТ-кПЦР, кПЦР, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке", амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блоттинг и блоттинг по Саузерну), чтобы определить количество мРНК, которое транскрибируется с генов 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 (например, количество мРНК, которое включает экзон 7 гена 8ΜΝ2, транскрибируемой с гена 8ΜΝ2). Образец, отобранный у пациента, относится к образцу, который преобразуют и/или обрабатывают после того, как получают от пациента, с использованием методов, известных специалистам в данной области техники. Например, образец, отобранный у пациента, может быть обработан, например, для выделения РНК, с помощью методик, известных специалистам в данной области техники. Образец, отобранный у пациента, может быть обработан, например, для выделения РНК, и РНК обратно транскрибируют с продуцированием кДНК. В конкретном варианте осуществления пациентом является больной с 8ΜΑ.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ определения количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента (например, образца крови или образца ткани) или производного от образца пациента (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК) с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее
- 36 029155
(например, 8Еф ΙΌ № 1, 7, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8Еф ГО № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией «по конечной точке» и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления образец получают от или отбирают у пациента, которому вводят соединение, такое как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления пациентом является больной с 8ΜΆ.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ определения количества мРНК, которое транскрибируется с генов 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента (например, образца крови или образца ткани), или производного от образца пациента (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК) с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 1, 7, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с генов 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления образец получают от или отбирают у пациента, которому было введено соединение, например соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форму, как описано в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления пациентом является больной с 8ΜΆ.
Количество мРНК, которое транскрибируется с человеческих генов 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, включающей экзон 7 гена 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, и количество мРНК, которое транскрибируется с человеческих генов 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, можно отличить друг от друга, например, по размеру фрагмента РНК или ДНК, образованного из мРНК 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, включающей экзон 7 гена 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, и из мРНК 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, которая не включает экзон 7 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ определения количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, включающий: (а) контактирование образца от пациента (например, образца крови или образца ткани) или производного от образца пациента (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК) с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8Еф ГО № 8, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8Еф ГО № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления образец получают от или отбирают у пациента, которому было введено соединение, например соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форму, как описано в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления пациентом является больной с 8ΜΆ.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ определения количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента (например, образца крови или образца ткани), или производного от образца пациента (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК) с 8ΜΝ зондом, описанным далее (например, 5>Еф ГО № 3 или 10), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР), амплификации по типу катящегося кольца и в зависимости от обстоятельств Нозерн-блоттинга или блоттинга по Саузерну; и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления образец получают от или отбирают у пациента, которому вводится соединение, такое как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления пациентом является больной с 8ΜΆ.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ определения количества мРНК, которое транскрибируется с генов 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента (например, образца крови или образца ткани), или производного от образца пациента (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК) с 8ΜΝ зондом, описанным далее (например, 5>Еф ГО № 3 или 10), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР), амплификации по типу катящегося кольца и в зависимости от обстоятельств Нозерн-блоттинга или блоттинга по Саузерну; и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с генов 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2.
Количество мРНК, которое транскрибируется с человеческих генов 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, включающей экзон 7 гена 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, и количество мРНК, которое транскрибируется с человеческих генов 8ΜΝ1
- 37 029155
и 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, можно отличить друг от друга, например, по размеру фрагмента РНК или ДНК, образованного из мРНК 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, включающей экзон 7 гена 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, и из мРНК 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, которая не включает экзон 7 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления образец получают от или отбирают у пациент, которому было введено соединение, такое как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления пациентом является больной с 8ΜΆ.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ определения количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента (например, образца крови или образца ткани), или производного от образца пациента (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК) с 8ΜΝ зондом, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 10), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР), амплификации по типу катящегося кольца или Нозерн-блоттинга или блоттинга по Саузерну; и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления образец получают от или отбирают у пациента, которому было введено соединение, такое как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления пациентом является больной с 8ΜΆ.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ определения количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента (например, образца крови или образца ткани) или производного от образца пациента (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК) с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 1, 7, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12), и/или 8ΜΝ зондом, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 3 или 10), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления образец получают от или отбирают у пациента, которому было введено соединение, такое как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления пациентом является больной с 8ΜΆ.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ определения количества мРНК, которое транскрибируется с генов 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента (например, образца крови или образца ткани), или производного от образца пациента (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК) с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 1, 7, 8, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12), и/или 8ΜΝ зондом, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 3 или 10), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца в зависимости от обстоятельств; и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с генов 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2. В конкретном варианте осуществления пациентом является больной с 8ΜΆ.
Количество мРНК, которое транскрибируется с человеческих генов 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, включающих экзон 7 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, и количество мРНК, которое транскрибируется с человеческих генов 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, которые не включают экзон 7 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, можно отличить друг от друга, например, по размеру фрагмента РНК или ДНК, образованного из мРНК 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, включающей экзон 7 гена 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, и из мРНК 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2, которая не включает экзон 7 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления образец получают от или отбирают у пациента, которому было введено соединение, такое как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления пациентом является больной с 8ΜΆ.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ определения количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента (например, образца крови или образца ткани), или производного от образца пациента (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК) с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 8), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12), и/или 8ΜΝ зондом, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 10), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не вклю- 38 029155
чает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2. В некоторых вариантах осуществления образец получают от или отбирают у пациента, которому было введено соединение, такое как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления пациентом является больной с 8ΜΑ.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ оценки ответной реакции пациента, страдающего 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента с 8ΜΑ (например, образца крови или образца ткани), или производного от образца, взятого у пациента с 8ΜΑ (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК), с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8ΜΝ, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, где образец получен или отобран у пациента, страдающего 8ΜΑ, обработанного соединением (например, соединением, описанным в настоящем документе); и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) увеличение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или терапевтически значимым для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или терапевтически значимым для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ оценки ответной реакции пациента, страдающего 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) введение соединения пациенту, страдающему 8ΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, образца крови или образца ткани), полученного или отобранного у пациента, с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕО ГО № 1, 7, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ2, где (1) увеличение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, по отношению к количеству мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или терапевтически значимым для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента оценивают через 1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч, 12 ч, 16 ч, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ оценки ответной реакции пациента, страдающего 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента, страдающего 8ΜΑ, (например, образца крови или образца ткани), или производного от образца, взятого у пациента с 8ΜΑ (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК), с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 1, 7, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕО ГО № 9 или 12), и/или 8ΜΝ зондом (например, 8ЕЦ ГО № 3 или 10), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР),
- 39 029155
ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, где образец получен или отобран у пациента, страдающего 8МА, обработанного соединением (например, соединением формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формой, как описано в настоящем документе); и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена §МШ и/или §МШ и включает экзон 7 гена §МШ и/или §МШ, где (1) увеличение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8МШ и/или и включает
экзон 7 гена 8МШ и/или БМШ. в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена §МШ и/или §МШ и включает экзон 7 гена §МШ и/или §МШ, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8МШ и/или и включает экзон 7 гена 8МШ и/или §М№, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена §МШ и/или §МШ и включает экзон 7 гена §МШ и/или в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или терапевтически значимым для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3,
6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ оценки ответной реакции пациента, страдающего 8МА, на соединение, включающий: (а) введение соединения пациенту, страдающему 8МА; (Ь) контактирование образца (например, образца крови или образца ткани), полученного или отобранного у пациента, с прямым §МК праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 1, 7, 11 или 13), и/или обратным §МК праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12), и/или §МК зондом (например, 8ЕЦ ГО № 3 или 10), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена и/или и включает экзон 7 гена
и/или §МШ, где (1) увеличение количества мРНК, которое транскрибируется с гена и/или
и включает экзон 7 гена и/или 8М№, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена и/или 8М№ и включает экзон 7 гена
и/или §М№, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена §МШ и/или §МШ и включает экзон 7 гена §МШ и/или §МШ, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена §МЫ 1 и/или и включает экзон 7 гена
и/или §М№, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или терапевтически значимым для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ оценки ответной реакции пациента, страдающего 8МА, на соединение, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента, страдающего 8МА, (например, образца крови или образца ткани) или производного от образца, взятого у пациента с 8МА (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК), с прямым §МК праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 8, 11 или 13), и/или обратным §МК праймером, описанным в настоящем документе (например, §ЕЦ ГО № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, где образец получен или отобран у пациента, страдающего 8МА, обработанного соединением (например, соединением формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формой, как описано в настоящем документе); и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена и/или §М№ и не включает экзон 7 гена и/или 8М№, где (1) снижение количества мРНК, которое
транскрибируется с гена §МШ и/или §МШ и не включает экзон 7 гена §МШ и/или §МШ, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена и/или
§МШ и не включает экзон 7 гена §МШ и/или §МШ, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена §МШ и/или §МШ и не включает экзон 7 гена §МШ и/или
- 40 029155
3ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или терапевтически значимым для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ оценки ответной реакции пациента, страдающего 3ΜΑ, на соединение, включающий: (а) введение соединения пациенту, страдающему 3ΜΑ; (Ъ) контактирование образца (например, образца крови или образца ткани), полученного или отобранного у пациента, с прямым 3ΜΝ праймером, описанным далее (например, ЗЕО ГО № 8, 11 или 13), и/или обратным 3ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, ЗЕО ГО № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2, где (1) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или терапевтически значимым для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ оценки ответной реакции пациента, страдающего 3ΜΑ, на соединение, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента, страдающего 3ΜΑ, (например, образца крови или образца ткани) или производного от образца, взятого у пациента с 3ΜΑ (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК), с прямым 3ΜΝ праймером, описанным далее (например, ЗЕЦ ГО № 8, 11 или 13), и/или обратным 3ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, ЗЕО ГО № 9 или 12), и/или 3ΜΝ зондом (например, ЗЕЦ ГО № 10), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, где образец получен или отобран у пациента, страдающего 3ΜΑ, обработанного соединением (например, соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой, как описано в настоящем документе); и (Ъ) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2, где (1) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 3ΜΝ1 и/или 3ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или терапевтически значимым для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ оценки ответной реакции пациента, страдающего 3ΜΑ, на соединение, включающий: (а) введение соединения пациенту, страдающему 3ΜΑ; (Ъ) контактирование образца (например, образца крови или образца
- 41 029155
ткани), полученного или отобранного у пациента, с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, §Еф ГО № 8, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, §Еф ГО № 9 или 12), и/или 8ΜΝ зондом (например, 8Еф ГО № 10), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТкПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или терапевтически значимым для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента оценивают через 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 12 часов, 16 часов, 20 часов, 1 день, 2 дня, 3 дня, 5 дней, 7 дней, 14 дней, 28 дней, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ оценки ответной реакции пациента, страдающего 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента, страдающего 8ΜΑ, (например, образца крови или образца ткани), или производного от образца, взятого у пациента с 8ΜΑ (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК), с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8Еф ГО № 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8Еф ГО № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, где образец получен или отобран у пациента, страдающего 8ΜΑ, обработанного соединением (например, соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой, как описано в настоящем документе); и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) (ί) повышение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, и (ίί) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, и (ίί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ оценки ответной реакции пациента, страдающего 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) введение соединения пациенту, страдающему 8ΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, образца крови или образца ткани), полученного или отобранного у пациента, с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (напри- 42 029155
мер, δΕΟ ΙΌ № 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, δΕΟ ΙΌ № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) (ί) повышение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, и (ίί) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным, и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, и (ίί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента оценивают через 1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч, 12 ч, 16 ч, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ оценки ответной реакции пациента, страдающего 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента, страдающего 8ΜΑ, (например, образца крови или образца ткани), или производного от образца, взятого у пациента с 8ΜΑ (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК), с 8ΜΝ зондом (например, 8Ε0 ГО № 10) вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, где образец получен или отобран у пациента, страдающего 8ΜΑ, обработанного соединением (например, соединением формулы (11а1) или формулы (111а1) или его формой, как описано в настоящем документе); и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) (ί) повышение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, и (ίί) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, и (ίί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах
- 43 029155
осуществления ответную реакцию пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ оценки ответной реакции пациента, страдающего 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) введение соединения пациенту, страдающему 8ΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, образца крови или образца ткани), полученного или отобранного у пациента, с 8ΜΝ зондом (например, 8ЕЦ ГО № 10), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) (ί) повышение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, и (ίί) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, и (ίί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ оценки ответной реакции пациента, страдающего 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента, страдающего 8ΜΑ, (например, образца крови или образца ткани) или производного от образца, взятого у пациента с 8ΜΑ (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК), с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12), и/или 8ΜΝ зондом (например, 8ЕЦ ГО № 10), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР) или ПЦР (например, кПЦР), где образец получен или отобран у пациента, страдающего 8ΜΑ, обработанного соединением (например, соединением формулы (I) или его формой, как описано в настоящем документе); и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) (ί) повышение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, и (ίί) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным, и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, и (ίί) отсутствие из- 44 029155
менений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ оценки ответной реакции пациента, страдающего 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) введение соединения пациенту, страдающему 8ΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, образца крови или образца ткани), полученного или отобранного у пациента, с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8Е0 ГО № 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8Е0 ГО № 9 или 12), и/или 8ΜΝ зондом (например, 8Е0 ГО № 10) вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТкПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) (ί) повышение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, и (ίί) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что 8ΜΝ1 и/или пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, и (ίί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ контролирования ответной реакции пациентов, страдающих 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента, страдающего 8ΜΑ, (например, образца крови или образца ткани) или производного от образца, взятого у пациента с 8ΜΑ (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК), с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕО ГО № 1, 7, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕО ГО № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТПЦР(например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, где образец получен или отобран у пациента, страдающего 8ΜΑ, обработанного соединением (например, соединением формулы (I) или его формой, как описано в настоящем документе); и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) увеличение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется
- 45 029155
с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления осуществляют контроль ответной реакции пациента в течение 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления осуществляют контролирование ответной реакции пациента после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более доз соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, контролирование ответной реакции пациента осуществляют в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, в процессе или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ контролирования ответной реакции пациентов, страдающих 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) введение соединения пациенту, страдающему 8ΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, образца крови или образца ткани), полученного или отобранного у пациента, с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 1, 7, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) увеличение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента контролируют в течение 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления осуществляют контролирование ответной реакции пациента, после того как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более доз соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, в процессе или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ контролирования ответной реакции пациентов, страдающих 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента, страдающего 8ΜΑ, (например, образца крови или образца ткани) или производного от образца, взятого у пациента с 8ΜΑ (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК), с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 1, 7, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12), и/или 8ΜΝ зондом (например, 8ЕЦ ГО № 3 или 10), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, где образец
- 46 029155
получен или отобран у пациента, страдающего 8ΜΑ, обработанного соединением (например, соединением формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формой, как описано в настоящем документе); и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) увеличение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления, осуществляют контроль ответной реакции пациента в течение 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более на соединение, такое как формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формы, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления осуществляют контролирование ответной реакции пациента, после того как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более доз соединения, такого как соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, в процессе или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ контролирования ответной реакции пациентов, страдающих 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) введение соединения пациенту, страдающему 8ΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, образца крови или образца ткани), полученного или отобранного у пациента, с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 1, 7, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12), и/или 8ΜΝ зондом (например, 8ЕЦ ГО № 3 или 10), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) увеличение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента контролируют в течение 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления осуществляют контролирование ответной реакции пациента, после того как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более доз соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, в процес- 47 029155
се или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ контролирования ответной реакции пациентов, страдающих 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента, страдающего 8ΜΑ, (например, образца крови или образца ткани) или производного от образца, взятого у пациента с 8ΜΑ (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК), с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8Е0 ГО № 8, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8Е0 ГО № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, где образец получен или отобран у пациента, страдающего 8ΜΑ, обработанного соединением (например, соединением формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его формой, как описано в настоящем документе); и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента контролируют в течение 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления осуществляют контролирование ответной реакции пациента, после того как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более доз соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, в процессе или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ контролирования ответной реакции пациентов, страдающих 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) введение соединения пациенту, страдающему 8ΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, образца крови или образца ткани), полученного или отобранного у пациента, с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 8, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В неко- 48 029155
торых вариантах осуществления ответную реакцию пациента контролируют в течение 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, осуществляют контролирование ответной реакции пациента, после того как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более доз соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, в процессе или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ контролирования ответной реакции пациентов, страдающих 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента, страдающего 8ΜΑ, (например, образца крови или образца ткани) или производного от образца, взятого у пациента с 8ΜΑ (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК), с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕО ГО № 8, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕО ГО № 9 или 12), и/или 8ΜΝ зондом (например, 8ЕО ГО № 10) вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТкПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, где образец получают от или отбирают у пациента, которому было введено соединение (например, соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе); и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента контролируют в течение 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, осуществляют контролирование ответной реакции пациента, после того как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более доз соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, в процессе или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ контролирования ответной реакции пациентов, страдающих 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) введение соединения пациенту, страдающему 8ΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, образца крови или образца ткани), полученного или отобранного у пациента, с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕО ГО № 8, 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕО ГО № 9 или 12), и/или 8ΜΝ зондом (например, 8ЕО ГО № 10) вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТкПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или
- 49 029155
δΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и не включает экзон 7 гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и не включает экзон 7 гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента контролируют в течение 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления осуществляют контролирование ответной реакции пациента, после того как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более доз соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, в процессе или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ контролирования ответной реакции пациента, страдающего δΜΑ, на соединение, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента, страдающего δΜΑ (например, образца крови или образца ткани), или производного от образца, взятого у пациента с δΜΑ (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК), с прямым δΜΝ праймером, описанным далее (например, δΕΟ ΙΌ № 11 или 13), и/или обратным δΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, δΕΟ ΙΌ № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, где образец получен или отобран у пациента, страдающего δΜΑ, обработанного соединением (например, соединением формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его формой, как описано в настоящем документе); и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и включает экзон 7 гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, и количества мРНК, которое транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и не включает экзон 7 гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, где (1) (ί) повышение количества мРНК, которое транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и включает экзон 7 гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и включает экзон 7 гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, и (ίί) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и не включает экзон 7 гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и не включает экзон 7 гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным, и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и включает экзон 7 гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и включает экзон 7 гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, и (ίί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и не включает экзон 7 гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и не включает экзон 7 гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента контролируют в течение 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых
- 50 029155
вариантах осуществления, осуществляют контролирование ответной реакции пациента, после того как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более доз соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, в процессе или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ контролирования ответной реакции пациента, страдающего ЗМА, на соединение, включающий: (а) введение соединения пациенту, страдающему ЗМА; (Ь) контактирование образца (например, образца крови или образца ткани), полученного или отобранного у пациента, с прямым ЗΜN праймером, описанным далее (например, ЗЕО ГО № 11 или 13), и/или обратным ЗΜN праймером, описанным в настоящем документе (например, ЗЕО ГО № 9 или 12), вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификация по типу катящегося кольца; и (с) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена ЗМШ и/или ЗМШ и включает экзон 7 гена ЗМШ и/или ЗМШ, и количества мРНК, которое транскрибируется с гена ЗМШ и/или ЗМШ и не включает экзон 7 гена ЗМШ и/или ЗМШ, где (1) (ί) повышение количества мРНК, которое транскрибируется с гена ЗМШ и/или ЗМШ и включает экзон 7 гена ЗМШ и/или ЗМ№, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена ЗМШ и/или ЗМШ и включает экзон 7 гена ЗМШ и/или ЗМШ, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, и (ίί) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена ЗМШ и/или ЗМШ и не включает экзон 7 гена ЗМШ и/или ЗМШ, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена ЗМШ и/или ЗМШ и не включает экзон 7 гена ЗМШ и/или ЗМШ, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена ЗМШ и/или ЗМШ и включает экзон 7 гена ЗМШ и/или ЗМШ, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена ЗΜN1 и/или ЗМШ и включает экзон 7 гена ЗМШ и/или ЗМ№, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, и (ίί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена ЗМШ и/или ЗМШ и не включает экзон 7 гена ЗМШ и/или ЗМ№, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена ЗМШ и/или ЗМШ и не включает экзон 7 гена ЗМШ и/или ЗМШ, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента контролируют в течение 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления осуществляют контролирование ответной реакции пациента, после того как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более доз соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, в процессе или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ контролирования ответной реакции пациента, страдающего ЗМА, на соединение, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента, страдающего ЗМА (например, образца крови или образца ткани), или производного от образца, взятого у пациента с ЗМА (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК), с ЗΜN зондом (например, ЗЕО ГО № 10) вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, где образец получен или отобран у пациента, страдающего ЗМА, обработанного соединением (например, со- 51 029155
единением формулы (I) или его формой, как описано в настоящем документе); и (Ъ) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) (ί) повышение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, и (ίί) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, и (ίί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента контролируют в течение 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления осуществляют контролирование ответной реакции пациента, после того как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более доз соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, в процессе или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ контролирования ответной реакции пациента, страдающего 8ΜΛ, на соединение, включающий: (а) введение соединения пациенту, страдающему 8ΜΆ; (Ъ) контактирование образца (например, образца крови или образца ткани), полученного или отобранного у пациента, с 8ΜΝ зондом (например, 8ЕО ГО № 10) вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) (ί) повышение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, и (ίί) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2,
- 52 029155
в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, и (ίί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента контролируют в течение 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления осуществляют контролирование ответной реакции пациента, после того как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более доз соединения, такого как соединение формулы (I) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, в процессе или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ контролирования ответной реакции пациента, страдающего 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) контактирование образца, взятого у пациента, страдающего 8ΜΑ (например, образца крови или образца ткани), или производного от образца, взятого у пациента с 8ΜΑ (например, образца крови или образца ткани, которые были подвергнуты обработке для выделения РНК), с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12), и/или 8ΜΝ зондом (8ЕЦ ГО № 10) вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, где образец получен или отобран у пациента, страдающего 8ΜΑ, обработанного соединением (например, соединением формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формой, как описано в настоящем документе); и (Ь) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) (ί) повышение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, и (ίί) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, и (ίί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента контролируют в течение 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, осуществляют контролирование ответной реакции пациента, после того как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
- 53 029155
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более доз соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 1520, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, в процессе или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ контролирования ответной реакции пациента, страдающего 8ΜΑ, на соединение, включающий: (а) введение соединения пациенту, страдающему 8ΜΑ; (Ь) контактирование образца (например, образца крови или образца ткани), полученного или отобранного у пациента, с прямым 8ΜΝ праймером, описанным далее (например, 8ЕЦ ГО № 11 или 13), и/или обратным 8ΜΝ праймером, описанным в настоящем документе (например, 8ЕЦ ГО № 9 или 12), и/или 8ΜΝ зондом (8ЕЦ ГО № 10) вместе с компонентами, применяемыми, например, для ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) определение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, где (1) (ί) повышение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, и (ίί) снижение количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент реагирует на соединение, и что соединение может быть или является эффективным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (ί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, и (ίί) отсутствие изменений или отсутствие существенных изменений количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в образце, отобранном у пациента, относительно количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, в аналогичном образце (например, образце ткани аналогичного типа), отобранном у пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или несколько раньше, показывает, что пациент не реагирует на соединение, и что соединение не является эффективным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответную реакцию пациента контролируют в течение 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или более после введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, осуществляют контролирование ответной реакции пациента, после того как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более доз соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют после введения 1-5, 510, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления контролирование ответной реакции пациента осуществляют в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет, в процессе или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма, как описано в настоящем документе.
В конкретных вариантах осуществления 8ΜΑ у пациента вызывается инактивирующей мутацией или делецией в гене 8ΜΝ1 на обеих хромосомах, приводя к потере функции гена 8ΜΝ1.
Наборы.
В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрены фармацевтические наборы или наборы для проведения анализов, содержащие 8тп праймер или зонд, описанные в настоящем документе, в одном или нескольких контейнерах, и инструкции по их применению. В одном из вариантов осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов включает в контейнере один или несколько 8ΜΝ обратных праймеров (например, 8ЕЦ ГО № 2, 9 и/или 12) и/или один или несколько 8ΜΝ
- 54 029155
прямых праймеров (8Е0 ΙΌ № 1, 7, 8, 11 и/или 13) и инструкции по их применению. В другом варианте осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов включает в одном контейнере 8ΜΝ обратный праймер (например, 8ЕЦ ГО № 2, 9 или 12), 8ΜΝ прямой праймер (8ЕЦ ГО № 1, 7, 8, 11 или 13) и инструкции по их применению.
В одном из вариантов осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов содержит в отдельных контейнерах один 8ΜΝ обратный праймер (например, 8ЕЦ ГО № 2, 9 или 12) в одном контейнере, другой 8ΜΝ прямой праймер (например, 8ЕЦ ГО № 1, 7, 8, 11 или 13)) в другом контейнере и инструкции по их применению.
В некоторых вариантах осуществления в такие наборы включены подходящие компоненты, необходимые для ПЦР (например, кПЦР), ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, например, полимеразы, дезоксинуклеозидтрифосфаты и т.д. В некоторых вариантах осуществления в такие наборы включены компоненты, необходимые для гибридизации. Фармацевтический набор или набор для проведения анализов, содержащий такие праймеры, может быть использован в ПЦР и ОТ-ПЦР, например, для: (ί) оценки того, способствует ли терапевтический агент (например, соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма) включению экзона 7 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, (ίί) контроля количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и количества мРНК, которое транскрибируется с гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2 и не включает экзон 7 гена 8ΜΝ1 и/или 8ΜΝ2, и/или (ίίί) контролирования ответной реакции субъекта на терапевтический агент (например, соединение формулы (11а1) или формулы (111а1) или его форма). В других вариантах осуществления испытуемым является человек. В других вариантах осуществления испытуемым человеком является больной человек. В некоторых других вариантах осуществления больным человеком является человек, страдающий 8ΜΑ.
В конкретном варианте осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов содержит прямой праймер с последовательностью, представленной в 8Е0 ГО № 1, в контейнере, и обратный праймер с последовательностью, представленной в 8ЕЦ ГО № 2, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используют в ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых человеческим минигеном 8ΜΝ1 или человеческим минигеном 8ΜΝ2, например, описанных в настоящем документе или международной публикации под номером ЩО 2009/151546 или публикации заявки на патент США под номером 2011/0086833, каждая из которых в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления эти праймеры используются в качестве зондов, например, в исследованиях гибридизации, таких как блоттинг по Саузерну или Нозерн-блоттинг.
В конкретном варианте осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов содержит прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в 8ЕО ГО № 7, в контейнере и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в 8ЕО ГО № 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используют в ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2. В других вариантах осуществления эти праймеры используют в качестве зондов, например, в исследованиях гибридизации, таких как блоттинг по Саузерну или Нозерн-блоттинг.
В другом конкретном варианте осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов содержит прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в 8ЕО ГО №
8, в контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в 8ЕО ГО №
9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используют в ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенным человеческим геном 8ΜΝ2. В других вариантах осуществления эти праймеры используют в качестве зондов, например, в исследованиях гибридизации, таких как блоттинг по Саузерну или Нозерн-блоттинг.
В конкретном варианте осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов содержит прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в 8ЕО ГО № 7, в контейнере, прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в 8ЕО ГО № 8, в другом контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в 8ЕО ГО № 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используют в ОТПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2. В других вариантах осуществления эти праймеры используют в качестве зондов, например, в исследованиях гибридизации, таких как блоттинг по Саузерну или Нозерн-блоттинг.
- 55 029155
В конкретном варианте осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов содержит прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в §Е0 ГО № 11, в контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в §Е0 ГО № 12, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используют в ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами §МЫ1 и §МЫ2. В других вариантах осуществления эти праймеры используют в качестве зондов, например, в исследованиях гибридизации, таких как блоттинг по Саузерну или Нозерн-блоттинг.
В конкретном варианте осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов содержит прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в §Е0 ГО № 11, в контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в §Е0 ГО № 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используют в ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами §МЫ1 и §МЫ2. В других вариантах осуществления эти праймеры используют в качестве зондов, например, в исследованиях гибридизации, таких как блоттинг по Саузерну или Нозерн-блоттинг.
В конкретном варианте осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов содержит прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в §Е0 ГО № 13, в контейнере и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в §Е0 ГО № 12, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используют в ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами §МЫ1 и §МЫ2. В других вариантах осуществления эти праймеры используют в качестве зондов, например, в исследованиях гибридизации, таких как блоттинг по Саузерну или Нозерн-блоттинг.
В конкретном варианте осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов содержит прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в §Е0 ГО № 13, в контейнере и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в §Е0 ГО № 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используют в ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами §МЫ1 и §МЫ2. В других вариантах осуществления эти праймеры используют в качестве зондов, например, в исследованиях гибридизации, таких как блоттинг по Саузерну или Нозерн-блоттинг.
В конкретном варианте осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов содержит прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в §Е0 ГО № 1, в контейнере и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в §Е0 ГО № 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используют в ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами §МЫ1 и §МЫ2. В других вариантах осуществления эти праймеры используют в качестве зондов, например, в исследованиях гибридизации, таких как блоттинг по Саузерну или Нозерн-блоттинг.
В конкретном варианте осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов содержит прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в §Е0 ГО № 1, в контейнере и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной в §Е0 ГО № 12, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используют в ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР), ПЦР (например, кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами §МЫ1 и §МЫ2. В других вариантах осуществления эти праймеры используют в качестве зондов, например, в исследованиях гибридизации, таких как блоттинг по Саузерну или Нозерн-блоттинг.
В другом варианте осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов содержит §МЫ зонд, описанный в настоящем документе (например, 8Е0 ГО № 3 или 10), в одном контейнере. В других вариантах осуществления зонд используют в, например, исследовании гибридизации, таком как блоттинг по Саузерну или Нозерн-блоттинг. В конкретном варианте осуществления зонд используют в ОТ-кПЦР или кПЦР. В некоторых вариантах осуществления компоненты, необходимые для ПЦР (например, кПЦР), ОТ-ПЦР (например, ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" и/или ОТ-кПЦР) или амплификации по типу катящегося кольца, такие как полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты, праймеры и т.д., включены в такие наборы. В некоторых вариантах осуществления компоненты, необходи- 56 029155
мые для гибридизации, включены в такие наборы.
В одном из вариантов осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов содержит δΜΝ обратный праймер (например, 8ЕЦ ГО № 2, 9 или 12) в одном контейнере, δΜΝ прямой праймер (например, 8ЕЦ ГО № 1, 7, 8, 11 или 13) в другом контейнере и δΜΝ зонд (например, δΞφ ΙΌ № 3 или 10) в другом контейнере, и инструкции по их применению. В другом варианте осуществления фармацевтический набор или набор для проведения анализов содержит один или несколько δΜΝ обратных праймеров (например, δΞφ ГО № 2, 9 и/или 12) в одном контейнере, один или несколько δΜΝ прямых праймеров (например, δΞφ ГО № 1, 7, 8, 11 и/или 13) в другом контейнере и один или несколько δΜΝ зондов (например, δΞφ ГО № 3 и/или 10) в другом контейнере и инструкции по их применению.
В некоторых вариантах осуществления в такие наборы включены компоненты, необходимые для запуска ПЦР, ОТ-ПЦР или амплификации по типу катящегося кольца, такие как полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты и т.д. Фармацевтический набор или набор для проведения анализов, содержащий такие зонды и/или праймеры, могут быть использованы в ПЦР и ОТ-ПЦР, например, для: (ί) оценки того, способствует ли терапевтический агент (например, соединение формулы (I) или его форма) включению экзона 7 δΜΝ1 и/или δΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, (ίί) контроля количества мРНК, которое транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и включает экзон 7, и количества мРНК, которое транскрибируется с гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2 и не включает экзон 7 гена δΜΝ1 и/или δΜΝ2, и/или (ίίί) контроля ответной реакции субъекта на терапевтический агент (например, соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его форма). В других вариантах осуществления пациентом является человек. В других вариантах осуществления пациентом-человеком является больной человек. В некоторых других вариантах осуществления больным человеком является человек, страдающий δΜΑ.
В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен фармацевтический набор, содержащий соединение формулы (11а1) или формулы (Ша1) или его форма, в контейнере, и инструкции по применению соединения или его формы. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен фармацевтический набор, содержащий фармацевтическую композицию, содержащую соединение формулы (I) или его форму и фармацевтически приемлемый носитель, инертный наполнитель или разбавитель, и инструкции по их применению. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен фармацевтический набор, включающий фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество соединения формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формы и фармацевтически приемлемый носитель, инертный наполнитель или разбавитель, и инструкции по их применению. В одном из вариантов осуществления инструкции по применению разъясняют применение одного, двух или более условий из следующих: дозы, способ введения, частота введения и побочные эффекты введения соединения формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формы пациенту. В других вариантах осуществления пациентом является человек. В других вариантах осуществления пациентомчеловеком является больной человек. В некоторых других вариантах осуществления больным человеком является человек, страдающий δΜΑ.
Общие способы синтеза
Как описано в настоящем документе, общие способы получения соединений формулы (Па1) или формулы (Ша1) или его формы, как описано в настоящем документе, доступны с помощью стандартных, хорошо известных синтетических методов. Многие из исходных материалов являются коммерчески доступными или, когда их нет в наличии, могут быть получены с использованием методов, известных специалистам в данной области. Синтетические схемы, представленные здесь, включают в себя несколько стадий реакций, каждая из которых предназначена для осуществления самостоятельно, и может быть осуществлена совместно или без любой(ых) из предыдущей(их) или последующей(их) стадии(ий). Другими словами, предполагается осуществление каждой отдельной реакционной стадии по схемам синтеза, представленным здесь отдельно.
Схема А.
Соединения формулы (Па1) или формулы (Ша1), описанные в данном документе, где Щ представляет собой моноциклическую гетероциклическую кольцевую систему, К2 представляет собой необязательно замещенную моноциклическую или бициклическую гетероарильную кольцевую систему, и Ка представляет собой водород, получают так, как представлено на схеме А далее.
- 57 029155
Замещенное 6-гидроксипиридиновое соединение А1 (где X представляет собой различные реакционноспособные группы, которые могут быть использованы для получения множества заместителей функциональной группы Κ1 путем взаимодействия соответствующих исходных продуктов с соединением А1 или впоследствии с соединением А3, соединением А4 или соединением А6 с использованием методов, известных среднему специалисту в данной области) подвергают взаимодействию с соединением А2 (где Ь1 представляет собой подходящую нуклеофильную удаляемую группу и Κ1 представляет собой моно- или бициклическую гетероциклическую кольцевую систему, содержащую по меньшей мере одну аминогруппу, например N-Βοс-пиперазин или N-Вοс-4-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)5,6-дигидропиридин) в подходящем растворителе или смеси растворителей (таком как н-ВиОН, ДМСО, ΝΜΡ и тому подобное или их смеси) в присутствии или в отсутствие необязательного палладиевого катализатора (таком как РбС12брр£ и тому подобное) с получением соединения А3.
Соединение А3 подвергают взаимодействию с параформальдегидом в присутствии Μ§Ο2 и тому подобного с получением соединения А4. Соединение А4 может быть конденсировано со сложным эфиром К2-а-замещенной уксусной кислоты и соединения А5 (где Ь2 представляет собой С1-2 алкильную удаляемую группу) в присутствии кислоты или слабого основания (такого как К2 замещенный сложный эфир или пиперидин и тому подобное), подвергая конденсации Кновенагеля с получением соединения А6.
СН3СО2-1_2
А7
„ . основание В2-1_з -►
А8
В2СН2СО2-Ь2
А5
Сложный эфир уксусной кислоты и соединения А7 (такой как трет-бутилацетат и тому подобное) с основанием (таким как ΓΗΜΌ8 и тому подобное) в подходящем растворителе (таком как ТГФ и тому подобное) подвергают взаимодействию с соединением А8 (где Ьз представляет собой удаляемую группу или аналогичную группу для реакции конденсации, такую как реакционноспособный нуклеофил) в присутствии необязательного катализатора с получением соединения А5.
О О
А9
А11
Замещенный 4-хлор-3-оксобутаноат соединения А9 (где Ь2 представляет собой удаляемую С1-2алкильную группу) подвергают взаимодействию с соединением А10 с необязательно замещенной моноциклической гетероциклильной или гетероарильной кольцевой системой (где термин "Не!" относится к группе, подобной амидину, такой как, но этим не ограничиваясь, 2-аминопиридин, 2-аминопиримидин, 4-аминопиримидин, 2-аминопиразин, 3-аминопиридазин, 2-аминотиазол, 4-аминотиазол и тому подобное) с получением соединения А11, которое затем вместо соединения А5 подвергают взаимодействию с соединением А4.
Схема В.
Соединения формулы (I), описанные в настоящем документе, где К2 представляет собой необязательно замещенную моноциклическую или бициклическую гетероциклическую, арильную или гетероарильную кольцевую систему, и Ка представляет собой водород, получают так, как представлено на схеме В далее.
- 58 029155
Соединение никотиновой кислоты В1 (где X представляет собой различные реакционноспособные группы, которые могут быть использованы с получением множества заместителей функциональной группы К! путем взаимодействия соответствующих исходных продуктов с соединением В1 или впоследствии с соединением В2, соединением В3 или соединением В4 с использованием методов, известных среднему специалисту в данной области) подвергают взаимодействию с реагентом (таким как метоксид натрия в варианте воплощения, когда X представляет собой хлор) в подходящем растворителе (таком как метанол и тому подобное) с получением соединения В2 в виде смеси 2-Х-6-метокси и 2-метокси-6-Х региоизомеров. Соединение В2 затем восстанавливают до соответствующего альдегида с помощью восстанавливающего реагента (такого как диборан и тому подобное) с последующим окислением с помощью подходящего окислителя (такого как ЫиО2 или перйодинан Десса-Мартина и тому подобное) с получением соединения В3 в виде смеси региоизомеров. Соединение В3 подвергают деметилированию с помощью ВВг3 с получением соединения В4 в виде смеси региоизомеров. Региоизомер 2-гидрокси-6-Х соединения В4 выделяют и подвергают дальнейшему взаимодействию вместо соединения А4 в соответствии со способом по схеме А.
Схема С.
Соединения формулы (I), описанные в настоящем документе, где К! представляет собой моноциклическую или бициклическую гетероциклическую кольцевую систему, К2 представляет собой необязательно замещенную бициклическую гетероарильную кольцевую систему и Ка представляет собой водород, получают так, как представлено на схеме С далее.
Соединение А4 подвергают конденсации с ацетоацетатом в присутствии кислоты или слабого основания (таких как уксусная кислота или пиперидин и тому подобное) в подходящем растворителе (таком как ацетонитрил, этанол и тому подобное или их смеси), подвергая конденсации Кновенагеля с получением соединения С1. Соединение С1 затем подвергают бромированию с помощью подходящего бромирующего реагента (такого как Вг2 или NВЗ и тому подобное) с получением соединения С2, которое подвергают взаимодействию с соединением А10 с получением соединения С3.
Схема Ώ.
Соединения формулы (I), описанные в настоящем документе, где К! представляет собой моноциклическую или бициклическую гетероциклическую кольцевую систему, К2 представляет собой необязательно замещенную моноциклическую или бициклическую гетероциклическую, арильную или гетероарильную кольцевую систему и Ка и КЪ представляют собой водород, получают так, как представлено на схеме Ώ далее.
- 59 029155
Замещенное 4-гидроксипиридиновое соединение 1)1 (где X представляет собой различные реакционноспособные группы, которые могут быть использованы для получения множества заместителей функциональной группы К! путем взаимодействия соответствующих исходных продуктов с соединением 1)1 или, впоследствии, с соединением Ώ2, соединением 1)3 или соединением 1)4 с использованием методов, известных среднему специалисту в данной области) подвергают взаимодействию с соединением А2 в подходящем растворителе в присутствии необязательного палладиевого катализатора с получением соединения Ώ2. Соединение 1)2 подвергают взаимодействию с параформальдегидом с использованием схемы А с получением соединения 1)3. Соединение 1)3 подвергают взаимодействию с соединением А5 с использованием способа по схеме А, подвергая конденсации Кновенагеля, с получением соединения 1)4.
Конкретные примеры синтеза
Для более подробного описания и лучшего понимания предложены следующие неограничивающие примеры в целях более полной иллюстрации объема соединений, описанных в данном документе, но они не должны быть истолкованы как специально ограничивающие его объем. Такие варианты соединений, описанные в данном документе, которые могут быть известными в настоящее время или могут быть разработаны позднее, находятся в компетенции специалиста в данной области, рассматриваются как подпадающие под объем соединений, описанных в настоящем документе и в последующей формуле изобретения. Эти примеры иллюстрируют получение некоторых соединений. Специалистам в данной области техники будет понятно, что способы, описанные в этих примерах, являются методами, описанными специалистами в данной области, назначение которых хорошо известно в синтетической практике, и как таковые они представляют собой предпочтительные способы при осуществлении синтезов. Тем не менее, следует понимать, что специалистам в данной области техники в свете настоящего описания должно быть понятно, что могут быть проделаны многие изменения при осуществлении конкретных описанных способов, а также может быть получен подобный или аналогичный результат без отхода от духа и объема настоящего описания.
Кроме следующих примеров получения соединений, если не указано обратное, все цифровые значения, выражающие количества ингредиентов, условия реакции, экспериментальные данные и т.д., используемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные термином "приблизительно". Соответственно, все такие цифровые значения представляют собой приближения, которые могут изменяться в зависимости от требуемых свойств, которые должны быть достигнуты в результате реакции или в результате перемены экспериментальных условий. Таким образом, в пределах ожидаемого диапазона экспериментальной воспроизводимости, термин "приблизительно", в контексте полученных данных, относится к диапазону данных, которые могут изменяться в соответствии со стандартным отклонением от среднего значения. А также для полученных экспериментальных результатов полученные данные могут быть округлены в большую или меньшую сторону, чтобы представить данные последовательно, без потери значащих цифр. По крайней мере, но не в качестве попытки ограничения объема формулы изобретения применением доктрины эквивалентов, каждый числовой параметр следует истолковывать в свете числа значащих цифр и методик округления, используемых специалистами в данной области.
В то время как область числовых значений и параметры, представляющие широкий объем настоящего описания, являются приближенными, числовые значения, представленные в примерах, описанных далее, приводятся настолько точно, насколько это возможно. Тем не менее, любое числовое значение по своей природе содержит определенные ошибки, неизбежно вытекающие из стандартного отклонения, обнаруживаемого при соответствующих экспериментальных измерениях.
Примеры соединений.
В приведенном выше и в настоящем описании следующие сокращения, если не указано иное, следует понимать, как имеющие следующие значения:
- 60 029155
Аббревиатура
Δ
АсОН или НОАс
АсгО
Аг
ΑΟΝ
ΒΙΝΑΡ
В(О1Рг)з
Вос
ВосгО
ВиОН
°С
ΟϋΙ
(ОНО)η или (НСНО)п
д/ч/час/часы/мин/с
ОачеРНоз
ΏΟΕ
ΏΟΜ
ϋΙΑϋ
ΏΙΕΑ или ϋΙΡΕΑ
ϋΜΑ
Значение
нагревание (химия) или удаление
(биология)
уксусная кислота
уксусный ангидрид
аргон
ацтонитрил
2,2'-бис(дифенилфосфино)-1,1'-бинафталин
триизопропил борат
трет-бутокси-карбонил
ди-трет-бутил дикарбонат
н-бутанол
градусы Цельсия
1.1- карбонилдиимидазол или Ν,Ν'карбонилдиимидазол параформальдегид
день(д)/час (ч, час или
часы/минута(мин)/секунда(сек) 2-дициклогексилфосфино-2'-(Ν,Νдиметиламино)бифенил
1.2- дихлорэтан
дихлорметан (СНгСЪ)
диизопропил азидокарбоксилат
Ν, АУ-диизопропилэтиламин
диметилацетамид
ΏΜΑΡ
ΏΜΕ
ДМФ
ДМСО
ΕϋΟ или ΕϋΟΙ
ЕбОАс
ЕбОН
Еб2О
НСНО
1Рг1
ЦоНпРНоз
КОАс
ЬАН
ЬС/МЗ, ЬСМЗ или ЬСМЗ
1ГОА
ЫНМОЗ или ЬНМОЗ
МеОН
Ме1
Ме-ТГФ
Μθ2Ζη
МпОг
М3
ЫаН
ЫаНЗ
ЫаНМОЗ
Ыа1
ЫаОАс
ЫаОМе
ΝΒ3
ΝΜΡ
ЯМР
о/п
4-(диметиламино)пиридин
1,2-диметоксиэтан
диметилформамид
диметилсульфоксид
Ν-(3-диметиламинопропил)-Ν'этилкарбодиимид гидрохлорид
этилацетат
этанол
диэтиловый эфир
формальдегид
2-йодпропан
(2-бифенил)-ди-трет-бутилфосфин
ацетат калия
литийалюминийгидрид
жидкостная хроматография
спектроскопия
диизопропиламид лития
бис(триметилсилил)амид лития
метанол
йодметан
2-метилтетрагидрофуран
диме тилцинк
диоксид марганца
масс-спектроскопия
гидрид натрия
гидросульфид натрия
бис(триметилсилил)амид натрия
гексаметилдисилазид натрия йодид натрия
ацетат натрия
метоксид натрия
Ν-бромсукцинимид
АУ-метилпирролидон
ядерный магнитный резонанс
в течение ночи
массили
- 61 029155
Ρά
Ρά/С Р0(аЬа)2 Ρά2 (ТЬа) з РТгТЬаз рас12(рисы)2 Рс1С12 (άρρ£) , Ρά<312άρρ£
Ρά (άρρ£) С12 Ρά(ΟΑο)2 РсЦРРЬз) 4 Ρά (ррЬз) 4 Ρά(ΡΡΗ3)2Ο12, рас12 (ррЬз) 2 рас12(РЬзР)2
ТГФ
ТСХ
ТМ5
ТМ5С1
ТМ5ОК
С-Ви
ТзОН, р-ТзОН рТЗА
хапбрЬоз
палладий
палладий на углероде
бис(дибензилиденацетон)палладий
или
трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) транс-бис(бензонитрил)дихлорпалладий(II) [1,1’или бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпаллад ий(II)
палладия(II) ацетат
или
тетракис(трифенилфосфин)палладий(0)
или
бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид
РНВизВБф или
№и3РНВЕ4
РЫ
РЫ (ОТРА) 2
РЬМе
РОС1з
РРЬз
РРА
РРТз
Р31
РуВОР
ком. темп.
5-РЬоз, ЗРЬоз или
ЗрЬоз
Т3Р
ТЕА, Ε£3Ν или ΝΕ£3 Т£2О
ТЕА
три-трет-бутилфосфония тетрафторборат йодбензол
[бис(трифторацетокси)йод]бензол толуол
фосфорилхлорид
трифенилфосфин
полифосфорная кислота
пиридиния л-толуолсульфонат
давление фунт на квадратный дюйм (бензотриазол-1илокси)трипирролидинофосфония гексафторфосфат комнатная температура 2-дициклогексилфосфино-2',6'диметоксибифенил
ангидрид пропилфосфоновой кислоты триэтиламин
трифторметансульфоновый ангидрид трифторуксусная кислота
тетрагидрофуран тонкослойная хроматография триметилсилан
триметилхлорсилан или триметилсилил
хлорид
триметилсиланолат калия трет-бутил
или п-толуолсульфоновая кислота или птолуолсульфоновая кислота 4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9диметилксантен
Пример 1. Получение соединения 5.
Часть 1. Получение трет-бутил 4-(5-формил-6-гидроксипиридин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилата
Стадия А. К 2-хлор-6-гидроксипиридину (12,3 г, 94 ммоль) в н-ВиОН (50 мл) добавляли трет-бутил пиперазин-1-карбоксилат (46,0 г, 235 ммоль). Смесь нагревали при температуре 140°С в течение 3 дней. Реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (1,5 л) и промывали насыщенным раствором ΝΗ4Ο и затем насыщенным солевым раствором. Органический слой отделяли, сушили над Μд8О4 и концентрировали при пониженном давлении. Полученный твердый продукт разбавляли СΗ3СN (100 мл) и высаживали осадок путем добавления воды (1 л). Осадок отфильтровывали, промывали водой и эфиром. Органический слой фильтрата отделяли и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (50-100% ЕЮАс/гексан). Получали всего 18,7 г (71%) трет-бутил 4-(6-гидроксипиридин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилата в виде твердого вещества белого цвета. Μ8 т/ζ
280,2 [М+Н]+; 1Н ЯМР (500 МГц, СЦС13) δ (м.д.) 7,40 (1Н, м), 6,04 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 5,64 (1Н, д, 1=7,2 Гц),
- 62 029155
3,62 (4Н, м), 3,36 (4Н, м), 1,51 (9Н, с).
Стадия В. К смеси трет-бутил 4-(6-гидроксипиридин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилата (8,4 г, 30 ммоль) и Ы§С12 (5,8 г, 60 ммоль) в СΗ3СN (100 мл) добавляли триэтиламин (25,2 мл, 150 ммоль). После перемешивания смеси в течение 10 мин при комнатной температуре в смесь добавляли параформальдегид (9,0 г, 300 ммоль). Смесь перемешивали в течение 18 ч при температуре 60°С и затем охлаждали до комнатной температуры. Затем смесь разбавляли ЕΐΟΑс (500 мл) и промывали 1М раствором соли Рошеля (200 мл) и насыщенным раствором МН4С1 (200 мл). Органический слой концентрировали при пониженном давлении и очищали с помощью колоночной хроматографии (30-50% ЕΐΟΑс/гексан) с получением 3,6 г (39%) трет-бутил 4-(5-формил-6-гидроксипиридин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилата в виде твердого вещества белого цвета. Μ8 т/ζ 308,2 [М+Н]+; 2Н ЯМР (500 МГц, СЭС13) δ (м.д.) 12,35 (1Н, шир.), 9,55 (1Н, с), 7,66 (1Н, д, 1=8,51 Гц), 6,26 (1Н, д, 1=8,83 Гц), 3,79 (4Н, м), 3,56 (4Н, м), 1,51 (9Н, с).
Часть 2. Получение трет-бутил 2-(4-хлорбензо[6]тиазол-2-ил)ацетата
В 1-литровую 3-горлую круглодонную колбу, снабженную трубкой для введения азота, 500-мл капельной воронкой и резиновой пробкой, помещали трет-бутил ацетат (26,8 мл, 200 ммоль) и безводный ТГФ (50 мл). При охлаждении на бане сухой лед-ацетон к смеси добавляли бис(триметилсилил)амид лития (1М раствор в ТГФ) (200 мл, 200 ммоль) с помощью шприца в течение 15 мин. После перемешивания при этой температуре в течение 30 мин к смеси добавляли раствор 2,4-дихлорбензотиазола (8,15 г, 40 ммоль) в ТГФ (100 мл) с помощью капельной воронки в течение 15 мин. Охлаждающую баню удаляли, давая реакции нагреться до комнатной температуры в течение 1 ч. Реакционную смесь концентрировали, затем разбавляли ЕΐΟΑс и насыщенным раствором №11ССГ. Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали два раза ЕΐΟΑс. Объединенный органический слой сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали, концентрировали и очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя градиентной смесью ЕΐΟΑс/гексан с получением 11,28 г (99%) указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества желтого цвета. Ή-ЯМР (500 МГц, ДМСО-66) δ (м.д.) 8,00 (1Н, дд, 1=1,0, 8,0 Гц), 7,53 (1Н, дд, 1=1,0, 8,0 Гц), 7,36 (1Н, т, 1=8,0 Гц), 4,19 (2Н, с), 1,38 (9Н, с).
Часть 3. 3-(4-Хлорбензо[6]тиазол-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
Стадия А. К смеси трет-бутил 4-(5-формил-6-гидроксипиридин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилата (614 мг, 2,0 ммоль) и трет-бутил 2-(4-хлорбензо[6]тиазол-2-ил)ацетата (624 мг, 2,2 ммоль) в ЕЮН (15 мл) добавляли пиперидин (0,6 мл, 6,0 ммоль) и уксусную кислоту (0,25 мл, 3,0 ммоль). Реакционную смесь нагревали при температуре 90°С в течение 6 ч и охлаждали до комнатной температуры. К смеси добавляли воду (30 мл) с получением осадка. Осадок отфильтровывали и промывали водой и затем эфиром. После высушивания в токе азота получали 850 мг (85%) трет-бутил 4-(3-(4-хлорбензо[6]тиазол-2-ил)-2оксо-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-7-ил)пиперазин-1-карбоксилата в виде твердого вещества желтого цвета. МС т/ζ 499,3 [М+Н]+; Ή ЯМР (500 МГц, СОС13) δ (м.д.) 9,04 (1Н, с), 7,87 (1Н, д, 1=6, 9 Гц), 7,85 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 7,54 (1Н, м), 7,33 (1Н, т, 1=7,9 Гц), 6,69 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 3,83 (4Н, м), 3,62 (4Н, м), 1,52 (9Н, с).
Стадия В. К суспензии трет-бутил 4-(3-(4-хлорбензо[6]тиазол-2-ил)-2-оксо-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-7-ил)пиперазин-1-карбоксилата (850 мг, 1,7 ммоль) в СН2С12 (15 мл) добавляли 4н. НС1 в диоксане (5 мл). Смесь перемешивали в течение 16 ч и фильтровали. Твердый продут промывали эфиром и сушили в атмосфере азота. Получали с количественным выходом гидрохлорид 3-(4-хлорбензо[6]тиазол2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-она и его использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. МС т/ζ 399,1 [М+Н]+; Ή ЯМР (500 МГц, ДМСО-66) δ (м.д.) 9,12 (1Н, с), 9,11 (2Н, шир. ), 8,36 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 8,16 (1Н, д, 1=6,9 Гц), 7,66 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 7,45 (1Н, т, 1=7,9 Гц), 7,14
- 63 029155
(1Н, д, 1=8,8 Гц), 4,03 (4Н, м), 3,26 (4Н, м).
Стадия С. К суспензии гидрохлорида 3-(4-хлорбензо[б]тиазол-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-она (890 мг, 2,0 ммоль) в ДМФ (10 мл) добавляли 37%-ную водную НСНО (0,4 мл, 3,4 ммоль) и затем NаΒН(ΟΑс)з (636 мг, 3,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. К смеси добавляли воду (10 мл) и насыщенный раствор NаНСΟз (10 мл) с получением осадка. Осадок отфильтровывали, промывали водой и сушили в атмосфере азота, получая 680 мг (97%) указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества желтого цвета. Точка плавления 258-260°С; МС т/ζ 413,2 [М+Н]+; 1Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-ф,) δ (м.д.) 9,06 (1Н, с), 8,25 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 8,14 (1Н, д, 1=6, 9 Гц), 7,64 (1Н, м), 7,44 (1Н, д, 1=7,7 Гц), 7,08 (1Н, д, 1=9, 1 Гц), 3,79 (4Н, м), 2,44 (4Н, м), 2,25 (3Н, с).
Стадия А. В 75-мл сосуд для работы под давлением помещали этил 4-хлор-3-оксо-бутират (6,58 г, 40 ммоль), 2-амино-4-метил пиридин (4,33 г, 40 ммоль) и ЕЮН крепости 200 (40 мл). После перемешивания при температуре 100°С на масляной бане в течение ночи реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, затем разбавляли СН2С12 и насыщенным раствором NаНСΟз. Органический слой отделяли и водный слой дважды экстрагировали СН2С12. Объединенный органический слой сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали, концентрировали и очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле. Элюирование градиентной смесью дихлорметан-метанол давало 3,23 г (37%) указанного в заголовке продукта в виде масла коричневого цвета. МС т/ζ 219,2 [М+Н]+; 1Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-ф,) δ (м.д.) 8,38 (1Н, д, 1=6,95 Гц), 7,73 (1Н, с), 7,24 (1Н, д, 1=1,60 Гц), 6,71 (1Н, дд, 1=1,60, 6,95 Гц), 4,10 (2Н, кв, 1=7,00 Гц), 3,74 (2Н, с), 2,34 (3Н, с), 1,20 (3Н, т, 1=7,00 Гц).
Стадия В. К смеси трет-бутил 4-(5-формил-6-гидроксипиридин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилата (120 мг, 0,4 ммоль) и этил 2-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)ацетата (96 мг, 0,4 4 ммоль) в ЕЮН (0,2 мл) добавляли пиперидин (0,3 мл) и уксусную кислоту (0,1 мл). Реакционную смесь нагревали при температуре 120°С в течение 15 ч и охлаждали до комнатной температуры. К смеси добавляли воду (6 мл) с получением осадка. Осадок отфильтровывали и промывали водой и затем эфиром. После высушивания в атмосфере азота получали 112 мг (60%) трет-бутил 4-(3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2-оксо-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-7-ил)пиперазин-1-карбоксилата в виде твердого вещества желтого цвета. МС т/ζ 462,4 [М+Н]+.
Стадия С. К суспензии трет-бутил 4-(3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2-оксо-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-7-ил)пиперазин-1-карбоксилата (112 мг, 0,24 ммоль) в СН2С12 (3 мл) добавляли 4н. НС1 в диоксане (1,5 мл). Смесь перемешивали в течение 16 ч и фильтровали. Твердый продут промывали эфиром и сушили в атмосфере азота. Гидрохлорид 3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-она получали с количественным выходом и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. МС т/ζ 362,3 [М+Н] .
Стадия Ώ. К суспензии гидрохлорида 3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-она (42 мг, 0,11 ммоль) в ДМФ (1,5 мл) добавляли 37%-ный водный формальдегид (0,02 мл, 0,22 ммоль) и затем NаΒН(ΟΑс)з (52 мг, 0,22 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Смесь разбавляли СН2С12 (30 мл) и промывали насыщенным раствором NаНСΟз. Органический слой концентрировали при пониженном давлении и очищали с помощью колоночной хроматографии (5%-10% МеОН/СН2С12) с получением 25 мг (60%) указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества желтого цвета. Точка плавления 264-268°С; МС т/ζ
376,3 [М+Н]+; 1Н ЯМР (500 МГц, СОС13) δ (м.д.) 8,55 (1Н, с), 8,32 (1Н, с), 7,92 (1Н, д, 1=6,94 Гц), 7,64 (1Н, д, 1=8,83 Гц), 7,26 (1Н, с), 6,56 (2Н, м), 3,74 (4Н, м), 2,52 (4Н, м), 2,33 (6Н, с).
Как показано в табл. 1 далее, дополнительные соединения, описанные в настоящем документе, могут быть получены в соответствии с примером 2 путем замены соответствующих исходных продуктов, реагентов и условий реакций.
- 64 029155
Пример 3. Получение соединения 11
Стадия А. К раствору 2-хлор-4-гидроксипиридина (12,9 г, 100 ммоль) в н-ВиОН (50 мл) добавляли трет-бутил пиперазин-1-карбоксилат (46,5 г, 250 ммоль). Смесь нагревали при температуре 140°С в течение 3 дней и затем разбавляли ΕΐΟΑο (2 л) при комнатной температуре. Органическую фазу промывали насыщенным раствором ΝΗ4Ο и затем насыщенным солевым раствором. Органический слой отделяли, сушили над Μ§8Ο4 и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (5%-20% МеОН/СН2С12) с получением 12,2 г (44%) трет-бутил 4-(4гидроксипиридин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилата в виде твердого вещества белого цвета. МС т/ζ 280,2 [М+Н]+; 2Н ЯМР (500 МГц, СОС13) δ (м.д.) 7,72 (1Н, д, 1=6,62 Гц), 6,20 (1Н, дд, 1=6,31, 2,21 Гц), 6,02 (1Н, д, 1=1,89 Гц), 3,56 (4Н, м), 3,42 (4Н, м), 1,50 (9Н, с).
Стадия В. К смеси трет-бутил 4-(4-гидроксипиридин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилата (5,03 г, 18,0 ммоль) и Ы§С12 (3,42 г, 36 ммоль) в СΗ3СN (100 мл) добавляли триэтиламин (15,1 мл, 90 ммоль). После перемешивания смеси в течение 10 мин при комнатной температуре к смеси добавляли параформальдегид (5,4 г, 180 ммоль). Смесь перемешивали в течение 18 ч при температуре 60°С и затем охлаждали до комнатной температуры. Затем смесь разбавляли ΕΐΟΑο (400 мл) и промывали 1М раствором соли Рошеля (200 мл) и насыщенным раствором ΝΗ4Ο (200 мл). Органический слой концентрировали при пониженном давлении и очищали с помощью колоночной хроматографии (30%-80% ΕЮΑс/гексан) с получением 1,5 г (27%) трет-бутил 4-(5-формил-4-гидроксипиридин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилата в виде твердого вещества белого цвета. МС т/ζ 308,2 [М+Н]+; 2Н ЯМР (500 МГц, СОС13) δ (м.д.) 11,37 (1Н, с), 9,64 (1Н, с), 8,27 (1Н, с), 5,98 (1Н, с), 3,71 (4Н, м), 3,56 (4Н, м), 1,48 (9Н, с).
Стадия С. К смеси трет-бутил 4-(5-формил-4-гидроксипиридин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилата (61 мг, 0,2 ммоль) и трет-бутил 2-(4-хлорбензо[0]тиазол-2-ил)ацетата (62 мг, 0,22 ммоль) в ЕЮН (2 мл) добавляли пиперидин (0,06 мл, 0,6 ммоль) и уксусную кислоту (0,025 мл, 0,3 ммоль). Реакционную смесь нагревали при температуре 60°С в течение 6 ч и охлаждали до комнатной температуры. К смеси добавляли воду (6 мл) с получением осадка. Осадок отфильтровывали и промывали водой и затем эфиром. После высушивания в атмосфере азота получали 96 мг (96%) трет-бутил 4-(3-(4-хлорбензо[0]тиазол-2ил)-2-оксо-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-7-ил)пиперазин-1-карбоксилата в виде твердого вещества желтого цвета. МС т/ζ 499,3 [М+Н]+; 2Н ЯМР (500 МГц, СОС13) δ (м.д.) 9,08 (1Н, с), 8,62 (1Н, с), 7,86 (1Н, д, 1=9,14 Гц), 7,55 (1Н, м), 7,34 (1Н, т, 1=7,88 Гц), 6,48 (1Н, с), 3,80 (4Н, м), 3,62 (4Н, м), 1,51 (9Н, с).
Стадия Ώ. К суспензии трет-бутил 4-(3-(4-хлорбензо[0]тиазол-2-ил)-2-оксо-2Н-пирано[3,2с]пиридин-7-ил)пиперазин-1-карбоксилата (96 мг, 0,19 ммоль) в СН2С12 (2 мл) добавляли 4н. НС1 в диоксане (1 мл). Смесь перемешивали в течение 6 ч и фильтровали. Твердый продут промывали эфиром и сушили в атмосфере азота с получением 61 мг (82%) гидрохлорида 3-(4-хлорбензо[0]тиазол-2-ил)-7(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-2-она, который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. МС т/ζ 399,1 [М+Н]+; 2Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-06) δ (м.д.) 9,34 (2Н, шир.), 9,13 (1Н, с), 8,96 (1Н, с), 8,16 (1Н, д, 1=6,94 Гц), 7,66 (1Н, д, 1=6,62 Гц), 7,46 (1Н, т, 1=7,88 Гц), 7,00 (1Н, с), 4,01 (4Н, м), 3,22 (4Н, м).
Стадия Е. К суспензии 40 мг (0,1 ммоль) гидрохлорида 3-(4-хлорбензо[0]тиазол-2-ил)-7-(пиперазин1-ил)-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-2-она в дихлорэтане (1 мл) добавляли 37%-ный водный формальдегид (0,01 мл, 0,2 ммоль) и затем №ВН(ОЛс)3 (40 мг, 0,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Растворитель упаривали и к смеси добавляли воду (2 мл). Осадок
- 65 029155
отфильтровывали, промывали водой и сушили в атмосфере азота с получением 34 мг (82%) указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества желтого цвета. Точка плавления 285-288°С; МС т/ζ 413,2 [М+Н]+; 1Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-к) δ (м.д.) 9,08 (1Н, с), 8,89 (1Н, с), 8,14 (1Н, м), 7,66 (1Н, м), 7,44 (1Н, т, 1=7,72 Гц), 6,89 (1Н, с), 3,77 (4Н, м), 2,42 (4Н, м), 2,24 (3Н, с).
Пример 4. Получение соединения 57
Стадия А. К смеси трет-бутил 4-(5-формил-4-гидроксипиридин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилата (124 мг, 0,40 ммоль) и этил 2-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)ацетата (96 мг, 0,44 ммоль) в ЕЮН (0,2 мл) добавляли пиперидин (0,3 мл) и уксусную кислоту (0,1 мл). Реакционную смесь нагревали при температуре 120°С в течение 15 ч и охлаждали до комнатной температуры. К смеси добавляли воду (2 мл) с получением осадка. Осадок отфильтровывали и промывали водой и затем эфиром. После высушивания в атмосфере азота получали 115 мг (63%) трет-бутил 4-(3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2оксо-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-7-ил)пиперазин-1-карбоксилата в виде твердого вещества желтого цвета. МС т/ζ 462,3 [М+Н]+.
Стадия В. К суспензии трет-бутил 4-(3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2-оксо-2Н-пирано[3,2с]пиридин-7-ил)пиперазин-1-карбоксилата (115 мг, 0,25 ммоль) в СН2С12 (2 мл) добавляли 4н. НС1 в диоксане (1 мл). Смесь перемешивали в течение 2 ч и затем фильтровали. Твердый продут промывали эфиром и сушили в атмосфере азота с получением гидрохлорида 3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-2-она с количественным выходом, который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. МС т/ζ 362,2 [М+Н]+.
Стадия С. К суспензии гидрохлорида 3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)2Н-пирано[3,2-с]пиридин-2-она (50 мг, 0,12 ммоль) в ДМФ (10 мл) добавляли 37%-ный водный формальдегид (0,025 мл, 0,25 ммоль) и затем NаΒН(ОΑс)з (55 мг, 0,25 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. К смеси добавляли воду (2 мл) и насыщенный раствор ΝπΙ 1С(О (2 мл) с получением осадка. Осадок отфильтровывали, промывали водой и сушили в атмосфере азота с получением 30 мг (67%) указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества желтого цвета. МС т/ζ 376,3 [М+Н]+; 1Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-06) δ (м.д.) 8,63 (1Н, с), 8,59 (1Н, с), 8,41 (1Н, д, 1=6,96 Гц), 8,32 (1Н, с), 7,22 (1Н, с), 6,71 (1Н, с), 6,66 (1Н, дд, 1=6,94, 1,58 Гц), 3,60 (4Н, м), 2,49 (3Н, с), 2,28 (3Н, с), 2,22 (4Н, м).
Как показано в табл. 1 далее, дополнительные соединения, описанные в настоящем документе, могут быть получены в соответствии с примером 4 путем замены соответствующих исходных продуктов, реагентов и условий реакций.
Пример 5. Получение соединения 91.
Часть 1. Получение 6-хлор-2-гидроксиникотинальдегида
Стадия А. При комнатной температуре в метаноле (300 мл) растворяли 2,6-дихлорникотиновую кислоту (30 г, 156,3 ммоль). При той же температуре медленно добавляли этоксид натрия (5,4М в МеОН,
781,3 ммоль, 145 мл). Реакционную смесь перемешивали при температуре 70°С в течение 5 ч и охлаждали до комнатной температуры. Выпавший из реакционной смеси твердый продукт отфильтровали и маточный раствор концентрировали в вакууме. Все собранные твердые вещества растворяли в воде (300
- 66 029155
мл) и раствор подкисляли 6н. раствором НС1 до рН 6 при температуре 0°С. Водный слой экстрагировали этилацетатом пять раз. Объединенные органические слои сушили над Μ§δΟ4. Органический слой отфильтровали и концентрировали с получением смеси 1:1 6-хлор-2-метоксиникотиновой кислоты и 2хлор-6-метоксиникотиновой кислоты (20,22 г, 69%). МС т/ζ 188 [М+Н]+.
Стадия В. Смесь, полученную выше (11,48 г, 61,2 ммоль), растворяли в ТГФ (50 мл) и охлаждали до температуры 0°С. При температуре 0°С медленно добавляли комплекс боран-ТГФ (1,0М в ТГФ, 200 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч и вновь охлаждали до температуры 0°С. При температуре 0°С очень медленно добавляли водную 6н. НС1 (15 мл). Водный слой нейтрализовали с помощью насыщенного раствора ЫаНСО3 до рН 7. Добавляли дихлорметан и водный слой экстрагировали. Объединенные органические слои сушили над К2СО3, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением 10,6 г соответствующих спиртов. Остаток может быть использован напрямую на стадии окисления или очищен на силикагеле смесью этилацетата и гексана. ТСХ 0,31 (30%ный ΕΐΟΑс в гексане). МС т/ζ 174 [М+Н]+.
Выделенные спирты (3,9 г, 22,7 ммоль) растворяли в дихлорметане (110 мл) и охлаждали до температуры 0°С. Порциями добавляли перйодинан Десс-Мартина (11,6 г, 27,3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при температуре 0°С в течение 30 мин. Реакцию гасили насыщенным раствором ЫаНСО3 и экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои сушили над К2СО3, фильтровали и концентрировали с получением смеси 3,53 г 6-хлор-2-метоксиникотинальдегида и 2-хлор-6метоксиникотинальдегида (91%).
Стадия С. Смесь 6-хлор-2-метоксиникотинальдегида и 2-хлор-6-метоксиникотинальдегида (3,3 г,
19,3 ммоль) растворяли в дихлорметане (100 мл) и охлаждали до температуры -15°С. При этой температуре медленно добавляли ВВг3 (1,0М в СН2С12, 38,6 ммоль). Раствор перемешивали при температуре 0°С в течение 30 мин и нейтрализовали с помощью насыщенного раствора ЫаНСО3 до рН 7. Водный слой дважды промывали дихлорметаном для удаления 2-хлор-6-метоксиальдегида. Водный слой обрабатывали насыщенным солевым раствором и оставляли на 3 ч. Выпавший твердый продукт фильтровали и сушили в вакууме с получением 1,07 г 6-хлор-2-метоксиальдегида (71%) в виде порошка белого цвета. ТСХ Кг 0,06 (70% СН3СЫ в ΕΐΟΑс). МС т/ζ 158 [М+Н]+.
Часть 2. Получение этил 2-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)ацетата
В 75-мл сосуд для работы под давлением помещали этил 4-хлор-3-оксобутират (4 г, 24,4 ммоль), 3,5-диметилпиразин-2-амин (3 г, 24,4 ммоль) и этанол крепости 200 (24 мл). После перемешивания при температуре 100°С на масляной бане в течение 16 ч реакционную смесь концентрировали, разбавляли дихлорметаном и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органический слой отделяли и водный слой дважды экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали, концентрировали и очищали на силикагеле. Элюирование градиентной смесью дихлорметана и метанола давало этил 2-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)ацетат в виде твердого вещества светло-коричневого цвета (5 г). МС т/ζ 234 [М+Н]+.
Часть 3. Получение соединения 91
- 67 029155
Стадия А. 6-Хлор-2-гидроксиникотинальдегид (1 г, 6,37 ммоль) при комнатной температуре растворяли в ДМСО (12 мл). Раствор обрабатывали трет-бутил 1,4-диазепан-1-карбоксилатом (2,55 г, 12,74 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при температуре 100°С в течение 2 ч и охлаждали до комнатной температуры. Добавляли насыщенный водный раствор №11С(О (50 мл). Водный слой три раза экстрагировали СН2С12. Объединенные органические слои сушили над К2СО3, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением 2,1 г трет-бутил 4-(5-формил-6гидроксипиридин-2-ил)-1,4-диазепан-1-карбоксилата. Концентрированный остаток использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. МС т/ζ 322 [М+Н]+.
Стадия В. Раствор трет-бутил 4-(5-формил-6-гидроксипиридин-2-ил)-1,4-диазепан-1-карбоксилата (225 мг, 0,7 ммоль) в 3 мл ЕЮН при комнатной температуре обрабатывали пиперидином (119,2 мг, 1,4 ммоль), уксусной кислотой (252 мг, 4,2 ммоль) и этил 2-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2ил)ацетатом (196 мг, 0,84 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в микроволновом реакторе при температуре 150°С в течение 2 ч. Смесь концентрировали, гасили насыщенным раствором №11С(О и три раза экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои объединяли и концентрировали. Остаток очищали на силикагеле с получением после упаривания трет-бутил 4-(3-(6,8диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-2-оксо-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-7-ил)-1,4-диазепан-1-карбоксилата. МС т/ζ 491 [М+Н]+.
Стадия С. Полученное выше твердое вещество белого цвета растворяли в 2 мл дихлорметана и обрабатывали 4М НС1 в диоксане (2 мл) при комнатной температуре. После перемешивания раствора при комнатной температуре в течение 16 ч весь растворитель упаривали. Остаток растирали в смеси эфир/дихлорметан/гексан с получением НС1 соли 7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2а]пиразин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-она (164 мг, 55%). Аналитический образец свободного основания получали путем растворения НС1 соли в дихлорметане, обработкой смеси насыщенным раствором №НС(О с последующими экстракцией и упариванием. МС т/ζ 391 [М+Н]+; 1Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-Й6) δ 8,74 (1Н, с), 8,51 (1Н, с), 8,33 (1Н, шир. с), 8,08 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 6,80 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 3,93,7 (4Н, шир. м), 2,9 (2Н, шир. т), 2,74 (3Н, с), 2,65 (2Н, шир. м), 2,38 (3Н, с), 1,8 (2Н, шир. м).
Стадия Ό. При комнатной температуре в ДМФ (4 мл) растворяли НС1 соль 7-(1,4-диазепан-1-ил)-3(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-она (100 мг, 0,26 ммоль). Раствор обрабатывали формальдегидом (37 мас.% в воде, 2,56 ммоль, 0,19 мл) и триацетоксиборгидридом натрия (165 мг, 0,78 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и концентрировали в вакууме. Остаток помещали на силикагелевую колонку и очищали метанолом (5-20%) в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения (66,9 мг, 64%). Точка плавления 243-245°С; МС т/ζ 405,1 [М+Н]+; 1Н ЯМР (ДМСО-46, 500 МГц) δ 8,74 (1Н, с), 8,51 (1Н, с), 8,32 (1Н, шир. с), 8,09 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 6,80 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 3,9-3,7 (4Н, шир. м), 3,18 (2Н, шир. д), 2,74 (3Н, с), 2,65 (2Н, шир. м), 2,38 (3Н, с), 2,25 (3Н, с), 1,8 (2Н, шир. м).
Как показано в табл. 1 далее, дополнительные соединения, описанные в настоящем документе, могут быть получены в соответствии с примером 5 путем замены соответствующих исходных продуктов, реагентов и условий реакций.
Пример 6. Получение соединения 71
Стадия А. При комнатной температуре в ДМСО (20 мл) растворяли 6-хлор-2гидроксиникотинальдегид (1,06 г, 6,76 ммоль). При комнатной температуре раствор обрабатывали цис2,6-диметилпиперазином (1,16 г, 10,18 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при температуре
- 68 029155
100°С в течение 3 ч и охлаждали до комнатной температуры с получением сырого 6-(цис-3,5диметилпиперазин-1-ил)-2-гидроксиникотинальдегида. МС т/ζ 236 [М+Н]+.
Стадия В. Раствор 6-(цис-3,5-диметилпиперазин-1-ил)-2-гидроксиникотинальдегида в дихлорметане (30 мл) обрабатывали при комнатной температуре тремя порциями диизопропилэтиламином (2,62 г,
20,3 ммоль) и ди-трет-бутил дикарбонатом (2,95 г, 13,52 ммоль). Смесь перемешивали при температуре 40°С в течение 2 ч и охлаждали до комнатной температуры. Реакцию гасили водой и три раза экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои концентрировали, и остаток очищали на силикагеле с получением трет-бутил 4-(5-формил-6-гидроксипиридин-2-ил)-цис-2,6-диметилпиперазин-1карбоксилата (2,03 г, 89%). МС т/ζ 336 [М+Н]+.
Стадия С. трет-Бутил 4-(3-(4-хлорбензо[б]тиазол-2-ил)-2-оксо-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-7-ил)-2,6диметилпиперазин-1-карбоксилат получали способом, подобным описанному в примере 5, часть 3, стадия В. МС т/ζ 529 [М+Н]+.
Стадия Ό. 3-(4-Хлорбензо[б]тиазол-2-ил)-7-цис-3,5-диметилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он получали способом, подобным описанному в примере 5, часть 3, стадия С. МС т/ζ 429 [М+Н]+; 1Н ЯМР (ДМСО-б6, 500 МГц) δ 9,08 (1Н, с), 8,33 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 8,13 (1Н, д, 1=7,8 Гц), 7,64 (1Н, д, 1=7,6 Гц), 7,43 (1Н, т, 1=7,8 Гц), 7,16 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 4,70 (2Н, шир. т), 3,4-3,2 (2Н, шир. м), 3,0 (2Н, шир. т), 1,31 (3Н, с), 1,30 (3Н, с).
Стадия Е. Указанное в заголовке соединение получали способом, подобным описанному в примере 5, часть 3, стадия Ό.
Точка плавления 286-288°С; МС т/ζ 441,1 [М+Н]+; !Н ЯМР (ДМСО-06, 500 МГц) δ 9,06 (1Н, с), 8,24 (1Н, д, 1=9,0 Гц), 8,13 (1Н, дд, 1=1,0, 7,9 Гц), 7,64 (1Н, д, 1=1,0, 7,8 Гц), 7,43 (1Н, т, 1=7,8 Гц), 7,11 (1Н, д, 1=9,0 Гц), 4,4 (2Н, шир. м), 2,8 (2Н, шир. т), 2,22 (3Н, с), 2,15 (2Н, шир. м), 1,12 (3Н, с), 1,14 (3Н, с).
Как показано в табл. 1 далее, дополнительные соединения, описанные в настоящем документе, могут быть получены в соответствии с примером 6 путем замены соответствующих исходных продуктов, реагентов и условий реакций.
Пример 7. Получение соединения 114
Стадия А. Раствор трет-бутил 4-(5-формил-6-гидроксипиридин-2-ил)-1,4-диазепан-1-карбоксилата (600 мг, 1,87 ммоль) в ЕЮН (4 мл) при комнатной температуре обрабатывали пиперидином (239 мг, 2,8 ммоль), уксусной кислотой (511 мг, 9,35 ммоль) и этилацетоацетатом (487 мг, 3,74 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при температуре 90°С в течение 3 ч. Смесь концентрировали, гасили насыщенным раствором \аНСО3 и три раза экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои объединяли, сушили над К2СОз, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на силикагеле метанолом (0-10%) в дихлорметане с получением трет-бутил 4-(3-ацетил-2-оксо-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-7-ил)-1,4диазепан-1-карбоксилата (450 мг, 62%). МС т/ζ 388 [М+Н]+.
Стадия В. трет-Бутил 4-(3-ацетил-2-оксо-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-7-ил)-1,4-диазепан-1карбоксилат (350 мг, 0,903 ммоль) в 10 мл хлороформа при комнатной температуре обрабатывали бромом (1М в СНС13, 0,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч.
Выпавший твердый продукт фильтровали, и маточный раствор концентрировали. Остаток очищали на силикагеле с получением трет-бутил 4-(3-(2-бромацетил)-2-оксо-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-7-ил)-1,4диазепан-1-карбоксилата (132,2 мг, 32%). МС т/ζ 489 |\Г\а|'.
Стадия С. трет-Бутил 4-(3-(2-бромацетил)-2-оксо-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-7-ил)-1,4-диазепан-1карбоксилат (132 мг, 0,28 ммоль) в 5 мл ЕЮН обрабатывали 2-аминотиазолом (34,1 мг, 0,34 ммоль) при
- 69 029155
комнатной температуре. Раствор кипятили с обратным холодильником в течение 16 ч и концентрировали в вакууме. Остаток очищали на силикагеле с получением трет-бутил 4-(3-(имидазо[2,1-Ь]тиазол-6-ил)-2оксо-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-7-ил)-1,4-диазепан-1-карбоксилата (64,3 мг, 49%). МС т/ζ 468 [М+Н]+.
Стадия Ό. НС1 соль 7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(имидазо[2,1-Ь]тиазол-6-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин2-он получали способом, подобным описанному в примере 5, часть 3, стадия С. МС т/ζ 367 [М+Н]+; 1Н ЯМР (ДМСО-а6, 500 МГц) δ 9,3 (1Н, шир. с), 8,61 (1Н, с), 8,38 (1Н, с), 8,07 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 7,98 (1Н, д, 1= 4,4 Гц), 7,30 (1Н, д, 1=4,4 Гц), 6,89 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 4,29 (1Н, шир. м), 4,02 (2Н, шир. м), 3,80 (2Н, шир. м), 3,29 (2Н, шир. м), 3,17 (2Н, шир. м), 2,13 (2Н, шир. м).
Стадия Е. Указанное в заголовке соединение получали способом, подобным описанному в примере 5, часть 3, стадия О.
Точка плавления 224-226°С; МС т/ζ 382 [М+Н]+; ’Н ЯМР (ДМСО-'6, 500 МГц) δ 8,54 (1Н, шир. с), 8,30 (1Н, с), 8,00 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 7,95 (1Н, д, 1=4,4 Гц), 7,26 (1Н, д, 1=4,4 Гц), 6,80 (1Н, д, 1=8,8 Гц), 3,953,61 (4Н, шир. м), 2,89-2,60 (4Н, шир. м), 2,38 (3Н, с), 1,99 (2Н, шир. м).
Как показано в табл. 1 далее, дополнительные соединения, описанные в настоящем документе, могут быть получены в соответствии с примером 7 путем замены соответствующих исходных продуктов, реагентов и условий реакций.
В табл. 1 представлены выделенные соединения в форме свободного основания соединения формулы (I), которые могут быть получены в соответствии со способами указанного примера путем замены соответствующих исходных продуктов, реагентов и условий реакций. Получение какой-либо соли, изотополога, стереоизомера, рацемата, энантиомера, диастереомера или таутомера формы свободного основания соединения формулы (I) также предполагается и, кроме того, входит в объем описания настоящего документа. Когда соединение в форме свободного основания не выделяют, специалист в данной области может представить, как осуществить необходимые реакции с целью получения и выделения свободной формы соединения.
Термин "Соед." обозначает номер соединения, термин "Пр." обозначает "номер примера" (где * указывает, что соответствующий пример для соединения представлен выше), термин "т.пл." обозначает "точку плавления (°С)", термин "МС" обозначает "пик(и) масс-спектроскопии т/ζ [М+Н]+, [М+2+Н]+, [М-Н]- или [М+2-Н]-", термин "Р" обозначает "разложение/разложенный", термин "ИР" обозначает "интервал разложения", термин "М" обозначает "размягчение", термин "НО" указывает, что значение "не определяли", и термин "НВ" указывает, что соединение "не выделяли".
Таблица 1
Название
2 2а
3- (1,З-бензотиазол-2-ил)-7(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3- 258-260 365,3
Ь]пиридин-2-он
3-(4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3- НВ НВ
Ь]пиридин-2-он
3- (1,З-бензотиазол-2-ил)-7-(4метилпиперазин-1-ил)-2Н- 247-250 379,2
пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
3- (1,З-бензотиазол-2-ил)-7-[4-(2хлорэтил)пиперазин-1-ил]-2Н- НО 427,2
пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
- 70 029155
3*
9а
10
11
12
13
14
15а
16а
17
18
19
20
21
22
23
24а
25
3- (4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3- (4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7- [4- (2-гидроксибензил)пиперазин1- ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2он
трет-бутил 4-[3-(1,3-бензотиазол2- ил)-2-охо-2Н-пирано[3,2с]пиридин-7-ил]пиперазин-1карбоксилат
трет-бутил 4-[ 3-(4-хлор-1,3бензотиазол-2-ил)-2-охо-2Нпирано[3,2-с]пиридин-7ил]пиперазин-1-карбоксилат
3- (4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[3,2с]пиридин-2-он
3- (4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7- [4- (2-гидроксиэтил)пиперазин-1ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[3,2-с]пиридин-2-он 3- (4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7- (4-этилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3- (4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7-(4-пропилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3- (1,З-бензотиазол-2-ил)-7-(4метилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[3,2-с]пиридин-2-он
3-(4-метил-1,З-тиазол-2-ил)-7(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он
7-(пиперазин-1-ил)-3-[4(трифторметил)-1,З-тиазол-2-ил]2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(1,З-бензотиазол-2-ил)-7-(4этилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(1,З-бензотиазол-2-ил)-7-(4пропилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(1,З-бензотиазол-2-ил)-7-[4(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-(4-этилпиперазин-1-ил)-3-(4метил-1,З-тиазол-2-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(4-метил-1,З-тиазол-2-ил)-7-(4пропилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7- [4- (2,3дигидроксипропил) пиперазин-1-ил]2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
3- (1,З-бензотиазол-2-ил)-7-[4-(2гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
258-260 413,2
262-266 505,2
НО 465,3
НО 499,3
НВ НВ
258-262 443,2
285-288 413,2
266-269 427,2
251-254 441,3
НО 379,2
НВ НВ
НВ НВ
254-257 393,3
247-250 407,3
241-245 407,3
228-232 357,2
210-214 371,2
216-220 473,3
230-234 441,3
НВ НВ
220-224 409,3
- 71 029155
26
27
28а
29а
30а
31а
32а
33
34
35а
36
37
38
39
40а
41а
42а
43а
44а
45а
4 6а
47а
3-(1,З-бензотиазол-2-ил)-7-[4(2,3-дигидроксипропил)пиперазин1- ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-гон
3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
3- (имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он
3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
7- (1,4-диазепан-1-ил)-3(имидазо[1,2-а]пиримидин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
3- (4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7- (1,4-диазепан-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
7-(1,4-диазепан-1-ил)-3(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Нпирано[3,2-с]пиридин-2-он
3- (6-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)2Н-пирано[3,2-с]пиридин-2-он
3- (8-хлор-6-метилимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1ил)-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-2-он 3-(имидазо[1,2-а]пиримидин-2-ил)7-(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
3-(4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7-(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7(4-метилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
3- (7-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Нпирано[3,2-с]пиридин-2-он
3- (2-метилимидазо[2,1b] [1,3]тиазол-6-ил)-7-(пиперазин1- ил)-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-гон
3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[3,2c] пиридин-2-он
3-(5-метилпиразоло[1,5-а]пиридин2- ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
3- (имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
7-(1,4-диазепан-1-ил)-3(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(8фторимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-(1,4-диазепан-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
236-239
260-264
НВ
НВ
НВ
НВ
НВ
НО
264-268
НВ
232-234
439, 3
376, 3
НВ
НВ
НВ
НВ
НВ
362,4
376, 2
НВ
377,3
263-265 427,1
243-246 362,2
264-268 376,3
НВ НВ
НВ НВ
НВ НВ
НВ НВ
НВ НВ
НВ НВ
НВ НВ
НВ НВ
- 72 029155
5 48
5 49
5 50
5 51а
5 52а
2 53
2 54
4 55
5 56
4* 57
2 58
2 59
6 60
2 61
2 62
2 63
2 64
5 65
5 66
6 67
2 68
3-(имидазо[1, 2-а]пиридин-2-ил)-7(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-2Нпирано[2, 3-Ь]пиридин-2-он 3-(8-фторимидазо[ 1,2-а]пиридин-2ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3- (1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(1,4диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он
3- (1,3-бензоксазол-2-ил)-7-(1,4диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он
7-(4-метилпиперазин-1-ил)-3-(5метилпиразоло[1,5-а]пиридин-2ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-бил) -7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(2-метилимидазо[2,1Ь][1,3]тиазол-б-ил)-7-(4метилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[3,2-с]пиридин-2-он
3-(1,З-бензотиазол-2-ил)-7-(4метил-1,4-диазепан-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)2Н-пирано[3,2-с]пиридин-2-он
3- (7-метилимидазо[1,2-а]пиридин2-ил)-7-[(33)-З-метилпиперазин-1ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-[(23)-2-метилпиперазин-1ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-[(ЗН,53)-3,5-диметилпиперазин1-ил]-3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-[(33)-3,4-диметилпиперазин-1ил]-3-(7-метилимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
7-[(23)-2,4-диметилпиперазин-1ил]-3-(7-метилимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
3- (8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7- [ (23)-2-метилпиперазин-1ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-[(33)-З-метилпиперазин-1ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7- (1,4-диазепан-1-ил)-3-(7метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(6метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-[(ЗН,53)-3,5-диметилпиперазин1-ил]-3-(б-метилимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
7-[(23)-2,4-диметилпиперазин-1ил]-3-(8-фторимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
271-274 376,2
269-272 394,8
245-246 410,3
НВ НВ
НВ НВ
264-268 376,3
268-272 368
282-286 382,2
274-276 393,1
НО 376,3
НО 376,3
НО 376,3
283-285 376,5
246-250 390,3
242-246 390,3
НО 380,8
НО 380,8
239-241 376,1
240-243 376,1
248-251 390,1
210-213 394,2
- 73 029155
2 69
6 70
6* 71
2 72
2 73
2 74
2 75
6 76
6 77
7-[(33)-3,4-диметилпиперазин-1ил]-3-(8-фторимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
3-(4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7-[(ЗН,53)-3,5-диметилпиперазин1- ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-гон
3-(4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7-[(ЗН,53)-3,4,5триметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-[(33)-З-метилпиперазин-1ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
3- (6-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-[(ЗН)-З-метилпиперазин-1ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-[(33)-3,4-диметилпиперазин-1ил]-3-(6-метилимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3—
b] пиридин-2-он
7-[(ЗН)-3,4-диметилпиперазин-1ил]-3-(6-метилимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
7-[(ЗН,53)-3,5-диметилпиперазин1-ил]-3-(8-фторимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3—
b] пиридин-2-он
3- (8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-[(ЗН,53)-3,5диметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
222-225 394,2
295-297 427,1
286-288 441,1
НО 376,3
НО 376,3
248-252 390,2
247-251 390,2
247-249 394,5
240-242 410
78
79а
80а
81
82
83а
84а
85
86
87
7-[(ЗН,53)-3,5-диметилпиперазин1- ил]-3-(имидазо[1,2-а]пиримидин2- ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-гон
3- (имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7[(33)-З-метилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7[(ЗН)-З-метилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-[(33)-3,4-диметилпиперазин-1ил]-3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-[(ЗН)-3,4-диметилпиперазин-1ил]-3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6ил)-7-[(33)-З-метилпиперазин-1ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6ил)-7-[(ЗН)-З-метилпиперазин-1ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7-[(2Н,53)-2,5-диметилпиперазин1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-гон
3-(4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7- [ (2Н, 53)-2,4,5триметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-[(2Н,53)-2,5-диметилпиперазин1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
255-258 377,5
НВ НВ
НВ НВ
213-216 376,1
216-219 376,1
НВ НВ
НВ НВ
223-227
427,1
(ИР)
233-234
441,2
(ИР)
225-229 390,2
- 74 029155
88
89а
90
91
92
93
94
95
96
7-[(2Н,53)-2,5-диметилпиперазин1-ил]-3-(7-метилимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(6,8диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(6,8-диметилимидазо[1,2а]пиразин-2-ил)-7-[(ЗН,53)-3,5диметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(6,8-диметилимидазо[1,2a] пиразин-2-ил)-7-(4-метил-1,4диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
7-[(2Н,53)-2,5-диметилпиперазин1- ил]-3-(8-фторимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3—
b] пиридин-2-он
3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-[(2Н,53)-2,4,5триметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
3- (8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-[(2Н,53)-2,5диметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
3-(6,8-диметилимидазо[1,2а]пиразин-2-ил)-7-[(2Н,53)-2,5диметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин2-ил)-7-[(2Н,53)-2,4,5триметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
НО 390,2
НВ НВ
279-282 405,1
243-245 405,1
210-212 394,2
НО 404,2
172-175 410,2
190-192 405,3
114-117 404,3
3-(8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-[(2Н,53)-2,4,597
триметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-[(2Н,53)-2,4,598
триметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
7-[(ЗН,53)-3,5-диметилпиперазин1-ил]-3-(7-метилимидазо[1,299
a] пиримидин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
7-[(ЗН,53)-3,5-диметилпиперазин1-ил]-3-(7-метилимидазо[1,2100
a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
7-[(ЗН,53)-3,5-диметилпиперазин1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2101
a] пиразин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
7-[(2Н,53)-2,5-диметилпиперазин1- ил]-3-(6-метилимидазо[1,2102
a] пиразин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин2- ил)-7-[(2Н,53)-2,4,5103
триметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7 - (1,4-диазепан-1-ил)-3-(6104а метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-3105 (6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
194-197 408,3
191-196 424,3
270-273 391,1
246-249 390,1
279-281 391,1
НО 391,2
248-250 405,2
НВ НВ
290-293 391
- 75 029155
5 107а
2 112а
7-[(ЗН,53)-3,5-диметилпиперазин1-ил]-3-(8-фтор-бметилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7- (1,4-диазепан-1-ил)-3-(8-фтор6- метилимидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(имидазо[1,2-а]пиримидин-2-ил)7- (пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он
3-(8-фтор-б-метилимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-7-(4-метил-1,4диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
3-(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-3(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-3(б-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
3-(имидазо[1,2-а]пиримидин-2-ил)7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(имидазо[1,2-а]пиримидин-2-ил)7-[ (ЗН, 53)-3,4,5триметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-[(ЗН,53)-3,4,5триметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-[(ЗН,53)-3,4,5триметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7[(ЗН,53)-3,4,5-триметилпиперазин1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2280-283 408
НВ НВ
231-235 366,1
233-237 382,1
258-262 380,2
256-259 396,1
НВ НВ
269-273 408
224-226 382
241-243 390
233-236 390,1
266-269 363,1
286-289 391,1
242-245 408,1
241-245 424
242-246 390,1
7-[(2Н,53)-2,5-диметилпиперазин1-ил]-3-(8-фтор-6метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(6,8-диметилимидазо[1,2а]пиразин-2-ил)-7-[(2Н,53)-2,4,5триметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7- [ (13,43)-2,5диазабицикло[2.2.1]гепт-2-ил]-3(б-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-[(13,43)-5-метил-2,5диазабицикло[2.2.1]гепт-2-ил]-3(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
195-198 408,5
234-236 419,6
НО 374,2
211-213 388,2
- 76 029155
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
7-(4-этил-1,4-диазепан-1-ил)-3(имидазо[1,2-а]пиримидин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7- (4-этил-1,4-диазепан-1-ил)-3(имидазо[ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(6,8-диметилимидазо[1,2a] пиразин-2-ил)-7-(4-этил-1,4диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
7-[(ЗН,53)-4-этил-З,5диметилпиперазин-1-ил]-3(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7- (4-этилпиперазин-1-ил)-3-(6метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-(4-этилпиперазин-1-ил)-3-(7метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-(4-этилпиперазин-1-ил)-3-(8фторимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-(4-этилпиперазин-1-ил)-3-(8фтор-б-метилимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
7- [ (13,43)-2,5диазабицикло[2.2.1]гепт-2-ил]-3(б,8-диметилимидазо[1,2a] пиразин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
271-273 391,1
285-288 390,1
289-291 419,1
281-284 404,1
235-237 390,1
258-261 390,1
203-206 394
218-221 410
238-242 408,1
НО 389,5
136
137
138
139
140
141
142
143
144
7- [ (13,43)-2,5диазабицикло[2.2.1]гепт-2-ил]-3(8-фтор-б-метилимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
7-[(33)-4-этил-З-метилпиперазин1-ил]-3-(8-фтор-6метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7- (4-этил-1,4-диазепан-1-ил)-3(8-фтор-б-метилимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
7- (4-этил-1,4-диазепан-1-ил)-3(8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(6,8-диметилимидазо[1,2а]пиразин-2-ил)-7-(4этилпиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-(4-этил-1,4-диазепан-1-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-(4-этил-1,4-диазепан-1-ил)-3(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 7-[(33)-4-этил-З-метилпиперазин1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2a] пиразин-2-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он
3-(6,8-диметилимидазо[1,2а]пиразин-2-ил)-7-[(33)-4-этил-Зметилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
НО 392,5
239-243 422,5
195-200 422,5
189-191 408,5
238-241 405,1
201-204 424,5
217-221 405,5
252-256 405,1
184-190
419, 1
(РН)
- 77 029155
3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-
5 145 ил)-7-[(33)-4-этил-З-
метилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он 3-(6,8-диметилимидазо[1,2а]пиразин-2-ил)-7-[ (ЗЗ)-З- 196-199 424
5 146 метилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он НО 391,7
или его соль, изотополог, стереоизомер, рацемат
энантиомер, диастереомер или таутомер.
В табл. 2 дополнительно представлены некоторые выделенные соединения в форме соли соединения формулы (I), которые могут быть получены в соответствии с процедурами, указанными в примере, с использованием соответствующих реактивов, реагентов и условий реакции. Также предполагается получение любого свободного основания, изотополога, стереоизомера, рацемата, энантиомера, диастереомера или таутомера из солевой формы соединения формулы (I), и которые дополнительно включены в объем настоящего описания. В случае, если соединение в форме свободного основания не было выделено из солевой формы, предполагается, что средний специалист с обычной квалификацией в данной области сможет выполнить необходимые взаимодействия для получения и выделения соединения в форме свободного основания.
Термин "Соед." относится к номеру соединения, термин "Пр." относится к "номеру примера" (где * указывает, что соответствующий пример для соединения приведен выше), термин "т.пл." относится к "Точке плавления (°С)", термин "МС" означает "Пик(и) в масс-спектроскопии) т/ζ [М+Н]+, [М+2+Н]+, [М-Н]- или [М+2-Н]-", термин "Р" относится к "разложение/расщепление", "термин" ИР" относится к "интервал разложения", термин "М" относится к "размягчает", и термин "НО" указывает, что значение было "не определено".
Таблица 2
Пр
15
16
24
28
29
30
31
3-(4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3b] пиридин-2-он гидрохлорид
3-(4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[3,2c] пиридин-2-он гидрохлорид
3-(4-метил-1,З-тиазол-2-ил)-7(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он гидрохлорид 7-(пиперазин-1-ил)-3-[4(трифторметил)-1,З-тиазол-2-ил]2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
3- (имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
7-(1,4-диазепан-1-ил)-3(имидазо[1,2-а]пиримидин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
3- (4-хлор-1,З-бензотиазол-2-ил)7- (1,4-диазепан-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
НО
399, 3
266-270
238-242
274-280
218-222
НО
240-244
250-252
271-273
399, 2
329, 2
383,2
362,3
348,2
362,2
363,3
413,2
- 78 029155
32
35
40
41
42
43
44
45
46
47
51
52
79
80
83
7-(1,4-диазепан-1-ил)-3(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
3-(8-хлор-6-метилимидазо[1,2a] пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1ил)-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-2-он гидрохлорид
3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин2- ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Нпирано[3,2-с]пиридин-2-он гидрохлорид
3- (2-метилимидазо[2,1b] [1,3]тиазол-6-ил)-7-(пиперазин1- ил)-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-гон гидрохлорид
3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[3,2c] пиридин-2-он гидрохлорид
3-(5-метилпиразоло[1,5-а]пиридин2- ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
3- (имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
7-(1,4-диазепан-1-ил)-3(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
7 - (1,4-диазепан-1-ил)-3-(8фторимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2ил)-7-(1,4-диазепан-1-ил)-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(1,4диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он гидрохлорид 3- (1,3-бензоксазол-2-ил)-7-(1,4диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он гидрохлорид 3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7[(33)-З-метилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7[(ЗН)-З-метилпиперазин-1-ил]-2Нпирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
3-(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6ил)-7-[(33)-З-метилпиперазин-1ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
3-(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6ил)-7-[(ЗН)-З-метилпиперазин-1ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(6,8диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(6метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
267-269 368,2
НО 3 9 6,3
НО 362,2
НО 368,2
278-284 348,3
НО 362,2
НО 354,2
265-267 362,4
267-269 380,1
252-255 396,1
284-286 379,2
243-245 363,2
НО 362
НО 362
НО 368,1
НО 368,1
273-276 391,2
267-269 377,1
- 79 029155
7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(8-фтор6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-25 107 276-279 394,1
ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
3-(имидазо[1,2-а]пиримидин-2-ил)2 112 7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3- НО 349,2
Ь]пиридин-2-он гидрохлорид
или его изотополог, стереоизомер, рацемат, энантиомер,
диастереомер или таутомер.
Биологические примеры
Для более подробного описания и лучшего понимания настоящего изобретения следующие биологические примеры, не ограничивающие объем изобретения, представлены с целью более полной иллюстрации объема изобретения, и эти примеры не должны быть истолкованы как специально ограничивающие его объем. Такие варианты настоящего описания, которые могут быть известны в настоящее время или разработаны в дальнейшем, и которые были бы в компетенции специалиста в данной области, включены в объем настоящего описания и как заявлено далее в настоящем документе. Эти примеры иллюстрируют тестирование отдельных соединений, описанных в настоящем документе, т νίΐτο и/или т νίνο и продемонстрируют применимость соединений для лечения 8ΜΑ путем повышения включения экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ2. Соединения формулы (I) способствуют включению экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена 8ΜΝ2, и повышают уровни белка 8тп, продуцируемого геном 8ΜΝ2, и таким образом могут быть использованы для лечения 8ΜΑ у человека, нуждающегося в таком лечении.
Пример 1. Конструкция минигена 8ΜΝ2.
Получение конструкции минигена ДНК, соответствующую области гена 8ΜΝ2, начиная с 5'-конца экзона 6 (ΑΤΑΑΤΤΟΟΟΟΟ) (8Ер ГО № 14) и заканчивая на остатке нуклеиновой кислоты 23 экзона 8 (СΑΟСΑС) (8ЕР ГО № 15), амплифицировали посредством ПЦР, используя следующий праймеры:
прямой праймер: 5’-СΟСΟΟΑΤССΑΤΑΑΤΤСССССΑССΑССТС-3’ (8Ер ГО № 16) и обратный праймер: 5’-СΟСΟΟΑΤССΟΤΟСΤΟСΤСΤΑΤΟССΑΟСΑ-3’ (8Ер ГО № 17).
5'-Конец каждого праймера был сконструирован, чтобы добавить сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции ВатШ на обоих 5'-концах экзона 6 (ΟΟΑΤСС) (8ЕР ГО № 18), и 3'-конец после 23-го нуклеотида экзона 8. Используя сайты узнавания эндонуклеазы рестрикции ВатШ, ПЦР-фрагмент клонировали в производное исходного вектора ροΌΝΑ 3,1/Нудго, который был модифицирован, как описано в публикации патента США И8 2005/0048549.
Новые ИТК добавляли к модифицированному вектору, используя сайт НтЛП и сайты рестрикции ВатШ, содержащие 5'ПЕС ИТК:
5'-ΤΛССΤΤСΤΤΛССССΤΛСΤССΛСССΤΤСССΛССΛССΛΤСССΛССΤСССΛССΤСΛΛССΛΤΤССΤΛ ΑΑСССΤС-3’ (8Ер ГО № 19), клонированную в модифицированный вектор ροΙ)ΝΑ3.1Ί 1удго вместе с инициирующим кодоном выше сайта рестрикции ВатШ, и
3'ПЕС ИТК:
5’-ΑΤССΑΑΑСΤΑСΑССΑСΤΑСССΤΤССΤΑССΑΑССССССССΤСССΑСΤСΤСΑСΑСΑΤСΑСΤСΑΑС ΑΤΑΤΑΤССΤСССΤΑΑССΤΑΤССΤСΤΑСССΑΤСΤΑΑСΤΑΤΤСССΤΑΤСΤСΤΤΑΤΑССС-3’ (8Ер ГО № 20), клонированную в модифицированный вектор ροΙ)ΝΑ3.1Ί 1удго. используя сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции ΝοΠ и сайт узнавания рестрикции XΗοI со стоп-кодоном, расположенным непосредственно ниже сайта рестрикции Νοΐ! Кроме того, ген люциферазы светлячка, лишенный инициирующего кодона, клонировали в вектор с использованием сайтов рестрикции ВатШ и ΝοΐΡ
Полученный миниген включает в порядке от 5' до 3': 5'ГОЕС ИТК, инициирующий кодон, шесть дополнительных нуклеотидов, образующих сайт рестрикции ВатШ, остатки нуклеиновых кислот экзона 6, остатки нуклеиновых кислот интрона 6 8ΜΝ2, остатки нуклеиновых кислот экзона 7 8ΜΝ2, остатки нуклеиновых кислот интрона 7 8ΜΝ2, и первые 23 остатка нуклеиновых кислот экзона 8 8ΜΝ2, дополнительных шесть нуклеотидов, образующих сайт рестрикции ВатШ и ген люциферазы светляков, лишенный инициирующего кодона.
Отдельный остаток аденина вставлен после нуклеотида 48 экзона 7 8ΜΝ2 путем сайтнаправленного мутагенеза. Эта конструкция минигена называется 8ΜΝ2-Α.
8ΜΝ2 транскрипты, полученные из минигенов, содержащих экзон 6-8, и промежуточные интроны воспроизводят сплайсинг своих эндогенных пре-мРНК (Ьогзоп е! а1., Ргос. ИаИ. Леа± 8с1. И.8.Л., 1999, 96(11), 6307). Была создана 8Ы№-альтернативная сплайсирующая репортерная конструкция, которая содержит экзоны 6-8 и промежуточные интроны после люциферазного репортерного гена. Отличительным признаком этой конструкция является отсутствие инициирующего кодона в люциферазном гене, инактивация терминирующего кодона (в открытой рамке считывания, которая кодирует белок 8ΜΝ) экзона 7 путем вставки нуклеотида после нуклеиновой кислоты 48 экзона 7 и добавления инициирующего кодона (ΑΤΟ) непосредственно перед экзоном 6. После нуклеинового остатка 48 экзона 7 вставляли отдельный аденин (8ΜΝ2-Α).
Миниген 8ΜΝ2 был сконструирован таким образом, что люциферазный репортер находится в рам- 80 029155
ке с инициирующим кодоном ΑΤΘ непосредственно перед экзоном 6, когда экзон 7 присутствует в мРНК, а люциферазный репортер находится вне рамки с инициирующим кодоном ΑΤΘ непосредственно перед экзон 6, если экзон 7 δΜΝ2 удаляется во время сплайсинга пре-мРНК. Кроме того, в отсутствие экзона 7, открытая рамка считывания, которая начинается с инициирующего кодона ΑΤΘ непосредственно перед экзоном 6, содержит стоп-кодон во фрагменте экзона 8 δΜΝ. Таким образом, в присутствии соединений, которые способствуют включению экзона 7 δΜΝ2 в мРНК, транскрибируемую с гена δΜΝ2, продуцируется больше транскриптов, содержащих экзон 7, и больше функционального репортера. Схематическое изображение этого описания можно найти на фиг. 1.
Последовательность ДНК минигена из δΜΝ2-Α конструкции δΕ^ ГО № 21 представлена на фиг. 2а. Изображение подпоследовательностей минигена δΜΝ2-Α показано на фиг. 2Ь.
Пример 2. ОТ-кПЦР-анализ сплайсинга мРНК минигена δΜΝ2 в культивируемых клетках. Исследование на основе количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) использовали
для количественного определения уровня мРНК полноразмерного минигена δΜΝ2, содержащего экзон 7 δΜΝ2 в линии клеток 11НК29311. стабильно трансфицированных указанным минигеном и обработанных исследуемым соединением.
Вещества
Вещества Источник
Клетки НЕК293Н АТСС Каталожный номер СНЬ-1573
Лизирующий буфер Ыбе Тесйпободбез, 1пс. (ранее
Се11з-То-Сб использовалось название Вбозузбешз)
Каталожный номер: 4399002
ЭМЕМ (среда Игла, Ыбе Тесйпободбез, 1пс. (ранее бпчббгодеп) модифицированная Каталожный номер: 11960-044
по Дульбекко)
96-луночные Весбоп 01ск1пзоп Каталожный номер: 353072
планшеты с плоским
дном
Ферментная смесь для проведения ОТПЦР
Буфер для ОТ-ПЦР
Набор АдРабП-Ю Опе-Збер КТ-РСК
Термоциклер
Ыбе ТесПпо1од1ез,
использовалось название
по каталогу: 4388520 набор АдРаЕП-Ю Кбб
1пс. (ранее
Вбозузбешз) Номер (также включена в Каталожный номер:
4387391)
Ыбе ТесНпободбез, 1пс. (ранее использовалось название Вбозузбетз) Номер по каталогу: 4388519 (также включен в набор АдРабН-Ю Кбб Каталожный номер: 4387391)
Ыбе ТесНпободбез, 1пс. (ранее использовалось название Вбозузбешз) Каталожный номер: 4387391
Ыбе ТесНпободбез, 1пс. (ранее
использовалось название Вбозузбешз) 7900НТ
Протокол. Клетки 11НК2931 к стабильно трансфицированные конструкцией минигена δΜΝ2-Α, описанной выше (10000 клеток/лунка), высевали в 200 мкл клеточной культуральной среды (Ι)ΜΙΜ плюс 10% ΡΒδ, 200 мкг/мл гигромицина) в 96-луночные планшеты с плоским дном и содержимое планшета незамедлительно перемешивали путем вращения планшета, чтобы обеспечить необходимое рассеивание клеток, с образованием равномерного клеточного монослоя. Клетки могут прикрепляться в течение по крайней мере 4-6 ч. Исследуемые соединения последовательно разбавляли 3,16-кратно в 100% ДМСО, чтобы построить кривую концентрации по 7 точкам. Раствор исследуемого соединения (1 мкл, 200 х в ДМСО) добавляли в каждую лунку, содержащую клетки, и планшет инкубировали в течение 24 ч в инкубаторе для клеточных культур (37°С, 5% СО2, 100% относительная влажность). Для каждой концентрации тестируемого соединения подготавливали две копии. Затем клетки лизировали в лизирующем буфере СеШ-То-СТ и лизат хранили при -80°С.
МРНК полноразмерного минигена δΜΝ2 и ΘΑΡΏΗ подвергали количественному исследованию, используя следующие праймеры и зонды, представленные в табл. 3. Прямой праймер Α δΜΝ (δΕ^ ГО № 1) гибридизировали с нуклеотидной последовательностью, в экзоне 7 (нуклеотид 22-нуклеотид 40), δΜΝ обратный праймер А (δΕ^ ГО № 2) гибридизировали с нуклеотидной последовательностью в кодирующей последовательности люциферазы светлячка, δΜΝ зонд (δΕ^ ГО № 3) гибридизировали с нуклеотидной последовательностью, в экзоне 7 (нуклеотид 50-нуклеотид 54) и экзоне 8 (нуклеотид 1-нуклеотид
- 81 029155
21). Сочетание этих трех олигонуклеотидов выявляет только минигены 8ΜΝ1 или 8ΜΝ2 (ОТ-кПЦР) и не выявляет эндогенные гены 8ΜΝ2 или 8ΜΝ1.
Таблица 3
Источник
Праймеры/Зонды
Последовательность
Α 3ΜΝ ЗЕО Ιϋ № 1: СААССААССТССТСАСАТТ РТС1
Обратный
праймер Α 3ΜΝ ЗЕО Ιϋ № 2: ТСТТТАТСТТТТТССССТСТТС РТС1
Прямой зонд А ЗЕО Ιϋ № 3: 6 г/мп- РТС1
3ΜΝ
ААССАСАААТССТСССАТАСАССАСС-ТАМКА
Прямой зонд ПСАРРН
Прямой праймер
ПСАРРН
Обратный
3Ες Ю № 4: У1СССССТССТСАССАССССТССТ-ТАМКА
ЗЕО Ιϋ № 5: СААССОАТТТССТССТАТТСС
ЗЕО Ιϋ № 6:
ЪТ12
ЪТ12
ЬТ12
ПСАРРН праймер ТСАТСССААСААТАТССАСТТТАСС
1
Праймеры и зонд разработаны фирмой РТС ТЬегареиЕсз, Шс.;
^Коммерчески доступный от фирмы Ы£е ТесЕпо1о§1е§, Шс. (ранее Шуфодеп).
Прямые и обратные праймеры 8ΜΝ использовали в конечных концентрациях 0,4 мкМ. Зонд 8ΜΝ использовали в конечной концентрации 0,15 мкМ. ΘΑΡΟΠ праймеры использовали в конечной концентрации 0,2 мкМ и зонд в 0,15 мкм.
Смесь ΘΑΡΟΠ и 8ΜN2-минигена (общий объем 15 мкл) получали путем объединения 7,5 мкл 2х буфера для ОТ-ПЦР, 0,4 мкл 25 х ферментной смеси для проведения ОТ-ПЦР, 0,75 мкл 20х смеси праймер-зонд ΠΑΡΌ! 4,0075 мкл воды, 2 мкл 10-кратного разведенного клеточного лизата, 0,06 мкл 100 мкМ прямого праймера 8ΜΝ, 0,06 мкл 100 мкМ обратного праймера 8ΜΝ и 0,225 мкл 100 мкМ зонда 8ΜΝ.
ПЦР выполняли при следующих температурах в течение указанного времени: стадия 1: 48°С (15 мин); стадия 2: 95°С (10 мин); стадия 3: 95°С (15 с); стадия 4: 60°С (1 мин); затем повторяли стадии 3 и 4 в течение всех 40 циклов.
Каждая реакционная смесь содержит как миниген 8ΜΝ2-Α, так и наборы праймеры/зонды ΘΑΡΟΠ (формат "мультиплекс"), что позволяет одновременно измерять уровни двух транскриптов.
Два сплайсированных продукта 8ΜΝ получали из минигена 8ΜΝ2. Первый сплайсированный продукт, содержащий экзон 7, соответствующий мРНК полноразмерного 8ΜΝ2, обозначается в настоящем документе термином "миниген ТЬ 8ΜΝ2". Второй сплайсированный продукт, лишенный экзона 7, обозначается в настоящем документе термином "миниген Δ7 8ΜΝ2".
Повышение мРНК минигена ТЬ 8ΜΝ2 относительно мРНК минигена ТЬ 8ΜΝ2 клеток, обработанных контролем носителем, определяли по данным ПЦР в режиме реального времени с использованием модифицированного метода ΔΔΟ: (как описано в Шуак апб 8сЬтШ§еп, ЫеШобз, 2001, 25:402-8). Эффективность амплификации (Е) вычисляли из наклона кривой амплификации в отдельности для минигена ТЬ 8ΜΝ2 и ΘΑΡΟΙΙ. Затем относительные содержания минигена ТЬ 8ΜΝ2 и ΘΑΡΟΠ вычисляли как (1+Е)-с1, где СТ представляет собой предельное значение для каждого ампликона. Относительное содержание минигена ТЕ 8ΜΝ2 нормировали к относительному содержанию ΘΑΡΟΙΙ. Далее для определения уровня мРНК ТЕ 8ΜΝ2 относительно контроля носителем, нормированное относительное содержание минигена ТЕ 8ΜΝ2 из образцов, обработанных исследуемым соединением, делили на нормированное относительное содержание минигена ТЕ 8ΜΝ2 из обработанных носителем клеток.
Результаты. Как показано на фиг. 3, клетки, обработанные соединением 5 (фиг. 3а) и соединением 27 (фиг. 3Ь) повышают уровень мРНК минигена ТЕ 8ΜΝ2 при низких концентрациях. Оба тестируемых соединения полностью восстанавливают включение экзона 7 по сравнению с необработанными клетками.
Для соединений формулы (I) или их формы, описанных в настоящем документе, в табл. 4 представлено значение ЕС1.5х для продуцирования мРНК полноразмерного 8ΜΝ2, полученное по данным кривой концентрации по 7 точкам, получаемым для каждого тестируемого соединения в соответствии с процедурой биологического примера 2. Термин "ЕС1.5х для продуцирования мРНК полноразмерного 8ΜΝ2" определяется как концентрация тестируемого соединения, которая является эффективной для увеличения количества мРНК полноразмерного 8ΜΝ2 до уровня в 1,5 раза большего по сравнению с уровнем в клетках, обработанных носителем. Значение ЕС1.5х для продуцирования мРНК полноразмерного 8ΜΝ2 в пределах >3 мкМ и <30 мкМ обозначается одной звездочкой (*), ЕС1.5х в пределах >1 мкМ и <3 мкМ обозначается двумя звездочками (**), ЕС1.5х в пределах >0,3 мкМ и <1 мкМ обозначается тремя звездочками
- 82 029155
(***), ЕС1-5х в пределах >0,1 мкМ и <0,3 мкМ обозначается четырьмя звездочками (****), и ЕС1-5х <0,1 мкМ обозначается пятью звездочками (*****).
Таблица 4
Соединение ЕС1.5Х Соединение ЕС1.5Х Соединение ЕС1.5Х
1 * * * * 50 ***** 99 ****
2 ***** 51 * * * 100 *****
3 *** 52 * 101 *****
4 * * 53 **** 102 *****
5 **** 54 **** 103 * * * *
6 * 55 ** 104 *****
7 * 56 **** 105 *****
8 * 57 *** 106 *****
9 **** 58 ***** 107 *****
10 *** 59 ***** 108 * * * * *
11 * * * 60 ***** 109 *****
12 *** 61 ***** 110 * * * * *
13 ** 62 ***** 111 *****
14 * 63 ***** 112 ****
15 * 64 ***** 113 *****
16 ** 65 *** 114 * * * * *
17 * * * 66 **** 115 *****
18 ** 67 ***** 116 * * * * *
19 * * * 68 ***** 117 ****
20 * 69 ***** 118 ****
21 * 70 **** 119 *****
22 *** 71 * * * * 120 * * * * *
23 * * * 72 ***** 121 *****
24 *** 73 * * * * 122 * * * * *
25 * * * 74 ***** 123 ****
26 ** 75 **** 124 ****
27 **** 76 ***** 125 ****
28 77 ***** 126 ****
29 ***** 78 **** 127 *****
30 **** 79 ***** 128 * * * * *
31 **** 80 ***** 129 * * * * *
32 ***** 81 **** 130 * * * *
33 * * 82 **** 131 ****
34 ** 83 ***** 132 ****
35 * 84 ***** 133 * * * * *
36 *** 85 **** 134 ****
37 ***** 86 *** 135 *****
38 * * * * 87 * * * * 136 * * * * *
39 * * * * * 88 ***** 137 * * * * *
40 *** 89 ***** 138 *****
41 * * * 90 ***** 139 * * * * *
42 * 91 ***** 140 * * *
43 **** 92 ***** 141 *****
44 ***** 93 *** 142 *****
45 * * * * 94 ***** 143 * * * * *
46 * * * * * 95 ***** 144 * * * * *
47 ***** 96 *** 145 *****
48 **** 97 **** 146 *****
49 ***** 98 ****
Пример 3. Анализ сплайсинга эндогенной мРНК 8ΜΝ2 методом ОТ-кПЦР в культивируемых клетках.
Для количественного определения уровней мРНК полноразмерного и Δ7 8ΜΝ2 в первичных клетках и клеточных линиях, содержащих ген 8ΜΝ2, обработанных исследуемым соединением, использовали анализ методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР).
- 83 029155
Вещества
Вещество
Человеческие
клетки ЗМА 1 типа Лизирующий буфер СеИз-То-Сб
БМЕМ
9б-луночные
планшеты с
плоским дном
Ферментная смесь для проведения
ОТ-ПЦР
Буфер для ОТ-ПЦР
Набор АдРаЬЬ-Ю Опе-ЗЬер КТ-РСК Шб
Термоциклер
Источник
6М03813 (СогФеИ 1пз£1£и£е)
Ы£е ТесЦпо1одФез, 1пс. (ранее
использовалось название ВФозузбетз) Каталожный номер: 4399002
Ы£е ТесЦпо1одФез, 1пс. (ранее 1пч1£годеп)
Каталожный номер: 11960-044
ВесГоп ϋίο]<ίη5οη Каталожный номер: 353072
Ы£е ТесПпо1од1ез, 1пс. (ранее
использовалось название В1озуз£етз) Номер по каталогу: 4388520 (также включен в набор АдРаЬЬ-Ю Κί£ Каталожный номер: 4387391)
Ы£е ТесНпо1од1ез, 1пс. (ранее
использовалось название В1озузЬешз) Номер по каталогу: 4388519 (также включен в набор АдРаЬЬ-Ю Κί£ Каталожный номер: 4387391)
Ы£е ТесНпо1од1ез, 1пс. (ранее
использовалось название В1озузЬешз) Каталожный номер: 4387391 Ы£е ТесНпо1од1ез, 1пс. (ранее использовалось название ВгозузЬешз) 7900НТ
Протокол. Клетки 8ΜΑ пациента ΘΜ03813 (5000 клеток/лунка) высевали в 200 мкл клеточной культуральной среды (ΏΜΕΜ плюс 10% РВ8) в 96-луночные планшеты с плоским дном и содержимое планшета незамедлительно перемешивали путем его вращения, чтобы обеспечить необходимое рассеивание клеток с образованием равномерного клеточного монослоя. Клетки оставляли прикрепляться в течение по крайней мере 4-6 ч. Исследуемые соединения последовательно разбавляли 3,16-кратно в 100% ДМСО для построения кривой концентрации по 7 точкам. Раствор исследуемого соединения (1 мкл, 200 х в ДМСО) добавляли в каждую лунку для анализа и 1 мкл ДМСО добавляли в каждую контрольную лунку. Планшет инкубировали в течение 24 ч в инкубаторе для клеточных культур (37°С, 5% СО2, 100% относительная влажность). Затем клетки лизировали в лизирующем буфере Се11§-То-С1, и лизат хранили при -80°С.
8ΜN2-специфические сплайсированные продукты и мРНК ΟΑΡΟΠ идентифицировали, используя следующие праймеры и зонды, представленные в табл. 5. Прямой праймер РЬ 8ΜΝ В (8Ε^ ГО № 7) гибридизировали с последовательностью нуклеотидов в экзоне 7 (нуклеотид 32-нуклеотид 54) и экзоне 8 (нуклеотид 1-нуклеотид 4), прямой праймер Δ7 8ΜΝ В (8Ε^ ГО № 8) гибридизировали с нуклеотидной последовательностью в экзоне 6 (нуклеотид 87-нуклеотид 111) и экзоне 8 (нуклеотид 1-нуклеотид 3). Обратный праймер 8ΜΝ В (8Ε^ ГО № 9) гибридизировали с нуклеотидной последовательностью в экзоне 8 (нуклеотид 39-нуклеотид 62), зонд 8ΜΝ РгоЬе В (8Ε^ ГО № 10) гибридизировали с нуклеотидной последовательностью в экзоне 8 (нуклеотид 7-нуклеотид 36). Эти праймеры и зонды гибридизировали с нуклеотидными последовательностями, обычно с мРНК человеческого 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2. Поскольку клетки пациента, страдающего 8ΜΑ, используемые в примере 3, содержат только ген 8ΜΝ2, ОТ-кПЦР может количественно определить только мРНК полноразмерного и Δ7 8ΜΝ2.
- 84 029155
Таблица 5
Праймер/зонд Последовательность Источник
Прямой праймер 8Εζ) Ю № 7: РТС1
РЪ 5ΜΝ В ССТСАСАТТССТТАААТТААССАСААА
Прямой праймер 8Εζ) Ιϋ № 8: РТС1
Δ75ΜΝ В Т ССС ТАТ САТАС Т ССС ТАТ ТАТАТ ССАА
Обратный 8Εζ) Ιϋ № 9: РТС1
праймер 5ΜΝ В ТССАСАТСТСТСТСАТССТТТСТТ
Прямой зонд 8Εζ) Ιϋ № 10: 6РАМ- РТС1
5ΜΝ В С Т СССАТАСАССАССАС ТАААТ САСАССАСТАМКА
Прямой зонд 8Εζ) Ιϋ № 4: У1С- ЬТ12
ΠΟΑΡϋΗ ССССТССТСАССАССССТССТ-ТАМКА
Прямой праймер ΠΟΑΡϋΗ 5Ες Ιϋ № 5: СААСССАТТТССТССТАТТСС ЬТ12
Обратный 8Εζ) Ιϋ № 6: ьтт2
праймер ΠΟΑΡϋΗ Т САТ СССААСААТАТ С САС Т Т ТАС С
1Праймеры и зонд, разработанные фирмой РТС ТРегареиРсз, Же.;
2Коммерчески доступный от фирмы Ше ТесЬпо1о§1е§, Ыс. (Ранее ШЛгодеп).
Прямой и обратный праймеры 8МУ использовали в конечных концентрациях, составляющих 0,4 мкМ. Зонд 8МN использовали в конечной концентрации, составляющей 0,15 мкМ. Праймеры ОАРЭН использовали в конечной концентрации, составляющей 0,1 мкМ, и зонд в концентрации, составляющей 0,075 мкМ.
Смесь ЗМ^САРБН (общий объем 10 мкл) получали путем объединения 5 мкл 2х буфера для ОТПЦР, 0,4 мкл 25 х ферментной смеси для проведения ОТ-ПЦР, 0,25 мкл 20х смеси праймер-зонд ОАРБН, 1,755 мкл воды, 2,5 мкл клеточного лизата, 0,04 мкл 100 мкМ прямого праймера 8МN РЬ или Δ7 8М^ 0,04 мкл 100 мкМ обратного праймера 8МN и 0,015 мкл 100 мкМ зонда.
ПЦР выполняли при следующих температурах в течение указанного времени: стадия 1: 48°С (15 мин); стадия 2: 95°С (10 мин); стадия 3: 95°С (15 с); стадия 4: 60°С (1 мин); затем повторяли стадии 3 и 4 в течение всех 40 циклов.
Каждая реакционная смесь содержит или наборы праймеры/зонд РЬ 8МШ и ОАРЭН или Δ7 8МШ и ОАРЭН (формат "мультиплекс"), что позволяет одновременно измерять уровни двух транскриптов.
Эндогенный ген 8МШ дает образование двух альтернативно сплайсированных мРНК. мРНК полноразмерного 8М№, содержащая экзон 7, обозначается в настоящем документе термином "РР 8М№". Процессированная мРНК, у которой отсутствует экзон 7, обозначается в настоящем документе термином "Δ7 8М№".
Повышение уровней мРНК РР 8МШ и снижение мРНК Δ7 8МШ относительно уровней в клетках, обработанных контрольным носителем, определяли по данным ПЦР в режиме реального времени, используя модифицированный метод ААС1 (как описано в Пуак апй 8сЬтй1деп, МеШой§, 2001, 25:402-8). Эффективность амплификации (Е) рассчитывали по наклону кривой амплификации отдельно для РР 8М№, Δ7 8МШ и ОАРЭН. Затем вычисляли относительные содержания РР 8М№, Δ7 8МШ и ОАРЭН по формуле (1+Е)-с\ где С1 представляет собой предельное значение для каждого ампликона. Относительные содержания РР 8МШ и Δ7 8МШ нормировали к относительному содержанию ОАРЭН. Далее нормированные относительные содержания РР 8МШ и Δ7 8МШ образцов, обработанных исследуемым соединением, делили на нормированные относительные содержания РР 8МШ и Δ7 8М№, соответственно, клеток, обработанных носителем, для определения уровней мРНК РР 8МШ и Δ7 8МШ относительно контроля носителем.
Результаты. Как показано на фиг. 4, клетки, обработанные возрастающими концентрациями соединения 5 (фиг. 4а) и соединения 27 (фиг. 4Ь), содержат прогрессирующе больше мРНК РР 8МШ и меньше мРНК Δ7 8М№, чем клетки, обработанные носителем, что указывает на коррекцию альтернативного сплайсинга 8М№.
Пример 4. Полуколичественной анализ сплайсинга методом ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" эндогенной мРНК 8МШ в культивируемых клетках.
Анализ сплайсинга методом ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" использовали для визуализации и количественной оценки уровней мРНК полноразмерного и Δ7 8МШ в первичных клетках и клеточных линиях, содержащих ген 8М№, обработанных исследуемым соединением.
- 85 029155
Вещества
Вещество
Источник
Человеческие
клетки ЗМА 1 типа Лизирующий буфер СеИз-То-Сб
ΏΜΕΜ (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) 96-луночные
планшеты с
плоским дном
Супермикс для ПЦР с Р1аб1пит Тад
ΗίΕί ДНКполимеразой Набор для ОТ-ПЦР с ферментом ί3θΓίρ£
2% агарозные Егели с бромистым этидием с 4 8луночными
двойными
гребенками
Система
документирования
гелей
6М03813 (СогФеИ ТпабФСибе)
Ы£е ТесНпо1од1ез, 1пс. (ранее
использовалось название ВФозузбетз) Каталожный номер: 4399002
Ы£е ТесЦпо1одФез, 1пс. (ранее 1пч1£годеп) Каталожный номер: 11960-044
Весбоп 01ск1пзоп Каталожный номер: 353072
Ы£е ТесПпо1од1ез, 1пс. (ранее 1пч1£годеп) Каталожный номер: 11304-016
В1оРаб: Каталожный номер: 170-8890
Ы£е ТесНпо1од1ез, 1пс. (ранее 1пч1бгодеп) Каталожный номер: 68008-02
υνΡ 6е1 ϋΟΟ 16 310 1шад1пд зузбет
Протокол. Клетки пациентов с 8ΜΑ ΟΜ03813 (5000 клеток/лунка) высевали в 200 мкл клеточной культуральной среды (ΌΜΞΜ плюс 10% ГВ8) в 96-луночные планшеты с плоским дном и содержимое планшета незамедлительно перемешивали путем его вращения, чтобы обеспечить необходимое рассеивание клеток с образованием равномерного клеточного монослоя. Клетки оставляли прикрепляться в течение по крайней мере 4-6 ч. Исследуемые соединения последовательно разбавляли 3,16-кратно в 100% ДМСО для построения кривой концентрации по 7 точкам. Раствор исследуемого соединения (1 мкл, 200 х в ДМСО) добавляли в каждую лунку для анализа и 1 мкл ДМСО добавляли в каждую лунку с контролем. Планшет инкубировали в течение 24 ч в инкубаторе для клеточных культур (37°С, 5% СО2, 100% относительная влажность). Затем клетки лизировали в лизирующем буфере Се11§-То-С1, и лизат хранили при -80°С.
мРНК ГЬ 8ΜΝ и мРНК Δ7 8ΜΝ идентифицировали, используя следующие указанные в табл. 6 праймеры. Эти праймеры гибридизировали с нуклеотидной последовательностью в экзоне 6 (прямой 8ΜΝ С, 8Е^ ГО № 11) (нуклеотид 43-нуклеотид 63) и экзоне 8 (обратный 8ΜΝ С, 8Е^ ГО № 12) (нуклеотид 51-нуклеотид 73), общие для мРНК 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2 человека. Поскольку клетки пациента, страдающего 8ΜΑ, используемые в примере 4, содержат только ген 8ΜΝ2, с помощью анализа ОТ-ПЦР можно визуализировать и количественно определить только мРНК полноразмерного и Δ7 8ΜΝ2.
Таблица 6
Праймер Последовательность Источник
Прямой 8ΜΝ С 3Εζ2 ΙΌ № 11: САТССТСАТССТТТСССААСТ РТС1
Обратный 3ΜΝ С 3Εζ2 ΙΌ № 12: СССТТСАСАТТССАСАТСТСТС РТС1 1Праймеры, синтезированные фирмой РТС ТЬегареиОсз, Тис.
Для синтеза кДНК объединяли 5 мкл лизата, 4 мкл 5х реакционной смеси 18спрТ 1 мкл обратной транскриптазы и 10 мкл воды и инкубировали 5 мин при 25°С, потом 30 мин при 42°С, затем 5 мин при 85°С. Раствор кДНК хранили при -20°С.
Для выполнения ПЦР с детекцией "по конечной точке" 5 мкл кДНК, 0,2 мкл 100 мкМ прямого праймера, 0,2 мкл 100 мкМ обратного праймера и 22,5 мкл полимеразного супермикса объединяли в 96луночном планшете для ПЦР с полуокантовкой. ПЦР выполняли при следующих температурах в течение указанного времени: стадия 1: 94°С (2 мин), стадия 2: 94°С (30 с), стадия 3: 55°С (30 с), стадия 4: 68°С (1
- 86 029155
мин), затем повторяли стадии 2 и 4 в течение всех 33 циклов, а потом хранили при 4°С.
10 мкл каждого ПЦР образца посредством электрофореза разделяли в 2% агарозном Е-геле в течение 14 мин, окрашивали реагентами для окрашивания двухцепочечной ДНК (дцДНК) (например, бромистым этидием) и визуализировали с помощью системы Ое1 1ша§ег.
Результаты. Как видно на фиг. 5, клетки, обработанные возрастающими концентрациями соединения 5 (фиг. 5 а) или соединения 27 (фиг. 5Ь), содержат прогрессирующе больше мРНК ЕЕ 8ΜΝ2 и меньше мРНК Δ7 8ΜΝ2, что указывает на коррекцию альтернативного сплайсинга 8ΜΝ2.
Пример 5. Анализ сплайсинга мРНК 8ΜΝ2 методом ОТ-кПЦР в тканях животных.
Исследование методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) использовали для количественного определения уровней мРНК полноразмерного и Δ7 8ΜΝ2 в тканях, отобранных у мышей, обработанных тестируемым соединением.
Вещества
Вещество Источник
Ткани, отобранные у мышей с ЗМА, несущих С/СТНе Ласкзоп ЬаЬогакогу, штамм под номером: 008714 (Вб. 129-Зтп1^5 δ)
аллель
Ткани, отобранные у страдающей ЗМА мыши с дефицитом экзона 7
ТНе Ласкзоп ЬаЬогакогу, штамм под номером: 005025 (ВУВ.Сд-Тд(ЗМЫ2*ае1ка7)4299АЬшЬ Тд (3ΜΝ2 ) 8 9АЬшЬ 5тп1 ^ΐΜΞό/δ)
Ферментная смесь для проведения
ОТ-ПЦР
Буфер для ОТ-ПЦР
Набор для ОТ-ПЦР АдРакН-Ιϋ ОпеЗТЕР
Мышиные праймеры и зонды ΟΑΡϋΗ
Ыке ТесНпо1од1ез, 1пс. (ранее
использовалось название ВФозузкетз) Номер по каталогу: 4388520 (также включен в набор АдРакН-Ιϋ Κί£ Каталожный номер: 4387391)
Ыке ТесНпо1од1ез, 1пс. (ранее
использовалось название В1озузкешз) Номер по каталогу: 4388519 (также включен в набор АдРакН-Ιϋ Κίί Каталожный номер: 4387391)
Ыке ТесНпо1од1ез, 1пс. (ранее
использовалось название В1озузкетз) Каталожный номер: 4387391 Ыке ТесНпо1од1ез, 1пс. (ранее использовалось название Вгозузкешз)
Лизирующий реагент ΟΙΑζοΙ Набор реагентов ВПеазу ЫрЫ Ыззие Μίηί Κίί 5-мм шарики из нержавеющей стали Гомогенизатор ЫззиеЬугег II Термоциклер
Каталожный номер: 4352339Е
01адеп Каталожный номер: 79306
01адеп Каталожный номер: 74804
01адеп Каталожный номер: 69989
Огадеп Каталожный номер: 85300
Ыке ТесНпоТодгез, Тпс. (ранее
использовалось название Ыозузкешз) 7900НТ
Протокол. Мышь, страдающую 8ΜΑ, с дефицитом С/С-аллеля, обрабатывали с помощью желудочного зонда два раза в день (ВГО) в течение 10 дней исследуемыми соединениями, ресуспендированными в 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозе (НРМС) и 0,1% Твин-80. Образцы ткани собирали и быстро замораживали для РНК очистки.
Образцы ткани (20-40 мг) гомогенизировали в лизирующем реагенте ^IΑζο1 в течение 2 мин при 20 Гц в гомогенизаторе Т1§§иеЕу§ег II с использованием одного шарика из нержавеющей стали. После добавления хлороформа гомогенат разделяли на водную и органическую фазы центрифугированием. РНК, отделенную в верхней водной фазе, экстрагировали и добавляли этанол, чтобы обеспечить соответствующие условия связывания. Затем образец наносили на колонку К№а§у из набора К№а§у Μΐπΐ Κΐΐ, где общая РНК связывается с мембраной. РНК элюировали в воде, лишенной рибонуклеазы, затем хранили
- 87 029155
при температуре -20°С и далее анализировали с помощью ТацЫап ОТ-кПЦР на термоциклере 7900НТ. Общую РНК разводили десятикратно и 2,5 мкл разведенного образца добавляли к смеси ТацЫап ОТкПЦР.
Продукты сплайсинга 8ΜΝ2 идентифицировали, используя следующие указанные в табл. 7 праймеры и зонд. Прямой праймер В ЕЬ 8ΜΝ (8ЕО ГО № 7) гибридизировали с нуклеотидной последовательностью в экзонах 7 и 8, прямой праймер В Δ7 8ΜΝ (8ЕО ГО № 8) гибридизировали с нуклеотидной последовательностью в экзонах 6 и 8, обратный праймер В 8ΜΝ (8ЕО ГО № 9) гибридизировали с нуклеотидной последовательностью в экзоне 8, зонд В 8ΜΝ (8ЕО ГО № 10) гибридизировали с нуклеотидной последовательностью в экзоне 8. Эти праймеры и зонд гибридизировали с нуклеотидными последовательностями, общими для мРНК 8ΜΝ1 и 8ΜΝ2 человека. Поскольку клетки пациента с 8ΜΑ, используемые в примере 5, содержат только ген 8ΜΝ2, ОТ-кПЦР может количественно определить только мРНК полноразмерного и Δ7 8ΜΝ2.
Таблица 7
Праймер/зонд
Прямой праймер В ВЪ 5ΜΝ
Прямой праймер В Δ7 5ΜΝ
Обратный праймер В 5ΜΝ
Прямой зонд В 5ΜΝ
Последовательность
Источник
5Е0 Ιϋ № 7: РТС* 1
ССТСАСАТТССТТАААТТААССАСААА
5Е0 Ιϋ № 8: РТС1
Т ССС ТАТ САТАС Т ССС ТАТ ТАТАТ ССАА
5Е0 Ιϋ № 9: РТС1
ТССАСАТСТСТСТСАТССТТТСТТ
5Е0 Ιϋ № 10: 6РАМ- РТС1
С Т СССАТАСАССАССАС ТАААТ САСАССАС ТАМПА
1Праймеры и зонд, синтезированные фирмой РТС ТЕегареийез, 1пс.
Прямой и обратный праймеры 8ΜΝ использовали в конечных концентрациях 0,4 мкМ. Зонд 8ΜΝ использовали в конечной концентрации 0,15 мкМ. Смесь 8ΜN-ΘΑΡ^Η (10 мкл общий объем) получали путем объединения 5 мкл 2х буфера для ОТ-ПЦР, 0,4 мкл 25 х ферментной смеси для проведения ОТПЦР, 0,5 мкл 20х смеси 6ΑΡ0Π праймер-зонд, 1,505 мкл воды, 2,5 мкл раствора РНК, 0,04 мкл 100 мкМ прямого праймера, 0,04 мкл 100 мкМ обратного праймера и 0,015 мкл 100 мкМ зонда 8ΜΝ.
Каждый цикл ПЦР проводили при следующих температурах в течение указанного времени: стадия 1: 48°С (15 мин); стадия 2: 95°С (10 мин); стадия 3: 95°С (15 с); стадия 4: 60°С (1 мин); затем повторяли стадии 3 и 4 в течение всех 40 циклов.
Каждая реакционная смесь содержит или ЕЕ 8ΜΝ2 и ηιίϊΑΡΟΙ I или Δ7 8ΜΝ2 и наборы праймеры/зонд ηιΟΑΡΟΙ I (формат мультиплекс), что позволяет одновременно измерять уровни двух транскриптов.
Увеличение мРНК ЕЕ 8ΜΝ2 и снижение мРНК Δ7 8ΜΝ2 по сравнению с теми, которые находятся в тканях животных, обработанных контролем носителем, определяли с помощью данных ПЦР в режиме реального времени, используя модифицированный ΔΔСΐ метод (как описано в ЕАак апй 8сктШ§еп, Μеΐкοά8, 2001, 25:402-8). Эффективность амплификации (Е) рассчитывали по наклону кривой амплификации индивидуально для ЕЕ 8ΜΝ2, Δ7 8ΜΝ2 и ΘΑΡΌΠ Затем относительные содержания ЕЕ 8ΜΝ2, Δ7 8ΜΝ2 и ΘΑΡΌΠ рассчитывали в виде (1+Е)-с\ где СЧ представляет собой предельное значение для каждого ампликона. Относительные содержания ЕЕ 8ΜΝ2 и Δ7 8ΜΝ2 нормировали к относительному содержанию ΘΑΡΌΠ Потом нормированные относительные содержания ЕЕ 8ΜΝ2 и Δ7 8ΜΝ2 из образцов, обработанных исследуемым соединением, делили на нормированные относительные содержания ЕЕ 8ΜΝ2 и Δ7 8ΜΝ2, соответственно, клеток, обработанных носителем, для определения уровней мРНК ЕЕ 8ΜΝ2 и мРНК Δ7 8ΜΝ2 относительно контроля носителем.
Пример 6. Анализ сплайсинга эндогенной мРНК 8ΜΝ2 методом полуколичественной ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" в тканях животных.
Анализ сплайсинга методом ОТ-ПЦР с детекцией "по конечной точке" использовали для количественного определения уровней мРНК полноразмерного или Δ7 8ΜΝ2 в тканях, отобранных у мышей, обработанных исследуемым соединением.
- 88 029155
Вещества
Вещество
Источник
Ткани, отобранные у мышей с ЗМА, несущих С/С-аллель
Ткани, отобранные у мышей с ЗМА, лишенных экзона 7
Набор ОФадеп НЫеазу Ιίρίά Κίί
Супермикс для ПЦР с Р1аЫпиш Тад ΗίΕί ДНК-полимеразой Набор для ОТ-ПЦР с ферментом ФЗсгФрб ТмФп.бес 96-луночный планшет для ПЦР с полуокантовкой 2% агарозные Е-гели с бромистым этидием с 48-луночными двойными гребенками
Система
документирования
гелей
ТНе Даскзоп ЪаЪогакогу, штамм под номером: 008714 (В6.129Зтп1Ёт5 (зпшЧ/зммг) мгрЪ /
ТНе Даскзоп ЪаЬогакогу, штамм под номером: 005025 (ЕУВ.СдТд(5МЫ2*ае1ка7)4299АНшЬ Тд(3ΜΝ2)89АНшЬ Зтп1ш1Мз0/ 3)
ОФадеп Каталожный номер: 74804
Ы£е ТесНпо1одФез, 1пс. (ранее
1пчФкгодеп) Каталожный номер: 11304016
ВФоНаб Каталожный номер: 170-8890
ЕррепбогЕ Каталожный номер: 951020389
Ы£е ТескпоФодФез, 1пс. (ранее
1пчФкгодеп) Каталожный номер: 68008-02
ВАР 6е1 ООС 1к 310 Тшадгпд зузкеш
Протокол. Мышь, страдающую 8ΜА, с дефицитом С/С-аллеля, обрабатывали с помощью желудочного зонда (ΒΙΌ) в течение 10 дней исследуемыми соединениями в 0,5% НРМС и 0,1% Т\сееп-80. Образцы ткани собирали и быстро замораживали для РНК очистки.
Образцы ткани (20-40 мг) гомогенизировали в лизирующем реагенте ^IАζο1 в течение 2 мин при 20 Гц в гомогенизаторе ТЦкиеЬукег II с использованием одного шарика из нержавеющей стали. После добавления хлороформа гомогенат разделяли на водную и органическую фазы центрифугированием. РНК, отделенную в верхней водной фазе, экстрагировали и добавляли этанол, чтобы обеспечить соответствующие условия связывания. Затем образец наносится на колонку К№аку из набора К№аку ΜίΝ Κίΐ, где общую РНК связывали с мембраной. РНК элюировали в воде, лишенной рибонуклеазы, потом хранили при -20°С.
Продукты сплайсинга 8ΜΝ2 идентифицировали, используя следующие праймеры для амплификации, указанные в табл. 8. Эти праймеры гибридизировали с нуклеотидной последовательностью в экзоне 6 (прямой Ό 8ΜΝ, 8Ε^ ΙΌ № 13) (нуклеотид 22-нуклеотид 46) и экзон 8 (обратный С 8ΜΝ, 8Ε^ ΙΌ № 12), обычными как для мРНК 8ΜΝ1 человека, так и мРНК 8ΜΝ2.
Для синтеза кДНК объединяли 1 мкл раствора РНК (25-50 нг), 4 мкл 5х реакционной смеси 18сг1рТ,
1 мкл обратной транскриптазы и 10 мкл воды и смесь инкубировали при 25°С в течение 5 мин, затем при 42°С в течение 30 мин, потом при 85°С в течение 5 мин. Раствор кДНК хранили при -20°С.
Для выполнения ПЦР с детекцией "по конечной точке", объединяли 5 мкл кДНК, 0,2 мкл 100 мкМ прямого праймера, 0,2 мкл 100 мкМ обратного праймера и 22,5 мкл полимеразного супермикса в 96луночном планшете для ПЦР с полуокантовкой. ПЦР выполняли при следующих температурах в течение указанного времени: стадия 1: 94°С (2 мин), стадия 2: 94°С (30 с), стадия 3: 55°С (30 с), стадия 4: 68°С (1 мин), затем повторяли стадии 2-4 в течение всех 33 циклов, и далее хранили при 4°С.
Таблица 8
Праймер Последовательность Источник
5ΜΝ Прямой δΕβ Ю № 13: АТАТСТССАСАТТСТСТТСАТСАТС РТС1
Ό
5ΜΝ 3Εζ2 Ю № 12: СССТТСАСАТТССАСАТСТСТС РТС1
Обратный С
1Праймеры, синтезированные фирмой РТС Тйегареийск, Шс.
- 89 029155
10 мкл каждого образца ПЦР электрофоретически разделяли на 2% агарозном Е-геле 14 мин, окрашенном дцДНК реагентами для окрашивания (например, бромистый этидий), и визуализировали с помощью системы Ое1 йпадег.
Пример 7. Исследование δтη-белка в культивируемых клетках.
Проводили исследование δтη НТКР (гомогенная флуоресценция с временным разрешением) для количественного определения уровня δтη-белка в клетках фибробластов пациентов с δΜΑ, обработанных исследуемыми соединениями. Результаты анализа приведены в табл. 9.
Вещества
Вещество Источник
протеаз
Анти-ЗМЫ 62
Анти-ЗМЫ криптат
Человеческие 6М03813 (Согбе11 1пзб1бибе)
клетки ЗМА 1 типа
Смесь ингибиторов НосЬе АррЫеб Зсбепсе Каталожный номер: 11836145001
В1ие сар С13Ы0 Каталожный номер:
3ΜΝ
Неб сар С13Ы0 Каталожный номер: 63ЫС0023ΜΝ
Восстанавливающий ЫзЫо Каталожный номер: 63Ιϋ<3002-3ΜΝВиббег
Ыбе ТесЬпободбез, 1пс. (ранее Ычббгодеп) Каталожный номер: 11960-044 20 мМ Трис-НС1 рН 7,5, 150 мМ ЫаС1, 1 мМ ΕΏΤΑ, 1% ΝΡ-40, 1% Дезоксихолат натрия
20 мМ Трис-НС1 рН 7,5, 150 мМ ДаС1
63ЫС002буфер 3ΜΝ ΏΜΕΜ
Лизирующии буфер ΗΙΡΑ
Буфер для разведения Планшет-ридер ЕггЫзгоп
РегЫп Е1тег Мобе! №: 2103
Протокол. Клетки размораживали и культивировали в ΌΜΕΜ-10% ΡΒδ в течение 72 ч. Клетки обрабатывали трипсином, подсчитывали и ресуспендировали до концентрации 25000 клеток/мл в ΌΜΕΜ10% ΡΒδ. Суспензию клеток высевали с концентрацией 5000 клеток на лунку в 96-луночный планшет для микротитрования и инкубировали в течение 3-5 ч. Для обеспечения контрольного сигнала три (3) лунки в 96-луночном планшете не наполняли клетками, и, таким образом, они служили в качестве контрольных лунок с "холостой пробой". Исследуемые соединения последовательно разбавляли 3,16-кратно в 100% ДМСО для построения кривой концентрации по 7 точкам. 1 мкл раствора исследуемого соединения переносили в лунки, содержащие клетки, и клетки инкубировали в течение 48 ч в инкубаторе для клеточных культур (37°С, 5% СО2, 100% относительная влажность). Для каждой концентрации тестируемого соединения использовали три образца. Через 48 ч супернатант удаляли из лунок и в лунки добавляли 25 мкл лизирующего буфера ΚΙΡΑ, содержащего ингибиторы протеазы, и инкубировали при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляли 25 мкл разбавителя, а затем 35 мкл полученного лизата переносили в 384-луночный планшет, где каждая лунка содержала 5 мкл раствора антител (1:100 разведение анти-δΜΝ Ό2 и криптата анти-δΜΝ в δΜΝ восстанавливающем буфере). Планшет центрифугировали в течение 1 мин, чтобы довести раствор до дна лунок, а затем инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Флуоресценцию для каждой лунки планшета измеряли при 665 нм и 620 нм на планшете-ридере Μи1ΐ^^аЬе1 (Регкт-В1тег).
Нормированный сигнал флуоресценции рассчитывали для каждой лунки с образцом, с "холостой пробой" и с контролем носителем, путем деления сигнала при 665 нм на сигнал при 620 нм. Нормировали значения сигнала для возможного ослабления флуоресценции в связи с влиянием матрицы лизата. Значение ΔΡ (измерение относительного содержания белка δтη в виде процентной величины) для каждой лунки с образцом вычисляли путем вычитания нормированной средней флуоресценции для контрольных лунок с "холостой пробой" из нормированной флуоресценции для каждой лунки с образцом, затем делили эту разность на нормированную среднюю флуоресценцию для контрольных лунок с "холостой пробой" и умножали полученное значение на 100. Значение ΔΡ для каждой лунки с образцом представляет собой относительное содержание белка δтη образцов, обработанных исследуемым соединением. Значение ΔΡ каждой лунки с образцом делили на значение ΔΡ для лунок с контролем носителем для вычисления кратного увеличения относительного содержания белка δтη по отношению к контролю носителем.
Результаты. Как показано на фиг. 6, фибробласты пациента, страдающего δΜΑ 1 типа, обработанные соединением 5 (фиг. 6а) и соединением 27 (фиг. 6Ь), показывают зависимое от дозы увеличение экспрессии белка δтη, что определено в анализе δΜΝ НТКР.
Для соединений формулы (I) или их формы, описанных в настоящем документе, в табл. 9 представ- 90 029155
лено значение ЕС1.5х для экспрессии белка 8тп, которое было получено из данных концентрации по 7 точкам, полученных для каждого исследуемого соединения в соответствии со способом, описанным в биологическом примере 7. Термин "ЕС1.5х для экспрессии белка 8шп" определяется как концентрация тестируемого соединения, которая является эффективной в повышении продуцирования в 1,5 раза количества белка 8тп в фибробластах пациента, страдающего 8ΜΑ, по сравнению с количеством, полученным с ДМСО-контролем носителем. Значение ЕС1.5х для экспрессии белка 8тп, находящееся в пределах >3 мкМ и <10 мкМ, обозначается одной звездочкой (*), ЕС1.5х в пределах >1 мкМ и <3 мкМ обозначается двумя звездочками (**), в пределах ЕС1.5х >0,3 мкМ и <1 мкМ обозначается тремя звездочками (***), и ЕС1.5х <0,3 мкМ обозначается четырьмя звездочками (****).
Таблица 9
Для соединений формулы (I) или их формы, описанных в настоящем документе, в табл. 10 представлена максимальная кратность (Ρο1ά) увеличения белка 8тп, полученная из данных графика концентрации, построенного по 7 точкам, полученных для каждого исследуемого соединения в соответствии с процедурой, описанной в биологическом примере 7. Значение максимального кратного увеличения, составляющее <1,2, обозначается одной звездочкой (*), кратное увеличение в пределах >1,2 и <1,35 обозначается двумя звездочками (**), кратное увеличение в пределах >1,35 и <1,5 обозначается тремя звездочками (***), кратное увеличение в пределах >1,5 и <1,65 обозначается четырьмя звездочками (****), и кратное увеличение >1,65 обозначается пятью звездочками (*****).
- 91 029155
Таблица 10
Соединение Кратность Соединение Кратность Соединение Кратность
1 А А А 50 А А А А А 99 ААА
2 А А А А А 51 А А 100 ААА
3 А А А 52 А 101 АААА
4 А А 53 ААА 102 А А А А А
5 А А А А 54 АААА 103 АААА
6 А А 55 ААА 104 А А
7 А 56 А А 105 ААА
8 А А А А А 57 А А 106 ААА
9 А 58 АААА 107 АААА
10 ААА 59 АААА 108 АААА
11 А 60 ААА 109 АААА
12 ААА 61 АААА 110 АААА
13 ААА 62 АААА 111 ААА
14 А 63 АААА 112 ААА
15 А А 64 АААА 113 АААА
16 А 65 АААА 114 АААА
17 ААА 66 ААА 115 ААА
18 А 67 АААА 116 ААА
19 А А 68 АААА 117 АААА
20 А 69 А А А А А 118 ААА
21 А 70 ААА 119 АААА
22 АААА 71 А А 120 ААА
23 А А 72 АААА 121 ААА
24 А А 73 ААА 122 АААА
25 ААА 74 АААА 123 АААА
26 А А 75 АААА 124 АААА
27 АААА 76 А А А А А 125 А А А А А
28 ААА 77 А А А А А 126 ААА
29 ААА 78 А А А А А 127 АААА
30 ААА 79 А А А А А 128 А А А А А
31 А А 80 АААА 129 А А А А А
32 ААА 81 А А А А А 130 ААА
33 ААА 82 АААА 131 ААА
34 ААА 83 АААА 132 А А
35 А А 84 А А А А А 133 ААА
36 АААА 85 А А 134 ААА
37 ААА 86 А А 135 А А А А А
38 А А А А А 87 А А А А А 136 ААА
39 АААА 88 АААА 137 АААА
40 А А 89 АААА 138 АААА
41 А А 90 А А А А А 139 АААА
42 А А 91 А А А А А 140 АААА
43 АААА 92 АААА 141 АААА
44 ААА 93 ААА 142 АААА
45 АААА 94 АААА 143 АААА
46 АААА 95 А А А А А 144 АААА
47 А А А А А 96 ААА 145 АААА
48 АААА 97 АААА 146 АААА
49 АААА 98 АААА
92
029155
Пример 8. Исследование количества спеклов (8тп-зависимое количество ядерных спеклов).
Уровень белка 8тп прямо коррелирует с количеством ядерных фокусов, также известных как спеклы, продуцируемых при окрашивании клетки флуоресцентно мечеными анти-8ΜN антителами (I ли апС ЭгеуШзз, ЕЫВО I., 1996, 15:3555). Спеклы являются мультибелковыми комплексами, чья структура включает ядро посредством белка 8тп, и для оценки уровня белка 8тп в клетке используют исследование количества спеклов. Как описано в настоящем документе, исследование количества спеклов используют для количественного определения уровня белка 8тп в фибробластах пациентов, страдающих 8ΜΑ, обработанных исследуемым соединением.
Вещества
Вещество Источник
Человеческие клетки
ЗМА 1 типа 6М03813 (СоггеИ 1пзЫбибе)
Мышиное первичное
анти-ЗМЫ антитело Згдта Каталожный номер: 32944
клон 2В1
Анти-мышиное вторичное антитело А1еха В1иог 555 Ы£е ТесПпо1од1ез, 1пс. (ранее 1пч1£годеп) Каталожный номер: А21422
Альбумин бычьей сыворотки(ВЗА) Згдша Каталожный номер: А3294
4% Параформальдегид Е1есЬгоп М1сгозсору Зс1епсез Каталожный номер: 15710
Бортезомиб ЬС ЬаЬз, Каталожный номер: В-1408
0,05% ТгФбоп Х-100 31дта Каталожный номер: 93443 (100 мл)
Заливочная среда-
РгоЪопд 6о1б АпЫРабе Ы£е ТесПпо1од1ез, 1пс. (ранее
реагент с красителем Ιηνί-Ьгодеп) СаЬа1од №№: Р7481 : и Р36935
ΏΑΡΙ (ДАПИ)
22x22 #1 стерильные покровные стекла ПзПег Каталожный номер : 12-548-В
Ы£е ТесПпо1од1ез, 1пс. (ранее
ΏΜΕΜ 1пч1Ьгодеп) Каталожный номер: 11960-
044
РВЗ (физиологический Ы£е ТесПпо1од1ез, 1пс. (ранее
раствор с фосфатным 1пч1Ьгодеп) Каталожный номер: 10010-
буфером) 031
Прозрачный лак для ногтей Флуоресцентный Р.еч1оп Ьгапб Каталожный номер: 1271-76
микроскоп Ζθ133 гегзз
Ахочегб 135
Протокол. Клетки размораживали и инкубировали в ^ΜЕΜ-10% ЕВ8 в течение 72 ч, затем обрабатывали трипсином, подсчитывали и ресуспендировали до 100000 клеток/мл в ^ΜЕΜ-10% ЕВ8. Суспензию клеток (2 мл) помещали в 6-луночный планшет для клеточных культур со стерильным покровным стеклом и инкубировали в течение 3-5 ч. Исследуемые соединения последовательно 3,16-кратно разбавляли в 100% ДМСО для построения кривой разбавления по 7 точкам. 10 мкл тестируемого соединения раствора добавляли в каждую лунку, содержащую клетки, и инкубировали в течение 48 ч в инкубаторе для клеточных культур (37°С, 5% СО2, относительная влажность 100%). Дубликаты создавали для каждой концентрации тестируемого соединения. Клетки, содержащие ДМСО при конечной концентрации 0,5%, использовали в качестве контролей.
Среду для культивирования клеток аспирировали из лунок, содержащих покровные стекла, и осторожно промывали три раза холодным РВ8. Клетки фиксировали путем инкубации в параформальдегиде в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем клетки промывали два раза холодным РВ8 с последующей инкубацией в течение 5 мин при комнатной температуре с 0,05% Τπΐοη Х-100 в РВ8 для пермеабилизации клеток. После того как фиксированные клетки промывали три раза холодным РВ8, их блокировали 10% ЕВ8 в течение 1 ч. Добавляли 60 мкл первичного антитела, разведенного 1:1000 в блокирующем буфере, и смесь инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Клетки промывали три раза РВ8 и добавляли 60 мкл вторичного антитела, разведенного 1:5000 в блокирующем буфере, потом смесь инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Покровные стекла устанавливали в
- 93 029155
слайды с помощью заливочной среды и оставляли сохнуть в течение ночи. Лак наносили на боковые стороны покровного стекла и слайды хранили в защищенном от света месте. Использовали объектив Ζϋΐδδ АхоуеЛ 135 с 63х Р1ап-Аросйгота1, ΝΑ=1,4 для детекции и подсчета с помощью иммунофлюоресценции. Подсчитывали количество спеклов на >150 ядер и вычисляли % активации, используя ДМСО и 10 нМ бортезомиб в качестве контроля. Для каждого исследуемого соединения клетки испытывали при всех длинах волн для идентификации исследуемых соединений с присущей флуоресценцией.
Результаты. Как показано на фиг. 7, клетки пациентов, страдающих 8ΜΑ 1 типа, обработанные соединением 5, содержат прогрессивно больше спеклов, чем клетки, обработанные ДМСО.
Пример 9. Исследование белка 8тп в двигательных нейронах человека.
Для количественного определения уровня белка 8тп в двигательных нейронах человека, обработанных исследуемыми соединениями, использовали иммунофлуоресцентную конфокальную микроскопию 8тп.
Протокол. Двигательные нейроны человека, полученные из индуцированных плюрипотентных 8ΜΑ клеток (ЕЬег1 е1 а1., №1иге, 2009, 457:277; и КиЫп е1 а1., ВΜС Вю1о§у, 2011, 9:42), обрабатывали исследуемым соединением в различных концентрациях в течение 72 ч. Уровень белка 8тп в ядре клетки практически количественно определяли посредством иммуноокрашивания 8тп и конфокальной флуоресцентной микроскопии, как описано в УакКоЛоуа е1 а1., №1иге Сйетюа1 Вю1о§у, 2011, 7:544. Уровень белка 8тп в образцах, обработанных соединением, нормировали к уровню в образцах, обработанных носителем, и строили график в виде функции концентрации соединения.
Пример 10. Исследование белка 8тп в тканях животных.
Для количественного измерения уровня белка 8тп в тканях мышей использовали исследования белка 8тп методом НТКЕ.
Вещества
Вещество
Источник
Ткани, отобранные у мышей с ЗМА, несущих С/С-аллель
Ткани, отобранные у страдающей ЗМА мыши с дефицитом экзона 7
Смесь ингибиторов
протеаз
Анти-ЗМЫ 62
Анти-ЗМЫ криптат
Тйе Даскзоп ЬаЬогакогу, штамм под номером: 008714 (В6.129ЗШП1 Ёт5 <3тп 1 /5ΜΝ2> МгрЬ / )
Тйе Даскзоп ЬаЬогайогу, штамм под номером: 005025 (ЕУВ.СдТд(ЗМЫ2*бе1йа7)4299АйшЬ Тд (3ΜΝ2 ) 8 9АйшЬ Зтп1 αηΐΜζά/^
Носке АррИеб Зс1епсе Каталожный
номер: 11836145001
В1ие сар С1зЫо Каталожный номер:
63ЮС002-ЗМЫ
Неб сар С1зЫо Каталожный номер: 63ЮС002-ЗМЫ
Восстанавливающий буфер СгзЫо Каталожный номер: 63ЮС0023ΜΝ
ЗМЫ-Ви££ег
Лизирующий буфер ΗΙΡΑ 20 мМ Трис-НС1 рН 7,5, 150 мМ ЫаС1,
1 мМ ΕΏΤΑ, 1% ΝΡ-40, 1% Дезоксихолат
Буфер для разведения
натрия
20 мМ Трис-НС1 рН 7,5, 150 мМ ЫаС1
- 94 029155
Набор для анализа содержания белков с использованием ВСА (бицинхониновой кислоты) Белый 384-луночный
планшет
Планшет с У-образным дном из полипропилена Прозрачный 96-луночный планшет из полистирола 5-мм шарики из нержавеющей стали Пробирки За£е-Ьоск ТиЬез 2,0 мл
96-луночный планшет для ПЦР с полуокантовкой ΤΜΐη.бес
Гомогенизатор
ТбззиеЬугег II
Планшет-ридер Епчгзгоп
Ргегсе Каталожный номер: 23225
Ыипс Каталожный номер: 351190
Га1соп Каталожный номер: 165195
Ыипс Каталожный номер: 442404
Сщадеп Каталожный номер: 6998 9
Еррепбогб Каталожный номер: 022363352
Еррепбогб Каталожный номер: 951020389
Суадеп Каталожный номер: 8 5300
РегЫп Е1шег номер модели: 2103
Протокол. Взвешивали образцы ткани в пробирках 8а£е-Ьоск ТиЪе8 и добавляли объем буфера ΚΙРА, содержащего смесь ингибиторов протеаз в зависимости от соотношений массы к объему для каждого типа ткани: головного мозга (50 мг/мл), мышечной (50 мг/мл) и спинного мозга (25 мкг/мл).
Ткани гомогенизировали с помощью гомогенизатора Т^88ие^уζе^ на шаровой мельнице. К образцу добавляли 5-мм шарики из нержавеющей стали и энергично встряхивали в течение 5 мин при 30 Гц в гомогенизаторе Т^88ие^уζе^. Затем образцы центрифугировали в течение 20 мин при 14000хд в микроцентрифуге и гомогенаты переносили в ПЦР планшет. Гомогенаты разбавляли в буфере ЫРА приблизительно до 1 мг/мл для НТКТ и приблизительно 0,5 мг/мл для измерения общего белка с использованием ВСА белкового анализа. Для анализа δΜΝ методом НТКР в 384-луночный планшет переносили 35 мкл гомогената ткани, содержащего 5 мкл раствора антител (разведение 1:100 каждого анти-δΜN42 и антиδΜΝ криптата в восстанавливающем буфере). Для обеспечения сигнала контроля три (3) лунки в планшете содержали только лизирующий буфер ЫРА и, таким образом, служили в качестве контрольных лунок с "холостой пробой". Планшет центрифугировали в течение 1 мин, чтобы довести раствор до дна лунок, а затем инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Флуоресценцию для каждой лунки планшета измеряли при 665 нм и 620 нм на планшете-ридере Μи1ί^^аЪе1 (Регкт-Е1тег). Весь белок в гомогенате ткани измеряли с помощью ВСА исследования в соответствии с протоколом производителя.
Нормированный сигнал флуоресценции вычисляли для каждой лунки с образцом, "холостой пробой" и контролем носителем, также путем деления сигнала при 665 нм на сигнал при длине волны 620 нм. Осуществляли нормализацию значений сигнала для возможного ослабления флуоресценции вследствие матричного эффекта гомогената ткани. Значение ΔΡ (измерение относительного содержания белка δтη, выраженного в процентах) для каждой лунки с образцом ткани вычисляли путем вычитания нормированной средней флуоресценции для контрольных лунок с «холостой пробой» из нормированной флуоресценции для каждой лунки с образцом ткани, затем делением этой разницы на нормированную среднюю флуоресценцию для контрольных лунок с «холостой пробой», и умножением полученного значения на 100. Значение ΔΡ для каждой лунки с образцом ткани делили на общее количество белка (определено с помощью исследования с ВСА) для этого образца ткани. Изменение относительного содержания белка δтη в каждом образце ткани относительно контроля носителем вычисляли как выраженную в процентах разность значения ΔΡ образца ткани в присутствии тестируемого соединения и среднего значения ΔΡ сигнала контроля носителем, деленную на среднее значение ΔΡ сигнала контроля носителем.
Пример 11. Исследование белка δтη в тканях взрослых мышей, страдающих δΜΑ с С/С-аллелем.
Образцы ткани, используемые для количественной оценки белка δΜΝ у взрослой мыши, страдающей δΜΑ с дефицитом С/С-аллеля, получали, как описано в примере 10. С помощью исследования определяли, увеличивает ли лечение с использованием исследуемых соединений в течение 10 дней у мышей, страдающих δΜΑ с дефицитом С/С-аллеля, уровни белка δтη, продуцируемого мышиным геном δΜΝ2 и гибридным геном δтη1-δΜN2.
- 95 029155
Вещества
Вещество Источник
Ткани, отобранные у мышей ТНе Ласкзоп ЪаЬогакогу, штамм под с 5МА, несущих С/С-аллель номером: 008714 (В6.1295шп 1Ёт5 ($тп 1 /5ΜΝ2> мгрь / д)
Протокол. Страдающим 8ΜΑ мышам с дефицитом С/С-аллеля вводили перорально два раза в день дозы (в 0,5% НРМС с 0,1% Τ\\ραοι-80) исследуемого соединения или носителя при 10 мг/кг в течение 10 дней. Подобранным по возрасту гетерозиготным мышам вводили дозы носителя для использования в качестве контроля. Ткани собирали для анализа уровней белка в соответствии с примером 10.
Результаты. Как показано на фиг. 8, уровень 8тп, нормализованный к общему белку, относительно группы с носителем, повышался в головном мозге, спинном мозге и мышечной ткани, отобранной у взрослой страдающей 8ΜΑ мыши с дефицитом С/С-аллеля, обработанной соединением 5 при дозе 50 мг/кг два раза в день в течение 10 дней.
Пример 12. 8тп белок в тканях неонатальных мышей с Δ7 8ΜΑ.
Образцы ткани, используемые для количественной оценки белков у неонатальных Δ7 8тп мышей, страдающих 8ΜΑ, получали способом, описанным в примере 10. С помощью исследования определяли, повышает ли лечение неонатальных Δ7 мышей, страдающих 8ΜΑ, исследуемым соединением в течение 7 дней, уровни белка 8тп, продуцируемого геном 8ΜΝ2.
Вещества
Вещество Источник
Ткани, отобранные у страдающей 5МА мыши с дефицитом экзона 7
ТЬе Ласкзоп ЪаЬогакогу, штамм под номером: 005025 (ЕУВ.СдТд(3ΜΝ2*άβ1ίβ7)4299АЬшЬ Тд(3ΜΝ2)89АЬшЬ 5ιτιη1ίΙπ1ΜΞά/ Л)
Протокол. Гомозиготным нокаутным Δ7 мышам, страдающим 8ΜΑ, внутрибрюшинно (ΊΡ) вводили один раз в день (ОЮ) дозы исследуемого соединения или носителя (100% ДМСО), начиная с послеродового дня (РЖ)) 3 до дня 9. Ткани собирали для анализа уровней белка в соответствии с примером 10.
Результаты. Как показано на фиг. 9, уровень общего нормализованного белка 8тп повышался в зависимости от дозы в тканях головного мозга (фиг. 9а), спинного мозга (фиг. 9Ь) и мышц (фиг. 9с) новорожденных гомозиготных Δ7 мышей, страдающих 8ΜΑ, обработанных соединением 27.
Пример 13. Вес тела неонатальных Δ7 мышей, страдающих 8ΜΑ.
Изменение веса тела неонатальных Δ7 мышей, страдающих 8ΜΑ, использовали для определения того, улучшает ли лечение тестируемым соединением вес тела.
Вещества
Вещество Источник
Ткани, отобранные у мыши с дефицитом экзона 7, страдающей ЗМА
ТЬе Ласкзоп ЬаЬогакогу, штамм под номером: 005025 (ЕУВ.СдТд(5МЫ2*ае1ка7)4299АЬшЬ Тд(3ΜΝ2)89АЬшЬ 5ιηη1ίιη1ΜΞά/ Л)
Протокол. Гомозиготным нокаутным Δ7 мышам, страдающим 8ΜΑ, вводили интраперитонеально исследуемое соединение или носитель (100% ДМСО) один раз в день, начиная с послеродового дня 3 и до тех пор, пока режим дозирования не изменится на пероральное введение дозы дважды в день в 0,5% НРМС с 0,1% Твин-80 при дозе в 3,16 раза выше, чем доза, используемая для интраперитонеального введения. Вес тела Δ7 мышей, страдающих 8ΜΑ, обработанных исследуемым соединением или носителем, и возраст гетерозиготных мышей регистрировали каждый день.
Пример 14. Условный рефлекс у неонатальных Δ7 мышей, страдающих 8ΜΑ.
Функциональное изменение рефлекса неонатальных Δ7 мышей, страдающих 8ΜΑ, использовали для определения того, улучшает ли лечение с использованием исследуемого соединения условный рефлекс.
Вещества
Вещество
Ткани, отобранные у мыши с дефицитом экзона 7, страдающей ЗМА
Источник
ТЬе Ласкзоп ЪаЬогакогу, штамм под номером: 005025 (ГУВ.СдТд (ЗМЫ2*с1е1ка7) 4299АЬшЬ Тд(3ΜΝ2) 89АЬтЬ 5тп1^1м^/^
- 96 029155
Протокол. Гомозиготным нокаутным Δ7 мышам, страдающим 8ΜΑ, интраперитонеально вводили дозы исследуемого соединения или носителя (100% ДМСО) один раз в день, начиная с послеродового дня 3 и до тех пор, пока режим дозирования не изменится на пероральное введение дозы дважды в день в 0,5% НРМС с 0,1% Твин-80 в дозе в 3,16 раза выше, чем доза, используемая для интраперитонеального введения. Время условного рефлекса определяли как время, необходимое мыши для переворота со спины на лапы. Время условного рефлекса измеряли пять раз для каждой мыши (предоставляя максимальное время, равное 30 с, для каждой попытки) с 5 мин между каждым измерением. Время условного рефлекса для гомозиготных нокаутных Δ7 мышей, страдающих 8ΜΑ, обработанных исследуемым соединением или носителем и подобранных по возрасту гетерозиготных мышей измеряли в послеродовой день 10, 14 и 18 и откладывали на графике.
Пример 15. Выживание неонатальных Δ7 мышей, страдающих 8ΜΑ.
Изменение числа выживших мышей в течение времени использовали для определения того, улучшает ли лечение с помощью исследуемого соединения выживаемость.
Вещества
Вещество Источник
Ткани, отобранные у мыши, страдающей 5МА с дефицитом экзона 7
ТЬе Ласкзоп ЪаЬогаТогу, штамм под номером: 005025 (ГУВ.СдТд (5МЫ2*с1е1ба7) 4299АЬшЬ Тд (8ΜΝ2) 8 9АЬшЬ
Зшп1ш1Мзс}/ й)
Протокол. Гомозиготным нокаутным Δ7 мышам, страдающим 8ΜΑ, интраперитонеально вводили дозы исследуемого соединения или носителя (100% ДМСО) один раз в день, начиная с послеродового дня 3 и до тех пор, пока режим дозирования не изменяли на пероральное введение дозы дважды в день в 0,5% НРМС с 0,1% Твин-80 в дозе в 3,16 раза выше, чем доза, используемая для интраперитонеального введения, а затем режим дозирования изменяли на пероральное введение дозы один раз в день в 0,5% НРМС с 0,1% Твин-80 в дозе в 6,32 раза выше, чем доза, используемая для интраперитонеального введения. Количество выживших мышей в каждой группе регистрировали каждый день, и их наносили на график в виде процента от общего количества мышей.
Пример 16. Полуколичественный ОТ-ПЦР анализ сплайсинга мРНК минигена Ηит8ΜN1 с детекцией "по конечной точке" в культивируемых клетках.
Для визуализации и количественной оценки уровней мРНК полноразмерного и Δ7 минигена 8ΜΝ1 человека в первичных клетках и клеточных линиях, экспрессирующих человеческие 8ΜΝ1 конструкции минигена, обработанных исследуемым соединением, использовали анализ методом ОТ-ПЦР.
Вещества
Вещество Источник
Клетки НЕК293Н
Лизирующий буфер Се11з-То-СД
Липидный реагент для трансфекции ЕиСЕДЕ-б
РМЕМ
96-луночные планшеты
с плоским дном
Супермикс для ПЦР с Р1аДФпит Тац ΗίΕί ДНК-полимеразой Набор для ОТ-ПЦР с ферментом 13сг1рД 2% Агарозные Е-гели с бромистым этидием с 48-луночными двойными гребенками
Система
документирования
гелей
Ы£е ТесЬпо1одФез, 1пс. (ранее 1пч1Дгодеп) Каталожный номер: 11631017
Ы£е ТесПпо1од1ез, 1пс. (ранее использовалось название В1озузДетз) Каталожный номер: 4399002
КосНе АррИеб ЗсФепсе, Каталожный номер: 11 814 443 001 Ы£е ТесПпо1одФез, 1пс. (ранее Ιηνί-Ьгодеп) Каталожный номер: 11960044
ВесДоп РФскДпзоп Каталожный номер: 353072
ЫДе ТесПпо1од1ез, 1пс. (ранее
1пчШгодеп) Каталожный номер: 11304016
ВДоКаб Каталожный номер: 170-8890
ЫДе ТесПпо1од1ез, 1пс. (ранее
1гЫДгодеп) Каталожный номер: 08008-02
РЛ/Р Се1 РОС 1Д 310 1тадФпд зузДет
- 97 029155
Конструкция минигена 3ΜΝ1. Получение конструкции минигена.
Использование процедуры получения конструкции минигена 3ΜΝ2 описано в биологическом примере 1, и вариант минигена 3ΜΝ1 синтезировали путем замены шестого нуклеотида в экзоне 7 (тиминовый остаток) конструкции минигена 3ΜΝ2-Α на цитозин, используя сайт-направленный мутагенез. Таким образом, аналогично конструкции минигена 3ΜΝ2-Α, конструкция минигена 3ΜΝ1 имеет один адениновый остаток, вставленный после нуклеинового остатка 48 экзона 7. Конструкция минигена 3ΜΝ1 называется 3ΜΝ1-Α.
Протокол. Клетки НЕК293Н (клетки 10000/лунка/199 мкл) трансфицировали, используя реагент ΡπΟΕΝΕ-6 в 96-луночном планшете с 15 нг репортерной плазмиды с минигеном 3ΜΝ1-Α на лунку. Клетки инкубировали в течение 24 ч после трансфекции. Исследуемые соединения серийно разводили в 3,16 раза в 100% ДМСО для построения кривой концентрации по 7 точкам. В каждую лунку для анализа добавляли раствор исследуемого соединения (1 мкл, 200х в ДМСО). В каждую контрольную лунку добавляли 1 мкл ДМСО. Планшет инкубировали в течение 7 ч в инкубаторе для клеточных культур (37°С, 5% СО2, 100% относительной влажности). Затем клетки лизировали в лизирующем буфере Сейз-ТО-О:, и лизаты хранили при -80°С.
Две сплайсированные мРНК Зти синтезировали на основе минигена 3ΜΝ1. Термин "миниген РБ 3ΜΝ1" относится к первому сплайсированному продукту, содержащему экзон 7, соответствующему мРНК полноразмерного 3ΜΝ1. Термин "миниген Δ7 3ΜΝ1" относится ко второму продукту, лишенному экзона 7.
мРНК минигена РЕ 3ΜΝ1 и минигена Δ7 3ΜΝ1 амплифицировали, используя праймеры, описанные в табл. 11. Прямой праймер 3ΜΝ С (3ЕЕ) II) № 11) гибридизировали с нуклеотидной последовательностью в экзоне 6 (нуклеотид 43-нуклеотид 63), обратный праймер 3ΜΝ Α (3ЕР ГО № 2) гибридизировали с нуклеотидной последовательностью в кодирующей последовательности люциферазы светлячка. Сочетание двух олигонуклеотидов обнаруживает только минигены 3ΜΝ1 или 3ΜΝ2 (ОТ-ПЦР) и не обнаруживает эндогенные гены 3ΜΝ2 или 3ΜΝ1. Поскольку клетки НЕК293Н, используемые в примере 16, трансфицировали только минигеном 3ΜΝ1 человека, ОТ-ПЦР может визуализировать и количественно оценить только мРНК минигена РБ 3ΜΝ1 и минигена Δ7 3ΜΝ1.
Т аблица 11
Праймер Последовательность Источник
3ΜΝ Прямой С 5Е0 Ю № 11: САТССТСАТССТТТСССААСТ РТС* 1
3ΜΝ Обратный Α 5Ες Ю № 2: СССТТСАСАТТССАСАТСТСТС РТС1
1Праймеры, синтезированные фирмой РТС ТЕегареийсз, 1ис.
Для синтеза кДНК объединяли 5 мкл лизата, 4 мкл 5х реакционной смеси 13спр1, 1 мкл обратной транскриптазы и 10 мкл воды и инкубировали 5 мин при 25°С, затем 30 мин при 42°С и далее 5 мин при 85°С. Раствор кДНК хранили при -20°С.
Для выполнения ПЦР с детекцией "по конечной точке" 5 мкл кДНК, 0,2 мкл 100 мкМ прямого праймера, 0,2 мкл 100 мкМ обратного праймера и 22,5 мкл полимеразного супермикса объединяли в 96луночном планшете для ПЦР с полуокантовкой. ПЦР выполняли при следующих температурах в течение указанного времени: стадия 1: 94°С (2 мин), стадия 2: 94°С (30 с), стадия 3: 55°С (30 с), стадия 4: 68°С (1 мин), затем повторяли стадии 2-4 в течение всех 33 циклов и затем содержали при 4°С.
10 мкл каждого образца ПЦР электрофоретически разделяли в течение 14 мин на 2% агарозном Егеле, окрашенном дцДНК реагентами для окрашивания (например, бромистый этидий), и визуализировали с помощью системы Ое1 1ша§ег.
Результаты. Как показано на фиг. 10, клетки, обработанные повышенными концентрациями соединения 5 (фиг. 10а) и соединения 27 (фиг. 10Ъ), содержат прогрессирующе больше мРНК минигена РБ 3ΜΝ1 и меньше мРНК минигена Δ7 3ΜΝ1, что указывает на коррекцию альтернативного сплайсинга 3ΜΝ1.
Без учета того, был ли документ, приведенный в настоящем документе, конкретно и индивидуально включен посредством ссылки, все документы, указанные в настоящем документе, включены посредством ссылки в настоящую заявку для любых и всевозможных целей в той же степени, как если бы каждая отдельная ссылка была бы полностью приведена в настоящем документе.
Хотя некоторые варианты осуществления были описаны подробно выше, специалистам с обычной квалификацией в данной области техники будет ясно, что в вариантах осуществления возможны многие модификации без отхода от их идей. Все такие модификации включены в формулу изобретения, как описано в настоящем документе.

Claims (10)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Соединение формулы (11а1) или формулы (111а1)
    - 98 029155
    или его фармацевтически приемлемая соль, где
    К1 представляет собой гетероциклил, выбранный из пиперазинила, 1,4-диазепанила, (18,48)-2,5диазабицикло[2.2.1]гептила, и где гетероциклил необязательно замещен одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из С1-8алкила, галоген-С1-8алкила, гидрокси-С1-8алкила, гидроксибензила или С1-8алкоксикарбонила;
    К2 представляет собой гетероарил, выбранный из 1,3-бензотиазолила, 1,3-тиазолила, 1,3бензоксазолила, имидазо[1,2-а]пиридинила, имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазолила, имидазо[1,2-а]пиримидинила, пиразоло[1,5-а]пиридинила, имидазо[1,2-а]пиразинила; и где гетероарил необязательно замещен одним или двумя заместителями, независимо выбранными из С1-8алкила или галоген-С1-8алкила;
    Ка представляет собой водород; и
    КЬ представляет собой водород.
  2. 2. Соединение по п.1, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид, гидробромид, гидрохлорид, дигидрохлорид, ацетат или соль трифторуксусной кислоты.
  3. 3. Соединение формулы (11а1) или формулы (111а1), выбранное из группы, включающей
    3-(1,3 -бензотиазол-2-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [2,3 -Ь] пиридин-2-он;
    3-(4-хлор-1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[4-(2-хлорэтил)пиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(4-хлор-1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(4-хлор-1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[4-(2-гидроксибензил)пиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин2-он;
    трет-бутил 4-[3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-2-оксо-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-7-ил]пиперазин-1-карбоксилат;
    трет-бутил 4-[3-(4-хлор-1,3-бензотиазол-2-ил)-2-оксо-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-7-ил]пиперазин-1карбоксилат;
    3-(4-хлор-1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [3,2-с]пиридин-2-он;
    3-(4-хлор-1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2он;
    3-(4-хлор-1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-2-он;
    3-(4-хлор-1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(4-хлор-1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(4-пропилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-2-он;
    3-(4-метил-1,3-тиазол-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-(пиперазин-1-ил)-3-[4-(трифторметил)-1,3-тиазол-2-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(1,3 -бензотиазол-2-ил)-7-(4-этилпиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [2,3 -Ь] пиридин-2-он;
    3-(1,3 -бензотиазол-2-ил)-7-(4-пропилпиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [2,3 -Ь] пиридин-2-он;
    3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-(4-этилпиперазин-1-ил)-3-(4-метил-1,3-тиазол-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(4-метил-1,3-тиазол-2-ил)-7-(4-пропилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(4-хлор-1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[4-(2,3-дигидроксипропил)пиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    3-(4-хлор-1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[4-(2,3-дигидроксипропил)пиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2он;
    3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-(1,4-диазепан-1 -ил)-3 -(имидазо [ 1,2-а]пиримидин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(4-хлор-1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(1,4-диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-2-он;
    3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-2-он;
    3-(8-хлор-6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[3,2-с]пиридин-2-он;
    - 99 029155
    3 -(имидазо [ 1,2-а]пиримидин-2-ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1 -ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3 -(4-хлор- 1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1 -ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он; 3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3 -(7-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он; 3 -(7-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [3,2-с]пиридин-2-он;
    3 -(2-метилимидазо [2,1 -Ь] [ 1,3]тиазол-6-ил)-7 -(пиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [3,2-с]пиридин-2-он;
    3 -(имидазо [1,2-а] пиридин-2 -ил) -7-(пиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [3,2-с] пиридин-2 -он;
    3-(5-метилпиразоло[1,5-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3 -(8-хлоримидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(1,4-диазепан-1 -ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2он;
    3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2он;
    3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(1,4-диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3 -(1,3-бензоксазол-2-ил)-7 -(1,4-диазепан-1 -ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он; 7-(4-метилпиперазин-1-ил)-3-(5-метилпиразоло[1,5-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2он;
    3 -(имидазо [2,1-Ь][1,3] тиазол-6 -ил) -7-(4 -метилпиперазин-1 -ил) -2Н -пирано [2,3-Ь] пиридин-2 -он;
    3 -(2-метилимидазо [2,1 -Ь] [ 1,3]тиазол-6-ил)-7 -(4-метилпиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [3,2-с]пиридин-2он;
    3 -(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1 -ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3 -(7-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [3,2-с]пиридин-2-он;
    3 -(7-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3 З)-3 -метилпиперазин-1-ил] -2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин2-он;
    3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(2З)-2-метилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин2-он;
    7-[(3К,5З)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин2-он;
    7-[(3 З)-3,4-диметилпиперазин-1 -ил] -3 -(7-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-[(2З)-2,4-диметилпиперазин-1-ил]-3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(2З)-2-метилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2он;
    3 -(8-фторимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3 З)-3 -метилпиперазин-1 -ил] -2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2он;
    7-(1,4-диазепан-1-ил)-3 -(7-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-(1,4-диазепан-1-ил)-3 -(6-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он; 7-[(3К,5З)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    7-[(2З)-2,4-диметилпиперазин-1 -ил] -3 -(8-фторимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-[(3 З)-3,4-диметилпиперазин-1 -ил] -3 -(8-фторимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3 -(4-хлор- 1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[(3К,5З)-3,5-диметилпиперазин-1-ил] -2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин2-он;
    3-(4-хлор-1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[(3К,5З)-3,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3 -(6-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3 З)-3 -метилпиперазин-1-ил] -2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин2-он;
    3 -(6-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3К)-3 -метилпиперазин-1 -ил] -2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин2-он;
    7-[(3З)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-[(3К)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-[(3К,5З)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    - 100 029155
    3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3К,5§)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    7-[(3К,5§)-3,5-диметилпиперазин-1-ил] -3 -(имидазо [ 1,2-а]пиримидин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3§)-3-метилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он; 3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3К)-3-метилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он; 7-[(3 §)-3,4-диметилпиперазин-1 -ил] -3 -(имидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2он;
    7-[(3К)-3,4-диметилпиперазин-1-ил] -3 -(имидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2он;
    3-(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6-ил)-7-[(3§)-3-метилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он; 3-(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6-ил)-7-[(3К)-3-метилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он; 3 -(4-хлор- 1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[(2К,5§)-2,5-диметилпиперазин-1-ил] -2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин2-он;
    3-(4-хлор-1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[(2К,5§)-2,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-[(2К,5§)-2,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    7-[(2К,5§)-2,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3К,5§)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-[(2К,5§)-2,5-диметилпиперазин-1-ил] -3 -(8-фторимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3Ь]пиридин-2-он;
    3 -(6-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(2К,5§)-2,4,5-триметилпиперазин-1-ил] -2Н-пирано [2,3Ь]пиридин-2-он;
    3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(2К,5§)-2,5-диметилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(2К,5§)-2,5-диметилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    3 -(7-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(2К,5§)-2,4,5-триметилпиперазин-1-ил] -2Н-пирано [2,3Ь]пиридин-2-он;
    3-(8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(2К,5§)-2,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(2К,5§)-2,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    7-[(3К,5§)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиримидин-2-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    7-[(3К,5§)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    7-[(3К,5§)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    7-[(2К,5§)-2,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(2К,5§)-2,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-(4-метил-1,4-диазепан-1 -ил)-3 -(6-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2он;
    7-[(3К,5§)-3,5-диметилпиперазин-1-ил] -3 -(8-фтор-6-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-(1,4-диазепан-1-ил)-3 -(8-фтор-6-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2он;
    3 -(8-фторимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3 -(8-хлоримидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3 -(имидазо [ 1,2-а]пиримидин-2-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он; 3-(8-фтор-6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3- 101 029155
    Ь]пиридин-2-он;
    3 -(имидазо [2,1-Ь][1,3] тиазол-6 -ил) -7-(4-метил-1,4 -диазе пан-1 -ил) -2Н -пирано [2,3-Ь] пиридин-2 -он;
    7-(4-метил-1,4-диазепан-1 -ил)-3 -(7 -метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2он;
    7-(4-метил-1,4-диазепан-1 -ил)-3 -(6-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2он;
    3 -(имидазо [ 1,2-а]пиримидин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он; 3-(имидазо[1,2-а]пиримидин-2-ил)-7-[(3К,58)-3,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    3-(8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3К,58)-3,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    3 -(8-хлоримидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3К,58)-3,4,5-триметилпиперазин-1-ил] -2Н-пирано [2,3Ь]пиридин-2-он;
    3 -(имидазо [1,2-а] пиридин-2 -ил) -7-[(3К,58)-3,4,5 -триметилпиперазин-1 -ил] -2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    7-[(2К,58)-2,5-диметилпиперазин-1-ил] -3 -(8-фтор-6-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Нпирано [2,3-Ь] пиридин-2 -он;
    3-(6,8 -диметилимидазо [1,2-а] пиразин-2 -ил) -7-[(2К,58)-2,4,5 -триметилпиперазин-1 -ил] -2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-[(18,48)-2,5-диазабицикло[2.2.1]гепт-2-ил]-3 -(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-[(18,48)-5-метил-2,5-диазабицикло[2.2.1]гепт-2-ил]-3 -(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Нпирано [2,3-Ь] пиридин-2 -он;
    7-(4-этил-1,4-диазепан-1 -ил)-3 -(имидазо [ 1,2-а]пиримидин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он; 7-(4-этил-1,4-диазепан-1-ил)-3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    3-(6,8 -диметилимидазо [1,2-а] пиразин-2 -ил) -7-(4-этил-1,4 -диазепан-1 -ил) -2Н-пирано [2,3-Ь] пиридин2-он;
    7-[(3К,58)-4-этил-3,5-диметилпиперазин-1 -ил] -3 -(имидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3Ь]пиридин-2-он;
    7-(4-этилпиперазин-1-ил)-3 -(6-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-(4-этилпиперазин-1-ил)-3 -(7-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он; 7-(4-этилпиперазин-1-ил)-3-(8-фторимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он; 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он; 7-(4-этилпиперазин-1-ил)-3-(8-фтор-6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-[(18,48)-2,5 -диазабицикло [2.2.1]гепт-2 -ил] -3-(6,8 -диметилимидазо [1,2-а] пиразин-2 -ил)-2Нпирано [2,3-Ь] пиридин-2 -он;
    7-[(18,48)-2,5-диазабицикло[2.2.1]гепт-2-ил]-3 -(8-фтор-6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Нпирано [2,3-Ь] пиридин-2 -он;
    7-[(3 8)-4-этил-3 -метилпиперазин-1 -ил] -3 -(8-фтор-6-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Нпирано [2,3-Ь] пиридин-2 -он;
    7-(4-этил-1,4-диазепан-1-ил)-3-(8-фтор-6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    7-(4-этил-1,4-диазепан-1 -ил)-3 -(8-фторимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2он;
    3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-этил-1,4-диазепан-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он;
    7-(4-этил-1,4-диазепан-1-ил)-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2он;
    7-[(3 8)-4-этил-3 -метилпиперазин-1 -ил] -3 -(6-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-2Н-пирано [2,3Ь]пиридин-2-он;
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(38)-4-этил-3-метилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3Ь]пиридин-2-он;
    3 -(8-хлоримидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3 8)-4-этил-3 -метилпиперазин-1 -ил] -2Н-пирано [2,3Ь]пиридин-2-он или
    3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(38)-3-метилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он,
    или его фармацевтически приемлемая соль.
  4. 4. Соединение по п.2, где солевая форма соединения выбрана из следующих:
    3 -(4-хлор- 1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3 -(4-хлор- 1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [3,2-с]пиридин-2-он гидрохлорид; 3-(4-метил-1,3-тиазол-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    - 102 029155
    7-(пиперазин-1-ил)-3-[4-(трифторметил)-1,3-тиазол-2-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3-(7-метилимидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(имидазо[1,2-а]пиримидин-2-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3 -(4-хлор- 1,3-бензотиазол-2-ил)-7-( 1,4-диазепан-1-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3 -(8-хлор-6-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано [3,2-с]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3 -(7-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [3,2-с]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3 -(2-метилимидазо [2,1 -Ь] [ 1,3]тиазол-6-ил)-7 -(пиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [3,2-с]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3 -(имидазо [1,2-а] пиридин-2 -ил) -7-(пиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [3,2-с] пиридин-2 -он гидрохлорид;
    3-(5-метилпиразоло[1,5-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3-(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-6-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    7-(1,4-диазепан-1 -ил)-3 -(имидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    7-(1,4-диазепан-1 -ил)-3 -(8-фторимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3 -(8-хлоримидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(1,4-диазепан-1 -ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3 -(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(1,4-диазепан-1-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3 -(1,3-бензоксазол-2-ил)-7 -(1,4-диазепан-1 -ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(38)-3-метилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
    гидрохлорид;
    3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3К)-3-метилпиперазин-1-ил]-2Н-пирано[2,3-Ь]пиридин-2-он
    гидрохлорид;
    3 -(имидазо [2,1 -Ь] [ 1,3]тиазол-6-ил)-7-[(3 8)-3 -метилпиперазин-1 -ил] -2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    3 -(имидазо [2,1 -Ь] [ 1,3]тиазол-6-ил)-7-[(3К)-3 -метилпиперазин-1-ил] -2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    7-(1,4-диазепан-1 -ил)-3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид;
    7-(1,4 -диазе пан-1 -ил) -3-(6 -метилимидазо [1,2-а] пиразин-2 -ил) -2Н -пирано [2,3-Ь] пиридин-2 -он гидро хлорид;
    7-(1,4-диазепан-1 -ил)-3 -(8-фтор-6-метилимидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2он гидрохлорид или
    3 -(имидазо [ 1,2-а]пиримидин-2-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-2Н-пирано [2,3-Ь]пиридин-2-он гидрохлорид, или его фармацевтически приемлемая соль.
  5. 5. Фармацевтическая композиция для лечения спинальной мышечной атрофии, содержащая эффективное количество соединения по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель, инертный наполнитель или разбавитель.
  6. 6. Способ увеличения включения экзона 7 8ΜΝ2 в мРНК, которая транскрибируется из гена 8ΜΝ2, включающий контактирование клетки человека с соединением по п.1.
  7. 7. Способ увеличения количества белка 8тп, включающий контактирование клетки человека с соединением по п.1.
  8. 8. Способ по п.6 или 7, где клеткой человека является клетка человека от пациента-человека со спинальной мышечной атрофией.
  9. 9. Способ лечения спинальной мышечной атрофии у пациента-человека, нуждающегося в этом лечении, включающий введение пациенту эффективного количества соединения по п.1.
  10. 10. Способ лечения спинальной мышечной атрофии у пациента-человека, нуждающегося в этом лечении, включающий введение пациенту фармацевтической композиции по п.5.
    - 103 029155
EA201491617A 2012-03-01 2013-02-28 Соединения для лечения спинальной мышечной атрофии EA029155B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261605487P 2012-03-01 2012-03-01
PCT/US2013/028131 WO2013130689A1 (en) 2012-03-01 2013-02-28 Compounds for treating spinal muscular atrophy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491617A1 EA201491617A1 (ru) 2015-01-30
EA029155B1 true EA029155B1 (ru) 2018-02-28

Family

ID=49083256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491617A EA029155B1 (ru) 2012-03-01 2013-02-28 Соединения для лечения спинальной мышечной атрофии

Country Status (11)

Country Link
US (1) US9371336B2 (ru)
EP (1) EP2819519B1 (ru)
JP (1) JP6092264B2 (ru)
KR (1) KR102099997B1 (ru)
CN (1) CN104302181B (ru)
BR (1) BR112014021531B1 (ru)
CA (1) CA2865957C (ru)
EA (1) EA029155B1 (ru)
HK (1) HK1200056A1 (ru)
MX (1) MX352962B (ru)
WO (1) WO2013130689A1 (ru)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2861609C (en) 2011-12-30 2021-02-16 Ptc Therapeutics, Inc. Compounds for treating spinal muscular atrophy
US9399649B2 (en) 2012-01-26 2016-07-26 Ptc Therapeutics, Inc. Compounds for treating spinal muscular atrophy
PE20142364A1 (es) 2012-02-10 2015-01-10 Hoffmann La Roche Compuestos para tratar atrofia muscular espinal
EA028382B1 (ru) 2012-03-23 2017-11-30 ПиТиСи ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. Соединения для лечения спинальной мышечной атрофии
EA201500699A1 (ru) * 2012-12-24 2015-12-30 Рамот Эт Тель-Авив Юниверсити Лтд. Агенты для лечения генетических заболеваний, возникающих в результате нонсенс-мутаций, и способы идентификации этих агентов
CA2915764A1 (en) 2013-08-19 2015-02-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Screening method
EP3082820B1 (en) 2013-12-19 2022-07-20 PTC Therapeutics, Inc. Methods for modulating the amount of rna transcripts
EP4249472A3 (en) 2015-05-30 2023-12-13 PTC Therapeutics, Inc. Methods for modulating rna splicing
EP3133065A1 (en) 2015-08-21 2017-02-22 Merck Patent GmbH Compounds for optically active devices
IL281633B (en) 2015-12-10 2022-07-01 Ptc Therapeutics Inc Methods for treating Huntington's disease
EP3544435A4 (en) 2016-11-28 2020-11-04 PTC Therapeutics, Inc. RNA SPLICE MODULATION PROCESSES
EP3363786A1 (en) 2017-02-15 2018-08-22 Merck Patent GmbH Compounds for optically active devices
EP3363793A1 (en) 2017-02-15 2018-08-22 Merck Patent GmbH Hydrophobic compounds for optically active devices
EP3634953B1 (en) 2017-06-05 2024-01-03 PTC Therapeutics, Inc. Compounds for treating huntington's disease
CN111372611A (zh) 2017-06-14 2020-07-03 Ptc医疗公司 修饰rna剪接的方法
CA3067591A1 (en) 2017-06-28 2019-01-03 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating huntington's disease
US11395822B2 (en) 2017-06-28 2022-07-26 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating Huntington's disease
CN111499615B (zh) 2017-08-04 2024-02-02 斯基霍克疗法公司 用于调节剪接的方法和组合物
CA3094703A1 (en) 2018-03-27 2019-10-03 Ptc Therapeutics, Inc. Compounds for treating huntington's disease
WO2020005873A1 (en) 2018-06-27 2020-01-02 Ptc Therapeutics, Inc. Heterocyclic and heteroaryl compounds for treating huntington's disease
MX2020014116A (es) 2018-06-27 2021-06-15 Reborna Biosciences Inc Agente profilactico o terapeutico para atrofia muscular espinal.
US11685746B2 (en) 2018-06-27 2023-06-27 Ptc Therapeutics, Inc. Heteroaryl compounds for treating Huntington's disease
EP3920915A4 (en) 2019-02-05 2022-10-05 Skyhawk Therapeutics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING SPLICE
EP3920928A4 (en) 2019-02-06 2022-09-28 Skyhawk Therapeutics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATION OF SPLICING
US11129829B2 (en) 2019-06-17 2021-09-28 Skyhawk Therapeutics, Inc. Methods for modulating splicing
CN111116460A (zh) * 2019-12-31 2020-05-08 阿里生物新材料（常州）有限公司 一种2-氯-4-羟基吡啶-3-甲醛氢溴酸盐的合成方法
US20230203214A1 (en) 2020-05-20 2023-06-29 Merck Patent Gmbh Azacoumarin and azathiocoumarin derivatives for use in optically active devices
WO2023114539A1 (en) * 2021-12-17 2023-06-22 Pretzel Therapeutics, Inc. Amino chromen-2-one modulators of polrmt

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5597922A (en) * 1994-07-29 1997-01-28 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University And The University Of Oregon Glycine receptor antagonist pharmacophore
US20050250770A1 (en) * 2003-11-10 2005-11-10 Mitsunori Ono Fused heterocyclic compounds
US20110086833A1 (en) * 2008-05-27 2011-04-14 Paushkin Sergey V Methods for treating spinal muscular atrophy

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3558618A (en) 1968-04-01 1971-01-26 Dow Chemical Co Novel 4h-pyrazino(1,2-a)pyrimidine-4-ones
US4122274A (en) 1977-05-25 1978-10-24 Bristol-Myers Company 3-Tetrazolo-5,6,7,8-substituted-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-ones
US4342870A (en) 1980-03-28 1982-08-03 Janssen Pharmaceutica N.V. Novel 3-(1-piperidinylalkyl)-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-one derivatives
US5089633A (en) 1987-04-28 1992-02-18 Georgia Tech Research Corporation Substituted isocoumarins
US5726182A (en) 1990-05-02 1998-03-10 Abbott Laboratories Quinolizinone type compounds
AU4231293A (en) 1992-05-13 1993-12-13 E.I. Du Pont De Nemours And Company Substituted pyrido(1,2-A)pyrimidinone derivatives as fungicides
EP1115724A1 (en) 1998-09-21 2001-07-18 Shire Biochem Inc. Quinolizinones as integrin inhibitors
DK1257537T3 (da) 2000-01-24 2007-10-01 Astrazeneca Ab Terapeutiske morpholino-substituerede forbindelser
GB0205281D0 (en) 2002-03-06 2002-04-17 Novartis Ag Organic compounds
AU2003237492A1 (en) 2002-06-10 2003-12-22 Acadia Pharmaceuticals Inc. Urotensin ii receptor modulators
WO2004047766A2 (en) 2002-11-25 2004-06-10 Kaloidis Antonia C Treatment for sma disease
US9068234B2 (en) 2003-01-21 2015-06-30 Ptc Therapeutics, Inc. Methods and agents for screening for compounds capable of modulating gene expression
ES2339862T3 (es) 2003-06-20 2010-05-26 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compuestos de piridino 1,2-a-pirimidin-4-ona como agentes anticancerosos.
US20050046698A1 (en) 2003-09-02 2005-03-03 Knight Andrew Frederick System and method for producing a selectable view of an object space
EP1749004B1 (en) 2004-05-04 2007-09-19 Warner-Lambert Company LLC Pyrrolyl substituted pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-ones and derivatives thereof as therapeutic agents
WO2006045010A2 (en) 2004-10-20 2006-04-27 Resverlogix Corp. Stilbenes and chalcones for the prevention and treatment of cardiovascular diseases
EP1846397A1 (en) 2005-01-21 2007-10-24 Janssen Pharmaceutica N.V. Novel heterocyclic benzoy[c]chromene derivatives useful as modulators of the estrogen receptors
AR059339A1 (es) 2006-02-09 2008-03-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Derivados de la cumarina para trastornos proliferativos de celulas, composicion farmaceutica y agente terapeutico que los contiene
WO2008013997A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fluorescent substrates for monoamine transporters as optical false neurotransmitters
CA2700841A1 (en) 2007-09-27 2009-04-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Departmen T Of Health And Human Services Isoindoline compounds for the treatment of spinal muscular atrophy and other uses
WO2010019243A1 (en) 2008-08-13 2010-02-18 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating viral infections
EP2501231B1 (en) 2009-11-20 2016-12-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Quinolizidinone carboxamide m1 receptor positive allosteric modulators
CN102812023A (zh) 2010-01-13 2012-12-05 韩国巴斯德研究所 抗感染吡啶并(1,2-a)嘧啶类
CA2861609C (en) 2011-12-30 2021-02-16 Ptc Therapeutics, Inc. Compounds for treating spinal muscular atrophy
US9399649B2 (en) 2012-01-26 2016-07-26 Ptc Therapeutics, Inc. Compounds for treating spinal muscular atrophy
PE20142364A1 (es) 2012-02-10 2015-01-10 Hoffmann La Roche Compuestos para tratar atrofia muscular espinal
EA028382B1 (ru) 2012-03-23 2017-11-30 ПиТиСи ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. Соединения для лечения спинальной мышечной атрофии

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5597922A (en) * 1994-07-29 1997-01-28 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University And The University Of Oregon Glycine receptor antagonist pharmacophore
US20050250770A1 (en) * 2003-11-10 2005-11-10 Mitsunori Ono Fused heterocyclic compounds
US20110086833A1 (en) * 2008-05-27 2011-04-14 Paushkin Sergey V Methods for treating spinal muscular atrophy

Also Published As

Publication number Publication date
US20150166575A1 (en) 2015-06-18
EP2819519A1 (en) 2015-01-07
CA2865957A1 (en) 2013-09-06
EP2819519A4 (en) 2015-09-02
EP2819519B1 (en) 2019-10-23
KR102099997B1 (ko) 2020-04-13
BR112014021531A8 (pt) 2021-06-15
HK1200056A1 (en) 2015-07-31
MX352962B (es) 2017-12-15
BR112014021531B1 (pt) 2022-10-04
CN104302181B (zh) 2017-09-15
MX2014010406A (es) 2015-03-10
CA2865957C (en) 2020-02-11
US9371336B2 (en) 2016-06-21
BR112014021531A2 (pt) 2017-06-20
JP2015509956A (ja) 2015-04-02
CN104302181A (zh) 2015-01-21
WO2013130689A1 (en) 2013-09-06
KR20140131384A (ko) 2014-11-12
EA201491617A1 (ru) 2015-01-30
JP6092264B2 (ja) 2017-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA029155B1 (ru) Соединения для лечения спинальной мышечной атрофии
KR102109992B1 (ko) 척수성 근위축증을 치료하기 위한 화합물
JP6193888B2 (ja) 脊髄性筋萎縮症を治療するための化合物
JP6193881B2 (ja) 脊髄性筋萎縮症を治療するための化合物
BR112014019750B1 (pt) Composto, composição farmacêutica e seus usos

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM