CN112533927A - 可用作激酶抑制剂的被取代的大环 - Google Patents

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CN112533927A CN202080004407.5A CN202080004407A CN112533927A CN 112533927 A CN112533927 A CN 112533927A CN 202080004407 A CN202080004407 A CN 202080004407A CN 112533927 A CN112533927 A CN 112533927A
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Abstract

提供了新的被取代的大环化合物，其药学上可接受的盐、溶剂合物和水合物。化合物和组合物具有蛋白激酶抑制活性，并且预期可用于治疗蛋白激酶介导的疾病和状况。

Description

可用作激酶抑制剂的被取代的大环
相关申请
本发明要求于2019年5月14日提交的美国临时专利申请第62/920,732号的权益，该美国临时专利申请通过引用以其整体并入本文。
发明领域
本发明涉及激酶的抑制剂及其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物、前药和代谢物，其制备方法，以及这样的化合物治疗激酶介导的疾病和状况诸如癌症的用途。
发明背景
蛋白激酶代表催化靶蛋白底物(target protein substrate)的磷酸化的大家族的酶。磷酸化通常是磷酸基团从ATP到蛋白底物的转移反应。磷酸基团与蛋白底物的常见连接点包括例如酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。蛋白激酶家族中激酶的实例包括但不限于Abl1(v-Abl Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1)、Akt、Alk、Bcr-Abl1、Blk、Brk、Btk、c-Kit、c-Met、c-Src、c-Fms、CDK1-10、b-Raf、c-Raf1、CSF1R、CSK、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、Erk、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5、Flt-1、Fps、Frk、Jak、KDR、MEK、PDGFR、PIK、PKC、PYK2、Ros、Tie、Tie2和Zap70。由于它们在许多细胞过程中的活性，蛋白激酶已经作为重要的治疗靶标出现。
ALK(间变淋巴瘤激酶)是一种1620个氨基酸的跨膜蛋白，由具有氨基末端信号肽的胞外结构域、具有带有胰岛素受体底物-1的结合位点的近膜片段的胞内结构域和羧基末端激酶结构域组成。ALK是胰岛素受体酪氨酸激酶的成员。棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)是120KDa的胞质蛋白，其涉及微管和微管结合蛋白的形成。EML4-ALK是由2号染色体短臂上的倒位(inversion)引起的新融合基因(fusion gene)，其将EML4的外显子1-13连接到ALK的外显子20-29。在约3％-13％的NSCLC(非小细胞肺癌)患者中确定了EML4-ALK融合的存在。为此，已经尝试确定用作PK抑制剂的小分子。例如，氨基杂芳基化合物(WO2004/076412)已经被描述为ALK/c-MET抑制剂。氮杂吲哚衍生物(WO2010/068292)已经被描述为ALK/EGFR激酶抑制剂。
因此，可以单独地或一起抑制蛋白激酶诸如ALK和其他激酶的活性的化合物可以被用于治疗人类疾病诸如癌症。
然而，对于克服ALK突变的抗性以及改善ALK抑制剂的安全性概况仍然存在巨大的未满足的医疗需求。
发明概述
在一个方面中，提供了式I的化合物：
Figure BDA0002932061470000021
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或对映体或前药或代谢物，其中
R1是C1-6烷基或C1-6烷氧基。
在另一个方面中，本申请还提供了包含上文描述的式I的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一个方面中，本申请还提供了用于治疗或预防激酶介导的紊乱的方法，该方法包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的任何上文描述的式I的化合物。
发明详述
在本发明的一些实施方案中，提供了式I的化合物：
Figure BDA0002932061470000031
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或对映体或前药或代谢物，其中
R1是C1-6烷基或C1-6烷氧基。
在本发明的一些实施方案中，提供了式II的化合物：
Figure BDA0002932061470000032
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或对映体或前药或代谢物，其中
R1是C1-6烷基或C1-6烷氧基。
在本发明的一些实施方案中，R1是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基。
在本发明的一种实施方案中，R1是甲基。
在本发明的一些实施方案中，R1是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基。
在本发明的一种实施方案中，R1是甲氧基。
在本发明的一种实施方案中，R1是乙氧基。
在某些实施方案中，提供了不限于选自由以下组成的组的化合物：
Figure BDA0002932061470000041
及类似化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂合物、或前药、或代谢物。
在某些实施方案中，提供了不限于选自由以下组成的组的化合物：
Figure BDA0002932061470000042
及类似化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂合物、或前药、或代谢物。
在其他实施方案中，本发明的化合物呈药学上可接受的盐的形式。在一些实施方案中，本发明的化合物呈溶剂合物的形式。在其他实施方案中，本发明的化合物呈代谢物的形式。在其他实施方案中，本发明的化合物呈前药的形式。在一些实施方案中，本发明的化合物是对映体。在其他实施方案中，本发明的化合物是非对映体。在另一种实施方案中，本发明的化合物中的氘富集度(deuterium enrichment)是至少约1％。
在一些实施方案中，提供了包含本发明的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方案中，组合物用于治疗由蛋白激酶调节的疾病。在某些实施方案中，组合物用于预防或治疗过度增殖性紊乱(hyper-proliferative disorder)和/或血管生成性紊乱。在一些实施方案中，药物组合物还包含抗肿瘤剂(anti-neoplastic agent)、免疫抑制剂、免疫刺激剂或其组合。在其他实施方案中，药物组合物适用于口服施用、肠胃外施用或静脉内施用。
在一些实施方案中，本发明提供了用于调节激酶信号转导的方法，该方法包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的本文描述的任何本发明的化合物。
在其他实施方案中，本文提供了用于治疗或预防ALK(包括所有融合和/或突变激酶)、ROS1和/或NTRK激酶介导的紊乱的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的本文描述的任何本发明的化合物。
在其他实施方案中，本文提供了用于治疗瘤形成(neoplasia)的方法，该方法包括向有相应需要的哺乳动物受试者施用治疗有效量的本文描述的任何本发明的化合物。在某些实施方案中，瘤形成选自皮肤癌、白血病、结肠癌、肾细胞癌、胃肠道间质癌(gastrointestinal stromal cancer)、实体瘤癌、骨髓瘤、乳腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、肝细胞癌、甲状腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、前列腺癌和脑癌。在一些实施方案中，该方法还包括施用一种或更多种抗癌剂。
以下定义应有助于理解本文描述的本发明。
术语“烷基”意图包括直链、支链和环状的烃基团，其仅含有碳-碳单键并且其可以是未被取代的或任选地被一个或更多个官能团取代的。烷基基团的优选的链长是从1个至6个碳原子。C1-C6烷基意图包括C1烷基基团(甲基)、C2烷基基团(乙基)、C3烷基基团(正丙基、异丙基)、C4烷基基团(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、C5烷基基团(例如，正戊基)和C6烷基基团。烷基可以是被取代的或未被取代的。说明性的被取代的烷基基团包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氨基甲基、氨基乙基、羟基甲基、甲氧基甲基、2-氟乙基和2-甲氧基乙基等。
术语“烷氧基”指的是-O-(烷基)基团或-O-(未被取代的环烷基)基团。C1-C6烷氧基意图包括-O-C1-C6烷基基团，其中C1-C6烷基是上文定义的。代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基及类似基团。
当关于本发明的化合物使用时，术语“药学上可接受的”意图指的是对于施用至受试者安全的化合物的形式。例如，已经通过管理机构或监管机构例如美国的食品和药物管理局(FDA)批准，用于经由口服摄取或任何其他施用途径的哺乳动物使用的本发明的化合物的游离碱、盐形式、溶剂合物、水合物、前药或衍生形式是药学上可接受的。
短语“有效量”意图量化每种剂的量，相对于每种剂本身的治疗，所述量将实现改善紊乱严重性和发生频率的目标，同时避免通常与替代疗法(alternative therapy)相关的不利副作用。在一种实施方案中，有效量以单一剂型或以多种剂型被施用。
本发明的起始材料是已知的、可商购的或者可以以类似于或根据本领域中已知的方法合成。许多起始材料可以根据已知的工艺制备，并且特别地，可以使用实施例中描述的工艺制备。在合成起始材料时，在某些情况下，官能团在必要时用合适的保护基团保护。保护基团、其引入和移除在下文中描述。
在根据期望的程序合成式I的化合物时，在一些实施方案中步骤以适合于制备化合物的顺序进行，该顺序包括本文描述的程序或通过本文描述的替代的步骤顺序，并且在一种实施方案中，在必要时在之前或之后是另外的保护/去保护步骤。在一些实施方案中，中间体在有或没有纯化的情况下被分离或原位继续。在合成本文描述的抑制剂化合物中有用的合成化学转化以及保护基团方法(保护与去保护)在本领域中是已知的，并且例如包括，诸如在以下中描述的方法：R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH出版社(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第3版,John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser和M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagentsfor Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1994)；A.Katritzky和A.Pozharski,Handbook of Heterocyclic Chemistry,第2版(2001)；M.Bodanszky,A.Bodanszky,ThePractice of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Berlin Heidelberg(1984)；J.Seyden-Penne,Reductions by the Alumino-and Borohydrides in OrganicSynthesis,第2版,Wiley-VCH,(1997)；以及L.Paquette,编辑,Encyclopedia of Reagentsfor Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)。
本发明的化合物在一些实施方案中还以多种互变异构形式表示。本发明明确地包括本文描述的化合物的所有互变异构形式。
在一种实施方案中，所述化合物还以顺式-或反式-或者E-或Z-双键异构体形式存在。所有这样的化合物的这样的异构体形式明确地包含在本发明中。
适应症
本发明提供了化合物，该化合物能够调节一种或更多种信号转导途径，包括但不限于ALK。
术语“调节”，其意指与不存在所述化合物的情况下其正常活性相比，途径(或其组成部分)的功能活性被改变。这种作用包括任何质量或程度的调节，包括增加、激动、增大、增强、促进、刺激、降低、阻断、抑制、减少、削弱、拮抗等。
本发明的化合物还可以调节以下过程中的一种或更多种，包括但不限于例如细胞生长(包括例如分化、细胞存活和/或增殖)、肿瘤细胞生长(包括例如分化、细胞存活和/或增殖)、肿瘤消退、内皮细胞生长(包括例如分化、细胞存活和/或增殖)、血管生成(血管生长)、淋巴管生成(淋巴管生长)和/或造血作用(hematopoiesis)(例如，T细胞和B细胞发育、树突细胞发育等)。
虽然不希望受任何理论或作用机制的束缚，但已经发现本发明的化合物具有调节激酶活性的能力。然而，本发明的方法不限于任何特定的机制或化合物如何实现其治疗效果。短语“激酶活性”，其意指其中来自三磷酸腺苷(ATP)的γ-磷酸(gamma-phosphate)转移至蛋白底物中的氨基酸残基(例如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)的催化活性。化合物可以调节激酶活性，例如通过直接与ATP竞争激酶的ATP结合口袋来抑制激酶活性，通过在酶的结构中产生影响其活性的构象变化(例如通过破坏生物学活性的三维结构)，通过结合至并且锁定处于非活性构象的激酶，等等。
制剂和使用方法
被施用的化合物的量以及用于采用本发明的化合物和/或组合物治疗癌症的剂量方案取决于多种因素，包括受试者的年龄、重量、性别和医学状况，疾病类型，疾病的严重性，施用的途径和频率，以及所使用的具体化合物。因此，剂量方案可以广泛地变化，但是可以使用标准方法常规地确定。约0.01mg/kg至500mg/kg、有利地约0.01mg/kg和约50mg/kg之间、更有利地约0.01mg/kg和约30mg/kg之间、甚至更有利地约0.1mg/kg和约10mg/kg之间的日剂量可以是合适的，并且应当对本文公开的所有使用方法是有用的。日剂量可以以每天一剂至四剂来施用。
虽然可以单独地施用本发明的化合物，但是在所描述的方法中，施用的化合物通常将作为药物组合物中的活性成分存在。因此，在本发明的另一种实施方案中，提供了药物组合物，该药物组合物包含与以下组合的本发明的化合物：药学上可接受的载体，其包括如本文所描述的稀释剂、赋形剂、佐剂及类似物(本文统称为“载体”材料)，以及如果需要，其他活性成分。本发明的药物组合物可以包含有效量的本发明化的合物或者有效剂量的本发明化合物。本发明的化合物的有效剂量包括小于、等于或大于该化合物的有效量的量；例如，其中需要两个或更多个单位剂量(诸如呈片剂、胶囊及类似物)以施用有效量的化合物的药物组合物，或者可选择地其中通过施用组合物的一部分来施用有效量的化合物的多剂药物组合物(诸如粉末、液体及类似物)。
施用途径
合适的施用途径包括但不限于口服施用、静脉内施用、直肠施用、气雾剂施用、胃肠外施用、眼施用、肺施用、经粘膜施用、经皮施用、阴道施用、耳施用、鼻施用和局部施用。此外，仅作为实例，肠胃外递送包括肌内注射、皮下注射、静脉内注射、髓内注射，以及鞘内注射、直接心室内注射、腹膜内注射、淋巴内注射和鼻内注射。
本发明的化合物可以口服施用。口服施用可以包括吞咽，使得化合物进入胃肠道，或者可以使用含服或舌下施用，化合物通过这些方式从口直接进入血流。适合于口服施用的制剂包括固体制剂，例如片剂，含有颗粒、液体或粉末的胶囊，锭剂(包括液体填充的)，咀嚼剂，多颗粒和纳米颗粒，凝胶，固体溶液，脂质体，膜(包括粘膜粘着的(muco-adhesive))，阴道栓剂(ovule)，喷雾剂和液体制剂。
本发明的化合物还可以以快速溶解剂型、快速崩解剂型使用，例如Liang和Chen在Expert Opinion in Therapeutic Patents，11(6)，981-986(2001)中描述的那些，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
用于胃肠外施用的制剂可以被配制成立即释放和/或改性释放(modifiedrelease)。改性释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序化释放(programmed release)。因此，本发明的化合物可以配制为用于作为植入的储库(implanted depot)施用的固体、半固体或触变性液体，提供活性化合物的改性释放。这样的制剂的实例包括药物涂覆的支架和PGLA微球。
组合
虽然本发明的化合物可以作为唯一的活性药物剂给药或施用，但是它们还可以与一种或更多种本发明的化合物组合使用或与其他剂联合使用。当作为组合施用时，治疗剂可以配制为同时施用或在不同时间相继施用的分开的组合物，或者治疗剂可以作为单一组合物给予。
本发明中的化合物的合成在以下的方案1中描述。
方案1中描述了式I的化合物的合成。按照类似的文献已知的程序制备起始材料化合物1。化合物1和被取代的甘氨酸的酰胺形成反应提供式I的化合物。
方案1
Figure BDA0002932061470000091
方案2中描述了式II的化合物的合成。按照已知的文献程序制备起始材料化合物2。化合物2的酰化反应提供式II的化合物。
方案2
Figure BDA0002932061470000101
质子NMR谱
除非另有指示，否则所有1H NMR谱在Varian系列Mercury 300、400、500MHz仪器或Bruker系列400、500MHz仪器上进行。在如此表征的情况下，所有观察到的质子被报告为在所指示的适当溶剂中从四甲基硅烷(TMS)或其他内标物向低场的百万分率(ppm)。
缩写
DCM意指二氯甲烷。
EA意指乙酸乙酯。
TLC意指薄层色谱法。
HATU意指1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐。
DIPEA意指二异丙基乙胺。
HPLC意指高效液相色谱法。
LC-MS意指液相色谱-质谱法。
NMR意指核磁共振。
实施例1：化合物3的合成
Figure BDA0002932061470000111
在0℃向化合物2(1g)在DCM(15mL)中的溶液加入吡啶(263.1mg，1.5当量)，并且搅拌持续0.5h。然后以若干次向反应混合物加入乙酰氯(208.9mg，1.2当量)。反应在0℃搅拌0.5小时，并且TLC指示反应的完成。然后将水(20mL)加入到反应，将层分离并且水层用DCM(2×10mL)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥。粗产物通过制备型TLC板纯化，以给出作为固体的化合物3，782.3mg。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：1.867-1.852.(d，J＝6，3H)，2.139(s，3H)，3.160(s，3H)，4.130(s，3H)，4.396-4.489(q，J1＝14.4，J2＝8.4，2H)，4.613(s，2H)，5.796-5.816(q，J1＝4.8，J2＝1.6，1H)，6.499-6.522(t，J1＝4.8，J2＝4.4，1H)，7.230-7.285(m 1H)，7.375-7.379(d，J＝1.6，1H)，8.139(s，1H)，8.143(s，1H)；LC-MS(M+1＝506).
实施例2：化合物4的合成
Figure BDA0002932061470000112
在室温，向化合物2(200mg)在甲苯(20mL)中的溶液加入(甲氧羰基)甘氨酸(78.6mg，1.2当量)、HATU(280.8mg，1.5当量)和DIPEA(127mg，2当量)，并且搅拌。将反应在回流下搅拌持续5小时，并且用水分离器除去水。TLC指示反应的完成，然后向反应加入水(30mL)，水层用EA萃取(3×10mL)。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥。粗产物通过制备型TLC纯化，以给出作为固体的化合物4，146.6mg。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：1.840-1.856.(d，J＝6.4，3H)，3.158(s，3H)，3.782(s，3H)，4.130(s，3H)，4.434-4.491(m，4H)，5.655(s，1H)，5.790-5.810(q，J1＝4.8，J2＝1.6，1H)，7.025-7.092(m，2H)，7.232-7.267(m 1H)，7.334-7.355(d，J＝8.4，1H)，8.138-8.142(s，1H)，8.607(s，1H).LC-MS(M+1＝522).
实施例3：化合物5的合成
Figure BDA0002932061470000121
在室温，向化合物2(100mg)在DCM(5mL)中的溶液加入(乙氧羰基)甘氨酸(54.3mg，1.5当量)、HATU(187.2mg，2当量)和DIPEA(80mg，2.5当量)，并且搅拌。将反应在回流下搅拌持续8小时，然后向反应加入水(5mL)。水层用DCM(3×5mL)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥。粗产物通过制备型TLC纯化，以给出作为固体的化合物5，40.8mg。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：1.263-1.354.(m，3H)，1.839-1.855.(d，J＝6.4，3H)，3.159(s，3H)，4.117-4.131(s，3H)，4.199-4.252(q，J1＝7.2，J2＝6.8，2H)，4.399-4.522(m，4H)，5.58(s，1H)，5.795-5.811(q，J1＝4.8，J2＝1.61H)，7.047-7.090(m 2H)，7.232-7.267(m，1H)，7.324-7.344(d，J＝8，1H)，8.142(s，1H)，8.146(s，1H).
LC-MS(M+1＝536)。
生物学测定：
如上所述，本发明中定义的化合物具有抗增殖活性。这些性质可以例如使用下文阐述的程序中的一个或更多个来评估：
确定测试化合物抑制激酶的能力的体外测定。
在衍生自BL21菌株的大肠杆菌宿主中制备激酶标记的T7噬菌体菌株。使大肠杆菌生长至对数期并且用T7噬菌体感染，并且在32℃在振荡的情况下孵育直至溶菌。将溶菌产物离心并且过滤以除去细胞碎片。剩余的激酶在HEK-293细胞中产生，并且随后用DNA标记用于qPCR检测。链霉亲和素包被的磁珠用生物素化的小分子配体在室温处理持续30分钟，以产生用于激酶测定的亲和树脂。用过量的生物素封闭带配体的珠(liganded bead)，并且用封闭缓冲液(blocking buffer)(SeaBlock(Pierce)、1％BSA、0.05％吐温20(Tween 20)、1mM DTT)洗涤以除去未结合的配体并且减少非特异性结合。通过在1×结合缓冲液(20％SeaBlock、0.17×PBS、0.05％吐温20、6mM DTT)中组合激酶、带配体的亲和珠和测试化合物来组装结合反应。所有反应在聚苯乙烯96孔板中进行，最终体积为0.135ml。将测定板在振荡的情况下在室温孵育持续1小时，并且用洗涤缓冲液(1×PBS、0.05％吐温20)洗涤亲和珠。然后将珠重悬在洗脱缓冲液(1×PBS、0.05％吐温20、0.5μM非生物素化的亲和配体)中，并且在振荡的情况下在室温孵育持续30分钟。通过qPCR测量洗脱液中的激酶浓度。
使用细胞增殖测定针对BAF3细胞系测定化合物的代表性数目：
细胞培养和接种：
1.收获处于对数生长期的细胞，并且用血小板计数器计数。使用台盼蓝排除法(Trypan blue exclusion method)来检测细胞活力，以确保细胞活力高于90％。
2.调节细胞浓度；将90μL细胞悬浮液分别加入到96孔板。
3.将96孔板中的细胞在37℃、5％CO2和95％湿度培养过夜。
药物稀释和给药：
1.制备10倍药物溶液，该溶液具有100μM的最高浓度，9种浓度，以及3.16倍稀释。向用细胞接种的96孔板的每个孔加入10μL的药物溶液，并且为每种药物浓度设置3个复制孔。
2.在具有所加入的药物的96孔板中的细胞在37℃、5％CO2和95％湿度培养持续72小时，并且然后进行CTG分析。
结束时读板(End reading board)：
1.熔化CTG试剂并且将细胞板平衡至室温持续30分钟。
2.向每个孔加入等体积的CTG溶液。
3.在固定轨道振荡器(fixed-orbit shaker)上振动持续5分钟以溶解细胞。
4.将细胞板置于室温持续20分钟，以将冷光信号稳定化。
5.读取冷光值。
通过GraphPad Prism 5.0软件来分析数据，并且通过经由非线性S曲线回归来拟合数据获得剂量-效应曲线，并且相应地计算IC50值。
细胞存活率(％)＝(Lum待测药物-Lum培养液对照)/(Lum细胞对照-Lum培养液对照)×100％。
下表A列出了代表本发明的化合物及其在细胞测定中的活性。
表A.细胞增殖测定
Figure BDA0002932061470000141
在人类肝微粒体中的P450 3A4测定中测试化合物的代表性数目，以测量CYP抑制：
人类肝微粒体(HLM)在-80℃储存。在研究之前，将微粒体在冷水浴中解冻，并且然后立即置于冰上。将测试化合物和P450 3A4特异性抑制剂酮康唑溶解在DMSO中，以得到10mM的储备溶液。将储备溶液用50％乙腈稀释，以得到浓度为1.5mM的工作溶液。将工作溶液用0.1M磷酸钾缓冲液进一步稀释，以得到浓度为150μM、50μM、15μM、5μM、1.5μM、0.5μM、0.15μM和0.05μM的一系列工作溶液。一式两份的孵育混合物含有在0.1M磷酸钾缓冲液(总体积0.1mL)中的汇集的人类肝微粒体(0.1mg/mL)、3.3mM MgCl2、CYP 3A4探针底物睾酮(50μM)、特异性抑制剂或测试化合物(30μM、10μM、3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM、0.003μM、0.01μM)。阴性对照包含0.1M磷酸盐缓冲液代替特异性抑制剂或测试化合物。DMSO和乙腈的最终浓度等于或小于0.1％。将混合物在37℃预孵育持续10分钟。然后，加入1mM NADPH以引发反应。在37℃的10min孵育之后，通过加入包含内标物的300μL乙腈终止反应。通过LC/MS/MS检测相应产物的形成。
LCMS方法：使用Waters ACQUITY UPLC系统联接的API 4000Qtrap系统。质谱仪配备有Turbo离子喷雾(ESI)接口(Applied Biosystems，Concord，Ontario，加拿大)。使用Analyst 1.5软件包(Applied Biosystems)控制LC-MS/MS系统，以及用于数据采集和处理。在Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50×2.1mm ID，1.7μm)上实现色谱分离。柱温保持在环境温度(25℃)。流动相A是补充有0.1％甲酸(v/v)的纯水。流动相B是补充有0.1％甲酸(v/v)的乙腈。流量保持在0.6mL/min。
样品制备：通过加入包含内标物的3倍体积的冰冷的甲醇/乙腈(1/1，v/v)混合物来猝灭反应。将混合物以4000rpm离心持续20min。将100μL的上清液与200μL的H2O混合，并且注射最终溶液用于LC-MS/MS分析。
数据分析：将产物(6β-羟基睾酮)与内标物的峰面积比绘制为每个反应的相关阴性对照的百分比，以表示残留酶活性。使用GraphPad Prism软件通过图的酶活性相对于抑制剂浓度的非线性回归来确定测试化合物的IC50值。评价药物-药物相互作用(DDI)的潜在风险的一般标准如下：
IC50＞10μM CYP抑制低；
3μM＜IC50＜10μM CYP抑制中等；
IC50＜3μM CYP抑制高。
下表B列出了代表本发明的化合物及其在细胞色素P450 3A4测定中的活性。化合物3示出对CYP 3A4的弱得多的抑制，这表明药物-药物相互作用的小得多的可能性。
表B.CYP 3A4抑制
化合物 CYP 3A4(IC<sub>50</sub>)
劳拉替尼(Lorlatinib) 7.8μM
2 10μM
3 279μM
溶解度测量：
参考标准溶液的制备：将2mg的化合物单独地加入到每个100mL容量瓶。将化合物用乙腈稀释至100mL。
样品溶液的制备：将2mg的化合物单独地加入到2mL eppendorf管(EP)中，然后加入1mL的pH 7.0或pH 10.0的缓冲溶液(20mM)。将溶液振荡持续2分钟，并且置于25℃持续30分钟。在静置持续30分钟之后，在EP的底部形成沉淀物。将溶液通过0.2μm膜过滤器过滤，并且然后用水稀释50倍。
将具有相同体积的标准溶液和样品溶液注射到在Shim-Pack CLC-ODS C18柱(150mm×6.0mm，5μm)上的HPLC中。流动相由乙腈和2％三氯甲烷—20mM KH2PO4缓冲液(pH＝7.0)组成，流量为1mL/分钟(40:60)。检测波长是在264nm。计算：样品的溶解度＝标准物的浓度×样品的面积×50/标准物的面积。化合物3在pH＝7.0时具有比化合物2和劳拉替尼高得多的溶解度。
表C.本发明的化合物的溶解度
劳拉替尼(PF-06463922) 化合物2 化合物3
在pH 7.0时的溶解度 0.029mg/mL 0.091mg/mL 0.772mg/mL
体内异种移植测定：
用于体内实验的代表性方案如下，以在裸鼠中建立皮下BaF3-SLC34A2-ROS1细胞系异种移植模型并且评价化合物的体内治疗效力：动物：雄性Balb/c裸鼠(6～8周龄)获得自中国上海斯莱克实验动物有限责任公司(SLAC Laboratory Animal,Shanghai,China)。动物被保持在无菌过滤器顶部笼子中在SPF条件下，并且被安置在HEPA过滤的通风架上。动物随意接受无菌啮齿动物食物(sterile rodent chow)和水。细胞系：BaF3-SLC34A2-ROS1,S.c.无胸腺小鼠的异种移植模型：收获用于植入到无胸腺小鼠中的细胞，并且通过以1200r/min离心持续5min来制粒。将细胞洗涤一次并且重悬在200μl的5×106的无菌PBS缓冲液中。然后将细胞s.c.植入到每只小鼠的右肩胛区中，并且在施用化合物之前允许细胞生长至200mm3-300mm3。给药制剂的制备：将每种化合物悬浮在0.5％CMC-Na中。随机化：当肿瘤体积接近200mm3-300mm3时，根据肿瘤体积小鼠将被随机化为5组。这一天将被表示为D1，并且治疗将在这一天开始。施用：剂量将采用口服管饲针(oral gavage needle)每天一次地施用持续数天。当肿瘤体积为200mm3-300 mm3时，开始通过p.o.管饲法以0.5％CMC-Na施用的化合物的治疗。观察：在接种之后，每天检查动物的发病率和死亡率。在常规监测时，将检查动物的肿瘤生长和治疗对正常行为的任何作用，诸如活动性、体重增加/损失(体重将被每周测量两次或每隔一天测量)、眼睛/毛发无光泽(eye/hair matting)和任何其他异常作用。死亡和观察到的临床体征将基于每个亚组中的动物数目进行记录。肿瘤尺寸测量：每3天通过用电子游标卡尺的测量来确定肿瘤体积，并且肿瘤体积计算为其长度×宽度2×0.5的乘积。作用研究：肿瘤体积在指定日被表示为平均肿瘤体积±SD。与经媒介物治疗的小鼠相比，测量经药物治疗的小鼠的百分比(％)抑制值，并且如下计算：肿瘤生长抑制(TGI，％)＝100-[MTV治疗的/MTV对照]×100。使用t检验确定治疗组与对照组之间的显著性差异(p<0.05)。在研究终点，在血液收集之后，通过颈脱臼对小鼠实施安乐死，首先收集肿瘤组织，然后剖开腹腔，切除肝和脾，然后在除去胆囊之后分别称重。比较治疗组与对照组之间的器官重量和器官重量/体重比率。比率计算如下：比率＝器官重量/(体重-肿瘤重量)。器官重量和器官重量/体重比率两者也均表示为平均值±SD，并且使用t检验确定治疗组与对照组之间的显著性差异(p<0.05)。
下表D列出了代表本发明的化合物及其在上文描述的裸鼠的皮下BaF3-SLC34A2-ROS1细胞系异种移植模型中的活性。化合物1和化合物3以5mg/kg通过口服管饲法每天一次地给药，持续数天。对肿瘤尺寸进行加权平均。在第20天，化合物3示出与劳拉替尼相比显著更好的肿瘤生长抑制作用。化合物3的剩余肿瘤重量比劳拉替尼(PF-06463922)小得多。
表D.第20天的肿瘤重量
对照 劳拉替尼 3
肿瘤重量 2.118g 0.531g 0.327g
PK研究：
PK(药代动力学)测定的代表性方案如下：化合物被IV给予或口服给予相同的动物。每种化合物的剂量为1mg/kg(体积5ml/kg)IV和10mg/kg(体积10ml/kg)口服。用于IV的制剂是处于0.4mg/mL的10％Solutol HS 15+90％磷酸盐缓冲盐水。处于0.5mg/mL的100％(0.5％吐温80在水中的0.5％MC中)悬浮液被用于口服制剂。样品收集：对于IV途径，在0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h和24h的时间点收集血浆样品。对于口服途径，在0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h和24h的时间点收集血浆样品。总生物利用度通过加入母体化合物和主要代谢物来计算。分析：使用LC-MS/MS计算PK参数：t1/2、t最大、C最大、Vss和AUC等。
下表E列出了所选择的化合物及其生物利用度。
化合物 总F(％)
2 49
3 100
4 100
在大鼠中，化合物2显示49％的口服生物利用度。化合物3和化合物4具有大大提高的生物利用度(F＝100％)。
毒性研究
在一个月的典型的大鼠毒性研究中，对雌性采用剂量8mg/kg/天并且对雄性采用剂量16mg/kg/天，对包括劳拉替尼(PF-06463922)和化合物3的多种代表性化合物进行了测试。在本实验的条件下，在化合物施用期结束和恢复期结束时，在使用劳拉替尼剂量施用的组中，一些动物的血液中的#淋巴液和红细胞减少，并且血小板和/或％NEUT示出增加的趋势。相应的动物显示凝血酶原时间的缩短时间。相比之下，在相同剂量的化合物3或媒介物对照组中没有观察到类似的变化。
稳定性测试：在25℃测试化合物的稳定性持续一个月，使用HPLC来测量纯度。发现化合物2在25℃明显分解，其中主要杂质A和B从第0天的1.13％和1.39％分别增加至第30天的3.98％和8.34％。化合物2在-30℃不稳定。在另一方面，化合物3、4和5在0℃或25℃没有示出显著变化(表F)。
HPLC方法和条件：
Figure BDA0002932061470000191
表F.化合物在25℃持续一个月的稳定性。
Figure BDA0002932061470000192
Figure BDA0002932061470000201

Claims (17)

1.一种根据式I的化合物：
Figure FDA0002932061460000011
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药或对映体或代谢物，其中
R1是C1-6烷基或C1-6烷氧基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述式I是式II，
Figure FDA0002932061460000012
3.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，或其溶剂合物，其中R1是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基。
4.根据权利要求3所述的化合物或其药学上可接受的盐，或其溶剂合物，其中R1是甲基。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或其溶剂合物，其中R1是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基。
6.根据权利要求5所述的化合物或其药学上可接受的盐，或其溶剂合物，其中R1是甲氧基。
7.根据权利要求5所述的化合物或其药学上可接受的盐，或其溶剂合物，其中R1是乙氧基。
8.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，或其溶剂合物，选自由以下组成的组：
Figure FDA0002932061460000021
9.一种化合物，选自由以下组成的组：
Figure FDA0002932061460000022
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药或代谢物。
10.一种药物组合物，包含权利要求1至9中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或根据权利要求10所述的药物组合物，用于作为药物使用。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或根据权利要求10所述的药物组合物用于治疗或预防过度增殖性紊乱的用途。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物用于调节激酶信号转导的用途。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物用于治疗或预防ALK、ROS1和/或NTRK激酶介导的紊乱的用途。
15.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物用于治疗瘤形成的用途。
16.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物用于治疗选自肺癌和/或脑癌的癌症疾病的用途。
17.与一种或更多种抗癌剂组合的根据权利要求1至9中任一项所述的化合物用于治疗瘤形成的用途。
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