JP2016527247A5

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Publication number: JP2016527247A5
Application number: JP2016528615A
Authority: JP
Filing date: 2014-07-15
Publication date: 2017-07-13

Description

多くの純粋な単一酵素および３つの単一酵素の混合物は、１例では、ＥＰＩの処置のための臨床開発段階に入っている。これらは、組み換え型胆汁酸刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）（Ｅｘｉｎａｌｄａ（商標）／Ｋｉｏｂｒｉｎａ（登録商標））（母乳に含まれている組み換え型ヒトリパーゼ）；Ｍｅｒｉｓｐａｓｅ（登録商標）（組み換え型イヌ胃リパーゼ）；ＭＳ１８１９（組み換え型リパーゼ）；およびリプロタマーゼ（ｌｉｐｒｏｔａｍａｓｅ）（微生物供給源から抽出し、化学的に架橋した、組み換え型細菌リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼからなる混合物）である。これら実験上の治療は全て、これまでのところ、Ｚｅｎｐｅｐ（登録商標）またはＵｌｔｒｅｓａ（登録商標）などのブタの膵臓由来の市販の酵素抽出物に匹敵するレベルの処置効能を証明できていない。同様に、２０１１年１月１２日のＦＤＡの顧問会議では、パンクレリパーゼ抽出生成物で従来得られたものと比較して、脂肪の吸収係数（ＣＦＡ）の増加に関するその低い効能により、リプロタマーゼの承認が反対された。

用語「リパーゼ」は、脂質のグリセロールおよび単純な脂肪酸への加水分解を触媒する酵素を指す。本発明に適したリパーゼの例として、限定するものではないが、動物のリパーゼ（たとえばブタのリパーゼ）、細菌のリパーゼ（たとえばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のリパーゼ、および／またはバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）のリパーゼ）、真菌のリパーゼ、植物のリパーゼ、組み換え型リパーゼ（たとえば培養物中の細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、もしくは哺乳類の宿主細胞のいずれか１つから選択される適切な宿主細胞による組み換えＤＮＡ技術を介して生成されるか、または、天然に存在する配列と相同または実質的に同一であるアミノ酸配列を含む組み換え型リパーゼ、天然に存在するリパーゼをコードする核酸と相同または実質的に同一である核酸によりコードされるリパーゼなどを含む）、合成リパーゼ、化学修飾されたリパーゼ、ならびにそれらの混合物が挙げられる。用語「脂質」は、脂肪、ワックス、ステロール、脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ，およびＫなど）、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質などを含む天然に存在する分子を広く含む。

本発明の組成物は、好ましくは、単位服用量あたり少なくとも約６５０ＩＵ（ＵＳＰ法）、単位服用量あたり少なくとも約９，０００ＩＵ、さらにより好ましくは、単位服用量あたり約２０，０００ＵＳＰ単位、約４０，０００ＵＳＰ単位、約６０，０００ＵＳＰ単位、約８０，０００ＵＳＰ単位、または約１００，０００ＵＳＰ単位のリパーゼを含む。

少なくとも約１２０ＵＳＰＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンは、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を使用して調製され、上記溶媒は、２８〜４５（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解パラメータ（ＳＰ）を有し、上記溶媒は、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、この工程は、低温、好ましくは室温を下回る温度で実行される。

１つの実施形態では、少なくとも約１２０ＵＳＰＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンは、溶媒でパンクレアチンを処理する工程を使用して調製され、上記溶媒は、２８〜３８（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解パラメータ（ＳＰ）を有し、上記溶媒は、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、工程が、低温、好ましくは室温を下回る温度で実行されている。

１つの特定の実施形態では、少なくとも約１２０ＵＳＰＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンは、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を使用して調製され、上記溶媒が、２８〜３４（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解パラメータ（ＳＰ）を有し、上記溶媒は、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、この工程は、低温、好ましくは室温を下回る温度で実行される。

別の特定の実施形態では、少なくとも約１２０ＵＳＰＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンは、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を使用して調製され、上記溶媒が、３４〜３８（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解パラメータ（ＳＰ）を有し、上記溶媒は、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、この工程は、低温、好ましくは室温を下回る温度で実行される。

別の実施形態では、少なくとも約１２０ＵＳＰＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンは、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を使用して調製され、上記溶媒が、３４〜４５（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解パラメータ（ＳＰ）を有し、上記溶媒は、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、この工程は、低温、好ましくは室温を下回る温度で実行される。

１つの特定の実施形態では、少なくとも約１２０ＵＳＰＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンは、溶媒でパンクレアチンを処理することを含む工程を使用して調製され、上記溶媒が、３８〜４５（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解パラメータ（ＳＰ）を有し、上記溶媒は、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、この工程は、低温、好ましくは室温を下回る温度で実行される。

ステップ１ａは、好ましくは約６０分間実行される。好ましい温度は４℃である。分離ステップ（ステップａ２）は、遠心分離、沈降、または濾過などの異なる方法により実行され得る。乾燥ステップ（ａ３）は、たとえば、効率の高い乾燥器、真空ポンプ、凍結乾燥器で行うことができ、他の方法もまた使用できる。ステップａ１の溶媒中のパンクレアチンの濃度は、好ましくは、０．０５０〜０．３ｍｇ／ｍＬの量、好ましくは０．０６５〜０．１ｍｇ／ｍＬの量であり、好ましくは０．０６５ｍｇ／ｍＬまたは０．１ｍｇ／ｍＬである。

本発明の一実施形態（単一のステップ工程）では、２８〜４５（ＭＰａ）^０．５のＳＰを有する溶媒でパンクレアチンを処理することは、以下の：ａ１）撹拌しながら溶媒にパンクレアチンを懸濁するステップと、ａ２）ステップａ１）の混合物の可溶部分（上清）から不溶部分（ペレット）で分離するステップと、ａ３）ａ２で得た不溶部分を乾燥させるステップとを含み、上記ステップａ１〜ａ３は、室温より低い温度で実行される。この工程の実行に適した温度は４℃である。

本発明の一実施形態（単一のステップ工程）では、３４〜３８（ＭＰａ）^０．５のＳＰを有する溶媒でパンクレアチンを処理することは、以下の：ａ１）撹拌しながら溶媒にパンクレアチンを懸濁するステップと、ａ２）ステップａ１の混合物の可溶部分（上清）から不溶部分（ペレット）で分離するステップと、ａ３）ステップａ２で得た不溶部分を乾燥させるステップとを含み、ステップａ１〜ａ３は、室温より低い温度で実行される。この工程の実行に適した温度は４℃である。

水性溶媒中のパンクレアチンは、０．０５０〜０．３ｍｇ／ｍＬの量、好ましくは０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０または０．３ｍｇ／ｍＬの量であり、有機溶媒は、好ましくはエタノールまたはアセトンのいずれかであり、水性溶媒は、好ましくはｐＨ＝４．０の緩衝液（１０ｍＭの酢酸塩緩衝液など）またはｐＨ７の緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩など）である。

水性溶媒中のパンクレアチンは、好ましくは、０．０５〜０．３ｍｇ／ｍＬの量、好ましくは０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１または０．３ｍｇ／ｍＬの量で存在する。使用する溶媒のＳＰは、好ましくは３８である。有機溶媒は、好ましくはエタノールまたはアセトンのいずれかであり、水性溶媒は、好ましくはｐＨ＝４．０の緩衝液（１０ｍＭの酢酸塩緩衝液など）またはｐＨ７の緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩など）である。

本発明の工程は、ＨＡ−パンクレアチンの滅菌、およびウイルスの不活性化またはウイルス量の低下を含み得るが、これは濾過、加熱、照射（紫外線照射、Ｘ線照射、β線照射、およびガンマ線照射）、高圧処理および／またはβプロピオラクトン（ｐｒｏｐｒｉｏｌａｃｔｏｎｅ）（ＢＰＬ）を使用するなどの核酸のアルキル化により、実行され得る。約１８時間超、好ましくは１８〜４８時間、さらにより好ましくは１８〜３０時間といった適切な時間、８５℃超、好ましくは８５℃〜１００℃などの温度での加熱は、ウイルス混入物の低減にも有効である。０．５重量％以下の残留水分を有する固体のＨＡ−パンクレアチンに、低温での加熱（８４℃、好ましくは８０℃）を行ってもよい。

実験
材料
パンクレアリパーゼ（ＡＰＩ、出発パンクレリパーゼまたはパンクレアチン、天然のパンクレリパーゼまたはパンクレアチン）は、Ｎｏｒｄｍａｒｋにより提供される。これは、ブタ膵臓から抽出され、典型的にタンパク質を約３０％含み（ブラッドフォード法で定量化）、９４．４ＩＵ／ｍｇのリパーゼ活性、２５３．２ＩＵ／ｍｇのプロテアーゼ活性、４２０．３ＩＵ／ｍｇのアミラーゼ活性を有し、Ｐ／Ｌ比は２．７、Ａ／Ｌ比は４．５であり、水の含量は０．３である。この材料を、１次元および２次元の電気泳動、次いでＭＡＬＤＩＴＯＦ分析により解析して、パンクレリパーゼの構成成分を同定する（ＭａｒｉｏＮｅｇｒｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）。この抽出物の２次元の電気泳動から、水に明らかに容易に可溶である画分の中に少なくとも５０のタンパク質／ペプチドスポット、および水に明らかに容易に可溶ではない画分の中に３０のタンパク質／ペプチドスポットが存在することが示される。溶解度の決定は、活性酵素がパンクレリパーゼの水不溶性成分の上に吸着し得る、またはパンクレリパーゼの水不溶性成分により捕捉され得るという事実により混同される。また溶解度は、ｐＨの関数でもある。混合物中の個々のタンパク質に対応するスポット、および可溶性の高いまたは可溶性の低い画分を使用して調製したゲルの画像を、主なスポットを切断してウシのトリプシンで消化させ、かつマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）および酵素電気泳動を使用して解析した後に解析する。ペプチド質量フィンガープリントを、ライブラリーの参照物質のフィンガープリントと比較し、アミラーゼ、リパーゼ、コリパーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ１およびＢ、エラスターゼ２Ａおよび１、キモトリプシン、トリプシン、およびホスホリパーゼＡ２を同定する。この抽出物は、明らかに、比較的粗製であり、多くの活性酵素種に加えて多くの外来性タンパク質を含む。

この工程の収率は、約３７〜約５６％の範囲である。収率％は、ステップａ１．ａで使用したパンクレリパーゼの理論上のリパーゼ活性に対する、ステップａ２のペレットおよび上清の総リパーゼ活性であり、無処置の原材料の比活性（すなわち、標準的なＵＳＰ法に従って決定した９４．４ＩＵＵＳＰ／ｍｇ）およびその初期重量を因数分解することにより計算される。

濃縮係数（ｐＨ非依存的）は、ステップａ２のペレットのリパーゼ活性と、出発パンクレアチン（９４．４ＩＵ／ｍｇである）のリパーゼ活性との比率を計算することにより決定する。この工程により最大２．５の濃縮係数が得られる。またこの濃縮は、ＨＰＬＣプロファイル解析によっても確認される。

全工程の収率は７３．１〜８４．５の範囲にあり、複数のステップの工程を用いて得た収率よりも高い。収率％は、ステップａ１．１で使用したパンクレアチンの理論上のリパーゼ活性に対する、ステップａ２のペレットおよび上清の総リパーゼ活性であり、これは、出発材料（すなわち標準的なＵＳＰ法により決定した９４．４ＩＵＵＳＰ／ｍｇ）の比活性およびその初期重量を因数分解することにより計算する。

実施例９精製したＨＡ−パンクレアチン（試料２０）の分析
ＨＡ材料を、消化能力に関して試験し、出発パンクレリパーゼと比較した。２０ｍｇのＨＡ−パンクレアチンおよび５０ｍｇの出発パンクレリパーゼ（２３００ＩＵＵＳＰリパーゼに対応）を、それぞれ１ｍＬの脱イオン水に懸濁し、５０ｍＬの腸溶製剤ＰｅｐｔａｍｅｎＪｕｎｉｏｒ１．０に３７℃で添加し、１００ｒｐｍで、６０分、１２０分、および２４０分間撹拌する。消化試験を、１時間後、２時間後、および４時間後に行う。この試験を、各パンクレリパーゼの試料で６回繰り返した。

Claims

高活性パンクレアチン（ＨＡ−パンクレアチン）であって、前記パンクレリパーゼが、少なくとも約１２０ＵＳＰＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する、高活性パンクレアチン。
少なくとも約１５０ＵＳＰＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する、請求項１に記載のパンクレアチン。
少なくとも約２００ＵＳＰＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する、請求項１に記載のパンクレアチン。
少なくとも約５００ＵＳＰＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有する、請求項１に記載のパンクレアチン。
請求項１、２、３、または４に記載のＨＡ−パンクレアチンを含む高力価医薬組成物。
前記パンクレアチンがブタ由来である、請求項１、２、３、４、または５に記載の組成物。
単位服用量あたり少なくとも約９，０００ＵＳＰＩＵ、約２０，０００ＵＳＰＩＵ、約４０，０００ＵＳＰＩＵ、約６０，０００ＵＳＰＩＵ、約８０，０００ＵＳＰＩＵ、または約１００，０００ＵＳＰＩＵのリパーゼを含む、請求項５または６に記載の組成物。
複数のコーティングされたＨＡ−パンクレアチン粒子を含み、前記粒子が少なくとも１つの腸溶性ポリマーでコーティングしたコアを含む、請求項７に記載の組成物。
粉剤、ペレット、マイクロスフェア、カプセル、分包包装、錠剤、液体懸濁物、または液体溶液の形態である、請求項５、６、７、または８に記載の組成物。
少なくとも約１２０ＵＳＰＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するＨＡ−パンクレアチンの調製のための工程であって、２８〜４５（ＭＰａ）^０．５のヒルデブランド溶解パラメータを有する溶媒でパンクレアチンを処理することを含み、前記溶媒が、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、前記工程の温度が室温を下回る、工程。
前記溶媒のヒルデブランド溶解パラメータの範囲が、２８〜３８（ＭＰａ）^０．５、３４〜３８（ＭＰａ） ^０．５、３４〜４５（ＭＰａ） ^０．５および３８〜４５（ＭＰａ） ^０．５からなる群より選択される、請求項１０に記載の工程。
少なくとも約１５０ＵＳＰＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するパンクレアチンの調製のための、請求項１０、または１１に記載の工程。
少なくとも約２００ＵＳＰＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するパンクレアチンの調製のための、請求項１０、または１１に記載の工程。
少なくとも約２５０ＵＳＰＩＵ／ｍｇのリパーゼ比活性を有するパンクレアチンの調製のための、請求項１０、または１１に記載の工程。
ａ１）３４〜４５（ＭＰａ）^０．５のヒルデブランド溶解パラメータを有する溶媒にパンクレアチンを懸濁するステップであって、前記溶媒が、１つの有機溶媒、または有機溶媒の混合物、または少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物である、ステップと、
ａ２）前記ステップａ１）の混合物の可溶部分から不溶部分を分離するステップと、
ａ３）前記ステップａ２）で得られた不溶部分を乾燥させるステップと
を含み、
前記工程で、温度が室温を下回る、
請求項１０に記載の工程。
ステップａ１）が、約３０分間実行され、工程の温度が４℃である、請求項１５に記載の工程。
前記溶媒が、少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であり、ステップａ１が、以下の、
ａ１．１）撹拌しながら水性溶媒にパンクレアチンを懸濁するステップと、
ａ１．２）前記ステップａ１）の懸濁物に前記１つの有機溶媒またはその混合物を添加するステップと
を含み、
前記工程の温度が室温を下回る、
請求項１０、１５、または１６に記載の工程。
前記溶媒が、少なくとも１つの有機溶媒と水性溶媒との混合物であって、ステップａ１）が、
ａ１．１）撹拌しながら前記水性溶媒にパンクレアチンを懸濁するステップと、
ａ１．２）前記ステップａ１．１の可溶部分を不溶部分から分離するステップと、
ａ１．３）前記ステップａ１．２）の可溶部分に前記１つの有機溶媒またはその混合物を添加するステップと
を含み、
前記工程の温度が室温を下回る、
請求項１７に記載の工程。
ステップａ１．３）が、約３０分間実行され、工程の温度が４℃である、請求項１８に記載の工程。
前記ステップａ１．１のパンクレアチンが、０．０５〜０．３ｍｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１７、１８、または１９に記載の工程。
前記溶媒が、３８（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解パラメータを有する、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０に記載の工程。
前記有機溶媒が、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、四塩化炭素、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、トリクロロエチレン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、エタノール、ジメチルスルホキシドブチルアルコール、メタノール、アセトニトリル、ジオキサン、および塩化メチレン（ｍｅｔｈｙｌｅｎｃｈｌｏｒｉｄｅ）の群から選択される、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１に記載の工程。
前記有機溶媒が、アセトン、イソプロパノール（ｉｓｏｐｒａｐａｎｏｌ）、およびエタノールの群から選択される、請求項２２に記載の工程。
前記水性溶媒が、緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２に記載の工程。
前記緩衝溶液が、ｐＨ＝７またはｐＨ＝４を有する、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４に記載の工程。
前記有機溶媒がアセトンであり、前記水性溶媒が、ｐＨ＝７の緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４に記載の工程。
前記有機溶媒がエタノールであり、前記水性溶媒が、ｐＨ＝７の緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４に記載の工程。
前記有機溶媒がアセトンであり、前記水性溶媒が、ｐＨ＝４の緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４に記載の工程。
前記有機溶媒がエタノールであり、前記水性溶媒が、ｐＨ＝４の緩衝溶液である、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４に記載の工程。
前記溶媒が、３８（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解パラメータを有し、前記ステップａ１）のパンクレアチンが、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項２６、２７、２８、または２９に記載の工程。
前記溶媒が、３８（ＭＰａ）^０．５のヒルデブラント溶解を有し、前記ステップａ１のパンクレアチンが、０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２６、２７、２８、または２９に記載の工程。
微生物および／またはウイルスの量を低減するステップを含む、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１に記載の工程。
前記細菌および／またはウイルスの量の低減を、濾過、加熱、電離放射線、高圧、またはアルキル化により実行する、請求項３２に記載の工程。
膵酵素不全に関連する生理学的な病態にある患者の処置において使用するための請求項５、６、７、８、または９に記載の組成物であって、薬学的に許容可能な量の前記組成物を前記患者に投与するための、組成物。