CN105392496A - 高效的胰酶药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供高效的药物组合物，所述药物组合物包含高活性的胰酶。本发明还涉及生产HA-胰酶及其组合物或剂型的方法，以及它们的使用方法。

Description

高效的胰酶药物组合物
相关交叉申请
本申请根据35USC§119(e)要求2013年7月22日提交的美国临时专利申请系列号：61/856,952的权益，其公开内容通过引用为所有目的完整并入本文。
发明领域
本发明涉及高效的药物组合物，所述药物组合物包含高活性胰酶(highactivitypancreatin，HA-胰酶)酶。本发明还涉及生产HA-胰酶酶及其组合物或剂型的方法，及它们的使用方法。
发明背景
FDA估计超过200,000美国人患有胰腺外分泌不足(EPI)，胰腺外分泌不足(EPI)包括生理紊乱，其中个体由于缺少由他们的胰腺产生的消化酶而不能很好地消化食物。这种消化酶的丧失导致诸如营养消化不良和吸收不良的紊乱，这导致营养不良及与其相关的其他后续和不良的生理状况。这些紊乱在患有囊性纤维化(CF)和损伤胰腺的外分泌功能的其它状况的患者中常见，所述其它状况诸如胰腺癌、胰切除术和胰腺炎。如果放置不理，营养不良能够危及生命，尤其是在婴儿和CF患者中。紊乱能够导致生长受损、妥协的免疫反应及缩短预期寿命。
能够施用消化酶，诸如胰脂肪酶酶和其它胰腺酶产物(pancreaticenzymeproduct，PEP)，从而至少部分补救EPI。施用的消化酶允许患者更有效地消化他们的食物。
用于治疗EPI的胰脂肪酶酶主要是三类酶同其它酶及多种辅因子和辅酶与其他的多种辅因子和辅酶组合，所述三类酶是脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶，所述其它酶，除了其他以外，包括弹性蛋白酶、磷脂酶、和胆固醇酯酶；列出了在酶产品中的水平或效力。这些酶在胰腺中天然产生并对于脂肪、蛋白质和碳水化合物的消化十分重要。这些酶催化脂肪水解成甘油和脂肪酸，淀粉水解成糊精和糖，及蛋白质水解成氨基酸和衍生物质。然而，消化是涉及许多其它酶和底物的复杂过程，所述酶和底物有助于正确的消化功能和生产全范围的消化产物。
胰脂肪酶酶通常从猪胰腺制备。其它胰脂肪酶来源包括牛胰腺或胰液。这些酶的天然哺乳动物来源产生具有与由人类胰腺分泌的相似的酶组成的产物。还能够使用其它非哺乳动物来源，例如，在U.S.6,051,220、U.S.2004/0057944、2001/0046493和WO2006044529中描述的那些。
虽然包含胰脂肪酶的产物能够提供有效的治疗，问题也随之而来。每餐需要多个(4-9)相当大的胶囊(高药物负载)，降低了患者对给药的坚持。还注意到高药物负载带来的潜在的微生物和病毒污染是不希望的。所有这些问题都与酶提取物的低纯度有关。纯度问题是已经使用多年的酶提取方法的结果，所述酶提取方法包括原液混合液或浆液的形成、用酒精的沉淀、离心和过滤。这样的提取方法生产的最终产物可以由仅25％的蛋白质组成。脂肪酶，这些胰脂肪酶提取物中一种在效力方面重要的酶，具有大约100IUUSP/mg的活性。这与纯的猪脂肪酶活性有差距，纯的猪脂肪酶具有约25,000IU/mg的活性(诸如可获得自SigmaAldrich的纯的猪脂肪酶)。使用这个近似值作为计算的基础，能够估算产物包含少于0.5％的活性脂肪酶。进一步讲，过量非活性物质存在的另外后果是，任何传染性污染可能不可避免地是这一团块(bulk)的一部分并也随混合物的期望的活性成分一同被摄取。非活性物质的过量还干扰旨在减少生物负担的技术，例如通过阻塞膜过滤器或过滤柱及遮蔽提取物不受电离辐射，所述电离辐射可用于降低其潜在的传染性负担。
在一个情形中，一些纯的单个酶或三种单个酶的混合物已经进入用于治疗EPI的临床开发。这些是包含在母乳中的一种重组人类脂肪酶重组胆汁盐刺激的脂肪酶(BSSL)(ExinaldaTM/)；一种重组犬胃脂肪酶一种重组脂肪酶MS1819；；和由化学交联的重组细菌脂肪酶、提取自微生物来源的蛋白酶和淀粉酶组成的混合物liprotamase。所有这些实验治疗方法目前都不能证明与来自猪胰脏的商业酶提取物诸如或相当的治疗效率水平。相似的，FDA咨询委员会会议在2011年1月12日投票反对批准liprotamase，这是由于其与之前用胰脂肪酶提取产物获得的相比在脂肪吸收系数(CFA)增加方面更低的效率。
对相比现有的包含胰脂肪酶的产品更浓缩和纯净，还要保持其对于治疗EPI的功效的产品存在明显需要，因为这将允许生产更好、更便利且潜在地更安全的产品。有一些文献报道描述使用胰脂肪酶作为用于分离蛋白酶、脂肪酶或淀粉酶的起始材料；然而，没有在PEP中发现的类型的胰脂肪酶类型或相似产品被纯化以用于制造用于治疗用途的改良产品的报道。在每个情形中，本文描述的本发明之前的目的是要相对于其它级分纯化特定酶或酶级分或移除某些成分而不实质性地增加总体的酶活性。在所有的情形中，还没有对生产用作治疗剂的HA-胰酶产品的指导。
描述蛋白质纯化的现有技术目标是提取并分离简单的蛋白质富集级分，如通过胰脂肪酶举例的，或目标是以分离单个蛋白质或单个的蛋白质类，如脂肪酶或蛋白酶。
例如，Hwang(Ind.Eng.Chem.Res.2007,46,4289)公开了胰腺酶溶解度和溶剂极性之间的关系，并报道了脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶从胰腺蛋白的选择性沉淀。Hwang展示了，当使用具有降低的极性的溶剂时胰酶沉淀被提高，且当溶剂具有28(MPa)0.5以下的Hildebrand溶解度参数时被最大化；淀粉酶和蛋白酶的选择性沉淀随着溶剂极性降低到34(MPa)0.5以下而增加，而脂肪酶的选择性沉淀与溶液极性无关，且混合物中存在的脂肪酶的不多于65％被回收。从这些结果，不存在一起纯化宽范围的胰腺酶以获得HA-胰酶的动机，且对于本领域技术人员不存在在纯化期间维持酶类的混合物的动机。胰脂肪酶已经被在治疗性产品中使用远超过60年，没有纯化胰脂肪酶的尝试的事实是这种操作的益处还没有被设想或意识到的强烈指示。所有改善胰脂肪酶产品的尝试都聚焦在来自非胰来源的单个酶上，进一步强调了使用胰脂肪酶作为用于改善的产品的制造的更纯的和/或更浓缩的酶的来源之前没有被意识到。
因胰脂肪酶目前被用于药学和清洁应用，没有动机或原因去将胰脂肪酶纯化数倍，所述纯化以生产具有酶活性的实质上相似的定性和定量属性的产品为目的。事实上，目前的产品充分地满足它们的角色并已经如此保持超过60年没有实质上的改变，且似乎没有对本文描述的显著改进的产品或相关制备方法的描述。包含用于治疗EPI的纯酶的这些产品都是基于来自重组技术或微生物来源的单个酶或，在一个情形中，三种纯的并化学修饰的单个酶的混合物。没有纯化来自粗胰腺提取物的包含蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的混合物用于EPI的治疗、清洁和组织消化的努力。相似的，没有单独纯化并随后重组来自胰来源的酶的动机或报道；这样的方法与实现分离的酶或酶类的目的背道而驰。
发明概述
本发明涉及HA-胰酶及其高效的药物组合物或剂型。本发明还涉及生产HA-胰酶的高产量方法及使用该产品的方法。
发明详述
本发明涉及一种产品(HA(高活性)-胰酶)，其包括具有有效且显著地高的治疗活性的必需酶类，更具体地，所述酶类还具有降低的不必要的生物成分和/或不良的潜在传染成分的生物负担。本发明还涉及用于生产HA-胰酶的方法，更具体地，所述方法以极高的产量生产HA胰酶。HA-胰酶还将使配制更小且更便利的剂型成为可能，尤其是可以作为单个药片递送的剂型、用于悬浮的小颗粒剂型和能够在单个剂量单位中与其它治疗剂或有益成分合并的剂型。本创新对于患有PEI的患者，诸如囊性纤维化患者将具有特别价值。本发明还有益于配制成其中患者的年龄或状况可能需要胶囊以外的替代施用形式的制剂，替代施用形式如，悬浮液、颗粒。更浓缩，并因此更小的剂型、单位或颗粒将对于这种患者组有巨大价值。本发明还使为以上列出的原因而应用设计为减少或移除不必要或不良的生物成分的技术成为可能，所述不必要或不良的生物成分诸如微生物和任何相关毒素。
本发明涉及HA-胰酶酶(HA-胰酶)及其高效药物组合物。在特定实施方案中，HA-胰酶是猪来源的。HA-胰酶包含脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶，并具有至少约120、或至少约150、或至少约200、或至少约400、或至少约500USPIU/mg的脂肪酶比活性。
本文使用的术语“消化酶”指消化道中的酶，其分解食物成分以使其能够被生物体获取或吸收。消化酶的非限制性实例包括胰脂肪酶酶(也称为胰脂肪酶或胰酶)、脂肪酶、辅脂肪酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰凝乳蛋白酶B、胰肽酶、羧肽酶A、羧肽酶B、甘油酯水解酶、磷脂酶、甾醇酯水解酶、弹性蛋白酶、激肽酶原、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、谷蛋白酶(glutenase)、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、β-淀粉酶、纤维素酶、β-半乳糖苷酶、乳糖酶、蔗糖酶、异麦芽糖酶及其混合物。
如本文使用的术语“胰腺酶(pancreaticenzyme)”指存在于胰分泌物中的任意一种酶类型，诸如淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶或其混合物，或任何具有酶活性的胰腺来源提取物，诸如胰酶。
术语“胰脂肪酶酶(pancrelipaseenzymes)”或“胰脂肪酶”或“胰酶”指几类酶的混合物，包括淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶酶。胰脂肪酶酶是可以商业获得的，例如，从NordmarkArzneimittelGmbH或ScientificProteinLaboratoriesLLC。
本文使用术语“API”指代“消化酶”或“胰脂肪酶酶”或“胰酶”。
术语“脂肪酶”指催化脂质水解为甘油和简单脂肪酸的酶。适合本发明的脂肪酶的实例包括，但不限于，动物脂肪酶(如，猪脂肪酶)、细菌脂肪酶(如，假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶和/或伯克氏菌属(Burkholderia)脂肪酶)、真菌脂肪酶、植物脂肪酶、重组脂肪酶(如，通过重组DNA技术由适当的宿主细胞生产的，所述宿主细胞选自培养中的细菌、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物宿主细胞的任一种、或包含与天然存在的序列同源或基本上相同的氨基酸序列的重组脂肪酶、由与天然存在的脂肪酶编码核酸同源或基本上相同的核酸编码的脂肪酶等等)、合成脂肪酶、化学修饰的脂肪酶及其混合物。术语“脂质(lipid)”广泛地包括天然存在的分子，包括脂肪(fat)、蜡、甾醇、脂溶性维生素(诸如维生素A、D、E和K)、单甘酯、双甘酯、三甘酯、磷脂等。
术语“淀粉酶”指的是分解淀粉的糖苷水解酶酶，例如，α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶、酸性α-葡糖苷酶、唾液淀粉酶，诸如唾液素等。适用于本发明中的淀粉酶包括，但不限于，动物淀粉酶、细菌淀粉酶、真菌淀粉酶(如，曲霉属(Aspergillus)淀粉酶，例如，米曲霉(Aspergillusoryzae)淀粉酶)、植物淀粉酶，重组淀粉酶(如，通过重组DNA技术由适当的宿主细胞生产的，所述宿主细胞选自培养中的细菌、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物宿主细胞的任一种、或包含与天然存在的序列同源或基本上相同的氨基酸序列的重组淀粉酶、由与天然存在的淀粉酶编码核酸同源或基本上相同的核酸编码的淀粉酶等等)、化学修饰的淀粉酶、及其混合物。
术语“蛋白酶(protease)”通常指打破蛋白质的氨基酸之间的肽键的酶(如朊酶(proteinase)、肽酶、或蛋白水解酶)。蛋白酶通常由其催化类型鉴别，如天冬氨酸肽酶、半胱氨酸(硫醇)肽酶、金属肽酶、丝氨酸肽酶、苏氨酸肽酶、碱性或半碱性蛋白酶、中性及催化机理未知的肽酶。适用于本发明中的蛋白酶的非限制性实例包括丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶(如，plasmepsin)金属蛋白酶和谷氨酸蛋白酶。此外，适用于本发明中的蛋白酶的非限制性实例包括，但不限于，动物蛋白酶、细菌蛋白酶、真菌蛋白酶(例如，蜂蜜曲霉(Aspergillusmelleus)蛋白酶)、植物蛋白酶，重组蛋白酶(如，通过重组DNA技术由适当的宿主细胞生产的，所述宿主细胞选自培养中的细菌、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物宿主细胞的任一种、或包含与天然存在的序列同源或基本上相同的氨基酸序列的重组蛋白酶、由与天然存在的蛋白酶编码核酸同源或基本上相同的核酸编码的蛋白酶等等)、化学修饰的蛋白酶及其混合物。
本发明的组合物的胰脂肪酶酶可以包括一种或更多种脂肪酶(即，一种脂肪酶、或两种或更多种脂肪酶)、一种或更多种淀粉酶(即，一种淀粉酶、或两种或更多种淀粉酶)、一种或更多种蛋白酶(即，一种蛋白酶、或两种或更多种蛋白酶)，和是这些酶以不同组合和比例的混合物。
可用在本发明的组合物中的脂肪酶活性能够从约650到约100,000IU(USP方法)。其能够从约675到约825IU、从约2,500到约28,000IU、从约2,700到约3,300IU、从约4,500到约5,500IU、从约8,000到约11,000IU、从约13,500到约16,500IU、及从约18,000到约22,000IU、从约22,500到约27,500IU、从约36,000到约44,000IU，及在这些之间的所有范围和子范围。
本发明的组合物优选地包含每剂量单位至少约650IU(USP方法)、至少约9,000，甚至更优选地它们包含约20,000、约40,000、约60,000、约80,000或约100,000USP单位脂肪酶。
根据本发明的HA-胰酶组合物可以为粉末形式或可以为压制的形式，如，片剂，或可以包括多个包衣和/或无包衣的颗粒。所述颗粒可包含以至少一种肠溶包衣包衣的核心，其中所述包衣包含肠溶聚合物。上述组合物除包衣颗粒外还可包含胰脂肪酶的无包衣颗粒。具体来说，颗粒是小片剂、微片剂、微粒、微球、微胶囊、微丸。所述颗粒可以具有达约5毫米的直径。它们可以具有任何合适的粒径或形状。例如，颗粒能够具有从约25-5,000μm范围的粒径，例如，它们能够为“小片剂”的形式，所述小片剂具有在约2-5mm范围的标称颗粒直径，或者它们可以是“微片剂”，所述微片剂具有小于约2mm的标称颗粒直径，例如约1-2mm。颗粒可以具有小于约800μm的平均粒径，优选小于500μm，更优选小于200μm。颗粒可具有不小于400μm的体积直径(d(v,0.1))(定义为其中体积分布的10％低于此值且90％高于此值的直径)和不超过800μm的体积直径d(v,0.9)(定义为其中90％的体积分布低于此值且10％高于此值的直径)。
在其中胰脂肪酶核心被肠溶包衣包围的实施方案中，包衣作为屏障保护药物免受胃的酸性环境和实质防止药物在到达小肠之前的释放。肠溶包衣组合物同其他包衣组合物的合适的组合能够用于提供对药物释放或治疗效果的所需类型的控制。肠溶包衣包含至少一种肠溶聚合物和另外的赋形剂。短语“肠溶聚合物”是指保护消化酶免受胃内容物的聚合物，例如，在酸性pH稳定但在较高的pH下能迅速分解的聚合物，或当它在胃中时其水合或侵蚀速率足够慢以确保胃内容物与消化酶的接触相对较小，而在胃肠道的其余部分时与此相反的聚合物。
肠溶聚合物的非限制性实例为纤维素乙酸邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯的酯、甲基丙烯酸甲酯共聚物、和甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物(1：1)、虫胶和乙基纤维素。这些聚合物可以以不同商标名称市售获得，诸如：Cellacefate(纤维素乙酸邻苯二甲酸酯)、L100、S100、L30D、FS30D、L100-55、L30D55(甲基丙烯酸的共聚物)、(纤维素乙酸邻苯二甲酸酯)、(羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯)及(羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)。肠溶包衣还可以包括其它赋形剂如滑石。优选地肠溶包衣包括：10-20wt.％的至少一种肠溶聚合物，其中每个所述wt.％是基于包衣颗粒的总重量。包衣还可包括亲脂剂，诸如C6-C30的亲脂性低分子量分子，选自脂肪族羧酸和醇，优选地C14-C18的羧酸和醇，诸如硬脂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻醇、或硬脂醇。包衣的其它可选成分是增塑剂、抗结剂(诸如滑石、硬脂酸镁、胶体二氧化硅及其组合；还任选地低粘度乙基纤维素)。适合的增塑剂的非限制性实例包括三醋精、柠檬酸三丁酯、柠檬酸三乙酯、乙酰基柠檬酸三正丁酯(acetyltri-n-butylcitrate)、邻苯二甲酸二乙酯、癸二酸二丁酯、聚乙二醇、聚丙二醇、蓖麻油、乙酰化的单和双甘油酯、鲸蜡醇，及其混合物。优选的增塑剂是非邻苯二甲酸酯增塑剂或其混合物。
包衣或无包衣的HA-胰酶颗粒可以根据已知的方法制备。例如，可以通过添加适当的粘合剂到HA-胰酶，随后在合适的溶剂存在下挤压并随后滚圆以制备微丸核心。可以施加控制的滚圆以生成小尺寸的HA-胰酶颗粒。可以将喷涂包衣、粉末分层和流化床技术用于通过包衣惰性核心制备珠剂。凝聚方法也可用于包衣的脂肪酶颗粒的制备。
直接压片法可用于制备无赋形剂的压制片剂。在某些情况下，片剂可能显示胃耐受性，这是由于在与胃液的接触原位形成疏水包衣层。
包括HA-胰酶的组合物可以为适合于含有消化酶的治疗剂的给药的任何形式，诸如例如，它们可以为粉末、丸剂(pellet)、微球、胶囊、袋剂、片剂、液体悬浮剂和液体溶液的形式。
在本发明的一个实施方案中，可以制备包含HA-胰酶的剂型，尤其是包含HA-胰酶的更小和/或单剂型。HA-胰酶的可利用性允许胶囊尺寸的减少和/或甚至相比于20,000单位强度规格0的胶囊的典型制剂组合物递送每餐减少数量的胶囊剂量，所述典型制剂组合物填充有250-275mg的API。成年患者每餐可以摄取从4到10个这样的胶囊。为了200,000USPU的脂肪酶的总体每日剂量，患者现在摄取10个胶囊且药物制品的摄入量是2,500-2,750mg。至少2倍的纯化构成有意义的改善，且更高程度的纯化更加如此。事实上，HA-胰酶药物剂型，其采用口服胶囊的形式，其可具有约100-110mgAPI含量(对比250-275mg)，因此为了200,000USPU的脂肪酶的总体每日剂量，患者的药物制品摄入量是约1,000-1,100mg(对比2,500-2,750mg)。此外，使用HA-胰酶胶囊，可以使用规格2(对比规格0)，从而也大大减少施用的胶囊的总数量，或替代地保持规格0的胶囊并适当地调整其内容物，从而显著减少每日摄入。EPI的治疗是长期治疗，其往往始于婴儿期。配制胰脂肪酶从而使其能够被包含在更小的剂量单位内和/或以减少量的每餐剂量单位摄入的能力构成对患者的显著益处。
本发明的新颖剂型还可以包括小颗粒剂型。具有每单位体积提高的效力的胰脂肪酶产品将克服关于珠剂尺寸减少的重要问题。大部分商业胰脂肪酶剂型是胶囊，其被用胰脂肪酶珠剂填充，所述珠剂以肠溶聚合物包衣。施加包衣是因为胰腺脂肪酶在酸性介质中被不可逆地失活。可以将胶囊打开，并将珠剂撒在某些食物上，这对于年幼患者或那些吞咽困难的人或应对高药物负担是重要的选择。然而由于珠剂具有可感知的直径，可达2mm，此选择不解决所有患者的需要。这意味着，对于婴儿或需要管喂的患者，珠剂不能容易地悬浮在液体中。减少珠剂尺寸的尝试导致总表面积大大增加并因此需要多得多的肠溶聚合物以有效地包衣颗粒的增加的表面积。这大大增加了剂型的体积和摄入的聚合物的量到临界点，在该临界点剂型的体积进一步增加了药物负担，且包衣赋形剂的水平可能超过为其每天摄入设立的限量。
具有大大减少的体积的HA-胰酶的可利用性不仅允许将全部剂量包含在单个剂量单位或减少数量的剂量单位中，而且还使得胰脂肪酶与其它化合物的组合成为可能。例如，抗酸缓冲剂，诸如碳酸氢钠和HA-胰酶可以在单个剂量单位中组合，而使用现有的胰脂肪酶不可能考虑胰腺酶和增加胃pH的剂的这样的组合，因为这会大大增加已经非常高的药物负担，因为将需要另外的胶囊/片剂和/或胶囊/片剂的尺寸将会过大。
HA-胰酶还提供了无需肠溶包衣提供可分散的剂型的选择，因为缓冲剂将防止胰酶的脂肪酶成分的酸失活。此外，补充的碳酸氢盐还可以提供治疗益处，因为在患有EPI的患者中碳酸氢盐分泌通常降低。可将这种新颖的剂型配制用于立即或延后释放并在液体介质中分散。这后一性质为需要液体喂食的患者提供了显著的优势，因为可以方便地将成分分散在食物或另一便利的介质中。这些组合可以以多种便利的形式递送，如胶囊、片剂、袋剂、珠剂和液体。如上所述，需要使用肠溶聚合物包衣胰脂肪酶剂型是由于脂肪酶在酸性介质中不稳定；但是，如果通过使用质子泵抑制剂使胃的pH升高，那么已经证明脂肪酶保持活性，这大概是因为其不暴露于足够低以灭活酶的pH水平。这种方法不方便，也不一定是医学上可取的，因为它增加了药物负担，并使用额外的慢性药物来克服另一个的缺点。使用简单的抗酸剂诸如碳酸氢钠，可暂时中和胃pH，这已被证明可有效保护酸不稳定的药物，诸如PPI奥美拉唑，其是药物的成分。这种药物中的碳酸氢钠水平是1.1g及奥美拉唑的水平是20mg或40mg，且这些成分都被包含在硬壳胶囊内。
含有HA-胰酶和至少一种其它活性化合物，诸如H2拮抗剂、质子泵抑制剂或胆盐的组合的单个剂型，也在本发明中公开。
本发明获得了产品改进。事实上，制备HA-胰酶使得生物负担减少，仅仅是由于携带这一生物负担的材料的量的减少。然而，此外，用于制备过程的方法也能够减少生物负担，并将因此生产出显著较少拖累的产品。进一步讲，从产品中去除大量的非活性材料使无菌技术的使用成为可能，所述无菌技术用于将施用的可注射的生物制品，如，过滤、紫外线(UV)照射。再次，这代表产品特性中显著且未预料到的改进。
存在于本发明的组合物或口服剂型中的HA-胰酶根据以下方法制备。
起始材料是胰酶。在本发明中我们还可以用术语“API”、或“起始胰酶”、或“起始胰腺酶”、或“天然胰酶”、“起始胰脂肪酶”、或“天然胰脂肪酶”指代胰酶。
一种方便的起始材料是猪源性胰脂肪酶，如从NordmarkArzneimittelGmbH、或ScientificProteinLaboratoriesLLC市售的。也可以使用来自牛或其他哺乳动物来源的类似提取物。优选的起始材料是猪源性胰脂肪酶。用于生产粗提取物的提取程序可以概括为包括以下步骤：猪腺体湿润研磨；添加胰脂肪酶‘激活剂’；用冷和热的异丙醇处理“粗酶浆液”以沉淀蛋白质并去除脂质；离心和过滤步骤以去除纤维并压缩和浓缩；真空干燥“湿饼”；为体积密度和粒径破坏结块并粉碎“湿饼”。这种干燥的产品是在现有产品中使用的胰酶。
本发明的HA-胰酶通过进一步处理起始胰酶制备；它保留对于基于胰腺酶的产品的功效关键的那些要素，并去除不必要的那些要素。
由本发明的方法所得到的材料是HA-胰酶。
具有至少约120USPIU/mg的脂肪酶比活性的HA-胰酶，使用包括用溶剂处理胰酶的方法制备，其中所述溶剂具有包含在28和45(MPa)0.5之间的Hildebrand溶解度参数(SP)，且所述溶剂是一种有机溶剂或有机溶剂的混合物，或至少一种有机溶剂和水性溶剂的混合物，且在低温，优选在低于室温的温度下进行该方法。
在一个实施方案中，具有至少约120USPIU/mg的脂肪酶比活性的HA-胰酶使用包括用溶剂处理胰酶的方法制备，其中所述溶剂具有包含在28和38(MPa)0.5之间的Hildebrand溶解度参数(SP)，且所述溶剂是一种有机溶剂或有机溶剂的混合物，或至少一种有机溶剂和水性溶剂的混合物，且在低温，优选在低于室温的温度下进行该方法。
在一个具体实施方案中，具有至少约120USPIU/mg的脂肪酶比活性的HA-胰酶使用包括用溶剂处理胰酶的方法制备，其中所述溶剂具有包含在28和34(MPa)0.5之间的Hildebrand溶解度参数(SP)，且所述溶剂是一种有机溶剂或有机溶剂的混合物，或至少一种有机溶剂和水性溶剂的混合物，且在低温，优选在低于室温的温度下进行该方法。
在另一个具体实施方案中，具有至少约120USPIU/mg的脂肪酶比活性的HA-胰酶使用包括用溶剂处理胰酶的方法制备，其中所述溶剂具有包含在34和38(MPa)0.5之间的Hildebrand溶解度参数(SP)，且所述溶剂是一种有机溶剂或有机溶剂的混合物，或至少一种有机溶剂和水性溶剂的混合物，且在低温，优选在低于室温的温度下进行该方法。
在另一个实施方案中，具有至少约120USPIU/mg的脂肪酶比活性的HA-胰酶使用包括用溶剂处理胰酶的方法制备，其中所述溶剂具有包含在34和45(MPa)0.5之间的Hildebrand溶解度参数(SP)，且所述溶剂是一种有机溶剂或有机溶剂的混合物，或至少一种有机溶剂和水性溶剂的混合物，且在低温，优选在低于室温的温度下进行该方法。
在一个具体实施方案中，具有至少约120USPIU/mg的脂肪酶比活性的HA-胰酶使用包括用溶剂处理胰酶的方法制备，其中所述溶剂具有包含在38和45(MPa)0.5之间的Hildebrand溶解度参数(SP)，且所述溶剂是一种有机溶剂或有机溶剂的混合物，或至少一种有机溶剂和水性溶剂的混合物，且在低温，优选在低于室温的温度下进行该方法。
HA-胰酶可具有至少约120、或至少约150、或至少约200、或至少约400、或至少约500USPIU/mg的脂肪酶比活性。
Hildebrand溶解度参数是指示特定溶剂的相对溶解性能的数值。它来自于溶剂的内聚能密度，而内聚能密度又是来自于汽化热。Hildebrand值可从文献来源获得，如从BartonHandbookofSolubilityParameters，CRCPress，1983。方法溶剂是一种有机溶剂或多种有机溶剂的混合物或至少一种有机溶剂和水性溶剂的混合物；有机溶剂和水性溶剂的混合物可以包括一种或更多种有机溶剂和一种或更多种水性溶剂。溶剂可具有以下溶解度值：45、42、40、38、36、35、34和28。
有机溶剂可选自包括正戊烷、正己烷、正庚烷、乙醚、环己烷、四氯化碳、乙酸乙酯、四氢呋喃、氯仿、三氯乙烯、丙酮、二甲基甲酰胺、正丙醇、异丙醇、乙醇、dimethylsulfoxidebutylalcohol、甲醇、乙腈、二噁烷和methylenchloride的溶剂的组。优选的有机溶剂是丙酮、异丙醇和乙醇。
水性溶剂可选自由以下组成的组：水或缓冲溶液。优选的缓冲剂具有pH＝7或pH＝4，它们可以分别为pH＝7：10mM磷酸盐缓冲剂和pH＝4：10mM乙酸盐缓冲剂。
在本发明的一个实施方案中，溶剂是包括一种或更多种有机溶剂和一种水性溶剂的混合物，所述混合物具有范围从28至45(MPa)0.5的Hildebrand溶解度参数。在本发明的实施方案中，溶剂是包括一种或更多种有机溶剂和一种水性溶剂的混合物，所述混合物具有范围从28至38(MPa)0.5的Hildebrand溶解度参数。在一个具体实施方案中，溶剂是包括一种或更多种有机溶剂和一种水性溶剂的混合物，所述混合物具有范围从28至34(MPa)0.5的Hildebrand溶解度参数。在一个具体实施方案中，溶剂是包括一种或更多种有机溶剂和一种水性溶剂的混合物，所述混合物具有范围从34至38(MPa)0.5的Hildebrand溶解度参数。在另一个实施方案中，溶剂是包括一种或更多种有机溶剂和一种水性溶剂的混合物，所述混合物具有范围从34至45(MPa)0.5的Hildebrand溶解度参数。在一个具体实施方案中，溶剂是包括一种或更多种有机溶剂和一种水性溶剂的混合物，所述混合物具有范围从38至45(MPa)0.5的Hildebrand溶解度参数。溶剂混合物的SP使用Hildebrand溶解度参数计算。
在一个实施方案中，溶剂具有38(MPa)0.5的SP并且是有机溶剂与水性溶剂的混合物。这样的具有SP＝38的二元溶剂的几个实例是：
丙酮-缓冲剂：丙酮与pH＝7的缓冲剂的体积比为35:65；丙酮与pH＝4.0的缓冲剂的体积比为35:65；其中：SP(丙酮)＝20.2，SP(缓冲剂)＝47.9；
乙醇-缓冲剂：乙醇与pH＝7的缓冲剂的体积比为45:55；乙醇与pH＝4.0的缓冲剂的体积比为45:55；其中SP(乙醇)＝26.0，SP(缓冲剂)＝47.9；
在另一个实施方案中，SP＝34(MPa)0.5的二元溶剂是：丙酮-缓冲剂：丙酮与pH＝7的缓冲剂的体积比为50:50；其中SP(丙酮)＝20.2，SP(缓冲剂)＝47.9。
在还另一个实施方案中，SP＝35(MPa)0.5的二元溶剂是丙酮-缓冲剂：丙酮与pH＝7的缓冲剂的体积比为45：55；其中SP(丙酮)＝20.2，SP(缓冲剂)＝47.9。
在本发明的一个实施方案(单步法)中，用具有28-45(MPa)0.5的SP的溶剂处理胰酶包括以下步骤：a1)在溶剂中在搅拌下悬浮胰酶；a2)从步骤a2的混合物的可溶部分(上清液)分离不可溶部分(小团(pellet))；a3)干燥在步骤a1中得到的不可溶部分；且其中步骤a1-a3在低于室温的温度下进行。适于执行方法的温度为4℃。
在本发明的一个实施方案(单步法)中，用具有34-38(MPa)0.5的SP的溶剂处理胰酶包括以下步骤：a1)在溶剂中在搅拌下悬浮胰酶；a2)从步骤a2的混合物的可溶部分(上清液)分离不可溶部分(小团)；a3)干燥在步骤a1中得到的不可溶部分；且其中步骤a1-a3在低于室温的温度下进行。适于执行方法的温度为4℃。
优选执行步骤1a约60分钟；优选温度是4℃。可以通过不同方法执行分离步骤(步骤a2)，诸如离心、沉降或过滤。干燥步骤(a3)可以在以下机器中执行，例如高效烘干机、真空泵、或冷冻干燥机；也可以使用其它方法。在步骤a1中溶剂中的胰酶浓度优选以包含在0.050和0.3mg/mL之间的量，优选在0.065和0.1mg/mL之间，优选为0.065或0.1mg/mL。
在单步法的一个具体实施方案中，溶剂具有38(MPa)0.5的SP且是丙酮和pH7的缓冲剂(如10mM磷酸盐)的混合物，且在步骤a1中的胰酶的浓度为10g/mL。
在本发明的另一个实施方案中(两步法)，其中溶剂是有机溶剂和水性溶剂的混合物，首先将胰酶分散在水性溶剂中并随后向其加入有机溶剂。在这个实施方案中，步骤a1包括以下步骤：a1.1(悬浮)在搅拌下在水性溶剂中悬浮胰酶；a1.2(沉淀)对步骤1a的悬浮液添加有机溶剂或其混合物。将步骤a1.1的混合物保持在静止条件下。取决于规模和设备，步骤a1.1的持续时间是从约10到约30分钟；步骤a1.2的持续时间是约30分钟。
在水性溶剂中的胰酶优选地以包含在0.050和0.3mg/mL之间的量，优选在0.1和0.3mg/mL之间，优选为0.1或0.3mg/mL，有机溶剂优选为乙醇或丙酮，且水性溶剂优选pH＝4.0的缓冲剂(诸如10mM乙酸盐缓冲剂)或pH7缓冲剂(诸如10mM磷酸盐)。
在单步法的一个具体实施方案中，溶剂具有38(MPa)0.5的SP，且是丙酮和pH7的缓冲剂(诸如10mM磷酸盐)的混合物，且步骤a1中的胰酶浓度为0.1mg/mL。
在单步法的另一个具体实施方案中，溶剂具有38(MPa)0.5的SP，且是丙酮和pH4的缓冲剂(诸如10mM乙酸盐缓冲剂)的混合物，且步骤a1中的胰酶浓度为0.1mg/mL。
在本发明的还另一实施方案中(多步法)，当溶剂是有机溶剂和水性溶剂的混合物时，胰脂肪酶首先分散在水性溶剂中，并随后将有机溶剂添加到这个水性分散液的可溶部分。在这个实施方案中，该方法步骤a1包括以下步骤：a1.1)(悬浮)在搅拌下在水性溶剂中悬浮胰酶；a1.2)(分离)将步骤a1.1的可溶部分(上清液)从不可溶部分(小团)分离；a1.3)(沉淀)对步骤a1.2的可溶部分添加有机溶剂或其混合物。
优选执行步骤a1.1约30分钟。将步骤a1.3的混合物在静止条件下保持约15分钟；对这些步骤的优选温度为4℃。
在水性溶剂中的胰酶优选地以包含在0.05和0.3mg/mL之间的量，优选在0.1和0.3mg/mL之间，优选为0.1或0.3mg/mL。使用的溶剂的SP优选为38。有机溶剂优选为乙醇或丙酮，且水性溶剂优选pH＝4.0的缓冲剂(诸如10mM乙酸盐缓冲剂)或pH7缓冲剂(诸如10mM磷酸盐)。
在多步法的一个具体实施方案中，溶剂具有38(MPa)0.5的SP，且其是丙酮和pH4.0的缓冲剂(诸如10mM乙酸盐缓冲剂)的混合物，且步骤a1中的胰酶浓度为0.3mg/mL。
在多步法的还另一个实施方案中，溶剂具有38(MPa)0.5的SP，且其是乙醇和pH4.0的缓冲剂(诸如10mM乙酸盐缓冲剂)的混合物，且步骤a1中的胰酶浓度为0.3mg/mL。
在多步法的还另一个实施方案中，溶剂具有38(MPa)0.5的SP，且其是乙醇和pH4.0的缓冲剂(诸如10mM乙酸盐缓冲剂)的混合物，且步骤a1中的胰酶浓度为0.1mg/mL。
在多步法的还另一个实施方案中，溶剂具有38(MPa)0.5的SP，且其是丙酮和pH7的缓冲剂(诸如10mM磷酸盐)的混合物，且步骤a1中的胰酶浓度为0.3mg/mL。
分离步骤(步骤a2和a1.2)可以通过不同的方法执行，诸如离心或过滤。HA-胰酶制备方法的所有方法步骤在温度控制下执行，其总是低于室温，优选约4℃；也可控制湿度。
本发明的方法还可以包括HA-胰酶的灭菌和病毒灭活或减少病毒负载，其可以通过以下被执行：例如，过滤、加热、辐射(紫外线、X射线、β射线和γ射线)，高压处理和/或核酸的烷基化，诸如使用β-propriolactone(BPL)。在诸如85℃以上的温度加热，优选在85℃和100℃之间持续适当的时间段，诸如18小时以上，及优选在18和48小时之间，甚至更优选在18和30小时之间也有效地减少病毒污染物。在较低的温度下加热(84℃，优选80℃)可在具有0.5重量％或更少的剩余水分的固体HA-胰酶上进行。
从以上清楚的是，本发明中公开的方法具有很多优势。它保留了消化液中存在的消化酶的天然谱和天然来源，并保持起始材料的消化特性。它移除了作为粗提取方法的结果而保留的消化不需要的那些材料，因此降低了API的体积。它使细菌或病毒污染物的减少或清除成为可能。它使控制混合酶类彼此的比率成为可能。此外，它使以数种剂型配制高效的API成为可能。
出于以上列出的原因，本文描述的方法产生优于现有产品的产品并代表疗法的显著进步。
实验
材料
胰脂肪酶(API，起始胰脂肪酶或胰酶、天然胰脂肪酶或胰酶)由Nordmark提供。其是从猪胰脏中提取的并通常包含约30％的蛋白质(使用Bradford法定量)并具有94.4IU/mg的脂肪酶活性、253.2IU/mg的蛋白酶活性、420.3IU/mg的淀粉酶活性；P/L比是2.7，A/L比是4.5；水含量为0.3。通过单和二维电泳及随后的MALDITOF表征来分析这一材料以确定胰脂肪酶组成部分(MarioNegriInstitute,Milan,Italy)。对该提取物的二维电泳显示明显易溶于水(apparentlyreadilysolubleinwater)的级分中有至少50个蛋白质/肽点，及明显不易溶于水(apparentlylessreadilysolubleinwater)的级分中有30个蛋白质/肽点。溶解度的确定因活性酶可以吸附到胰脂肪酶的非水溶性成分上或以其他方式被胰脂肪酶的非水溶性成分困住的事实而混淆。溶解性也受pH影响。在切下并用牛胰蛋白酶消化主要点，且使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)和酶谱法分析之后，分析对应混合物中的单个蛋白质的点和使用较易溶或较不溶的级分制备的凝胶的图像。将肽质量指纹术与来自文库的那些参照对比，并鉴定淀粉酶、脂肪酶、辅脂肪酶、羧肽酶A1和B、弹性蛋白酶2A和1、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和磷脂酶A2。提取物明显相对粗糙并包含数种活性酶类型以外的许多额外的蛋白质。
肠内配方：Junior1.0Cal(Nestlé，250mL装)：脂肪含量：3.8g/100mL，蛋白含量：3g/100mL，脂肪和碳水化合物含量：20.4g/Ml。
方法
脂解活性：测量以基于在胰脂肪酶酶USP专著中描述的脂肪酶测定的药典方法的方法进行，其基于通过pH稳态方法滴定由从使用的基质(橄榄油)中的酯化脂肪酸的水解形成的游离脂肪酸。它是基于以下原理：脂肪酶催化甘油三酯水解，导致游离脂肪酸(FFA)的形成。根据时间形成的FFA的滴定提供脂肪酶的酶活性的确认，其可以表示为单位：1U＝1μmol形成的FFA/分钟。反应通过由实验系统保持稳定pH值而发生，所述实验系统当pH值相较固定值变化时提供添加NaOH(滴定标准液)(pH稳态方法)。根据时间添加的滴定标准液的量与由脂肪酶对甘油三酯作用形成的FFA的量相对应。曲线斜率{加入的滴定标准液＝f(体积(mL)/时间(分钟))}给出脂肪酶的酶活性。
以下报道的脂肪酶活性(LA)始终表示为IUUSP。
以下报道的脂肪酶比活性(LSA)始终表示为IUUSP/mg。
蛋白质水解和amilolytic活性：测量根据在胰脂肪酶酶USP专著中描述的药典方法进行。以下报道的酶比活性(SA)始终表示为IUUSP/mg。
水含量通过TGA在80℃下4小时(样品18、19和20)或卡尔·费休方法(样品26、27和28)测量。
甘油三酯使用己烷：异丙醇(3:2)提取，使用棕榈酸胆甾醇酯为内部标准，并通过HPLC分析；通过与标准三油精溶液比较所有保留时间来鉴定峰。
蛋白质分析：使用Bradford测定定量总蛋白质含量。
碳水化合物分析：1)通过HPLC分析短链糖，使用木糖醇作为内部标准；通过与标准糖即麦芽糖比较所有保留时间来鉴定峰。2)在CarrezI和CarrezII存在下提取麦芽糖糊精，并通过HPLC分析；通过与标准麦芽糖糊精即麦芽糖一水合物、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖比较所有保留时间来鉴定峰。
实施例
实施例1HA胰酶的制备；0.1g/mL；多步：悬浮、分离、沉淀；(SP＝38：丙酮：水性溶剂＝35：65；乙醇：溶剂水性溶剂＝45:55)
步骤a1.1-悬浮：在4℃将起始胰脂肪酶以0.1g/mL的浓度分散在水性溶剂中，并在搅拌下保持30分钟。在实验室规模使用650mg(当有机溶剂是丙酮时)或550mg(当有机溶剂是乙醇时)的起始胰脂肪酶执行实验。为胰脂肪酶悬浮测试了四种不同的水性溶剂：1)pH＝4.0的缓冲剂(10mM乙酸盐缓冲剂)；2)pH＝7.0的缓冲剂(10mM磷酸盐)；3)去离子水(DW)；4)含有NaCl(0.5M)的pH＝4.0的缓冲剂(10mM乙酸盐)。
步骤a1.2-分离：离心来自步骤a1.1的悬浮液(10分钟，4℃，约11,000g)并将上清液(SN)从小团分离。
步骤a1.3-沉淀：将有机溶剂加入到步骤a1.2的上清液中，并将混合物以静止状态在4℃保持15分钟。所述有机溶剂是丙酮或乙醇。以每65份(体积)水性溶剂35份(体积)的量加入丙酮；以每55份(体积)水性溶剂45份(体积)的量加入乙醇。
步骤a2-分离：离心混合物(10分钟，4℃，约11,000g)以将上清液从小团分离，所述小团包含胰脂肪酶酶。将小团重新悬浮在步骤a1.1使用的水性溶剂中(在重新悬浮、沉淀之后的小团中的LA)。
分析不同步骤的材料。测量胰脂肪酶的量，将其表示为脂肪酶活性(LA)。
-在步骤a1的悬浮液中(悬浮液中的LA；LA-Sa1.1)；
-在步骤a2获得的上清液中(在沉淀SN中的LA，LA-SN)；
-在步骤a2获得并随后重新悬浮在起始介质的小团中(在沉淀小团中的LA，LA-P)。
在表1、2、3和4中报告结果。
表1
LA＝脂肪酶活性(IUUSP)；A＝丙酮。E＝乙醇；S＝悬浮液；SN＝上清液；P＝小团
表1示出，胰脂肪酶的沉淀(步骤a1.3)允许在沉淀部分(小团)中的脂肪酶活性的良好回收，其范围从约67％到约77％。产量是步骤a2的总脂肪酶活性(小团和上清液)相对表示为在步骤a1.1的悬浮液中的脂肪酶活性(Sa1.1)的初始的悬浮的胰脂肪酶的脂肪酶活性的％:(LA-SN+LA-P)/(LA-Sa1.1)。
表2
LA＝脂肪酶活性(IUUSP)；A＝丙酮。E＝乙醇；S＝悬浮液；SN＝上清液；P＝小团；Theor.＝理论。
该方法的产量在从约37％到约56％的范围。产量％是在步骤a2的小团和上清液中的总脂肪酶活性相对在步骤a1.1中使用的胰脂肪酶的理论脂肪酶活性，所述理论脂肪酶活性是通过包括未处理的原始材料的比活性(即如根据药典USP方法确定的94.4IUUSP/mg)及其初始重量的因素计算的。
表3
LSA＝脂肪酶比活性(IUUSP/mg)；A＝丙酮。E＝乙醇；SN＝上清液；EF＝富集系数＝在步骤a2的小团中的LSA/在步骤1.1a中的理论脂肪酶比活性，理论脂肪酶比活性即如根据药典USP方法所确定的94.4IUUSP/mg。
通过计算步骤a2的小团的脂肪酶活性和起始胰酶的脂肪酶活性(其为94.4IU/mg)之间的比率确定富集系数(不依赖pH的)。使用这个方法获得了最高到2.5的富集系数。还通过HPLC曲线分析确认了该富集。
关于其它消化酶，在最终的小团(步骤a2中的沉淀)中的淀粉酶含量低于起始胰脂肪酶中的淀粉酶含量。
实施例2HA胰酶的制备；0.3g/mL；多步：悬浮、分离、沉淀(SP＝38：丙酮：水性溶剂＝35：65；乙醇：水性溶剂＝45:55)
步骤a1.1-悬浮：在4℃将胰脂肪酶(API)以0.3g/mL的浓度分散在水性溶剂中，并搅拌30分钟。在实验室规模使用650mg(当有机溶剂是丙酮时)或550mg(当有机溶剂是乙醇时)的起始胰脂肪酶执行实验。在不同水性溶剂中各自运行两个实验：1)pH＝4.0的缓冲剂(10mM乙酸盐缓冲剂)；2)pH＝7.0的缓冲剂(10mM磷酸盐)。
步骤a1.2-分离：离心来自步骤a1的悬浮液(10分钟，4℃，约11,000g)并将上清液(SN)从小团分离。
步骤a1.3-沉淀：将有机溶剂加入到步骤a1.2的上清液中，并将混合物以静止状态在4℃保持15分钟。所述有机溶剂是丙酮或乙醇。以每65份(体积)水性溶剂35份(体积)的量加入丙酮。以每55份(体积)水性溶剂45份(体积)的量加入乙醇。
步骤a2-分离：离心混合物(10分钟，4℃，约11,000g)以将上清液从小团分离，所述小团包含胰脂肪酶酶。将小团重新悬浮在起始水性溶剂中(在重新悬浮、沉淀之后小团中的LA)。
步骤a3-干燥：将步骤a2的小团干燥。
分析不同步骤的材料。胰脂肪酶的量表示为脂肪酶活性(LA)且其在以下中测量：
-在步骤a1.1的悬浮液中(悬浮液中的LA；LA-Sa1.1)；
-在步骤a2获得的上清液中(在沉淀SN中的LA，LA-SN)
-在步骤a2获得的并随后重新悬浮在起始水性介质的小团中(在沉淀小团中的LA，LA-P)。
在表4、5和6中报告结果。
表4
LA＝脂肪酶活性(IUUSP)；A＝丙酮。E＝乙醇；S＝悬浮液；SN＝上清液；P＝小团
表4示出，沉淀之后的回收非常好(73-92％)。
表5
LA＝脂肪酶活性(IUUSP)；A＝丙酮。E＝乙醇；S＝悬浮液；SN＝上清液；P＝小团；Theor.＝理论。
对0.3g/mL胰脂肪酶浓度执行的多步法的总产量在从约56到约64的范围。
表6
LSA＝脂肪酶比活性(IUUSP/mg)；A＝丙酮。E＝乙醇；SN＝上清液；EF＝富集系数＝在步骤a2的小团中的LSA(IUUSP/mg)//在步骤a1.1中的理论脂肪酶活性(IUUSP/mg)。
通过计算步骤a2的小团的脂肪酶活性和步骤a1.1的起始胰脂肪酶的脂肪酶活性(其为94.4IU/mg)之间的比率确定富集系数。富集系数在从1.9到3.0的范围。
实施例3HA-胰酶的制备；0.1g/mL；两步：悬浮、沉淀(SP＝38：丙酮：水性溶剂＝35：65；乙醇：水性溶剂＝45:55，其中SP(丙酮)＝20.2，SP(乙醇)＝26.0，SP(缓冲剂)＝47.9)
步骤a1.1-悬浮：在4℃将胰脂肪酶以0.1g/mL的浓度分散在水性溶剂中，并在搅拌下保持30分钟。在实验室规模使用650mg(当有机溶剂是丙酮时)或550mg(当有机溶剂是乙醇时)的起始胰脂肪酶执行实验。在不同水性溶剂中各自运行两个实验：1)pH＝4.0，10mM乙酸盐缓冲剂；2)pH＝7.0，10mM磷酸盐缓冲剂。
步骤a1.2-沉淀：将有机溶剂加入到步骤a1.1的悬浮液中，并将这个混合物在4℃保持15分钟。所述有机溶剂是丙酮或乙醇。以每65份(体积)水性溶剂35份(体积)的量加入丙酮。以每55份(体积)水性溶剂45份(体积)的量加入乙醇。
步骤a2-分离：离心混合物(10分钟，4℃，约11,000g)以将上清液从小团分离，所述小团包含胰腺酶。将小团重新悬浮在起始水性溶剂中(在重新悬浮、分离之后的小团中的LA)。
分析不同步骤的材料。在整个过程中检测胰脂肪酶的量，将其表示为脂肪酶活性：
-在步骤a1.1的悬浮液中(悬浮液中的LA；LA-Sa1.1)；
-在步骤a2获得的上清液中(在分离SN中的LA，LA-SN)；
-在步骤a2获得的并随后重新悬浮在起始介质的小团中(在沉淀小团中的LA，LA-P)。
在表7、8和9中报告结果。
表7
LA＝脂肪酶活性(IUUSP)；A＝丙酮。E＝乙醇；S＝悬浮液；SN＝上清液；P＝小团。
沉淀后的回收高，使用两步法几乎达到完全回收。
表8
LA＝脂肪酶活性(IUUSP)；A＝丙酮。E＝乙醇；S＝悬浮液；SN＝上清液；P＝小团；Theor.＝理论。
总方法产量在从73.1到84.5的范围，高于使用多步法获得的。产量％是在步骤a2的小团和上清液中的总脂肪酶活性相对在步骤a1.1中使用的胰脂肪酶的理论脂肪酶活性，所述理论脂肪酶活性是通过包括起始材料的比活性(即如根据药典USP方法确定的94.4IUUSP/mg)及其初始重量的因素计算的。
表9
LSA＝脂肪酶比活性(IUUSP/mg)；A＝丙酮。E＝乙醇；SN＝上清液；EF＝富集系数＝在步骤a2的小团中的LSA(IUUSP/mg)/在步骤a1.1中的理论脂肪酶活性(IUUSP/mg)。
结果显示，在两步法中使用pH＝7的水性缓冲剂和丙酮提供有益的产量(总方法产量约76％)且富集系数在从2.1到4.2的范围。
实施例4HA-胰酶的制备；0.1g/mL；两步：悬浮、沉淀；扩大规模(SP＝38：丙酮：水性溶剂＝35：65)
步骤a1.1-悬浮：在4℃将6.5g起始胰脂肪酶(61,400U脂肪酶)分散在45mL的pH＝7.0的缓冲溶液中(10mM磷酸盐缓冲剂)，并每循环搅拌(Ultraturrax，3个循环)1分钟，将搅拌器用10mL冷缓冲剂洗涤两次以回收剩余的胰脂肪酶。
步骤a1.2-沉淀：将35mL丙酮加入到步骤a1.1的悬浮液中，并将这个混合物以静止状态在4℃保持30分钟。
步骤a2-分离：离心混合物(15分钟，4℃，约2,700g)以将上清液从小团分离，所述小团包含胰腺酶。
步骤a3-干燥：根据两种不同方案干燥小团，干燥后的小团的平均重量是1.55g，脂肪酶活性(LA)是365,000IU脂肪酶，且比活性(LSA)是235IUUSP/mg。
表10报告了对使用两种方案获得的每种材料测量的脂肪酶(L)、蛋白酶(P)及淀粉酶(A)比活性。还在干燥处理前测量在小团中的脂肪酶活性(在将其悬浮在1mL缓冲剂之后测量)。其等于233.7IUUSP/mg。
表10
LSA＝脂肪酶比活性(IUUSP/mg)；PSA＝蛋白酶比活性(IUUSP/mg)；ASA＝淀粉酶比活性(IUUSP/mg)。
分析显示，干燥过程自身不影响LSA且不同方案得到具有相同的酶活性的材料。如在先实施例那样计算的富集系数也总是大于2，且在不同的方案之间恒定，其为：2.5(样品18)、2.7(样品19)、2.3(样品10)，平均值为2.5。在干燥处理前测量的小团中的脂肪酶活性，等于233.7IUUSP/mg(样品18)。
表11
L＝脂肪酶；P＝蛋白酶；A＝淀粉酶；A＝活性；Y＝产量(％)；W＝干燥后测量的重量(g)。
使用不同方案获得的样品的HPLC曲线是可叠加的。没有观察到起始材料的HPLC曲线的相关定性差异。
实施例5HA-胰酶的制备；0.1g/mL；两步：悬浮、沉淀；扩大规模(SP＝38：乙醇：水性溶剂(pH＝7)＝45：55，样品21)；(SP＝34：丙酮：水性溶剂(pH＝7)＝50：50样品22)；(SP＝35:丙酮：水性溶剂(pH＝7)＝45：55，样品23)。这里对不同的起始胰脂肪酶量、不同的缓冲溶液体积和不同的丙酮体积(HS＝34或35)或乙醇体积(HS＝38)实行实施例4的制备过程。干燥方案为24小时，6-8℃，0.2mbar，所有其它参数和条件与实施例4相同。
表12
样品 HS 胰脂肪酶(g) 缓冲剂(mL) 丙酮(mL) 乙醇(mL)
21 38 5.5 55 无 45
22 34 5.0 50 50 无
23 35 5.5 55 45 无
在表13和14中报告结果。
表13
样品 LSA PSA ASA P/L比率 A/L比率
21 150.2 - - - -
22 123.3 351.7 436.0 2.85 3.54
23 158.7 388.9 241.9 2.45 1.52
LSA＝脂肪酶比活性(IUUSP/mg)；PSA＝蛋白酶比活性(IUUSP/mg)；ASA＝淀粉酶比活性(IUUSP/mg)。
数据显示，干燥过程自身不影响LA且不同方案得到具有相同的酶活性的材料。如在先实施例中的那样计算的富集系数是：1.6(样品21)、1.3(样品22)、1.7(样品23)。
表14显示使用在此施加的扩大规模的方法获得的最终的纯化的材料的酶活性以及酶产量。
L＝脂肪酶；P＝蛋白酶；A＝淀粉酶；A＝活性；Y＝产量(％)；W＝干燥后测量的重量(g)。
使用不同冻干方案获得的样品的HPLC曲线是可叠加的。没有观察到起始材料的HPLC曲线的相关定性差异。
使用不同方案获得的样品25和26表现出比使用方案(HS＝38)生产的样品24更低的比LA和更高的PA和AA。
实施例6HA-胰酶的制备；0.065和0.1g/mL；单步；实验室规模(SP＝38-丙酮：水性溶剂＝35：65)
步骤a1-悬浮-沉淀：在4℃在搅拌下将650mg(样品24)或1000mg(样品25)的天然胰脂肪酶分散在10mL的65：35的缓冲剂(pH＝710mM磷酸盐)和丙酮的混合物(65体积的缓冲剂和35体积的丙酮)中30分钟。
步骤a2-分离：离心步骤a1的混合物(10分钟，4℃，10,000g)以将上清液从小团分离，所述小团包含胰腺酶。
步骤a3)-干燥：使用高效泵在0.2mbar干燥小团。
分析材料。在整个过程中测量胰脂肪酶的量，表示为脂肪酶活性：
-在步骤a2获得的上清液中(在分离SN中的LA，LA-SN)；
-在步骤a2获得的并随后重新悬浮在起始介质的小团中(在沉淀小团中的LA，LA-P)；
-悬浮-沉淀步骤a1的LA(悬浮液中的LA；LA-SN)表示为理论值。
在表15和16中报告结果。
表15
LA＝脂肪酶活性(IUUSP)；A＝丙酮；E＝乙醇；S＝悬浮液；SN＝上清液；P＝小团；Theor.＝理论。
表16
LA＝脂肪酶活性；A＝丙酮。E＝乙醇；SN＝上清液；EF＝富集系数＝在步骤a2的小团中的LSA(IUUSP/mg)/在步骤a1中的理论脂肪酶活性(IUUSP/mg)。
单步法提供良好的产量和比两步法更高的增强系数。这对于工业化是有意义的，因其实行的简单和直接。
实施例7HA胰酶的制备；0.1g/mL；单步；小型规模(SP＝38-丙酮：水性溶剂＝35：65)。
步骤a1-悬浮-沉淀：在4℃在搅拌下将10g天然胰脂肪酶分散在100mL的缓冲剂(pH＝7，10mM磷酸盐)和丙酮的溶剂混合物(65体积的缓冲剂和35体积的丙酮)中60分钟。
步骤a2-分离：离心步骤a1的混合物(10分钟，4℃，2,700g)以将上清液从小团分离，所述小团包含胰腺酶。
步骤a3-干燥，将样品26中的小团倒入培养皿中，而将样品28和29的小团保留在离心管中并使用高效泵在0.2mbar直接干燥。
分析材料。在整个方法中测量以下中的胰脂肪酶的量，表示为脂肪酶活性：
-在步骤a2获得的上清液中(在分离SN中的LA，LA-SN)；
-在步骤a2获得的并随后重新悬浮在起始介质的小团中(在分离小团中的LA，LA-P)；
-悬浮-沉淀步骤a1的LA(悬浮液中的LA；LA-SN)表示为理论值。
在表17和18中报告结果。
表17
样品 LSA PSA ASA p/L比率 A/L比率
26 207.8 249.4 155.20 1.20 0.75
27 222.7 249.2 158.90 1.12 0.71
28 219.1 285.0 167.50 1.30 0.76
在脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活性方面获得了良好的再现性。
表18
L＝脂肪酶；P＝蛋白酶；A＝淀粉酶；A＝活性；Y＝产量(％)；W＝干燥后测量的重量(g)。
获得了非常高的脂肪酶产量，富集系数也是高的(高于2)：其是：2.2(样品26)、2.4(样品27)、2.3(样品28)。
单步法提供良好产量。获得了4.2grHA-胰酶(起始胰脂肪酶的42％)，脂肪酶的总单位是940,000IUUSP(初始LA的99-100％)。获得的HA-胰酶具有221IUUSP/mg的比活性。
实施例8HA-胰酶的制备；0.1g/mL；多步：悬浮、沉淀、分离；比较性实施例(SP＝38-丙酮：水＝35：65)。
步骤a1.1-悬浮：在4℃在搅拌下将胰脂肪酶以0.045mg/mL的浓度(样品29)分散在水性溶剂(蒸馏水)中约30分钟。
步骤a1.2-沉淀：将80mL的溶剂混合物(丙酮：水＝35：45)加入到20mL步骤a1.1的悬浮液中(以获得SP＝38(Mpa)0.5的最终溶剂混合物)；将混合物在静止状态下在25℃保持60分钟。
步骤a2-分离：离心混合物(10分钟，3,000g，25℃)以从上清液分离小团，所述小团包含胰腺酶。
分析不同步骤的材料。在整个过程中检测胰脂肪酶的量，表示为脂肪酶活性：
-在步骤a1.1的悬浮液中(悬浮液中的LA；LA-Sa1.1)；
-在步骤a2获得的上清液中(在沉淀SN中的LA，LA-SN)；
-在步骤a2获得的并随后重新悬浮在起始蒸馏水的小团中(在沉淀小团中的LA，LA-P)。
在表19-20中报告结果。为了直接比较的目的，在此处报告在之前的实施例中使用两步和单步方法获得的结果。
表19
LA＝脂肪酶活性(IUUSP)；A＝丙酮；E＝乙醇；S＝悬浮液；SN＝上清液；P＝小团；Theor.＝理论。
表20
LSA＝脂肪酶比活性(IUUSP/mg)；A＝丙酮。E＝乙醇；SN＝上清液；EF＝富集系数＝在步骤a2的小团中的LSA(IUUSP/mg)/在步骤a1中的理论脂肪酶活性(IUUSP/mg)。
这种现有技术方法提供低的产量，酶失活显著且因而没有获得脂肪酶的富集。
实施例9纯化的HA-胰酶的表征(样品20)
测试HA材料的消化能力并将其同起始胰脂肪酶比较。将20mgHA-胰酶和50mg起始胰脂肪酶(对应2300IUUSP脂肪酶)分别悬浮于1mL去离子水中并在37℃将其加入到50mL肠内制剂Junior1.0中，并在100rpm搅拌60、120和240分钟。在1、2和4小时后进行消化测试。对每个胰脂肪酶样品重复测试6次。
通过测量三油精的消化(三油精峰的降低)监测脂类营养物。通过Bradford方法监测总蛋白质的消化。通过测量短链糖的形成监测淀粉水解过程。通过在4小时的消化后比较天然和HA材料的消化表现获得消化程度的差异。
表21
H＝HA-胰酶；N＝天然胰酶；W＝重量(mg)
使用以下公式计算活性差异：
(天然胰酶活性-HA-胰酶活性)/天然胰脂肪酶活性
使用以下公式计算消化差异：
(天然胰酶消化的％-HA-胰酶消化的％)
这一体外测试允许对HA-胰酶的脂肪酶、蛋白质和碳水化合物消化的分析。脂肪酶消化对反应容器中存在的酶活性的差异极其敏感，因此活性中达10％的差异对应于消化量中10％的差异。消化动力学显示相似的趋势。这些结果显示，天然和HA-胰酶具有相似的脂类消化模式。
蛋白质消化曲线也几乎重叠，显示HA-胰酶的蛋白酶活性支持同天然胰脂肪酶水平相同的消化。蛋白酶活性上约60％的差异没有对蛋白质的消化程度产生任何影响。
因麦芽糖产生在HA-胰酶中较低，碳水化合物的消化曲线是有差异的。在淀粉酶活性的差异和消化产物的量上的比较显示，在HA-胰酶中也发生淀粉水解。

Claims (42)

1.一种高活性胰酶(HA-胰酶)，其中所述胰脂肪酶具有至少约120USPIU/mg的脂肪酶比活性。
2.根据权利要求1所述的胰酶，其中所述胰酶具有至少约150USPIU/mg的脂肪酶比活性。
3.根据权利要求1所述的胰酶，其中所述胰酶具有至少约200USPIU/mg的脂肪酶比活性。
4.根据权利要求1所述的胰酶，其中所述胰酶具有至少约500USPIU/mg的脂肪酶比活性。
5.一种高效的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1、2、3或4所述的HA-胰酶。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的组合物，其中所述胰酶是源自猪的。
7.根据权利要求5或6所述的组合物，所述组合物包含每剂量单位至少约9,000、约20,000、约40,000、约60,000、约80,000或约100,000USPIU脂肪酶。
8.根据权利要求7所述的组合物，所述组合物包含多个HA胰酶的包衣的颗粒，所述颗粒包含用至少一种肠溶聚合物包衣的核心。
9.根据权利要求5、6、7或8所述的组合物，所述组合物为粉末、丸剂、微球、胶囊、袋剂、片剂、液体悬浮剂或液体溶液的形式。
10.一种用于制备HA-胰酶的方法，所述HA-胰酶具有至少约120USPIU/mg的脂肪酶比活性，所述方法包括用具有包含在28和45(MPa)0.5之间的Hildebrand溶解度参数的溶剂处理胰酶，其中所述溶剂是一种有机溶剂或有机溶剂的混合物或至少一种有机溶剂和水性溶剂的混合物，且所述方法的温度低于室温。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述溶剂具有包含在28和38(MPa)0.5之间的Hildebrand溶解度参数。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述溶剂具有包含在28和34(MPa)0.5之间的Hildebrand溶解度参数。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述溶剂具有包含在34和38(MPa)0.5之间的Hildebrand溶解度参数。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述溶剂具有包含在34和45(MPa)0.5之间的Hildebrand溶解度参数。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述溶剂具有包含在38和45(MPa)0.5之间的Hildebrand溶解度参数。
16.根据权利要求10、11、12、13、14或15所述的方法，所述方法用于制备具有至少约150USPIU/mg的脂肪酶比活性的胰酶。
17.根据权利要求10、11、12、13、14或15所述的方法，所述方法用于制备具有至少约200USPIU/mg的脂肪酶比活性的胰酶。
18.根据权利要求10、11、12、13、14或15所述的方法，所述方法用于制备具有至少约250USPIU/mg的脂肪酶比活性的胰酶。
19.根据权利要求10所述的方法，所述方法包括以下步骤：
a1)在溶剂中悬浮胰酶，所述溶剂具有包含在34和45(MPa)0.5之间的Hildebrand溶解度参数，其中所述溶剂是一种有机溶剂或多种有机溶剂的混合物、或至少一种有机溶剂和水性溶剂的混合物；
a2)从步骤a1的混合物的可溶部分分离不可溶部分；
a3)干燥步骤a2中获得的所述不可溶部分；且
其中所述方法的温度低于室温。
20.权利要求19所述的方法，其中步骤1a)进行约30分钟，且方法温度为4℃。
21.根据权利要求10、19或20所述的方法，其中所述溶剂是至少一种有机溶剂和水性溶剂的混合物且其中步骤a1包括以下步骤：
a1.1)在搅拌下在水性溶剂中悬浮胰酶；
a1.2)向步骤1a的悬浮液添加一种有机溶剂或其混合物；且
其中所述方法的温度低于室温。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述溶剂是至少一种有机溶剂和水性溶剂的混合物且其中步骤a1包括以下步骤：
a1.1)在搅拌下在所述水性溶剂中悬浮胰酶；
a1.2)将步骤a1.1的可溶部分从不可溶部分分离；
a1.3)向步骤a1.2的所述可溶部分添加一种有机溶剂或其混合物；
且其中所述方法的温度低于室温。
23.根据权利要求22所述的方法，其中步骤a1.3进行约30分钟，且方法温度是4℃。
24.根据权利要求21、22或23所述的方法，其中所述步骤a1.1的胰酶是以包含在0.05和0.3mg/mL之间的量。
25.根据权利要求10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24所述的方法，其中所述溶剂具有38(MPa)0.5的Hildebrand溶解度参数。
26.根据权利要求10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25所述的方法，其中所述有机溶剂选自以下的组：正戊烷、正己烷、正庚烷、乙醚、环己烷、四氯化碳、乙酸乙酯、四氢呋喃、氯仿、三氯乙烯、丙酮、二甲基甲酰胺、正丙醇、异丙醇、乙醇、dimethylsulfoxidebutylalcohol、甲醇、乙腈、二噁烷和methylenchloride。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述有机溶剂选自丙酮、异丙醇和乙醇的组。
28.根据权利要求10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26所述的方法，其中所述水性溶剂是缓冲溶液。
29.根据权利要求10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或28所述的方法，其中所述缓冲溶液具有pH＝7或pH＝4。
30.根据权利要求10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或28所述的方法，其中所述有机溶剂是丙酮且所述水性溶剂是pH＝7的缓冲溶液。
31.根据权利要求10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28所述的方法，其中所述有机溶剂是乙醇且所述水性溶剂是pH＝7的缓冲溶液。
32.根据权利要求10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28所述的方法，其中所述有机溶剂是丙酮且所述水性溶剂是pH＝4的缓冲溶液。
33.根据权利要求10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28或24所述的方法，其中所述有机溶剂是乙醇且所述水性溶剂是pH＝4的缓冲溶液。
34.根据权利要求19或21所述的方法，其中所述溶剂具有38(MPa)0.5的Hildebrand溶解度参数，且其中所述溶剂是丙酮和pH＝7的缓冲溶液的混合物，及步骤1a中的胰酶是以0.1mg/mL的浓度。
35.根据权利要求22所述的方法，其中所述溶剂具有38(MPa)0.5的Hildebrand溶解度参数，且其中所述溶剂是丙酮和pH＝4的缓冲溶液的混合物，及步骤a1中的胰酶是以0.1mg/mL的浓度。
36.根据权利要求22所述的方法，其中所述溶剂具有38(MPa)0.5的Hildebrand溶解度参数，且其中所述溶剂是乙醇和pH＝4的缓冲溶液的混合物，及步骤a1中的胰酶是以0.1mg/mL的浓度。
37.根据权利要求22所述的方法，其中所述溶剂具有38(MPa)0.5的Hildebrand溶解度参数，且其中所述溶剂是丙酮和pH＝7的缓冲溶液的混合物，及步骤a1中的胰酶是以0.3mg/mL的浓度。
38.根据权利要求23所述的方法，其中所述溶剂具有38(MPa)0.5的Hildebrand溶解度参数，且其中所述溶剂是丙酮和pH＝4的缓冲溶液的混合物，及步骤a1中的胰酶是以0.3mg/mL的浓度。
39.根据权利要求23所述的方法，其中所述溶剂具有38(MPa)0.5的Hildebrand溶解度参数，且其中所述溶剂是乙醇和pH＝4的缓冲溶液的混合物，及步骤a1中的胰酶是以0.3mg/mL的浓度。
40.根据权利要求10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39所述的方法，所述方法包括微生物和/或病毒负载减少的步骤。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述细菌和/或病毒负载减少通过过滤、加热、离子辐射、高压或通过烷基化进行。
42.治疗患有与胰腺酶不足相关的生理状况的患者的方法，所述方法包括对患者施用药学上可接受量的根据权利要求5、6、7、8或9所述的组合物。
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