KR20160055123A - 고효능 판크레아틴 약학적 조성물 - Google Patents

고효능 판크레아틴 약학적 조성물 Download PDF

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로버트 베커
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Abstract

본 발명은 고활성 판크레아틴 효소를 포함하는 고효능 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HA-판크레아틴 효소의 제조방법 및 이의 조성물 또는 제형, 및 이의 이용방법에 관한 것이다.

Description

고효능 판크레아틴 약학적 조성물 {HIGH POTENCY PANCREATIN PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS}
상호-관련 출원
본 출원은 35 USC § 119(e) 하에 2013년 7월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 제 61/856,952호의 우선권을 주장하고, 개시 내용은 모든 목적을 위해 전부 참조로 본 명세서에 포함된다.
기술분야
본 발명은 고활성 판크레아틴 (HA-판크레아틴) 효소를 포함하는 고효능 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HA-판크레아틴 효소의 제조방법 및 이의 조성물 또는 제형, 및 이의 이용방법에 관한 것이다.
FDA가 200,000 이상의 미국인이 고통받고 있는 것으로 추정하는 외분비 췌장기능부전(Exocrine pancreatic insufficiency, EPI)은, 개인들이 이들의 췌장에 의해 만들어지는 소화 효소의 결핍으로 인해 제대로 음식물을 소화시킬 수 없는 생리적 장애(physiological disorder)를 수반한다. 이러한 소화 효소의 손실은 소화불량 및 영양소의 흡수 불량과 같은 장애를 야기하고, 영양실조 및 이로 인한 다른 것 및 이와 관련된 바람직하지 않은 생리적 상태를 야기한다. 이러한 장애는 낭포성 섬유증(cystic fibrosis, CF) 및 췌장의 외분비 기능을 손상시키는 기타 질병, 예를 들어 췌장암, 췌장절제술(pancreatectomy), 및 췌장염에 걸린 사람들에게서 흔하다. 영양실조는 특히 영유아 및 CF 환자의 경우 치료되지 않은 채 방치되면, 생명을 위태롭게 할 수 있다. 이러한 장애는 성장 장애, 약화된 면역 반응, 및 기대 수명 단축을 야기할 수 있다.
소화 효소, 예를 들어 췌장리파제 효소 및 기타 췌장 효소 산물(pancreatic enzyme products, PEPs)은 적어도 부분적으로 EPI를 치료하기 위해 투여될 수 있다. 투여된 소화 효소는 환자들이 보다 효과적으로 음식물을 소화시킬 수 있도록 한다.
EPI의 치료에 사용되는 췌장리파제 효소는 주로 다른 것들 중 엘라스타제, 포스포리파제, 및 콜레스터라제를 포함하는 기타 효소와 함께, 3가지 효소 종류 (리파제, 아밀라제, 및 프로테아제), 및 다른 다양한 보조인자 및 조효소와 함께 다양한 보조인자 및 조효소의 조합이다; 효소 산물의 수준 또는 효능은 나열되어 있다. 이러한 효소는 췌장에서 자연적으로 생성되며, 지방, 단백질 및 탄수화물의 소화에서 중요하다. 상기 효소는 지방을 글리세롤 및 지방산으로 가수분해, 전분을 덱스트린 및 당으로 가수분해, 및 단백질을 아미노산 및 유도된 물질로 가수분해를 촉진시킨다. 그러나, 소화는 모든 종류의 소화제의 제조에서 소화 기능을 바로잡는데 기여하는 많은 다른 효소들 및 기질들을 수반하는 복잡한 공정이다.
췌장리파제 효소는 일반적으로 돼지 췌장샘에서 제조된다. 기타 췌장리파제 공급원은 소 췌장샘, 또는 췌액을 포함한다. 이러한 효소의 천연 포유류 공급원은 인간 췌장에 의해 분비되는 것과 유사한 효소 조성을 갖는 생성물을 야기한다. 기타 비-포유류 공급원은 U.S. 6,051,220, U.S. 2004/0057944, 2001/0046493, 및 WO2006044529에 기재된 것이 사용될 수도 있다.
췌장리파제-함유 생성물은 효과적인 치료를 제공할 수 있지만, 문제가 있다. 매 식사와 함께 다수의 (4-9) 상대적으로 큰 캡슐 (높은 알약 부하(high pill load))에 대한 요구는 투여에 대한 환자의 순응도를 감소시킨다. 또한, 높은 알약 부하로 인한 잠재적인 미생물 및 바이러스 오염은 바람직하지 않은 것으로 알려져 있다. 이러한 모든 문제는 덜 순수한 효소 추출물과 관련이 있다. 순도 문제는 조악한 수성 혼합물 또는 슬러리의 형성, 알콜로 침전, 원심분리 및 여과를 수반하는, 수년 간 적절한 효소 추출 과정의 결과이다. 이러한 추출 공정은 최소한 25% 단백질로 구성될 수 있는 최종 생성물을 생성한다. 이러한 췌장리파제 추출물에서 효능에 관하여 중요한 효소인, 리파제는 약 100 USP IU/mg의 활성을 가진다. 이것은 약 25,000 IU/mg의 활성을 가지는 순수한 돼지 리파제의 활성 (예를 들어, Sigma Aldrich에서 시판하는 순수한 돼지 리파제)과 대비된다. 계산을 위한 근거로 이 근사치를 사용하는 경우, 생성물은 0.5% 미만의 활성 리파제를 함유하는 것으로 추정될 수 있다. 또한, 과량의 비활성 물질의 존재의 추가 결과는, 임의의 감염성 오염이 필연적으로 이 벌크의 일부일 수 있고 그 결과 혼합물의 바람직한 활성 성분과 함께 섭취될 수도 있다는 것이다. 또한, 과량의 비활성 물질은 막 여과기 또는 여과 컬럼의 막힘으로 생균수(bio-burden)를 감소시키고, 이의 잠재적인 감염성 존재량(infectious burden)의 감소에 유용한 이온화 방사선으로부터 추출물을 차폐하는 것을 목적으로 하는 기술을 방해한다.
한 경우에, 많은 순수한 단일 효소 및 3개의 단일 효소의 혼합물은 EPI의 치료를 위해 임상 개발에 들어갔다. 이들은 재조합 담즙산염 자극 리파제 (recombinant bile salt stimulated lipase, BSSL) (Exinalda™/Kiobrina®); 모유에 함유된 재조합 인간 리파제 Merispase®; 재조합 개의 위 리파제 MS 1819; 재조합 리파제 및 리프로타마제; 화학적으로 교차-결합된 재조합 박테리아 리파제, 미생물 공급원으로부터 추출된 프로테아제 및 아밀라제로 이루어진 혼합물이다. 이러한 모든 실험 요법은 Zenpep® 또는 Ultresa®와 같은 돼지 췌장으로부터의 상용 효소 추출물의 것과 유사한 치료 효능 수준을 입증하는데 지금까지 실패하였다. 마찬가지로, 2011년 1월 12일에 FDA 자문 위원회 회의는 췌장리파제 추출 생성물로 미리 얻은 것과 비교하여 지방 흡수 계수(coefficient of fat absorption, CFA)의 증가 면에서 이의 낮은 효능 때문에 리프로타마제의 승인에 반대투표를 하였다.
이것은 더 좋고, 더 편리하고, 잠재적으로 더 안전한 생성물을 생성할 수 있도록, EPI의 치료에 대한 이의 효능을 아직까지 유지하는, 기존의 췌장리파제-함유 생성물에 비해 더 농축되고 더 정제된 생성물에 대한 명백한 필요성이 있다. 프로테아제, 리파제 또는 아밀라제의 분리를 위한 출발 물질로서 췌장리파제의 용도를 기재한 많은 문헌 보고가 있다; 그러나, 치료적 사용을 위한 개선된 생성물을 제조하기 위해 정제되는 PEPs 또는 유사한 생성물에서 확인되는 유형의 췌장리파제의 보고는 없다. 각각의 경우, 본 명세서에 기재된 발명 이전의 노력은 다른 것보다 특정 효소 또는 효소 분획을 정제하거나 또는 실질적으로 전체 효소 활성을 증가시키지 않고 특정 성분을 제거하는 것이었다. 모든 경우에, 치료제로서 사용하기 위한 HA-판크레아틴 생성물을 제조하려는 방법도 없었다.
단백질 정제를 기재하는 선행 기술은, 췌장리파제에 의해 예시된 바와 같이, 간단한 단백질-풍부 분획을 추출 및 분리하거나, 또는 단일 단백질 또는 단일 종류의 단백질, 예를 들어 리파제 또는 프로테아제를 분리하는 것을 목표로 한다.
예를 들어, Hwang (Ind. Eng. Chem. Res. 2007, 46, 4289)은, 췌장 효소 용해도 및 용매 극성 간의 관계를 개시하고 있고, 췌장 단백질로부터 리파제, 프로테아제 및 아밀라제의 선택적 침전에 관하여 보고하고 있다. Hwang은 감소된 극성을 갖는 용매가 사용될 때 판크레아틴 침전이 향상되고, 용매가 28 (MPa)0.5 이하의 힐데브란트 용해도 매개변수(Hildebrand solubility parameter)를 가질 때 판크레아틴 침전이 극대화됨을 보여준다; 아밀라제 및 프로테아제의 선택적 침전은 34 (MPa)0.5 이하의 용매 극성의 감소와 함께 증가되는 반면, 리파제의 선택적 침전은 용매 극성과는 관계없고, 혼합물에 존재하는 65% 미만의 리파제는 회수된다. 이러한 결과로부터, 다양한 췌장 효소를 함께 정제하여 HA-판크레아틴을 얻는 것에 대해 보상이 없고, 정제 동안 효소 종류의 혼합물을 보존하려는 당업자에 대해서도 보상이 없다. 60년 이상 치료제로 잘 사용되어 온 췌장리파제를 정제하려는 시도가 없었다는 사실은, 이것을 하는 것의 이점이 예상되거나 또는 평가되지 않았다는 강한 지표이다. 췌장리파제 생성물을 개선하려는 모든 시도는, 개선된 생성물의 제조를 위해 더 순수하고 및/또는 더 농축된 효소의 공급원으로서 췌장리파제의 사용이 미리 평가되지 않았음을 더 강조하는, 비-췌장 공급원으로부터의 단일 효소에 초점이 맞춰졌다.
이것이 의약품 및 세정 적용에 현재 사용되고 있기 때문에, 몇 배 더 높은 효소 농도와 함께 효소 활성의 상당히 유사한 정성 및 정량 프로파일을 갖는 생성물을 제조할 목적으로, 췌장리파제를 정제할 보상 또는 이유가 없다. 사실, 현재의 생성물은 충분히 자신의 역할을 수행하고 있고, 60년 이상 동안 실질적으로 변하지 않았으며, 본 명세서에 기재된 현저히 개선된 생성물 또는 관련 제조 방법의 기술 분야에서 더 설명할 수 없는 것처럼 보인다. EPI의 치료를 위한 순수한 효소를 함유하는 이러한 생성물은 모두, 재조합 기술 또는 미생물 공급원으로부터, 단일 효소들 또는, 한 경우에는, 3개의 순수하고 화학적으로 변형된 단일 효소들의 혼합물을 기반으로 하였다. EPI, 세정 및 조직 소화의 치료를 위해 사용되는 조 췌장샘 추출물로부터 프로테아제, 리파제 및 아밀라제를 포함하는 혼합물을 정제하려고 노력하지 않았다. 마찬가지로, 개별적으로 정제된 다음 나중에 재조합되는 췌장 공급원으로부터의 효소의 보상 또는 보고가 없었다; 이러한 방법은 분리된 효소 또는 효소 종류를 이루려는 목적에 반하는 것이다.
본 발명은 HA-판크레아틴 효소 및 이의 고효능 약학적 조성물 또는 제형에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 고수율의 HA-판크레아틴의 제조방법 및 이러한 생성물의 이용방법에 관한 것이다.
본 발명은 효과적이고 상당히 높은 치료 활성을 갖는, 더 상세하게는 불필요한 생물학적 성분 및/또는 바람직하지 않은 잠재적인 감염성 성분의 감소된 생균수를 갖는 필수 효소 종류를 포함하는 생성물 (HA(고활성)-판크레아틴)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 매우 고수율의 HA-판크레아틴의 제조방법에 관한 것이다. HA-판크레아틴은 더 작고 더 간편한 제형, 특히 단일 알약으로 전달될 수 있는 제형, 현탁을 위한 작은 입자 제형 및 단일 용량 단위로 기타 치료적이거나 또는 유용한 성분과 조합될 수 있는 제형으로 제제화할 수 있다. 이러한 변화는 EPI에 걸린 환자, 예를 들어 낭포성 섬유증 환자에게 특히 유용할 것이다. 또한, 본 발명은 환자의 연령 또는 상태가 캡슐 이외의 대안적인 투여 형태, 예를 들어 현탁액, 입자를 요구하는 경우, 제형으로 제제화하는데 유용할 것이다. 이런 이유로, 더 농축되고, 더 작은 제형 단위 또는 입자가 이러한 환자 군에게 매우 유용할 것이다. 또한, 본 발명은 상기와 같은 이유로 미생물 및 임의의 관련된 독소와 같은 불필요하거나 또는 바람직하지 않은 생물학적 성분을 감소시키거나 또는 제거하도록 설계된 기술을 적용할 수 있다.
본 발명은 HA-판크레아틴 효소 (HA-판크레아틴) 및 이의 고효능 약학적 조성물에 관한 것이다. 특정 실시예에서, HA-판크레아틴은 돼지에서 유래된다. HA-판크레아틴은 리파제, 프로테아제, 및 아밀라제를 포함하며, 적어도 약 120, 또는 적어도 약 150, 또는 적어도 약 200, 또는 적어도 약 400, 또는 적어도 약 500 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 가진다.
본 명세서에 사용된 용어 "소화 효소"는 음식물이 유기체에 의해 섭취 또는 흡수될 수 있도록 음식물의 성분들을 분해하는 소화관에서의 효소를 나타낸다. 소화 효소의 비-제한적인 예는 췌장리파제 효소 (췌장리파제 또는 판크레아틴이라고도 함), 리파제, 코-리파제(co-lipase), 트립신, 키모트립신, 키모트립신 B, 판크레아토펩티다제(pancreatopeptidase), 카복시펩티다제 A, 카복시펩티다제 B, 글리세롤 에스터 가수분해효소(glycerol ester hydrolase), 포스포리파제, 스테롤 에스터 가수분해효소, 엘라스타제, 키니노게나제(kininogenase), 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, α-아밀라제, 파파인(papain), 키모파파인, 글루테나제, 브로멜라인(bromelain), 피신(ficin), β-아밀라제, 셀룰라제, β-갈락토시다제, 락타제, 수크라제, 이소말타제, 및 이의 혼합물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "췌장 효소"는 췌장 분비에 존재하는 효소 유형들 중 어느 하나, 예를 들어 아밀라제, 리파제, 프로테아제, 또는 이의 혼합물, 또는 효소 활성을 갖는 췌장 기원의 임의의 추출물, 예를 들어 판크레아틴을 나타낸다.
용어 "췌장리파제 효소" 또는 "췌장리파제" 또는 "판크레아틴"은 아밀라제, 리파제, 및 프로테아제 효소를 포함하여, 몇몇 유형의 효소의 혼합물을 나타낸다. 췌장리파제 효소는 Nordmark Arzneimittel GmbH, 또는 Scientific Protein Laboratories LLC에서 시판된다.
본 명세서에 사용된 용어 "API"는 "소화 효소" 또는 "췌장리파제 효소" 또는 "판크레아틴"을 나타낸다.
용어 "리파제"는 지질을 글리세롤 및 간단한 지방산으로 가수분해를 촉진시키는 효소를 나타낸다. 리파제의 예는 동물 리파제 (예를 들어, 돼지 리파제), 박테리아 리파제 (예를 들어, 슈도모나스 리파제 및/또는 버크홀데리아 리파제 (Burkholderia lipase)), 균류 리파제, 식물 리파제, 재조합 리파제 (예를 들어, 배양물에서 박테리아, 효모, 균류, 식물, 곤충 또는 포유류 숙주 세포 중 어느 하나로부터 선택된 적당한 숙주 세포, 또는 자연 발생적인 리파제-인코딩 핵산 등과 상동성 또는 실질적으로 동일한 핵산에 의해 인코딩된 리파제인 자연 발생적인 서열과 상동성 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 리파제에 의한 재조합 DNA 기술을 통해 제조됨), 합성 리파제, 화학적으로-변형된 리파제, 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 용어 "지질"은 광범위하게 지방, 왁스, 스테롤, 지용성 비타민 (예를 들어, 비타민 A, D, E 및 K), 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질 등을 포함하는 자연 발생적인 분자를 포함한다.
용어 "아밀라제"는 전분을 분해하는 글리코시드 가수분해효소, 예를 들어, α-아밀라제, β-아밀라제, γ-아밀라제, 산 α-글루코시다제, 프티알린(ptyalin) 등과 같은 타액 아밀라제를 나타낸다. 본 발명에서 사용에 적합한 아밀라제는 동물 아밀라제, 박테리아 아밀라제, 균류 아밀라제 (예를 들어, 아스퍼질러스 아밀라제, 예컨대, 아스퍼질러스 오리재 아밀라제), 식물 아밀라제, 재조합 아밀라제 (예를 들어, 배양물에서 박테리아, 효모, 균류, 식물, 곤충 또는 포유류 숙주 세포 중 어느 하나로부터 선택된 적당한 숙주 세포, 또는 자연 발생적인 아밀라제-인코딩 핵산 등과 상동성 또는 실질적으로 동일한 핵산에 의해 인코딩된 아밀라제인 자연 발생적인 서열과 상동성 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 아밀라제에 의한 재조합 DNA 기술을 통해 제조됨), 화학적으로-변형된 아밀라제, 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "프로테아제"는 일반적으로 단백질의 아미노산들 간의 펩티드 결합을 파괴하는 효소 (예를 들어, 프로테이나제, 펩티다제, 또는 단백질 가수분해효소 (proteolytic enzymes))를 나타낸다. 프로테아제는 일반적으로 이의 촉매 유형, 예를 들어, 아스파르트산 펩티다제, 시스테인 (티올) 펩티다제, 메탈로펩티다제, 세린 펩티다제, 트레오닌 펩티다제, 알칼리성 또는 반-알칼리성 프로테아제, 중성 및 알려지지 않은 촉매 메커니즘의 펩티다제에 의해 확인된다. 본 발명에서 사용에 적합한 프로테아제의 비-제한적인 예는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제 (예를 들어, 플라스멥신(plasmepsin)) 메탈로프로테아제 및 글루탐산 프로테아제를 포함한다. 또한, 본 발명에서 사용에 적합한 프로테아제는 동물 프로테아제, 박테리아 프로테아제, 균류 프로테아제 (예를 들어, 아스퍼질러스 멜레우스 프로테아제(Aspergillus melleus protease)), 식물 프로테아제, 재조합 프로테아제 (예를 들어, 배양물에서 박테리아, 효모, 균류, 식물, 곤충 또는 포유류 숙주 세포 중 어느 하나로부터 선택된 적당한 숙주 세포, 또는 자연 발생적인 프로테아제-인코딩 핵산 등과 상동성 또는 실질적으로 동일한 핵산에 의해 인코딩된 프로테아제인 자연 발생적인 서열과 상동성 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 프로테아제에 의한 재조합 DNA 기술을 통해 제조됨), 화학적으로-변형된 프로테아제, 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물의 췌장리파제 효소는 하나 이상의 리파제 (즉, 하나의 리파제, 또는 2 이상의 리파제), 하나 이상의 아밀라제 (즉, 하나의 아밀라제, 또는 2 이상의 아밀라제), 하나 이상의 프로테아제 (즉, 하나의 프로테아제, 또는 2 이상의 프로테아제), 및 다른 조합 및 비율로 이들 효소들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 유용한 조성물의 리파제 활성은 약 650 내지 약 100,000 IU (USP 방법)일 수 있다. 이것은 약 675 내지 약 825 IU, 약 2,500 내지 약 28,000 IU, 약 2,700 내지 약 3,300 IU, 약 4,500 내지 약 5,500 IU, 약 8,000 내지 약 11,000 IU, 약 13,500 내지 약 16,500 IU, 및 약 18,000 내지 약 22,000 IU, 약 22,500 내지 약 27,500 IU, 약 36,000 내지 약 44,000 IU, 및 모든 범위와 이들 사이의 부분 범위일 수 있다.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 적어도 약 650 IU (USP 방법), 더 바람직하게는 적어도 약 9,000 IU를 함유할 수 있고, 더욱 더 바람직하게는 용량 단위 당 약 20,000, 약 40,000, 약 60,000, 약 80,000, 또는 약 100,000 USP IU 단위 리파제를 함유한다.
본 발명에 따른 HA-판크레아틴 조성물은 분말 형태 또는 압축된 형태, 예를 들어 정제일 수 있으며, 또는 다수의 코팅된 및/또는 코팅되지 않은 입자를 포함할 수 있다. 상기 입자는 적어도 하나의 장용성 코팅으로 코팅된 코어를 포함할 수 있으며, 상기 코팅은 장용성 고분자를 함유한다. 상기 조성물은 상기 코팅된 입자 외에 췌장리파제의 코팅되지 않은 입자도 포함할 수 있다. 특히, 상기 입자는 미니정제(minitablets), 미립정(microtablets), 미립자(microparticles), 미립구 (microspheres), 미세캡슐(microcapsules), 미세펠렛(micropellets)이다. 상기 입자는 최대 약 5 mm의 직경을 가질 수 있다. 이들은 임의의 적당한 입자 크기 또는 모양을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 입자는 약 25-5,000 ㎛ 범위의 입자 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 이들은 약 2-5 mm 범위의 공칭 입경(nominal particle diameter)을 가지는 "미니정제"의 형태일 수 있거나, 또는 이들은 약 2 mm 미만, 예를 들어 약 1-2 mm의 공칭 입경을 가지는 "미립정"일 수 있다. 상기 입자는 약 800 ㎛ 미만, 바람직하게는 약 500 ㎛ 미만, 더 바람직하게는 약 200 ㎛ 미만의 평균 입자 크기를 가질 수 있다. 상기 입자는 400 ㎛ 이상의 부피 직경 (d(v,0.1)) (분포용적의 10%가 이 수치 이하이고 90%가 이 수치 이상인 경우의 직경으로 정의됨) 및 800 ㎛ 미만의 부피 직경 (d(v,0.9)) (분포용적의 90%가 이 수치 이하이고 10%가 이 수치 이상인 경우의 직경으로 정의됨)을 가질 수 있다.
췌장리파제 코어가 장용성 코팅으로 둘러싸여 있는 실시예에서, 상기 코팅은 약이 소장에 도달하기 전에 위의 산성 환경으로부터 약을 보호하고 실질적으로 약의 방출을 막는 장벽으로 작용한다. 장용성 코팅 조성물과 다른 코팅 조성물의 적당한 조합을 사용하여 약물 방출 동안 원하는 조절 유형 또는 치료 효과를 제공할 수 있다. 상기 장용성 코팅은 적어도 하나의 장용성 고분자 및 추가 부형제를 포함한다. 문구 "장용성 고분자"는 위의 내용물로부터 소화 효소를 보호하는 고분자, 예를 들어, 산성 pH에서는 안정하나 더 높은 pH에서는 빠르게 분해할 수 있는 고분자, 또는 위장관의 나머지와는 대조적으로, 이의 수화 또는 부식 속도가 소화 효소와 위의 내용물의 접촉이 위에 있는 동안 상대적으로 작다는 것을 보장할 만큼 충분히 느린 고분자를 의미한다.
장용성 고분자의 비-제한적인 예는 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 아세테이트 석시네이트, 폴리비닐아세테이트 프탈레이트, 메타크릴산의 공중합체, 메틸메타크릴레이트의 에스터, 메틸메타크릴레이트 공중합체, 및 메타크릴산/메틸메타크릴레이트 공중합체, 메타크릴산-에틸 아크릴레이트 공중합체 (1:1), 셸락(shellac), 및 에틸 셀룰로오스를 포함한다. 이러한 고분자들은 다른 상표명으로 시판된다: 예를 들어, 셀라세페이트(Cellacefate) (셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트), Eudragit® L100, S100, L30D, FS30D, L100-55, L30D55 (메타크릴산의 공중합체), Aquateric® (셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트), Aqoat® (히드록시프로필메틸셀룰로오스 아세테이트 석시네이트), 및 HP55® (히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트). 장용성 코팅은 탈크와 같은 다른 부형제를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 장용성 코팅은 10-20 wt.%의 적어도 하나의 장용성 고분자를 포함하며, 각각의 상기 wt.%는 코팅된 입자의 총 중량을 기준으로 한다. 상기 코팅은 친유성 물질, 예를 들어 지방족 카복실산 및 알콜로부터 선택된 C6 - C30 친유성 저분자량 분자, 바람직하게는 C14 - C18 카복실산 또는 알콜, 예를 들어 스테아르산, 미리스트산, 미리스틱 알콜, 또는 스테아릴 알콜을 더 포함할 수 있다. 상기 코팅의 다른 임의의 성분은 가소제, 항-고정제(anti-tacking agents) (예를 들어, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 콜로이드성 이산화규소 및 이의 조합; 또한 임의로 낮은 점도 에틸셀룰로오스)이다. 적당한 가소제의 비-제한적인 예는 트리아세틴, 트리부틸 시트레이트, 트리-에틸 시트레이트, 아세틸 트리-n-부틸 시트레이트, 디에틸 프탈레이트, 디부틸 세바케이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 피마자유, 아세틸화 모노- 및 디-글리세리드, 세틸 알콜, 및 이의 혼합물을 포함한다. 바람직한 가소제는 비-프탈레이트 가소제 또는 이의 혼합물이다.
HA-판크레아틴 코팅된 또는 코팅되지 않은 입자는 공지의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 미세펠렛은 HA-판크레아틴에 적당한 결합제를 가한 후 적당한 용매의 존재 하에 압출한 다음 구형화(spheronization)하여 제조될 수 있다. 작은 크기의 HA-판크레아틴 입자를 생성하기 위해 제어된 구형화(Controlled spheronization)가 적용될 수 있다. 분사 코팅(Spray coating), 분말 계층(powder layering) 및 유동층(fluid bed) 기술들은 비활성 코어의 코팅을 통해 비드를 제조하는데 사용될 수 있다. 코아세르베이션(Coacervation) 공정은 코팅된 췌장리파제 입자의 제조에도 유용할 수 있다.
직접 압축은 부형제-없는 압축된 정제를 제조하는데 사용될 수 있다. 특정한 경우에, 정제는 위액과 접촉하는 소수성 코팅층의 인시츄(in situ) 형성 때문에 위-내성(gastro-resistance)을 나타낼 수 있다.
HA-판크레아틴을 포함하는 조성물은 소화 효소를 함유하는 치료제의 투여에 적합한 임의의 형태일 수 있으며, 예를 들어, 이들은 분말, 펠렛, 미립구, 캡슐, 향낭(sachets), 정제, 액체 현탁액 및 액체 용액의 형태일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, HA-판크레아틴을 포함하는 제형, 특히, HA-판크레아틴을 포함하는 더 작고 및/또는 단일 제형이 제조될 수 있다. HA-판크레아틴의 이용률은 캡슐의 크기를 감소시킬 수 있으며, 및/또는 250-275 mg의 API로 채워진 20,000 단위 강도 Zenpep® 크기 0 캡슐의 일반적인 제제 조성물에 비해, 식사 당 감소된 수의 캡슐의 용량을 전달할 수 있게 한다. 성인 환자는 식사 당 이러한 캡슐을 4 내지 10으로 복용할 수 있다. 200,000 USP IU의 리파제의 전체 일일 용량에 대해, 환자는 현재 10 캡슐을 복용하고, 의약품 섭취는 약 2,500-2,750 mg 이다. 적어도 2배의 정제(purification)는 의미있는 개선 및 더욱 고도의 정제를 이룬다. 사실상, HA-판크레아틴 약학적 제형은, 경구 투여되는 캡슐의 형태로 복용하고, 약 100-110 mg의 API의 함량 (vs 250-275 mg)을 가질 수 있으므로, 200,000 USP IU의 리파제의 전체 일일 용량에 대해, 환자의 의약품 섭취는 약 1,000-1,100 mg (vs 2,500-2,750 mg)이다. 또한, HA-판크레아틴과 함께, 크기 2 (vs 크기 0) 캡슐이 사용됨으로써 투여되는 캡슐의 총 수도 대폭 감소될 수 있고, 또는 대안적으로 크기 0 캡슐을 유지하고 이의 함량을 적당히 조절함으로써 일일 섭취량을 상당히 감소시킬 수 있다. EPI 치료는 유아기에서 자주 발생하는 만성 치료이다. 이것이 더 작은 용량 단위에 함유될 수 있고 및/또는 식사 당 감소된 수의 용량 단위로 복용될 수 있도록 췌장리파제를 제제화하는 능력은 환자에게 상당한 혜택을 준다.
본 발명의 새로운 제형은 작은 입자 제형을 포함할 수도 있다. 단위 부피 당 증가된 효능을 갖는 췌장리파제 생성물은 비드의 치수의 감소에 관한 중요한 쟁점을 극복할 것이다. 대부분의 상용 췌장리파제 제형은 췌장리파제 비드로 채워진 캡슐이며, 장용성 고분자로 코팅되어 있다. 췌장리파제가 산성 매질에서 비가역적으로 비활성이기 때문에 코팅이 적용된다. 캡슐은 개방될 수 있으며, 특정 음식물에 뿌려진 비드는 어린 환자들 또는 삼키기 어렵거나 높은 복용 부담(high pill burden)을 극복하기 어려운 환자들에게 중요한 대안이다. 비드는 최대 2 mm일 수 있는 상당한 직경을 가지고 있으나, 이 대안이 모든 환자들의 요구를 처리하지는 않는다. 이것은 아기들 또는 경관 영양(tube feeding)을 필요로 하는 환자들에 대해 비드가 액체에 용이하게 현탁될 수 없다는 것을 의미한다. 비드의 치수를 감소시키려는 시도는 총 표면적의 상당한 증가를 초래하고, 그 결과 훨씬 더 장용성 고분자는 입자의 증가된 표면적을 효과적으로 덮는데 필요하다. 이것은 제형의 크기 및 제형의 크기가 복용 부담을 더 증가시키는 시점에 삼키는 고분자의 양을 크게 증가시키고, 코팅 부형제의 수준은 이의 일일 섭취량의 설정된 한계를 초과할 수 있다.
훨씬 감소된 크기를 갖는 HA-판크레아틴의 이용률은, 단일 용량 단위 또는 감소된 수의 용량 단위에 함유되는 전체 용량을 허용할 뿐만 아니라, 췌장리파제가 다른 화합물과 조합할 수도 있다. 제산제 완충제(antacid buffering agent), 예를 들어, 중탄산나트륨(sodium bicarbonate) 및 HA-판크레아틴은 단일 용량 단위로 조합될 수 있는 반면, 이것은 추가 캡슐/정제가 요구되고 및/또는 상기 캡슐/정제가 과도한 크기일 경우 이미 매우 높은 복용 부담을 상당히 증가시킬 것이기 때문에 현재의 췌장리파제를 이용하여 위의 pH를 증가시키는 물질과 췌장 효소의 이러한 조합을 고려하는 것이 가능하지 않을 것이다.
또한, HA-판크레아틴은 완충제가 판크레아틴의 리파제 성분의 산-비활성화를 예방하므로, 장용성 코팅 없이 분산시킬 수 있는 제형을 제공하는 방안을 제공한다. 또한, 중탄산염 분비가 일반적으로 EPI에 걸린 환자에서 감소되기 때문에, 중탄산염 보충제도 치료 혜택을 제공할 수 있다. 이러한 새로운 제형은 즉시 방출 또는 지연 방출을 위해 제제화될 수 있으며, 액체 매질에서 분산될 수 있다. 이러한 후자의 특성은 상기 성분이 공급물 또는 다른 간편한 매질에서 즉시 분산할 수 있기 때문에 액체 공급물을 필요로 하는 환자에게 상당한 이점을 제공한다. 이러한 조합은 다양한 종래의 제시물, 예를 들어 캡슐, 정제, 향낭, 비드 및 액체로 전달될 수 있다. 상기한 바와 같이, 췌장리파제 제형을 장용성 고분자로 코팅할 필요성은 산성 매질에서 리파제 효소의 불안정성의 결과이다. 그러나, 위의 pH가 상승하는 경우, 양성자 펌프 저해제의 사용을 통해, 양성자 펌프 저해제가 리파제를 비활성화할 만큼 충분히 낮은 pH 수준으로 노출되지 않는 것으로 추정되기 때문에, 리파제가 계속 활성상태로 유지하는 것이 입증되었다. 이러한 방법은 이것이 복용 부담을 증가시키고 다른 단점을 극복하기 위해 추가의 만성 약물을 사용하므로, 간편하지 않으며, 반드시 의학적으로도 바람직하지 않다. 위의 pH는 중탄산나트륨과 같은 간단한 제산제로 일시적으로 중화될 수 있으며, 산 불안정한 약물, 예를 들어 약물 Zegerid®의 성분인, PPI 오메프라졸을 보호하는데 효과적인 것으로 나타났다. 이 약물에서 중탄산나트륨의 수준은 l.lg이고, 오메프라졸의 수준은 20 mg 또는 40 mg이며, 이러한 성분들은 경질 쉘 캡슐에 함유된다.
HA-판크레아틴 및 적어도 하나의 다른 활성 화합물, 예를 들어 H2 길항제, 양성자 펌프 저해제 또는 담즙산염의 조합을 함유하는 단일 제형도 본 발명에 개시된다.
생성물 개선이 본 발명으로 얻어진다. 사실상, HA-판크레아틴의 제조는 이 생균수를 운반하는 물질의 양의 감소의 결과로서 간단히 생균수의 감소를 야기한다. 또한, 그러나, 제조 공정에 사용된 방법은 생균수를 감소시킬 수도 있고, 결과적으로 상당히 덜 방해되는 생성물이 제조될 것이다. 또한, 생성물로부터 상당량의 비활성 물질의 제거는 적용되는 주사가능한 생물제제에 사용되는 멸균 기술, 예를 들어, 여과, 자외선 (UV) 노출의 사용을 가능하게 한다. 또한, 이것은 생성물 특성에서 중요하고 예기치못한 개선을 나타낸다.
본 발명의 조성물 또는 경구 제형에 존재하는 HA-판크레아틴은 하기 공정에 따라 제조된다.
출발물질은 판크레아틴이다. 본 발명에서는, 용어 "API", 또는 "출발 판크레아틴", 또는 "출발 췌장 효소", 또는 "순수한 판크레아틴", "출발 췌장리파제", 또는 "순수한 췌장리파제"를 이용하여 나타낼 수도 있다.
간편한 출발물질은 Nordmark Arzneimittel GmbH, 또는 Scientific Protein Laboratories LLC에서 시판되는 돼지 유래 췌장리파제이다. 소 또는 다른 포유류 공급원으로부터의 유사한 추출물이 사용될 수도 있다. 바람직한 출발물질은 돼지 유래 췌장리파제이다. 조 추출물을 제조하는데 사용되는 추출 과정은 다음 단계를 포함하는 것으로 요약될 수 있다: 돼지 샘 습식 분쇄(pig glands ground wet) 단계; 췌장리파제 '활성화제'의 첨가 단계; "조 효소 슬러리 (crude enzyme slurry)"를 차갑고 뜨거운 이소프로판올로 처리하여 단백질을 침전시키고 지질을 제거하는 단계; 원심분리 및 여과하여 섬유질을 제거하고 압축 및 농축하는 단계; "습식 케이크"의 진공 건조 단계; 부피 밀도 및 입자 크기에 대해 "습식 케이크"의 덩어리를 절단하고 제분하는 단계. 이 건조 생성물은 현재 제품에 사용되는 판크레아틴이다.
본 발명의 HA-판크레아틴은 출발 판크레아틴을 더 처리하여 제조된다; 이것은 췌장 효소 기반 제품의 효능에 중요한 요소들을 보존하고 비-필수적인 요소들은 제거한다.
본 발명의 방법으로부터 얻은 물질은 HA-판크레아틴이다.
적어도 약 120 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 갖는 HA-판크레아틴은 용매로 판크레아틴을 처리하는 단계를 포함하는 공정을 이용하여 제조되며, 상기 용매는 28 및 45 (MPa)0.5 사이의 힐데브란트 용해도 매개변수 (SP)를 가지고, 상기 용매는 하나의 유기 용매 또는 유기 용매들의 혼합물, 또는 적어도 하나의 유기 용매 및 수성 용매의 혼합물이며, 공정은 낮은 온도, 바람직하게는 실온 이하의 온도에서 수행된다.
일 실시예에서, 적어도 약 120 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 갖는 HA-판크레아틴은 용매로 판크레아틴을 처리하는 단계를 포함하는 공정을 이용하여 제조되며, 상기 용매는 28 및 38 (MPa)0.5 사이의 힐데브란트 용해도 매개변수 (SP)를 가지고, 상기 용매는 하나의 유기 용매 또는 유기 용매들의 혼합물, 또는 적어도 하나의 유기 용매 및 수성 용매의 혼합물이며, 공정은 낮은 온도, 바람직하게는 실온 이하의 온도에서 수행된다.
하나의 특정 실시예에서, 적어도 약 120 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 갖는 HA-판크레아틴은 용매로 판크레아틴을 처리하는 단계를 포함하는 공정을 이용하여 제조되며, 상기 용매는 28 및 34 (MPa)0.5 사이의 힐데브란트 용해도 매개변수 (SP)를 가지고, 상기 용매는 하나의 유기 용매 또는 유기 용매들의 혼합물, 또는 적어도 하나의 유기 용매 및 수성 용매의 혼합물이며, 공정은 낮은 온도, 바람직하게는 실온 이하의 온도에서 수행된다.
다른 특정 실시예에서, 적어도 약 120 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 갖는 HA-판크레아틴은 용매로 판크레아틴을 처리하는 단계를 포함하는 공정을 이용하여 제조되며, 상기 용매는 34 및 38 (MPa)0.5 사이의 힐데브란트 용해도 매개변수 (SP)를 가지고, 상기 용매는 하나의 유기 용매 또는 유기 용매들의 혼합물, 또는 적어도 하나의 유기 용매 및 수성 용매의 혼합물이며, 공정은 낮은 온도, 바람직하게는 실온 이하의 온도에서 수행된다.
또 다른 실시예에서, 적어도 약 120 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 갖는 HA-판크레아틴은 용매로 판크레아틴을 처리하는 단계를 포함하는 공정을 이용하여 제조되며, 상기 용매는 34 및 45 (MPa)0.5 사이의 힐데브란트 용해도 매개변수 (SP)를 가지고, 상기 용매는 하나의 유기 용매 또는 유기 용매들의 혼합물, 또는 적어도 하나의 유기 용매 및 수성 용매의 혼합물이며, 공정은 낮은 온도, 바람직하게는 실온 이하의 온도에서 수행된다.
하나의 특정 실시예에서, 적어도 약 120 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 갖는 HA-판크레아틴은 용매로 판크레아틴을 처리하는 단계를 포함하는 공정을 이용하여 제조되며, 상기 용매는 38 및 45 (MPa)0.5 사이의 힐데브란트 용해도 매개변수 (SP)를 가지고, 상기 용매는 하나의 유기 용매 또는 유기 용매들의 혼합물, 또는 적어도 하나의 유기 용매 및 수성 용매의 혼합물이며, 공정은 낮은 온도, 바람직하게는 실온 이하의 온도에서 수행된다.
HA-판크레아틴은 적어도 약 120, 또는 적어도 약 150, 또는 적어도 약 200, 또는 적어도 약 400, 또는 적어도 약 500 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 가질 수 있다.
힐데브란트 용해도 매개변수는 특정 용매의 상대적 용매 행동(relative solvency behavior)을 나타내는 수치이다. 이것은 용매의 응집 에너지 밀도로부터 유래되고, 차례로 증발열로부터 유래된다. 힐데브란트 수치는 문헌 출처 (예를 들어, Barton Handbook of Solubility Parameters, CRC Press, 1983)로부터 이용할 수 있다. 공정 용매는 하나의 유기 용매 또는 유기 용매들의 혼합물, 또는 적어도 하나의 유기 용매 및 수성 용매의 혼합물이며; 상기 유기 용매와 수성 용매의 혼합물은 하나 이상의 유기 용매와 하나 이상의 수성 용매를 포함할 수 있다. 상기 용매는 45, 42, 40, 38, 36, 35, 34, 및 28의 용해도 값을 가질 수 있다.
유기 용매는 n-펜탄, n-헥산, n-헵탄, 디에틸에테르, 시클로헥산, 사염화탄소, 에틸아세테이트, 테트라히드로퓨란, 클로로포름, 트리클로로에틸렌, 아세톤, 디메틸포름아미드, n-프로판올, 이소프로판올, 에탄올, 디메틸설폭시드 부틸알콜, 메탄올, 아세토니트릴, 디옥산, 및 염화메틸렌을 포함하는 용매의 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 유기 용매는 아세톤, 이소프로판올, 및 에탄올이다.
수성 용매는 물 또는 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 완충액은 pH=7 또는 pH=4를 가진다. 이들은 각각 pH=7: 10 mM 인산염 완충액 및 pH=4.0: 10 mM 아세트산염 완충액일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 용매는 하나 이상의 유기 용매와 하나의 수성 용매를 포함하는 혼합물이고, 상기 혼합물은 28 내지 45 (MPa)0.5의 힐데브란트 용해도 매개변수를 가진다. 본 발명의 실시예에서, 용매는 하나 이상의 유기 용매와 하나의 수성 용매를 포함하는 혼합물이고, 상기 혼합물은 28 내지 38 (MPa)0.5의 힐데브란트 용해도 매개변수를 가진다. 하나의 특정 실시예에서, 용매는 하나 이상의 유기 용매와 하나의 수성 용매를 포함하는 혼합물이고, 상기 혼합물은 28 내지 34 (MPa)0.5의 힐데브란트 용해도 매개변수를 가진다. 하나의 특정 실시예에서, 용매는 하나 이상의 유기 용매와 하나의 수성 용매를 포함하는 혼합물이고, 상기 혼합물은 34 내지 38 (MPa)0.5의 힐데브란트 용해도 매개변수를 가진다. 다른 실시예에서, 용매는 하나 이상의 유기 용매와 하나의 수성 용매를 포함하는 혼합물이고, 상기 혼합물은 34 내지 45 (MPa)0.5의 힐데브란트 용해도 매개변수를 가진다. 하나의 특정 실시예에서, 용매는 하나 이상의 유기 용매와 하나의 수성 용매를 포함하는 혼합물이고, 상기 혼합물은 38 내지 45 (MPa)0.5의 힐데브란트 용해도 매개변수를 가진다. 용매 혼합물의 용해도 매개변수 (SP)는 힐데브란트 용해도 매개변수를 이용하여 계산된다.
일 실시예에서, 용매는 38 (MPa)0.5의 SP를 가지며, 유기 용매와 수성 용매의 혼합물이다. SP=38을 갖는 이러한 이성분 용매(binary solvent)의 몇 가지 예는 다음과 같다:
아세톤-완충액: SP(아세톤)=20.2, SP(완충액)=47.9인 경우; 아세톤 대 pH=7 완충액의 부피비는 35:65이고; 아세톤 대 pH=4.0 완충액의 부피비는 35:65이다;
에탄올-완충액: SP(에탄올)=26.0, SP(완충액)=47.9인 경우; 에탄올 대 pH=7 완충액의 부피비는 45:55이고; 에탄올 대 pH=4.0 완충액의 부피비는 45:55이다;
다른 실시예에서, SP=34 (MPa)0.5를 갖는 이성분 용매는 아세톤-완충액이고: SP(아세톤)=20.2, SP(완충액)=47.9인 경우; 아세톤 대 pH=7 완충액의 부피비는 50:50이다.
또 다른 실시예에서, SP=35 (MPa)0.5를 갖는 이성분 용매는 아세톤-완충액이고: SP(아세톤)=20.2, SP(완충액)=47.9인 경우; 아세톤 대 pH=7 완충액의 부피비는 45:55이다.
본 발명의 일 실시예에서 (한-단계 공정), 28-45 (MPa)0.5의 SP를 갖는 용매로 판크레아틴을 처리하는 단계는: al) 교반 하에 용매에서 판크레아틴을 현탁하는 단계; a2) 단계 al의 혼합물의 가용성 부분 (상청액)으로부터 불용성 부분 (펠렛)을 분리하는 단계; a3) 단계 a2에서 얻어진 불용성 부분을 건조하는 단계를 포함하고; 상기 단계 al-a3는 실온 이하의 온도에서 수행된다. 공정을 수행하는데 적당한 온도는 4℃이다.
본 발명의 일 실시예에서 (한-단계 공정), 34-38 (MPa)0.5의 SP를 갖는 용매로 판크레아틴을 처리하는 단계는: al) 교반 하에 용매에서 판크레아틴을 현탁하는 단계; a2) 단계 al의 혼합물의 가용성 부분 (상청액)으로부터 불용성 부분 (펠렛)을 분리하는 단계; a3) 단계 a2에서 얻어진 불용성 부분을 건조하는 단계를 포함하고; 상기 단계 al-a3는 실온 이하의 온도에서 수행된다. 공정을 수행하는데 적당한 온도는 4℃이다.
단계 a1은 바람직하게는 약 60분 동안 수행되며, 바람직한 온도는 4℃이다. 분리 단계 (단계 a2)는 원심분리, 침전 또는 여과와 같은 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 건조 단계 (a3)는 고효율 건조기, 진공 펌프, 또는 동결 건조기에서 수행될 수 있다; 다른 방법이 사용될 수도 있다. 단계 al에서 용매 내 판크레아틴의 농도는 0.050 및 0.3 mg/mL 사이, 바람직하게는 0.065 및 0.1 mg/mL 사이, 더 바람직하게는 0.065 또는 0.1 mg/mL로 포함되는 양이다.
한-단계 공정의 하나의 특정 실시예에서, 용매는 38 (MPa)0.5의 SP를 가지며, 아세톤과 pH 7 완충액 (예를 들어, 10 mM 인산염)의 혼합물이고, 단계 al에서 판크레아틴은 10 g/mL의 농도이다.
본 발명의 다른 실시예에서 (두-단계 공정), 용매가 유기 용매와 수성 용매의 혼합물인 경우, 판크레아틴을 먼저 수성 용매에 분산시킨 다음 유기 용매를 여기에 가한다. 이 실시예에서, 단계 al은 다음 단계를 포함한다: a1.1 (현탁) 교반 하에 수성 용매에서 판크레아틴을 현탁하는 단계; al.2 (침전) 단계 a1.1의 현탁액에 유기 용매 또는 이의 혼합물을 가하는 단계. 단계 a1.1의 혼합물은 정적 조건 하에 유지시킨다. 단계 a1.1의 시간은 규모 및 장치에 따라 약 10 내지 약 30분이고; 단계 a1.2의 시간은 약 30분이다.
수성 용매 내 판크레아틴은 0.050 및 0.3 mg/mL 사이, 바람직하게는 0.1 및 0.3 mg/mL 사이, 더 바람직하게는 0.1 또는 0.3 mg/mL로 포함되는 양이다. 유기 용매는 에탄올 또는 아세톤이 바람직하며, 수성 용매는 pH=4.0 완충액 (예를 들어, lOmM 아세트산염 완충액) 또는 pH 7 완충액 (예를 들어, 10 mM 인산염)이 바람직하다.
한-단계 공정의 하나의 특정 실시예에서, 용매는 38 (MPa)0.5의 SP를 가지며, 아세톤과 pH 7 완충액 (예를 들어, 10 mM 인산염)의 혼합물이고, 단계 al에서 판크레아틴은 0.1 mg/mL의 농도이다.
한-단계 공정의 하나의 특정 실시예에서, 용매는 38 (MPa)0.5의 SP를 가지며, 아세톤과 pH 4 완충액 (예를 들어, 10 mM 아세트산염 완충액)의 혼합물이고, 단계 al에서 판크레아틴은 0.1 mg/mL의 농도이다.
본 발명의 또 다른 실시예에서 (다-단계 공정), 용매가 유기 용매와 수성 용매의 혼합물인 경우, 췌장리파제를 먼저 수성 용매에 분산시킨 다음 유기 용매를 이 수성 분산액의 가용성 부분에 가한다. 이 실시예에서, 공정 단계 al은 다음 단계를 포함한다: al.l) (현탁) 교반 하에 수성 용매에서 판크레아틴을 현탁하는 단계; al.2) (분리) 불용성 부분 (펠렛)으로부터 단계 a1.1의 가용성 부분 (상청액)을 분리하는 단계; al.3) (침전) 단계 a1.2의 가용성 부분에 유기 용매 또는 이의 혼합물을 가하는 단계.
단계 a1.1은 약 30분 동안 수행하는 것이 바람직하다. 단계 a1.3의 혼합물은 약 15분 동안 정적 조건 하에 유지시키고, 이 단계의 바람직한 온도는 4℃이다.
수성 용매 내 판크레아틴은 0.05 및 0.3 mg/mL 사이, 바람직하게는 0.1 내지 0.3 mg/mL, 더 바람직하게는 0.1 또는 0.3 mg/mL로 포함되는 양이다. 사용된 용매의 SP는 바람직하게는 38이다. 유기 용매는 에탄올 또는 아세톤이 바람직하며, 수성 용매는 pH=4.0 완충액 (예를 들어, lOmM 아세트산염 완충액) 또는 pH 7 완충액 (예를 들어, 10 mM 인산염)이 바람직하다.
다-단계 공정의 하나의 특정 실시예에서, 용매는 38 (MPa)0.5의 SP를 가지며, 아세톤과 pH 4.0 완충액 (예를 들어, 10 mM 아세트산염 완충액)의 혼합물이고, 단계 al에서 판크레아틴은 0.3 mg/mL의 농도이다.
다-단계 공정의 또 다른 실시예에서, 용매는 38 (MPa)0.5의 SP를 가지며, 에탄올과 pH 4.0 완충액 (예를 들어, 10 mM 아세트산염 완충액)의 혼합물이고, 단계 al에서 판크레아틴은 0.3 mg/mL의 농도이다.
다-단계 공정의 또 다른 실시예에서, 용매는 38 (MPa)0.5의 SP를 가지며, 에탄올과 pH 4.0 완충액 (예를 들어, 10 mM 아세트산염 완충액)의 혼합물이고, 단계 al에서 판크레아틴은 0.1 mg/mL의 농도이다.
다-단계 공정의 또 다른 실시예에서, 용매는 38 (MPa)0.5의 SP를 가지며, 아세톤과 pH 7 완충액 (예를 들어, 10 mM 인산염)의 혼합물이고, 단계 al에서 판크레아틴은 0.3 mg/mL의 농도이다.
분리 단계 (단계 a2 및 al.2)는 다른 방법, 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 수행될 수 있다. HA-판크레아틴 제조 방법의 모든 공정 단계는 온도 조절 하에 수행되며, 항상 실온 이하, 바람직하게는 4℃이다; 습도도 조절될 수 있다.
또한, 본 발명의 공정은 HA-판크레아틴의 멸균 및 바이러스 비활성화 또는 바이러스 부하 감소(viral load reduction)를 포함할 수 있으며, 여과, 가열, 방사선 조사 (자외선 조사, X-선 조사, 베타선-조사 및 감마선-조사), 고압 처리 및/또는 베타-프로프리오락톤 (beta-propriolactone, BPL)을 이용한 핵산의 알킬화에 의해 수행될 수 있다. 적당한 시간, 예를 들어 18시간 이상, 바람직하게는 18 내지 48시간, 더 바람직하게는 18 내지 30시간 동안, 85℃ 이상, 바람직하게는 85℃ 내지 100℃의 온도에서의 가열은 바이러스 오염물질을 감소시키는데 효과적이다. 낮은 온도 (84℃, 바람직하게는 80℃)에서의 가열은 0.5 중량% 이하의 잔여 수분을 갖는 고체 HA-판크레아틴에서 수행될 수 있다.
본 발명에 개시된 방법에 많은 이점이 있다는 것은 상기로부터 명백하다. 이것은 소화액에 존재하는 소화 효소의 천연 스펙트럼 및 천연 공급원을 보존하고, 출발물질의 소화 행동을 유지한다. 이것은 조 추출 공정의 결과로서 남아있는 소화에 필요하지 않은 물질들을 제거하고, 이로써 API의 크기를 감소시킨다. 이것은 박테리아 또는 바이러스 오염물질의 감소 또는 제거를 가능하게 한다. 이것은 서로에 대해 혼합된 효소 종류의 비의 조절을 가능하게 한다. 또한, 이것은 API가 고효능을 가진 많은 제형으로 제제화하는 것을 가능하게 한다.
본 명세서에 기재된 발명은 현재의 제품보다 우수한 제품을 야기하고, 위에서 설명한 이유로 치료에서 현저한 진보를 나타낸다.
실험
물질
췌장리파제 (API, 출발 췌장리파제 또는 판크레아틴, 순수한 췌장리파제 또는 판크레아틴)는 Nordmark에 의해 제공된다. 이것은 돼지 췌장으로부터 추출되며, 일반적으로 약 30%의 단백질 (Bradford 방법으로 정량화)을 함유하고, 94.4 IU/mg의 리파제 활성, 253.2 IU/mg의 프로테아제 활성, 420.3 IU/mg의 아밀라제 활성을 가지며; P/L 비는 2.7이고, A/L 비는 4.5이며, 수분 함량은 0.3%이다. 이 물질은 췌장리파제 성분을 확인하기 위하여 일차원 및 이차원 전기영동 다음에 Maldi Tof 특징으로 분석된다 (Mario Negri Institute, Milan, Italy). 이 추출물에 대한 이차원 전기영동은 물에서 명백하게 쉽게 용해되는 분획 내 적어도 50 단백질/펩티드 스팟 및 물에서 명백하게 덜 쉽게 용해되는 분획 내 적어도 30 단백질/펩티드 스팟으로 나타난다. 용해도 측정은 활성 효소가 췌장리파제의 수-불용성 (water-insoluble) 성분 위에 흡착할 수 있거나 또는 그 반대로 갇힐 수 있다는 사실에 의해 혼동된다. 또한, 용해도는 pH의 함수일 것이다. 혼합물에서 각각의 단백질에 상응하는 스팟, 및 더 용해되는 분획 및 덜 용해되는 분획을 이용하여 제조된 겔의 영상은, 소 트립신으로 주요 스팟을 절단 및 소화하고 MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry) 및 자이모그래피 (zymography)를 이용하여 분석한 후에 분석된다. 펩티드 질량 지문법 (peptide mass fingerprints)은 라이브러리 기준과 비교하고, 아밀라제, 리파제, 코리파제 (colipase), 카복시펩티다제 Al 및 B, 엘라스타제 2A 및 1, 키모트립신, 트립신, 및 포스포리파제 A2를 확인한다. 추출물은 명백히 상대적으로 가공하지 않고, 많은 활성 효소 종 이외에 많은 외부 단백질을 함유한다.
경장 영양액( Enteral formula): Peptamen® Junior 1.0 Cal (Nestle, 250 mL의 봉지): 지방 함량: 3.8 g/100 mL, 단백질 함량: 3 g/lOOmL, 지방 및 탄수화물 함량: 20.4 g/MI.
방법
지질분해 활성( Lipolytic activity): 측정은 췌장리파제 효소 USP 논문에 기재된 리파제 어세이의 공정서 방법(compendial procedure)을 기준으로 한 방법으로 수행되고, pH-stat 방법에 의하여 사용된 기질 (올리브유)에서 에스터화 지방산의 가수분해로부터 형성된 유리 지방산의 적정을 기준으로 한다. 이것은 다음의 원리를 기준으로 한다: 리파제는 트리글리세리드의 가수분해를 촉진시켜 유리 지방산 (FFA)의 형성을 야기한다. 시간에 따라 형성된 FFA의 적정은 리파제의 효소 활성의 측정을 제공하며, 하기 단위로 나타낼 수 있다: 1 U = 분 당 형성된 FFA의 1 μmole. 반응은 pH 값이 고정된 값과 비교하여 변할 때 (pH-stat 방법) NaOH (적정제)의 첨가를 제공하는 실험 시스템을 통해 고정된 pH 값을 유지함으로써 발생한다. 시간에 따라 첨가된 적정제의 양은 트리글리세리드에 대해 리파제 작용에 의해 형성된 FFA의 양과 일치한다. 곡선 기울기 {첨가된 적정제 = f (부피 (mL)/ 시간 (분))}는 리파제 효소 활성을 제공한다.
하기에 보고된 리파제 활성 (LA)은 항상 IU USP로 나타낸다.
하기에 보고된 리파제 특정 활성(lipase specific activity, LSA)은 항상 IU USP/mg로 나타낸다.
단백질 가수분해 및 전분가수분해( amilolytic ) 활성: 측정은 췌장리파제 효소 USP 논문에 기재된 공정서 방법에 따라 수행된다. 하기에 보고된 특정 효소 활성(Specific enzymatic activity, SA)은 항상 IU USP/mg로 나타낸다.
수분 함량은 4시간 동안 80℃에서 TGA로 (시료 18, 19 및 20) 또는 Karl Fisher 방법 (시료 26, 27 및 28)으로 측정된다.
트리글리세리드는 내부 표준으로 콜레스테릴 팔미테이트를 이용하여 헥산:이소프로판올 (3:2)로 추출하고 HPLC로 분석된다; 피크는 표준 트리올레인 용액으로 모든 머무름 시간(retention times)을 비교하여 확인된다.
단백질 분석: 총 단백질 함량은 Bradford 어세이로 정량화된다.
탄수화물 분석: 1) 짧은 사슬 당(Short chain sugars)은 내부 표준으로 자일리톨을 이용하여 HPLC로 분석된다; 피크는 당 표준, 즉 말토오스로 모든 머무름 시간을 비교하여 확인된다. 2) 말토덱스트린은 Carrez I 및 Carrez II의 존재 하에 추출하고 HPLC로 분석된다; 피크는 말토덱스트린 표준, 즉 말토오스 일수화물, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스 및 말토헵타오스로 모든 머무름 시간을 비교하여 확인된다.
실시예
실시예 1
HA-판크레아틴의 제조; 0.1 g/mL; 다-단계: 현탁, 분리, 침전; (SP=38: 아세톤:수성 용매 = 35:65; 에탄올:수성 용매 = 45:55)
단계 a1.1 - 현탁: 출발 췌장리파제를 4℃에서 0.1 g/mL 농도의 수성 용매에서 분산시키고, 30분 동안 교반시킨다. 650 mg (유기 용매가 아세톤인 경우) 또는 550 mg (유기 용매가 에탄올인 경우)의 출발 췌장리파제를 사용하여 실험실 규모로 실험을 수행한다. 4개의 다른 수성 용매는 췌장리파제 현탁액을 위해 시험된다: NaCl (0.5M)과 함께, 1) pH=4.0 완충액 (lOmM 아세트산염 완충액); 2) pH=7.0 완충액 (10 mM 인산염); 3) 탈이온수 (DW); 4) pH=4.0 완충액 (lOmM 아세트산염).
단계 al.2 - 분리: 단계 al.l의 현탁액을 원심분리하고 (10분, 4℃, 약 11,000 g), 상청액 (SN)을 펠렛 (P)으로부터 분리한다.
단계 al.3 - 침전: 유기 용매를 단계 al.2의 상청액에 가하고, 혼합물을 정적 조건에서 15분 동안 4℃에서 유지시킨다. 유기 용매는 아세톤 또는 에탄올이다. 아세톤을 수성 용매의 각 65 부 (부피) 당 35 부 (부피)의 양으로 가한다. 에탄올을 수성 용매의 각 55 부 (부피) 당 45 부 (부피)의 양으로 가한다.
단계 a2 - 분리: 혼합물을 원심분리하여 (10분, 4℃, 약 11,000 g), 췌장리파제 효소를 함유하는 펠렛으로부터 상청액을 분리한다. 펠렛을 단계 a1.1에서 사용된 수성 용매에 재-현탁시킨다 (재-현탁 후 펠렛 내 LA, 침전).
다른 단계의 물질을 분석한다. 리파제 활성 (LA)으로 나타낸, 췌장리파제의 양은 다음과 같이 측정된다:
- 단계 al.l의 현탁액 내 (현탁액 내 LA; LA-Sal.l);
- 단계 a2에서 얻어진 상청액 내 (SN 내 LA, 침전, LA-SN);
- 단계 a2에서 얻어진 펠렛 내 다음에 출발 매질에서 재-현탁됨 (펠렛 내 LA, 침전, LA-P).
결과는 표 1, 2, 3에 나타내었다.
시료 실험 조건 현탁
(단계 a1.1)		 분리 (단계 a2) 수율
(%)
매질 용매 LA-Sa1.1 상청액 (SN) 펠렛 (P)
LA-SN %
LA-SN/
LA-Sa1.1		 LA-P %
LA-P/
LA-Sa1.1
1 pH 4.0 A 33528.2 5820.0 17.4 25376.4 75.7 93.1
2 물 A 31974.0 8105.5 25.4 22659.2 70.9 96.3
3 pH 4.0 E 35388.9 3464.3 9.8 27417.6 77.5 87.3
4 물 E 30369.8 4301.0 14.2 20835.1 68.6 82.8
5 pH 4.0 + NaCl A 47761.0 9408.0 19.7 34543.3 72.3 92.0
6 pH 4.0 + NaCl E 40364.0 10410.4 25.8 27101.5 67.1 92.9
7 pH 7.0 A 40388.9 9798.8 24.3 30178.8 74.7 99.0
LA=리파제 활성 (IU USP); A=아세톤, E=에탄올; S=현탁액; SN=상청액; P=펠렛
표 1은 췌장리파제의 침전 (단계 al.3)이 침전 부분 (펠렛)에서 리파제 활성의 우수한 회수를 고려하여, 약 67 내지 약 77% 범위임을 나타낸다. 수율은 단계 al.1의 현탁액에서 리파제 활성 (Sal.1):(LA-SN + LA-P)/(LA-Sal.1)으로 나타낸, 초기 현탁된 췌장리파제의 리파제 활성에 대하여 단계 a2 (펠렛 및 상청액)의 총 리파제 활성의 % 이다.
시료 실험 조건 분리 (단계 a2) 수율
(%)
매질 용매 단계 Sa1.1에서 Theor. LA 상청액 (SN) 펠렛 (P)
LA-SN %
LA-SN/
Theor. LA-Sa1.1		 LA-P %
LA-P/
Theor.
LA-Sa1.1
1 pH 4.0 A 61605.4 5820.0 9.4 25376.4 41.2 50.6
2 물 A 61458.2 8105.5 13.2 22659.2 36.9 50.1
3 pH 4.0 E 51940.8 3464.3 6.7 27417.6 52.8 59.5
4 물 E 51894.0 4301.0 8.3 20835.1 40.1 48.4
5 pH 4.0 + NaCl A 61452.0 9408.0 15.3 34543.3 56.2 71.5
6 pH 4.0 + NaCl E 52031.5 10410.4 20.0 27101.5 52.1 72.1
7 pH 7.0 A 61470.4 9798.8 15.9 30178.8 49.1 65.0
LA=리파제 활성 (IU USP); A=아세톤, E=에탄올; S=현탁액; SN=상청액; P=펠렛; Theor.=이론적
공정 수율은 약 37 내지 56% 범위이다. 수율 %는 단계 al.1에서 사용된 췌장리파제의 이론적 리파제 활성에 대하여 단계 a2의 펠렛 및 상청액에서 총 리파제 활성이며, 처리되지 않은 원료 물질의 특정 활성 (즉, 공정서 USP 방법에 따라 측정된 94.4 IU USP/mg) 및 이의 초기 중량을 인수분해하여 계산된다.
시료 실험 조건 분리 (단계 a2) EF
매질 용매 상청액 (SN) 펠렛 (P)
LSA LSA
1 pH 4.0 A 10.7 239.4 2.5
2 물 A 14.5 233.6 2.5
3 pH 4.0 E 10.1 179.2 1.9
4 물 E 11.5 145.7 1.5
5 pH 4.0 + NaCl A 14.7 101.3 1.1
6 pH 4.0 + NaCl E 18.2 80.9 0.9
7 pH 7.0 A 18.7 181.8 1.9
LSA=리파제 특정 활성 (IU USP/mg); A=아세톤, E=에탄올; SN=상청액; EF=농축 인자(enrichment factor)= 단계 a2의 펠렛에서 LSA/단계 al.1에서 이론적 리파제 특정 활성, 즉, 공정서 USP 방법에 따라 측정된 94.4 IU USP/mg.
농축 인자 (pH 독립)는 단계 a2의 펠렛에서 리파제 활성과 출발 판크레아틴의 리파제 활성 간의 비율을 계산하여 결정된다 (94.4 IU/mg 이다). 2.5 까지의 농축 인자는 이 공정으로 얻어진다. 또한 농축은 HPLC 프로파일 분석으로 확인된다.
다른 소화 효소에 관하여, 최종 펠렛 (단계 a2의 침전물) 내 아밀라제 함량은 출발 췌장리파제 내 아밀라제 함량보다 낮다.
실시예 2
HA-판크레아틴의 제조; 0.3 g/mL; 다-단계: 현탁, 분리, 침전 (SP=38: 아세톤:수성 용매 = 35:65; 에탄올:수성 용매 = 45:55)
단계 a1.1 - 현탁: 췌장리파제 (API)를 4℃에서 0.3 g/mL 농도의 수성 용매에서 분산시키고, 30분 동안 교반시킨다. 650 mg (유기 용매가 아세톤인 경우) 또는 550 mg (유기 용매가 에탄올인 경우)의 출발 췌장리파제를 사용하여 실험실 규모로 실험을 수행한다. 두 개의 실험이 각각 다른 수성 용매에서 수행된다: 1) pH=4.0 완충액 (lOmM 아세트산염 완충액); 2) pH=7.0 완충액 (10 mM 인산염).
단계 al.2 - 분리: 단계 al.l의 현탁액을 원심분리하고 (10분, 4℃, 약 11,000 g), 상청액 (SN)을 펠렛 (P)으로부터 분리한다.
단계 al.3 - 침전: 유기 용매를 단계 al.2의 상청액에 가하고, 혼합물을 정적 조건에서 15분 동안 4℃에서 유지시킨다. 유기 용매는 아세톤 또는 에탄올이다. 아세톤을 수성 용매의 각 65 부 (부피) 당 35 부 (부피)의 양으로 가한다. 에탄올을 수성 용매의 각 55 부 (부피) 당 45 부 (부피)의 양으로 가한다.
단계 a2 - 분리: 혼합물을 원심분리하여 (10분, 4℃, 약 11,000 g), 췌장리파제 효소를 함유하는 펠렛으로부터 상청액을 분리한다. 펠렛을 출발 수성 용매에 재-현탁시킨다 (재-현탁 후 펠렛 내 LA, 침전).
단계 a3 - 건조: 단계 a2의 펠렛을 건조시킨다.
다른 단계의 물질을 분석한다. 췌장리파제의 양은 리파제 활성 (LA)으로 나타내고, 다음과 같이 측정된다:
- 단계 al.l의 현탁액 내 (현탁액 내 LA; LA-Sal.l);
- 단계 a2에서 얻어진 상청액 내 (SN 내 LA, 침전, LA-SN);
- 단계 a2에서 얻어진 펠렛 내 다음에 출발 수성 매질에서 재-현탁됨 (펠렛 내 LA, 침전, LA-P).
결과는 표 4, 5, 6에 나타내었다.
시료 실험 조건 현탁
(단계 a1.1)		 분리 (단계 a2) 수율
(%)
매질 용매 LA
(Sa1.1)		 상청액 (SN) 펠렛 (P)
LA-SN %
LA-SN/
LA-Sa1.1		 LA-P %
LA-P/
LA-Sa1.1
8 pH 4.0 A 139968.7 11856.6 8.5 112830.4 80.6 89.1
9 pH 4.0 E 107348.7 5035.2 4.7 99146.6 92.4 97.0
10 pH 4.0 A 137050.4 8778.9 6.4 108734.7 79.3 85.7
11 pH 4.0 E 115965.7 5097.9 4.4 88019.7 75.9 80.3
12 pH 7.0 A 137267.4 10535.3 7.7 108038.6 78.7 86.4
13 pH 7.0 E 118929.3 11340.9 9.5 86636.2 72.8 82.4
LA=리파제 활성 (IU USP); A=아세톤, E=에탄올; S=현탁액; SN=상청액; P=펠렛
표 4는 침전 후의 회수가 매우 우수함을 나타낸다 (73-92%).
시료 실험 조건 분리 (단계 a2) 수율
(%)
매질 용매 단계 a1.1에서 Theor. LA 상청액 (SN) 펠렛 (P)
LA %
LA-SN/
Theor. LA-Sa1.1		 LA %
LA-P/
Theor.
LA-Sa1.1
8 pH 4.0 A 184080.0 11856.6 6.4 112830.4 61.3 67.7
9 pH 4.0 E 155760.0 5035.2 3.2 99146.6 63.7 66.9
10 pH 4.0 A 184080.0 8778.9 4.8 108734.7 59.1 63.8
11 pH 4.0 E 155760.0 5097.9 3.3 88019.7 56.5 59.8
12 pH 7.0 A 184080.0 10535.3 5.7 108038.6 58.7 64.4
13 pH 7.0 E 155760.0 11340.9 7.3 86636.2 55.6 62.9
LA=리파제 활성 (IU USP); A=아세톤, E=에탄올; S=현탁액; SN=상청액; P=펠렛; Theor.=이론적
0.3 g/mL 췌장리파제 농도에서 수행된 다-단계 공정의 전체 수율은 약 56 내지 약 64% 범위이다.
시료 실험 조건 분리 (단계 a2) EF
매질 용매 상청액 (SN) 펠렛 (P)
LSA LSA
8 pH 4.0 A 6.2 197.9 2.1
9 pH 4.0 E 5.3 250.4 2.7
10 pH 4.0 A 7.5 284.6 3.0
11 pH 4.0 E 5.5 185.7 2.0
12 pH 7.0 A 8.4 248.9 2.6
13 pH 7.0 E 11.1 180.9 1.9
LSA=리파제 특정 활성 (IU USP/mg); A=아세톤, E=에탄올; SN=상청액; EF=농축 인자= 단계 a2의 펠렛에서 LSA (IU USP/mg)/단계 al.1에서 이론적 리파제 활성 (IU USP/mg).
농축 인자는 단계 a2의 펠렛에서 리파제 활성과 단계 a1.1의 출발 췌장리파제의 리파제 활성 간의 비율을 계산하여 결정된다 (94.4 IU/mg 이다). 농축 인자는 1.9 내지 3.0 범위이다.
실시예 3
HA-판크레아틴의 제조; 0.1 g/mL; 두-단계: 현탁, 침전 (SP=38: SP(아세톤)=20.2, SP(에탄올)=26.0, SP(완충액)=47.9인 경우, 아세톤:수성 용매 = 35:65; 에탄올:수성 용매 = 45:55)
단계 a1.1 - 현탁: 췌장리파제를 4℃에서 0.1 g/mL 농도의 수성 용매에서 분산시키고, 30분 동안 교반시킨다. 650 mg (유기 용매가 아세톤인 경우) 또는 550 mg (유기 용매가 에탄올인 경우)의 출발 췌장리파제를 사용하여 실험실 규모로 실험을 수행한다. 2개의 실험이 각각 다른 수성 용매에서 수행된다: 1) pH=4.0, lOmM 아세트산염 완충액; 2) pH=7.0, 10 mM 인산염 완충액.
단계 al.2 - 침전: 유기 용매를 단계 al.1의 현탁액에 가하고, 이 혼합물을 15분 동안 4℃에서 유지시킨다. 유기 용매는 아세톤 또는 에탄올이다. 아세톤을 수성 용매의 각 65 부 (부피) 당 35 부 (부피)의 양으로 가한다. 에탄올을 수성 용매의 각 55 부 (부피) 당 45 부 (부피)의 양으로 가한다.
단계 a2 - 분리: 혼합물을 원심분리하여 (10분, 4℃, 약 11,000 g), 췌장 효소를 함유하는 펠렛으로부터 상청액을 분리한다. 펠렛을 출발 수성 용매에 재-현탁시킨다 (재-현탁 후 펠렛 내 LA, 분리).
다른 단계의 물질을 분석한다. 리파제 활성으로 나타낸, 췌장리파제의 양은 전체 공정으로 측정된다:
- 단계 al.l의 현탁액 내 (현탁액 내 LSA; LA-Sal.l);
- 단계 a2에서 얻어진 상청액 내 (SN 내 LA, 분리, LA-SN);
- 단계 a2에서 얻어진 펠렛 내 다음에 출발 매질에서 재-현탁됨 (펠렛 내 LA, 침전, LA-P).
결과는 표 7, 8, 9에 나타낸다.
시료 실험 조건 현탁
(단계 a1.1)		 분리 (단계 a2) 수율
(%)
매질 용매 LA
(Sa1.1)		 상청액 (SN) 펠렛 (P)
LA %
LA-SN/
LA-Sa1.1		 LA %
LA-P/
LA-Sa1.1
14 pH 4.0 A 48960.7 4688.0 9.6 45021.4 92.0 101.5
15 pH 4.0 E 41428.3 1394.3 3.4 40656.7 98.1 101.5
16 pH 7.0 A 56936.9 4750.9 8.3 46955.0 82.5 90.8
17 pH 7.0 E 48177.4 2316.1 4.8 41808.2 86.8 91.6
LA=리파제 활성 (IU USP); A=아세톤, E=에탄올; S=현탁액; SN=상청액; P=펠렛
침전 후 회수가 높고, 두-단계 공정으로 거의 완전한 회수가 달성된다.
시료 실험 조건 분리 (단계 a2) 수율
(%)
매질 용매 단계 a1.1에서 Theor. LA 상청액 (SN) 펠렛 (P)
LA %
LA-SN/
Theor. SL-Sa1.1		 LA %
LA-P/
Theor.
LA-Sa1.1
14 pH 4.0 A 61605.4 4688.0 7.6 45021.4 73.1 80.7
15 pH 4.0 E 51940.8 1394.3 2.7 40656.7 78.3 81.0
16 pH 7.0 A 61421.4 4750.9 7.7 46955.0 76.4 84.2
17 pH 7.0 E 51971.9 2316.1 4.5 41808.2 80.4 84.9
LA=리파제 활성 (IU USP); A=아세톤, E=에탄올; S=현탁액; SN=상청액; P=펠렛; Theor.=이론적
전체 공정 수율은 약 73.1 내지 84.5% 범위이고, 다-단계 공정으로 얻어진 것보다 더 높다. 수율 %는 단계 al.1에서 사용된 판크레아틴의 이론적 리파제 활성에 대하여 단계 a2의 펠렛 및 상청액에서 총 리파제 활성이며, 출발 물질의 특정 활성 (즉, 공정서 USP 방법에 따라 측정된 94.4 IU USP/mg) 및 이의 초기 중량을 인수분해하여 계산된다.
시료 실험 조건 분리 (단계 a2) EF
매질 용매 상청액 (SN) 펠렛 (P)
LSA LSA
14 pH 4.0 A 10.1 247.4 2.6
15 pH 4.0 E 4.0 204.3 2.2
16 pH 7.0 A 10.1 276.2 2.9
17 pH 7.0 E 6.7 193.6 2.1
LSA=리파제 특정 활성 (IU USP/mg); A=아세톤, E=에탄올; SN=상청액; EF=농축 인자= 단계 a2의 펠렛에서 LSA (IU USP/mg)/단계 al.1에서 이론적 리파제 활성 (IU USP/mg).
결과는 두-단계 공정에서 pH=7에서의 수성 완충액 및 아세톤의 사용이 흥미로운 수율 (약 76%의 전체 공정 수율)을 제공하고, 농축 인자는 2.1 내지 2.9 범위라는 것을 나타낸다.
실시예 4
HA-판크레아틴의 제조; 0.1 g/mL; 두-단계: 현탁, 침전; 스케일-업 (SP=38: 아세톤:수성 용매 = 35:65)
단계 a1.1 - 현탁: 6.5 g의 출발 췌장리파제 (61,400 U 리파제)를 4℃에서 45 mL의 pH=7.0 완충액 (10 mM 인산염 완충액)에서 분산시키고, 각 주기에 대해 1분 동안 교반시키고 (Ultraturrax, 3 주기), 잔여 췌장리파제를 회수하기 위하여 10 mL의 차가운 완충액으로 교반기를 2번 세척한다.
단계 al.2 - 침전: 35 mL의 아세톤을 단계 al.1의 현탁액에 가하고, 혼합물을 정적 조건 하에 30분 동안 4℃에서 유지시킨다.
단계 a2 - 분리: 혼합물을 원심분리하여 (15분, 4℃, 약 2,700 g), 췌장 효소를 함유하는 펠렛으로부터 상청액을 분리한다.
단계 a3 - 건조: 2개의 다른 프로토콜에 따라 펠렛을 건조하고, 건조된 펠렛의 평균 중량은 1.55g 이며, 리파제 활성 (LA)은 365,000 IU 리파제이고, 특정 활성 (LSA)은 235 IU USP/mg 이다.
표 10은 2개의 프로토콜로 얻어진 각 물질에 대해 측정된 리파제 (L), 프로테아제 (P), 및 아밀라제 (A) 특정 활성을 나타낸다. 또한, 펠렛 내 리파제 활성 (1 mL의 완충액에서 이의 현탁 후 측정됨)은 건조 처리 전에 측정된다; 이것은 233.7 IU USP/mg이 된다.
시료 프로토콜 LSA PSA ASA P/L 비 A/L 비 수분 함량 (%)
18 72h, 6-8℃, 0.2 mbar 234.2 226.5 149.5 0.97 0.64 7.4
19 72h, 6-8℃, 0.2 mbar 254.0 217.7 130.7 0.86 0.51 6.5
20 24h, 6-8℃, 0.2 mbar 216.3 230.1 129.8 1.06 0.60 7.4
평균 234.8 224.8 136.7 0.96 0.58 7.10
Ds 18.9 6.4 11.1
cv% 8% 3% 8%
LSA = 리파제 특정 활성 (IU USP/mg); PSA = 프로테아제 특정 활성 (IU USP/mg); ASA = 아밀라제 특정 활성 (IU USP/mg).
분석은 건조 공정 자체가 LSA에 영향을 미치지 않고 다른 프로토콜이 동일한 효소 활성을 갖는 물질을 야기한다는 것을 나타낸다. 또한, 이전 실시예에서 계산된 농축 인자는 항상 2 이상이고, 다른 프로토콜 간에는 일정하다. 이것은 2.5 (시료 18), 2.7 (시료 19), 2.3 (시료 20) 이고, 평균값은 2.5이다. 건조 처리 전에 측정된, 펠렛에서 리파제 활성은 233.7 IU USP/mg (시료 18)이 된다.
시료 W
출발 팬		 W
펠렛		 초기 LA 초기 PA 초기 AA 회수된 LA 회수된 PA 회수된 AA LY PY AY
18 6.5113 1.5325 614666.7 1648661.2 2736699.4 358911.5 347111.25 229108.75 58 21 8
19 6.4997 1.7084 613571.7 1645724.0 2731823.9 369526.92 393102.84 221750.32 60 24 8
20 6.5137 1.3673 614893.3 1649268.8 2737708.1 347294.2 297661.21 178706.11 56 18 7
L= 리파제; P= 프로테아제; A= 아밀라제; A= 활성; Y=수율 (%); W = 건조 후 측정된 중량 (g).
다른 프로토콜로 얻어진 시료의 HPLC 프로파일을 첨가하였고; 출발 물질의 HPLC 프로파일을 갖는 유의미한 질적 차이는 관찰되지 않았다.
실시예 5
HA-판크레아틴의 제조; 0.1 g/mL; 두-단계: 현탁, 침전; 스케일-업 (SP=38: 에탄올:수성 용매 (pH=7) = 45:55, 시료 21); (SP=34: 아세톤:수성 용매 (pH=7) = 50:50 시료 22); (SP=35: 아세톤:수성 용매 (pH=7) = 45:55, 시료 23). 실시예 4의 제조 공정은 다른 양의 출발 췌장리파제, 다른 부피의 완충액 및 다른 부피의 아세톤 (HS=34 또는 35) 또는 다른 부피의 에탄올 (HS=38)에 적용된다. 건조 프로토콜은 24시간, 6-8℃, 0.2 mbar 이고, 모든 기타 매개변수 및 조건은 실시예 4와 동일하다.
시료 HS 췌장리파제 (g) 완충액 (mL) 아세톤 (mL) 에탄올 (mL)
21 38 5.5 55 없음 45
22 34 5.0 50 50 없음
23 35 5.5 55 45 없음
결과는 표 13 및 14에 나타낸다.
시료 LSA PSA ASA P/L 비 A/L 비
21 150.2 - - - -
22 123.3 351.7 436.0 2.85 3.54
23 158.7 388.9 241.9 2.45 1.52
LSA= 리파제 특정 활성 (IU USP/mg); PSA = 프로테아제 특정 활성 (IU USP/mg); ASA = 아밀라제 특정 활성 (IU USP/mg).
자료는 건조 공정 자체가 LA에 영향을 미치지 않고 다른 프로토콜이 동일한 효소 활성을 갖는 물질을 야기한다는 것을 나타낸다. 이전 실시예에서 계산된 농축 인자는 1.6 (시료 21), 1.3 (시료 22), 1.7 (시료 23) 이다.
표 14는 본 명세서에 적용된 스케일-업 공정으로 얻어진 최종 정제된 물질의 효소 활성 및 효소 수율을 나타낸다.
시료 W
출발 팬		 W
펠렛		 초기 LA 초기 PA 초기 AA 회수된 LA 회수된 PA 회수된 AA LY PY AY
21 5.5197 1.6826 514988.0 - - 252390.0 - - 49 - -
22 5.5183 2.0255 520927.5 1397233.6 2319341.5 321446.85 787716.95 489968.45 62 56 21
23 4.9986 2.7464 471867.8 1265645.5 2100911.6 338631.12 965908.88 1197430.4 72 76 57
L= 리파제; P= 프로테아제; A= 아밀라제; A= 활성; Y=수율 (%); W = 건조 후 측정된 중량 (g).
다른 동결-건조 프로토콜로 얻어진 시료의 HPLC 프로파일을 겹쳐 놓았다. 출발 물질의 HPLC 프로파일을 갖는 유의미한 질적 차이는 관찰되지 않았다.
다른 프로토콜로 얻어진 시료 22 및 23은, 프로토콜 (HS=38)로 제조된 시료 21에 비해 더 낮은 특정 LA 및 더 높은 PA 및 AA를 나타낸다.
실시예 6
HA-판크레아틴의 제조; 0.065 및 0.1 g/mL; 한-단계: 실험실 규모 (SP=38: 아세톤:수성 용매 = 35:65)
단계 a1 - 현탁 - 침전: 650 mg (시료 24) 또는 1000 mg (시료 25)의 순수한 췌장리파제를 4℃에서 30분 동안 교반 하에 완충액 (pH=7, 10 mM 인산염) 및 아세톤 (65 부피의 완충액 및 35 부피의 아세톤)의 65:35 혼합물의 10mL에 분산시킨다.
단계 a2 - 분리: 단계 a1의 혼합물을 원심분리하여 (10분, 약 10,000 g, 4℃), 췌장 효소를 함유하는 펠렛으로부터 상청액을 분리한다.
단계 a3 - 건조: 펠렛을 0.2 mbar에서 고효율 펌프로 건조시킨다.
물질을 분석한다. 리파제 활성으로 나타낸, 췌장리파제의 양은 전체 공정으로 측정된다:
- 단계 a2에서 얻어진 상청액 내 (SN 내 LA, 분리, LA-SN);
- 단계 a2에서 얻어진 펠렛 내 다음에 출발 매질에서 재-현탁됨 (펠렛 내 LA, 침전, LA-P).
- 현탁 - 침전 단계 a1의 LA (현탁액 내 LA; LA-SN)는 이론값으로 나타낸다.
결과는 표 15 및 16에 나타낸다.
시료 실험 조건 분리 (단계 a2) 수율
(%)
매질 용매 단계 a1에서 Theor. 초기 LA 상청액 (SN) 펠렛 (P)
LA %
LA-SN/
Theor. SL-Sa1		 LA %
LA-P/
Theor.
LA-Sa1
24 pH 7.0 A - 2834.7 - 47807.9 - -
25 pH 7.0 A - 3360.4 - 71997.8 - -
LA=리파제 활성 (IU USP); A=아세톤, E=에탄올; S=현탁액; SN=상청액; P=펠렛; Theor.=이론적.
시료 실험 조건 분리 (단계 a2) EF
매질 용매 상청액 (SN) 펠렛 (P)
LSA LSA
24 pH 7.0 A 5.4 237.9 2.5
25 pH 7.0 A 5.7 265.7 2.8
LSA=리파제 특정 활성; A=아세톤, E=에탄올; SN=상청액; EF=농축 인자= 단계 a2의 펠렛에서 LSA (IU USP/mg)/단계 a1에서 이론적 리파제 활성 (IU USP/mg).
한-단계 공정은 두-단계 공정보다 우수한 수율 및 높은 농축 인자를 제공한다. 이것은 실행이 쉽고 간단하기 때문에 산업화하는데 유용하다.
실시예 7
HA-판크레아틴의 제조; 0.1 g/mL; 한-단계: 파일럿 규모 (SP=38: 아세톤:수성 용매 = 35:65)
단계 a1 - 현탁 - 침전: 10 g의 순수한 췌장리파제를 4℃에서 60분 동안 교반 하에 완충액 (pH=7, 10 mM 인산염) 및 아세톤 (65 부피의 완충액 및 35 부피의 아세톤)의 용매 혼합물의 100mL에 분산시킨다.
단계 a2 - 분리: 단계 a1의 혼합물을 원심분리하여 (10분, 약 2,700 g, 4℃), 췌장 효소를 함유하는 펠렛으로부터 상청액을 분리한다.
단계 a3 - 건조: 시료 26의 펠렛을 페트리 접시에 붓고, 시료 27 및 28의 펠렛은 원심분리 튜브에 넣고 0.2 mbar에서 고효율 펌프를 이용하여 직접 건조시킨다.
물질을 분석한다. 리파제 활성으로 나타낸, 췌장리파제의 양이 전체 공정으로 측정된다:
- 단계 a2에서 얻어진 상청액 내 (SN 내 LA, 분리, LA-SN);
- 단계 a2에서 얻어진 펠렛 내 다음에 출발 매질에서 재-현탁됨 (펠렛 내 LA, 침전, LA-P).
- 현탁 - 침전 단계 a1의 LA (현탁액 내 LA; LA-SN)는 이론값으로 나타낸다.
결과는 표 17 및 18에 나타낸다.
시료 LSA PSA ASA P/L 비 A/L 비
26 207.8 249.4 155.20 1.20 0.75
27 222.7 249.2 158.90 1.12 0.71
28 219.1 285.0 167.50 1.30 0.76
LSA= 리파제 특정 활성 (IU USP/mg); PSA = 프로테아제 특정 활성 (IU USP/mg); ASA = 아밀라제 특정 활성 (IU USP/mg).
리파제, 프로테아제, 아밀라제 활성에 대하여 우수한 재현성이 얻어졌다.
시료 W
출발 팬		 W
펠렛		 LY PY AY
26 10.02 3.94 87 39 15
27 10.01 4.22 100 42 16
28 10.02 4.28 99 48 17
L= 리파제; P= 프로테아제; A= 아밀라제; A= 활성; Y=수율 (%); W = 건조 후 측정된 중량 (g).
매우 높은 리파제 수율이 얻어졌고, 농축 인자는 높았다 (2 이상). 농축 인자는 2.2 (시료 26), 2.4 (시료 27), 2.3 (시료 28) 이었다.
한-단계 공정은 우수한 수율로 제공되었다. 4.2 g의 HA-판크레아틴이 얻어지고 (42%의 출발 췌장리파제), 리파제의 총 단위는 940,000 IU USP (99-100%의 초기 LA) 이다. 얻어진 HA-판크레아틴은 221 IU USP/mg의 특정 활성을 가진다.
실시예 8
HA-판크레아틴의 제조; 0.1 g/mL; 다-단계; 현탁, 침전, 분리; 비교예 (SP=38: 아세톤:물 = 35:65).
단계 a1.1 - 현탁: 췌장리파제를 교반 하에 30분 동안, 4℃에서 0.045 mg/mL 농도의 수성 용매 (증류수)에서 분산시킨다 (시료 29).
단계 a1.2 - 침전: 80 mL의 용매 혼합물 (아세톤:물 = 35:45)을 단계 a1.1의 20 mL의 현탁액에 가한다 (최종 용매 혼합물에서 SP=38 (MPa)0. 5을 얻기 위하여); 혼합물을 정적 조건 하에 60분 동안 25℃에서 유지시킨다.
단계 a2- 분리: 혼합물을 원심분리하여 (10분, 3,000 g, 25℃), 췌장 효소를 함유하는 펠렛으로부터 상청액을 분리한다.
다른 단계의 물질을 분석한다. 리파제 활성으로 나타낸, 췌장리파제의 양이 전체 공정으로 측정된다:
- 단계 a1.1의 현탁액 내 (현탁액 내 LA; LA-Sal.1);
- 단계 a2에서 얻어진 상청액 내 (SN 내 LA, 침전, LA-SN);
- 단계 a2에서 얻어진 펠렛 내 다음에 출발 증류수에서 재-현탁됨 (펠렛 내 LA, 침전, LA-P).
결과는 표 19-20에 나타낸다. 또한, 이전 실시예에서 두-단계 및 한-단계 방법으로 얻어진 결과는 직접 비교 목적으로 본 명세서에 기재한다.
시료 실험 조건 분리 (단계 a2) 수율
(%)
매질 용매 단계 a1.1에서 이론적 초기 LA 상청액 (SN) 펠렛 (P)
LA %
LA-SN/
theor SL-Sa1.1		 LA %
LA-P/
theor LA-Sa1.1
16 pH 7.0 A 56936.9 4750.9 8,3 46955.0 82.5 90.8
18 pH 7.0 A - 2834.7 - 47807.9 - -
19 pH 7.0 A - 3360.4 - 71997.8 - -
29 물 A 66313.9 7928.8 12.0 24082.9 36.3 48.3
LA=리파제 활성 (IU USP); A=아세톤, E=에탄올; S=현탁액; SN=상청액; P=펠렛; Theor.=이론적.
시료 실험 조건 분리 (단계 a2) EF
매질 용매 상청액 (SN) 펠렛 (P)
LSA LSA
16 pH 7.0 A 10.1 276.2 2.9
18 pH 7.0 A 5.4 237.9 2.5
19 pH 7.0 A 5.7 265.7 2.8
29 물 A 9.7 27.1 0.3
LSA=리파제 특정 활성 (IU USP/mg); A=아세톤, E=에탄올; SN=상청액; EF=농축 인자= 단계 a2의 펠렛에서 LSA (IU USP/mg)/단계 a1에서 이론적 리파제 활성 (IU USP/mg).
이 선행기술 공정은 나쁜 수율을 제공하고, 효소 비활성화가 두드러지며, 리파제 농축은 얻어지지 않았다.
실시예 9 : 정제된 HA-판크레아틴의 특성 (시료 20)
HA 물질은 이의 소화 능력을 시험하고 출발 췌장리파제와 비교한다. 20 mg의 HA-판크레아틴 및 50 mg의 출발 췌장리파제 (2300 IU USP 리파제와 상응)를 각각 1 mL의 탈이온수에 현탁시키고, 37℃에서 50 mL의 경장 영양액 Peptamen® Junior 1.0에 가한 다음, 60, 120 및 240분 동안 100 rpm에서 교반한다. 1, 2 및 4시간 후에 소화 시험을 수행하였다. 시험은 각 췌장리파제 시료에 대해 6번 반복하였다.
지질 영양소는 트리올레인의 소화를 측정하여 관찰된다 (트리올레인 피크의 감소). 총 단백질 소화는 Bradford 방법으로 관찰된다. 전분가수분해 공정은 짧은 사슬 당의 형성을 측정하여 관찰된다. 소화 정도 차이는 소화 4시간 후 순수한 물질 및 HA 물질의 소화 성능을 비교하여 얻어진다.
시료 W 리파제 프로테아제 아밀라제
N 50 4,720 12,660 21,015
H 20 4,142 4,354 2,614
활성 차이 (%) -12 -66 -88
소화 차이 (%) -10 6 -33
H= HA-판크레아틴; N= 순수한 판크레아틴; W= 중량 (mg)
활성 차이는 하기 식으로 계산된다:
(순수한 판크레아틴의 활성 - HA-판크레아틴의 활성) / 순수한 췌장리파제의 활성
소화 차이는 하기 식으로 계산된다:
(순수한 판크레아틴의 소화 % - HA-판크레아틴의 소화 %)
이 in vitro 시험은 HA-판크레아틴의 지질, 단백질 및 탄수화물 소화의 분석을 가능하게 한다. 리파제 소화는 10%의 활성 차이가 10%의 소화량 차이와 일치하기 때문에 반응 용기에 존재하는 효소 활성의 차이에 대해 매우 민감하다. 소화 동역학(Digestion kinetics)은 유사한 경향을 나타낸다. 이러한 결과는 순수한 판크레아틴 및 HA-판크레아틴이 유사한 지질 소화 패턴을 가진다는 것을 암시한다.
단백질 소화 프로파일은 HA-판크레아틴의 프로테아제 활성이 순수한 췌장리파제의 동일한 수준에서 소화를 지속시킨다는 것을 암시하는 것 같이 거의 중첩된다. 프로테아제에 대한 약 60%의 활성의 차이는 단백질 소화 정도에 어떠한 영향을 발생시키지 않는다.
탄수화물 소화 프로파일은 말토오스 생성이 HA-판크레아틴에서 낮기 때문에 다르다. 아밀라제 활성 및 소화된 생성물의 양의 차이의 비교는 HA-판크레아틴에서도 전분분해(amylolysis)가 발생한다는 것을 보여준다.

Claims (42)

  1. 고활성 판크레아틴 (HA-판크레아틴)으로서, 상기 판크레아틴은 적어도 120 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 판크레아틴.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 판크레아틴은 적어도 150 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 판크레아틴.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 판크레아틴은 적어도 200 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 판크레아틴.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 판크레아틴은 적어도 500 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 판크레아틴.
  5. 제 1항, 제 2항, 제 3항 또는 제 4항의 HA-판크레아틴을 포함하는 고효능 약학적 조성물.
  6. 제 1항, 제 2항, 제 3항, 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 판크레아틴은 돼지 유래인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 조성물은 용량 단위 당 적어도 9,000, 20,000, 40,000, 60,000, 80,000, 또는 100,000 USP IU 리파제를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 조성물은 다수의 코팅된 입자의 HA-판크레아틴을 포함하며, 상기 입자는 적어도 하나의 장용성 고분자로 코팅된 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 5항, 제 6항, 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 펠렛, 미립구, 캡슐, 향낭(sachets), 정제, 액체 현탁액 또는 액체 용액의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 적어도 120 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 갖는 HA-판크레아틴의 제조 방법으로서, 상기 방법은 판크레아틴을 28 및 45 (MPa)0.5 사이의 힐데브란트 용해도 매개변수를 갖는 용매로 처리하는 단계를 포함하며,
    상기 용매는 하나의 유기 용매 또는 유기 용매들의 혼합물, 또는 적어도 하나의 유기 용매 및 수성 용매의 혼합물이며, 상기 공정 온도는 실온 이하인 것을 특징으로 하는, HA-판크레아틴의 제조 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 용매는 28 및 38 (MPa)0.5 사이의 힐데브란트 용해도 매개변수를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 용매는 28 및 34 (MPa)0.5 사이의 힐데브란트 용해도 매개변수를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 용매는 34 및 38 (MPa)0.5 사이의 힐데브란트 용해도 매개변수를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제 10항에 있어서, 상기 용매는 34 및 45 (MPa)0.5 사이의 힐데브란트 용해도 매개변수를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  15. 제 10항에 있어서, 상기 용매는 38 및 45 (MPa)0.5 사이의 힐데브란트 용해도 매개변수를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제 10항, 제 11항, 제 12항, 제 13항, 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 상기 방법은 적어도 150 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 갖는 판크레아틴을 제조하기 위한, 방법.
  17. 제 10항, 제 11항, 제 12항, 제 13항, 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 상기 방법은 적어도 200 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 갖는 판크레아틴을 제조하기 위한, 방법.
  18. 제 10항, 제 11항, 제 12항, 제 13항, 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 상기 방법은 적어도 250 USP IU/mg의 특정 리파제 활성을 갖는 판크레아틴을 제조하기 위한, 방법.
  19. 제 10항에 있어서,
    al) 34 및 45 (MPa)0.5 사이의 힐데브란트 용해도 매개변수를 갖는 용매에서 판크레아틴을 현탁하는 단계로, 상기 용매는 하나의 유기 용매 또는 유기 용매들의 혼합물, 또는 적어도 하나의 유기 용매 및 수성 용매의 혼합물인 것을 특징으로 하는 단계;
    a2) 단계 al의 혼합물의 가용성 부분으로부터 불용성 부분을 분리하는 단계; 및
    a3) 단계 a2에서 얻어진 불용성 부분을 건조하는 단계를 포함하며,
    공정 온도는 실온 이하인 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 단계 al)은 4℃의 온도에서 30분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  21. 제 10항, 제 19항 또는 제 20항에 있어서,
    상기 용매는 적어도 하나의 유기 용매 및 수성 용매의 혼합물이며,
    단계 a1은
    al.1) 교반 하에 수성 용매에서 판크레아틴을 현탁하는 단계;
    a1.2) 적어도 하나의 유기 용매 또는 이의 혼합물을 단계 al.1의 현탁액에 가하는 단계를 포함하며,
    공정 온도는 실온 이하인 것을 특징으로 하는, 방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 용매는 적어도 하나의 유기 용매 및 수성 용매의 혼합물이며,
    단계 a1은
    al.1) 교반 하에 수성 용매에서 판크레아틴을 현탁하는 단계;
    a1.2) 불용성 부분으로부터 단계 al.1의 가용성 부분을 분리하는 단계;
    a1.3) 하나의 유기 용매 또는 이의 혼합물을 단계 al.2의 가용성 부분에 가하는 단계를 포함하며,
    공정 온도는 실온 이하인 것을 특징으로 하는, 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 단계 a1.3은 4℃의 온도에서 30분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  24. 제 21항, 제 22항 또는 제 23항에 있어서, 단계 a1.1의 판크레아틴은 0.05 및 0.3 g/mL 사이의 양인 것을 특징으로 하는, 방법.
  25. 제 10항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 용매는 38 (MPa)0.5의 힐데브란트 용해도 매개변수를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  26. 제 10항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매는 n-펜탄, n-헥산, n-헵탄, 디에틸에테르, 시클로헥산, 사염화탄소, 에틸아세테이트, 테트라히드로퓨란, 클로로포름, 트리클로로에틸렌, 아세톤, 디메틸포름아미드, n-프로판올, 이소프로판올, 에탄올, 디메틸설폭시드 부틸알콜, 메탄올, 아세토니트릴, 디옥산, 및 염화메틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 유기 용매는 아세톤, 이소프로판올 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  28. 제 10항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 용매는 완충액인 것을 특징으로 하는, 방법.
  29. 제 10항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액은 pH=7 또는 pH=4를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  30. 제 10항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매는 아세톤이고 수성 용매는 pH=7의 완충액인 것을 특징으로 하는, 방법.
  31. 제 10항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매는 에탄올이고 수성 용매는 pH=7의 완충액인 것을 특징으로 하는, 방법.
  32. 제 10항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매는 아세톤이고 수성 용매는 pH=4의 완충액인 것을 특징으로 하는, 방법.
  33. 제 10항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매는 에탄올이고 수성 용매는 pH=4의 완충액인 것을 특징으로 하는, 방법.
  34. 제 19항 또는 제 21항에 있어서, 상기 용매는 38 (MPa)0.5의 힐데브란트 용해도 매개변수를 가지며, 상기 용매는 아세톤과 pH=7의 완충액의 혼합물이고, 단계 a1의 판크레아틴은 0.1 mg/mL의 농도인 것을 특징으로 하는, 방법.
  35. 제 22항에 있어서, 상기 용매는 38 (MPa)0.5의 힐데브란트 용해도 매개변수를 가지며, 상기 용매는 아세톤과 pH=4의 완충액의 혼합물이고, 단계 a1의 판크레아틴은 0.1 mg/mL의 농도인 것을 특징으로 하는, 방법.
  36. 제 22항에 있어서, 상기 용매는 38 (MPa)0.5의 힐데브란트 용해도 매개변수를 가지며, 상기 용매는 에탄올과 pH=4의 완충액의 혼합물이고, 단계 a1의 판크레아틴은 0.1 mg/mL의 농도인 것을 특징으로 하는, 방법.
  37. 제 22항에 있어서, 상기 용매는 38 (MPa)0.5의 힐데브란트 용해도 매개변수를 가지며, 상기 용매는 아세톤과 pH=7의 완충액의 혼합물이고, 단계 a1의 판크레아틴은 0.3 mg/mL의 농도인 것을 특징으로 하는, 방법.
  38. 제 23항에 있어서, 상기 용매는 38 (MPa)0.5의 힐데브란트 용해도 매개변수를 가지며, 상기 용매는 아세톤과 pH=4의 완충액의 혼합물이고, 단계 a1의 판크레아틴은 0.3 mg/mL의 농도인 것을 특징으로 하는, 방법.
  39. 제 23항에 있어서, 상기 용매는 38 (MPa)0.5의 힐데브란트 용해도 매개변수를 가지며, 상기 용매는 에탄올과 pH=4의 완충액의 혼합물이고, 단계 a1의 판크레아틴은 0.3 mg/mL의 농도인 것을 특징으로 하는, 방법.
  40. 제 10항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 및/또는 바이러스 부하 감소의 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 미생물 및/또는 바이러스 부하 감소는 여과, 가열, 이온화 방사선(ionizing radiation), 고압 또는 알킬화에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  42. 제 5항, 제 6항, 제 7항, 제 8항 또는 제 9항의 조성물의 약학적으로 허용가능한 양을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 췌장 효소 기능부전(pancreatic enzymatic insufficiency)과 관련된 생리학적 질병에 걸린 환자의 치료방법.
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