CN115737790A - 病毒和微生物污染减少的酶组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种自经电子束辐照的动物组织比如猪胰腺获得的酶制剂。本发明还涉及用于制备这种酶制剂的方法、包含这种酶制剂的药用组合物及使用这种药用组合物和酶制剂的方法。

Description

病毒和微生物污染减少的酶组合物
相关申请的交叉参考
本申请要求2016年3月28日递交的美国临时申请第62/314048号、2017年1月31日递交的美国临时申请第62/452746号和2017年2月3日递交的美国临时申请第62/454184号的优先权，所述申请的整个内容通过参照结合于此。
技术领域
本发明涉及源自动物组织的酶制剂、包含这种酶制剂的药用组合物及用于降低这种制剂和组合物中的病毒和微生物污染风险的方法。示例性的酶组合物包括适合于治疗用途，比如用于在哺乳动物和人中治疗和/或预防消化不良，并且特别是基于慢性胰腺外分泌功能不全的消化不良的胰腺提取物。
背景
源自动物组织的产物可能呈现病毒和/或微生物污染。某些生物污染物比如细菌或原生动物可在制备过程期间灭活。然而，其他生物污染物比如无包膜病毒对已建立的污染物减少或灭活方法具有抗性。特别的挑战是从源自动物组织的酶组合物灭活或去除病毒而在该过程中不破坏或改变酶的活性。
已建立的病毒灭活方法包括例如巴氏灭菌法、干热、蒸汽热、溶剂/去污剂处理和低pH。用于病毒灭活的方法的选择取决于产物的性质和污染、使用的纯化方法(如果有的话)和病毒污染物的性质。例如，溶剂或去污剂处理可破坏包膜病毒的脂质膜，并因此已用于灭活包膜病毒。然而，许多无包膜病毒通常不会被溶剂或去污剂处理灭活。
热，特别是干热，为用于病毒灭活的另一种已建立的方法。尽管干热处理甚至可灭活高度抗性的病毒比如无包膜病毒，但是处理需要延长的时间段(数小时)和监测含水量。此外，热处理可能损害产物的期望的生物活性，特别是当产物为酶组合物时。
胰酶产物已被长期用于治疗胰腺外分泌功能不全，一种与囊性纤维化(CF)、慢性胰腺炎、胰腺或胆总管梗阻(比如由肿瘤性疾病引起)、外科手术比如胰腺切除术或胃肠道旁路手术以及其他疾病和障碍相关的病症。胰腺将消化酶(包括脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶)分泌至近端十二指肠腔中，这些消化酶在此处促进常量营养素的水解。淀粉酶和蛋白酶由非胰腺的器官分泌，并且这些酶有助于碳水化合物和蛋白质的消化。然而，来自非胰腺来源的脂肪酶相对较少参与脂质消化。因此，未经治疗的胰腺外分泌功能不全患者一般地难以消化脂肪，并且可能会患有消化不良或营养不良或两者兼有的症状，伴有缺乏必需脂肪酸和脂溶性维生素、体重减轻、痉挛、肠胃气胀、胃气胀和油腻、恶臭味、稀粪(脂肪泻)。对于CF患者，治疗不当可能具有严重后果，因为营养状况良好与肺功能良好直接相关。
胰酶疗法治疗和/或避免吸收不良，并且促进胰腺外分泌功能不全患者的生长和发育。在CF患者中，粘液阻塞胰腺中的胰管，就像其在肺中一样。胰腺消化酶不会分泌至肠内，并且从而淀粉、脂肪和蛋白质的消化受损。缺乏消化尤其导致脂肪泻、腹痛和体重减轻。
哺乳动物和人的消化不良通常基于消化酶缺乏，特别是基于内源性脂肪酶缺乏，以及蛋白酶和/或淀粉酶缺乏。如果胰腺功能不全为病理性的，那么这可能是先天性或获得性的。获得性慢性胰腺功能不全可例如归因于酒精中毒。先天性胰腺功能不全可例如归因于先天性疾病囊性纤维化。消化酶缺乏的后果可能是营养低下和营养不良的严重症状，这可能伴随对继发性疾病的易感性增加。
用外源性消化酶或消化酶混合物(即胰酶疗法)替代已被证明是内源性消化酶缺乏的有效治疗。最常见的是，含有猪胰酶制剂的药用制剂用于胰酶疗法(也称为“酶替代疗法”)。对于这种药用制剂，临床试验中评价的活性成分为脂肪酶，并且市售产品的剂量以脂肪酶单位给出。然而，得自猪胰腺的这种消化酶混合物包含脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶，并且由于酶和其中含有的伴随物质与人胰液内容物的极大相似性而可有效地用于人胰酶疗法。胰酶通常以固体制剂的形式口服给予。
胰腺可得自为食物而饲养和屠宰的动物，比如猪。政府法规通常要求胰腺得自单一物种屠宰场(即所述设施没有屠宰和加工其他物种)，并且从而限制起始材料的可用性。感染性病原体广泛污染设施可能导致生产停工和供应短缺。目前的测试程序可鉴定污染的批次并消除这种批次对已受限制的起始材料供给造成的进一步负担。
自哺乳动物胰腺获得胰酶的方法是可获得的。例如，US 4623624中描述了通过含有异丙醇的水性组织浆液的自溶获得胰酶制剂的方法。
认识到在用于制备胰酶制剂的猪胰腺中存在感染性病原体，并且特别是病毒。确实，大多数猪群都感染了猪细小病毒(PPV)，其对灭活具有高抗性。已经在胰酶制剂中检测到PPV作为感染性病原体。尽管不认为PPV对人有致病性，但是期望获得PPV载量降低的胰酶制剂。另外，PPV为一种常见的模式病毒，因为其难以通过标准方法比如化学或热处理灭活。
US 2010/0119654涉及辐照悬浮液形式的含有固体的含醇或含水生物提取物。US2010/0119654中采用的辐照为紫外(UV)辐照、x射线辐照、β辐照或γ辐照。溶解于40%异丙醇的胰酶制剂中间体的UV辐照产生M2噬菌体高达4 log10的减少。胰酶制剂(API)的γ辐照产生在27 kGy时脂肪酶活性约40%的降低和在5 kGy时脂肪酶活性13%的降低。细菌含量减少超过2.5 log10，但是没有报道病毒灭活。当用β辐照处理胰酶制剂(API)时，据报道保持了>85%的酶活性，但是“微生物计数”仅减少约1.5 log10。
WO 2003/020324涉及用辐照使消化酶比如胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶和艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶灭菌。单独或在稳定剂存在下辐照冻干酶或液体酶(胰蛋白酶、糖苷酶或硫酸酯酶)。使用60Co源完成γ辐照。没有报道病毒灭活。
WO 2007/014896涉及通过加热胰酶制剂来降低胰酶制剂的一种或多种生物污染物特别是病毒污染物的浓度。
在US 2009/0233344中，胰酶制剂在80℃下热处理32小时提供PPV病毒滴度约2.5log10的降低，以及脂肪酶活性20%的丧失。胰酶制剂在100℃下热处理8小时提供PPV病毒滴度大于3log10的降低，但是脂肪酶活性丧失近50%。
因此，可有效对抗难以灭活的病毒比如PPV的处理步骤，具有很高的潜力通过降解或减少胰酶(特别是脂肪酶)至不可接受的水平来改变胰酶制剂产物的性质。效力的这种变化可降低或改变最终产物的功效概况。因此，期望在制备过程期间保持酶活性，特别是脂肪酶活性。
因为证实对难以灭活的病毒(例如PPV)具有一些有效性的每种先前测试的病毒清除方法导致酶活性(包括脂肪酶活性)显著丧失，所以业内怀疑可在不损害产物质量的情况下实现稳健的病毒灭活/清除水平。特别是，业内怀疑可开发出合适的稳健的正交病毒清除步骤而不会不利地影响胰酶制剂的化学、物理或药用性质。参见例如Scientific ProteinLaboratories于2004年6月22日致FDA的信，备案号2003D-0206。
发明概述
本发明涉及一种分离自动物组织来源的酶制剂。分离的酶制剂包含一种或多种酶，相对于源动物组织具有减少的病毒和/或微生物污染，并且保持源动物组织的至少一种生物活性。在某些实施方案中，酶制剂通过使源动物组织经受辐照，优选地为电子束辐照，并且随后自经辐照的组织分离一种或多种酶来产生。在某些实施方案中，源动物组织为完整组织。在某些实施方案中，与未经辐照的源动物组织相比，经辐照的组织呈现病毒和/或微生物污染物至少3 log10，优选地至少4 log10的减少。在某些实施方案中，与源动物组织相比，经辐照的组织呈现病毒载量至少3 log10，优选地至少4 log10的减少。在某些实施方案中，采用另外的正交病毒减少步骤(例如在自经辐照的组织分离一种或多种酶的步骤期间)。在某些实施方案中，分离自经辐照的组织的酶制剂具有相当于对照酶制剂，比如分离自未经辐照的源动物组织的酶制剂，的生物活性的至少50%，优选地至少90%的生物活性。在某些实施方案中，生物活性为脂肪酶活性。在某些实施方案中，与未经辐照的源动物组织相比，经辐照的组织呈现病毒和/或微生物污染物至少3 log10，优选地至少4 log10的减少，并且分离自经辐照的组织的酶制剂具有相当于对照酶制剂，比如分离自未经辐照的源动物组织的酶制剂，的生物活性的至少50%，优选地至少90%的生物活性。
本发明的另一方面涉及一种用于产生源自动物组织的酶制剂的方法，其中相对于源动物组织，酶制剂具有减少的病毒和/或微生物污染。与源动物组织相比，方法包括足以产生病毒和/或微生物污染物至少3 log10，优选地至少4 log10的减少的处理。在某些实施方案中，处理包括使完整源动物组织经受辐照，优选地为电子束辐照，以产生经辐照的动物组织。在某些实施方案中，电子束辐照处理足以减少源动物组织的病毒和/或微生物污染，同时保持源动物组织的至少一种生物活性。在某些实施方案中，生物活性为脂肪酶活性。在某些实施方案中，一种或多种酶和/或前酶提取自经辐照的动物组织。在某些实施方案中，一种或多种酶分离自经辐照的动物组织。在某些实施方案中，相对于未经处理的对照，方法降低动物来源的酶制剂或包含动物来源的酶制剂的药用组合物的感染性污染的风险。
本发明的另一方面涉及一种包含本文描述的酶制剂的药用组合物。药物组合物可为口服药用剂型。在某些实施方案中，药用组合物用于治疗或预防对胰酶替代疗法有反应的疾病，比如胰腺外分泌功能不全。因此，本发明的另一方面涉及一种用于治疗或预防胰腺外分泌功能不全的方法，包括给予有需要的受试者一定剂量的本文描述的酶制剂或药用组合物。
本发明的另一方面涉及包含本文描述的酶制剂或药用组合物的药盒。
本发明的这些和其他目的描述于以下段落中。这些目的不应视为缩小本发明的范围。
发明详述
该详述仅打算使本领域的其他技术人员熟悉本发明、其原理及其实际应用，使得本领域的其他技术人员可以其多种形式适应和应用本发明，因为它们可能最适合于特定用途的需要。该描述及其具体实例仅打算用于说明的目的。因此，本发明不限于该专利申请中描述的实施方案，并且可进行各种修改。
A. 定义
如说明书和附加权利要求中使用的那样，除非另外规定，以下术语具有指明的含义：
本文使用的术语“API” 代表“活性药用成分”。本文公开的优选的“API”为胰酶制剂，特别是通常用于治疗目的的猪胰酶制剂，即根据标准药典例如欧洲药典和/或美国药典的要求并且适合于口服给予在哺乳动物(特别是人)中治疗或预防消化不良的胰酶制剂，所述消化不良特别是比如患有囊性纤维化、慢性胰腺炎的患者或者经历过上胃肠道手术的患者中，由于慢性胰腺外分泌功能不全引起的消化不良。
本文使用的术语“粗品”指的是含有酶和/或前酶以及源自源组织的另外组分的未经纯化的制剂或混合物。粗品制剂或混合物包括(但不限于)动物组织本身。
术语“酶制剂”指的是含有一种或多种酶的任何物质组成，无论是以活性还是非活性形式(即前酶或酶原)存在。术语包括细胞或组织提取物以及源自动物组织或其他细胞材料的粗品制剂。酶制剂的一个实例为胰酶制剂(胰脂肪酶)，其为源自哺乳动物(优选地为猪)胰腺的提取物。
与本发明的酶制剂有关的术语“提取物”指的是与其来源的组织的至少一种组分分离的一种或多种酶和/或前酶。提取的组分可以活性酶或需要随后转化为活性形式的前酶(酶原)形式存在。
与本发明的酶制剂有关的术语“分离”指的是与其来源的组织的至少一种组分分离的一种或多种活性酶。因此，在某些实施方案中，“分离的酶”或“分离的酶制剂”包括一种或多种经水解和/或自溶自相应的前酶形式转化的活性酶。水解和/或自溶以使前酶转化为活性酶可发生在提取之前、期间或之后。
本文使用的术语“胰酶”、“胰酶制剂”和“胰脂肪酶”指的是源自哺乳动物胰腺的酶混合物，其包含消化酶比如脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶作为主要组分。特别是，术语“胰酶”、“胰酶制剂”和“胰脂肪酶”本文可同义使用，并且指的是适合于标准药典治疗用途的胰腺提取物，其含有几种消化酶，其性质通过以上说明的标准专论定义。由于标准制备方法，“胰酶”、“胰酶制剂”和“胰脂肪酶”通常以粉末形式作为“胰酶制剂粉”提供，有时也称为“胰腺粉”。胰酶、胰酶制剂和胰脂肪酶也可为，并且优选地为API。用于药用用途的胰酶制剂一般地为牛或猪来源。猪胰酶制剂为优选的。胰脂肪酶在一些参考文献中已描述为相对于胰酶制剂活性(脂肪酶)增加的酶制剂。
本文使用的术语“药用组合物”意指包含本文描述的酶制剂和任选的一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物。
术语“药学上可接受的”作形容词使用，意指修饰的名词适合用作药品或药品的一部分。
“正交”微生物和/或病毒减少步骤指的是用于减少可能存在于样品中的微生物和/或病毒的独特方法。如果过程中存在一个或多个另外的微生物和/或病毒减少步骤，那么微生物和/或病毒减少步骤可为正交的。在某些实施方案中，“正交”微生物和/或病毒减少步骤具有与过程中使用的所有其他微生物和/或病毒减少步骤充分区别的机制，使得通过“正交”步骤实现的log10杀灭变得对于由用于获得酶制剂的所有其他微生物和/或病毒减少步骤实现的累积log10杀灭是相加的。
术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”指的是预防病症、障碍或疾病和/或其伴随症状的发作或者阻碍受试者获得病症、障碍或疾病的方法。本文使用的“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”还包括延迟病症、障碍或疾病和/或其伴随症状的发作及降低受试者获得病症、障碍或疾病的风险。
术语“受试者”包括人和其他灵长类动物以及驯养和半驯养动物，包括(但不限于)家禽、蜜蜂、牛、绵羊、山羊、猪、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。术语“家禽”包括所有类型的家禽，包括(但不限于)鸡、火鸡、鸭、鹅、平胸鸟类和猎鸟类。在某些实施方案中，受试者为人。
术语“治疗有效量”意指以适用于任何医疗的合理的效益/风险比足以治疗病症、障碍或疾病的酶制剂或药用组合物的量。当用于医疗时，治疗有效量的一种酶制剂可作为提取物或以粗品形式使用。或者，酶组合物可作为含有与一种或多种药学上可接受的载体组合的感兴趣的酶组合物的药用组合物给予。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指的是减轻或消除病症、障碍或疾病和/或其伴随症状的方法。
B. 酶制剂和制备方法
在一个方面，本发明包括一种酶制剂，其包含一种或多种源自动物(优选地为哺乳动物)组织的酶和/或前酶。在某些实施方案中，酶制剂包含消化酶和/或前酶的混合物。在某些实施方案中，酶制剂包含脂肪酶。在某些实施方案中，酶制剂包含淀粉酶。在某些实施方案中，酶制剂包含蛋白酶。在某些实施方案中，酶制剂包含胰酶制剂。在某些实施方案中，酶制剂包含前酶，比如前脂酶或胰蛋白酶原。在某些实施方案中，酶制剂以粗品形式存在。在某些实施方案中，酶制剂包含一种或多种提取自动物组织的酶和/或前酶。在某些实施方案中，酶制剂包含一种或多种分离自动物组织的酶。
在某些方面，分离的酶制剂具有与分离其的组织相同或基本相同的生物活性，但是感染性较低。在某些实施方案中，分离的酶制剂具有与对照酶制剂相同或基本相同的生物活性。在某些实施方案中，相对于分离其的组织感染性，分离的酶制剂感染性降低至少3log10，优选地至少4 log10。在某些实施方案中，降低的感染性为病毒感染性，特别是无包膜病毒感染性和/或包膜病毒感染性。在某些实施方案中，分离的酶制剂生物活性为对照酶制剂的生物活性的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或优选地至少90%。在某些实施方案中，生物活性为酶活性，比如蛋白酶活性、淀粉酶活性或优选地脂肪酶活性。
另一方面，酶制剂分离自预处理的组织来源，并且具有与分离自未经处理的组织来源的对照制剂相比相同或基本相同的生物活性，但是感染性较低。在某些实施方案中，相对于对照制剂，酶制剂的感染性降低至少3 log10，优选地至少4 log10。在某些实施方案中，相对于未经处理的组织来源，预处理的组织来源的感染性降低至少3 log10，优选地至少4log10。在某些实施方案中，降低的感染性为病毒感染性，特别是无包膜病毒感染性。在某些实施方案中，酶制剂的生物活性为分离自未经处理的组织来源的对照制剂生物活性的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或优选地至少90%。在某些实施方案中，生物活性为酶活性，比如蛋白酶活性、淀粉酶活性或优选地脂肪酶活性。
另一方面，酶制剂源自经电子束辐照的组织。在某些实施方案中，经电子束辐照的组织为哺乳动物(优选地为猪)组织。在某些实施方案中，源自经电子束辐照的组织的酶制剂包含胰酶制剂。在某些实施方案中，源自经电子束辐照的组织的酶制剂包含前酶，比如前脂酶或胰蛋白酶原。在某些实施方案中，源自经电子束辐照的组织的酶制剂以粗品形式存在。在某些实施方案中，源自经电子束辐照的组织的酶制剂包含一种或多种提取自经辐照的组织的酶和/或前酶。在某些实施方案中，源自经电子束辐照的组织的酶制剂包含一种或多种分离自经辐照的组织的酶。
另一方面，酶制剂分离自经电子束辐照的组织，并且具有与分离自未经辐照的组织来源的对照制剂相同或基本相同的生物活性，但是感染性较低。在某些实施方案中，经辐照的组织为胰腺组织。在某些实施方案中，经辐照的组织为片状胰腺组织、整个胰腺或整个胰腺的一部分。在某些实施方案中，未经辐照的组织来源为胰腺组织。在某些实施方案中，相对于对照制剂，酶制剂的感染性降低至少3 log10，优选地至少4 log10。在某些实施方案中，降低的感染性为病毒感染性，特别是无包膜和/或包膜病毒感染性。在某些实施方案中，降低的感染性为PPV感染性。在某些实施方案中，分离的酶制剂的生物活性为对照制剂生物活性的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或优选地至少90%。在某些实施方案中，生物活性为酶活性，比如蛋白酶活性、淀粉酶活性或优选地脂肪酶活性。
另一方面，酶制剂包含经电子束辐照的前酶。在某些实施方案中，酶制剂被进一步处理，比如通过将经辐照的前酶转化为其活性形式(例如通过自溶和/或水解)。
本发明的酶制剂可结合以下方法更好地理解，所述方法说明可借以获得酶制剂的示例性技术。
在一个方面，本发明包括一种用于制备酶组合物的方法，包括使前酶来源经受辐照，优选地为电子束辐照。在某些实施方案中，前酶来源为细胞群。在某些实施方案中，细胞群为得自哺乳动物腺体的完整组织或其一部分。在某些实施方案中，细胞群为得自哺乳动物的整个腺体。在某些实施方案中，细胞群为得自哺乳动物的腺体的一部分。在某些实施方案中，细胞群为冷冻的组织块。在某些实施方案中，细胞群为片状或切碎的动物组织。
另一方面，本发明包括一种用于制备酶制剂的方法。方法包括使动物组织经受辐照，优选地为电子束辐照。在某些实施方案中，动物组织为完整组织。在某些实施方案中，完整动物组织为冷冻的组织块。在某些实施方案中，完整动物组织为片状或切碎的动物组织。
在某些实施方案中，方法开始于动物组织，优选地为完整动物组织。在某些实施方案中，动物组织为哺乳动物(并且优选地为猪)胰腺。在某些实施方案中，猪胰腺得自经批准的屠宰场，优选地为单一物种屠宰场。
在某些实施方案中，完整动物组织包括完整胰腺组织。在某些实施方案中，完整胰腺组织包括整个胰腺或其一部分，比如一个或多个胰叶。在某些实施方案中，完整胰腺组织包括片状冷冻组织。在某些实施方案中，完整胰腺组织包括可能已经机械加工的冷冻组织块。在某些实施方案中，完整胰腺组织包括已经以例如破坏活性酶和/或使组织中的前酶转化为其活性形式的这种方式被最小程度地操控或改变，或者优选地未被操控或改变的胰腺组织。例如，经历过显著化学或酶处理以使前酶转化为其活性形式的组织匀浆不是本文使用的术语“完整组织”。作为另一个实例，已经在破坏活性酶和/或使组织中的前酶转化为其活性形式的条件下研磨或切碎的组织不是本文使用的术语“完整组织”。
在某些实施方案中，将动物组织(优选地为冷冻的动物组织)粉碎。在某些实施方案中，粉碎可使用冷冻块刨片机实现，比如General Machinery Corporation (Sheboygan,WI)提供的Hydrauflake Chunker，其被设计成形成冷冻组织的厚块，为进一步加工做准备。
在某些实施方案中，动物组织被辐照。在某些实施方案中，使动物组织暴露于加速电子灭菌束，即电子束或电子束辐照。在某些实施方案中，使完整动物组织暴露于电子束辐照。在某些实施方案中，使整个胰腺或其完整部分暴露于电子束辐照。在某些实施方案中，使片状猪胰腺组织暴露于电子束辐照。
电子束辐照为电离能的一种形式，其特征通常在于其低穿透性和高剂量率。电子束(一种集中的高度荷电的电子流)通过电力的加速和转换产生。电子由称为加速器的设备产生，加速器能够产生脉冲或连续的束。当被辐照的材料在电子束下面或前面通过时，来自电子的能量被吸收。这种能量吸收改变产品/材料中的各种化学键和生物学性质。吸收的能量称为“吸收剂量”。正是这种能量吸收-或“剂量射送”-例如通过破坏其DNA或RNA链来杀灭病毒和微生物。
辐照可以常规方式实施，比如通过将组织置于合适的容器中并使组织暴露于电子束。在某些实施方案中，将装有组织的容器置于传送带上，传送带然后通过电子束。在某些实施方案中，装有组织的容器不含任何溶剂。在某些实施方案中，装有组织的容器基本上不含溶剂。在某些实施方案中，装有组织的容器不含任何易燃溶剂。在某些实施方案中，装有组织的容器基本上不含易燃溶剂比如乙醇。例如，容器可含有冷冻的完整组织，比如整个腺体、整个腺体的一部分或片状组织。
在某些实施方案中，辐照以足以基本上灭活组织中的抗性病毒和/或微生物的剂量提供。在某些实施方案中，辐照以相对于分离自未经辐照的组织的对照酶制剂防止生物活性(优选地为酶活性)丧失的剂量存在。
加速的电子束可由电子加速器提供，比如Iotron Industries USA, Inc.(Columbia City, IN)提供的电子加速器。在某些实施方案中，电子加速器以20-250 kW的功率和5-18兆电子伏特(MeV)的电子束能量操作。在某些实施方案中，电子加速器以60 kW和10 MeV操作。在某些实施方案中，电子加速器提供10 MeV或之上的电子束能量。
可使组织暴露于电子束辐照，辐照的时间和量足以实现病毒或微生物灭活而不损害一种或多种随后提取或分离自经辐照的组织的酶生物活性。使组织灭菌需要的电子束辐照的剂量可基于例如组织大小、组织类型以及存在于或怀疑存在于组织样品中的病毒或微生物污染物的类型和量而变化。本领域的技术人员将基于组织特征和所使用的加速器认识并能够确定适合于特定组织的合适剂量和时间。选择的电子束剂量有效灭活通过常规方法难以杀灭的感染性病原体，同时造成酶活性的丧失最小。
辐照的“吸收剂量”以千戈瑞(kGy)为单位表示，其中一千戈瑞等于每千克材料储存一千焦耳能量。在某些实施方案中，使组织暴露于电子束直至吸收灭活感染性病原体的辐照量。例如，可使组织暴露于电子束直至获得约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50千戈瑞(kGy)或更多的剂量。作为另一个实例，可使组织暴露于电子束直至获得约5-约50、约10-约40、约15-约35 kGy的剂量。在某些实施方案中，使组织暴露于电子束直至吸收约30 kGy的剂量。在某些实施方案中，猪胰腺用足以提供感染性病原体(优选地为难以灭活的感染性病原体比如无包膜病毒)的高log10杀灭，同时造成酶活性的丧失最小的电子束剂量辐照。
在某些实施方案中，剂量可使用辐照变色染料膜来确定。这种膜可参照国家标准进行校准。
在某些实施方案中，使组织暴露于电子束辐照，辐照的时间和量足以产生模式病毒的病毒载量与对照样品相比至少3 log10，优选地至少4 log10的减少。在一些这种实施方案中，使组织暴露于电子束辐照，辐照的时间和量足以产生模式病毒的病毒载量与对照样品相比约3 log10-约5 log10的减少。在一些这种实施方案中，使组织暴露于电子束辐照，辐照的时间和量足以产生模式病毒的病毒载量与对照样品相比约4 log10的减少。在某些实施方案中，模式病毒为PPV。在某些实施方案中，组织为完整组织。在一些这种实施方案中，完整组织为腺体，比如整个胰腺或其一部分，比如胰腺的一个或多个胰叶。在其他这种实施方案中，完整组织为冷冻的片状组织。
在某些实施方案中，电子束暴露包括单侧或多侧暴露。在某些实施方案中，使组织经受单侧暴露于电子束。在某些实施方案中，使组织经受多侧暴露，例如双侧暴露于电子束。因此，约20 kGy的剂量可包括约10 kGy/侧的双侧暴露；约30 kGy的剂量可包括约15kGy/侧的双侧暴露；约40 kGy的剂量可包括约20 kGy/侧的双侧暴露；和约50 kGy的剂量可包括约25 kGy/侧的双侧暴露。
在某些实施方案中，制备酶制剂的方法降低包含酶制剂的药用组合物的病毒或微生物感染性的风险。
在某些实施方案中，相对于辐照处理之前的腺体感染性，经辐照的胰腺的感染性降低至少3 log10，优选地至少4 log10。在某些实施方案中，相对于辐照处理之前的腺体感染性，源自或分离自经辐照的胰腺的酶制剂感染性降低至少3 log10，优选地至少4 log10。或者，酶制剂的感染性相对于源自或分离自未经辐照的胰腺的对照酶制剂进行测定。
在某些实施方案中，降低的感染性为病毒感染性，特别是无包膜病毒比如PPV的病毒感染性。例如，相对于分离自未经辐照的胰腺的对照酶制剂，分离自经辐照的胰腺的胰酶制剂产物的PPV感染性降低至少3 log10，优选地至少4 log10。作为另一个实例，相对于未经辐照的胰腺，经辐照的胰腺的PPV感染性降低至少3 log10，优选地至少4 log10。在一些这种实施方案中，酶制剂的PPV感染性通过随后在辐照后实施的正交病毒灭活步骤进一步降低。
在某些实施方案中，方法还可包括在辐照步骤后测试组织或源自组织的酶制剂中一种或多种微生物(例如病毒、细菌或原生动物)的存在情况或量的步骤。用于确定样品是否含有微生物的方法为本领域已知的，并且包括例如噬菌斑测定或集落形成测试。有效灭菌也可使用常规微生物技术确定，比如在辐照批次中包含合适的生物指示剂或者使组织与培养基接触，并温育培养基以确定组织的无菌性。
在某些实施方案中，病毒感染性可通过终点滴定和随后计算半数组织培养感染剂量(TCID50)来计算。以该方式计算的病毒滴度可作为log10 TCID50/ml给出，置信区间为95%。
在某些实施方案中，病毒污染的减少按照USP-NF通则<1050>，作为对数减少因数给出，其为对照样品与源自经电子束辐照的组织的样品之间在分离时的病毒滴度差异。例如，减少3 log10可能表明病毒载量减少至1/1000，和减少4 log10可能表明病毒载量减少至1/10000。
在某些实施方案中，制备酶制剂的方法使得能够减少酶制剂的病毒和/或微生物污染而不显著降低其酶活性。
在某些实施方案中，分离自经辐照的胰腺的酶制剂的酶活性得以保持。例如，在某些实施方案中，酶制剂的生物活性为分离自未经辐照的胰腺的对照制剂的生物活性的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或优选地至少90%。在某些实施方案中，生物活性为酶活性，比如蛋白酶活性、淀粉酶活性或优选地脂肪酶活性。
辐照后，组织可进一步加工以提供酶组合物。例如，在某些实施方案中，一种或多种酶和/或前酶提取自经辐照的组织。在某些实施方案中，一种或多种酶分离自经辐照的组织。用于自组织样品分离酶的各种方法为已知的。例如，US 4623624提供了用于通过含有异丙醇的水性组织浆液的自溶分离胰酶制剂的方法。
在某些实施方案中，经辐照的组织可经受自溶和/或水解以使前酶转化为其活性形式。例如，经辐照的组织可与水解起始剂组合以引发自溶。在某些实施方案中，自溶和/或水解在环境温度下实施。在某些实施方案中，在反应完成时过滤反应混合物，收集滤液，沉淀滤液中存在的酶(例如用异丙醇)，并过滤沉淀、用异丙醇洗涤且真空干燥。
可以理解上述和如在实施例部分说明的方法为说明性的，并且不应理解为限制如在附加权利要求中定义的本发明范围。方法和具体实例的所有备选、修改和等同物包括在权利要求的范围内。
C. 组合物
至少在一个方面，本发明包括包含本文描述的酶制剂的组合物。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种提取自经辐照的动物组织的酶和/或前酶。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种分离自经辐照的动物组织的酶。在某些实施方案中，组合物为含有一种或多种源自动物组织的酶的粗品混合物。
另一方面，提供一种包含本文描述的酶制剂的药用组合物，其进一步任选地包含一种或多种常规药学上可接受的赋形剂，比如在例如以下的教科书中找到的那些：Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (Alfonso R. Gennaro, ed.; MackPublishing Company, Easton, PA, 1990); Remington: the Science and Practice ofPharmacy 19th Ed. (Lippincott, Williams & Wilkins, 1995); Handbook ofPharmaceutical Excipients, 3rd Ed. (Arthur H. Kibbe, ed.; Amer.Pharmaceutical Assoc, 1999); the Pharmaceutical Codex: Principles andPractice of Pharmaceutics 12th Ed. (Walter Lund ed.; Pharmaceutical Press,London, 1994); The United States Pharmacopeia: The National Formulary (UnitedStates Pharmacopeial Convention); 和Goodman and Gilman's: the PharmacologicalBasis of Therapeutics (Louis S. Goodman and Lee E. Limbird, eds.; McGrawHill, 1992)，它们的公开内容特此通过参照结合。
包含本文描述的酶制剂的药用组合物可用于在治疗和/或预防哺乳动物的消化不良中补充消化酶，所述消化不良特别是比如患有囊性纤维化、慢性胰腺炎的患者或者经历过上胃肠道手术的患者中，由于慢性胰腺外分泌功能不全引起的消化不良。本文描述的药用组合物或剂型优选地可为特别是可给予人的口服剂型。
含有酶制剂的口服剂型可以例如胶囊剂、颗粒剂(granule)、粒剂(granulate)、微丸、微球、微片、小丸剂、丸剂、粉剂和/或片剂的形式存在。对于该描述的目的，如果口服剂型的直径或其所有尺寸(长度、高度、宽度)等于或小于约5 mm，则前缀“微”用于描述口服剂型。
在某些实施方案中，口服剂型为胶囊剂。胶囊剂可包含约2000-约40000脂肪酶单位/胶囊。在某些实施方案中，口服剂型为包含3000、6000、12000、24000或36000脂肪酶单位/胶囊的胶囊剂。在某些实施方案中，口服剂型为包含3000、5000、10000、15000、20000、25000或40000脂肪酶单位/胶囊的胶囊剂。在某些实施方案中，口服剂型为包含2600、4200、10500、16800或21000脂肪酶单位/胶囊的胶囊剂。在某些实施方案中，口服剂型为包含4000、13800、20700或23000脂肪酶单位/胶囊的胶囊剂。在某些实施方案中，口服剂型为包含4000、8000或16000脂肪酶单位/胶囊的胶囊剂。在某些实施方案中，口服剂型为包含4000、8000或16000脂肪酶单位/胶囊的胶囊剂。在某些实施方案中，口服剂型为包含3000、4000、6000或8000脂肪酶单位/胶囊的胶囊剂。剂量强度可以各种方式表示，包括USP单位、欧洲药典单位或BP单位。
在某些实施方案中，口服剂型为包含10440或20880脂肪酶单位/片的片剂。
各种含有胰酶制剂的药用组合物和剂型为已知的，比如延迟释放和立即释放组合物。例如，US 9198871提供延迟释放胰酶制剂组合物。
在某些实施方案中，口服剂型为胰酶制剂微丸或胰酶制剂微球。在某些实施方案中，胰酶制剂微丸或胰酶制剂微球用例如肠溶衣包衣。在某些实施方案中，胰酶制剂微丸或胰酶制剂微球-独立于任何这种包衣-包含按重量计约10%-约95%之间的胰酶制剂、按重量计约5%-约90%之间的至少一种药学上可接受的粘合剂和按重量计0%-约10%之间的至少一种药学上可接受的赋形剂。更具体地讲，胰酶制剂微丸或胰酶制剂微球包含按重量计约70%-约90%之间的胰酶制剂、按重量计约10%-约30%之间的至少一种药学上可接受的粘合剂和按重量计0%-约5%之间的至少一种药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，胰酶制剂微丸或胰酶制剂微球包含按重量计约70%-约90%之间的胰酶制剂和按重量计约10%-约30%之间的至少一种药学上可接受的粘合剂。在某些实施方案中，胰酶制剂微丸或胰酶制剂微球近似为球形并且具有约0.5 mm-约2.0 mm之间的直径。在某些实施方案中，胰酶制剂微丸或胰酶制剂微球具有约0.5 mm-约2.0 mm之间的第一尺寸和约0.5 mm-约2.0 mm之间的第二尺寸。在某些实施方案中，胰酶制剂微丸或胰酶制剂微球具有约0.8 mm-约1.0 mm之间的第一尺寸和约0.5 mm-约2.0 mm之间的第二尺寸。
药学上可接受的粘合剂的实例包括聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇3000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、羟丙基甲基纤维素、聚氧乙烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物及所述有机聚合物的混合物。前述药学上可接受的粘合剂列表并不意指为详尽的，而是仅为说明性的，因为本领域的普通技术人员会理解也可使用许多其他药学上可接受的粘合剂或粘合剂组合。聚乙二醇4000为优选的药学上可接受的粘合剂。
合适的药学上可接受的赋形剂的实例包括：光滑剂像硬脂酸镁或硬脂酸钙、硬脂酸、滑石和/或淀粉；填充剂像磷酸钙、玉米淀粉、葡聚糖、糊精、水合二氧化硅、微晶纤维素、高岭土、乳糖、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、沉淀碳酸钙、山梨醇和/或滑石；崩解剂像Aerosil(硅酸)、海藻酸、直链淀粉、海藻酸钙、碳酸钙、甲醛明胶、果胶酸碳酸盐(pecticcarbonate)、西米淀粉、碳酸氢钠和/或淀粉; 和/或湿润剂像甘油和/或淀粉。前述药学上可接受的赋形剂列表并不意指为详尽的，而是仅为说明性的，因为本领域的普通技术人员会理解也可使用许多其他药学上可接受的赋形剂或赋形剂组合。对于本公开的目的，合成油类和单体酞酸酯类不认为是合适的药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，胰酶制剂微丸或胰酶制剂微球不含药学上可接受的赋形剂，而是可任选地含有更大量的胰酶制剂。
在另一个实施方案中，提供胰酶制剂的口服剂型比如肠溶包衣的口服剂型，用于制备用于治疗医学病症比如消化障碍、胰腺外分泌功能不全、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的药物。
在某些实施方案中，药用组合物为控释药用组合物。例如，控释药用组合物可通过将肠溶衣涂覆于口服剂型来获得。在某些实施方案中，肠溶衣包含成膜剂、增塑剂和任选的防粘剂。
合适的成膜剂包括琼脂、卡波姆均聚物和共聚物(即高分子量交联的基于丙烯酸的聚合物)、羧甲基纤维素、羧甲基乙基纤维素、角叉菜胶、醋酸纤维素酞酸酯、醋酸纤维素琥珀酸酯、醋酸纤维素偏苯三酸酯、甲壳质、玉米蛋白提取物、乙基纤维素、阿拉伯树胶、羟丙基纤维素、醋酸羟丙基甲基酯琥珀酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素酞酸酯、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸乙酯共聚物、甲基纤维素、果胶、聚醋酸乙烯酯酞酸酯、聚乙烯醇、虫胶、海藻酸钠、醋酸淀粉酞酸酯和/或苯乙烯/马来酸共聚物或所述成膜聚合物的混合物。醋酸纤维素酞酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯和/或甲基丙烯酸-甲基丙烯酸乙酯共聚物为优选的成膜剂。最优选的为羟丙基甲基纤维素酞酸酯，比如HP 55或HPMCP HP-50。合成油类不认为是优选的成膜剂。前述成膜剂列表并不意指为详尽的，而是仅为说明性的，因为本领域的普通技术人员会理解也可使用许多其他成膜剂或成膜剂组合。
相对于成膜剂，增塑剂通常可以按重量计大于约1.5%的量，并且一般地以约2%-约20%之间的量存在。增塑剂可含有具有12-30个碳原子的饱和线性一元醇。更具体地讲，可接受的增塑剂包括月桂醇、十三烷醇、肉豆蔻醇、十五烷醇、鲸蜡醇、十七烷醇、硬脂醇、十九烷醇、花生醇、山嵛醇、巴西棕榈醇、蜡醇、二十五烷醇(corianyl alcohol)、蜂花醇、乙酰枸橼酸三丁酯、癸二酸二丁酯、甘油脂肪酸酯、甘油、聚乙二醇、丙二醇、脱水山梨糖醇脂肪酸、三醋精、枸橼酸三乙酯及所述增塑剂的混合物。优选的增塑剂为鲸蜡醇、硬脂醇、枸橼酸三乙酯及其混合物。当鲸蜡醇用作单一增塑剂时，相对于成膜剂，其可以按重量计大于约1.5%的量，一般地以约2%-约15%，优选地约2%-约10%的量存在。当枸橼酸三乙酯用作单一增塑剂时，相对于成膜剂，其可以按重量计约5%-约20%之间，优选地约12%-约15%之间的量存在。合成油类和单体酞酸酯类不认为是合适的增塑剂。前述增塑剂列表并不意指为详尽的，而是仅为说明性的，因为本领域的普通技术人员会理解也可使用许多其他增塑剂或增塑剂组合，只要其基本上不含合成油类和单体酞酸酯类两者。
在某些实施方案中，增塑剂包含鲸蜡醇和枸橼酸三乙酯，相对于成膜剂，其总计以按重量计大于约3%的量，一般地以约4%-约20%，特别是约6%-约15%之间，更特别地约7%-约10%之间的量存在。当两者均存在时，鲸蜡醇-枸橼酸三乙酯的重量-重量比率可为约0.05:1-约1:1，例如0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1或0.9:1。特别是，蜡醇醇-枸橼酸三乙酯的比率可为约0.25:1-约0.5:1，优选地约0.3:1-约0.45:1，更优选地约0.35:1-约0.4:1，和甚至更优选地约0.38:1-约0.4:1 (w/w)。
肠溶衣任选地包含防粘剂。合适的防粘剂包括二甲聚硅氧烷和蓖麻油。二甲聚硅氧烷(特别是二甲聚硅氧烷1000)为优选的防粘剂。相对于成膜剂，肠溶衣中防粘剂(如果存在)的量为按重量计约1.5%-约3%。合成油类不认为是优选的防粘剂。前述防粘剂列表并不意指为详尽的，而是仅为说明性的，因为本领域的普通技术人员会理解也可使用许多其他防粘剂或防粘剂组合。
在某些实施方案中，肠溶衣占肠溶包衣的口服剂型或控释药用组合物的总组成的按重量计约5%-约30%之间，更优选地按重量计约7%-约20%之间，仍然更优选地按重量计约10%-约15%之间。在某些实施方案中，肠溶衣占肠溶包衣的口服剂型或控释药用组合物的总组成的按重量计约20%-约30%之间，更优选地按重量计约22%-约26%之间，仍然更优选地按重量计约22.5%-约25%之间。
在某些实施方案中，药用组合物为用于口服给予的控释胶囊。胶囊剂可含有包含脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的肠溶包衣小丸。肠溶包衣小丸可具有约0.5 mm-约2.0 mm之间的第一尺寸和任选的约0.5 mm-约2.0 mm 之间的第二尺寸。例如，肠溶包衣小丸可近似为球形并且具有约0.71-约1.60 mm的直径。作为另一个实例，肠溶包衣小丸可为串状的并且具有约0.5 mm-约2.0 mm的直径和约0.5 mm-约2.0 mm的长度。组合物可进一步包含本文描述的非活性成分，比如鲸蜡醇、二甲聚硅氧烷、酞酸羟丙甲纤维素、聚乙二醇和枸橼酸三乙酯。
在某些其他实施方案中，药用组合物为立即释放药用组合物。例如，立即释放药用组合物可没有肠溶衣。
D. 使用方法
至少在一个方面，本发明包括一种在需要这种治疗的受试者(特别是人受试者)中治疗胰腺外分泌功能不全的方法。方法包括给予受试者酶制剂或含有酶制剂的药用组合物。在某些实施方案中，胰腺外分泌功能不全是由于囊性纤维化、慢性胰腺炎、胰腺切除术或其他病症引起。
另一方面，本发明包括一种在需要这种治疗或预防的受试者(特别是人受试者)中治疗或预防消化不良的方法。在某些实施方案中，消化不良是比如在患有囊性纤维化、慢性胰腺炎的受试者或者经历过上胃肠道手术的患者中，由于慢性胰腺外分泌功能不全引起。
另一方面，本发明包括酶制剂或含有酶制剂的药用组合物用于在需要这种治疗的受试者中治疗胰腺外分泌功能不全的用途。
另一方面，本发明包括酶制剂或含有酶制剂的药用组合物用于在需要这种治疗或预防的受试者中治疗或预防消化不良的用途。
在与上述方法和用途有关的某些实施方案中，酶制剂包含胰酶制剂。在某些实施方案中，合适的胰酶制剂剂量可基于脂肪酶单位。囊性纤维化基金会(Cystic FibrosisFoundation, CFF)已经发布了共识指南(Consensus Guidelines)，其含有推荐的脂肪酶单位每日总剂量。
在某些实施方案中，每120 mL配方或每次母乳喂养，给予12个月龄以下的婴儿2000-4000脂肪酶单位，优选地为3000脂肪酶单位。
在某些实施方案中，给予一(1)-四(4)岁龄的个体每餐每kg体重1000-2500脂肪酶单位。在某些实施方案中，给予至少四(4)岁龄的个体每餐每kg体重500-2500脂肪酶单位。
在某些实施方案中，每日最大剂量不超过每kg体重10000脂肪酶单位。在某些实施方案中，每日最大剂量不超过每g摄入脂肪4000脂肪酶单位。
在某些实施方案中，酶制剂或含有酶制剂的药用组合物在用餐之前立即给予。在某些实施方案中，酶制剂或含有酶制剂的药用组合物在用餐或小吃期间给予。
在仍然另一个实施方案中，提供一种通过给予需要这种治疗的人治疗有效量的酶制剂或含有酶制剂的药用组合物，用于治疗医学病症比如消化障碍、胰腺外分泌功能不全、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法。
至少在一个方面，本发明包括一种消化蛋白质的方法。方法包括使待消化的蛋白质与酶制剂在足以消化蛋白质的条件下接触。
在某些实施方案中，酶制剂包含一种或多种提取自经电子束辐照的动物组织的酶和/或前酶。在某些实施方案中，酶制剂包含一种或多种分离自经电子束辐照的动物组织的酶。在某些实施方案中，酶制剂以粗品形式存在。
在某些实施方案中，接触步骤发生在体内。在某些实施方案中，接触步骤发生在体外。
在某些实施方案中，消化的蛋白质用于制备蛋白质水解产物。
本文描述的酶制剂、组合物、方法和用途通过参照以下示例性实施方案和实施例而得以更好地理解，所述实施方案和实施例被包括作为对本发明范围的说明而不是限制。
E. 示例性实施方案
本发明的一个方面包括一种通过包含以下步骤的方法产生的酶制剂：(a) 提供哺乳动物胰腺组织；(b) 使胰腺组织经受电子束辐照以产生经辐照的胰腺组织，其中电子束辐照足以产生微生物和/或病毒载量的减少；和(c) 自经辐照的胰腺组织分离胰酶制剂。在某些实施方案中，分离步骤包括引发胰腺组织的水解或自溶。在某些实施方案中，分离步骤包括混合经辐照的胰腺组织与水。在某些实施方案中，步骤(c)包括激活来自经辐照的胰腺组织的前酶。在某些实施方案中，相对于得自未经辐照的组织的对照样品，微生物和/或病毒载量的减少为至少3 log10，优选地至少4 log10的减少。例如，相对于得自未经辐照的组织的对照样品，微生物和/或病毒载量的减少为PPV病毒载量至少3 log10，优选地至少4log10的减少。在某些实施方案中，步骤(c)中获得的酶制剂的生物活性相当于得自未经辐照的胰腺组织的对照酶制剂的生物活性的至少50%，优选地至少90%。在某些实施方案中，生物活性为脂肪酶活性。在某些实施方案中，生物活性为蛋白酶活性或淀粉酶活性。在某些实施方案中，方法进一步包括一个或多个提供微生物和/或病毒载量的另外减少的另外步骤。
本发明的另一方面包括一种酶制剂，其包含一种或多种分离自哺乳动物组织的酶，所述组织经受足以产生至少3 log10，优选地至少4 log10的病毒载量减少的处理。例如，相对于未经辐照的对照样品，处理足以产生PPV病毒载量至少3 log10，优选地至少4 log10的减少。
本发明的另一方面包括一种酶制剂，其包含一种或多种分离自哺乳动物组织的酶，其中在酶分离之前，哺乳动物组织已经受足以产生病毒载量至少3 log10，优选地至少4log10的减少的处理。例如，相对于未经处理的对照样品，处理足以产生PPV病毒载量至少3log10，优选地至少4 log10的减少。在某些实施方案中，哺乳动物组织为猪胰腺。在某些实施方案中，猪胰腺为片状。在某些实施方案中，猪胰腺为冷冻块。在某些实施方案中，猪胰腺为整个腺体或其部分，比如一个或多个胰叶。在某些实施方案中，一种或多种酶包括胰酶制剂。在某些实施方案中，处理包括电子束辐照。在某些实施方案中，电子束辐照具有约5-约50 kGy，优选地约10-约40 kGy的剂量。在某些实施方案中，酶制剂的生物活性相当于得自未经处理的胰腺组织的对照酶制剂的生物活性的至少50%，优选地至少90%。在某些实施方案中，生物活性为脂肪酶活性。在某些实施方案中，生物活性为蛋白酶活性或淀粉酶活性。在某些实施方案中，病毒载量的减少为正交减少。
本发明的另一方面包括一种用于降低胰酶制剂产物被感染性病原体污染的风险的方法，包括以下步骤：(a) 提供哺乳动物胰腺组织；(b) 使胰腺组织经受电子束辐照以产生经辐照的胰腺组织，其中电子束辐照足以降低被感染性病原体污染的风险；和(c) 自经辐照的胰腺组织分离胰酶制剂，从而相对于步骤(a)中提供的哺乳动物胰腺组织或源自未经辐照的胰腺组织的胰酶制剂样品，获得具有降低的被感染性病原体污染的风险的胰酶制剂产物。在某些实施方案中，感染性病原体为猪细小病毒(PPV)。在某些实施方案中，方法提供表明无包膜病毒比如猪细小病毒(PPV)水平或活性的量度至少3 log10，优选地至少4log10的减少。在某些实施方案中，表明无包膜病毒水平或活性的量度为病毒载量。
本发明的另一方面包括一种酶制剂，其包含一种或多种分离自哺乳动物组织的酶和基本上灭活的无包膜病毒，其中制剂具有相当于对照制剂的生物活性的至少50%，优选地至少90%的生物活性。在某些实施方案中，对照制剂未经受足以灭活无包膜病毒的处理。在某些实施方案中，基本上灭活的无包膜病毒为猪细小病毒(PPV)。在某些实施方案中，一种或多种酶包括胰酶制剂。在某些实施方案中，一种或多种酶分离自哺乳动物组织。在某些实施方案中，哺乳动物组织为经电子束辐照的哺乳动物组织。
本发明的另一方面包括一种药用组合物，其包含一种或多种分离自哺乳动物组织的酶，所述组织已经受处理，以降低病毒和微生物感染性的风险，其中组合物具有相当于对照组合物的生物活性的至少50%，优选地至少90%的生物活性。在某些实施方案中，一种或多种酶包括脂肪酶。在某些实施方案中，对照组合物包含未经处理的哺乳动物组织样品，所述组织对应于已经受处理以降低病毒和微生物感染性的风险的哺乳动物组织。在某些实施方案中，处理包括电子束辐照。在某些实施方案中，电子束辐照具有约5-约50 kGy，优选地约10-约40 kGy的剂量。
本发明的另一方面包括一种用于产生胰酶制剂产物的方法，包括以下步骤：(a)提供哺乳动物胰腺组织；(b) 使胰腺组织经受电子束辐照以产生经辐照的胰腺组织；和(c)自经辐照的胰腺组织分离胰酶制剂以获得胰酶制剂产物。在某些实施方案中，步骤(c)中获得的胰酶制剂产物的生物活性相当于对照胰酶制剂产物的生物活性的至少50%，优选地至少90%。在某些实施方案中，对照胰酶制剂产物得自未经辐照的胰腺组织。在某些实施方案中，电子束辐照足以产生病毒载量至少3 log10，优选地至少4 log10的减少。例如，相对于未经辐照的对照样品，处理足以产生为PPV病毒载量减少至少3 log10，优选地至少4 log10的病毒载量减少。在某些实施方案中，电子束辐照具有约5-约50 kGy，优选地约10-约40 kGy的剂量。在某些实施方案中，生物活性为脂肪酶活性。在某些实施方案中，生物活性为蛋白酶活性或淀粉酶活性。
本发明的另一方面包括一种用于消化蛋白质的方法，包括以下步骤：(a) 提供分离自经电子束辐照的动物组织的酶或前酶制剂；和(b) 使蛋白质与酶或前酶制剂在足以消化蛋白质的条件下接触。在某些实施方案中，接触步骤发生在体内。在某些实施方案中，接触步骤发生在体外。在某些实施方案中，动物组织为猪胰腺。在某些实施方案中，消化的蛋白质用于制备蛋白质水解产物。在某些实施方案中，与源自未经辐照的动物组织的对照酶或前酶制剂相比，源自经电子束辐照的动物组织的酶或前酶制剂呈现病毒载量至少3log10，优选地至少4 log10的减少。在某些实施方案中，源自经电子束辐照的动物组织的酶或前酶制剂呈现相当于源自未经辐照的动物组织的对照酶或前酶制剂的生物活性的至少50%，优选地至少90%的生物活性。
本发明的另一方面包括一种酶制剂，其包含一种或多种分离自经电子束辐照的胰腺组织的酶。在某些实施方案中，胰腺组织包括猪胰腺。在某些实施方案中，猪胰腺被冷冻并在辐照之前机械加工成薄片或块。因此，在一些这种实施方案中，经电子束辐照的胰腺组织为片状冷冻胰腺组织或冷冻的胰腺组织块。在某些实施方案中，猪胰腺为整个腺体或其部分，比如一个或多个胰叶。在某些实施方案中，一种或多种酶包括胰酶制剂。在某些实施方案中，与对照酶制剂相比，酶制剂呈现病毒载量至少3 log10，优选地至少4 log10的减少。例如，相对于对照酶制剂，酶制剂呈现PPV病毒载量至少3 log10，优选地至少4 log10的减少。在某些实施方案中，酶制剂的生物活性相当于对照酶制剂的生物活性的至少50%，优选地至少90%。在某些实施方案中，生物活性为脂肪酶活性。在某些实施方案中，生物活性为蛋白酶活性或淀粉酶活性。在某些实施方案中，对照酶制剂得自未经辐照的组织。在某些实施方案中，病毒载量的减少为正交减少。
本发明的另一方面包括一种治疗胰腺外分泌功能不全的方法，包括：给予有需要的受试者一定剂量的任何前述酶制剂和/或药用组合物。在某些实施方案中，胰腺外分泌功能不全是由于囊性纤维化或慢性胰腺炎引起。
F. 实施例
实施例1.猪细小病毒(PPV)、胰酶制剂API和猪胰腺的电子束辐照
材料与方法.
装入小瓶的细胞培养液中的猪细小病毒. 因为猪腺体组织本身可对病毒有一些灭活作用，所以最初，用于这些研究的病毒样品为自感染的细胞培养物制备。猪细小病毒(PPV)、株NADL-2 (ATCC® VR-742™)和猪睾丸(ST)细胞(ATCC® CRL-1746™)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。PPV根据ATCC的建议进行繁殖、培养和维持。将PPV繁殖至近似滴度为108病毒感染单位(IU)/ml。自细胞培养基中的裂解细胞收获病毒，所述细胞培养基由最小必需培养基(MEM)、10% 胎牛血清(FBS)、2 mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100 mg/ml链霉素组成。
将PPV包装在小瓶中，然后在装运之前双层装袋。小瓶为Nalgene CryogenicVials (即聚丙烯，具有带外螺纹的高密度聚乙烯(HDPE)封口和防漏密封圈，长度1.87英寸，直径0.5英寸，容量2.0 ml和填充体积1.0 ml。将每个单个小瓶置于Food Saver袋(聚乙烯，外层为尼龙)中，并真空密封。袋子被修剪得正好适合小瓶。然后将4个单个密封小瓶置于另一个Food Saver袋(近似11X14")内，并真空密封。
冷冻片状猪胰腺. 将得自屠宰猪的胰腺(Animal Technologies, Tyler, TX)保持在干冰上。
将冷冻片状猪胰腺置于12" x 12" x 1 ¾"容器(透明聚丙烯)中，将其真空密封在透明的3 mil poly/尼龙袋内。将袋热封。将胰腺保持在干冰上以确保温度低于-20℃。冷冻片状猪胰腺的样品重量为1.05 kg，外加包装重量为270 g (0.27 kg)。盖子重100 g。表面密度为1.3 g/cm2。每个辐照剂量制备两个包装，包括没有辐照的对照，一个完整包装用于在转回到实施分离的场地之后分离酶制剂，另一个包装为储备。
胰酶制剂(API). 使用两种类型的胰酶制剂API：胰酶制剂N和胰酶制剂S。两种API均保持在环境条件下。胰酶制剂N (材料# 1030828, Abbott Laboratories)为浅黄色/灰色至灰白色粉末。胰酶制剂N源自屠宰猪胰腺。胰酶制剂S (材料#1030829, AbbottLaboratories)为浅黄色/灰色至灰白色粉末。胰酶制剂S源自母猪胰腺。
将胰酶制剂API置于2 ½" x 3 ½" x 1 ¾"容器(透明聚丙烯)中，将其真空密封在透明的3 mil poly/尼龙袋内。将袋热封。胰酶制剂API的样品重量为80 g，外加包装重量为26 g。表面密度为1.4 g/cm2。使胰酶制剂N样品暴露于指明剂量的电子束辐照。对照未暴露于电子束辐照。在转回到实验场地之后测定胰酶制剂N的活性。胰酶制剂N源自屠宰猪。所有胰酶制剂N包装均自辐照场地完整到达。
电子束辐照.
电子束来源为Industrial Materials Processing Electron LinearAccelerator (IMPELA®; Iotron Industries, Inc. Columbia City, IN)，10 MeV，80cm扫描宽度。
通过置于铝制托盘中含有的干冰上，使包装的冷冻片状猪胰腺和猪细小病毒样品保持在低于-20℃。将剂量计置于每个样品的上表面。将保持在环境温度下的包装的胰酶制剂API样品置于发泡聚苯乙烯泡沫板上，将剂量计置于上表面。将包装送至电子束扫描喇叭下的传送带上面。在一次通过辐照之后，取回剂量计。在翻转包装之后(现上面朝下)，将包装送至辐照喇叭下面进行二次通过，并将新的剂量计置于上表面上。在第二轮辐照之后，取回包装和剂量计。取回冷冻片状猪胰腺和猪细小病毒包装，并置于干冰上用于装运。取回胰酶制剂API的包装并保持在环境温度下用于装运。置于干冰上的冷冻片状胰腺和猪细小病毒的对照包装准备在干冰上重新装运而不经历辐照。保持在环境温度下的胰酶制剂API的对照包装准备在环境下重新装运而不经历辐照。使用校准曲线自剂量计暴露计算电子束剂量。
病毒感染性测试.
通过滴定96孔微孔板中的10倍稀释液和使用适当的对照，在每个能量剂量下对一式三份样品测定病毒感染性。使用Reed, L.J.; Muench, H. (1938). "A simple methodof estimating fifty percent endpoints." The American Journal of Hygiene 27:493-497中描述的Reed和Muench方法计算病毒滴度并表示为50%TCID50/mL。
胰酶制剂分离和测试.
用于分离胰酶制剂的方法基本上类似于US 4623624中描述的方法，其包括水解和/或自溶，随后进行纤维筛分、酶沉淀、经过滤和/或离心分离沉淀物，洗涤滤饼、干燥和粒度减小。使用一个对应于每个辐照剂量的包装(包括未经辐照的对照)实施水解。选择没有损坏包装(比如大裂缝)的包装用于每个分离实验。由于在转回到实验场地期间的照顾，所有包装完整到达，并且每个辐照剂量(包括对照)随机选择一个包装用于分离。来自先前分离的胰酶制剂用作蛋白酶来源以开始水解。氢氧化钙用于供给激活蛋白酶所需要的钙离子。碳酸氢钠用作水解的缓冲剂。二甲聚硅氧烷用作消泡剂。胰腺水解在接近环境温度下实施。如下所述，通过在加入异丙醇之后离心水解的混合物来检查水解的完成。水解完成之后，加入另外的异丙醇以降低水解速率，冷却混合物，搅拌混合物并使用0.425英寸筛网分离纤维。用异丙醇洗涤纤维并压缩以排出保持的液体。将洗涤液与先前获得的滤液合并。向滤液中加入另外的异丙醇以引起酶沉淀。使悬浮液通过具有15微米开口的滤布过滤，并用浓度逐渐增加的异丙醇洗涤，完全异丙醇作为最终洗涤液。滤饼在滤布上于氮气流下干燥，同时在滤布下方抽真空直到滤饼视觉上看起来干燥(去除异丙醇和水之后滤饼的颜色变得更浅)。将滤饼从滤布上剥离，并在真空和氮气流下于低于约50℃的温度下干燥至KarlFischer水含量为3.5%或者更低。来自屠宰猪的1 kg冷冻片状猪胰腺的干胰酶制剂产量为80-100 g。
完成水解的离心实验. 自水解容器采集3勺的约10 ml的样品并通过0.425 mm筛网，将滤液收集到塑料烧杯中(还将滤液刮到塑料烧杯中)，丢弃保留在筛网上的纤维。使用移液管，自反应器向50 mL离心管加入10 g溶液，加入5.5 mL IPA 85%，用刮刀搅拌1分钟。向50 mL离心管中的滤液中加入20 mL IPA 85%。用刮刀搅拌1分钟。以约90X g将悬浮液离心2分钟。
可在水解开始之后两小时或当颜色从粉红色变为褐色时并且悬浮液变得更稀薄(约2小时)时，采集第一个样品。
当颜色为棕色而没有粉红色阴影时采集下一个样品，此时沉积物预计为约25%，沉积物将不太坚固并且在上面透明层中可能存在散落物。在此之后，可以尽可能每半小时间隔进行采样。
如果两次随后测量显示沉积物少于20%，则水解停止。此时沉积物将是坚固的，并且在上面透明层中没有散落物。
一式三份地实施装入小瓶的PPV的双侧电子束辐照。暴露于电子束辐照的PPV的病毒载量减少和对数杀灭数据显示于表1中：
剂量(KGy) 0 9.5 19.25 38.45 0 9.5 19.25 38.45
病毒载量 病毒载量 病毒载量 病毒载量 对数杀灭 对数杀灭 对数杀灭 对数杀灭
病毒滴度/mL 病毒滴度/mL 病毒滴度/mL 病毒滴度/mL
测试A 1.50E+08 2.50E+06 1.50E+05 0.00E+00 1.78E+00 3.00E+00
测试B 1.50E+08 6.34E+06 6.34E+04 0 1.37E+00 3.37E+00
测试C 4.00E+08 1.26E+06 4.00E+05 1.50E+02 0 2.50E+00 3.00E+00 6.43E+00
平均值 0 1.88E+00 3.12E+00 6.43E+00
电子束剂量通过估算每个样品自如通过附于样品容器的剂量计所示的表面剂量吸收的剂量来确定。
表1显示PPV暴露于约40 kGy提供约6.5 log10杀灭，而暴露于约20 kGy提供约3log10杀灭。基于这些数据，预计暴露于约30 kGy将提供至少4 log10杀灭。
PPV暴露于约60 kGy、约80 kGy或约100 kGy导致最终病毒滴度低于测定的检测限。
如USP所述，通过验证的方法测试胰酶制剂的游离蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。如欧洲药典(EP)所述，通过验证的方法测试胰酶制剂的总蛋白酶。
实施胰酶制剂N的双侧电子束辐照。所有胰酶制剂N容器在实验场地被完整接收并用于测定。暴露于电子束辐照的胰酶制剂API的酶活性数据显示于表2中：
电子束剂量 脂肪酶活性 淀粉酶活性 总蛋白酶活性 游离蛋白酶活性
KGy USP单位/g USP单位/g USP单位/g USP单位/g
对照(0 kGy) 89106 564390 383192 314093
18.6 kGy 63328 398752 321567 266540
37.45 kGy 58631 386628 302341 244531
56.5 kGy 47755 282378 272499 232087
76.35 kGy 40583 272760 259117 214914
99.4 kGy 37799 286652 247005 196356
表2显示胰酶制剂API暴露于约20 kGy提供约30%的脂肪酶活性丧失，胰酶制剂API暴露于约40 kGy提供约35%的脂肪酶活性丧失，胰酶制剂API暴露于约60 kGy提供约46%的脂肪酶活性丧失，胰酶制剂API暴露于约80 kGy提供约54%的脂肪酶活性丧失，和胰酶制剂API暴露于约100 kGy提供约58%的脂肪酶活性丧失。基于这些数据，预计胰酶制剂API暴露于约30 kGy将提供至少30%的脂肪酶活性丧失。
实施屠宰猪胰腺的双侧电子束辐照。源自暴露于电子束辐照的冷冻片状猪胰腺的胰酶制剂的酶活性数据显示在表3中：
电子束剂量 脂肪酶活性 淀粉酶活性 总蛋白酶活性 游离蛋白酶活性
KGy USP单位/g USP单位/g USP单位/g USP单位/g
对照(0 kGy) 74986 423487 243421 151365
18.75 kGy 74741 449569 337594 128749
35.5 kGy 65348 349816 360407 128506
56.55 kGy 57976 398281 258297 119727
77.4 kGy 34806 251691 175994 109158
100.4 kGy 36362 276118 206217 100342
表3显示冷冻片状猪胰腺暴露于约20 kGy提供约1%的脂肪酶活性丧失，冷冻片状猪胰腺暴露于约40 kGy提供约13%的脂肪酶活性丧失，冷冻片状猪胰腺暴露于约60 kGy提供约23%的脂肪酶活性丧失，冷冻片状猪胰腺暴露于约80 kGy提供约54%的脂肪酶活性丧失，和冷冻片状猪胰腺暴露于约100 kGy提供约52%的脂肪酶活性丧失。基于这些数据，预计冷冻片状胰腺暴露于约30 kGy将提供约10%的脂肪酶活性丧失。
如表2和3所示，与分离之前胰腺组织的电子束辐照相比，胰酶制剂API的电子束辐照产生更多的酶活性丧失。不希望受到理论的束缚，完整组织对电子束辐照的抗性可为由于源组织中的酶的构象(例如作为前酶)和/或源组织中提供结构保护的辅因子引起。
实施例2. 整个猪胰腺的电子束辐照
使用整个猪胰腺实施进一步研究。将约3.6 kg解冻的猪胰腺装入约10 x 15 x1.5英寸厚的蜡衬纸板盒中。将盒子冷冻至-20℃并保持直至用于电子束辐照。盒子用冷冻卡车(-20℃)装运用于电子束辐照。自冷冻卡车取出盒子，然后暴露于双侧电子束辐照-未经辐照的盒子用作对照。包括未经辐照的盒子在内，五(5)个盒子用于每个标称辐照剂量：0、15、20和25 kGy，并用冷冻卡车(-20℃)运回用于评估，然后保持在-20℃下。
在盒子中的随机位置自每个盒子选择冷冻的胰腺样品用于随后分离胰酶制剂。如本文所述地实施分离。然后根据比色测定测试自经电子束辐照的整个胰腺分离的胰酶制剂的酶活性。
使用与USP 39 <Pancrelipase(胰脂肪酶)>中使用的那些结构相似的底物，通过酶标仪，使用比色动力学分析测试胰酶制剂样品(API)。酶活性通过相对于胰脂肪酶参考标准品测量产物的生产率来确定。分析的可比性已在归档的USP专论方法和备选酶标仪方法之间证实。
每个剂量重复采样、分离和测定程序4次，每个剂量共获得5次测量。5次测量的平均值报告于表4中。
表4：辐照整个胰腺之后的API酶活性
电子束剂量* 平均脂肪酶活性 平均淀粉酶活性 平均游离蛋白酶活性 平均总蛋白酶活性
KGy USP单位/mg USP单位/mg USP单位/mg USP单位/mg
对照(0 kGy) 104 456 197 344
14.9 kGy 99 435 201 291
19.9 kGy 106 411 200 316
24.9 kGy 104 395 183 301
*(最小剂量+最大剂量)/2
表4显示自暴露于高达约25 kGy剂量的电子束辐照的整个胰腺分离的胰酶制剂具有与自未经辐照的对照分离的胰酶制剂相同或基本上相同的脂肪酶活性。
实施例3. 完整猪胰腺组织的低剂量电子束辐照
进一步的研究已如下实施：用活病毒添加到猪胰腺组织，然后使添加病毒的组织经受较低剂量(约12.3 kGy)的电子束辐照以使得能够进行病毒回收和评价。进行这项另外的工作以证实低剂量的几种相关病毒的有效灭活，这将使得能够有效地列举电子束辐照的影响。
将选择的病毒特意添加至组织样品上，并通过比较病毒输入量与电子束处理之后剩余的病毒量来评估病毒清除程度。选择用于这项研究的病毒验明于表5中。
表5：选择用于病毒清除研究的病毒
病毒 科 基因组 包膜 大小(nm) 物理化学抗性
呼肠孤病毒3型(REO3) Reo RNA 无 60-80 中等
猪细小病毒(PPV) Parvo DNA 无 18-24 高
猫杯状病毒(FCV) Calici RNA 无 35-39 中等
REO3具有双链RNA的分段基因组，并且属于呼肠孤病毒科病毒，后者也包括轮状病毒。因此，REO3可用作轮状病毒的模型。FCV已用作验证血液制品中灭活方法的模式病毒，并且特别是用作戊型肝炎病毒(HEV)的模型。
将猪胰腺切片并研磨。然后将组织加入培养皿中，并添加指明的病毒。标准病毒贮液的证明滴度为至少1 x 107 pfu/mL。将经添加的样品在室温下温育最少60分钟(直到组织恢复至其初始干燥度)。温育后，将另外的猪胰腺组织加入到皿中。将皿密封并置于干冰上装运至电子束设施。每个皿含有约13 g组织，并且组织密度类似于整个腺体的密度。
对于每种病毒，包括经添加的回收样品(未装运的)和未经辐照的装运对照(装运至电子束设施但未经辐照)。
电子束辐照在电子束设施实施。在暴露于电子束辐照完成之后，经辐照的样品和未经辐照的装运对照被运回用于病毒载量评估。收到后，将样品储存于<-60℃下直至测试。
对于每种样品，向无菌瓶加入50 mL培养基。通过在室温下实施3轮以下操作来提取组织：约5-10分钟的浸泡，随后进行15-30秒涡旋。然后将样品以3000 RPM离心10分钟。来自提取的上清液用于病毒测试。
病毒滴度通过标准噬菌斑测定来确定。REO3、PPV和FCV的细胞类型指示符分别为Vero、PT-1和CRFK。病毒滴度和病毒清除因子根据标准程序计算。病毒清除因子(VCF)如下计算：
VCF = log10[处理之前的体积*滴度/处理之后的体积*滴度]
通过使经添加的组织暴露于电子束辐照而产生的病毒清除数据显示于表6中。
表6：辐照添加病毒的胰腺之后的病毒清除
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这些研究证实，电子束辐照完整组织可实现足够的包括猫杯状病毒(FCV)和呼肠孤病毒3 (REO3)在内的病毒灭活。此外，辐照胰腺随后自经辐照的腺体分离酶制剂(例如胰酶制剂API)显示就相对于未经辐照的对照的酶活性丧失而言，与其中使用片状猪胰腺的表3所示的那些类似的结果。
加工猪胰腺之前引入去污步骤在酶分离期间的操作人员安全性以及患者安全性两方面提供对已知感染性病原体的有效控制。因此，使用有效灭活广谱微生物和病毒(包括难以灭活的病毒(例如猪细小病毒))的电子束处理，酶活性丧失最小，相对于其他方法是有利的。
本文使用的电子束辐照步骤可认为是正交病毒灭活步骤。自经电子束辐照的胰腺组织获得的微生物和/或病毒载量减少，以相对于由用于微生物和/或病毒减少的其他步骤获得的减少相加的方式转移至从其分离的胰酶制剂。通过包括电子束辐照的所有步骤实现的总log10杀灭为通过对胰腺组织实施的所有微生物和/或病毒灭活步骤实现的累积log10杀灭。
应该理解，前述详述和附加实施例仅为说明性的，并且不应作为对本发明范围的限制，本发明的范围仅通过附加权利要求及其等同物定义。对所公开的实施方案的各种变化和修改对本领域技术人员将是显而易见的。可进行这种变化和修改(非限制性地包括与化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、制剂或方法有关的那些)或者本发明用途的这种变化和修改的任何组合而不背离其精神和范围。
以上引用的所有参考文献(专利和非专利)通过参照结合到该专利申请中。对那些参考文献的讨论仅打算概述其作者的主张。并未承认任何参考文献(或任何参考文献的一部分)为相关的现有技术(或完全是现有技术)。申请人保留质疑所引用的参考文献的准确性和相关性的权利。

Claims (21)

1. 一种通过包括以下步骤的方法产生的酶制剂：
(a) 使完整哺乳动物胰腺组织经受电子束辐照以产生经辐照的胰腺组织，其中与对照样品相比，所述电子束辐照足以产生模式病毒的病毒载量至少3 log10的减少；和
(b) 自所述经辐照的胰腺组织分离胰酶制剂。
2. 权利要求1的酶制剂，其中与对照样品相比，所述电子束辐照足以产生模式病毒的病毒载量至少4 log10的减少。
3.权利要求1的酶制剂，其中所述模式病毒为猪细小病毒(PPV)。
4.权利要求1的酶制剂，其中所述完整哺乳动物胰腺组织为片状组织、整个腺体或整个腺体的一部分。
5.权利要求1的酶制剂，其中步骤(b)包括引发所述经辐照的胰腺组织的水解或自溶或者激活来自所述经辐照的胰腺组织的前酶。
6.权利要求1-5中任一项的酶制剂，其中步骤(b)中获得的酶制剂的生物活性相当于对照酶制剂的生物活性的至少50%，优选地至少90%。
7.权利要求6的酶制剂，其中所述生物活性为脂肪酶活性。
8. 权利要求1-7中任一项的方法，其中所述电子束辐照具有约5-约50 kGy，优选地约10-约40 kGy的剂量。
9.一种酶制剂，其包含一种或多种分离自经电子束辐照的胰腺组织的酶。
10.权利要求9的酶制剂，其中所述经电子束辐照的胰腺组织为片状胰腺组织、整个胰腺或整个胰腺的一部分。
11.权利要求9或权利要求10的酶制剂，其中所述一种或多种酶包括胰酶制剂。
12.权利要求9-11中任一项的酶制剂，其中所述酶制剂的生物活性相当于对照酶制剂的生物活性的至少50%，优选地至少90%。
13.权利要求12的酶制剂，其中所述生物活性为脂肪酶活性。
14. 一种用于产生胰酶制剂产物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a) 使完整哺乳动物胰腺组织经受电子束辐照以产生经辐照的胰腺组织，和
(b) 自所述经辐照的胰腺组织分离胰酶制剂。
15.权利要求14的方法，其中步骤(b)中获得的胰酶制剂产物的生物活性相当于对照胰酶制剂产物的生物活性的至少50%，优选地至少90%。
16. 权利要求14或15的方法，其中与对照样品相比，所述电子束辐照足以产生模式病毒的病毒载量至少3 log10，优选地至少4 log10的减少，其中所述模式病毒优选地为猪细小病毒(PPV)。
17. 权利要求14-16中任一项的方法，其中所述电子束辐照具有约5-约50 kGy，优选地约10-约40 kGy的剂量。
18.权利要求15-17中任一项的方法，其中所述生物活性为脂肪酶活性。
19.一种药用组合物，所述组合物包含权利要求1-13中任一项的酶制剂。
20.一种治疗胰腺外分泌功能不全的方法，所述方法包括：
给予有需要的受试者一定剂量的权利要求1-13中任一项的酶制剂或权利要求19的药用组合物。
21.权利要求20的方法，其中所述胰腺外分泌功能不全是由于囊性纤维化或慢性胰腺炎引起。
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