ES2896244T3 - Método para reducir o inactivar contenido vírico y microbiano en los procesos para la fabricación de pancreatina - Google Patents

Abstract

Un método de fabricación de una preparación de pancreatina, que comprende las etapas de: (a) pretratar una glándula pancreática o un tejido pancreático con ácido peracético (PAA) en una reacción (b) procesar la glándula pancreática o el tejido pancreático para extraer la preparación de pancreatina con el fin de reducir de este modo la infectividad vírica y de reducir el recuento bacteriano en la preparación de pancreatina.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para reducir o inactivar contenido vírico y microbiano en los procesos para la fabricación de pancreatina

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para reducir la infectividad vírica o inactivar contenido vírico y microbiano durante procesos para la fabricación de pancreatina.

Antecedentes de la invención

La pancreatina se fabrica a partir de tejido pancreático porcino de animales que se han encontrado aptos para el consumo humano después de exámenes veterinarios. La pancreatina es una mezcla de enzimas digestivas, principalmente amilasa, proteasa y lipasa, extraídas del páncreas porcino. Debido a sus importantes propiedades terapéuticas y su alto nivel de seguridad, la pancreatina se ha usado durante mucho tiempo como preparación farmacéutica en terapia de sustitución de enzimas. Una amplia variedad de preparaciones de pancreatina están disponibles en el mercado como un suplemento de enzimas digestivas para ayudar a la digestión y mejorar la absorción de nutrientes. Clínicamente, la terapia de sustitución de enzimas pancreáticas es el pilar del tratamiento de la insuficiencia exocrina pancreática, que se asocia a fibrosis quística, pancreatitis crónica, cirugía de derivación gastrointestinal, pospancreatectomía, etc.

Una característica común a todos los productos biológicos obtenidos de cualquier material de origen animal o humano es el riesgo de contaminación vírica. La contaminación biológica puede surgir del material fuente o de agentes inesperados introducidos durante los procesos de fabricación.

Los virus son pequeños agentes infecciosos que se replican solamente dentro de las células vivas de otros organismos. Los virus consisten en ácidos nucleicos (ARN o ADN) que están rodeados por una cubierta proteica y, en algunos casos, una capa lipídica. Los virus que producen solo una cubierta proteica se conocen comúnmente como virus sin envoltura y aquellos con componentes proteicos y lipídicos en la cubierta se conocen comúnmente como virus con envoltura. Varían en tamaño desde aproximadamente 15 nm hasta aproximadamente 450 nm y no se pueden ver con microscopios ópticos. La forma y la estructura de los virus se han estudiado mediante microscopía electrónica, espectroscopía de RMN y cristalografía de rayos X.

Los virus pueden infectar todo tipo de formas de vida, desde animales y plantas hasta bacterias y arqueas. Como los virus no pueden replicarse de forma independiente, dependen de huéspedes. Por consiguiente, aparecen en prácticamente todos los seres vivos del mundo. Muy pocos de los virus conocidos son patógenos para los seres humanos, ya que son muy específicos del huésped. Varias autoridades nacionales han instado a los fabricantes de pancreatina a mejorar las capacidades de inactivación/eliminación de virus de los procesos de fabricación; sin embargo, los intentos de mejora han tenido un éxito limitado, debido al hecho de que la mayoría de las condiciones que eliminarían o inactivarían los virus también darían como resultado un producto inactivo (actividades enzimáticas destruidas). Las regulaciones y las preocupaciones de seguridad exigen el aclaramiento vírico (eliminación o inactivación de virus) en productos biofarmacéuticos tales como el principio farmacéutico activo (API) de pancreatina. En consecuencia, las compañías que producen productos farmacéuticos derivados de tejidos biológicos están experimentando una presión adicional por parte de los organismos reguladores para aumentar el nivel de seguridad de sus productos al reducir todos los contaminantes al nivel más bajo posible.

Algunos virus pequeños de ADN sin envoltura, tales como el parvovirus porcino (PPV) y el circovirus porcino (PCV), son difíciles de inactivar. En las condiciones usadas para producir los productos comerciales, los títulos de PPV y PCV pueden reducirse, pero es posible que los virus no se inactiven por completo. Sin embargo, nunca se han notificado infecciones humanas por exposición a virus porcinos sin envoltura tales como PPV y PCV a partir de productos comerciales a pesar del uso generalizado de estos productos comerciales de origen porcino en seres humanos. Por ejemplo, los ADN de PCV se detectaron con frecuencia en productos comerciales de origen porcino, tales como pepsina y un concentrado de factor VIII; sin embargo, los productos contaminados no pudieron provocar ninguna infección cuando se administraron por vía intravenosa a cerdos [Fenaux et al. (2004), "A Chimeric Porcine Circovirus (PCV) with the Immunogenic Capsid Gene of the Pathogenic PCV Type 2 (PCV2) Cloned into the Genomic Backbone of the Nonpathogenic PCV1 Induces Protective Immunity against PCV2 Infection in Pigs". J. Virology 78: 6297-6303]. Se detectaron ADN de PPV en 21 de los 22 lotes de concentrado de factor VIII porcino Hyate: C, aunque las muestras de suero de 98 receptores humanos de Hyate:C resultaron negativas para anticuerpos contra PPV (Soucie et al. "Investigation of porcine parvovirus among persons with hemophilia receiving Hyate: C porcine factor VIII concentrate". Tranfusion (2000) 40: 708-711.). Giangrande et al. ("Viral pharmacovigilance study of haemophiliacs receiving porcine factor VIII". Haemophilia (2002) 8:798-801.) también pusieron a prueba muestras de suero de 81 receptores anteriores de factor III porcino y de otros 125 voluntarios en busca de evidencia de anticuerpos contra una variedad de virus porcinos, incluyendo PPV, y los resultados fueron negativos. Por lo tanto, el riesgo de infección humana por PPV, PCV u otros virus porcinos sin envoltura que todavía pueden estar presentes en productos comerciales no está respaldado por informes publicados, y dicho riesgo, si es que existe, es extremadamente pequeño.

La presente invención está dirigida a un método para reducir o inactivar contenido vírico y microbiano durante un proceso para la fabricación de pancreatina sin comprometer la pureza, composición o potencia medida por la actividad enzimática o las relaciones de actividad enzimática.

Hasta la fecha, no se ha desarrollado ningún método fiable para la eliminación o inactivación de todos los contaminantes víricos en una muestra de pancreatina. Esto se debe al hecho de que las enzimas activas en la pancreatina son incompatibles con muchas de las condiciones de inactivación conocidas que incluyen calor, pH bajo, oxidación e irradiación ionizante. No obstante, se han publicado varios métodos para la inactivación o reducción de virus y microorganismos.

Tijssen et al (US 2014/0017223 A1) divulga un proceso para elaborar una preparación de enzima pancreática (PEP) que comprende la etapa de hacer reaccionar beta-propiolactona (BPL) con una preparación que contiene una o más enzimas pancreáticas durante un tiempo suficiente para reducir una infectividad vírica en la preparación.

Ramsch et al. (patente de EE. UU. US 2011/0268844 A1) divulga pancreatina tratada con alta presión y/o con una filtración por tamiz seguida de un tratamiento a alta presión de 4000, 5000 o 6000 bares durante 5 minutos a 15 °C. Según Ramsch, esto es aplicable a todas las formas de virus, tales como virus de ADN y ARN, virus con y sin envoltura y bacterias y hongos y que comprenden al menos un 50 % de actividad biológica. También divulgó la imprevisibilidad sobre si la inactivación de ciertos virus usando tratamiento a alta presión es realmente exitosa. Deben seleccionarse diferentes condiciones de método dependiendo de si las muestras son líquidas o sólidas debido a la diferente compresibilidad de las muestras.

Kurfurst, et al. (US 2009/0233344 A1) divulga un método para reducir la contaminación vírica y microbiana de una muestra tratando la muestra con una humedad residual del 0,5 % en peso o menos, sometiendo la pancreatina tratada con tratamiento térmico a una temperatura de 84 °C, preferentemente 80 °C e inferior, durante 48 horas o 30 horas, en donde la actividad de la pancreatina obtenida es al menos un 50 % de actividad biológica. La infecciosidad vírica de la pancreatina se divulga como reducida por un factor de reducción log-10 de más de 1 log-10.

Mann (US 2009/6749851) divulga una metodología para esterilizar preparaciones de enzimas digestivas para reducir el nivel de contaminantes biológicos activos tales como virus, bacterias, levaduras, mohos y hongos. El tratamiento de composiciones que comprenden enzimas digestivas implicó estabilizar las composiciones ya sea (a) reduciendo la temperatura de, (b) reduciendo los disolventes de, o (c) añadiendo un estabilizante a, la composición, seguido de irradiación de la composición.

Becher, et al. (US 2009/0130063 A1) divulga un proceso para separar una carga vírica infecciosa de una muestra de pancreatina para determinar cuantitativamente la carga vírica en una muestra de pancreatina usando centrifugación y ultracentrifugación. Este método tiene limitaciones solo para muestras líquidas adecuadas para centrifugación.

Braeuniger et al. (Int. J. Hyg. Environ. Health (2000) 203: 71-75) divulga el uso de calor para la inactivación del parvovirus bovino (BPV). Se ha demostrado que el BPV se puede desactivar dependiendo de la exposición al calor y la humedad residual. Sin embargo, Braeuniger et al no divulgaron ningún efecto del calor sobre la actividad enzimática y el cambio de composición.

Lewis (US 1971/3.956.483) divulga un método de procesamiento de pancreatina y reducción de bacterias mientras se mantienen las actividades amilolítica, proteolítica y lipolítica. El método comprende calentar la pancreatina a una temperatura suficientemente alta entre 49 °C - 82 °C. Lewis, sin embargo, no consigue proporcionar un proceso para inactivar o reducir la cantidad de virus.

Un desafío particular es la inactivación o reducción de virus a partir de una matriz de extractos biológicos cuyo principio activo son mezclas de enzimas, sin destruir ni cambiar la actividad enzimática o la relación de las proteínas en el proceso. Existe una demanda de métodos en los que el contenido vírico y bacteriano en un extracto biológico que contiene sólidos se reduzca o minimice en la mayor medida posible coherente con la conservación de la pureza, composición y potencia deseadas del principio activo farmacéutico. El método debe ser igualmente adecuado para sólidos y suspensiones.

De conformidad con la ICH Q5A: "Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derivedfrom Cell Lines of Human or Animal Origin", el proceso desarrollado en este documento requería la reducción o inactivación de virus de productos biológicos mientras que, al mismo tiempo, era necesario mantener las actividades enzimáticas y las relaciones de composición (por ejemplo, lipasa, proteasa y amilasa) a un nivel aceptable. En principio, los agentes farmacéuticamente activos no deben contener virus infecciosos. Los procesos de producción actuales no son capaces de reducir o inactivar los virus sin envoltura potencialmente presentes con un margen de seguridad suficiente, y se deben implementar etapas adicionales de reducción de virus.

El PAA se considera un desinfectante eficaz que puede inactivar una amplia variedad de bacterias (Cronmiller, J. R., et al. (1999), Efficacy of Conventional Endoscopic Disinfection and Sterilization Methods Against Helicobacter pylori Contamination. Helicobacter 4: 198-203.); hongos (Werner y Wewalka (1973), Oxidation of vitamin A alcohol with peracetic acid. Tetrahedron 29: 47-50) y virus (Kline y Hull (1960), The Virucidal Properties of Peracetic Acid. American Journal of Clinical Pathology 33: 30 - 33).

El ácido peracético (PAA) también se ha usado como germicida en la pulverización de frutas y verduras (Greenspan y MacKeller (1951), "The Application of Peracetic Acid Germicidal Washes to Control Mold of Tomatoes (Food Technology 5: 95-97).

Baldry (en J. Applied Bacteriology. (1983) 54: 417-423; notificó una reducción en un factor de 106 en el número de bacterias vegetativas en 1 minuto a 25 °C usando una solución que contenía 1,3 mmol/l de PAA.

Hodde e Hiles (2002, Biotechnology and Bioengineering 79:211-216) demostraron el uso de PAA como esterilizante para inactivar varios virus modelo a partir de material poroso, no reticulado, basado en colágeno usado para dispositivos médicos. Su trabajo respalda la seguridad de los materiales tratados con PAA para uso humano sin temor a la transmisión vírica.

Lomas et al. (en Cell and Tissue Banking (2004) 5: 149-160) notificaron que el tratamiento del injerto de hueso-tendón rotuliano-hueso humano (BPTB) con PAA no lo hacía citotóxico o proinflamatorio in vitro. Los injertos de BPTB tratados con PAA fueron más susceptibles a la degradación por colagenasa. Describieron además el protocolo de desinfección de alto nivel, utilizando PAA y su efecto positivo sobre la biocompatibilidad y la biomecánica de los aloinjertos de tendón rotuliano.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para reducir o inactivar la contaminación microbiana y vírica de extractos biológicos, sin afectar a la actividad y sin cambiar la composición de las enzimas contenidas en el extracto biológico. Adicionalmente, el método no produce ningún compuesto o residuo tóxico en el producto final.

También se describe en el presente documento una preparación de pancreatina. La preparación tiene una infectividad vírica reducida e incluye una o más enzimas de pancreatina y PAA. Como se describe en el presente documento, la preparación incluye una o más glándulas pancreáticas porcinas.

Como se describe en el presente documento, la preparación de pancreatina tiene una infectividad vírica del virus de la encefalomiocarditis (EMC) de al menos 1 log-10 por debajo de la de una muestra de control de pancreatina no tratada con PAA; una infectividad vírica del virus diminuto murino (MMV) de al menos 1 log10 por debajo de la de una muestra de control de pancreatina no tratada con PAA; una infectividad vírica de parvovirus porcino (PPV) de al menos 1 log-10 por debajo de la de una muestra de control de pancreatina no tratada con PAA, y/o una infectividad vírica de virus sin envoltura de al menos 1 log-10 por debajo de la de una muestra de control de pancreatina no tratada con PAA.

Como se describe en el presente documento, al menos una enzima de pancreatina se deriva de una fuente animal. Como se describe en el presente documento, una o más enzimas de pancreatina se seleccionan del grupo que consiste en lipasas, proteasas y amilasas.

Como se describe en el presente documento, la preparación de pancreatina comprende un API de pancreatina. En el presente documento se describe adicionalmente un API de pancreatina derivado de una glándula pancreática. El API de pancreatina tiene una infectividad vírica reducida y un recuento bacteriano reducido. El API de pancreatina incluye al menos 2,0 unidades USP de lipasa, al menos 25 unidades USP de proteasa y al menos 25 unidades USP de amilasa. La glándula pancreática se pretrata con PAA. El API de pancreatina tiene una infectividad vírica de PPV, EMC y MMV de al menos 1 log-10 por debajo de la de una muestra de control de API de pancreatina no tratada con PAA.

Como se describe en el presente documento, el API de pancreatina está en forma de polvo.

Como se describe en el presente documento, el API de pancreatina tiene una infectividad vírica de MMV de al menos 2 log-10 por debajo de la de una muestra de control de API de pancreatina no tratada con PAA. En algunas realizaciones, el API de pancreatina tiene una infectividad vírica de MMV entre aproximadamente 2 log-10 y aproximadamente 4 log-10 por debajo de la de una muestra de control de API de pancreatina no tratada con PAA.

En una realización, se proporciona un método de fabricación de una preparación de pancreatina. El método incluye las etapas de pretratar una glándula pancreática o un tejido pancreático con PAA en una reacción. La reacción con PAA reduce la infectividad vírica y reduce el recuento bacteriano en la preparación de pancreatina.

En algunas realizaciones, la infectividad vírica de virus sin envoltura en la preparación de pancreatina después de la reacción es al menos 1 log-10 menor en comparación con la infectividad vírica de virus sin envoltura de la glándula con pancreatina antes de la reacción con PAA.

En algunas realizaciones, la etapa de reacción también incluye etapas de añadir PAA a la glándula pancreática o el tejido pancreático e incubar la glándula pancreática o el tejido pancreático y PAA durante un tiempo suficiente para reducir la infectividad vírica.

En algunas realizaciones, la reacción comprende PAA a una concentración de aproximadamente 100 ppm a aproximadamente 40.000 ppm. En algunas realizaciones, la reacción puede comprender PAA a una concentración de aproximadamente 500 ppm a aproximadamente 20.000 ppm.

En algunas realizaciones, la reacción se lleva a cabo durante de aproximadamente 0,5 minutos a aproximadamente 30 minutos.

En algunas realizaciones, la reacción se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 22 °C.

En algunas realizaciones, la reacción se lleva a cabo a un pH de aproximadamente pH 1,0 a aproximadamente pH 5,5.

En algunas realizaciones, la reacción se lleva a cabo con alcohol como codisolvente.

La pancreatina y/o las enzimas pancreáticas en cualquier realización de la presente invención pueden derivarse de una fuente animal (cerdo, buey, oveja, porcino, bovino etc.). Las enzimas de pancreatina incluyen, pero no se limitan a, lipasa, proteasa y amilasa.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la reducción de TAMC en la glándula pancreática tratada con PAA antes y después del tratamiento;

La figura 2 es un diagrama de flujo que muestra el flujo del proceso de virus para infectividad, el tratamiento con PAA y un diagrama de flujo de proceso de ejemplo;

La figura 3 muestra la cinética de la inactivación de MMV;

La figura 4A es una imagen de microscopio electrónico de tejido glandular tratado con PAA;

La figura 4B es una imagen de microscopio electrónico de tejido glandular no tratado;

La figura 4C es una imagen de microscopio electrónico de pancreatina en polvo producida a partir de tejido glandular no tratado;

La figura 4D es una imagen de microscopio electrónico de tejido glandular no tratado;

La figura 5 muestra una comparación de identificación y composición de cromatogramas de muestras de pancreatina tratadas con diferentes concentraciones de PAA y muestras de control de pancreatina sin tratamiento con PAA.

La figura 6 muestra la actividad enzimática consolidada con muestras de pancreatina tratadas con PAA y no tratadas (control).

Descripción detallada de determinadas realizaciones

Los métodos descritos en el presente documento comprenden tratar una fuente animal de un extracto deseado, tal como una glándula pancreática, con una concentración de ácido peracético. Sin limitación, la glándula pancreática animal puede ser una glándula pancreática bovina o porcina. Ventajosamente, la pancreatina resultante producida mediante los métodos descritos en el presente documento, así como las composiciones farmacéuticas que comprenden la pancreatina, se pueden obtener mediante operaciones a escala de laboratorio, escala piloto y escala de producción.

Tratamiento con ácido peracético (PAA) de glándulas pancreáticas: La invención se refiere a un método para reducir o inactivar contenido vírico y microbiano durante un proceso para la fabricación de pancreatina que comprende tratar una glándula pancreática animal, por ejemplo una glándula pancreática porcina, con una concentración de reactivo disponible para esterilización en frío o descontaminación tal como peróxido de hidrógeno, sales de percarbonato, ácido perbenzoico, peroxiácido butúrico, ácido peracético, etc. El método puede comprender además proporcionar un producto de pancreatina, tal como un API de pancreatina a partir de la glándula tratada.

La eficacia de esterilización del PAA está vinculada con su rápida penetración en microorganismos y la liberación de oxígeno y radicales libres críticos para la oxidación y destrucción de enzimas microbianas. Pruss, et al., (1999; "Virus Safety of Avital Bone Tissue Transplants: Evaluation of Sterilization Steps of Spongiosa Cuboids Using a Peracetic Acid-Methanol Mixture". Biologicals 27: 195-201). Los títulos notificados se redujeron en más de 4 log-10 cuando la esponjosa del cuboides con adición de virus durante 4 horas a temperatura ambiente (TA) con un 1 % de PAA/un 24 % de etanol (PES) inactivaron eficientemente la mayoría de los virus puestos a prueba (inmunodeficiencia humana) tipo de virus 2 (HIV-2), virus de la hepatitis A (HAV), poliovirus (PV-1), virus de la pseudorrabia (PRV), parvovirus porcino (PPV) y virus de la diarrea vírica bovina (BVDV), con la excepción de1 HAV. El PAA inactiva bacterias, grampositivas y gramnegativas, hongos y levaduras en menos de 5 minutos a concentraciones <100 ppm. Para los virus, el intervalo de dosis es amplio (100-40.000 ppm).

El ácido peracético (PAA) es un compuesto orgánico con la fórmula CH3CO3H. Este peróxido orgánico es un líquido incoloro con un olor acre característico que recuerda al ácido acético. Es un oxidante fuerte, puede ser muy corrosivo y se produce industrialmente mediante la autooxidación de acetaldehído. El PAA se puede emplear en las reacciones descritas en el presente documento con o sin un codisolvente, tal como un alcohol.

De acuerdo con realizaciones de la presente invención, las glándulas animales se pretratan con PAA antes de la extracción de un API de pancreatina según métodos conocidos por los expertos en la materia. El pretratamiento consiste en sumergir glándulas animales enteras en una solución que contiene PAA para reducir de ese modo la actividad vírica y los recuentos bacterianos. En otras realizaciones, el pretratamiento puede consistir en sumergir glándulas animales en rodajas, picadas o trituradas en una solución que contiene PAA para reducir de ese modo la actividad vírica y los recuentos bacterianos. El pretratamiento de las glándulas animales se puede realizar a concentraciones de PAA, temperaturas, pH y períodos de tiempo variables.

En una realización preferida, se emplean para el pretratamiento soluciones acuosas que tienen concentraciones de PAA de entre aproximadamente 100 ppm y 40.000 ppm. En realizaciones más preferidas, se emplean concentraciones de PAA de aproximadamente 500 ppm a aproximadamente 25.000 ppm. En algunas realizaciones, se pueden emplear concentraciones de PAA de 100-5.000 ppm, 5.000-10.000 ppm, 10.000-20.000 ppm, 20.000-30.000 ppm, 30.000 a 40.000 ppm o superiores a 40.000 ppm.

En una realización preferida, el pretratamiento con PAA se realiza a un pH de entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 5,5. En una realización más preferida, el pretratamiento con PAA se realiza a un pH de entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 5,0.

En una realización preferida, el pretratamiento con PAA se realiza aproximadamente a temperatura ambiente. En algunas realizaciones, el pretratamiento con PAA se realiza a una temperatura entre aproximadamente 15 °C y 22 °C. En otras realizaciones, el pretratamiento con PAA se puede realizar con una solución refrigerada que contiene PAA. En dichas realizaciones, el pretratamiento con PAA se puede realizar a intervalos de temperatura desde justo por encima del punto de congelación de la solución acuosa hasta la temperatura ambiente, por ejemplo aproximadamente 4 °C.

En una realización preferida, el pretratamiento con PAA se realiza durante una duración de aproximadamente 0,5 minutos a aproximadamente 1 hora. En una realización más preferida, el pretratamiento con pAa se realiza durante una duración de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos. En algunas realizaciones, el pretratamiento con PAA se puede realizar durante 0,5-5 minutos, 5-10 minutos, 10-20 minutos, 30-60 minutos o más de 60 minutos.

Después del pretratamiento con PAA, las glándulas animales tratadas pueden usarse como material fuente para la extracción de productos enzimáticos deseados, como se conoce, en general, en la técnica.

En una realización preferida, la glándula animal es una glándula pancreática y, particularmente, una glándula pancreática porcina. Otras glándulas, órganos y tejidos animales también pueden pretratarse con PAA, incluyendo, pero sin limitarse a, pulmones, cerebro, vesícula biliar, glándula pituitaria, intestinos y moco intestinal, glándula suprarrenal, bilis y timo, para su uso en la fabricación de otros productos de origen animal, incluyendo productos enzimáticos.

El pretratamiento de las glándulas animales con PAA es especialmente ventajoso porque el pretratamiento reduce significativamente la infectividad vírica y los recuentos bacterianos en el material glandular tratado. Inesperadamente, los productos enzimáticos producidos a partir de glándulas animales tratadas con PAA no tienen ninguna alteración significativa del perfil enzimático de los extractos, en comparación con el perfil enzimático de extractos producidos mediante los mismos procesos a partir de glándulas animales que no han recibido un pretratamiento con PAA.

La expresión "unidad USP" se refiere a una unidad usada para medir la potencia de una enzima activa presente en la pancreatina.

Una unidad USP de actividad amilasa está contenida en la cantidad de pancreatina que descompone almidón a una velocidad inicial tal que se hidrolizan 0,16 p Eq de enlace glucosídico por minuto en las condiciones del Ensayo para actividad amilasa de la USP.

Una unidad USP de actividad lipasa está contenida en la cantidad de pancreatina que libera 1,0 pEq de ácido por minuto a un pH de 9,0 °C a 37 °C en las condiciones del Ensayo para actividad lipasa.

Una unidad USP de actividad de proteasa está contenida en la cantidad de pancreatina que, en las condiciones del Ensayo para actividad proteasa, hidroliza la caseína a una velocidad inicial tal que se libera por minuto una cantidad de péptidos no precipitados por el ácido tricloroacético que da la misma absorbancia a 280 nm que 15 nmol de tirosina.

La invención de aclaramiento vírico se diseñó para cumplir con los requisitos de CPMP/BWP/268/95. "Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validation the Inactivation and Removal of Viruses" CBER/FDA: "Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals", ICH Topic Q5A: "Quality of Biotechnological Products: Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin" y CBER/FDA: "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use".

La invención de aclaramiento vírico se llevó a cabo con el fin de establecer la capacidad y eficiencia del proceso para la reducción y/o inactivación de virus que pueden estar presentes como contaminantes conocidos o imprevistos. Estos experimentos se realizaron añadiendo virus y midiendo su reducción o inactivación durante las siguientes etapas del proceso. Los experimentos de aclaramiento vírico se llevaron a cabo en un laboratorio equipado para trabajos virológicos.

Ejemplo 1

Para la preparación de pancreatina, se sumergieron 3 kg de glándulas pancreáticas porcinas enteras descongeladas y 3 kg de glándulas pancreáticas porcinas cortadas en tiras de aproximadamente 2 pulgadas en dos concentraciones diferentes de PAA, 500 ppm y 2000 ppm durante 10 y 15 minutos a temperatura ambiente (18 °C - 22 °C). Las glándulas tratadas se enjuagaron con agua de proceso y se colocaron en una bolsa de muestra estéril y se almacenaron a -20 °C para congelar no menos de 12 horas. Se pusieron a prueba un total de 6 muestras por ejecución. La preparación se ejecutó 2 veces. La segunda ejecución no incluyó glándulas en tiras porque se observó en la primera ejecución que las glándulas en tiras se volvieron demasiado resistentes al tratamiento para su procesamiento posterior.

1. Glándula entera (A) - 500 ppm;

2. Glándula entera (b ) - 2000 ppm;

3. Glándula en tiras (A) - 500 ppm;

4. Glándula en tiras (b ) - 2000 ppm;

5. Glándula entera (C) - Sin tratamiento-Control;

6. Glándula en tiras (C) - Sin tratamiento-Control. Para todos los resultados, véanse las tablas 1 y 2.

Después del tratamiento, se procesaron las glándulas para obtener pancreatina en polvo con etapas adicionales del método de la invención que pueden comprender: 1) glándula pancreática entera y glándulas en tiras de 2 pulgadas congeladas se trituran a partir de material congelado; 2) se activa el material triturado, seguido de la extinción de la activación; 3) separación de materia insoluble; 4) precipitación de pancreatina; 5) lavado y separación; 6) secado del residuo sólido; 7) molienda; y 8) se obtiene el producto final de pancreatina de principio activo farmacéutico (API) seco no estéril.

El ejemplo proporcionado en el presente documento fue para determinar el efecto del PAA sobre glándulas pancreáticas porcinas enteras y en tiras de 2 pulgadas. Ambos conjuntos de glándulas se analizaron para determinar el recuento total de microorganismos aerobios (TAMC), (reducción de la carga biológica), así como la inactivación vírica antes y después del tratamiento con PAA. Las muestras de producto terminado se pusieron a prueba para determinar la actividad enzimática. Para las glándulas enteras tratadas, el tratamiento con PAA disminuyó significativamente el TAMC (tabla 1). Las glándulas no tratadas tenían recuentos de 24.000 y 20.000 UFC/g y después del tratamiento con PAA los resultados de TAMC se redujeron a entre 10 y 90 UFC/g.

Lo mismo ocurrió con las tiras de glándulas. Las tiras de glándulas no tratadas tuvieron un resultado de TAMC de 9.700 UFC/g y las glándulas tratadas tuvieron recuentos disminuidos de 130 y 45 UFC/g. Los resultados de TAMC disminuyeron ligeramente para las muestras de producto terminado de glándulas enteras. Las muestras de control fueron 50 y 290 UFC/g. Después del tratamiento con 500 ppm y 2000 ppm de PAA, los resultados variaron de 10 a 25 UFC/g. Las glándulas en tiras se mantuvieron constantes. La muestra de control fue <10 UFC/g y las glándulas tratadas fueron 30 y 10 UFC/g (tabla 2).

TABLA 1:

continuación

Un análisis relevante para evaluar un cambio de proceso potencial es una evaluación de la degradación enzimática potencial. Los datos proporcionados en las tablas 1 y 2 demuestran una falta de degradación enzimática significativa a concentraciones seleccionadas de PPA. La figura 1 muestra una reducción de 1 a 2 log-10 en TAMC en muestras antes y después del tratamiento con PAA.

TABLA 2:

Ejemplo 2

Para la preparación de pancreatina, se sumergieron 3 kg de glándulas enteras descongeladas y 3 kg de glándula molida en dos concentraciones diferentes de PAA, 500 ppm y 2000 ppm durante 10 y 15 minutos a temperatura ambiente (18-22 °C). Las glándulas tratadas se enjuagaron con agua purificada y se colocaron en una bolsa de muestra estéril y se almacenaron a -20 °C para congelar no menos de 12 horas. Se pusieron a prueba un total de 6 muestras por ejecución. La preparación se ejecutó 2 veces. Las glándulas molidas eran difíciles de procesar debido a que se formaba una suspensión espesa después del tratamiento con PAA. La segunda ejecución no incluyó glándulas molidas.

1. Glándula entera (A) - 500 ppm;

2. Glándula entera (b ) - 2000 ppm;

3. Glándula molida (A) - 500 ppm;

4. Glándula molida (b ) - 2000ppm;

5. Glándula entera (C) - Sin tratamiento-Control;

6. Glándula molida (C) - Sin tratamiento-Control. Para todos los resultados, véanse las tablas 3 y 4.

Después del tratamiento, se procesaron las glándulas para obtener pancreatina en polvo como se describe en el ejemplo 1 con etapas adicionales del método de la invención. Los resultados de TAMC tanto para las glándulas enteras como molidas antes de los tratamientos con PAA fueron similares con 1400 y 1100 UFC/g. Después del tratamiento con 500 ppm y 2000 ppm de PAA, los resultados de TAMC para las glándulas enteras tratadas fueron exactamente iguales, 10 UFC/g. Las glándulas molidas no se pusieron a prueba después del tratamiento con PAA. Véanse los resultados en la tabla 3.

TABLA 3:

Los resultados de las enzimas para glándulas enteras están presentes en la tabla 4. Las glándulas sometidas a 500 ppm de PAA tenían los niveles de enzimas más altos. Las glándulas sometidas a 2000 ppm de PAA tuvieron los siguientes niveles más altos con la excepción de la actividad proteasa, que fue más baja que en las glándulas de control y con 500 ppm. Estos datos también se presentan en la figura 6 consolidada

TABLA 4:

Ejemplo 3

Medición de la actividad de infectividad vírica: la actividad de los virus en la pancreatina inicial y tratada se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica. Preferentemente, la infectividad vírica de uno o más virus se mide en la pancreatina tratada. En una realización, se mide la infectividad vírica de PCV2, PPV y/u otros virus.

En una realización, el ensayo de infectividad usa cultivos de células que crecen en pocillos de cultivo tisular a los que se aplican muestras y se mide la infección de las células.

Las muestras de API de pancreatina se fabricaron con la glándula entera con pancreatina tratada con una solución de PAA a 500 ppm y 2000 ppm después del proceso de fabricación. Las muestras de prueba enumeradas en la tabla 5 fueron muestras de API de pancreatina disueltas en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) con Mg2+ y Ca2+ para generar una suspensión al 10 % usada para determinar el título de circovirus porcino infeccioso tipo 2 (PCV 2) mediante un ensayo in vitro basado en células usando células PK-13 (células de riñón porcino). Los elementos de prueba analizados en el ensayo de interferencia se enriquecieron con 3000 TCID50/ml de PCV-2. Se usó una dilución final de 1:800 de cada solución para realizar los análisis. El título se determinó mediante una siembra en placas a gran volumen. Adicionalmente, los efectos de interferencia de los elementos de prueba sobre la infección por PCV-2 se evaluaron en un ensayo comparativo de punto final de titulación. Los elementos de prueba no mostraron efectos de interferencia negativos sobre la infección por PCV-2. Los resultados se resumen en la tabla 5.

TABLA 5:

Ejemplo 4

Se descubrió que el tratamiento de superficie con PAA a 500 ppm y 2000 ppm reduce el recuento total de microorganismos aerobios (TAMC). Sin embargo, según lo medido mediante la prueba de infectividad de PCV-2 (en virus endógenos), el tratamiento de superficie con PAA a 500 y 2000 ppm no tiene ningún efecto discernible. Por lo tanto, se puso a prueba una concentración aumentada de PAA usada para el tratamiento de superficie. El experimento que incluye el rendimiento del proceso, la adición de virus y el tratamiento de las glándulas con PAA se detalla en el diagrama de flujo de la figura 2.

Para el experimento de inactivación o reducción vírica con las concentraciones más altas de PAA, se seleccionaron los virus modelo EMC, MMV y PPV.

El EMC es un virus pequeño sin envoltura (20-30 nm) con un genoma de ARN que pertenece a la familia Picomaviridae y es de estructura icosaédrica. Es relativamente termoestable, resistente a disolventes orgánicos, detergentes no iónicos y es estable a pH ácido. Este virus es representativo de picornavirus humanos tales como el virus de la polio, el virus de la hepatitis A y el rinovirus.

El MMV es un virus pequeño sin envoltura (18-24 nm) con genoma de ADN que pertenece a la familia Parvoviridae y es de estructura icosaédrica. Es resistente a alta temperatura, a disolventes lipídicos y es estable a pH ácido. Este virus se considera una prueba severa de una amplia variedad de tratamientos físicos y químicos y es un modelo representativo de parvovirus y circovirus humanos que se encuentran en altas tasas de seroprevalencia en poblaciones humanas en todo el mundo.

El parvovirus porcino (PPV) es un miembro de la familia Parvoviridae con un ADN monocatenario como genoma. El PPV se asocia a problemas reproductivos, incluyendo abortos, mortinatos, camadas pequeñas, muertes neonatales y lechones débiles. El PPV se multiplica normalmente en el intestino del cerdo sin provocar signos clínicos. La enfermedad aparece cuando las madres seronegativas se infectan en la primera mitad de la gestación y el virus atraviesa la placenta. Es resistente a la mayoría de los desinfectantes.

El experimento llevado a cabo fue para determinar si los procedimientos de purificación inactivan virus según lo medido por el cambio en el ensayo de punto final de la dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50 % (TDID50) en la línea celular apropiada. Se midió el pH de cada muestra para garantizar que el pH estuviera entre pH 6-8. Las muestras se diluyeron según los resultados de citotoxicidad/interferencia vírica usando diluyente de ensayo (EMEM con FBS al 2 %). El método de ensayo se describe en la tabla 6. Antes de realizar el ensayo de TDID50 en muestras recogidas, las placas se sembraron con las células apropiadas. Se observaron las placas en busca de citotoxicidad antes de la inoculación. Todas las diluciones de control se inocularon a 50 |jl por pocillo en 8 pocillos replicados. Todas las diluciones del artículo de prueba se inocularon en 8 pocillos replicados.

TABLA 6:

La muestra de control positivo dio un título de virus ± 1,0 logi0 del título certificado del virus para cada virus en cada día de prueba, lo que confirmó que el virus en el ensayo se estaba comportando dentro de especificaciones predeterminadas. El control negativo mostró una morfología y confluencia normales y la ausencia de efecto citopático inducido vírica (CPE) para cada virus, lo que confirma que la línea celular detectora se estaba comportando dentro de especificaciones predeterminadas.

Cuando se analizaron los datos de interferencia del virus PPV, se determinó que había una interferencia significativa en todas las diluciones no citotóxicas puestas a prueba. Las muestras recuperadas sin diluir y de primera dilución (1:5) fueron citotóxicas, mientras que las muestras recuperadas de la segunda y la tercera dilución en serie (1:25 y 1:125 respectivamente) arrojaron títulos víricos aproximadamente 1,8 log10 por debajo del valor esperado. El artículo de prueba es de origen porcino y el PPV es un virus porcino. Lo más probable es que la interferencia vírica se deba a anticuerpos neutralizantes presentes en el huésped. Es poco probable que este tipo de interferencia pueda aliviarse mediante una dilución adicional. La presencia de interferencia vírica impide la medición precisa del título y, por lo tanto, evita la evaluación del aclaramiento. Se terminó la parte del experimento llevado a cabo con PPV.

Se evaluó la capacidad del procedimiento de purificación para reducir o inactivar el virus de la encefalomiocarditis (EMC) y el virus diminuto murino (MMV) añadidos a los materiales de carga individuales. El aclaramiento se calculó usando el control de recuperación, muestra a 0 minutos y 10.000 ppm, muestra a 30 minutos. Los resultados de la prueba para EMC mostraron un factor de reducción de aproximadamente 1,75 log10 a los 15 minutos y aproximadamente 0,8 log10, cuando se calcularon usando la muestra a 30 minutos. Los resultados de la prueba de MMV mostraron un factor de reducción significativo de 3,0 ± 0,9 Log10, ilustrado por el gráfico cinético en la figura 3. La reducción se calculó usando el control de recuperación, muestra a 0 minutos y 10.000 ppm, muestra a 30 minutos.

Ejemplo 5

Estudio microscópico electrónico: Con referencia a las figuras 4A-4D, se realizaron microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido (SEM) para visualizar la presencia de bacterias y virus en la superficie del tejido de la glándula pancreática y pancreatina en polvo tratados con diferentes concentraciones de PAA y se compararon con muestras no tratadas (control).

Los tejidos de la glándula pancreática tratados con PAA y las muestras sin tratar, así como la pancreatina en polvo resultante producida con el tratamiento con PAA, se analizaron con TEM y SEM. Para s Em , las muestras se recubrieron con un recubrimiento ultrafino de material eléctricamente conductor, depositado sobre la muestra mediante evaporación del recubrimiento por pulverización catódica a bajo vacío. Un material conductor en el recubrimiento actual usado fue el oro para observar bacterias y virus. Se usó un microscopio electrónico de barrido ZEISS LEO - 1530 DSM para producir las imágenes de las figuras 4A y 4B. La figura 4A muestra tejido de la glándula pancreática tratado con 20.000 ppm de PAA durante 30 minutos y no muestra signos de actividad bacteriana. (la barra de escala es de 2 pm). La figura 4B muestra la superficie de tejido de la glándula pancreática no tratado que muestra la presencia de abundancia de colonias bacterianas (la barra de escala es de 10 pm). Los virus son de tamaño muy pequeño (15 a 100 nm) y no fue posible de observarlos en SEM. Para TEM, el tejido de la glándula pancreática y la muestra de pancreatina en polvo tratados con 20.000 ppm de PAA durante 30 minutos y las muestras de control se tiñeron con acetato de uranilo (ac) al 2 %. Se usó un microscopio electrónico de transmisión modelo H-7600 HITACHI, Versión 3.01, para producir las imágenes de las figuras 4C y 4D. Se observaron tres portaobjetos de TEM de cada tratamiento. Cada portaobjetos de TEM tenía 400 cuadrículas para observar. Se observó un mínimo de 10-15 cuadrículas por portaobjetos. La muestra de control de pancreatina (169) mostró presencia de virus en la pancreatina en polvo y también en el tejido glandular no tratado en superficie con pancreatina. La figura 4C es una imagen de TEM de una muestra no tratada de pancreatina en polvo (muestra 169), que muestra la presencia de virus, indicada por la flecha (la barra de escala es de 20 nm). La figura 4D es una sección de TEM de una muestra de tejido de la superficie no tratada de la glándula pancreática, que muestra la presencia de virus, indicada por la flecha (la barra de escala es de 200 nm). No se encontró ningún virus en la muestra de pancreatina en polvo N.° de ID 166, 167 y 168. No se observó ningún virus en el tejido glandular con pancreatina tratado con 20.000 ppm de PAA durante 30 minutos.

Ejemplo 6

Se desarrolló un método para tratar las glándulas pancreáticas porcinas con PAA antes del procesamiento para reducir el material extraño e inactivar virus en un proceso de producción sin impacto sobre el rendimiento enzimático de la pancreatina. El objetivo de este experimento fue demostrar una actividad enzimática equivalente independientemente de la presencia o ausencia de pretratamiento de las glándulas. Adicionalmente, las glándulas que habían sido tratadas para inactivación vírica demostraron una reducción en la carga vírica a través del procesamiento y en el producto final sin afectar a la actividad enzimática (composición y potencia). La carga vírica de diferentes tratamientos de glándulas se midió mediante un estudio diferente. Este estudio solamente midió la actividad enzimática de las glándulas a través del proceso. Este procedimiento se repitió ocho veces para definir completamente el proceso.

En este estudio se pusieron a prueba tres condiciones de tratamiento. La primera condición de tratamiento sumergió las glándulas en una solución estática de ácido peracético de 10.000 ppm en una relación de 1:1 (peso de glándulas: peso de solución de PAA) durante un tiempo de tratamiento de 5 minutos y 30 minutos (muestras 163 y 164). La segunda condición de tratamiento sumergió las glándulas en una solución peracética agitada de 20.000 ppm con una relación de 1:10 (peso de glándulas: peso de PAA) con las glándulas aseguradas en una jaula de tratamiento e invertidas cada 5 minutos. La tercera condición de tratamiento sumergió las glándulas en una solución peracética agitada de 40.000 ppm con una relación de 1:10 (peso de glándulas: peso de PAA) durante 30 segundos. A continuación, se retiraron las glándulas de la solución de ácido peracético y se dejó reaccionar el ácido peracético durante 30 minutos en la superficie de la glándula. En los tres casos, las glándulas se enjuagaron con agua y se colocaron en recipientes y se congelaron antes de procesarlas para la extracción de pancreatina.

A continuación, las glándulas se procesaron y se liofilizaron. El material resultante se molió para producir pancreatina en polvo con un tamaño promedio de partícula de 180 pm. La pancreatina en polvo se analizó para determinar las actividades enzimáticas de pancreatina. Los parámetros del proceso de cada una de las ejecuciones se resumen en la tabla 7.

TABLA 7:

continuación

Ejemplo 7

Todas las muestras tratadas con PAA produjeron actividades enzimáticas aceptables. Los cromatogramas de RP-HPLC para la identificación de estas muestras indicaron la composición adecuada para la pancreatina (véase la figura 5 para una comparación de los cromatogramas de la pancreatina aceptable).

Se usó la prueba límite de la cantidad residual de peróxido total para comprobar la presencia de cualquier PAA restante en el API de pancreatina. El límite de detección para este método es de 2 ppm en solución, 200 ppm de H2O2 en la muestra y 100 ppm de O* (radical libre de oxígeno) total en la muestra. Las muestras de tratamiento con PAA y enjuague no mostraron detección, lo que indica que el PAA se puede eliminar de la pancreatina a niveles inferiores a los de detección.

Basándose en estos resultados analíticos de los lotes restantes, resultó que las condiciones de tratamiento con ácido peracético de las muestras no afectaron al rendimiento del producto final o a la composición, pureza, identificación y potencia.

Ejemplo 8

A continuación, se pusieron a prueba las muestras de pancreatina para evaluación vírica. Los resultados de estas evaluaciones se resumen en la tabla 8. Todas las muestras dieron negativo para ensayos víricos específicos y estaban por debajo del límite de detección para el ensayo de PPV. La única muestra que demostró una diferencia entre los tratamientos fue el ensayo de PCV2 donde las muestras tratadas con 20.000 ppm de ácido peracético mostraron valores más bajos que las otras muestras, aunque la muestra de control descongelada demostró un valor equivalente a una de las muestras tratadas con 20.000 ppm de ácido peracético. Se desconoce si la carga bacteriana y vírica de las glándulas iniciales fue equivalente. Sin embargo, las muestras producidas a partir de glándulas tratadas con 20.000 ppm de ácido peracético durante 30 minutos demostraron resultados de ensayo de PCV2 equivalentes o inferiores a los de cualquiera de las otras muestras.

TABLA 8:

Ejemplo 9

A continuación, las glándulas resultantes se convirtieron en pancreatina usando dos procesos de extracción de pancreatina patentados diferentes (denominados "Método 1" y "Método 2"), con un rendimiento de producto del 9-15 %. Las actividades de las muestras de pancreatina fueron similares independientemente de si las glándulas se trataron o no con ácido peracético (véase la tabla 7). Las condiciones de tratamiento de hasta 40.000 ppm de ácido peracético, y los tiempos de inmersión de hasta 30 minutos, no afectaron a la actividad o potencia de la pancreatina producida. Los resultados obtenidos de los procesos de extracción de pancreatina usando el Método 1 y el Método 2 se consolidan y se presentan en la figura 6. Adicionalmente, los resultados de la prueba de identificación por HPLC de fase inversa de todas las muestras fueron positivos para pancreatina (véase la figura 5).

Los resultados víricos indicaron que todas las muestras, ya fueran tratadas con ácido peracético o no, dieron negativo en todos los paneles víricos puestos a prueba y estaban por debajo del límite de detección para el ensayo de PPV. Las muestras tratadas con 20.000 ppm de ácido peracético demostraron valores de ensayo iguales o inferiores para el ensayo de PCV2.

Cabe señalar que el PPV y el PCV2 no son buenos indicadores de la eficacia de la inactivación vírica porque se desconoce el título del virus del estudio. Los resultados de PCR no son indicativos de infectividad vírica.

Se ha de interpretar que el uso de los términos "un", "uno/una" y "el/la" y las referencias similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) abarcan tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. Las expresiones "que comprende(n)", "que tiene(n)", "que incluye(n)", y "que contiene(n)" se han de interpretar como expresiones abiertas (es decir, que significan "que incluye(n), pero sin limitación") a menos que se indique lo contrario. La enumeración de intervalos de valores en el presente documento meramente pretende servir como método abreviado de hacer referencia de manera individual a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se enumerara de manera individual en el presente documento. Todos los métodos que se describen en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique otra cosa en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera y todos los ejemplos o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") proporcionados en el presente documento, tiene por objeto simplemente ilustrar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención, a menos que se reivindique de otro modo. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva ha de interpretarse como una indicación de que cualquier elemento no reivindicado sea esencial para la práctica de la invención.

Las realizaciones preferidas de esta invención se describen en el presente documento, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para realizar la invención. Las variaciones de esas realizaciones preferidas pueden resultar evidentes para los expertos en la materia tras la lectura de la descripción anterior. Los inventores esperan que los expertos en la materia empleen tales variaciones como adecuadas y los inventores pretenden que la invención se ponga en práctica de otro modo diferente que el específicamente descrito en el presente documento.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método de fabricación de una preparación de pancreatina, que comprende las etapas de:

(a) pretratar una glándula pancreática o un tejido pancreático con ácido peracético (PAA) en una reacción (b) procesar la glándula pancreática o el tejido pancreático para extraer la preparación de pancreatina con el fin de reducir de este modo la infectividad vírica y de reducir el recuento bacteriano en la preparación de pancreatina.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la infectividad vírica de virus sin envoltura en la preparación de pancreatina después de la reacción es al menos 1 log-10 menor en comparación con la infectividad vírica de virus sin envoltura de la glándula pancreática o del tejido pancreático antes de la reacción con PAA.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende, además: (i) añadir PAA a la glándula pancreática o al tejido pancreático, y (ii) incubar la glándula pancreática o el tejido pancreático y PAA durante un tiempo suficiente para reducir la infectividad vírica.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la reacción comprende PAA a una concentración de aproximadamente 500 ppm a aproximadamente 20.000 ppm.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la reacción comprende PAA a una concentración de aproximadamente 100 ppm a aproximadamente 40.000 ppm.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la reacción se lleva a cabo durante de aproximadamente 0,5 minutos a aproximadamente 30 minutos.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la reacción se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 22 °C.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la reacción se lleva a cabo a un pH de aproximadamente pH 1,0 a aproximadamente pH 5,5.

9. El método de la reivindicación 1, en el que la reacción se lleva a cabo con alcohol como codisolvente.