CN106879884B

CN106879884B - 一种提高蜂王浆性能的方法

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Publication number: CN106879884B
Application number: CN201510934212.1A
Authority: CN
Inventors: 陈忠周; 田文礼; 李敏; 彭文君; 方小明; 吴玮; 赵亚周
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2015-12-15
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2035-12-15
Also published as: CN106879884A

Abstract

本发明提供了一种提高蜂王浆性能的方法，其包括：在蜂王浆中直接添加蛋白酶。本发明还提供了一种提高蜂王浆性能的方法，其包括：(1)从蜂王浆中分离纯化MRJP1低聚体蛋白；(2)使用蛋白酶对经分离纯化的MRJP1低聚体蛋白进行酶切处理；(3)将处理后的MRJP1低聚体蛋白加入蜂王浆中；其中所述MRJP1低聚体蛋白为由MRJP1单体、多肽apisimin小分子和24‑亚甲基胆固醇组成的异质三元复合物。经过本发明方法处理的蜂王浆可以显著促进蜜蜂幼虫的生长发育。

Description

一种提高蜂王浆性能的方法

·技术领域

本发明涉及食品和分子生物学领域，更具体地涉及一种提高蜂王浆性能的方法。

·背景技术

蜜蜂是典型的社会性昆虫，由2种性别、3种类型的个体组成，即雄蜂、工蜂和蜂王。蜜蜂的级型分化主要是指遗传组成完全一致的蜜蜂雌性幼虫在不同的条件下发育成生殖个体蜂王和非生殖个体工蜂。蜂王终生以蜂王浆为食，而工蜂前3天以蜂王浆为食物，从3日龄后改用由蜂蜜和蜂花粉制成的蜂粮进行饲喂。

蜂王浆(Royal Jelly，RJ)则是一种哺育工蜂咽下腺和上颚腺分泌的，主要用以饲喂蜂王和蜜蜂幼虫的乳白色、淡黄色浆状物。蜂王浆中的蛋白质含量占干物质的50％左右，生物学功能大部分应归因于其中的蜂王浆主要蛋白家族(Major Royal Jelly Proteins,MRJP)，其含量占总蛋白质的82％～90％。到目前为止，MRJP家族已发现9个家庭成员，即，MRJP1-9。MRJP1含量最丰富，约占蜂王浆水溶性蛋白的48％。Simuth等报道MRJP1在蜂王浆中以三种形式存在：单体、低聚体以及和脂肪酸交互作用后形成的水不溶性的聚合体(

J.Some properties of the main protein of honeybee(Apis mellifera)royal jelly Apidologie 32(1),69-80(2001))。

MRJP1单体是一个分子量约为49kDa～60kDa的弱酸性糖蛋白，而目前通过超速离心法与凝胶过滤层析法对MRJP1低聚体进行的分子量的测定，出现了280kDa、290kDa、350kDa、420kDa、450kDa等多种结果。据文献报道MRJP1低聚体是五聚体或六聚体。MRJP1低聚体在2-D blue native/SDS-PAGE上可被分解成2个亚基，分子量分别为55kDa(MRJP1)和5kDa(apisimin)，认为其比例为5:1，其中apisimin是一种在蜜蜂的整个生命周期中都有着高水平表达的富含丝氨酸和缬氨酸的由54个氨基酸组成的多肽。MRJP低聚体为热稳定性蛋白，其结构在56℃保持30min的情况下仍是稳定的。

2011年，Kamakura在Nature上发表论文认为蜂王浆主要蛋白MRJP1对蜜蜂的级型分化起到关键作用，并证实MRJP1单体是蜂王浆中诱导蜜蜂发生级型分化的主要功能因子，而MRJP1低聚体则不具此功能(Kamakura M.Royalactin induces queen differentiationin honeybees.Nature 473(7348),478-483(2011))。

尽管目前对MRJP1的研究取得了一些进展，但是对MRJP1低聚体的研究还不深入，如何改进MRJP1低聚体的生物学功能，从而提高蜂王浆和MRJP1低聚体的性能还有待研究。

因此，需要克服蜂王浆和MRJP1低聚体的生物学功能的缺陷，从而提高蜂王浆的性能以促进蜜蜂幼虫的生长发育。

·发明内容

本发明的第一方面提供了一种提高蜂王浆性能的方法，其包括在蜂王浆中直接添加蛋白酶。

本发明的第二方面提供了一种提高蜂王浆性能的方法，其包括：

(1)从蜂王浆中分离纯化MRJP1低聚体蛋白；

(2)使用蛋白酶对经分离纯化的MRJP1低聚体蛋白进行酶切处理；

(3)将处理后的MRJP1低聚体蛋白加入蜂王浆中；

其中所述MRJP1低聚体蛋白为由MRJP1单体、多肽apisimin小分子和24-亚甲基胆固醇组成的异质三元复合物(下文简称P-MRJP1)。

本发明的第三方面提供了一种性能提高的蜂王浆，其中含有蛋白酶，所述蛋白酶在使用前0～5年添加到蜂王浆中。

本发明的第四方面提供了一种性能提高的蜂王浆，其中含有经过蛋白酶酶切处理的MRJP1低聚体蛋白，所述MRJP1低聚体蛋白为由MRJP1单体、多肽apisimin小分子和24-亚甲基胆固醇组成的异质三元复合物。

本发明的方法提高了蜂王浆的性能，有助于促进蜜蜂幼虫的生长发育。

·附图说明

根据以下参照附图进行的详细描述，本发明的上述和其他方面、特征和优点会变得更加清楚。

图1示出了蜂王浆蛋白粗提液经过Q-琼脂糖柱分离后SDS-PAGE电泳检测的结果。其中，泳道1：40mM NaCl洗脱液；泳道2：60mM NaCl洗脱液；泳道3：80mM NaCl洗脱液；泳道4：100mM NaCl洗脱液；泳道5：120mM NaCl洗脱液；泳道6：140mM NaCl洗脱液；泳道7：160mMNaCl洗脱液；泳道8：200mM NaCl洗脱液；泳道9：300mM NaCl洗脱液。M表示标准蛋白，*表示目标蛋白。

图2示出了天然提取的MRJP1蛋白经过分子筛纯化的结果。

图3示出了经过胰蛋白酶酶切后的MRJP1蛋白的质谱图，A)为MRJP1总离子流图与荷质比为1631.2-1632.2提取粒子流图，B)为MRJP1肽质量指纹图谱。

图4示出了MRJP1低聚体蛋白分析超速离心实验的结果。主峰对应的分子量约为254kDa。

图5示出了SDS-PAGE检测MRJP1低聚体蛋白中多肽apisimin存在的结果。A.12％SDS-PAGE电泳图；B.Tricine-SDS-PAGE电泳图。

图6示出了MRJP1低聚体蛋白中24-亚甲基胆固醇的质谱图。

图7示出了蛋白酶处理对幼虫六日龄体重的影响。

图8示出了不同条件下饲养六日龄幼虫的结果，A：40-30d RJ；B：40-30d RJ+10％P；C：40-30d RJ+1％P；D：40-30d RJ+0.1％P；E：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％P 1小时37℃)；F：RJ。P表示胃蛋白酶，RJ表示蜂王浆，40-30d RJ表示在40℃放置30天的蜂王浆，P-MRJP1表示MRJP1低聚体。

图9示出了不同条件下饲养六日龄幼虫的放大示意图，A：40-30d RJ；B：RJ；C：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％P 1小时37℃)。

·具体实施方式

如上所述，本发明的第一方面提供了一种提高蜂王浆性能的方法，其包括在蜂王浆中直接添加蛋白酶。

本发明方法中的蛋白酶可以是，例如，酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶等。所述酸性蛋白酶包含胃蛋白酶、某些金属基质蛋白酶和组织酶、以及由各种动植物、微生物产生的蛋白酶。所述丝氨酸蛋白酶包含胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血蛋白酶。所述巯基蛋白酶包含木瓜酶、无花果酶、某些链球菌蛋白酶。本发明方法中的蛋白酶可以是发酵的粗产品和经过精制提炼的等。

在一个实施方案中，所述蛋白酶为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或巯基蛋白酶，优选为酸性蛋白酶。

在一个实施方案中，所述蛋白酶的工作浓度为0.01％～20％。

在一个实施方案中，所述方法包括在蜂王浆中添加蛋白酶于-100～45℃酶切0～5年。

在一个优选的实施方案中，所述方法包括在蜂王浆中添加蛋白酶于-86～-20℃酶切0～3年或于0～37℃酶切0～30天。

在一个更优选的实施方案中，所述方法包括在蜂王浆中添加蛋白酶于-86～-20℃酶切0～2年或于0～37℃酶切0～3小时。

(1)从蜂王浆中分离纯化MRJP1低聚体蛋白；

(3)将处理后的MRJP1低聚体蛋白加入蜂王浆中；

其中所述MRJP1低聚体蛋白为由MRJP1单体、多肽apisimin小分子和24-亚甲基胆固醇组成的异质三元复合物。

在一个实施方案中，所述蛋白酶的工作浓度为0.01％～20％。

在一个实施方案中，所述酶切处理的条件为-100～45℃、0～5年。

在一个优选的实施方案中，所述酶切处理的条件为-86～-20℃酶切0～3年或于0～37℃酶切0～30天。

在一个更优选的实施方案中，所述酶切处理的条件为-86～-20℃酶切0～2年或为0～37℃酶切0～3小时。

以下通过具体实施例来说明本发明的内容。应理解，所述具体实施例仅为说明目的，并不意味着本发明的内容仅限于具体实施例。实施例中使用的化合物或试剂可通过商业途径购得，或者通过本领域技术人员已知的常规方法制备得到；所使用的实验仪器可通过商业途径购得。

实施例1：天然蜂王浆MRJP1蛋白的分离纯化

将1g蜂王浆与10mL 40mM磷酸盐缓冲液pH 8.0混合，用静音混匀器(购自其林贝尔公司)混匀1小时后，在高速离心机(购自安徽中科中佳科学仪器有限公司)中以20,000rpm离心15分钟，上清液用0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液即为蜂王浆蛋白粗提液，然后再通过以下步骤进一步纯化：

1.1阴离子交换层析

MRJP1的阴离子交换层析使用的是北京韦氏博慧色谱有限公司的Q-琼脂糖凝胶快速分离填料，在4℃中进行。

1.用缓冲液A(20mM Tris-HCl pH 8.0)平衡柱子2个柱体积。

2.向5mL蜂王浆蛋白粗提取液中加入5mL缓冲液A，混匀后过柱上样。

3.用缓冲液A漂洗2个柱体积。

4.配置缓冲液A与缓冲液B(20mM Tris-HCl pH 8.0，1M NaCl)的不同梯度的洗脱液洗脱蛋白，收集80-300mM NaCl洗脱液，通过SDS-PAGE蛋白胶来检验蛋白的纯度(如图1所示)。

1.2凝胶过滤层析

使用Superdex 200HR10/300GL(GE Healthcare)凝胶过滤柱进行分子筛纯化，整个纯化过程在4℃中进行。

1.用分子筛缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，1mM DTT)平衡凝胶过滤柱2个柱体积。

2.将上述洗脱液浓缩至1mL上样，柱子流速为0.3mL/min。

3.收集MRJP1的聚体峰(如图2所示)并浓缩。向浓缩后的蛋白加入10％的甘油，液氮快速冷冻后于-80℃保存。

实施例2：MRJP1低聚体蛋白的表征

1.MRJP1蛋白的质谱验证

本发明首先采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的方法对实施例1中经纯化的蛋白进行验证。

将图2中分子筛后收集的纯度很高的蛋白除盐，用胰蛋白酶酶切过夜后，进行质谱上样，结果如图3所示。质谱的结果得到分子量较大的多个多肽片段，通过Swissprot数据库(http://www.uniprot.org)检索，与已知蛋白序列进行匹配，多肽片段匹配情况如表1所示，序列覆盖率为84％，匹配得分为12755，序列与MRJP1的匹配度非常高，且为唯一及格蛋白，结合生物信息学比对结果进一步确认经分子筛后收集蛋白的主峰为蜂王浆主蛋白MRJP1(见表1)。

表1：数据库比对MRJP1的主要性质

2.MRJP1低聚体蛋白的聚集形式

为了检测MRJP1低聚体蛋白的聚集状态，本发明采用分析超速离心的方法进行鉴定。

在本实施例中，将实施例1中经分子筛纯化得到的MRJP1低聚体蛋白在Beckman/Coulter/XL-I分析超速离心机中以42000rpm于20℃下进行超速离心，采用干扰法检测。double-sector cells上样量分别为0.1mM和0.2mM。数据分析采用SEDFIT和SEDPHAT软件，结果如图5所示。从图中可以看出，主峰对应的分子量约为254kDa，故本发明纯化得到的MRJP1低聚体蛋白主要以四聚体形式存在。

3.MRJP1低聚体蛋白中多肽apisimin的存在

本发明采用两种不同的SDS-PAGE分析方法以验证MRJP1低聚体蛋白中多肽apisimin的存在。从图5中可以看出，在12％的SDS-PAGE胶(图5A)和Tricine-SDS-PAGE胶(图5B)的最底部均有分子量比较小，大小约为5kDa的多肽存在。通过对SAS-PAGE进行积分，计算表明MRJP1低聚体蛋白中MRJP1单体分子与apisimin的比例接近1：1。

4.MRJP1低聚体蛋白中24-亚甲基胆固醇的验证。

向100μL 10mg/mL的MRJP1低聚体蛋白溶液中加入50mg尿素，反复震荡几次，放置半小时。再加入0.4mg NaOH固体至终浓度为1M(pH 14)，反复震荡几次，放置半小时。用500-600μL的正己烷萃取3-6次，收集正己烷层。用旋转蒸发仪除去正己烷，即可分离出24-亚甲基胆固醇，并经过质谱进行验证，结果如图6所示。

实施例3：蛋白酶处理蜂王浆和MRJP1低聚体蛋白对蜜蜂幼虫的生长发育的影响

根据Kamakura等的研究结果，MRJP1单体可诱导蜜蜂的级型分化，而MRJP1低聚体则不具有此功能。因此，在该实施例中，对蜂王浆和经纯化的MRJP1低聚体蛋白进行多种蛋白酶处理，然后分别用经处理的蜂王浆和MRJP1低聚体蛋白配制饲粮配方对意蜂幼虫进行离群饲养。

本实施例使用多种蛋白酶对蜂王浆以及上述实施例中经纯化的MRJP1低聚体蛋白进行处理，共配制了34种饲粮配方(表2和表3)对蜜蜂(意蜂)幼虫进行饲喂，在六日龄时观察幼虫的大小或称量幼虫的体重(图7到图9)。从图7A(对应于表2中的配方)中可以看出，与配方1(新鲜蜂王浆RJ)相比，配方2-4显著促进幼虫的生长发育(p<0.01)，说明在鲜蜂王浆中添加0.01～20％胃蛋白酶(P)显著提高鲜蜂王浆的效果(p<0.01)。配方5-17也显著促进幼虫的生长发育(p<0.01)，说明在-100～45℃使用多种不同浓度的蛋白酶对蜂王浆进行酶切处理0～5年都可显著提高鲜蜂王浆的效果。从图7B(对应于表3中的配方)中可以看出，与配方1(40-30d RJ)相比，配方2-4显著促进幼虫的生长发育(p<0.01)，说明在40℃贮存30天的蜂王浆中添加胃蛋白酶可显著促进幼虫的生长发育，并且胃蛋白酶的浓度越高效果越好。与配方5(40-30d RJ+P-MRJP1)相比，配方6-17都能显著促进幼虫的生长发育(p<0.01)。但配方7-8、11-12、14-15的效果要优于配方9-10、13和16-17的效果，推测MRJP1低聚体蛋白在37℃用酸性蛋白酶处理之后，活性部位得以暴露，具有MRJP1单体的效果，而且饲养幼虫的温度为34℃，在这个温度下酸性蛋白酶可以继续对MRJP1低聚体酶切，起到缓释的效果。而过高温度(如45℃)会使蛋白酶的活性降低，因此对MRJP1低聚体蛋白处理的效果降低，另外，由于蜂王浆中pH是酸性，中性蛋白酶或碱性蛋白酶在饲养过程中不能起到缓释作用，故与酸性蛋白酶相比对幼虫生长发育的促进作用降低。

表2：在新鲜的蜂王浆中添加蛋白酶的蜜蜂幼虫饲粮配方

注：表中数据为质量百分比(％)。金霉素都是加0.0025。

与表2饲粮配方对照：1：RJ(新鲜的蜂王浆)；2：RJ+0.01％P，添加0.01％胃蛋白酶(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)；3：RJ+0.1％P，添加0.1％胃蛋白酶；4：RJ+20％P，添加20％胃蛋白酶；5：RJ+0.1％P 1小时37℃，添加0.1％胃蛋白酶在37℃酶切1小时；6：RJ+0.1％P2月37℃，添加0.1％胃蛋白酶在37℃放置两个月后再按比例添加；7：RJ+0.1％P2月45℃，添加0.1％胃蛋白酶在45℃放置两个月后再按比例添加；8：RJ+0.1％P 1年4℃，添加0.1％胃蛋白酶在4℃放置一年后再按比例添加；9：RJ+0.1％P 3年4℃，添加0.1％胃蛋白酶在4℃放置三年后再按比例添加；10：RJ+0.1％P 3年-20℃，添加0.1％胃蛋白酶在-20℃放置三年后再按比例添加；11：RJ+0.1％P 5年-80℃，添加0.1％胃蛋白酶在-80℃放置五年后再按比例添加；12：RJ+0.1％P 5年-100℃，添加0.1％胃蛋白酶在-100℃放置五年后再按比例添加；13：RJ+0.1％S15年-100℃，添加0.1％来自黑曲霉的酸性蛋白酶(购自济宁和信生物技术有限公司，也是一种金属蛋白酶)在-100℃放置五年后再按比例添加；14：RJ+0.1％S2 5年-100℃，添加0.1％凝乳酶(购自安徽中旭生物科技有限公司)在-100℃放置五年后再按比例添加；15：RJ+0.1％N 5年-100℃，添加0.1％中性蛋白酶(购自东恒华道生物科技有限责任公司的中性蛋白酶)在-100℃放置五年后再按比例添加；16：RJ+0.2％M 5年-100℃，添加0.2％蛋白酶混合物(购自东恒华道生物科技有限责任公司的粗提的蛋白酶)在-100℃放置五年后再按比例添加；17：RJ+0.2％F 5年-100℃，添加0.2％复合酶(购自东恒华道生物科技有限责任公司的啤酒复合酶)在-100℃放置五年后再按比例添加。P：胃蛋白酶；S1:来自黑曲霉的酸性蛋白酶；S2:凝乳酶；N：中性蛋白酶；M：蛋白酶混合物；F：复合酶。

表3：在40-30d的蜂王浆中添加蛋白酶的蜜蜂幼虫饲粮配方

注：表中数据为质量百分比(％)。40-30d RJ：鲜蜂王浆于密封管中，在40℃恒温箱中放置30天，金霉素都是加0.0025。

与表3饲粮配方对照：1：40-30d RJ，鲜蜂王浆于密封管中，在40℃恒温箱中放置30天后再按比例添加；2：40-30d RJ+0.01％P，添加0.01％胃蛋白酶；3：40-30d RJ+0.1％P，添加0.1％胃蛋白酶；4：40-30d RJ+20％P，添加20％胃蛋白酶；5：40-30d RJ+P-MRJP1，添加2％MRJP1低聚体；6：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％P 0.1小时37℃)，MRJP1低聚体经0.1％胃蛋白酶在37℃酶切0.1小时后再按比例添加；7：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％P 3小时37℃)，MRJP1低聚体经0.1％胃蛋白酶在37℃酶切3小时后再按比例添加；8：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％P 3天37℃)，MRJP1低聚体经0.1％胃蛋白酶在37℃酶切3天后再按比例添加；9：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％P 3天45℃)，MRJP1低聚体经0.1％胃蛋白酶在45℃酶切3天后再按比例添加；10：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.02％T 3小时37℃)，MRJP1低聚体经0.02％胰蛋白酶(生工生物工程(上海)股份有限公司,丝氨酸蛋白酶的一种)在37℃酶切3小时后再按比例添加；11：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％S1 3小时37℃)，MRJP1低聚体经0.1％来自黑曲霉的酸性蛋白酶(购自济宁和信生物技术有限公司，也是一种金属蛋白酶)在37℃酶切3小时后再按比例添加；12：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％S2 3小时37℃)，MRJP1低聚体经0.1％来自美曲霉的酸性蛋白酶在37℃酶切3小时后再按比例添加；13：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％N3小时37℃)，MRJP1低聚体经0.1％中性蛋白酶(购自东恒华道生物科技有限责任公司的中性蛋白酶)在37℃酶切3小时后再按比例添加；14：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.2％M 3小时37℃)，MRJP1低聚体经0.2％蛋白酶混合物(购自东恒华道生物科技有限责任公司的蛋白酶粗酶)在37℃酶切3小时后再按比例添加；15：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.2％F 3小时37℃)，MRJP1低聚体经0.2％复合酶(购自东恒华道生物科技有限责任公司的啤酒复合酶)在37℃酶切3小时后再按比例添加；16：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％L 3小时37℃)，MRJP1低聚体经0.1％木瓜蛋白酶(巯基蛋白酶的一种，购自生工生物工程(上海)股份有限公司)在37℃酶切3小时后再按比例添加；17：40-30d RJ+(P-MRJP1+0.1％A 3小时37℃)，MRJP1低聚体经0.1％碱性蛋白酶(购自东恒华道生物科技有限责任公司的碱性蛋白酶)在37℃酶切3小时后再按比例添加。P-MRJP1：MRJP1低聚体。P：胃蛋白酶；T：胰蛋白酶；S1:来自黑曲霉的酸性蛋白酶；S2:凝乳酶；N：中性蛋白酶；M：蛋白酶混合物；F：复合酶；L:木瓜蛋白酶；A:碱性蛋白酶。

上述结果表明，使用蛋白酶对蜂王浆和MRJP1低聚体蛋白进行处理可提高蜂王浆的性能，从而显著促进蜜蜂幼虫的生长发育。

Claims

1.一种提高蜂王浆性能的方法，所述性能为促进蜜蜂幼虫的生长发育，所述方法包括：

（1）从蜂王浆中分离纯化MRJP1低聚体蛋白；

（2）使用蛋白酶对经分离纯化的MRJP1低聚体蛋白进行酶切处理；

（3）将处理后的MRJP1低聚体蛋白加入蜂王浆中；

其中所述MRJP1低聚体蛋白为由MRJP1单体、多肽apisimin

小分子和24-亚甲基胆固醇组成的异质三元复合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白酶为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或巯基蛋白酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白酶的工作浓度为0.01%~20%，并且所述酶切处理的条件为-100~45℃、酶切0~5年。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述酶切处理的条件为-86~-20℃酶切0~3年或0~37℃酶切0~30天。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述酶切处理的条件为-86~-20℃酶切0~2年或0~37℃酶切0~3小时。