JP2016513970A - ワクチンにおけるデングウイルスキメラ構築物に関する組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本願の実施形態は、弱毒生デングウイルスおよびデングウイルス構築物の組成物、使用および製造を報告する。いくつかの実施形態は、四価デングウイルス組成物を含むがそれに限定されない組成物に関する。ある実施形態では、組成物は、デングウイルスの１種以上の血清型の構築物、例えばデング−１（ＤＥＮ−１）ウイルス、デング−２（ＤＥＮ−２）ウイルス、デング−３（ＤＥＮ−３）またはデング−４（ＤＥＮ−４）ウイルス構築物を含むことができる。他の実施形態において、本願に開示される構築物は、１つ以上のデングウイルス構築物に対するワクチンを生成するために組成物中で組み合わされてもよく、これはその後、哺乳類細胞中で継代されてもされなくてもよい。

Description

〔連邦政府資金による研究〕
本願に開示されるいくつかの実施形態は、アメリカ国立衛生研究所の認可番号Ｒ４３ＡＩ０８４２９１−０１によって一部援助された。米国政府は対象の発明を実施する特定の権利を有し得る。

〔分野〕
本願の実施形態は、デングウイルス構築物およびそのワクチン組成物に関する組成物、方法、使用および製造工程を報告する。いくつかの実施形態は、キメラフラビウイルスのウイルス構築物を含むがそれに限定されない組成物に関し、上記ウイルス構築物は単独で、または他の構築物と組み合わされてワクチン組成物に使用することができる。ある実施形態では、組成物は、デングウイルスの２種以上の血清型、例えばデング−１（ＤＥＮ−１）ウイルス、デング−２（ＤＥＮ−２）ウイルス、デング−３（ＤＥＮ−３）ウイルスおよび／またはデング−４（ＤＥＮ−４）ウイルスの構築物を含むことができる。他の実施形態において、組換え弱毒生キメラデングワクチン（ＤＥＮＶａｘ）ウイルスの安全性および遺伝子安定性を向上できる製造戦略。ある実施形態は、ワクチン組成物において安全かつ有効であることが確認されたデングウイルスキメラ構築物と組み合わされた少なくとも１つの弱毒生デングウイルスを含み、ここで、上記構築物は、細胞培養で更なる継代を経たものである。

デングウイルスによる感染は、痛みを伴う発熱を様々な重症度でもたらし得る。今のところ、デングウイルスの４種類の血清型が特定されており、これらはデング−４（ＤＥＮ−４）と組み合わされたデング−１（ＤＥＮ−１）、デング−２（ＤＥＮ−２）、またはデング−３（ＤＥＮ−３）である。デング熱はデングウイルスの感染によって生じる。他の亜型も将来発見されるかもしれない（例えばＤＥＮ−５）。デングウイルス血清型１〜４は、デング出血熱（ＤＨＦ）およびデングショック症候群（ＤＳＳ）を引き起こすこともある。感染の最も深刻な結果であるＤＨＦおよびＤＳＳは生命に関わることがある。デングウイルスは毎年５千万〜１億症例の消耗性デング熱、５００，０００症例のＤＨＦ／ＤＳＳ、および２０，０００を超える死亡例を引き起こしている。今のところ、デング熱から防御するための有効なワクチンはなく、この疾患に対する薬物療法もない。蚊を駆除する努力も、流行地域でのデングの大流行やこの疾患の更なる地理的拡大を防ぐのに効果を上げていない。推定では、３５億人がデングウイルスの感染に脅かさている。さらに、デングウイルスは、アジア、中央アメリカ、南アメリカ、およびカリブ海のような流行地域への旅行者の発熱の一番の原因である。

全４種のデングウイルス血清型は、世界の熱帯地域の全域に特有であり、世界的に見て、熱帯地域の人に対して最も脅威的な蚊媒介性ウイルスとなっている。デングウイルスは主にネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）を介してヒトに伝染する。１種のデングウイルス血清型に感染すると、その血清型による再感染から生涯にわたり防御されるが、他の３種のデングウイルス血清型のうちの１つによる二次感染は防御しない。実際、１種のデングウイルス血清型による以前の感染は、異なる血清型に二次感染した時に深刻な疾患（ＤＨＦ／ＤＳＳ）のリスクを高める可能性がある。有効なワクチンを開発することが、この世界的な流行性疾患を予防および抑制するのに重要なアプローチとなる。多数回の免疫は、旅行者にとって、およびデングウイルスの流行国における公衆衛生活動にとって、完全なワクチン接種率を達成するのを困難にしている。

本願の実施形態は、キメラデングウイルス構築物の組成物、方法および使用に関する。いくつかの実施形態において、組成物は、弱毒化デングウイルス骨格を、少なくとも１種の他のデングウイルス血清型に由来する構造遺伝子と共に有するキメラデングウイルス構築物を含むことができる。他の実施形態は、１つ以上のキメラデングウイルスと組み合わされた少なくとも１つの弱毒生ウイルスに関する。他の実施形態は、改変型ＤＥＮ−２骨格（例えばＰ１（継代１）の開始骨格としてＰＤＫ−５３、および、Ｐ２、Ｐ３、・・・Ｐ８・・・Ｐ１０等と表される継代変動性（許容細胞株でのｉｎ ｖｉｔｒｏでの継代および増殖後））および、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３またはＤＥＮ−４の１つ以上の構造要素を有するキメラデングウイルスの組成物を含むことができる。他の実施形態では、対象に導入されるとその対象における１つ以上のデングウイルスに対する免疫応答を生成する免疫原性組成物が製造される。したがって、本願で企図される構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成および継代することができ、各継代は、薬学的に許容されるワクチン組成物への使用が意図された弱毒化デングウイルスをもたらす。ある実施形態では、弱毒生ウイルスは、単独の、または１つ以上のキメラデングウイルスと組み合わされた、弱毒生デング−２ウイルスとすることができる。

ある実施形態では、複数のデングウイルス血清型のキメラデングウイルス構築物は、配列番号１、４、７および１０で示される核酸配列または配列番号２、３、５、６、８、９、１１および１２で示されるポリペプチド配列を有する継代７（Ｐ７）の弱毒化ウイルスまたはキメラウイルスを含むことができる。本願では、本明細書に記載の任意の弱毒生ウイルスを任意の代数で継代させたものが、提示されるデングウイルス（例えば血清型１〜４）に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物に使用可能であると考えられる。これらの実施形態に従って、単離したＰ−８弱毒生ウイルスを含む免疫原性組成物を、選択された構築物に応じた１種以上のデングウイルス血清型に対する免疫原性応答を誘導するために、対象に投与することができる。さらに、弱毒生ウイルスは、これらのキメラウイルスのうちの１つ以上と組み合わせることができる。これは、その後の各細胞継代（例えば、アフリカミドリザルＶｅｒｏ細胞産生、以降「Ｖｅｒｏ細胞」）において単離／生成された弱毒生ウイルスの各々について考慮される。本願では、デングウイルスを産生可能なあらゆる細胞株（例えば、ＧＭＰに準拠して作られたセルバンク、ＦＤＡまたはＥＭＡが許可したもの）が、製造規模で、あるいは、デングウイルスに対するワクチンまたは免疫原性組成物中でのその後の使用のために本願で適切と考えられる態様で、いずれのウイルス構築物の継代にも使用されると考えられる。

他の実施形態において、本願で考慮される組成物は、他の免疫原性組成物と組み合わせることができ、ここで、他の免疫原性組成物は、他のフラビウイルス、例えばウエストナイルウイルス、日本脳炎または他の任意のフラビウイルスのキメラ構築物および／または弱毒生ウイルスに対するものである。ある実施形態では、単一の組成物を複数のフラビウイルスに対して用いることができる。

ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３および／またはＤＥＮ−４のうちの１種以上に対するキメラデングウイルスを、単独で、または弱毒生デングウイルス組成物と組み合わせて含むことができる。

他の実施形態において、構築物は対象に導入された時にそのウイルスの弱毒性または安全性に影響を与えることなく増殖または生成を増大させる適応突然変異を、そのウイルスの構造領域または非構造領域に有する構築物を含むことができる。ある実施形態では、企図されるキメラデングウイルス構築物はいずれも、骨格として用いられる特定の突然変異を有する弱毒生ＤＥＮ−２ウイルスを含むことができ、その弱毒生ＤＥＮ−２ ＰＤＫウイルスは、他のデングウイルス血清型のｐｒＭ（プレメンブレン）構造タンパク質およびＥ（エンベロープ）構造タンパク質のうちの１つ以上の構造タンパク質を更に含む。さらに、ＤＥＮ−２骨格は、所定の組成物（例えばキメラデングウイルス２／１、２／３または２／４）を投与した時に対象においてその組成物に対する免疫応答の生成を増強させるか、またはその免疫応答を増進するために、更なる突然変異を含むことができる。

いくつかの実施形態において、構造タンパク質遺伝子は、弱毒生デングウイルスの一部である１つまたは２つの突然変異を有するＤＥＮ−２骨格上に、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３またはＤＥＮ−４のｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子を含むことができる。例えば、デング構築物は、特定の実施形態ではＤＥＮＶａｘ−１−Ａ、ＤＥＮＶａｘ−２−Ｆ、ＤＥＮＶａｘ−３−Ｆ、およびＤＥＮＶａｘ−４−Ｆと名付けられた構築物（実施例の節を参照）を含むことができ、ここで、ＤＥＮ−２骨格は、安全かつ免疫応答を誘導するのに有効であることが以前に実証されているＤＥＮ−２弱毒生ウイルスからの１つ以上の突然変異（例えば、Ｐ１または他の以前の継代ウイルスあるいはＰＤＫ−５３に見られないもの）を有する。本願のＤＥＮ−２弱毒生ウイルスは、もともと使われていたＤＥＮ−２弱毒生ウイルスの改善版である。本発明のキメラ構築物は、第２のデングウイルス血清型の１つ以上の構造タンパク質を有する改変型弱毒化ＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３骨格を含むことができ、ここで、構造タンパク質は、そのキメラ構築物に対する免疫原性応答を増強する更なる突然変異を含むことができる。いくつかの実施形態において、弱毒化ＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３が獲得した特定の突然変異は、Ｐ１構築物とは異なる、製造等のための望ましい特性をもたらし得る構築物において、保存的アミノ酸変化を生成することができ、またはできない。

他の実施形態において、弱毒生ＤＥＮ−２ゲノムは、デングウイルス血清型１（ＤＥＮ−１）およびデングウイルス血清型３（ＤＥＮ−３）、デングウイルス血清型４（ＤＥＮ−４）の構築物を作製するために使用することができ、ＤＥＮ−２ウイルスゲノムの１つ以上の構造タンパク質遺伝子が、それぞれＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３またはＤＥＮ−４の１つ以上の構造タンパク質遺伝子に置換され得る。いくつかの実施形態において、構造タンパク質は第２のデングウイルスのＣタンパク質、ｐｒＭタンパク質またはＥタンパク質とすることができる。ある実施形態では、構造タンパク質遺伝子はＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３またはＤＥＮ−４のｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子を含む。これらのハイブリッドウイルスは、親の弱毒化ＤＥＮ−２の弱毒表現型を維持しつつ、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３またはＤＥＮ−４の表面抗原を発現する。

本願に開示される構築物は、弱毒化ＤＥＮ−２ウイルスを骨格として用いてＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４の表面抗原を発現するＤＥＮ−４、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−１、およびＤＥＮ−３のキメラ構築物を含むことができる。

ある実施形態では、本発明の組成物は、本願に開示される単一のキメラデングウイルス構築物および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物を含むことができる。あるいは、本発明の組成物は、本願に開示される２つ以上または３つ以上のキメラデングウイルス構築物を含む組成物と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含むことができる。これらの実施形態に従って、本願で企図される１つ以上のデングウイルスキメラ構築物は、１つ以上の弱毒生デングウイルスと組み合わせることができる。ある実施形態では、弱毒生ウイルスは弱毒生ＤＥＮ−２ウイルスとすることができ、ここで、ＮＣＲ領域、ＮＳ１領域または他の領域における更なる突然変異が免疫応答を増強するか、ウイルス増殖を高めるか、または改善された弱毒生デングウイルスのための他の改善を強化する。

ある実施形態では、ＤＥＮＶ−２ワクチンの弱毒化位置であるヌクレオチド５’ＮＣＲ−５７−Ｔ、ＮＳ１−５３−Ａｓｐ、およびＮＳ３−２５０−Ｖａｌは以前に決定されており、これらの変化のすべてが、４種のＤＥＮＶａｘウイルスの共通のＰＤＫ−５３ウイルス特異的遺伝的背景に共有されている。これらのワクチン候補の以前に確立されたｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ弱毒表現型ならびに上記３つの弱毒化位置の遺伝子配列は、ｃＧＭＰに準拠して製造されたＤＥＮＶａｘシードについて注意深くモニタリングされた。この報告は、マスターウイルスシード（ＭＶＳ）の製造に用いる方策ならびにデングウイルスワクチン組成物の製造に用いる場合のそれらの遺伝子のおよび表現型の特徴解析について説明する。これらのＭＶＳは、臨床材料の製造および最終的には市販のワクチン供給に使用することができる。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、特定の実施形態をさらに実証するために含められている。いくつかの実施形態は、これらの図面のうちの１つ以上を、単独で、もしくは提示された特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、よりよく理解されよう。

本発明の例示的なキメラ構築物を反映した例示的なチャートを示し、ＤＥＮ−２／ＤＥＮ−４を以前に作製された構築物および野生型デングウイルスと比較している。 弱毒生ＤＥＮ−２骨格（更なる突然変異を伴う）、および、デング−２構造要素を置換する構造要素として第２のデングウイルス血清型（例えばＤＥＮＶａｘ−１ ＭＶＳ）を用いて様々な応答を比較した例示的なヒストグラムプロットを示す。このプロットは、ＤＥＮＶａｘ ＭＶＳのプラークサイズを表す。野生型デングウイルスおよび以前に公開されたリサーチグレードのワクチン候補ウイルスを対照および比較用に含めた。このプロットは、デングウイルス構築物の、対照デングウイルスキメラ構築物と比較して改善された生産を表している。 ＤＥＮＶａｘ ＭＶＳ（マスターウイルスシード）の温度感受性を表す例示的なヒストグラムプロットを示す。野生型デングウイルスおよび以前に公開されたリサーチグレードのワクチン候補ウイルスを、ＭＶＳグレードとの比較のために含めた。 対照と比較した、Ｃ６／３６細胞におけるＤＥＮＶａｘ ＭＶＳのウイルス増殖を表す例示的なヒストグラムプロットを示す。野生型デングウイルスおよびリサーチグレードのワクチン候補ウイルスを、ＤＥＮＶａｘ ＭＶＳとの比較のために含めた。 Ａ〜Ｃは、新生マウスにおける神経毒性の例示的なプロットを示す。いくつかの実験のプールした結果は、１０^４ｐｆｕのウイルスでｉｃ攻撃したＣＤＣ−ＩＣＲ（ｎ＝７２）およびＴａｃｏｎｉｃ−ＩＣＲ（ｎ＝３２）新生マウスにおけるｗｔ ＤＥＮＶ−２ １６６８１ウイルスの神経毒性を要約している（Ａ）。Ｔａｃｏｎｉｃ−ＩＣＲマウスにおいて、１０^４ｐｆｕ（Ｂ）または１０^３ｐｆｕ（Ｃ）の用量で試験したＤＥＮＶａｘ ＭＶＳの神経毒性。１つの実験での１グループ当たりの試験動物の数（ｎ＝１６）または２つの実験のプールでの数（ｎ＝３１または３２）が示されている。 ＤＥＮＶａｘ ＭＶＳ、ＷＶＳ、およびＢＶＳのプラークサイズを表す例示的なヒストグラムを示す。アガロースオーバーレイ下のＶｅｒｏ細胞またはＬＬＣ−ＭＫ_２細胞中のウイルスプラークの平均プラーク直径±ＳＤ（エラーバー）をｐｉ９日目に測定した。野生型ＤＥＮＶおよび以前に公開されたリサーチグレードのワクチン候補ウイルスを対照および比較のために含めた。 Ｃ６／３６細胞におけるＤＥＮＶａｘ ＭＳＶ、ＷＶＳ、およびＢＶＳの増殖を、これらの大規模製造後のこのｉｎ ｖｉｔｒｏ弱毒化マーカーの保持を評価するため２種類のインキュベーション温度で表す例示的なヒストグラムプロットを示す。 Ｃ６／３６細胞におけるＤＥＮＶａｘ ＭＶＳ、ＷＶＳ、およびＢＶＳの制限された増殖をプロットした例示的なヒストグラムを表す。Ｃ６／３６細胞で複製されたウイルスのｐｉ７日目の平均力価±ＳＤ（エラーバー）。ｗｔデングウイルスおよび以前に公開されたリサーチグレードのワクチン候補ウイルスを比較のために含めた。 Ａ〜Ｂは、新生ＩＣＲマウスにおけるＤＥＮＶａｘ ＭＶＳの神経毒性のデータの例示的なグラフを示す。（Ａ）１０^４ＰＦＵの用量でのウイルスのＩＣ接種。（Ｂ）１０^３ＰＦＵの用量でのウイルスのＩＣ接種。 新規な弱毒生ウイルスと以前に作製された弱毒生デングウイルスとを比較した例示的なチャートを示す。

〔定義〕
本願で使用される場合、「１つの」とは、１つもしくは１つより多くの事項を意味する場合がある。

本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトのような哺乳類や、家畜化または野生の哺乳類（例えば、イヌ、ネコ、他の家庭用ペット（例えば、ハムスター、モルモット、マウス、ラット）、フェレット、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、プレーリードッグ、野生げっ歯類、または動物園動物）を含み得るが、これらに限定されない。

本願で使用する場合、「ウイルスキメラ」、「キメラウイルス」、「フラビウイルスキメラ」および「キメラフラビウイルス」という用語は、デング−２ウイルスのヌクレオチド配列の一部、そしてさらにデング−２ウイルスに由来しないか、異なるデングウイルスに由来するヌクレオチド配列を含む構築物を意味することがある。「デングキメラ」は少なくとも２種の、異なるフラビウイルスではないが異なるデングウイルスの血清型を含む。したがって、他のデングウイルスまたはフラビウイルスの例には、デング−１ウイルス、デング−３ウイルス、デング−４ウイルス、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、黄熱ウイルスおよびこれらの任意の組合せ由来の配列が挙げられるがこれらに限定されない。

本願で使用する「核酸キメラ」は、デング−２ウイルスのヌクレオチド配列の一部を含む核酸配列と、さらにデング−２ウイルスのヌクレオチド配列と同じ起源のものではないヌクレオチド配列とを含む本発明の構築物を意味することがある。それに応じて、本願に開示される任意のキメラフラビウイルスまたはフラビウイルスキメラは核酸キメラの一例として認識され得る。

本願で使用する場合、「弱毒生ウイルス」は、突然変異しているか、あるいはワクチンまたは他の免疫原性組成物における使用特性のために選択された野生型ウイルスを意味する場合があり、いくつかの特性は、低下した毒性、安全性、有効性または向上した増殖等を含み得る。

〔説明〕
以下の節では、様々な実施形態を詳述するために、様々な例示的な組成物および方法が説明されている。当業者には、様々な実施形態の実施にあたり、本明細書に概説された詳細の全てを採用することも、あるいはその幾つかさえ採用することも必要なく、むしろ、濃度、時間その他の詳細は通常の実験によって変更可能であることが明らかであろう。いくつかの場合、周知の方法や構成要素はこの説明には含められていない。

本発明の実施形態によれば、本分野の従来技術に含まれる分子生物学、タンパク質化学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が採用されてもよい。そのような技術は文献に十分に説明されている。例えば、サムブルック、フリッチュおよびマニアティス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ）、分子クローニング：実験室マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー；動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）、Ｒ．Ｉ．フレシュニー（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）編、１９８６年を参照されたい。

本願の実施形態は、対象における１種以上のデングウイルス血清型に対する免疫応答を個々にまたは同時に誘導するための組成物、方法および使用に関する。これらの実施形態に従って、弱毒化デングウイルスおよび核酸キメラが生成され、本願に開示されるワクチン組成物に使用される。いくつかの実施形態は、改変型または突然変異型デング構築物またはキメラに関する。他の実施形態は、デングウイルスの構造タンパク質のアミノ酸配列を改変するための突然変異の導入に関し、その突然変異はそのウイルスの免疫原性を高める。

全４種の血清型の弱毒生デングウイルスは、野生型ウイルスを細胞培養で継代することによって開発されている。これらは、フラビウイルス、特にデングウイルス感染および／または疾患に対する免疫付与に最も有望な弱毒生ワクチン候補の一部である。これらのワクチン候補は、それらのデング血清型の組合せ、継代に用いる細胞株、および継代させた回数により命名されてきた。したがって、ＰＤＫ細胞で１３回継代させたデング血清型１野生型ウイルスはＤＥＮ−１ ＰＤＫ−１３ウイルスと表される。他のワクチン候補はＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３、ＤＥＮ−３ ＰＧＭＫ−３０／ＦＲｈＬ−３（例えば、初代ミドリザル腎細胞で３０回継代させ、その後アカゲザル胎児肺細胞で３回継代させたものおよびＤＥＮ−４ ＰＤＫ−４８）である。これら４つの候補ワクチンウイルスは、それぞれ、野生型親ＤＥＮ−１ １６００７、ＤＥＮ−２ １６６８１、ＤＥＮ−３ １６５６２およびＤＥＮ−４ １０３６ウイルスの組織培養継代により誘導された。

ある実施形態において、弱毒生デング−２ ＰＤＫ−５３ワクチンウイルスは、様々なヌクレオチド差を含む集団のウイルスの混合物を含んでいた。弱毒化突然変異の遺伝子解析後、特定の弱毒化特徴の概要をまとめ、それをｃＤＮＡ感染性クローンに作出した。この感染性クローンからＲＮＡを転写し、新規に特徴解析され誘導されたＰＤＫ−５３−Ｖｅｒｏ−ＤＥＮ−２−Ｐ１ウイルスの継代１として、Ｖｅｒｏ細胞に導入した（例えば表１を参照）。この弱毒化ウイルスは各ＤＥＮ血清型について作製したが、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４については、ｐｒＭおよびＥ遺伝子は３つの別個のｃＤＮＡ感染性クローン中で操作し、これにより４つの別個のＰＤＫ−５３−Ｖｅｒｏウイルスを生成した（ここではＰＤＫ−５３−Ｖｅｒｏ−ＤＥＮ−２−Ｐ１、ＰＤＫ−５３−Ｖｅｒｏ−ＤＥＮ−１−Ｐ１、ＰＤＫ−５３−Ｖｅｒｏ−ＤＥＮ−３−Ｐ１、およびＰＤＫ−５３−Ｖｅｒｏ−ＤＥＮ−４−Ｐ１と名付ける）。これらの弱毒化ワクチンウイルス株をＶｅｒｏ細胞で１０回継代させ（表１）、各別個の系統は、Ｖｅｒｏ細胞内での増殖に適応すると、突然変異を獲得した（表３）。本明細書における特定の実施形態は、これらの弱毒生デングウイルスの誘導および使用に関する。

これらの弱毒化ウイルスを用いた以前のヒト治験により、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３がヒトでは最低の感染用量（５プラーク形成単位すなわちＰＦＵの５０％最少感染量）であり、強い免疫原性であり、明らかな安全性に関する問題を生じないことが示されている。ＤＥＮ−１ ＰＤＫ−１３、ＤＥＮ−３ ＰＧＭＫ−３０／ＦＲｈＬ−３およびＤＥＮ−４ ＰＤＫ−４８ワクチンウイルス候補は、ヒトでそれぞれ１０，０００、３５００、および１５０ＰＦＵの、より高い５０％最少感染量を有する。ヒト対象で１００％セロコンバージョンを達成するのに必要な一価ＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３ウイルスまたはＤＥＮ−４ ＰＤＫ−４８ウイルスでの免疫は１回のみであったが、ヒトへの感染用量の高さが上位２つのＤＥＮ−１ ＰＤＫ−１３およびＤＥＮ−３ ＰＧＭＫ−３０／ＦＲｈＬ−３ウイルスについては、同じセロコンバージョン率を達成するには追加免疫が必要であった。

ＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３ウイルスワクチン候補（ＰＤＫ−５３とも略される）は、弱毒化に関するいくつかの測定可能な生物学的マーカーを有し、これらは温度感受性、小さいプラークサイズ、蚊Ｃ６１３６細胞培養における低下した複製、無傷の蚊における低下した複製、哺乳期マウスに対する神経毒性の喪失、およびサルにおけるウイルス血症の発症率の低下を含む。候補ＰＤＫ−５３ワクチンの治験は、ヒトでの安全性および免疫原性を実証した。さらに、ＰＤＫ−５３ワクチンは、ヒトワクチンレシピエントにおいてデングウイルス特異的Ｔ細胞記憶応答を誘導する。本明細書のいくつかの実施形態は、本願に開示のキメラ構築物に使用されるＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３の改善について記載する。

デング−２ウイルス骨格および別のデングウイルス血清型の少なくとも１つの構造タンパク質を有する免疫原性フラビウイルスキメラは、デングウイルスキメラの調製に用いることができ、デングウイルスキメラの製造方法が記載される。免疫原性デングウイルスキメラは、感染を最小化、抑制、または個体を１つ以上の血清型、例えばデングウイルス血清型ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４の単独または組合せによる感染に対し免疫する免疫原性組成物として、薬学的に許容される担体中、単独で、または組み合わせで提供される。組み合わされると、免疫原性デングウイルスキメラは、フラビウイルスの２つ以上の種または株による感染に対する同時の防御を与える多価ワクチン（例えば二価、三価、四価）として使用することができる。ある実施形態では、デングウイルスキメラは、既知デングウイルス血清型に対する二価、三価、または四価ワクチンとして有用な免疫原性組成物中で組み合わされるか、または異なるフラビウイルスに由来する１つ以上のタンパク質をコードする核酸を含むことにより、他の病原性フラビウイルスに対する免疫を与える。

いくつかの実施形態において、本願で提供される非病原性の免疫原性デングウイルスキメラは、弱毒化デング−２ウイルス（例えばＰＤＫ−５３）の非構造タンパク質遺伝子またはその等価物、および、対象においてそれに対する免疫原性を誘導しようとするフラビウイルスの１つ以上の構造タンパク質遺伝子またはその免疫原性タンパク質を含む。例えば、いくつかの実施形態は、ウイルス骨格として弱毒化デング−２ウイルスＰＤＫ−５３ゲノムと、ＰＤＫ−５３ゲノムのカプシド、プレメンブレン／メンブレン、またはエンベロープあるいはこれらの組合せをコードする１つ以上の構造タンパク質遺伝子であって、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３またはＤＥＮ−４、あるいは防御対象となる他のフラビウイルス、例えば異なるフラビウイルスまたは異なるデングウイルス血清型に由来する１つ以上の対応する構造タンパク質遺伝子で置換されている、１つ以上の構造タンパク質遺伝子とを含むキメラに関する。これらの実施形態に従って、本願に開示の核酸キメラは弱毒化デング−２ウイルスの機能性を有することができ、非病原性であるが、他のフラビウイルスに加え、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３またはＤＥＮ−４の構造遺伝子産物の抗原エピトープを発現し、免疫原性である（例えば、対象において遺伝子産物に対する免疫応答を誘導する）。その結果、これらのＤＮＡ構築物は感染性クローンからＲＮＡを転写するのに用いられ、このＲＮＡはＶｅｒｏ細胞に再び導入されてＰ１で新しい子孫ウイルスを生産する。これらの新子孫ウイルスはＰＤＫ−５３とは区別可能である。（例えばＰ１〜Ｐ１０を参照）。

別の実施形態において、核酸キメラは、限定するものではないが、弱毒化デング−２ウイルスに由来する非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列と、デング−４ウイルス単独または別のフラビウイルスとの組合せに由来する構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列とを有する核酸キメラとすることができる。他の実施形態において、弱毒化デング−２ウイルスは、１つ以上の突然変異アミノ酸を有するワクチン株ＰＤＫ−５３とすることができる（実施例参照）。これらの更なる突然変異は、弱毒生デング−２としての、または本願に開示のキメラ構築物としての望ましい使用特性を与える。いくつかの実施形態は、第２のデングウイルスのＣ、ｐｒＭまたはＥタンパク質のうちの１つ以上の構造タンパク質を含む。

他の態様は、キメラウイルスが、例えば対照ＰＤＫ−５３デング−２ゲノムに、標的デングウイルス血清型に対する免疫原性応答との干渉を低減させるためのヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、欠失または挿入を含んでもよいことを含む。これらの改変は、単独で、または本願に開示の例示的な改変と組み合わせて、構造タンパク質および非構造タンパク質になされてもよく、弱毒化ウイルスの継代により生成することができ、１種以上のデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導するための改善された組成物を得ることができる。

本願に開示されるある実施形態は、組換え技術を用いて必要な置換を適切な骨格ゲノムに挿入することによる本発明のキメラウイルスの製造方法を提供する。本願の他の実施形態は、確立された（例えば安全かつ有効な）弱毒生キメラウイルスを更なる改善のために継代させることに関する。ある実施形態では、本願で用いるデング−２骨格は、表３に提示される１つ以上の突然変異を含むことができる。他の実施形態において、本願のデング−デングキメラは表３に提示される１つ以上の突然変異を含むことができる。さらに他の実施形態において、デング−デングキメラは各キメラにつき、Ｄｅｎ−２／Ｄｅｎ−１、Ｄｅｎ−２／Ｄｅｎ−３またはＤｅｎ−２／Ｄｅｎ−４に関して表３に提示したような突然変異の全てを含むことができる。表３の構築物により示される弱毒生ウイルスを含む医薬組成物も企図される。例えば、一価、二価、三価、または四価組成物が、表３に示されるようなキメラおよび弱毒生デング−２ウイルスを用いる本願の用途に企図される。

ある実施形態において、本願で企図される弱毒生ＤＥＮ−２改変体は、医薬組成物に製剤化することができる。ここで、医薬組成物は単独で、またはデング−デングキメラあるいはデング−フラビウイルスキメラと組み合わせて投与することができる。ある実施形態において、二価、三価または四価組成物は、対象への単回の適用または複数回の適用で投与することができる。

フラビウイルスキメラ
デングウイルス型１〜４（ＤＥＮ−１からＤＥＮ−４）は蚊媒介性フラビウイルス病原体である。フラビウイルスゲノムは、５’非コード領域（５’−ＮＣ）、それに続くカプシドタンパク質（Ｃ）コード領域、それに続くプレメンブレン／メンブレンタンパク質（ｐｒＭ）コード領域、それに続くエンベロープタンパク質（Ｅ）コード領域、それに続く非構造タンパク質（ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５）をコードする領域、最後に３’非コード領域（３’ＮＣ）を含む。ウイルス構造タンパク質はＣ、ｐｒＭおよびＥであり、非構造タンパク質はＮＳ１〜ＮＳ５である。構造タンパク質および非構造タンパク質は、単一のポリプロテインとして翻訳され、細胞内プロテアーゼおよびウイルスプロテアーゼによってプロセシングされる。

フラビウイルスキメラは、デングウイルスまたはフラビウイルス科のウイルス種の１つの種または血清型に由来する非構造タンパク質遺伝子と、デングウイルスまたはフラビウイルス科のウイルス種の異なる種または血清型に由来するタンパク質遺伝子、例えば構造タンパク質遺伝子とを融合させることにより形成される構築物とすることができる。あるいは、本発明のフラビウイルスキメラは、デングウイルスまたはフラビウイルス科のウイルス種の１つの種または血清型に由来する非構造タンパク質遺伝子と、他のデングウイルス血清型または他のフラビウイルス科のウイルスから選択されるポリペプチドまたはタンパク質の合成をもたらす更なるヌクレオチド配列とを融合させることにより形成される構築物である。

他の実施形態において、本願で提供される非病原性かつ免疫原性のフラビウイルスキメラは、弱毒化デング−２ウイルスの非構造タンパク質遺伝子またはその等価物と、それに対する免疫原性を与えようとするフラビウイルスの１つ以上の構造タンパク質遺伝子またはその抗原性タンパク質とを含む。適切なフラビウイルスは、限定するものではないが、表１に挙げられたものを含む。

キメラの構築に用いられる他の適切なデングウイルスは、野生型、病原性ＤＥＮ−１ １６００７、ＤＥＮ−２ １６６８１、ＤＥＮ−３ １６５６２およびＤＥＮ−４ １０３６、ならびに弱毒化ワクチン株ＤＥＮ−１ ＰＤＫ−１３、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３、ＤＥＮ−３ ＰＭＫ−３０／ＦＲｈＬ−３およびＤＥＮ−４ ＰＤＫ−４８であり得る。ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４野生型／弱毒化ウイルスペアの間の遺伝子の差異は、そのウイルスゲノムによってコードされたアミノ酸配列における変化に沿って考慮される。

ＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３の配列表は、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３−Ｖ改変体に対応しており、ゲノムヌクレオチド５２７０位がＡからＴに突然変異し、ポリプロテインのアミノ酸１７２５位すなわちＮＳ３タンパク質のアミノ酸２５０位はバリン残基を含む。このヌクレオチド突然変異を含まないＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３改変体であるＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３−Ｅは、ＰＤＫ−５３−Ｖとはこの１つの位置のみで異なる。ＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３−Ｅはヌクレオチド５２７０位にＡを有し、ポリプロテインアミノ酸１７２５位、ＮＳ３タンパク質アミノ酸２５０位にグルタミン酸を有する。本明細書中の実施形態は、別個の宿主細胞（例えばＶｅｒｏ細胞、表１参照）で１回以上継代させた改変型ＰＤＫ５３を含むことが理解され、ここには本願で企図されるワクチン組成物での望ましい使用特性が創出される。

ある実施形態において、キメラの名称は、ＤＥＮ−２ウイルス特異的感染性クローン改変骨格、および他のデングウイルスまたは他のフラビウイルスの構造遺伝子（ｐｒＭ−ＥまたはＣ−ｐｒＭ−Ｅ）インサートに基づくことができる。デング−２用骨格のＤＥＮ−２の後に、挿入される構造遺伝子の株が続く。１つのＤＥＮ−２骨格改変体が数字名称の次の文字に反映される。キメラが構築された１つの特定のＤＥＮ−２骨格改変体は、ハイフンの後に置かれる下記の文字で示され、親１６６８１（Ｐ）、ＰＤＫ−５３−Ｅ（Ｅ）、またはＰＤＫ−５３−Ｖ（Ｖ）；最後の文字は親（Ｐ）株またはそのワクチン誘導体（Ｖ）に由来するＣ−ｐｒＭ−Ｅ構造遺伝子、あるいは親（Ｐ）株もしくはそのワクチン誘導体（Ｖ１）に由来するｐｒＭ−Ｅ構造遺伝子を示す。例えば、ＤＥＮ−２／１−ＶＰは、ＮＳ３−２５０のバリンおよび野生型ＤＥＮ−１ １６００７に由来するＣ−ｐｒＭ−Ｅ遺伝子を含む弱毒化ＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３Ｖ骨格を含むキメラを提供する；ＤＥＮ−２／１−ＶＶはデング−１のワクチン株ＤＥＮ−１ ＰＤＫ−１３とのＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３Ｖ骨格を提供する；ＤＥＮ−２／１−ＶＰ１はＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３Ｖ骨格および野生型ＤＥＮ−１ １６００７に由来するｐｒＭ−Ｅ遺伝子を提供する；ＤＥＮ−２／３−ＶＰ１はＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３Ｖ骨格および野生型ＤＥＮ−３ １６５６２に由来するｐｒＭ−Ｅ遺伝子を提供する；ＤＥＮ−２／４ＶＰ１はＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３Ｖ骨格および野生型ＤＥＮ−４ １０３６に由来するｐｒＭ−Ｅ遺伝子を提供する。本願に開示の他のキメラが同じ方式で指定される。

一実施形態において、本願に開示のキメラは弱毒化デング−２ウイルスＰＤＫ−５３ゲノムをウイルス骨格として含み、ＰＤＫ−５３ゲノムのＣ、ｐｒＭおよびＥタンパク質またはそれらの組合せをコードする構造タンパク質遺伝子は、デング−１、デング−３またはデング−４ウイルスの、および任意選択で、防御対象となる別のフラビウイルス、例えば異なるフラビウイルスまたは異なるデングウイルス株の対応する構造タンパク質遺伝子で置換されていてもよい。

非構造タンパク質領域において、ＧｌｙからＡｓｐへの（野生型からＰＤＫ−５３への）突然変異が非構造タンパク質ＮＳ１−５３（ゲノムヌクレオチド２５７９位）で発見され；ＬｅｕからＰｈｅへの（野生型からＰＤＫ−５３への）突然変異が非構造タンパク質ＮＳ２Ａ−１８１（ゲノムヌクレオチド４０１８位）で発見され；ＧｌｕからＶａｌへの（野生型からＰＤＫ−５３への）突然変異が非構造タンパク質ＮＳ３−２５０（ゲノムヌクレオチド５２７０位）で発見され；ＧｌｙからＡｌａへの突然変異（野生型からＰＤＫ−５３への）が非構造タンパク質ＮＳ４Ａ−７５（ゲノムヌクレオチド６５９９位）で発見された。本発明の弱毒生ＤＥＮ−２ウイルスは、表３の任意のキメラまたは弱毒生デング−２ウイルスに提示されるような突然変異をさらに含む。

ＰＤＫ−５３ウイルス株は、ゲノムヌクレオチド５２７０に混合遺伝子型を有する。ウイルス集団のかなりの部分（約２９％）は、ＮＳ３−２５０−Ｖａｌ突然変異ではなく、野生型ＤＥＮ−２ １６６８１ウイルスに存在する突然変異していないＮＳ３−２５０−Ｇｌｕをコードする。両方の遺伝的変異体は非病原性であるため、この突然変異は非病原性キメラにおいて必須ではない。

以前、弱毒化ＰＤＫ−５３ウイルス株の非病原性が、非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列および５’非コード領域における突然変異に起因する可能性があることが発見された。例えば、ＮＳ１−５３における単一の突然変異、ＮＳ１−５３および５’ＮＣ−５７における２つの突然変異、ＮＳ１−５３およびＮＳ３−２５０における２つの突然変異、ならびにＮＳ１−５３、５’ＮＣ−５７およびＮＳ３−２５０における３つの突然変異は、ＤＥＮ−２ウイルスの弱毒化をもたらす。したがって、これらの位置にそのような非保存的アミノ酸置換またはヌクレオチド置換を含むあらゆるデング−２ウイルスのゲノムを、本願に開示の改変型ＰＤＫ−５３ウイルスを誘導するためのベース配列に使用することができる。所望であれば、５’非コード領域のステム／ループ構造のステムにおける別の突然変異が、更なる非病原性表現型安定性を提供し得る。この領域への突然変異は、ウイルス複製に重要な潜在的な二次構造を妨害する。ＤＥＮおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスウイルスにおけるこの短い（たった６ヌクレオチド残基長）ステムにおける単一の突然変異は、ヘアピン構造の形成を妨害する。ステム構造における更なる突然変異は、ウイルス生存能力を維持しつつ、この位置の復帰の可能性を低下させる。

本願に開示の突然変異は、限定するものではないが、対象とする細胞株（例えばＶｅｒｏ細胞）で一度継代された更なる特徴を有する自然発生または選択されたクローンを含む当分野において既知の任意の方法によって達成することができる。当業者には、本願に記載のような、そして当分野で周知のような病原性スクリーニングアッセイを使用して病原性骨格構造と非病原性骨格構造とを識別可能であることが理解される。

フラビウイルスキメラの構築
本願に開示のフラビウイルスキメラは、対応するＰＤＫ−５３遺伝子を除去し、それをデング−１、デング−３またはデング−４ウイルス遺伝子または当分野で既知の他の遺伝子に置換する組換え操作を用いて、それに対する免疫が望まれるフラビウイルスの１つ以上の構造タンパク質遺伝子をＰＤＫ−５３デングウイルスゲノム骨格にスプライシングすることにより、または当分野で知られている他の方法により製造することができる。

別法として、配列表に提供された配列を用いて、フラビウイルスタンパク質をコードする核酸分子を既知の核酸合成技術を用いて合成し、適切なベクターに挿入してもよい。したがって、非病原性かつ免疫原性のウイルスは、当業者に既知の組み換え操作技術を用いて製造される。

標的遺伝子は、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３、ＤＥＮ−４または他のフラビウイルスに関して、対象とするフラビウイルス構造タンパク質をコードする骨格に挿入することができる。挿入されるフラビウイルス遺伝子は、Ｃタンパク質、ＰｒＭタンパク質および／またはＥタンパク質をコードする遺伝子とすることができる。デング−２骨格に挿入される配列は、ＰｒＭ構造タンパク質およびＥ構造タンパク質の両方をコードすることができる。デング−２骨格に挿入される配列は、Ｃ構造タンパク質、ｐｒＭ構造タンパク質およびＥ構造タンパク質の全てまたはそれらのうちの１つをコードすることができる。

他のフラビウイルスまたはデングウイルス血清型の構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む適切なキメラウイルスまたは核酸キメラは、非病原性を示す前述した弱毒表現型マーカーについてそれらをスクリーニングすることにより、また、免疫原性についてそれらをスクリーニングすることにより、ワクチンとしての有用性について評価することができる。抗原性および免疫原性は、当業者に知られている日常的なスクリーニング手順により、フラビウイルス抗体または免疫反応性血清とのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ反応性を利用して評価することができる。

デングウイルスワクチン
ある実施形態において、キメラウイルスおよび核酸キメラは、免疫原またはワクチンとして有用な弱毒生ウイルスを提供することができる。いくつかの実施形態は、デング−４ウイルスに対する高い免疫原性を示すと同時に、危険な病原性または致死的効果をもたらさないキメラを含む。

対象においてＤＨＦ／ＤＳＳの発症率を低減するため、ウイルスの全４種の血清型に対する同時免疫を提供する四価ワクチンが必要とされている。四価ワクチンは、本願の弱毒生デング−２ウイルスと上述したデング−２／１、デング−２／３、およびデング−２／４キメラとを、多価ワクチンとしての投与に適切な薬学的担体中で組み合わせることにより製造される。

本発明のキメラウイルスまたは核酸キメラは、病原性または弱毒化ＤＥＮ−２ウイルス骨格に、野生型または弱毒生ウイルスのいずれかの構造遺伝子を含むことができる。例えば、キメラは野生型ＤＥＮ−４ １０３６ウイルス、その候補ワクチン誘導体の構造タンパク質遺伝子を、いずれかのＤＥＮ−２バックグランドにおいて発現してもよい。

本願に記載のキメラに用いられるウイルスは、当分野で既知の技術を用いて増殖させることができる。増殖培養物の生存能力および表現型特徴を評価するために、その後、ウイルスプラーク滴定が実施され、プラークがカウントされる。野生型ウイルスを培養細胞株を通して継代させ、弱毒化候補開始材料を誘導することができる。

キメラ感染性クローンは、入手できる様々なデング血清型クローンから構築することができる。所望であれば、ウイルス特異的ｃＤＮＡフラグメントのクローニングを遂行してもよい。構造タンパク質遺伝子または非構造タンパク質遺伝子を含むｃＤＮＡフラグメントは、デングウイルスＲＮＡから、様々なプライマーを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅される。増幅されたフラグメントは、他の中間体クローンの切断部位にクローニングされる。中間体キメラデングウイルスクローンは、その後、挿入されたデングウイルス特異的ｃＤＮＡの正確性を評価するために配列解析される。

デング血清型ウイルスの構造タンパク質遺伝子領域および／または非構造タンパク質遺伝子領域をベクターに挿入することにより構築されるフルゲノム長キメラプラスミドは、当業者に周知の組換え技術を用いて得ることができる。

ヌクレオチドおよびアミノ酸解析
ＤＥＮ−２ １６６８１ウイルスのＮＳ１−５３−Ｇｌｙは、今日までに配列解析されているダニ媒介性ウイルスを含むほぼ全てのフラビウイルスにおいて保存されているため、ＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３ワクチンウイルスにおけるＮＳ１−５３突然変異は、このウイルスの弱毒表現型に重要である。ＤＥＮ−４ワクチンウイルスはまた、ＮＳ１タンパク質の２５３位にアミノ酸突然変異を含むことができる。この位置は、ＤＥＮ−４ ＰＤＫ−４８ワクチンウイルスにおいてはＧｌｎからＨｉｓへの突然変異であり、デングウイルスの全４種の野生型血清型でＧｌｎである。このＧｌｎ残基は、フラビウイルス属の中で、デングウイルスに特有である。ＮＳ１タンパク質は、フラビウイルスに感染した細胞から分泌される糖タンパク質である。これは感染細胞の表面に存在し、ＮＳ１特異的抗体はウイルスに感染した個体の血清に存在する。ＮＳ１タンパク質で免疫された動物またはＮＳ１特異的抗体で受動的に免疫された動物の防御が報告されている。ＮＳ１タンパク質は早期ウイルスＲＮＡ複製に関与すると考えられる。

ＤＥＮ−１、−２、−３および−４弱毒化株のＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ４Ａ、およびＮＳ４Ｂタンパク質に生じる突然変異は性質上保存的である。ＤＥＮ−２およびＤＥＮ−４ワクチンウイルスのそれぞれＮＳ４Ａ−７５およびＮＳ４Ａ−９５突然変異は、デングウイルスの間のアミノ酸保存部位に生じたが、一般的なフラビウイルスの間では生じなかった。

フラビウイルスＮＳ３タンパク質は少なくとも２つの認識された機能を有する。すなわち、ウイルスプロテイナーゼおよびＲＮＡヘリカーゼ／ＮＰＴアーゼである。６９８ａａ長（ＤＥＮ−２ウイルス）ＮＳ３タンパク質は、アミノ末端セリンプロテアーゼドメイン（ＮＳ３−５１−Ｈｉｓ、−７５−Ａｓｐ、−１３５−Ｓｅｒ触媒三残基）およびそれに続くＲＮＡヘリカーゼ／ＮＴＰアーゼ機能に関する配列モチーフ（ＮＳ３−１９６−ＧＡＧＫＴ（配列番号１４７）、−２８４−ＤＥＡＨ、−４５９−ＧＲＩＧＲ）を含む。ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、またはＤＥＮ−３ウイルスのＮＳ３タンパク質における突然変異は、いずれも認識されたモチーフ内には生じなかった。ＤＥＮ−１ ＰＤＫ−１３ウイルスにおけるＮＳ３−５１０ ＴｒｙからＰｈｅへの突然変異は保存的である。野生型ＤＥＮ−２、−３および−４ウイルスはこの位置にＰｈｅを含むため、ＴｒｙからＰｈｅへの突然変異がＤＥＮ−１ウイルスの弱毒化に寄与することは考えにくい。ＤＥＮ−１ ＰＤＫ−１３ウイルスにおけるＮＳ３−１８２ ＧｌｕからＬｙｓへの突然変異は、大部分の蚊媒介性フラビウイルスでＡｓｐまたはＧｌｕとして保存された位置に生じており、弱毒化に何らかの役割を担っている可能性がある。この突然変異はＧＡＧＫＴヘリカーゼモチーフの１５アミノ酸残基上流に位置した。以前の報告で述べたように、ＤＥＮ−２ １６６８１ウイルスにおけるＮＳ３−２５０−Ｇｌｕは黄熱ウイルスを除く全ての蚊媒介性フラビウイルスで保存されている。

核酸プローブは、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４ウイルスをコードする核酸分子またはその相補的配列と選択的にハイブリダイズする。「選択的」または「選択的に」という用語は、他の核酸とハイブリダイズしてデングウイルスの十分な検出を妨げることのない配列を意味する。したがって、ハイブリダイズ用核酸配列の設計において、選択性は試料中に存在する他の成分に依存するであろう。ハイブリダイズ用核酸は、ハイブリダイズする相手である核酸のセグメントと少なくとも７０％相補性を有しなければならない。核酸を説明するために本願で使用される場合、「選択的にハイブリダイズする」という用語は、偶発的に無作為にハイブリダイズする核酸を含まず、したがって、「選択的なハイブリダイズ」と同じ意味を持つ。本発明の選択的にハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズする配列のセグメントと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、および９９％、好ましくは８５％以上の相補性を有し得る。

コード核酸またはその核酸の相補鎖または逆鎖に選択的にハイブリダイズする配列、プローブおよびプライマーが企図される。核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、その核酸に機能的な種特異的ハイブリダイゼーション能力を維持させる限り、軽度の改変や置換を生じさせてもよい。「プローブ」は、相補的核酸配列と選択的にハイブリダイズしてそれを検出または増幅するためのプローブまたはプライマーとして使用可能な核酸配列を意味し、そのプローブは長さが約５〜１００ヌクレオチド、または好ましくは約１０〜５０ヌクレオチド、または最も好ましくは約１８〜２４ヌクレオチドの間で変動可能である。

プライマーとして用いられる場合、組成物は、標的分子の異なる領域にハイブリダイズして所望の領域を増幅する好ましくは少なくとも２つの核酸分子を含む。プローブまたはプライマーの長さに応じて、標的領域は７０％相補的塩基から完全相補性までの範囲とすることができ、依然としてストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。例えば、デングウイルスの存在を検出する目的のために、ハイブリダイズ用核酸（プローブまたはプライマー）とそれがハイブリダイズする配列との間の相補性の程度は、少なくとも、他の有機体から核酸とのハイブリダイゼーションを識別するのに十分である。

ＤＥＮ−４、ＤＥＮ−３またはＤＥＮ−１ウイルス（例えば構造要素）をコードする核酸配列を、プラスミド等のベクターに挿入することができ、生命体において組換え発現させて（例えばデング−２骨格中に）組換えデングウイルスペプチドおよび／またはポリペプチドおよび／またはウイルスを産生させることができる。

核酸検出方法
本願に記載のワクチンウイルスの各々の診断である迅速遺伝子試験が本発明により提供される。本発明のこの実施形態は、ウイルス血症を発症したワクチン接種されたヒトの血清から単離されたウイルスの解析を促進し、また、候補ワクチンウイルスで免疫された非ヒト霊長類におけるウイルス血症の特徴解析を促進する。

配列は、後述するように、逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）、ならびに、ｃＤＮＡアンプリコンを増幅するように設計されたフォワードアンプライマーおよびリバースアンプライマーを用いて、ウイルスゲノムＲＮＡテンプレートから増幅されたｃＤＮＡアンプリコンの検出を報告するのに役立つ診断用ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを含む。ある例において、アンプライマーの１つはワクチンウイルス特異的突然変異をアンプライマーの３’末端に含むように設計されている。この設計は試験をワクチン株に対し更に効果的に特異的にする。その理由は、標的部位でのプライマーの伸長および結果的に増幅は、ウイルスＲＮＡテンプレートがその特定の突然変異を含む場合にのみ生じるためである。

自動化ＰＣＲに基づく核酸配列検出システム、あるいは核酸検出のための他の既知の技術を用いることができる。ＴａｑＭａｎアッセイは、試料核酸テンプレートからＰＣＲ生成されたアンプリコンのリアルタイムの可視化および定量の自動化が可能な高度に特異的かつ感度の高いアッセイである。ＴａｑＭａｎ（登録商標）は、特定の配列の存在または不在を判定することができる。このアッセイでは、フォワードおよびリバースプライマーは標的突然変異部位の上流および下流にそれぞれアニーリングするように設計される。いずれかのアンプライマーよりも約１０℃高い融解温度を有するように設計され、ワクチンウイルス特異的ヌクレオチド突然変異またはその相補体（検出されるＲＴ／ＰＣＲアンプリコンの鎖に依存する）を有する特異的検出プローブが、このアッセイの第３のプライマー成分を構成する。

ワクチンウイルスゲノムの１つにおいて突然変異した位置を特異的に検出するように設計されたプローブは、ワクチン特異的ヌクレオチドをプローブの中央に含み得る。このプローブは、ウイルスＲＮＡテンプレートがワクチンウイルス特異的である場合、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおいて検出可能な蛍光をもたらし得る。しかしながら、野生型ＤＥＮウイルスに由来するゲノムＲＮＡテンプレートでは、単一ヌクレオチドミスマッチ（親ウイルスがＤＥＮウイルスである場合）、あるいは可能性として２つ以上のミスマッチ（他の野生型ＤＥＮウイルスに生じ得る）に起因して、プローブハイブリダイゼーションの効率が低下し得、意味のある蛍光をもたらさないであろう。ＤＮＡポリメラーゼは、ミスマッチしたプローブを切断してレポーター色素を放出するよりも、ミスマッチしたプローブをＲＴ／ＰＣＲアンプリコンテンプレートから外す傾向が強い（ＴａｑＭａｎ（登録商標）対立遺伝子識別（Ａｌｌｅｌｉｃ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）アッセイ、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））。

診断的遺伝子試験の１つの方策は、分子標識を利用することである。分子標識方策は、アンプリコンのＲＴ／ＰＣＲ増幅のための、および、プローブの両端にレポーター色素およびクエンチャー色素を含むプローブによるアンプリコン内での特異的配列の検出のためのプライマーも利用する。このアッセイでは、プローブはステム−ループ構造を形成する。分子標識アッセイは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイで用いられるものとは異なるクエンチャー色素およびレポーター色素を採用する。

医薬組成物
本願の実施形態は、対象に対する、ｉｎ ｖｉｖｏ薬剤投与に適した生物学的に適合性の形態での組成物の投与を提供する。「ｉｎ ｖｉｖｏ投与に適した生物学的に適合性の形態」は、活性作用剤（例えば、実施形態の医薬化学物質、タンパク質、遺伝子）の投与される形態であって、活性作用剤の治療効果があらゆる毒性効果を上回る形態を意味する。薬学的に活性な量の医薬組成物の投与は、所望の結果を達成するのに必要な用量および期間での有効な量と定義される。例えば、薬学的に活性な量の化合物は、個体の病気の状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体の性能等の要因に応じて変動し得る。投薬レジメンは、最適な治療的応答を提供するように調整され得る。

一実施形態において、化合物（例えば実施形態の医薬化合物、タンパク質、ペプチド等）は好都合な様式、例えば、皮下、静脈内、経口投与、吸入、皮内、経皮適用、経膣適用、局所適用、鼻腔内または直腸投与により投与されてもよい。投与の経路に応じて、活性化合物は保護バッファー（例えばＦＴＡ、Ｆ１２７／トレハロース／アルブミン）中に含有されてもよい。一実施形態において、組成物は経口投与され得る。別の実施形態において、組成物は静脈内投与され得る。一実施形態において、組成物は鼻腔内投与、例えば吸入され得る。さらに別の実施形態において、組成物は無針システム（例えばＰｈａｒｍａｊｅｔ（商標））または他の皮内投与システムを用いて皮内投与され得る。

組成物は、適切な担体または希釈剤中で対象に投与されるか、酵素阻害剤と共に、またはリポソーム等の適切な担体中で投与されてもよい。「薬学的に許容される担体」という用語は、本願で使用される場合、生理食塩水や緩衝剤水溶液等の希釈剤を含むことを意図している。化合物を、不活性化を防ぐ材料でコーティングするか、そのような材料と共に投与する必要がある場合もある。活性作用剤は非経口的に、または腹腔内に投与されてもよい。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物ならびに油中に懸濁液を調製してもよい。保管および使用の通常の条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐ保存剤または他の安定化製剤（例えばＦＴＡ）を含有してもよい。

注射用に適した医薬組成物は、当分野で既知の手段により投与され得る。例えば、滅菌水溶液（水溶性である場合）または懸濁液、および滅菌注射用溶液または懸濁液の即席調製用の滅菌粉末が使用され得る。全ての場合において、組成物は滅菌することができ、注射可能である程度に流体とすることができる。製造および保管条件下で安定であってもよく、細菌および菌類等の微生物の汚染作用に対し保護されていてもよい。薬学的に許容される担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。例えば、レシチン等のコーティングの使用により、懸濁液の場合には要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物の抑制は、加熱、洗浄性の物質への曝露、照射殺菌あるいは様々な抗細菌剤または抗菌剤の添加により達成することができる。

滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物（例えば、１種以上のデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導する化合物）を適切な溶媒に、必要に応じて上記に列挙した材料との１つ以上の組み合わせで含有させ、濾過滅菌することにより調製することができる。

調剤されたら、溶液が投与製剤と適合した態様で、治療上有効な量となるように投与される。製剤は、上述した注射用溶液のタイプなどの様々な剤形で容易に投与される。組成物は、筋肉内、皮下、皮内、鼻腔内および腹腔内投与に特に適していると考えられる。１：１、１：２または他の比率（例えば所与のデングウイルス血清型のＰＦＵ）などの特定の比率が模索されてもよい。

活性治療剤は、混合物中に所定の比率で調剤されてもよい。単一用量または複数の用量を、所与の状況（例えば旅行の前、デング熱の流行前）に対する適切なスケジュールで投与することができる。

別の実施形態において、鼻腔用溶液またはスプレー、エアロゾルまたは吸入剤が対象化合物の送達に用いられてもよい。他の投与方法に適切な更なる製剤は、坐薬およびペッサリを含む。

ある製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン酸ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の賦形剤を含むことができる。

医薬組成物は、活性材料を体からの迅速な排出から保護する担体、例えば持続放出製剤又はコーティング等と共に調製されてもよい。そのような担体は、限定するものではないが、マイクロカプセル化送達システム、および生分解性、生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸および他の既知のもの）等の制御放出製剤を含む。

医薬組成物は、移植の副作用を抑制または緩和するのに、かつ／または拒絶反応を軽減または抑制するのに効果的な量および頻度で投与される。厳密な用量および治療の継続期間は、既知の試験プロトコルを用いて、または組成物を当分野で既知のモデルシステムで試験し、そこから推定することにより経験的に決定され得る。また、用量は症状の重症度とともに変動し得る。医薬組成物は一般に、治療上有効な効果を発揮し、かつ望ましくない副作用を最小化するように製剤され、投与される。一般に、約１０^２〜１０^６ＰＦＵの用量範囲を最初に投与することができ、任意選択で、必要に応じて２回目の投与を３０日以内から最大１８０日後までに続けてもよい。ある実施形態において、対象は本願に開示の一価、二価、三価または四価の組成物の二重の投与を受けてもよく、ここで、組成物は単一組成物混合物であるか、異なるデングウイルス血清型の所定の組成物を有する。いくつかの実施形態において、ＤＥＮ２／４キメラが弱毒生デング−１等の他のデングウイルス血清型よりも高濃度で存在してもよい。

任意の特定の対象について、個々の必要性に従って特定の投薬レジメンが時間をかけて調整されてもよいことは明らかであろう。
一実施形態において、本願に開示の組成物は対象に皮下または皮内投与することができる。

弱毒生デングウイルスを含む医薬組成物は、個体、特にヒトに対し、例えば皮下、筋肉内、鼻腔内、経口、局所、経皮、非経口、胃腸内、経気管支、および経肺胞投与されてもよい。局所的投与は、治療上有効量のセリンプロテアーゼ阻害剤を含有する局所適用クリーム、ゲル、リンス液等により達成される。経皮投与は、セリンプロテアーゼ阻害剤が皮膚を浸透し血流へ入るのを可能にするクリーム、リンス液、ゲル等の適用により達成される。また、浸透圧ポンプを投与に用いてもよい。必要な用量は、治療される特定の症状、投与方法および体からの分子の排除速度と共に変動し得る。

本発明の方法の特定の実施形態において、対象はヒトまたは獣医動物および／または家畜化動物あるいは家畜または野生動物等の哺乳類であってもよい。
治療方法
本発明の一実施形態において、方法は、本願で企図される弱毒生および／またはキメラウイルス構築物の一価、二価、三価または四価製剤を用いたデングウイルス血清型に対する免疫応答の誘導を提供する。

本発明の実施形態は、下記の非限定的な実施例によってさらに例証される。これらはいかなる場合にも、それらの範囲に限定を課すものと解釈されないものとする。反対に、本明細書中の説明を読めば、これらの様々な他の実施形態、変更例、および等価物が当業者には明確に理解され、それら自体を、本発明の趣旨または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく示唆し得る。

〔実施例〕
以下の実施例は、本明細書に示される特定の実施形態を実証するために含められる。以下の実施例において開示された技術が、本明細書に開示される実施において十分に機能することが見出されている代表的な技術に従っており、よってその実施の好ましい形態を構成するとみなすことができることは、当業者には理解されるはずである。しかしながら、当業者は本開示に鑑みれば、開示されるある種の実施形態では、本願の趣旨および範囲から逸脱することなく、多くの変更が可能であり、依然として同様のまたは類似の結果を得られることを理解するはずである。

〔実施例１〕
いくつかの例示的方法において、本願では「マスターウイルスシード（ＭＶＳ）」と呼ぶものを作製するために使用される組成物が開示される。これらの組成物は、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３、およびＤＥＮ−４等の１つ以上の弱毒生デングウイルスから誘導され得る。特定の方法では、組成物は、ＤＥＮＶａｘ−１、ＤＥＮＶａｘ−２、ＤＥＮＶａｘ−３、およびＤＥＮＶａｘ−４と呼ばれる本願に開示される特定の構築物を含むがこれらに限定されない１つ以上の弱毒生デングウイルスから誘導され得る。他の例示的方法において、これらの組成物を製造し特徴解析するのに用いられる方策が提供される。さらに他の実施形態において、四価デングウイルス製剤およびこれらの製剤の遺伝子のおよび表現型の特徴解析が提供される。

プレマスターＤＥＮＶａｘウイルスの製造および解析
デングウイルス（例えばＤＥＮＶａｘ）の連続的増幅および精製等の特定の手順を実施してプレマスターデングウイルスシードを作製した。まず、完全長組換えＤＥＮＶａｘ ｃＤＮＡから転写されたウイルスＲＮＡを産生の保証された細胞（例えばＶｅｒｏ細胞）に導入することによりＤＥＮＶａｘウイルスを再誘導して、Ｐ１（継代１）ウイルスシードを得た。デング−１からデング−４の各々からの４つのＰ１ウイルスを、続いて増幅し、プラークを精製して候補プレマスターワクチンＰ７シードを得た（表１参照）。特定の試験を実施してデングウイルスの各継代を解析した。例えば、完全長ゲノム配列解析により、Ｐ２（継代２）シードウイルスの全４種が、それらの同種の祖先である、研究的に誘導されたリサーチグレードの候補ワクチンウイルスと遺伝子的に同一であることが実証された。元のプラーク表現型もＰ２ウイルスで維持されていた。デングウイルスの各血清型（例えばＤＥＮＶａｘ１〜４）についてＰ２シードから６つのプラーク精製ウイルス（Ｐ３Ａ〜Ｆ）を単離し、各単離プラークを更に２回、直接プラーク精製した。各ウイルスの３回目のプラーク精製物（Ｐ５）をＶｅｒｏ細胞で２度増幅し（Ｐ６Ａ〜ＦおよびＰ７Ａ〜Ｆ）、潜在的なプレマスターＰ７ＤＥＮＶａｘシードを作成した（表１）。

Ｐ７ ＤＥＮＶａｘシードの特徴解析、例えばＰ７シードのゲノム配列およびプラーク表現型の解析、およびＰ２シードとの比較（表２）のために、いくつかの試験を更に実施した。Ｐ７ウイルスのプラーク表現型はＰ２シードに大体類似していた。いくつかの例示的実験において、ウイルス力価をモニタリングした。Ｐ７シードのうち、５つのウイルスを除く大部分でウイルス力価は６．０ ｌｏｇ ｐｆｕ／ｍｌ超に達した。Ｖｅｒｏ細胞での１０回以上の連続継代後の６０を超える候補ワクチンウイルスシードのゲノム配列解析は、ＤＥＮＶ−２ ＰＤＫ−５３遺伝子ベクターの３つの主要な弱毒化決定要因のうちＮＳ１−５３およびＮＳ３−２５０に復帰事象がないことを示した。これは、これらの２つの位置が候補ワクチンウイルスシードにおいて非常に安定であることを示唆している。これら２つの部位について、フォワードおよびリバース両方の配列解析から生成された、２４の候補株の全配列クロマトグラムは、ＮＳ１−５３およびＮＳ３−２５０位置に明らかな僅かなヌクレオチド集団も一切なく相同であった。ＮＳ１およびＮＳ３部位とは反対に、多数回連続継代されたリサーチグレードのワクチンウイルスからは、５’ＮＣＲ−５７弱毒化位置で異なるレベルの復帰が確認された。これは、この位置が細胞培養での多数回の継代後、ＮＳ１およびＮＳ３よりも安定でない可能性があることを示唆している。そのため、５’ＮＣＲ−５７位置における復帰率をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで正確に測定するため、高感度ミスマッチ増幅アッセイ（ＴａｑＭＡＭＡ）を開発した。いくつかの研究において、全２４のＰ７シードの５’ＮＣＲ−５７復帰率をＴａｑＭＡＭＡで測定した。アッセイ中、各ウイルスにつきインプットのウイルスＲＮＡの濃度に応じて、ＴａｑＭＡＭＡの感度限界の範囲は０．０１％〜０．０７％の復帰率となった。これは、コンセンサスゲノム配列解析により検出可能な感度限界である１０〜３０％の復帰率よりも遥かに感度が高い。得られたデータは、２４のＰ７ウイルスのうち１５で復帰が最少または検出不能（＜０．０７％）であり、１つのウイルス（ＤＥＮＶａｘ−３−Ｄ）でほぼ１００％の復帰であり、８つのウイルス（１つのＤＥＮＶａｘ−１、１つのＤＥＮＶａｘ−２、２つのＤＥＮＶａｘ−３、および４つのＤＥＮＶａｘ−４）で０．０８％から１２．８５％の範囲の部分的復帰であったことを示している（表２）。２４のＰ７ウイルスのうち、ＴａｑＭＡＭＡで測定された５’ＮＣＲ５７復帰が低レベルであった１６種について、完全長ゲノム配列解析を実施した。配列決定されたウイルスは他の２つのＤＥＮＶａｘ弱毒化決定要因（ＮＳ１−５３、ＮＳ３−２５０）を維持しており、全てが、元の操作した組換えｃＤＮＡクローンに存在しない更なる突然変異を獲得していた（表２）。１つの例示的標的ワクチン組成物において、ＤＥＮＶａｘ−１−Ａ、ＤＥＮＶａｘ−２−Ｆ、ＤＥＮＶａｘ−３−Ｆ、およびＤＥＮＶａｘ−４−Ｆを、各血清型について標的プレマスターシードとして選択した。その理由は、これらの遺伝子型およびプラーク表現型が、元々設計されたワクチン組換え体のそれらに最もよく似ていたためである。ＤＥＮＶａｘ−１−Ａ、ＤＥＮＶａｘ−２−Ｆ、およびＤＥＮＶａｘ−４−Ｆは２つの、ＤＥＮＶａｘ−３−Ｆは１つの非同義突然変異を有していた。この証拠は、これらの４つのプレマスターシードで観察されたこれらの更なる突然変異がウイルスの安全性の問題または免疫原性の変更を生じないことを示唆している。ＭＶＳを作製するために、これらのプレマスターシードを更に増幅した（Ｐ７と表されるマスターシード、表１）。

本願で提供される例示的な方法は、ワクチン保証Ｖｅｒｏ細胞を形質転換してワクチンウイルスを生成するために、純粋供給源としてクローニングされたｃＤＮＡプラスミドからｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたウイルスＲＮＡ精製物を用いた。製造されたワクチンシードが最適な純度および遺伝子安定性であるようにするため、製造工程には連続的プラーク精製およびフルゲノム配列解析を含めた。ＤＥＮＶａｘの各血清型の潜在的なプレマスターシードとして、６つのクローニングウイルスを調製した。ＴａｑＭＡＭＡおよび完全ゲノム配列解析を含むゲノム解析により、ならびにウイルスプラーク表現型の特徴解析により、各血清型（血清型１〜４）につき、マスターウイルスシード生成に進めるためのプレマスターシードが選択された。選択されたプレマスターシードの復帰は５’ＮＣＲ−５７位置で検出不能であった（＜０．０１％または＜０．０７％）。これらのゲノムには１または２個のアミノ酸置換があり、以前に観察された小プラークの表現型を維持した。

〔実施例２〕
いくつかの例示的方法において、マスターウイルスシード、ワーキングウイルスシードおよびバルクウイルスシードの組成物、ならびにそれらの遺伝子のおよび表現型の特徴解析が説明される。これらの組成物は、臨床材料の製造、そして究極的には市販のワクチン供給のために提供される。製造されたワクチンシードの組成物が、治験材料の製造に最適な純度および遺伝子安定性であるようにするため、製造工程には連続的プラーク精製およびフルゲノム配列解析を含めた。

ＭＶＳ、ＷＶＳ、およびＢＶＳの製造および製造品質管理
いくつかの研究では、保証されたＶｅｒｏ細胞中でプレマスターＰ７シードを増幅することにより４ＤＥＮＶａｘのＭＶＳを製造した。他の研究では、ＭＶＳを用いて細胞ファクトリーで大量のＷＶＳを作製した。さらに、ＤＥＮＶａｘのＢＶＳストックをＷＶＳから増幅し、ヒト治験用の四価薬剤製品混合物として製剤化した。製品リリースの品質管理は、ＭＶＳ、ＷＶＳ、およびＢＶＳの全てについての同一性、感染力価、無菌性、マイコプラズマ、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ外来物質（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔ）試験を含むがこれらに限定されないいくつかの例示的方法で実施された。全てのシードが、血清型特異的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いたウイルス同一性試験に合格し、これは、その血清型に対応する正の増幅および異種血清型の負の増幅を示した（データは示されていない）。マイコプラズマおよび外来物質は、ＭＶＳ、ＷＶＳ、またはＢＶＳストックでは検出されなかった。

ＭＶＳ、ＷＶＳ、およびＢＶＳの遺伝子解析
ある例示的な方法において、選択されたプレＭＶＳ（Ｐ７）からのＭＶＳの作成後、上記で選択された株を生成し、個々のウイルスＲＮＡを再度配列解析した。完全長ゲノム配列解析により、ＤＮＶａｘ−１のＭＶＳはそのプレマスターシードと同一であったが、ＷＶＳおよびその後のＢＶＳは、Ｅ−４８３およびＮＳ４Ｂ−１０８に２つの更なる置換を獲得したことが判明した（表２および３参照）。Ｅ−４８３のＡｌａ置換は、ＭＶＳでは遺伝子型の一部を代表したが、ＢＶＳでは主要な遺伝子型となった。ＤＥＮＶａｘ−２およびＤＥＮＶａｘ−３はそれらのプレマスターシードのそれぞれと同一であった（表２および３）。ＤＥＮＶａｘ−２ ＭＶＳはそのマスターシードと同一であり、ＷＶＳおよびＢＶＳはＮＳ４Ａ−３６およびＮＳ４Ｂ−１１１に２つの更なる突然変異を有した。どちらの突然変異も、ＷＶＳでは部分的であり、ＢＶＳでは主要な遺伝子型であった。ＤＥＮＶａｘ−３のＭＶＳもやはりそのプレマスターシードと同一であったが、ＷＶＳおよびＢＶＳはＮＳ４Ａ−２３に更なるａａ置換を含んでいた。ＤＥＮＶａｘ−４ ＭＶＳは、ＭＶＳの製造中、ＮＳ２Ａ−９９位置に更なる（ＬｙｓからＬｙｓ／Ａｒｇ混合遺伝子型への）アミノ酸突然変異を獲得した（表３）。そのＷＶＳおよびＢＶＳはＮＳ２Ａ−９９Ｌｙｓ／Ａｒｇ混合遺伝子型を維持し、ＢＶＳは更にＮＳ４Ｂ−２３８Ｓｅｒ／Ｐｈｅ混合遺伝子型を有した。コンセンサス配列結果は、ＭＶＳ、ＷＶＳおよびＢＶが、５’ＮＣＲ−５７、ＮＳ１−５３、およびＮＳ３−２５０位置の３つの弱毒化遺伝子決定要因を保持したことも裏付けた。ＴａｑＭＡＭＡによる最低安定性弱毒化位置の解析では、５’ＮＣＲ−５７復帰率がＭＶＳでは＜０．７％から０．１３％であり、ＷＶＳでは≦０．０７％であり、ＢＶＳでは＜０．０７から０．２１％であったことが実証された。５’ＮＣＲ−５７位置での３％の復帰は、ワクチンロットの受け入れについての最大許容率であると考えられた（表３）。

フルゲノム配列解析により、更なるアミノ酸突然変異がＤＥＮＶａｘ−４ ＭＶＳに生じ、一方、他の３つのｐＤＥＮＶａｘ ＭＶＳロットは、それらのプレマスターシードのコンセンサスゲノム配列を保持したことが分かった。全体では、Ｐ１シードの誘導物からプレマスター（Ｐ７）シードまで、１つか２つの非同義突然変異が所与のシードで生じたのみであった。Ｐ１からＭＶＳ（Ｐ８）シードまで、任意の所与のＤＥＮＶａｘシードで２〜７個のヌクレオチド置換が同定され、これらの置換のうち２〜３個のみがアミノ酸変化をもたらした。よって、僅かな変化が生じた。ＲＮＡウイルスはそれらのゲノム複製物でエラーを生じやすく、そのため、細胞継代中のフラビウイルスゲノムの遺伝子上の置換は予想外のものではない。ＭＶＳにおけるサイレント変異はいずれも、ウイルス複製に影響を及ぼし得る５’または３’ＮＣＲ内にはなかった。ＤＥＮＶａｘ−２のｐｒＭ−５２におけるＬｙｓ−Ｇｌｕの変化、およびＤＥＮＶａｘ−４のＮＳ２Ａ−６６におけるＡｓｐ−Ｇｌｙの置換のみが、保存的変化ではなかった。ＤＥＮＶａｘ−４のＮＳ２Ａ−６６変異は、ＤＥＮＶ−２ ＰＤＫ−５３の非構造的骨格部分にある。ＮＳ２Ａ−６６位置は、ＤＥＮＶ−２の様々な株では通常Ａｓｐであるが、ＤＥＮＶ−４では通常Ｇｌｙである。ＤＥＮＶａｘ−４におけるＡｓｐからＧｌｙへの変化は、Ｖｅｒｏ細胞におけるＤＥＮＶａｘ−４の適合に関係している可能性がある。ＤＥＮＶａｘ−２ ｐｒＭ−５２突然変異は、ｐｒＭの、成熟ウイルス粒子から切り出されるＣ末端部分に存在する。いくつかの例示的方法において、ＭＶＳシードのいずれの突然変異もワクチンの弱毒表現型をあまり変化させないことを確認するために、表現型の特徴解析を行った。

ＤＥＮＶａｘウイルスは、製造工程中の高い遺伝子安定性を示した。５’ＮＣＲ、ＮＳ１−５３、およびＮＳ３−２５０における３つの特定されたＤＥＮＶ−２ ＰＤＫ−５３弱毒化位置は、プレマスター株からバルクワクチン調製までのＤＥＮＶａｘの連続継代時も、コンセンサスゲノム配列において安定したままであった。５’ＮＣＲ−５７位置の高感度ＴａｑＭＡＭＡは、各デングウイルス血清型のＭＶＳ、ＷＶＳ（Ｐ９／ワーキング）、およびＢＶＳ（ワクチン用バルクウイルスシード（Ｂｕｌｋ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｅｄ））での最小または検出不能な復帰を示した。ＤＥＮＶａｘ ＢＶＳ調製物（Ｐ１０等価物）の５’ＮＣＲ−５７復帰率は、Ｖｅｒｏ細胞において１０回連続継代後にリサーチグレードワクチン候補物において展開された５’ＮＣＲ−５７復帰率（４〜７４％の復帰）よりも有意に低かった。本願で提供するＤＥＮＶａｘシードの大規模製造のための方策は、その候補ワクチンウイルスにおいて弱毒化マーカーを保持した遺伝子的に安定なワクチンシードをもたらした。

ＤＥＮＶａｘ ＭＶＳのプラーク表現型
１つの例示的方法において、ＤＥＮＶａｘ ＭＶＳのプラーク表現型を野生型デングウイルスと、およびこれらと同種のリサーチグレードキメラウイルスとＶｅｒｏ細胞において比較した（図２）。ＤＥＮＶａｘ−１、−２、および−３のＭＶＳの全てが、それらの野生型ホモログよりも有意に小さく、かつそれらの同種リサーチグレードウイルスに非常によく似た（０．４ｍｍ差以内の）プラークをＶｅｒｏ細胞内で形成した。また、ＤＥＮＶａｘ−４ ＭＶＳは野生型ＤＥＮＶ−４よりも有意に小さかったが、元の実験室由来のＤ２／４−Ｖキメラよりは僅かに大きかった（０．９ｍｍ差）。

図２は、ＤＥＮＶａｘ ＭＶＳのプラークサイズを対照野生型ウイルスおよびリサーチグレードワクチン候補ウイルスと比較して示した例示的なヒストグラムを表す。アガロースオーバーレイ下のＶｅｒｏ細胞におけるウイルスプラークの平均プラーク直径（ｍｍ）±ＳＤ（エラーバー）をｐｉ９日目に測定した。黒のバーで表す野生型ＤＥＮウイルス、および白のバーで表す以前に公開されたリサーチグレードワクチン候補ウイルスを、灰色のバーで表すＤＥＮＶａｘマスターワクチンシードに対する対照および比較のために含めた。

ＤＥＮＶａｘ ＭＶＳの温度感受性
別の例示的方法において、Ｖｅｒｏ細胞における温度感受性をＤＥＮＶａｘ ＭＶＳについて調査し、それらの同種野生型および元のリサーチグレードキメラワクチンウイルスと比較した。野生型（ｗｔ）ＤＥＮＶ−３ １６５６２は温度感受性ではなかった。ｗｔデングウイルス血清型１およびデングウイルス血清型−４は、３９℃で中程度に温度感受性であった（３９℃での力価は、３７℃よりも約１．０ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌ低かった。図３）。ｗｔデングウイルス血清型−２ １６６８１は、調査したｗｔデングウイルスの中で最も温度感受性であり、３９℃で力価が１００分の１に低下した。ＤＥＮＶａｘ−１、−２、および−３はそれらの元の同種リサーチグレードキメラワクチンウイルスと同程度の温度感受性であった（図２）。これらのＤＥＮＶａｘ株では、３９℃での力価は２．０〜３．０ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌ低下した。ＤＥＮＶａｘ−４も温度感受性であり、力価の５分の１の低下を示した。しかし、元のリサーチグレードＤ２／４−Ｖは、力価の約１０分の１の低下を示した。最終安定化ＤＥＮＶａｘ−４ ＭＶＳはＦ１２７（および、これらの製剤を安定化することが知られている他の作用剤（ＦＴＡ））を含み、これはデングウイルスの熱安定性を高めることが示された。ＤＥＮＶａｘ−４ ＭＶＳにおけるＦ１２７の存在は、Ｖｅｒｏ細胞培養アッセイにおいて、ウイルスのあまりはっきりしない温度感受性に貢献するように思われる。別の実験において、Ｆ１２７の存在しないＭＶＳ誘導性ＤＥＮＶａｘ−４株の温度感受性をさらに評価した。株からＦ１２７を除去するために、ウイルスＲＮＡをＤＥＮＶａｘ−４バルクウイルス調製物から単離し、Ｖｅｒｏ細胞に導入した。このＦ１２７の存在しないＤＥＮＶａｘ−４ウイルスは、ｐｉ３日目、Ｄ２／４Ｖリサーチ株と同程度（力価が１．５ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌ低下）の温度感受性のようであった（図３）。

図３は、ＤＥＮＶａｘ ＭＶＳの温度感受性を示す例示的なヒストグラムを表す。野生型デングウイルスおよび以前に公開されたリサーチグレードワクチン候補ウイルスを比較のために含めた。ＤＥＮＶａｘ−４ ＭＶＳは、このアッセイでのウイルスの温度感受性の結果をマスキングし得る更なるＦ−１２７を含む。Ｆ１２７の存在しないサロゲートＤＥＮＶａｘ−４を解析する別の実験も含められた。３７℃または３９℃で、Ｖｅｒｏ細胞において複製されたウイルスの平均力価±ＳＤ（エラーバー）。

蚊Ｃ６／３６細胞におけるＤＥＮＶａｘ ＭＶＳ複製
リサーチグレードキメラワクチンウイルスはＣ６／３６細胞において骨格ＤＥＮＶ−２ ＰＤＫ５３ウイルスの弱毒表現型を維持したという知識の下、いくつかの例示的方法において、ＤＥＮＶａｘ ＭＶＳをＣ６／３６細胞で増殖させ、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ弱毒表現型の維持について評価した。ｗｔデングウイルスに比べ、ＤＥＮＶａｘ−１、ＤＥＮＶａｘ−２およびＤＥＮＶａｘ−４ ＭＶＳは、Ｃ６／３６細胞においてｐｉ６日目に有意な増殖低下（少なくとも３ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌの低下）を示した（図４）。ＤＥＮＶａｘ−３ ＭＳＶも、ｗｔＤＥＮＶ−３ １６５６２と比べて増殖の低下を示したが、それほど顕著な低下ではなかった（１〜２ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌの低下）。しかしながら、ＤＥＮＶａｘ−３シードロットのＣ６／３６力価は元のリサーチグレードキメラＤ２／３−ＶワクチンウイルスのＣ６／３６力価に類似していた（１ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌ以内の差）。

図４は、Ｃ６／３６細胞におけるＤＥＮＶａｘ ＭＶＳ（灰色のバー）の制限された増殖を、ｗｔデングウイルス（黒いバー）およびリサーチグレードワクチンウイルス（白いバー）と比較してプロットした例示的なヒストグラムを示す。ｐｉ６日目、Ｃ６／３６細胞で複製されたウイルスの平均力価±ＳＤ（エラーバー）。

蚊個体におけるウイルス感染率、播種率、および伝染率
いくつかの例示的方法において、ＤＥＮＶａｘの感染率および播種率をそれらの親のｗｔデングウイルスと比較した。ある例示的な実験において、ネッタイシマカで経口感染実験を実施した。感染性の血液飼料を逆滴定してウイルス力価を測定し、各血清型について親のデングウイルスとＤＥＮＶａｘとの間でウイルス力価が類似している（１ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌ未満の差）血液飼料を用いた実験のみを、比較のために表４に含めた。ＤＥＮＶａｘ−１、ＤＥＮＶａｘ−２、およびリサーチグレードＤ２ ＰＤＫ−５３−ＶＶ４５Ｒは、経口給餌では蚊を感染させず、これはそれらの親ウイルスであるＤＥＮＶ−１ １６００７（４４％感染）およびＤＥＮ−２ １６６８１（４３．３％感染）とは有意に異なっている（ｐ＜０．０００１）。ＤＥＮＶａｘ−１および−２によって感染した蚊は存在しなかったため、これら２つのワクチンウイルスについて播種の心配はほとんどあるいは全くなかった。ＤＥＮＶａｘ−４は一部の蚊を経口給餌により感染させたが（５５匹中２匹）、感染率は親ｗｔウイルスのＤＥＮＶ−４ １０３６（５０匹中８匹）よりも有意に低かった（ｐ＜０．０５）。ＤＥＮＶａｘ−３は、ウイルス力価５．２±０．０２ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌの血液飼料を用いた２つの実験（表４）では蚊を全く感染させず、ウイルス力価６．０ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌの血液飼料を用いた別の実験では３０匹中１匹の蚊だけが感染した（データは示されていない）。しかしながら、ｗｔデングウイルス−３ １６５６２も５．２ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌでの感染率は非常に低く（８％）、この率は、６．２ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌのより高い血液飼料ウイルス力価を用いた別の実験でも上昇しなかった（３％、蚊３０匹中１匹が陽性、データは示されていない）。野生型（ｗｔ）デングウイルス−３およびデングウイルス−４はｗｔデングウイルス−１およびデングウイルス−２よりも有意に低い感染率であったが、感染した蚊における平均ウイルス力価は類似していた（３．１〜３．９ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／蚊）。対照的に、２匹の感染した蚊のＤＥＮＶａｘ−４力価は両方とも最低限（０．７ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／蚊）であり、これはｗｔデングウイルス血清型−４ １０３６に感染した蚊の力価（３．９±１．５ｐｆｕ／蚊）の１０００分の１であった。

感染した蚊について、中腸からの播種はウイルスが肢に存在するか否かを調べることにより評価することができる。４つの親ＤＥＮＶは３６．３％〜６２．５％の範囲の播種率をもたらし、肢からのこれらの平均ウイルス力価（ｌｏｇ_１０ｐｆｕ）は０．９±０．３から２．２±０．７の間であった（陰性サンプルを除く）。これら２匹のＤＥＮＶａｘ−４感染蚊はいずれも肢へのウイルス播種をもたらさなかった（表４）。播種されたウイルスは肢で検出されたが、４つのｗｔデングウイルスはいずれも経口感染蚊の唾液では検出されなかった。このことは、経口給餌条件が、これらのＤＥＮＶの伝染率を測定するのに十分な感度でない可能性があることを示唆している。したがって、他の例示的な方法において、直接ＩＴ接種による高ストリンジェント人工的蚊感染を続いて実施した（表４）。ＤＥＮＶａｘ−４を除く全てのウイルス（ｗｔおよびＤＥＮＶａｘ）が、ＩＴ接種されたネッタイシマカの１００％の感染を達成した。ＤＥＮＶａｘ−４接種ではウイルス力価が他の３つのウイルス接種よりも僅かに低かったが、それでも接種された蚊の７０％を感染させるのに成功した。ＩＴ接種による高い体幹感染率にもかかわらず、全４種のＤＥＮＶａｘウイルスが、ｗｔデングウイルス（４３〜８７％、表４）と比較して有意に低い（ｐ＜０．００５）または検出不能の伝染率（０〜１０％）を示した。ＤＥＮＶａｘウイルスは、経口給餌後に感染および播種をほとんどあるいは全く示さず、また、高ストリンジェントＩＴ結果はこれらのＤＥＮＶａｘウイルスのネッタイシマカにおける最低限の伝染能力を確認した。

ベクター適性は弱毒生フラビウイルスワクチンウイルスにとって重要な安全性要素である。以前、リサーチグレードＤＥＮＶ−２ ＰＤＫ−５３−ＶＶ４５Ｒウイルスおよびｗｔ誘導体をネッタイシマカで試験し、ＮＳ１−５３−Ａｓｐ弱毒化突然変異は、損なわれた蚊複製にとって支配的な決定因子であることを発見した。ＤＥＮＶ−２ ＰＤＫ−５３ワクチンの他の２つの主要な弱毒化位置である５’ＮＣＲ−５７−ＴおよびＮＳ３−２５０−Ｖａｌも、蚊における複製に対し何らかの阻害作用を示し、したがって蚊ベクター適性に更に重複する制限を提供した。本明細書に記載のいくつかの例示的方法を、蚊の経口およびＩＴ感染ならびに全４種のＤＥＮＶａｘ株の複製を試験するために使用した。ＤＥＮＶａｘ−１、−２、および−３は、ネッタイシマカ蚊を経口感染では全く感染させなかった（表４）。ＤＥＮＶａｘ−４は経口曝露された蚊の３．６％を感染させたのみであり（これはｗｔＤＥＮＶ−４よりも有意に低いレベルである）、蚊の体幹における複製平均力価はｗｔＤＥＮＶ−４感染蚊よりも低かった。驚くべきことに、ＤＥＮＶａｘ−４は感染した蚊の肢で検出されており、ＤＥＮＶａｘ−４は経口感染後に蚊の中腸から播種できないことを示唆している。ＤＥＮＶａｘ−１、−２、および−４の感染率は、いずれもそれらの対応するｗｔのものよりも有意に低かったが、ＤＥＮＶａｘ−３とｗｔＤＥＮＶ−３ １６５６２との間では、両方のウイルスで感染率が非常に低かったため、この差は有意ではなかった。同じタイ王国のメーソート郡から収集したネッタイシマカで評価したＤＥＮＶの他のｗｔ株と比較して、ＤＥＮＶａｘの作出に使用した親ｗｔデングウイルス株では、経口感染による感染率および播種率が低いようであった。黄熱（ＹＦ）１７ＤワクチンベースのＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＤＥＮワクチンの作出に用いられたｗｔＤＥＮＶ−１ ＰＵＯ３５９、ＤＥＮＶ−２ ＰＵＯ２１８、ＤＥＮＶ−３ ＰａＨ８８１／８８、およびＤＥＮＶ−４ １２８８は、４７〜７７％の範囲の感染率であった。反対に、ＹＦ１７Ｄワクチンはネッタイシマカを感染させることができない。ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ株はこれらの高感染性ｗｔＤＥＮＶ由来のｐｒＭ−Ｅを含んでいたが、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘは、そのＹＦ１７Ｄ複製骨格の蚊弱毒表現型を維持する。本明細書に提示された結果は、ＤＥＮＶ−２ ＰＤＫ−５３骨格の蚊弱毒化がＤＥＮＶａｘ株で維持されたことも示す。さらに、本明細書に記載の組成物に含有される構築物における蚊感染性の低いｗｔデングウイルス株の使用は、更なる安全性特性を提供する。

経口感染結果は、ＤＥＮＶａｘが最少の蚊感染性および播種能力を有することを示している。さらに、より感度が高く、よりストリンジェントなＩＴ感染実験を実施して、ネッタイシマカによって伝染されるＤＥＮＶａｘの潜在能力をさらに解析した。ＩＴ結果は、全４種のＤＥＮＶａｘウイルスで、それらの対応するｗｔと比較して蚊感染能力が検出不能または最低であることを示した。ＤＥＮＶａｘ伝染は、理論的には（１）ベクターが、蚊の中腸を感染させるのに十分なウイルス血症力価をワクチンに供給する場合、（２）ウイルスが中腸上皮内で複製可能であり、その後中腸から出て播種可能な場合、および（３）播種されたウイルスが唾液腺で複製可能であり、伝染に十分なウイルスを唾液で吐き出せる場合にのみ生じ得る。蚊を感染させるのに必要なヒトウイルス血症の閾値は十分に確立されていないが、天然ｗｔＤＥＮＶ感染後、ヒトウイルス血症は１０^６〜１０^８蚊感染用量_５０（ＭＩＤ_５０）／ｍｌとなり得る。このＭＩＤ_５０は、蚊への希釈ヒト血漿の直接ＩＴ接種に基づいた。非ヒト霊長類におけるＤＥＮＶａｘの解析は、ＤＥＮＶａｘ免疫後のウイルス血症力価が非常に低く（２．４ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌ未満）、２〜７日間続くことを示した。このウイルス血症レベルの低さおよびＤＥＮＶａｘの蚊への感染、播種、および伝染能力の低さを考慮すると、これらのワクチンウイルスが自然環境で蚊によって伝染し、あるいはウイルス血症を引き起こすとは考えにくい。

したがって、１種、２種、３種または全４種のデングウイルス血清型に対する安全かつ効果的なワクチンを製造するために、任意の血清型の任意の継代物（Ｐ１〜Ｐ１０）が組成物に使用可能であることが提案される。

哺乳期マウスにける神経毒性
元のリサーチグレードワクチンウイルスは、ＤＶＢＤ／ＣＤＣでセンター内に維持された新生ＩＣＲマウスにおける神経毒性に関して高度に弱毒化された。これらのマウスは全て、１０^４ｐｆｕでの各ワクチンウイルスのｉｃ（脳内）攻撃を生き延びた。一方、ｗｔデングウイルス血清型−２ １６６８１ウイルスは、様々な実験においてこれらのＣＤＣ−ＩＣＲマウスの６２．５％〜１００％の死亡率をもたらした。いくつかの実験では、タコニック・ラブズ（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ）から入手した市販のＩＣＲマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ−ＩＣＲ）を用いて新生マウスにおける神経毒性を調査した。新生Ｔａｃｏｎｉｃ−ＩＣＲマウスは、以前のＣＤＣ−ＩＣＲマウスよりも、デングウイルス血清型−２に対して有意に感染しやすいことが観察された。図５Ａは１０^４ｐｆｕのウイルスでｉｃ攻撃されたＴａｃｏｎｉｃ−ＩＣＲ新生マウスおよびＣＤＣ−ＩＣＲコロニーにおけるｗｔデングウイルス血清型−２ １６６８１の神経毒性をまとめたものである。Ｔａｃｏｎｉｃ−ＩＣＲマウス（３２匹のマウスで１００％死亡率、平均生存時間８．３±０．５日）は、以前のＣＤＣ−ＩＣＲマウス（７２匹のマウスで９１％致死率、平均生存時間１４．６±２．３日）よりも、ｉｃデングウイルス血清型−２ １６６８１攻撃に対し、より影響を受けやすかった。

他の例示的な方法において、１つ（ｎ＝１６）または２つ（ｎ＝３１〜３２）の実験で、ＤＥＮＶａｘ ＭＶＳの神経毒性を評価するために、Ｔａｃｏｎｉｃ−ＩＣＲマウスを最初に約１０^４ｐｆｕの用量のｗｔデングウイルス血清型−２ １６６８１、Ｄ２ ＰＤＫ−５３ ＶＶ４５Ｒ、Ｄ２／３−Ｖ、またはＤＥＮＶａｘ１〜４ウイルスでｉｃ（脳内）攻撃した（図５Ｂ）。この用量で、Ｄ２／３−ＶリサーチグレードウイルスならびにＤＥＮＶａｘ−１およびＤＥＮＶａｘ−３ ＭＶＳは完全に弱毒化された神経毒性表現型を示した（疾患および死亡なし）。予想通り、ｗｔデングウイルス血清型−２は「致死性」であり、平均マウス生存時間（ＡＳＴ）は８．３±０．８日であることが分かった。これらのデングウイルス血清型−２−感受性Ｔａｃｏｎｉｃ−ＩＣＲマウスにおいて、Ｄ２ ＰＤＫ−５３−ＶＶ４５Ｒリサーチグレードウイルスは８１．３％の死亡率をもたらした。ＤＥＮＶａｘ−２ ＭＶＳおよびＤＥＮＶａｘ−４ ＭＶＳはＴａｃｏｎｉｃ−ＩＣＲにおいて一様に致死性であり、それぞれ９．８±１．７、１０．２±１．４、および１１．３±０．４日のＡＳＴ値を示した。

いくつかの例示的方法において、ｗｔデングウイルス血清型−２ １６６８１ウイルスの神経毒性を、Ｄ２ ＰＤＫ−５３ ＶＶ４５Ｒ、ＤＥＮＶａｘ−２ ＭＶＳおよびＤＥＮＶａｘ−４ ＭＶＳと、ならびにＤ２／４−Ｖリサーチグレードウイルスと、１０分の１の用量（１０^３ｐｆｕ、図５Ｃ）で比較した。ｗｔデングウイルス血清型−２は、この低い攻撃用量で、９．０±１．４日のＡＳＴで一様に致死的な神経毒性表現型を維持した。他の４種のウイルスは中間型の神経毒性表現型を示し、神経毒性の程度は血清型特異的であった。Ｄ２ ＰＤＫ−５３−ＶＶ４５ＲウイルスおよびそのＤＥＮＶａｘ−２ ＭＶＳの同種物は有意な弱毒化を示した（それぞれ、１３．１±３．８日のＡＳＴで３２．３％の生存率、および１０．５±３．４日のＡＳＴで３１．２％の生存率）。ＤＥＮＶａｘ−４ ＭＶＳおよびリサーチグレードＤ２／４−Ｖウイルスは両方とも、神経毒性に関して高度に弱毒化されていた（それぞれ、１８．８±５．８日のＡＳＴで８１．３％の生存率、および１００％の生存率）。この結果は、ＤＥＮＶａｘ−１および−３のＭＶＳが完全な神経毒性の弱毒化を示し、一方、ＤＥＮＶａｘ−２および−４ ＭＶＳロットは、それらの同種リサーチグレードウイルスワクチン候補に非常によく似た弱毒表現型を維持したことを示唆した。

図５Ａ〜５Ｃは、ｗｔデングウイルス血清型−２および種々の弱毒化デングウイルスを含む様々な組成物で処置した新生マウスにおける神経毒性を示す例示的なグラフを表す。多数の実験のプールした結果は、１０^４ｐｆｕのウイルス（Ａ）でｉｃ攻撃したＣＤＣ−ＩＣＲ（ｎ＝７２）およびＴａｃｏｎｉｃ−ＩＣＲ（ｎ＝３２）新生マウスにおけるｗｔデングウイルス血清型−２ １６６８１ウイルスの神経毒性をまとめている。１０^４ｐｆｕ（Ｂ）または１０^３ｐｆｕ（Ｃ）の用量でのＴａｃｏｎｉｃ−ＩＣＲマウスにおけるＤＥＮＶａｘ ＭＶＳ試験の神経毒性。１つの実験（ｎ＝１６）または２つのプールされた実験（ｎ＝３１または３２）において試験された動物の１群当たりの数が示されている。

ＷＶＳ、およびＢＶＳのプラーク表現型
ＷＶＳおよびＢＶＳのプラーク表現型をＭＶＳ、ｗｔデングウイルスおよびそれらの同種の実験室由来のリサーチグレードキメラとＶｅｒｏ細胞において比較するために、ある調査を行った（図６）。各ワクチンウイルスにつき１０個（ただしｗｔＤＥＮＶ−１、−３、および−４については減らした数）のプラークから平均プラークサイズを計算した。ＤＥＮＶａｘ−１、−２、および−３のＭＶＳウイルスはいずれも、Ｖｅｒｏ細胞において、それらのｗｔホモログよりも有意に小さく、同種リサーチグレードウイルスと非常に近い（０．４ｍｍ差以内）プラークを形成した。ＤＥＮＶａｘ−４ ＭＶＳもｗｔＤＥＮＶ−４よりも有意に小さかったが、元の実験室由来のＤ２／４−Ｖキメラよりは僅かに（０．９ｍｍ）大きかった。ＤＥＮＶａｘ−２を除き、ＤＥＮＶａｘ−１、−３、−４のＷＶＳおよびＢＶＳはいずれも、それらのｗｔホモログから形成されるプラークよりも有意に小さいプラークサイズを維持した。ＤＥＮＶａｘ−２ ＷＶＳおよびＢＶＳは、Ｖｅｒｏ細胞においてｗｔＤＥＮＶ−２ウイルスのプラークに近いプラークを形成したが、ＬＬＣ−ＭＫ_２細胞で試験したところ、ＤＥＮＶａｘ−２製造シードの全てが、ｗｔＤＥＮＶ−２のものよりも幾分小さく（１．４±０．４）、実験室由来のＤ２ ＰＤＫ−５３−ＶＶ４５Ｒに近い（１．０±０．３）プラークを形成した（図６）。

小さいプラーク表現型、温度感受性、蚊細胞における低下した複製、蚊による低下した感染／播種／伝染、および新生ＩＣＲマウスにおける低下した神経毒性を含むウイルス弱毒化の表現型マーカーの評価を、ＭＶＳストックの組成物について決定した。結果は、全てのＤＥＮＶａｘが、予想された、元のリサーチグレードワクチンウイルスに似た弱毒表現型を維持することを示した。弱毒化の原因となる突然変異がＭＶＳ、ＷＶＳおよびＢＶの全てで保存されていることを考慮すると、弱毒表現型はヒト治験用に製造された材料で維持されると予想することができる。

図６は、ＤＥＮＶａｘ ＭＶＳ、ＷＶＳ、およびＢＶＳのプラークサイズを示す例示的なヒストグラムを表す。アガロースオーバーレイ下のＶｅｒｏ細胞またはＬＬＣ−ＭＫ_２細胞内のウイルスプラークの、ｐｉ９日目に測定された平均プラーク直径±ＳＤ（エラーバー）。ｗｔＤＥＮＶおよび以前に公開されたリサーチグレードワクチン候補ウイルスを対照および比較のために含めた。

蚊Ｃ６／３６細胞内でのウイルス複製
以前の研究により、リサーチグレードＰＤＫ−５３ベースキメラワクチンウイルスは、Ｃ６／３６細胞内で骨格ＤＥＮＶ−２ ＰＤＫ５３ウイルスの弱毒表現型を維持することが実証された。いくつかの例示的方法において、ＤＥＮＶａｘ ＭＳＶ、ＷＶＳ、およびＢＶＳをＣ６／３６細胞内で増殖させ、大規模製造後のこのｉｎ ｖｉｔｒｏ弱毒化マーカーの維持について評価した。ｗｔデングウイルスと比較して、ＤＥＮＶａｘ−３を除き、製造されたシードはＣ６／３６細胞内でｐｉ６日目に顕著な増殖低下（少なくとも３ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌ）を示した（図７）。ＤＥＮＶａｘ−３シードもｗｔＤＥＮＶ−３ １６５６２と比べて低下した増殖を示したが、それほど顕著な低下ではなかった（１〜２ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌ）。しかし、ＤＥＮＶａｘ−３シードロットの力価は元のリサーチグレードキメラＤ２／３−Ｖワクチンウイルスと同程度であった（１ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／ｍｌ差以内）。

図８は、Ｃ６／３６細胞におけるＤＥＮＶａｘ ＭＶＳ、ＷＶＳ、およびＢＶＳの制限された増殖をプロットした例示的なヒストグラムを表す。ｐｉ７日目にＣ６／３６細胞内で複製されたウイルスの平均力価±ＳＤ（エラーバー）。ｗｔデングウイルスおよび以前に公開されたリサーチグレードワクチン候補ウイルスを比較のために含めた。

哺乳期マウスにおける神経毒性
新生ＩＣＲマウスにおける神経毒性を解析するために更なる実験を行った。頭蓋内への１０^４ＰＦＵの用量で、ｗｔＤＥＮＶ−２ １６６８１およびＤ２ ＰＤＫ−５３−ＶＶ４５Ｒに対する生存率は、ＩＣＲマウスではそれぞれ０％および１８．８％であった（図９Ａ）。しかし、ＣＤＣ ＩＣＲマウスでは、ｗｔＤＥＮＶ−２ １６６８１に対しては約２０％であり、Ｄ２ ＰＤＫ−５３−ＶＶ４５Ｒに対しては１００％であった。この研究では、１０^４ＰＦＵの用量のＤＥＮＶａｘ−１およびＤＥＮＶａｘ−３ ＭＶＳはマウスに対して弱毒化されたが（生存率１００％）、ＤＥＮＶａｘ−２およびＤＥＮＶａｘ−４のＭＶＳは、１０^４ＰＦＵを超える用量で１００％の死亡率をもたらした（図５Ａ）。しかしながら、１０^３ＰＦＵ用量のウイルスで試験したところ、ＤＥＮＶａｘ−２（生存率３１．３％）およびＤＥＮＶａｘ−４（生存率８１．３％）はｗｔデングウイルス血清型−２ １６６８１（生存率０％）に対し低下した神経毒性を示し、これらの生存率は、それぞれリサーチグレードワクチン候補Ｄ２ ＰＫＤ−５３−ＶＶ４５Ｒ（３２．３％）およびＤ２／４−Ｖ（１００％）と同程度であった（図９Ｂ）。ｗｔＤＥＮＶ−１、−３、または−４は、この研究では比較のために含めなかったが、以前の研究はｗｔＤＥＮＶ−１ １６００７がＣＤＣ−ＩＣＲマウスにおいてｉｃ経路により弱毒化されたのに対し、ｗｔＤＥＮＶ−３ １６５６２およびＤＥＮＶ−４ １０３６は両方ともＣＤＣ−ＩＣＲマウスに対し高毒性（生存率０％）であったことを実証した。これら３つのｗｔＤＥＮＶは、より感受性の高いＴａｃｏｎｉｃ ＩＣＲマウスでは同程度またはそれ以上の毒性を示すと考えられる。したがって、これらのｗｔデングウイルスをそれらの同種ＤＥＮＶａｘ ＭＶＳとの比較のために含めることは無益であると考えられた。この研究は、全４種のＤＥＮＶａｘ ＭＶＳおよび元の実験室由来の候補ワクチンウイルスが、ｗｔＤＥＮＶ−２ １６６８１と同程度のマウス弱毒表現型を提示することを示した。

図９Ａ〜９Ｂは、新生ＩＣＲマウスにおけるＤＥＮＶａｘ ＭＶＳの神経毒性のデータの例示的なグラフを表す。（Ａ）１０^４ＰＦＵ用量でのウイルスのＩＣ接種。（Ｂ）１０^３ＰＦＵ用量でのウイルスのＩＣ接種
ＤＥＮＶａｘの全シードロットを、同一性、無菌性、および望ましくない物質の不在について試験した。フルゲノム配列解析により、１つの余分なアミノ酸突然変異がＤＥＮＶａｘ−４ ＭＶＳに生じたが、他の３つのＤＥＮＶａｘ ＭＶＳは、それらのプレマスターシードのコンセンサスゲノム配列を保持していることが判明した。ＷＶＳロットでは、ＤＥＮＶａｘ−３は１つの余分なアミノ酸突然変異を獲得し、他の３つの血清型は、それらのプレマスターシードに対し２つの余分なアミノ酸置換を蓄積した。４つのＢＶＳロット全てのゲノム配列がそれらのＷＶＳロットと同一であった。Ｐ２シードからプレマスター（Ｐ７）シードまでの全体で、僅か１つまたは２つの非サイレント変異が所与のシードに生じた。プレマスターシードとＢＣＳ（Ｐ１０）シードとの間では、僅か１〜２個のヌクレオチド置換が見られ、それらはいずれもＮＳ２Ａ、４Ａ、または４Ｂに生じた（残基Ｅ−４８３の保存されたグリシンおよびアラニンをもたらす単一ヌクレオチド変化は例外）。Ｐ２からＢＶＳ（Ｐ１０）シードまで、合計で３〜８個のヌクレオチド置換が所与のＤＥＮＶａｘシードで同定され、これらの置換のうち僅か２〜４個がアミノ酸変化をもたらした。ＢＶＳにおけるサイレント変異はいずれも、ウイルス複製に影響を及ぼし得る５’−および３’−ＮＣＲ領域内にはなかった。これらの結果は、ＤＥＮＶａｘウイルスが、製造中、遺伝子的に高度に安定であることを示唆している。５’ＮＣＲ、ＮＳ１−５３、およびＮＳ３−２５０に位置する定義された３つのＤＥＮＶ−２ ＰＤＫ−５３弱毒化位置は、ＢＶＳストックを生成するためにＤＥＮＶａｘを連続継代しても、コンセンサスゲノム配列において変化していなかった。５’−ＮＣＲ−５７位置の高感度ＴａｑＭＡＭＡは、ＤＥＮＶａｘのＭＶＳ、ＷＶＳ、およびＢＶＳにおける最少のまたは検出不能な復帰を示した。０．２１％の最高の復帰率がＤＥＮＶａｘ−２ ＢＶＳにおいて確認された。Ｐ１０等価ＢＶＳの復帰率（＜０．０７％〜０．２１％）は、Ｖｅｒｏ細胞での連続継代後に他のワクチン候補に生じた復帰率よりも有意に低かった（Ｐ１０までに４〜７４％の復帰）。これは、ＤＥＮＶａｘシードのこの大規模製造の方策が、候補ワクチンウイルスにおいて遺伝子安定性を維持し、弱毒化マーカーを保持することに関して成功することを示唆している。

本願に開示されるＭＶＳストックは、将来的にＷＶＳおよびＢＶＳロットの製造に用いられ得るため、ウイルス弱毒表現型の評価のフルパネル（これらは、小さいプラーク表現型、温度感受性、蚊細胞における低下した複製、蚊個体における低下した感染／播種／伝染、および新生ＩＣＲマウスにおける低下した神経毒性を含む）を、全ＭＶＳまたはそれらの等価サロゲートストックに対して実施した。ＷＶＳおよびＢＶＳストックについては、弱毒化を確認するために、プラークサイズ、蚊細胞における感染性も実施した。結果は、ＤＥＮＶａｘの４種の血清型のＭＶＳストックの全てが、元の実験室由来のワクチンウイルスと類似した小さいプラーク、Ｃ６／３６細胞における低下した複製、および低下したマウス神経毒性等の、予想された弱毒表現型を維持したことを示した（図６、８、および９）。図３および７に示すように、ＤＥＮＶａｘ−４を除く他の３つのＤＥＮＶａｘのＭＶＳストックの全てが３９℃でＴＳであった。

ＷＶＳおよびＢＶＳストックについては、２つの弱毒表現型、すなわち小さいプラークおよびＣ６／３６細胞における低下した複製を解析および確認した。ＭＶＳとＢＶＳとの間の遺伝子の変化は極僅かしかないため、これらはＭＶＳのように弱毒表現型を保持すると予想された。この報告で説明した実験に加え、Ａｇ１２９マウスおよび非ヒト霊長類における製造されたＤＥＮＶａｘの安全性および免疫原性を試験した。

ｃＧＭＰに準拠したＤＥＮＶａｘ ＭＶＳ、ＷＶＳ、およびＢＶＳストックの製造を実証するための例示的な方法がここで提供される。ＢＶＳストックを、現在ヒト治験評価中の四価ＤＥＮＶａｘを製造するために使用した。製造されたＭＶＳの遺伝子安定性および安全性を最適化するための特有の製造方策が、いくつかの例示的方法において提供された。ＤＥＮＶａｘの主要な弱毒化位置は既に十分に特徴解析されているので、ゲノム解析とＴａｑＭＡＭＡとを統合してＭＶＳを作製するのに最適なプレマスターシードを特定するために、高感度かつ定量可能なＳＮＰアッセイのＴａｑＭＡＭＡを開発した。ＭＶＳの遺伝子特性および表現型特性を完全に解析して、ウイルスがワクチン安全性について望ましい弱毒性を保持していることを確かめた。これは、プレマスターからＢＶＳストックまでの製造中に全主要弱毒化遺伝子座について効率的に解析可能な唯一の弱毒生ウイルスワクチンかもしれない。ここに提供される結果は、戦略的に設計された弱毒生ワクチンのワクチン安全性における利点を実証した。

図１０は、新規な弱毒生ウイルスと以前に作製された弱毒生デングウイルスとを比較した例示的な表を表す。対照ウイルス（例えば１６６８１）、または他の弱毒生デング−２ウイルスと異なるところの突然変異が示されている。

〔材料と方法〕
ウイルスおよび細胞
ＤＥＮＶ−１ １６００７、ＤＥＮＶ−２ １６６８１、ＤＥＮＶ−３ １６５６２、およびＤＥＮＶ−４ １０３４を野生型（ｗｔ）ＤＥＮＶ対照とし、これらは４つの組換えＤＥＮＶａｘワクチン候補の親遺伝子型ウイルスであった。ＤＥＮＶａｘ前駆リサーチグレードウイルスとして、Ｄ２／１−Ｖ、Ｄ２ ＰＤＫ−５３−ＶＶ４５Ｒ、Ｄ２／３−Ｖ、およびＤ２／４−Ｖと称するものが、以前に調製および特徴解析された。ワクチン製造のためのマスターおよびワーキングセルバンクの作製に用いたＶｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓）細胞は、世界保健機関（ＷＨＯ）によってワクチン製造について特徴解析されている米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）ＣＣＬ８１細胞株（ＷＣＢ−Ｖｅｒｏ細胞）を起源とした。

ｃＤＮＡクローンからの組換え生ＤＥＮＶａｘウイルスの誘導
ｃＧＭＰ製造条件下で候補ワクチンウイルスを再誘導するため、以前に作出されたＤＥＮＶ感染性ｃＤＮＡクローンである、完全ゲノム長ウイルスｃＤＮＡを含有するｐＤ２−ＰＤＫ−５３−ＶＶ４５Ｒ、ｐＤ２／１−Ｖ、ｐＤ２／４−Ｖ、およびｉｎ ｖｉｔｒｏライゲーションｐＤ２／３−Ｖを用いて、以前に説明されたようなｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により新しいウイルスＲＮＡ転写産物を生成した。簡潔に述べると、ＸｂａＩ直鎖化ＤＥＮＶゲノムｃＤＮＡをプロテイナーゼＫで処理し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール中で沈殿させてあらゆる残留タンパク質を除去した。その後、転写前にＲＮａｓｅフリーのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーに懸濁させた。ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７高収率転写キット（エピセンターテクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、メーカーの推奨プロトコルにしたがってｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を実施した。ＲＮＡ転写産物に５’末端Ａキャップを付加するため、ＲＮＡのＡキャップアナログであるｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ（ニューイングランドバイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ））を、２時間の転写反応中に組み込ませた。続いて試料をＤＮａｓｅＩで処理してテンプレートｃＤＮＡを消化し、その後、低ｐＨフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行って残留ＤＮＡおよびタンパク質を除去した。精製されたＲＮＡ転写産物をＲＮａｓｅフリーの水に懸濁させ、２０μｌのアリコートに分けて、細胞の形質転換の準備が整うまで−８０℃で保管した。ＲＮＡ転写産物の完全性および濃度をアガロースゲル電気泳動により解析した。各２０μｌアリコートは、エレクトロポレーションで０．４〜１×１０^７個の産生保証Ｖｅｒｏ細胞を形質転換するのに十分なゲノム長のウイルスＲＮＡを含んでいると推定された。

各ＲＮＡ転写産物のＷＣＢ−Ｖｅｒｏ細胞へのトランスフェクションは、シャンタ・バイオテクニクス（Ｓｈａｎｔｈａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ）のｃＧＭＰ設備で実施した。ＤＥＮＶａｘ ＲＮＡ転写産物を解凍し、４００μｌのＶｅｒｏ細胞懸濁液（１×１０^７細胞／ｍｌ）と混合し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌトータルシステム（バイオラッドラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））によるエレクトロポレーションのために、予備冷却した滅菌エレクトロポレーションキュベット（４ｍｍギャップ）に移した。各試料を２５０Ｖ／∞オーム／５００μＦで一度パルスし、室温で１０〜１５分間インキュベートし、３０ｍｌの細胞増殖培地（１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ）を含有する７５ｃｍ^２フラスコに移し、３６℃±１℃、５％ＣＯ_２で６〜１１日間インキュベートした。培地を回収し、遠心分離により清澄化し、安定化し、小アリコートに分けて−６０℃以下で保管した。形質転換で得られた候補ワクチンストック（継代レベル１についてはＰ１と称する）のウイルス力価を、Ｖｅｒｏ細胞におけるプラーク滴定アッセイにより決定し、ＤＥＮＶａｘシードの更なる増殖に使用した。

ＤＥＮＶａｘウイルスシードの製造
製造されたロットの最適な遺伝子安定性および安全性を確実にするように設計された方策によって、Ｐ１ウイルスシードを用いてＤＥＮＶａｘプレマスター、マスター、ワーキング、およびバルクウイルスシードロットを増殖させた。この方策は、３回の連続したプラーク精製、および、継続的なシード製造用の最適なクローンウイルス集団を選択するための様々な継代レベルでのウイルスの遺伝子解析を含んでいた（表１）。簡潔に述べると、形質転換した細胞から回収したＰ１シードを、０．００１のＭＯＩでのＶｅｒｏ細胞の感染により一度増幅させ、Ｐ２シードを生成した。Ｐ２シードストックのアリコートをプラーク表現型および完全ウイルスゲノム配列解析により評価した。遺伝子が確認されたＰ２ストックを、下記のプラーク滴定の節で説明するようなオーバーレイ培地を伴うＶｅｒｏ細胞単層にプレーティングし、十分に単離されたプラークを形成した。ニュートラルレッドで可視化した後、ワクチンウイルスの４種の血清型の各々から６つの別個のプラークを単離し（プラーククローンＡ〜Ｆ）、０．５ｍｌの培地と混合した（継代Ｐ３）。

６つのプラーク懸濁液のそれぞれを更に２回のプラーク精製に供し、それぞれ２度および３度プラーク精製された継代Ｐ４およびＰ５のウイルスシードを得た。Ｐ５ウイルスを２回の連続するＶｅｒｏ継代により増幅し、Ｐ７シードストックを生成した。

全２４のＰ７シードをスクリーニングするために、スポットシークエンシング、および／または、前述のＴａｑｍａｎ（登録商標）に基づくミスマッチ増幅突然変異アッセイ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）−ｂａｓｅｄ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ：ＴａｑＭＡＭＡ）を用いた３つの主要なＤＥＮＶａｘ弱毒化位置の遺伝子解析、ならびにプラーク表現型解析を行った。適切な当初の特性を有するシードを、続いてフルゲノム配列解析により更に特徴解析した。これらの解析の結果、ＤＥＮＶ−２ ＰＤＫ−５３弱毒化突然変異の存在、最少ゲノム配列変化、および予測されるプラーク表現型に基づき、各ＤＥＮＶａｘ血清型の６つ（クローンＡ〜Ｆ）のＰ７シードのうちの１つをプレマスターシードとすべく選択した。各選択されたプレマスターシードを、Ｖｅｒｏ細胞の複数の１７５ｃｍ^２フラスコ中０．００１のＭＯＩでのウイルスの１回の継代によりマスターウイルスシード（ＭＶＳまたはＰ８）に展開した。ＤＥＮＶａｘ−４ ＭＶＳ以外は、マスターウイルスシードを感染後（ｐｏｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｐｉ）８〜１０日目に回収した。感染後（ｐｉ）６〜１０日目にＭＶＳストックを回収し、遠心分離により清澄化し、スクロース／リン酸／グルタミン酸溶液（最終濃度はそれぞれ７．５％スクロース、３．４ｍＭリン酸二水素カリウム、７．２ｍＭリン酸水素二カリウム、５．４ｍＭグルタミン酸ナトリウム）および０．９５〜１．９０％ＦＢＳ（最終濃度）の添加により安定化した。ＤＥＮＶａｘ−４ ＭＶＳは、収率を最適化するために異なる方法で調製した。簡潔に述べると、細胞の複数のフラスコを、０．１％Ｆ−１２７（商標）、ＤＥＮＶウイルス熱安定性を高めることが実証されているポロキサマー４０７（他のＥＯ−ＰＯブロックコポリマーが評価されており、ここで置換可能である。発行された特許を参照）の存在下、０．００１のＭＯＩでＤＥＮＶａｘ−４プレマスターシードにより感染させた。感染性培地をｐｉ６〜１０日目に回収し、１７％ＦＢＳ（最終濃度）で安定化させ、プールし、冷凍した。全４種のＤＥＮＶａｘ ＭＶＳストックを１ｍｌのアリコートに分け、−６０℃以下で保管した。

ＤＥＮＶａｘワーキングウイルスシード（ＷＶＳ）は、０．００１のＭＯＩでのＭＶＳのＶｅｒｏ細胞培養における１回継代により調製した。製造工程は、多層細胞ファクトリー（６３６０ｃｍ^２）で培養したこと以外はＭＶＳの製造と同様であった。ＷＶＳストックを１０μＭフィルターおよび０．４５μＭフィルターで濾過し、ＭＶＳで使用したのと同じ安定化剤で安定化し、３０ｍｌのＰＥＴＧボトルまたは２．０ｍｌクライオバイアルへアリコートに分けて、−６０℃以下で保管した。

ある方法において、バルクウイルスシード（ＢＶＳ）を、０．００１のＭＯＩを達成するように希釈したＷＶＳ９０ｍＬでのコンフルエントＶｅｒｏ細胞の多細胞ファクトリー（各６３６０ｃｍ^２）感染により製造した。ＷＶＳ接種物の希釈に用いた培地は、血清を含まない０．１％Ｆ−１２７（商標）を含んでいた。１．５時間の吸着後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、８００ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地を各細胞ファクトリーに添加して、ファクトリーを５（±０．５）％ＣＯ_２中３６（±１）℃でインキュベートした。４日間のインキュベーション後、無菌性試験のために培地の小アリコートを回収した。ｐｉ５日目から１０日目の間にウイルスを回収し、直ちに０．４５ｕｍポアサイズフィルターで濾過することにより清澄化し、１Ｌの各清澄化ウイルスプールを、５００ｍｌの３×ＦＴＡバッファー（ＰＢＳ中最終濃度１５％のトレハロース、１．０％のプルロニック（登録商標）Ｆ−１２７（商標）ポロキサマー４０７、０．１％のヒトアルブミンＵＳＰ、ｐＨ７．４）を添加することにより安定化した。安定化したウイルスを１Ｌ ＰＥＴＧボトルに分配し、後のプーリングおよび品質管理試験のために−６０℃以下で冷凍保管した。ウイルス力価が１０^５ＰＦＵ／ｍｌを超え、かつ許容できる残留ＤＮＡレベルの安定化ウイルス回収物を全て、３２℃のウォーターバスで迅速に解凍し、その後無菌でプールおよび混合した。プールした各一価ＢＶＳをラベル付けしたＰＥＴＧ容器に分配し、後の使用まで−６０℃以下で保管した。

製造製品品質管理
ＭＶＳ、ＷＶＳ、およびＢＶＳシードを、同一性、無菌性、および検出可能な外来物質について試験した。各ワクチンストックの同一性は、ＤＥＮＶａｘ血清型特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより確認した。増幅されたｃＤＮＡフラグメントは、４種のＤＥＮＶａｘ血清型の各々の同定を可能にするＥ／ＮＳ１キメラジャンクション部位を含んでいた。各シードは、ウイルスの同一性および異種ＤＥＮＶａｘ血清型による交差汚染の不在を確認するために、全４種の血清型特異的ＲＴ−ＰＣＲ反応において試験した。無菌性試験はＵＳＰ７１（米国薬局方、セクション７１）に準拠して実施した。マイコプラズマ試験を実施した。

シードの製造中に回収した清澄化および安定化していないＤＥＮＶａｘ回収物を用いて、ウイルス汚染についての下記のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験を全て実施した。回収した感染性培地を最初にＤＥＮＶウサギポリクローナル抗血清（インビラジェン（Ｉｎｖｉｒａｇｅｎ））によって、３６±１℃で１時間中和し、ＤＥＮＶを不活性化した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験については、中和したシードを２５ｃｍ^２フラスコ内のＭＲＣ５、ＶＥＲＯおよびＭＡ１０４の３種のインジケーター細胞に接種した。陽性ＣＰＥまたは血球吸着対照として、それぞれエコーウイルス（ＣＰＥ対照）またはムンプスウイルス（血球吸着対照）を使用した。全ての細胞を、ＣＰＥについて毎日、合計１４日モニタリングした。１４日の終わりに、培養物の上清を除去し、１０ｍＬのモルモット赤血球細胞（ＲＢＣ）溶液（３ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水中０．５％モルモットＲＢＣ、細胞増殖培地で１０ｍＬにメスアップ）に置換した。その後フラスコを５±３℃で３０分間インキュベートし、続いて室温で３０分間インキュベートした。単層をＰＢＳで洗浄し、１０×倍率で、血球吸着に関するＲＢＣの星型の集塊が存在するか観察した。

外来物質に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、哺乳期マウス、離乳後マウスおよびモルモットにおいて実施した。哺乳期マウスに０．１ｍｌまたは０．０１ｍｌのＤＥＮＶ−抗血清中和シード試料を腹腔内（ｉｐ）注射で接種した（各用量群につき１０匹のマウス）。同様に、１０匹の離乳後マウスにそれぞれ０．５ｍｌまたは０．０３ｍｌの試料をｉｐ接種した。モルモット（５／群）にそれぞれ５．０ｍＬをｉｐ接種した。哺乳期マウスを疾病率および死亡率について毎日、接種後合計１４日間観察した。離乳後マウスは接種後合計２８日間観察し、モルモットは合計４２日間観察した。試験項目は、接種した動物の８０％以上が観察期間中健康のままである場合に許容基準を満たした。

不純物に関するｉｎ ｖｉｖｏ試験も、胚発生させたニワトリ卵で実施した。各試験につき、１０個の胚発生させたメンドリ卵（９日齢）の尿膜腔液にそれぞれ０．５ｍＬのＤＥＮＶ抗血清中和試料を接種し、３５℃で３日間インキュベートした。これら１０個の卵から尿膜腔液を採集し、プールし、新しい１０個の胚発生卵の尿膜腔液中で継代させ（１０〜１１日齢；０．５ｍＬ／卵）、３５℃で更に３日間インキュベートした。同様に、各試料につき、１０個の胚発生卵（６〜７日齢）にそれぞれ０．５ｍＬ／卵（ＤＥＮＶａｘ−２一価ＢＶＳ）または０．２５ｍＬ／卵（ＤＥＮＶａｘ−１、ＤＥＮＶａｘ−３およびＤＥＮＶａｘ−４ ＢＶＳ）を卵黄嚢への注射により接種し、３５℃で９日間インキュベートした。これら１０個の卵から卵黄嚢を採集してプールし、１０％懸濁液を新しい１０個の胚発生卵の卵黄嚢内で継代させ（６〜７日齢；０．５ｍＬ／卵）、３５℃で更に９日間インキュベートした。３日間のインキュベーション後、尿膜腔液に接種した卵（初期のものと継代接種したものの両方）を生存率について観察した。ニワトリ、モルモットおよびヒト型Ｏ赤血球を用いて、尿膜腔液の両方のプールを、４℃および２５℃で血球凝集活性について試験した。９日間のインキュベーション後、卵黄嚢に接種した卵（初期のものと継代接種したものの両方）を生存率について観察した。

ウイルスプラークアッセイおよびイムノフォーカスアッセイ
Ｖｅｒｏ細胞を用いたプラークアッセイまたはイムノフォーカスアッセイによりウイルス力価を測定した。プラークアッセイは、以前に説明されたように、コンフルエントＶｅｒｏ細胞の６ウェルプレートにおいて二重アガロースオーバーレイで実施し、これらはＤＥＮＶａｘシードのプラーク表現型を評価するのにも利用した。正確な比較のため、全てのウイルスのプラークサイズを測定し、同じ実験内で比較した。ｐｉ９日目にニュートラルレッドで可視化した後、平均プラークサイズ計算のために最大１０ウェルの単離したプラークを各ウイルスにつき測定した。ｗｔＤＥＮＶ−１、−３、および−４については、プラークサイズが大きく、しばしば１０ウェル単離プラークの測定が不可能であり、測定されたプラークの数は少なくなった。

四価ＤＥＮＶａｘは全４種のＤＥＮＶ血清型を含むことから、四価製剤中の各ＤＥＮＶａｘ成分を定量するためにＤＥＮＶ血清型特異的イムノフォーカスアッセイを開発した。個々のＤＥＮＶａｘ ＭＶＳそれぞれのイムノフォーカスアッセイを、プラークアッセイと比較し、ウイルス力価の結果がこれら２つのアッセイの間で同程度であることを確認した。イムノフォーカスアッセイは、連続希釈したウイルスで感染させたコンフルエントＶｅｒｏ細胞の６ウェルプレートにおいて行った。細胞を、０．７％高粘度カルボキシメチルセルロース（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有する平衡塩培地（ＢＳＳ／ＹＥ−ＬＡＨ培地）オーバーレイで覆い、５％ＣＯ_２、３７℃で７日間インキュベートした。オーバーレイを除去した後、細胞シートをＰＢＳで３回洗浄し、−２０℃において冷却８０％アセトンで３０分間固定し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中２．５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳、０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０を含有するブロッキングバッファーにより、３７℃で３０分間ブロッキングした。ブロッキングした細胞を、希釈したＤＥＮＶ血清型特異的ＭＡｂである１Ｆ１（ＤＥＮＶ−１）、３Ｈ５（ＤＥＮＶ−２）、８Ａ−１（ＤＥＮＶ−３）、または１Ｈ１０（ＤＥＮＶ−４）と共に、ブロッキングバッファー中３７℃で１時間または４℃で一晩インキュベートし、洗浄バッファー（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）で３回洗浄し、アルカリホスファターゼ結合またはセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合アフィニティピュアヤギ抗マウスＩｇＧ（ジャクソン・イムノ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））と共に３７℃で４５〜６０分間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、適切な基質、アルカリホスファターゼ用１ステップＮＢＴ／ＢＣＩＰプラスサプレッサー（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））またはＨＲＰ用のＶｅｃｔｏｒ−ＶＩＰキット（ベクター・ラブズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ））を発色のために添加した。フォーカスが十分に発展したら、水でリンスすることにより発色を止めた。染色されたイムノフォーカスを直接可視化し、ライトボックス上でカウントした。

遺伝子配列
ＭＶＳおよびＷＶＳの完全長ゲノムを配列解析した（下記参照）。簡潔に述べると、ＱＩＡｍｐウイルスＲＮＡキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用してウイルスＲＮＡをＤＥＮＶａｘシードから抽出し、Ｔｉｔａｎ Ｏｎｅ Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲキット（ロシュ・アプライド・サイエンス社（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．））を使用してゲノム全体をカバーする重複したｃＤＮＡフラグメントを増幅した。増幅したｃＤＮＡフラグメントをゲルで精製した後、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクルシークエンシングキット（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて、フォワードおよびリバースプライマーにより配列解析した。ＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（アプライドバイオシステムズ）を用いてシークエンス反応をきれいにし、ＤＶＢＤ／ＣＤＣで３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃアナライザー（アプライドバイオシステムズ）にかけた。ゲノム解析および比較にはＬａｓｅｒｇｅｎｅ ＳｅｑＭａｎソフトウェア（ＤＮＡスター社（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ））を用いた。

Ｔａｑｍａｎ（登録商標）に基づくミスマッチ増幅突然変異アッセイ（ＴａｑＭＡＭＡ）
ＴａｑＭＡＭＡは、弱毒化の５’ＮＣ−５７位置における復帰レベルのより精密な評価を可能にするために開発された高感度の定量的単一ヌクレオチド多型性アッセイであり、この研究のために更に最適化された。ＭＶＳおよびＷＶＳから抽出されたウイルスＲＮＡは、ｗｔまたはワクチン５’ＮＣ−５７領域に特異的なプライマー／Ｔａｑｍａｎプローブの両対を用いたＴａｑＭＡＭＡにより解析された。ＤＥＮＶ−２のｗｔ配列およびワクチン配列を検出するのに使用したフォワードプライマーは、それぞれＤ２−４１−ＧＣおよびＤ２−４０−ＴＴであった。各ウイルスについて、各フォワードプライマーの３’末端ヌクレオチドは特異的５’ＮＣＲ−５７ヌクレオチドと一致していたが、各プライマーの３’末端ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドは、ミスマッチ効果を高めるため、ＤＥＮＶ−２ウイルスゲノム配列とは異なっていた。リバースプライマーのＣＤ−２０７とＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブのＣＤ−１６９Ｆは、ｗｔおよびワクチンセットの両方とも同一であった。プライマーおよびプローブの配列、ならびにサイクル条件は以前に説明された。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、ｉＱ５またはＣＦＸ−９５システム（バイオラッド）で、ＢｉｏＲａｄ ｉＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ（プローブ用）キットを用いて、５μｌのウイルスＲＮＡテンプレート、０．４ｕＭの各プライマー、および０．２ｕＭのプローブを含有する２５μｌ反応で行った。各試料につき、各ｗｔ特異的およびワクチン特異的反応についてトリプリケート反応を行った。各ウイルス血清型について用意した標準曲線に対してゲノムコピー数を決定した。ここで、ＲＮＡ標準は各遺伝子型特異的ｃＤＮＡのｎｔ１〜２６７０を含むプラスミドから誘導された転写産物であった。さらに、全ての実験で最少の交差反応性を確実にするため、異種遺伝子型プライマー／プローブセットにより各ＲＮＡ標準を試験することによりアッセイの特異性を確認した。結果を、復帰を示したウイルスゲノムの割合として報告した。以前、このアッセイのインプットＲＮＡレベルを制限する高い交差反応性バックグラウンドのために、当初の検出感度は約０．１％の復帰（識別能）であった。以降、改善されたリアルタイムＰＣＲ装置および反応キットを用いてアッセイは更に最適化されて、交差反応性バックグラウンドは遥かに高レベル（７〜８ ｌｏｇ_１０コピー）のＲＮＡテンプレートインプットに大幅に低減された。この最適化は、０．０１〜０．０７％の復帰率にまで、検出感度のかなりの向上をもたらした。

蚊Ｃ６／３６細胞におけるウイルス複製および哺乳類Ｖｅｒｏ細胞における温度感受性
４つのＤＥＮＶａｘ ＭＶＳストックおよびｗｔＤＥＮＶ−１、−２、−３、および−４ウイルスの複製表現型をＣ６／３６蚊細胞（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）で評価した。６ウェルプレートで増殖させたＣ６／３６細胞を、０．００１のＭＯＩの各ウイルスにデュプリケートで感染させ、２８℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中、４ｍｌ／ウェルの２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地でインキュベートした。各ウイルスについてｐｉ６日目に培養上清の小アリコートを回収し、４０％のＦＢＳを含有する同じ体積の培地と混合し、ウイルスプラーク滴定の準備が整うまで−８０℃で保管した。

温度感受性は、６ウェルプレートにおいて、Ｖｅｒｏ細胞のｐｉ５日目の３９℃のウイルス増殖と３７℃の増殖とを比較することにより実施した。細胞をクアドルプリケートで０．００１のＭＯＩの各ウイルスに３７℃で感染させた。ウイルスの吸着後、感染した培養物を、２つの別個の５％ＣＯ_２インキュベーター内（一方のセット（デュプリケートプレート）は３７℃、他方は３９℃）で４ｍｌ／ウェルの２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地と共にインキュベートした。培養上清のアリコート（５０μｌ）をｐｉ５日目に回収し、４０％のＦＢＳを含有する同じ体積のＤＭＥＭと混合し、ウイルスプラーク滴定の準備が整うまで−８０℃で保管した。インキュベーター温度はＮＩＳＴ−トレーサブル・ファクトリー校正サーモメータ（−１〜５１℃；ＥＲＴＣＯ）で校正した。

蚊の感染、播種、および伝染
研究に用いたネッタイシマカは、タイ王国メーソート近郊の村（１６’Ｎ，３３’Ｅ）に由来する２００２年に確立されたコロニーに由来した。幼虫から変態後、成虫の蚊を２８℃、１６：８（明：暗）の光周期で、１０％スクロース溶液を自由摂取で提供することにより維持した。５〜７日齢のメスの蚊を感染性血液飼料供給または胸腔内（ＩＴ）接種に使用した。後述するような経口感染用のウイルス血液飼料を作るため、新たに培養したＤＥＮＶａｘおよびｗｔＤＥＮＶのアリコートを回収後直ちに（凍結解凍サイクルを経ずに）使用した。残りのウイルス上清にはＦＢＳを最終濃度２０％で添加し、アリコートを後のウイルスプラーク滴定およびＩＴ接種実験のために−８０℃で保管した。これらの実験用に新たに調製したＤＥＮＶａｘシードをプレマスターシードからＶｅｒｏ細胞内で増幅し、これらはＤＥＮＶａｘ ＭＶＳ等価物とみなした。

感染性血液飼料は、経口感染の当日、新しいウイルスを脱繊維素ニワトリ血液（コロラドセラムカンパニー（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ））と１：１の比率で混合することにより調製した。蚊は一晩糖を絶たれており、その後ウイルス：血液混合物を１時間、Ｈｅｍｏｔｅｋメンブレンフィーディングシステム（ディスカバリーワークショップス（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ））を用いて提供した。血液飼料の５０μｌのアリコートを、ウイルス用量の逆滴定のために−８０℃で保持した。完全に飽食させたメスを寒冷麻酔下で選別し、自由摂取で提供される１０％スクロース溶液を備えた箱に入れた。箱を２８℃、１６：８時間（明：暗）の光周期に置いた。１４日後、各ウイルスグループから２５〜３０匹の蚊をトリエチルアミン（Ｆｌｙｎａｐ（商標）、カロライナバイオロジカルサプライカンパニー（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ Ｃｏｍｐａｎｙ））への曝露により麻酔し、１本の後肢を取り外して、１０％ＦＢＳおよび５％ペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ１００Ｕ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を添加した０．５ｍｌのＤＭＥＭに入れた。麻酔した蚊の吻を、２．５％ＦＢＳおよび２５％スクロース溶液を含有する毛細管に挿入することにより唾液を採集した。蚊に少なくとも１５分間唾液を分泌させ、その後、ＤＭＥＭを含有する別々のチューブに毛細管および体幹を入れた。蚊の体幹、肢および唾液を、感染性ウイルスについて粉砕およびアッセイされるまで−８０℃で保管した。ＩＴ接種については、蚊を寒冷麻酔し、約５０ｐｆｕのウイルスを０．３４μｌの接種量で接種した。接種した蚊を７日間、上記と同じ条件で維持した。その後、蚊を麻酔し、唾液および体幹を上記のように採集した。試料を更に処理するまで−８０℃で保管した。

試料をウイルス滴定用に処理するため、体幹および肢の試料を２４回転／秒の銅被覆ＢＢｓ（クロスマンコーポレーション（Ｃｒｏｓｓｍａｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ニューヨーク）で４分間、ミキサーミルを用いてホモジナイズし、その後３，０００×ｇ、３分間の遠心分離により清澄化した。唾液試料は３，０００×ｇで３分間遠心分離し、液体を毛細管から放出させた。体幹および肢のホモジネートの１０倍希釈物および唾液試料を、プラークアッセイにより、感染性ウイルスの存在について試験した。体幹、肢、および唾液の結果を、それぞれ感染率、播種率、および伝染率を決定するために用いた。

マウス神経毒性
タイミング調整した妊娠メスＩＣＲマウスをタコニックラブズから入手し、各腹の子マウスのおおよその出産時期を決定するために毎日数回モニタリングした。所与の実験において、出生の約１２〜２４時間後、各ウイルスにつき８匹の子マウス二腹分（ｎ＝１６）を、３０ゲージ針を用いて２０μｌの希釈剤中１０^３〜１０^４ｐｆｕのウイルスで頭蓋内（ｉｃ）攻撃した。攻撃後、動物を少なくとも毎日３回、少なくとも３２日間モニタリングした。疾患の最初の徴候が出たとき（被毛粗剛、屈背、体重減少、異常な動き、まひ、または無気力）、動物をイソフルランガスでの致死麻酔により安楽死させ、その後、頸椎脱臼させた。感染後安楽死までの日数は、動物の「疾患／病的状態までの時間」または「生存時間」を表した。動物実験はＤＶＢＤ／ＣＤＣ ＩＡＣＵＣに認可された動物プロトコルに従って実施された。

マスターシードウイルスの誘導
ＤＥＮＶａｘ−１マスターウイルスシード（ＭＶＳ）
キメラウイルスゲノムのヌクレオチド配列および翻訳されたタンパク質の推定アミノ酸配列がここに提供される。ｐｒＭ−Ｅ遺伝子の大部分（ｎｔ４５７〜２３７９、下線を付す）は野生型（ｗｔ）ＤＥＮ−１ １６００７ウイルスに特異的であり、残りのゲノムはＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３ウイルスに特異的である。ｗｔウイルス（Ｄ１ １６００７またはＤ２ １６６８１）とは異なる作出された置換の全て、および、ＭＶＳで検出された余分な突然変異（作出されたｃＤＮＡクローンからの変化）に印を付けている。

ゲノムおよびタンパク質に含まれる置換：
Ｄ１（ｐｒＭ−Ｅ）とＤ２骨格との間のジャンクション部位：
ａ．ＭｌｕＩ（ｎｔ４５１〜４５６）：作出されたサイレント変異、ｎｔ４５３ Ａ→Ｇ
ｂ．ＮｇｏＭＩＶ（ｎｔ２３８０〜２３８５）：作出された突然変異、ｎｔ２３８１／２３８２ ＴＧ→ＣＣ（Ｅ−４８２ ＶａｌからＡｌａへの変化をもたらす）
Ｄ２ ＰＤＫ−５３ウイルス骨格（ｗｔＤ２ １６６８１からの変化）：全て太字
ａ．５’非コード領域（ＮＣＲ）−５７（ｎｔ−５７ Ｃ→Ｔ）：主要な弱毒化位置（赤字）
ｂ．ＮＳ１−５３ Ｇｌｙ→Ａｓｐ（ｎｔ−２５７９ Ｇ→Ａ）：主要な弱毒化位置（赤字）
ｃ．ＮＳ２Ａ−１８１ Ｌｅｕ→Ｐｈｅ（ｎｔ−４０１８ Ｃ→Ｔ）
ｄ．ＮＳ３−２５０ Ｇｌｕ→Ｖａｌ（ｎｔ−５２７０ Ａ→Ｔ）：主要な弱毒化位置（赤字）
ｅ．ｎｔ−５５４７（ＮＳ３遺伝子）Ｔ→Ｃサイレント変異
ｆ．ＮＳ４Ａ−７５ Ｇｌｙ→Ａｌａ（ｎｔ−６５９９ Ｇ→Ｃ）
^＊ＰＤＫ−５３のｎｔ−８５７１ Ｃ→Ｔサイレント変異はこのワクチンウイルスには作出されていない
ＤＥＮ−１ ｐｒＭ−Ｅ（ｗｔＤ１ １６００７からの変化）
ａ．天然のＸｂａＩ部位を除去するために作出されたｎｔ−１５７５ Ｔ→Ｃサイレント変異
ワクチンシードに見られる更なる置換（元のクローンからの０．０３％のｎｔの相違）
ａ．ＮＳ２Ａ−１１６ Ｉｌｅ→Ｌｅｕ（ｎｔ−３８２３ Ａ→Ｃ、太字）
ｂ．ＮＳ２Ｂ−９２ Ｇｌｕ→Ａｓｐ（ｎｔ−４４０７ Ａ→Ｔ、太字）
ｃ．ｎｔ−７３１１ Ａ→Ｇサイレント変異（太字）

ＤＥＮＶａｘ−２マスターウイルスシード（ＭＶＳ）
組換えウイルスゲノムのヌクレオチド配列および翻訳されたタンパク質の推定アミノ酸配列がここで提供される。作出されたウイルスはＤ２ ＰＤＫ−５３ウイルスに基づいている。野生型ＤＥＮ−２ １６６８１ウイルス（また、ＰＤＫ−５３の親ウイルス）とは異なる作出された置換の全て、および、ＭＶＳで検出された余分な突然変異（作出されたｃＤＮＡクローンからの変化）に印を付けている。

ゲノムおよびタンパク質に含まれる置換：
Ｄ２ ＰＤＫ−５３ウイルス骨格（ｗｔＤ２ １６６８１からの変化）：全て太字
ａ．５’非コード領域（ＮＣＲ）−５７（ｎｔ−５７ Ｃ→Ｔ）：主要な弱毒化位置（赤字）
ｂ．ｐｒＭ−２９ Ａｓｐ→Ｖａｌ（ｎｔ−５２４ Ａ→Ｔ）
ｃ．ｎｔ−２０５５ Ｃ→Ｔ（Ｅ遺伝子）サイレント変異
ｄ．ＮＳ１−５３ Ｇｌｙ→Ａｓｐ（ｎｔ−２５７９ Ｇ→Ａ）：主要な弱毒化位置（赤字）
ｅ．ＮＳ２Ａ−１８１ Ｌｅｕ→Ｐｈｅ（ｎｔ−４０１８ Ｃ→Ｔ）
ｆ．ＮＳ３−２５０ Ｇｌｕ→Ｖａｌ（ｎｔ−５２７０ Ａ→Ｔ）：主要な弱毒化位置（赤字）
ｇ．ｎｔ−５５４７（ＮＳ３遺伝子）Ｔ→Ｃサイレント変異
ｈ．ＮＳ４Ａ−７５ Ｇｌｙ→Ａｌａ（ｎｔ−６５９９ Ｇ→Ｃ）
^＊ＰＤＫ−５３のｎｔ−８５７１ Ｃ→Ｔサイレント変異はこのワクチンウイルスには作出されていない
作出されたクローンマーカー（サイレント変異）：
ａ．ｎｔ−９００ Ｔ→Ｃサイレント変異：感染性クローンマーカー
ワクチンシードに見られる更なる置換（元のクローンからの０．０２％のｎｔの差）
ａ．ｐｒＭ−５２ Ｌｙｓ→Ｇｌｕ（ｎｔ−５９２ Ａ→Ｇ）、太字
ｂ．ＮＳ５−４１２ Ｉｌｅ→Ｖａｌ（ｎｔ−８８０３ Ａ→Ｇ）、太字

ＤＥＮＶａｘ−３ マスターウイルスシード（ＭＶＳ）
キメラウイルスゲノムのヌクレオチド配列および翻訳されたタンパク質の推定アミノ酸配列がここに提供される。ｐｒＭ−Ｅ遺伝子の大部分（ｎｔ−４５７〜−２３７３、下線を付す）は野生型（ｗｔ）ＤＥＮ−３ １６５６２ウイルスに特異的であり、残りのヌクレオチド配列はＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３ウイルスに特異的である。ＤＥＮ−３ウイルスのＥタンパク質は、ＤＥＮ−２のＥタンパク質よりも２個少ないアミノ酸を有する。したがって、ＮｇｏＭＩＶから開始するｎｔ位置は元のＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３ｎｔ位置よりも６ｎｔ少ない。ｗｔウイルス（ＤＥＮ−３ １６５６２またはＤＥＮ−２ １６６８１）とは異なる作出された置換の全て、および、ＭＶＳで検出された余分な突然変異（作出されたｃＤＮＡクローンからの変化）に印を付けている。

ゲノムおよびタンパク質に含まれる置換：
ジャンクション部位：
ａ．ＭｌｕＩ（ｎｔ４５１〜４５６）：作出されたサイレント変異、ｎｔ−４５３ Ａ→Ｇ
ｂ．ＮｇｏＭＩＶ（ｎｔ２３７４〜２３７９）：作出された突然変異、ｎｔ−２３７５／２３７６ ＴＧ→ＣＣ（Ｅ−４８０ ＶａｌからＡｌａへの変化をもたらす）
Ｄ２ ＰＤＫ−５３ウイルス骨格（ｗｔＤ２ １６６８１からの変化）：太字
ａ．５’非コード領域（ＮＣＲ）−５７（ｎｔ−５７ Ｃ→Ｔ）：主要な弱毒化位置（赤字）
ｂ．ＮＳ１−５３ Ｇｌｙ→Ａｓｐ（ｎｔ−２５７３ Ｇ→Ａ）：主要な弱毒化位置（赤字）
ｃ．ＮＳ２Ａ−１８１ Ｌｅｕ→Ｐｈｅ（ｎｔ−４０１２ Ｃ→Ｔ）
ｄ．ＮＳ３−２５０ Ｇｌｕ→Ｖａｌ（ｎｔ−５２６４ Ａ→Ｔ）：主要な弱毒化位置（赤字）
ｅ．ｎｔ−５５４１（ＮＳ３遺伝子）Ｔ→Ｃサイレント変異
ｆ．ＮＳ４Ａ−７５ Ｇｌｙ→Ａｌａ（ｎｔ−６５９３ Ｇ→Ｃ）
^＊ＰＤＫ−５３のｎｔ−８５６５ Ｃ→Ｔサイレント変異はこのワクチンウイルスには作出されていない
ＤＥＮ−３ ｐｒＭ−Ｅに作出された突然変異（ｗｔＤ３ １６５６２からの変化）
ａ．作出されたｎｔ−５５２ Ｃ→Ｔサイレント変異：クローンマーカー
ｂ．培養物中での効率的な複製のために作出されたＥ−３４５ Ｈｉｓ→Ｌｅｕ（ｎｔ−１９７０ Ａ→Ｔ）
ワクチンシードに見られる更なる置換（元のクローンからの０．０２％のｎｔの差）
ａ．Ｅ−２２３ Ｔｈｒ→Ｓｅｒ突然変異（ｎｔ−１６０３ Ａ→Ｔ、太字）
ｂ．ｎｔ−７６２０ Ａ→Ｇサイレント変異（太字）

ＤＥＮＶａｘ−４ マスターウイルスシード（ＭＶＳ）
キメラウイルスゲノムのヌクレオチド配列および翻訳されたタンパク質の推定アミノ酸配列。ｐｒＭ−Ｅ遺伝子の大部分（ｎｔ−４５７〜−２３７９、下線を付す）は野生型（ｗｔ）ＤＥＮ−４ １０３６ウイルスに特異的であり、残りのヌクレオチド配列はＤＥＮ−２ ＰＤＫ−５３ウイルスに特異的である。ｗｔウイルス（ＤＥＮ−３ １６５６２またはＤＥＮ−２ １６６８１）とは異なる作出された置換の全て、および、ＭＶＳで検出された余分な突然変異（作出されたｃＤＮＡクローンからの変化）に印を付けている。

ゲノムおよびタンパク質に含まれる置換：
ジャンクション部位：
ａ．ＭｌｕＩ（ｎｔ４５１〜４５６）：作出されたサイレント変異、ｎｔ−４５３ Ａ→Ｇ
ｂ．ＮｇｏＭＩＶ（ｎｔ２３８０〜２３８５）：作出された突然変異、ｎｔ−２３８１／２３８２ ＴＧ→ＣＣ（Ｅ−４８２ ＶａｌからＡｌａへの変化をもたらす）
Ｄ２ ＰＤＫ−５３ウイルス骨格（ｗｔＤ２ １６６８１からの変化）
ａ．５’非コード領域（ＮＣＲ）−５７（ｎｔ−５７ Ｃ→Ｔ）：主要な弱毒化位置（赤字）
ｂ．ＮＳ１−５３ Ｇｌｙ→Ａｓｐ（ｎｔ−２５７９ Ｇ→Ａ）：主要な弱毒化位置（赤字）
ｃ．ＮＳ２Ａ−１８１ Ｌｅｕ→Ｐｈｅ（ｎｔ−４０１８ Ｃ→Ｔ、太字）
ｄ．ＮＳ３−２５０ Ｇｌｕ→Ｖａｌ（ｎｔ−５２７０ Ａ→Ｔ）：主要な弱毒化位置（赤字）
ｅ．ｎｔ−５５４７（ＮＳ３遺伝子）Ｔ→Ｃサイレント変異（太字）
ｆ．ＮＳ４Ａ−７５ Ｇｌｙ→Ａｌａ（ｎｔ−６５９９ Ｇ→Ｃ、太字）
^＊ＰＤＫ−５３のｎｔ−８５７１ Ｃ→Ｔサイレント変異はこのワクチンウイルスには作出されていない
ｃＤＮＡクローンに作出された置換
ａ．作出されたＣ−１００ Ａｒｇ→Ｓｅｒ（ｎｔ−３９６ Ａ→Ｃ）：培養におけるウイルス複製を向上し得る
ｂ．作出されたｎｔ−１４０１ Ａ→Ｇサイレント変異
ｃ．作出されたＥ−３６４ Ａｌａ→Ｖａｌ（ｎｔ−２０２７ Ｃ→Ｔ）：培養におけるウイルス複製を向上し得る
ｄ．作出されたＥ−４４７ Ｍｅｔ→Ｌｅｕ（ｎｔ−２２７５ Ａ→Ｃ）：培養におけるウイルス複製を向上し得る
ワクチンシードに見られる更なる置換（元のクローンからの０．０６％のｎｔの差）
ａ．ｎｔ−２２５（Ｃ遺伝子）Ａ→Ｔサイレント変異（太字）
ｂ．ＮＳ２Ａ−６６ Ａｓｐ→Ｇｌｙ（ｎｔ−３６７４ Ａ→Ｇ）突然変異（太字）
ｃ．ＮＳ２Ａ−９９ Ｌｙｓ→Ｌｙｓ／Ａｒｇ混合（ｎｔ−３７７３ Ａ→Ａ／Ｇ混合、太字）
ｄ．ｎｔ−５３９１ Ｃ→Ｔ（ＮＳ３遺伝子）サイレント変異（太字）
ｅ．ＮＳ４Ａ−２１ Ａｌａ→Ｖａｌ（ｎｔ−６４３７ Ｃ→Ｔ、太字）
ｆ．ｎｔ−７０２６ Ｔ→Ｃ／Ｔ混合サイレント変異（太字）
ｇ．ｎｔ−９７５０ Ａ→Ｃサイレント変異（太字）

Claims (51)

1. 改変された弱毒生デング−２ウイルス株ＰＤＫ−５３に由来する非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、および、デング−１に由来する少なくとも１つの構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸キメラであって、前記弱毒生デング−２ウイルスは、核酸３８２３位に突然変異を含む少なくとも１つの更なる突然変異をさらに含み、ＮＳ２Ａ遺伝子のアミノ酸１１６位がイソロイシンに代わりロイシンである、核酸キメラ。
2. 前記弱毒生デング−２ウイルスは、４４０７位に突然変異をさらに含み、ＮＳ２Ｂのアミノ酸９２位がグルタミン酸に代わりアスパラギン酸である、請求項１に記載の核酸キメラ。
3. 前記弱毒生デング−２ウイルスは、７１４８位に突然変異をさらに含み、ＮＳ４Ｂのアミノ酸１０８位がトレオニンに代わりイソロイシンである、請求項１に記載の核酸キメラ。
4. 前記弱毒生デング−２ウイルスは、７３１１位に突然変異をさらに含む、請求項１に記載の核酸キメラ。
5. 前記第２のヌクレオチド配列は、２３８４位に突然変異をさらに含むデング−１に由来するＥタンパク質をコードするとともに、前記Ｅタンパク質のアミノ酸４８３位がグリシンに代わりアラニンである、請求項１に記載の核酸キメラ。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸キメラ、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
7. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸キメラによってコードされるポリペプチド、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
8. 対象において免疫応答を誘導する方法であって、薬学的に許容される量の請求項６または７に記載の組成物を投与することを含み、前記組成物が対象においてデングウイルスに対する免疫応答を誘導する、方法。
9. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸配列をコードするベクター。
10. 改変された弱毒生デング−２ウイルス株ＰＤＫ−５３をコードする核酸配列を含む核酸配列であって、前記弱毒生デング−２ウイルスは、核酸６４８１位の突然変異を含む少なくとも１つの更なる突然変異をさらに含み、ＮＳ４Ａ遺伝子のアミノ酸３６位がアラニンに代わりプロリンである、核酸配列。
11. 前記弱毒生デング−２ウイルスは７１５６位に突然変異をさらに含み、ＮＳ４Ｂのアミノ酸１１１位がロイシンに代わりフェニルアラニンである、請求項１０に記載の核酸配列。
12. 前記弱毒生デング−２ウイルスは８８０３位に突然変異をさらに含み、ＮＳ５のアミノ酸４１２位がイソロイシンに代わりバリンである、請求項１０に記載の核酸配列。
13. 前記弱毒生デング−２ウイルスは５９２位に突然変異をさらに含み、ｐｒＭのアミノ酸５２位がリジンに代わりグルタミン酸である、請求項１に記載の核酸配列。
14. 請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の核酸キメラ、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
15. 請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の核酸配列によってコードされるポリペプチド、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
16. 対象において免疫応答を誘導する方法であって、薬学的に許容される量の請求項１４または１５に記載の組成物を投与することを含み、前記組成物が対象においてデングウイルスに対する免疫応答を誘導する、方法。
17. 請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の核酸配列をコードするベクター。
18. 改変された弱毒生デング−２ウイルス株ＰＤＫ−５３に由来する非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、および、デング−３に由来する少なくとも１つの構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸キメラであって、前記弱毒生デング−２ウイルスは、核酸６４３６位に突然変異を含む少なくとも１つの更なる突然変異をさらに含み、Ｎ４２Ａ遺伝子のアミノ酸２３位がアスパラギン酸に代わりアスパラギンである、核酸キメラ。
19. 前記弱毒生デング−２ウイルスは、７６２０位に突然変異をさらに含む、請求項１６に記載の核酸キメラ。
20. 前記第２の核酸配列は、１６０３位に突然変異をさらに含むデング−３に由来するＥタンパク質をコードし、前記Ｅタンパク質のアミノ酸２２３位がトレオニンに代わりセリンである、請求項１６に記載の核酸キメラ。
21. 請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の核酸キメラ、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
22. 請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の核酸キメラによってコードされるポリペプチド、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
23. 対象において免疫応答を誘導する方法であって、薬学的に許容される量の請求項２１または２２に記載の組成物を投与することを含み、前記組成物が対象においてデングウイルスに対する免疫応答を誘導する、方法。
24. 請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の核酸配列をコードするベクター。
25. 改変された弱毒生デング−２ウイルス株ＰＤＫ−５３に由来する非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、および、デング−４に由来する少なくとも１つの構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸キメラであって、前記弱毒生デング−２ウイルスは、核酸３６７４位に突然変異を含む少なくとも１つの更なる突然変異をさらに含み、ＮＳ２Ａ遺伝子のアミノ酸６６位がアスパラギン酸に代わりグリシンである、核酸キメラ。
26. 前記弱毒生デング−２ウイルスは、３７７３位に突然変異をさらに含み、ＮＳ２Ａのアミノ酸９９位がリジンに代わりアルギニンである、請求項２２に記載の核酸キメラ。
27. 前記弱毒生デング−２ウイルスは、５３９１位に突然変異をさらに含む、請求項２２に記載の核酸キメラ。
28. 前記弱毒生デング−２ウイルスは、６４３７位に突然変異をさらに含み、ＮＳ４Ａのアミノ酸２１位がアラニンに代わりバリンである、請求項２２に記載の核酸キメラ。
29. 前記弱毒生デング−２ウイルスは、７０２６位に突然変異をさらに含む、請求項２２に記載の核酸キメラ。
30. 前記弱毒生デング−２ウイルスは、７５３８位に突然変異をさらに含み、ＮＳ４Ｂのアミノ酸２３８位がセリンに代わりフェニルアラニンである、請求項２２に記載の核酸キメラ。
31. 前記弱毒生デング−２ウイルスは、９７５０位に突然変異をさらに含む、請求項２２に記載の核酸キメラ。
32. 前記弱毒生デング−２ウイルスは、２２５位に突然変異をさらに含む、請求項２２に記載の核酸キメラ。
33. 請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の核酸キメラ、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
34. 請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の核酸キメラによってコードされるポリペプチド、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
35. 対象において免疫応答を誘導する方法であって、薬学的に許容される量の請求項３３または３４に記載の組成物を投与することを含み、前記組成物が対象においてデングウイルスに対する免疫応答を誘導する、方法。
36. 請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の核酸配列をコードするベクター。
37. 配列番号１、７、および１０によって特定される１つ以上の核酸配列を含む核酸配列。
38. 前記核酸キメラは配列番号２、３、８、９、１１または１２によって表されるポリペプチドをコードする、請求項３３に記載の核酸。
39. 請求項３７に記載の１つ以上の核酸配列または請求項３８に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む免疫原性組成物。
40. 弱毒生デング−２ウイルスをさらに含む、請求項３９に記載の組成物。
41. 前記弱毒生デング−２ウイルスは、配列番号４の核酸配列または配列番号５および６のうちの１つ以上のアミノ酸配列によって表される、請求項４０に記載の組成物。
42. 前記組成物は全４種のデングウイルス血清型、四価組成物を含む、請求項４０に記載の組成物。
43. 黄熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびこれらの２つ以上の組合せのうちから選択されるフラビウイルスに対する免疫原性組成物をさらに含む、請求項３９に記載の組成物。
44. 少なくとも１つの請求項１〜５、１０〜１３、１８〜２０および２５〜３２のいずれか一項に記載の核酸配列；または少なくとも１つの請求項６、７、１４、１５、２１、２２、３３および３４のいずれか一項に記載の組成物、および容器を含むキット。
45. １つ以上の請求項１〜５、１０〜１３、１８〜２０および２５〜３２のいずれか一項に記載の核酸配列を含む弱毒生ウイルス。
46. 表３の核酸配列を含む１つ以上の核酸配列によってコードされる、核酸配列またはポリペプチド。
47. ＤＥＮＶａｘ−１−Ａ、ＤＥＮＶａｘ−２−Ｆ、ＤＥＮＶａｘ−３−Ｆ、およびＤＥＮＶａｘ−４−Ｆのうちの１つ以上を含む１つ以上の核酸配列によってコードされる、核酸配列またはポリペプチド。
48. 請求項４７に記載の核酸配列によってコードされる１つ以上の核酸配列またはポリペプチドと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む組成物。
49. 薬学的に許容されるアジュバントをさらに含む、請求項４８に記載の組成物。
50. 請求項４５に記載の１つ以上の弱毒生ウイルスと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
51. 前記組成物は、対象において全４種のデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導可能な四価デングウイルス組成物を含む、請求項５０に記載の組成物。