KR20220054892A - 백신 내의 뎅기 바이러스 키메라 구조체를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

백신 내의 뎅기 바이러스 키메라 구조체를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서 구현예는 뎅기 바이러스 구조체 및 생약독화 뎅기 바이러스의 조성물, 용도 및 제조방법을 제공한다. 일부 구현예는 4가 뎅기 바이러스 조성물을 포함하는 조성물에 관한 것이지만, 이에 한정되지 아니한다. 어떤 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 뎅기 바이러스 혈청형, 예컨대 뎅기-1(DEN-1) 바이러스, 뎅기-2(DEN-2) 바이러스, 뎅기-3(DEN-3) 또는 뎅기-4(DEN-4) 바이러스의 구조체를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명에서 개시된 구조체는 포유동물 세포에서 이어서 계대배양될 수 있거나, 될 수 없는 하나 이상의 뎅기 바이러스 구조체에 대한 백신을 발생시키기 위해 조성물에 병용될 수 있다.

Description

백신 내의 뎅기 바이러스 키메라 구조체를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR DENGUE VIRUS CHIMERIC CONSTRUCTS IN VACCINES}
우선권
본 발명은 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 제61/800,204호에 대한 우선권을 주장한다. 이 발명은 모든 목적을 위해 개시된 내용 전체가 인용에 의해 본 발명에 포함된다.
연방 자금 지원을 받은 연구
본 발명에 개시된 일부 구현예는 미국 국립 보건원에서 연구비 번호 R43 AI084291-01에 의해 일부 지원되었다. 미국 정부는 본 발명을 실시하기 위한 특정 권리를 가질 수 있다.
분야
본 발명에서 구현예는 뎅기 바이러스 구조체 및 이의 백신 조성물을 위한 조성물, 방법, 용도 및 제조 방법 순서를 제공한다. 일부 구현예는 단독 또는 백신 조성물에서 사용될 수 있는 다른 구조체와 병용하는 키메라 플라비바이러스 바이러스 구조체를 포함하는 조성물에 관한 것이나, 이에 한정되지 아니한다. 어떤 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 뎅기 바이러스 혈청형, 예컨대 뎅기-1(DEN-1) 바이러스, 뎅기-2(DEN-2) 바이러스, 뎅기-3(DEN-3) 바이러스 및/또는 뎅기-4(DEN-4) 바이러스의 구조체를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 제조방법 전략은 재조합 생약독화 키메라 뎅기 백신(DENVax) 바이러스의 안전성 및 유전적 안정성를 개선할 수 있다. 어떤 구현예는 백신 조성물에서 안전하고 효과적인 것으로 확인된 뎅기 바이러스 키메라 구조체와 병용하는 적어도 하나의 생약독화 뎅기 바이러스를 포함하고, 상기 구조체는 세포 배양에서 추가적인 계대배양(passage)을 받은 구조체이다.
뎅기 바이러스에 의한 감염은 다른 중증도의 고통스러운 열을 초래할 수 있다. 지금까지, 4개의 혈청형 뎅기 바이러스가 확인되었다: 뎅기-1(DEN-1), 뎅기-2(DEN-2), 또는 뎅기-4(DEN-4)와 병용하는 뎅기-3(DEN-3). 뎅기열은 뎅기 바이러스의 감염에 의해 유발된다. 미래에 다른 아형(subtype)이 발견될 수 있다(예를 들면, DEN-5). 뎅기 바이러스 혈청형 1-4는 또한 뎅기 출혈열(dengue hemorrhagic fever, DHF) 및 뎅기 쇼크 증후군(dengue shock syndrome, DSS)을 유발할 수 있다. 감염, DHF 및 DSS의 가장 심각한 결과는 생명을 위협하는 것일 수 있다. 뎅기 바이러스는 매년 50-100 백만 건의 쇠약하게 하는 뎅기열, 500,000건의 DHF/DSS 및 20,000명 이상의 사망을 유발한다. 지금까지 뎅기열에 대하여 보호하기 위한 효과적인 백신 및 이 질환을 위한 약물 치료는 없다. 모기 제어 노력은 풍토병 영역에서 뎅기 발생을 예방하는 것 또는 이 질환의 지리학상 확장을 추가로 예방하는 것에 효과가 없었다. 35억명의 사람들이 뎅기 바이러스에 감염에 의해 위협받고 있는 것으로 추정된다. 게다가, 뎅기 바이러스는 풍토병 영역, 예컨대 아시아, 중앙 및 남아메리카, 및 카리브해 지역으로의 여행자에서 열 유발을 초래하고 있다.
4개의 모든 뎅기 바이러스 혈청형은 세계의 열대 지방 도처에서 풍토병이고, 열대 지방, 세계에서 인간을 위협하는 가장 현저한 모기-매개 바이러스로 여겨진다. 뎅기 바이러스는 이집트 숲모기(Aedes aegypti)에 의해 1차로 인간에게 전달된다. 하나의 뎅기 바이러스 혈청형에 의한 감염은 그 혈청형에 의한 재감염으로부터 일생 동안 보호하지만, 다른 3개의 뎅기 바이러스 항원현 중 하나에 의한 2차 감염은 예방하지 못한다. 사실, 하나의 뎅기 바이러스 혈청형에 의한 이전의 감염은 다른 혈청형에 의한 2차 감염시 심각한 질환(DHF/DSS)의 증가된 위험을 초래한다. 효과적인 백신의 개발은 이 지구의 발생하는 질환의 예방 및 제어를 위한 중요한 접근법을 나타낸다. 다중 면역화는 뎅기 바이러스 풍토병 국가뿐만 아니라 여행자 모두를 위한 공중 보건 노력을 위한 완전한 백신 접종을 어렵게 만든다.
본 발명에서 구현예는 키메라 뎅기 바이러스 구조체의 조성물, 방법 및 용도에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 다른 뎅기 바이러스 혈청형 유래 구조 유전자와 약독화 뎅기 바이러스 백본을 가지는 키메라 뎅기 바이러스 구조체를 포함할 수 있다. 다른 구현예는 하나 이상의 키메라 뎅기 바이러스와 병용하는 적어도 하나의 생약독화 바이러스에 관한 것이다. 다른 구현예는 변형된 DEN-2 백본(예를 들면, P1(계대배양-1)에서 개시 백본으로 PDK-53, 및 P2, P3, ...P8..P10 등으로 나타내는 바와 같은 계대배양 변이성(허용 세포주(permissive cell line)에서 시험관 내에서 계대배양되고 성장된 후)); 및 하나 이상의 DEN-1, DEN-2, DEN-3 또는 DEN-4의 구조 성분을 가지는 키메라 뎅기 바이러스의 조성물을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물은 개체로 도입할 때에 발생되고, 상기 조성물은 개체에서 하나 이상의 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 생산한다. 따라서, 본 발명에서 고려되는 구조체는 시험관 내에서 발생될 수 있고, 계대배양될 수 있으며, 각 계대배양은 약학적으로 허용가능한 백신 조성물에서 이용이 고려되는 약독화 뎅기 바이러스를 제공한다. 어떤 구현예에서, 약독화 바이러스는 단독 또는 하나 이상의 키메라 뎅기 바이러스와 병용하는 생약독화 뎅기-2 바이러스일 수 있다.
특정 실시예에서, 뎅기 바이러스 혈청형의 키메라 뎅기 바이러스 구조체는 서열번호: 1, 4, 7 및 10으로 나타내는 핵산 서열 또는 서열번호: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 및 12로 나타내는 폴리펩티드 서열을 가지는, 계대배양 7(P7) 생약독화 바이러스 또는 키메라성 바이러스를 포함할 수 있다. 본 발명에서 기재된 임의의 상기 생약독화 바이러스를 위한 임의의 계대배양은 상기 나타낸 뎅기 바이러스(예를 들면, 혈청형 1-4)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물에 사용될 수 있는 것이 본 발명에서 고려된다. 이러한 구현예에 따르면, P-8 분리된 생약독화 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물은 상기 선택된 구조체에 따라 하나 이상의 뎅기 바이러스 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도하기 위하여 개체에 투여될 수 있다. 게다가, 생약독화 바이러스는 하나 이상의 이러한 키메라성 바이러스와 병용될 수 있다. 이것은 각 다음 세포 계대배양(예를 들면, 아프리카 사바나 원숭이 Vero 세포 생산, 이하 'Vero 세포'로 기재함)에서 분리된/생산된 상기 생약독화 바이러스 각각에 대하여 고려된다. 뎅기 바이러스를 생산할 수 있는 임의의 세포주(예를 들면, GMP-생산 세포 은행, FDA 또는 EMA-승인된)는 제조 방법 스케일에서 또는 뎅기 바이러스에 대한 백신 또는 면역원성 조성물에 다음 이용을 위하여 본 발명에서 적절히 고려되는 것과 같이 임의의 상기 바이러스 구조체를 계대배양하는 것에 유용한 것이 본 발명에서 고려된다.
다른 구현예에서, 본 발명에서 고려된 조성물은 다른 플라비바이러스, 예컨대 웨스트 나일 바이러스, 일본 뇌염 또는 임의의 다른 플라비바이러스 키메라 구조체 및/또는 생약독화 바이러스에 대한 다른 면역원성 조성물과 병용될 수 있다. 어떤 구현예에서, 단독 조성물은 복수의 플라비바이러스에 대하여 사용될 수 있다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및/또는 DEN-4에 대한 키메라 뎅기 바이러스, 단독 또는 생약독화 뎅기 바이러스 조성물과 병용하는 것을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 구조체는 개체로 도입시에, 상기 바이러스의 약독화 또는 안정성에 영향을 미치는 것 없이 성장 또는 생산을 증가시키는 상기 바이러스의 구조 또는 비구조 영역에서 유도적 돌연변이를 가지는 구조체를 포함할 수 있다. 어떤 구현예에서, 임의의 상기 고려된 키메라 뎅기 바이러스 구조체는 백본으로 사용된 특이적 돌연변이를 가지는 생약독화 DEN-2 바이러스를 포함할 수 있고, 상기 생약독화(live, attenuated) DEN-2 PDK 바이러스는 추가로 하나 이상의 prM(premembrane)의 구조 단백질 및 다른 뎅기 바이러스 혈청형의 E(envelope) 구조 단백질을 추가로 포함한다. 게다가, DEN-2 백본은 개체로 투여시 소정의 조성물(예를 들면. 키메라 뎅기 바이러스 2/1, 2/3 또는 2/4)에 대한 면역 반응의 생산을 증가시키거나, 면역 반응을 향상시키기 위하여 추가적인 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 구조 단백질 유전자는 생약독화 뎅기 바이러스의 일부인 하나 이상의 돌연변이를 가지는 DEN-2 백본에 DEN-1, DEN-2, DEN-3 또는 DEN-4의 유전자의 prM 및 E 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 뎅기 구조체는 어떤 구현예에서 DENVax-1-A, DENVax-2-F, DENVax-3-F, 및 DENVax-4-F(실시예 부분 참조)로 일컫는 이러한 구조체를 포함할 수 있고, 상기 DEN-2 백본은 면역 반응을 유도하기 위해 안전하고 효과적인 것으로 이전에 확인된 상기 DEN-2 생약독화 바이러스 유래 하나 이상의 돌연변이(예를 들면, 상기 P1 또는 다른 이전에 계대배양된 바이러스 또는 PDK-53에서 발견되지 않은)를 갖는다. 본 발명의 상기 DEN-2 생약독화 바이러스는 원래의 사용된 DEN-2 생약독화 바이러스의 개선된 버전이다. 본 발명의 키메라 구조체는 상기 제2 뎅기 바이러스 혈청형의 하나 이상의 구조 단백질을 가지는 변형되고 약독화 DEN-2 PDK-53 백본을 포함할 수 있고, 상기 구조 단백질은 상기 키메라 구조체에 대한 면역 반응을 증가시키기 위하여 추가적인 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약독화 DEN-2 PDK-53에 의해 수득된 특정 돌연변이는 생산 등을 위한 바람직한 특성을 만들 수 있는 상기 P1 구조체와 전혀 다른 구조체에서 보존적 아미노산 변경을 생산하거나 하지 않을 수 있다.
다른 구현예에서, 생약독화 DEN-2 게놈은 뎅기 바이러스 혈청형 1(DEN-1) 및 뎅기 바이러스 혈청형 3(DEN-3), 뎅기 바이러스 혈청형 4(DEN-4)의 구조체를 발생시키기 위하여 사용될 수 있고, 상기 DEN-2 바이러스 게놈의 하나 이상의 구조 단백질 유전자는 DEN-1, DEN-3 또는 DEN-4 각각의 하나 이상의 구조 단백질 유전자로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 구조 단백질은 제2 뎅기 바이러스의 C, prM 또는 E 단백질일 수 있다. 어떤 구현예에서, 구조 단백질 유전자는 상기 DEN-1, DEN-3 또는 DEN-4의 prM 및 E 유전자를 포함한다. 이러한 융합 바이러스는 상기 모(parent) 약독화 DEN-2의 약독화 표현형을 유지하면서, DEN-1, DEN-3 또는 DEN-4의 표면 항원을 발현한다.
본 발명에서 개시된 구조체는 백본으로 약독화 DEN-2 바이러스를 사용하여 DEN-1, DEN-3 및 DEN-4의 표면 항원을 발현하는 DEN-4, DEN-2, DEN-1 및 DEN-3의 키메라 구조체를 포함할 수 있다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 발명에서 개시된 단독 키메라 뎅기 바이러스 구조체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 다른 한편으로는, 본 발명의 조성물은 본 발명에 개시된 둘 이상 또는 셋 이상의 키메라 뎅기 바이러스 구조체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 본 발명에서 고려된 하나 이상의 뎅기 바이러스 키메라 구조체는 하나 이상의 생약독화 뎅기 바이러스와 병용될 수 있다. 어떤 구현예에서, 생약독화 바이러스는 생약독화 DEN-2 바이러스일 수 있고, NCR, NS1 영역 또는 다른 영역에서 추가적인 돌연변이는 면역 반응을 증가시키거나, 개선된 생약독화 뎅기 바이러스에 대한 바이러스 성장 또는 다른 개선을 증가시킨다.
어떤 구현예에서, 약독화 유전자자리(attenuation loci)인 상기 DENV-2 백신의 뉴클레오티드 5'NCR-57-T, NS1- 53-Asp, 및 NS3-250-Val은 이전에 결정되었고, 모든 이러한 변경은 4개의 DENVax 바이러스의 일반적인 PDK-53 바이러스 특이적 유전적 배경에 의해 공유된다. 상기 3개의 약독화 유전자자리의 유전 서열뿐만 아니라, 이러한 백신 후보의 이전에 수립된 시험관 내 및 생체 내에서 약독화 표현형은 cGMP-가공된 DENVax 시드(seed)에 대하여 주의깊게 모니터되었다. 본 발명은 마스터 바이러스 시드(master virus seed, MVS)를 발생시키기 위하여 사용된 전략뿐만 아니라, 뎅기 바이러스 백신 조성물의 제조에서 이들의 유전적 및 표현형 특성의 용도를 기재한다. 이러한 MVS는 임상 재료의 제조 및 결국 상업용 백신 공급품의 제조에 사용될 수 있다.
하기의 도면은 본 명세서의 일부를 구성하고, 어떤 구현예를 추가로 입증하는 것이 포함된다. 일부 구현예는 하나 이상의 이러한 도면 단독 또는 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 병용하여 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 이전에 발생된 구조체 및 야생형 뎅기 바이러스에 비하여 본 발명의 예시적인 키메라 구조체인 DEN-2/DEN-4를 반영하는 예시적인 차트를 나타낸다.
도 2는 생약독화 DEN-2 백본(추가적인 돌연변이가 있는); 및 상기 뎅기-2 구조 성분(예를 들면, DENVax-1 MVS)에 대하여 치환된 구조 성분으로서 제2 뎅기 바이러스 혈청형;을 이용하여 다양한 반응을 비교한 예시적인 히스토그램 플롯을 나타낸다. 이 플롯은 상기 DENVax MVS의 플라크 사이즈를 예시한다. 야생형 뎅기 바이러스 및 이전에 출판된 연구-등급 백신 후보 바이러스가 대조 및 비교를 위해 포함되었다. 이 플롯은 대조군 뎅기 바이러스 키메라 구조체에 비하여 상기 뎅기 바이러스 구조체의 개선된 생산을 예시한다.
도 3은 DENVax MVS(마스터 바이러스 시드)의 온도 민감성을 나타내는 예시적인 히스토그램 플롯을 나타낸다. 야생형 뎅기 바이러스 및 이전에 출판된 연구-등급 백신 후보 바이러스가 상기 MVS 등급과 비교를 위해 포함되었다.
도 4는 대조군에 비하여 C6/36 세포에서 DENVax MVS의 바이러스 성장을 나타내는 예시적인 히스토그램 플롯을 나타낸다. 야생형 뎅기 바이러스 및 연구-등급 백신 후보 바이러스가 상기 DENVax MVS와 비교를 위해 포함되었다.
도 5의 A 내지 C는 신생 마우스에서 신경병원성의 예시적인 플롯을 나타낸다. 상기 바이러스 104 pfu로 ic 시험된 신생 마우스 CDC-ICR(n=72) 및 Taconic-ICR(n=32) 내의 wt DENV-2 16681 바이러스의 신경병원성을 요약하는 몇몇의 실험을 모은 결과(pooled result)(A). 104 pfu(B) 또는 103 pfu(C)의 투여량으로 Taconic-ICR 마우스에서 시험된 DENVax MVS의 신경병원성. 하나의 실험(n=16) 또는 2개를 모은 실험(pooled experiment)(n=31 또는 32)의 그룹당 시험된 동물의 수가 표시된다.
도 6은 상기 DENVax MVS, WVS, 및 BVS의 플라크 크기를 나타내는 예시적인 히스토그램을 나타낸다. 9pi일에 아가로스 오버레이 하의 Vero 또는 LLC-MK2 세포의 바이러스 플라크의 평균 플라크 직경 ± SD(오차 막대)을 측정하였다. 야생형 DENV 및 이전에 출판된 연구-등급 백신 후보 바이러스가 대조 및 비교를 위해 포함되었다.
도 7은 대규모 제조방법 후에 이 시험관 내에서 약독화 마커의 그들의 유지를 확인하기 위하여 2개의 배양 온도에서 C6/36 세포에서 DENVax MSV, WVS, 및 BVS의 성장을 나타내는 예시적인 히스토그램 플롯을 나타낸다.
도 8은 C6/36 세포에서 DENVax MVS, WVS, 및 BVS의 제한된 성장을 플롯팅한 예시적인 히스토그램을 나타낸다. 7일 pi C6/36 세포에서 반복 검증된 상기 바이러스의 평균 역가 ± SD(오차 막대). 상기 wt 뎅기 바이러스 및 이전에 출판된 연구-등급 백신 후보 바이러스가 비교군을 위해 포함되어 있다.
도 9의 A 및 B는 신생 ICR 마우스에서 DENVax MVS의 신경병원성의 데이터의 예시적인 그래프를 나타낸다.
(A)104 PFU의 투여량에서의 상기 바이러스의 IC 접종
(B)103 PFU의 투여량에서의 상기 바이러스의 IC 접종
도 10은 새로운 생약독화 바이러스와 이전에 발생된 생약독화 뎅기 바이러스를 비교하는 예시적인 차트를 나타낸다.
정의
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "한(a)" 또는 "하나의(an)"는 하나 또는 하나 이상의 항목을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "개체" 또는 "개체들"은 포유동물, 예컨대 인간 또는 포유동물, 사육된 또는 야생의, 예를 들면 개, 고양이, 다른 애완 동물(예를 들면, 햄스터, 기니아 피그, 마우스, 랫), 페릿(ferret), 토끼, 돼지, 말, 소, 프레리독, 야생 설치류 또는 동물원 동물을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 아니한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은, 상기 용어 "바이러스 키메라", "키메라성 바이러스", "플라비바이러스 키메라" 및 "키메라성 플라비바이러스"는 뎅기-2 바이러스의 뉴클레오티드 서열의 일부 및 추가로 뎅기-2 바이러스 유래가 아닌 또는 다른 플라비바이러스 유래인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 구조체를 의미할 수 있다. "뎅기 키메라"는 적어도 2개의 다른 뎅기 바이러스 혈청형을 포함하지만, 다른 플라비바이러스는 아니다. 따라서, 다른 뎅기 바이러스 또는 플라비바이러스의 예는 뎅기-1 바이러스, 뎅기-3 바이러스, 뎅기-4 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 진드기매개 뇌염 바이러스, 황열병 바이러스 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 아니한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은, "핵산 키메라"는 뎅기-2 바이러스의 뉴클레오티드 서열의 일부를 포함하는 핵산 및 추가로 뎅기-2 바이러스의 뉴클레오티드 서열과 동일한 기원이 아닌 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 구조체를 의미할 수 있다. 상대적으로 본 발명에 개시된 임의의 키메라성 플라비바이러스 또는 플라비바이러스 키메라가 핵산 키메라의 예로서 인식될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은, "생약독화 바이러스"는 백신 또는 다른 면역원성 조성물에서 특성의 이용을 위한 야생형 바이러스, 돌연변이된 또는 선택된 것을 의미할 수 있고, 일부 특성은 감소된 병독성, 안정성, 효과 또는 개선된 성장 등을 포함할 수 있다.
설명
하기 부분에서, 다양한 구현예를 열거하기 위하여 다양한 예시적인 조성물 및 방법이 기재된다. 상기 다양한 구현예를 수행하는 것은 본 발명에서 개략적으로 나타내는 특정한 설명의 모두 또는 심지어 일부의 사용을 필요로 하는 것이 아니라, 오히려, 농도, 시간 및 다른 특정한 설명이 통상적인 실험을 통해 변형될 수 있다는 것이 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 일부 경우에서, 잘 알려진 방법 또는 성분이 상기 설명에 포함되지 않았다.
본 발명의 구현예에 따라서, 본 기술 분야 내의 관습적인 분자 생물학, 단백질 화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술은 상기 문헌에 충분히 설명된다. 예를 들면, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed.,1986 참조.
본 발명에서 구현예는 개체 내에서 하나 이상의 뎅기 바이러스 혈청형에 대하여 독립적으로 또는 동시에 면역 반응을 유도하기 위한 조성물, 방법 및 용도에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따르면, 약독화 뎅기 바이러스 및 핵산 키메라가 발생되고, 본 발명에 개시된 백신 조성물에 사용된다. 일부 구현예는 변형된 또는 돌연변이된 뎅기 구조체 또는 키메라에 관한 것이다. 다른 구현예는 뎅기 바이러스의 구조 단백질의 아미노산 서열을 변형시키기 위하여 돌연변이를 유도하는 것에 관한 것이고, 상기 돌연변이는 상기 바이러스에 대한 면역원성을 증가시킨다.
생약독화 뎅기 바이러스의 4개의 모든 혈청형은 세포 배양에서 야생형 바이러스를 계대배양함으로써 개발되었다. 이것은 플라비바이러스 및 특히 뎅기 바이러스 감염 및/또는 질환에 대하여 면역화에 대한 가장 유망한 생약독화 백신 후보의 일부이다. 이러한 백신 후보는 그들의 뎅기 혈청형, 그들이 계대배양된 것을 통한 상기 세포주 및 그들이 계대배양된 횟수의 병용에 의해 표기되었다. 따라서, PDK 세포에서 13회 계대배양된 뎅기 혈청형 1 야생형 바이러스는 DEN-1 PDK-13로 표기된다. 다른 백신 후보는 DEN-2 PDK-53, DEN-3 PGMK-30/FRhL-3이다(예를 들면, 1차 사바나 원숭이 신장 세포에서 30회 계대배양, 후에 레서스 원숭이 태아 폐 세포에서 3회 계대배양 및 DEN-4 PDK-48). 이러한 4개의 후보 백신 바이러스는 모(parental) 야생형 DEN-1 16007, DEN-2 16681, DEN-3 16562 및 DEN-4 1036 각각의 조직 배양 계대배양에 의해 유래되었다.
어떤 구현예에서, 생약독화 뎅기-2 PDK-53 백신 바이러스는 다른 뉴클레오티드 차이점을 함유하는 상기 개체군과 바이러스의 혼합물을 함유한다. 상기 약독화 돌연변이의 유전적 특성분석 후에, 특정한 약독화 특징은 개략적으로 나타내고, cDNA 감염성 클론으로 제작되었다. 새로운 특징화되고, PDK-53-Vero-DEN-2-P1 바이러스(예를 들면, 표 1 참조) 유래된 계대배양 1로서, RNA가 이 감염성 클론으로부터 전사되었고 Vero 세포로 도입되었다. 이 약독화 바이러스는 DEN-1, DEN-3 및 DEN-4에 대해서는 각 DEN 혈청형에 대하여 만들어지고, 상기 prM 및 E 유전자는 3개의 분리된 감염성 클론으로 제작되며, 따라서 4개의 분리된 PDK-53-Vero 바이러스를 발생시켰다(본 발명에서 PDK-53-Vero-DEN-2-P 1, PDK-53 -Vero-DEN-1-P 1, PDK-53-Vero-DEN-3-P 1, 및 PDK-53-Vero-DEN-4-P 1로 일컫는). 이러한 약독화 백신 바이러스 균주는 Vero 세포에서 10회 계대배양되고(표 1), Vero 세포에서 성장하기 위하여 그들의 적응시 각 분리된 계열은 돌연변이를 수득하였다(표 3). 본 발명에서 어떤 구현예는 이러한 생약독화 뎅기 바이러스에 대한 유도물 및 용도에 관한 것이다.
이러한 약독화 바이러스로 이전의 인간 임상 실험은 DEN-2 PDK-53이 인간에서 가장 낮은 감염성 투여량(5 플라크 형성 단위 또는 PFU의 50% 최소 감염성 투여량)을 가지고, 강한 면역원성이며, 어떠한 명백한 안정성 문제도 유발하지 않는 것을 나타내었다. 상기 DEN-1 PDK-13, DEN-3 PGMK-30/FRhL-3 및 DEN-4 PDK-48 백신 바이러스 후보는 인간에서 각각 10,000, 3500, 및 150 PFU의 보다 높은 50% 최소 감염성 투여량을 갖는다. 인간 개체에서 100% 혈청변환을 달성하기 위하여 1가 DEN-2 PDK-53 바이러스 또는 DEN-4 PDK-48 바이러스로 하나의 면역화만이 필요하긴 했지만, 인간에 대하여 2개의 가장 높은 감염성 투여량을 가지는 DEN-1 PDK-13 및 DEN-3 PGMK-30/FRhL-3 바이러스에 대한 상기 동일한 혈청변환 비율을 달성하기 위하여 부스터가 필요했다.
또한 PDK-53로 축약된 DEN-2 PDK-53 바이러스 백신 후보는, 온도 민감성, 작은 플라크 사이즈, 모기 C6136 세포 배양에서 감소된 복제, 온전한 모기에서 감소된 복제, 이유 마우스(suckling mice)에 대한 신경병원성의 감소 및 원숭이에서 바이러스혈증의 감소된 발생 정도를 포함하는 약독화와 관련된 몇몇의 측정가능한 생물학적 마커를 갖는다. 후보 PDK-53 백신의 임상 실험은 인간에서 그것의 안정성 및 면역원성을 확인하였다. 또한, 상기 PDK-53 백신은 인간 백신 수용자에서 뎅기 바이러스 특이적 T-세포 기억 반응을 유도한다. 본 발명에서 일부 구현예는 본 발명에 개시된 키메라성 구조체에서 사용된 상기 DEN-2 PDK-53에 대한 개선을 기재한다.
뎅기-2 바이러스 백본 및 적어도 하나의 다른 뎅기 바이러스 혈청형의 구조 단백질을 가지는 면역원성 플라비바이러스 키메라는 뎅기 바이러스 키메라를 준비하는 것 및 기재된 상기 뎅기 바이러스 키메라를 생산하기 위한 방법에 대하여 사용될 수 있다. 상기 면역원성 뎅기 바이러스 키메라는 단독 또는 하나 이상의 혈청형, 예컨대 뎅기 바이러스 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4, 단독 또는 병용에 의한 감염에 대한 개인을 최소화, 억제 또는 면역화하기 위하여 면역원성 조성물로서 약학적으로 허용가능한 담체를 병용으로 제공된다. 병용시, 상기 면역원성 뎅기 바이러스 키메라는 하나 이상의 플라비바이러스의 한 종 또는 균주에 의한 감염에 대한 동시 방지를 부여하기 위하여 다가 백신(예를 들면, 2가, 3가 및 4가)으로서 사용될 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 뎅기 바이러스 키메라는 상기 알려진 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 2가, 3가 또는 4가 백신으로서 유용한 면역원성 조성물에 병용되거나, 다른 플라비바이러스 유래 하나 이상의 단백질을 암호화하는 핵산을 포함함으로써 다른 병인성 플라비바이러스에 대한 면역력을 부여한다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 제공된 독성이 없는 면역원성 뎅기 바이러스 키메라는 상기 약독화 뎅기-2 바이러스(예를 들면, PDK-53)의 비구조 단백질 유전자 또는 이들의 등가물; 및 개체에 도입되는 것이 면역원성인 상기 플라비바이러스의 하나 이상의 구조 단백질 유전자 또는 이들의 면역원성 부분;을 함유한다. 예를 들면, 일부 구현예는 바이러스 백본으로서 약독화 뎅기-2 바이러스 PDK-53 게놈; 및 DEN-1, DEN-3 또는 DEN-4 또는 상이한 플라비바이러스 또는 상이한 뎅기 바이러스 혈청형과 같이 그로부터 보호되어야 할 다른 플라비 바이러스 유래의 하나 이상의 상응하는 구조 단백질 유전자로 교체되는, 상기 PDK-53 게놈의 캡시드, 전막(premembrane)/막, 또는 외피(envelope)를 암호화하는 하나 이상의 구조 단백질 유전자, 또는 이들의 조합;을 가지는 키메라에 관한 것이다. 이러한 구현예에 따르면, 본 발명에 개시된 핵산 키메라는 상기 약독화 뎅기-2 바이러스의 기능적 특성을 가질 수 있고, 독성이 없을 수 있지만, DEN-1, DEN-3 또는 DEN-4 게다가 다른 플라비바이러스의 구조 유전자 생산물의 항원성 에피토프를 발현할 수 있고, 면역성일 수 있다(예를 들면, 개체에서 유전자 생산물에 대한 면역 반응을 유도한다). 그 후에 이러한 DNA 구조체는 감염성 클론으로부터 RNA를 전사하기 위하여 사용되고, 이 RNA는 다시 Vero 세포로 도입되어 P1에서 새로운 자손 바이러스를 생산한다. 이러한 새로운 자손 바이러스는 PDK-53과 구별할 수 있다(예를 들면, P1-P10 참조).
다른 구현예에서, 핵산 키메라는 약독화 뎅기-2 바이러스 유래의 비구조 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열, 및 뎅기-4 바이러스 단독 또는 다른 플라비바이러스와 병용 유래 구조 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 키메라일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 다른 구현예에서, 상기 약독화 뎅기-2 바이러스는 하나 이상의 돌연변이된 아미노산을 가지는 백신 균주 PDK-53일 수 있다(실시예 참조). 이러한 추가적인 돌연변이는 본 발명에 기재된 생약독화 뎅기-2 또는 키메라성 구조체로서 이용의 바람직한 특성을 부여한다. 일부 구현예는 제2 뎅기 바이러스의 하나 이상의 C, prM 또는 E 단백질의 구조 단백질을 포함한다.
다른 측면은 키메라성 바이러스가 PDK-53 뎅기-2 게놈의 제어에 있어서 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 결실 또는 삽입, 예를 들면 표적 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역원성의 간섭을 감소시키기 위하여 포함할 수 있는 것을 포함한다. 이러한 변형은 구조 및 비구조 단백질 단독 또는 본 발명에 개시된 변형 예와 병용하여 만들어질 수 있고, 상기 약독화 바이러스를 계대배양하고, 하나 이상의 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하기 위하여 개선된 조성물을 얻음으로써 발생될 수 있다.
본 발명에 개시된 어떤 구현예는 재조합 기술을 이용하여 상기 필요한 치환을 상기 적절한 백본 게놈으로 삽입함으로써 본 발명의 상기 키메라성 바이러스를 만드는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 구현예는 추가적인 개선을 위하여 확인된(예를 들면, 안전한 및 효과적인) 생약독화 키메라성 바이러스를 계대배양하는 것에 관한 것이다. 어떤 구현예에서, 본 발명에 사용된 뎅기-2 백본은 표 3에 제시된 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 뎅기-뎅기 키메라는 표 3에 제시된 것과 같이 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 뎅기-뎅기 키메라는 Den-2/Den-1, Den-2/Den-3 또는 Den-2/Den-4에 대하여 표 3에 나타낸 바와 같이 각 키메라에 대하여 모든 돌연변이를 포함할 수 있다. 표 3의 구조체에 의해 나타낸 생약독화 바이러스를 포함하는 약학적 조성물이 고려된다. 예를 들면, 1가, 2가, 3가 또는 4가 조성물은 표 3에 제시된 바와 같이 키메라 및 생약독화 뎅기-2 바이러스를 이용한 본 발명에서 이용이 고려된다.
어떤 구현예에서, 본 발명에서 고려된 생약독화 DEN-2 변이체는 약학적 조성물로 제형화될 수 있고, 상기 약학적 조성물은 단독 또는 뎅기-뎅기 키메라 또는 뎅기-플라비바이러스 키메라와 병용하여 투여될 수 있다. 어떤 구현예에서, 2가, 3가 또는 4가 조성물은 단일 적용 또는 복수 적용으로 개체에 투여될 수 있다.
플라비바이러스 키메라
뎅기 바이러스 유형 1-4(DEN-1 내지 DEN-4)는 모기-매개 플라비바이러스 병원체이다. 상기 플라비바이러스 게놈은 5'-비암호화 영역(5'-NC), 그 다음 캡시드 단백질(C) 암호화 영역, 그 다음 전막/막 단백질(prM) 암호화 영역, 그 다음 외피 단백질(E) 암호화 영역, 그 다음 상기 비구조 단백질(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)을 암호화하는 영역 및 마지막으로 3' 비암호화 영역(3TSTC)을 포함한다. 상기 바이러스 구조 단백질은 C, prM 및 E이고, 비구조 단백질은 NS1-NS5이다. 상기 구조 및 비구조 단백질은 단일 다단백질로 번역되고 세포 및 바이러스의 프로테아제에 의해 처리된다.
플라비바이러스 키메라는 뎅기 바이러스 또는 플라비바이러스과의 한 유형 또는 혈청형 유래의 비구조 단백질 유전자와; 단백질 유전자, 예를 들면 뎅기 바이러스 또는 플라비바이러스과의 다른 유형 또는 혈청형 유래 구조 단백질 유전자;를 융합함으로써 형성된 구조체일 수 있다. 다른 한편으로는, 본 발명의 플라비바이러스 키메라는 뎅기 바이러스 또는 플라비바이러스과의 한 유형 또는 혈청형 유래의 비구조 단백질 유전자와; 추가로 다른 뎅기 바이러스 혈청형 또는 플라비바이러스과의 다른 바이러스로부터 선택되는 폴리펩티드 또는 단백질의 합성을 유도하는 뉴클레오티드 서열;을 융합함으로써 형성된 구조체이다.
다른 구현예에서, 본 발명에서 제공된 독성이 없는, 면역원성 플라비바이러스 키메라는 약독화 뎅기-2 바이러스의 비구조 단백질 유전자 또는 이들의 등가물; 및 면역원성이 부여되는 것인 플라비바이러스의 하나 이상의 구조 단백질 유전자, 또는 이들의 항원성 부분;을 함유한다. 적합한 플라비바이러스는 표 1에 열거된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 아니한다.
상기 키메라를 구성하는 것에 이용을 위한 다른 적합한 뎅기 바이러스는 야생형, 독성이 있는 DEN-1 16007, DEN-2 16681, DEN-3 16562 및 DEN-4 1036; 및 약독화 백신-균주 DEN-1 PDK-13, DEN-2 PDK-53, DEN-3 PMK-30/FRhL-3 및 DEN-4 PDK-48;일 수 있다. DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4 야생형/약독화 바이러스 쌍 사이의 유전적 차이점은 상기 바이러스 게놈에 의하여 암호화된 아미노산 서열의 변경에 따라 고려된다.
DEN-2 PDK-53에 대한 서열 목록은 상기 DEN-2 PDK-53-V 변이체에 해당하고, 게놈 뉴클레오티드 위치 5270이 A 내지 T로 돌연변이되고, 다단백질의 아미노산 위치 1725 또는 상기 NS3 단백질의 아미노산 위치 250이 발린 잔기를 함유한다. 상기 DEN-2 PDK-53 변이체는, 이 뉴클레오티드 돌연변이가 없이 DEN-2 PDK-53-E는 이 한 위치에서만 PDK-53-V와 다르다. DEN-2 PDK-53-E는 뉴클레오티드 위치 5270에서 A 및 다단백질 아미노산 위치 1725, NS3 단백질 아미노산 위치 250에서 글루타민산을 갖는다. 본 발명에서 구현예는 하나 이상의 분리된 숙주 세포에서 계대배양(예를 들면, Vero 세포, 표 1 참조)을 포함하는 변형된 PDK 53을 포함하고, 이는 본 발명에서 고려된 백신 조성물의 이용의 바람직한 특성이 발생되는 것으로 이해된다.
어떤 구현예에서, 상기 키메라의 표기는 상기 DEN-2 바이러스 특이적 감염성 클론 변형된 백본 및 다른 뎅기 바이러스 또는 다른 플라비바이러스의 구조 유전자(prM-E 또는 C-prM-E) 삽입에 기초할 수 있다. 상기 뎅기-2 위한 백본 DEN-2, 다음에는 상기 구조 유전자가 삽입된 상기 균주가 이어진다. DEN-2 백본 변이체는 상기 숫자 표기 후에 다음 문자에 반영된다. 구성된 키메라인 한 특정한 DEN-2 백본 변이체는 하이픈 뒤에 놓여진 다음 문자에 의해 표시되고, 모(parent) 16681(P), PDK-53-E(E), 또는 PDK-53-V(V)이며; 상기 마지막 문자는 상기 모(parental, P) 균주 또는 그들의 백신 유도체(V), 또는 상기 모(P) 균주 또는 그들의 백신 유도체(V) 유래 prM-E 구조 유전자 유래 C-prM-E 구조 유전자를 나타낸다. 예를 들면; DEN-2/1-VP는 야생형 DEN-1 16007 유래 NS3-250 및 상기 C-prM-E 유전자에서 발린을 포함하는 상기 약독화 DEN-2 PDK-53V 백본을 포함하는 키메라를 나타내고; DEN-2/1-VV는 DEN-1 PDK-13인 뎅기-1의 백신 균주가 있는 DEN-2 PDK-53V 백본을 나타내며; DEN-2/1-VP1은 상기 DEN-2 PDK-53V 백본 및 야생형 DEN-1 16007 유래 prM-E 유전자를 나타내고; DEN-2/3-VP1은 상기 DEN-2 PDK-53V 백본 및 야생형 DEN-3 16562 유래 prM-E 유전자를 나타내며; DEN-2/4VP1은 상기 DEN-2 PDK-53V 백본 및 야생형 DEN-4 1036 유래 prM-E 유전자를 나타낸다. 본 발명에 개시된 다른 키메라도 동일한 방식으로 표시된다.
한 구현예에서, 본 발명에 개시된 키메라는 바이러스 백본으로서 약독화 뎅기-2 바이러스 PDK-53 게놈을 함유하고, 상기 PDK-53 게놈의 C, prM 및 E 단백질을 암호화하는 구조 단백질 유전자 또는 이들의 조합은 뎅기-1, 뎅기-3 또는 뎅기-4 바이러스 및 선택적으로, 예컨대 상이한 플라비바이러스 또는 상이한 뎅기 바이러스 균주와 같이 그로부터 보호되어야 할 다른 플라비바이러스 유래의 상응하는 구조 단백질 유전자로 교체될 수 있다.
비구조 단백질 영역에서, Gly-to-Asp(야생형이 PDK-53으로) 돌연변이가 비구조 단백질 NS1-53(게놈 뉴클레오티드 위치 2579)에서 확인되었고; Leu-to-Phe(야생형이 PDK-53으로) 돌연변이가 비구조 단백질 NS2A-181(게놈 뉴클레오티드 위치 4018)에서 확인되었으며; Glu이 Val으로(야생형이 PDK-53으로) 돌연변이가 비구조 단백질 NS3-250(게놈 뉴클레오티드 위치 5270)에서 확인되었고; Gly-to-Ala 돌연변이(야생형이 PDK-53으로)가 비구조 단백질 NS4A-75(게놈 뉴클레오티드 위치 6599)에서 확인되었다. 상기 본 발명의 생약독화 DEN-2 바이러스는 표 3의 임의의 키메라 또는 생약독화 뎅기-2 바이러스에서 제시된 바와 같은 돌연변이를 추가로 포함한다.
PDK-53 바이러스는 게놈 뉴클레오티드 5270에서 혼합된 유전자형을 갖는다. 상기 바이러스 개체군의 상당한 부분(대략 29%)은 상기 NS3-250-Val 돌연변이보다 오히려 야생형 DEN-2 16681 바이러스 내에 존재하는 비-돌연변이된 NS3-250-Glu를 암호화한다. 유전적 변이체들이 모두 독성이 없기 때문에 이 돌연변이는 독성이 없는 키메라에 필요하지 않을 수 있다.
이전에, 상기 약독화 PDK-53 바이러스 균주의 무독성이 비구조 단백질을 암호화하는 상기 뉴클레오티드 서열 내에 및 상기 5' 비암호화 영역 내에서의 돌연변이로 여겨질 수 있는 것이 확인되었다. 예를 들면, NS1-53에서 단일 돌연변이, NS1-53 및 5TSTC-57에서 이중 돌연변이, NS1-53 및 NS3-250에서 이중 돌연변이, 및 NS1-53, 5TSTC-57 및 NS3-250에서 삼중 돌연변이는 DEN-2 바이러스의 약독화를 야기한다. 따라서, 이러한 비-보존적 아미노산 치환 또는 이러한 유전자자리에서 뉴클레오티드 치환을 함유하는 상기 임의의 뎅기-2 바이러스의 게놈은 본 발명에 개시된 상기 변형된 PDK-53 바이러스를 유도하기 위한 기초 서열로서 이용될 수 있다. 만일 원한다면 5' 비암호화 영역에서 스템/루프 구조 중 스템에서 다른 돌연변이는 추가적인 독성이 없는 표현형 안정성를 제공할 것이다. 이 영역에 대한 돌연변이는 바이러스 복제를 위해 중요한 가능성있는 2차 구조를 방해한다. DEN 및 베네스웰라 마형 뇌염 바이러스 모두에서 이 짧은(오직 6 뉴클레오티드 잔기 길이에서만) 스템 구조에서 단일 돌연변이는 상기 헤어핀 구조의 형성을 방해한다. 이 스템 구조에서 추가 돌연변이는 바이러스 생존력은 유지하면서 이 유전자자리(locus)의 복귀 가능성을 감소시킨다.
본 발명에 개시된 돌연변이는 본 기술 분야의 알려진 임의의 방법에 의하여 달성될 수 있고, 관심있는 세포주(예를 들면, Vero 세포)에서 한번 계대배양하여 추가적인 특징을 가지는 자연적으로 발생된 또는 선택된 클론을 포함하지만, 이에 한정되지 아니한다. 본 발명에 개시되고 본 기술 분야에 잘 알려진 병독성 스크리닝 분석이 병독성 및 독성이 없는 백본 구조를 구별하기 위하여 사용될 수 있는 것이 본 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해된다.
플라비바이러스 키메라의 구조
본 발명에 기재된 플라비바이러스 키메라는 PDK-53 뎅기 바이러스 게놈 백본으로 원하는 면역력이 있는 하나 이상의 플라비바이러스의 구조 단백질 유전자를 스플라이싱하거나, 본 기술 분야에 알려진 다른 기술인 상기 상응하는 PDK-53 유전자를 제거하고 이것을 뎅기-1, 뎅기-3 또는 뎅기-4 바이러스 유전자 또는 본 기술 분야에 알려진 다른 유전자로 대체하기 위하여 재조합 제작을 이용하여 생산될 수 있다.
다른 한편으로는, 서열 목록에 제공된 서열을 이용시 상기 플라비바이러스 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 알려진 핵산 합성 기술을 이용하여 합성될 수 잇고, 적절한 벡터로 삽입될 수 있다. 따라서, 독성이 없는 면역원성 바이러스는 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 재조합 제작 기술을 이용하여 생산된다.
표적 유전자는 DEN-1, DEN-3, DEN-4 또는 다른 플라비바이러스에 대해 관심있는 플라비바이러스 구조 단백질을 암호화하는 상기 백본으로 삽입될 수 있다. 삽입되는 플라비바이러스 유전자는 C 단백질, PrM 단백질 및/또는 E 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다. 상기 뎅기-2 백본으로 삽입된 상기 서열은 PrM 및 E 구조 단백질 모두를 암호화할 수 있다. 상기 뎅기-2 백본으로 삽입된 상기 서열은 C, prM 및 E 구조 단백질 모두 또는 하나를 암호화할 수 있다.
적합한 키메라성 바이러스 또는 다른 플라비바이러스 또는 뎅기 바이러스 혈청형의 구조 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 핵산 키메라는 그들을 병독성을 나타내는 전술한 약독화의 표현형 마커에 대하여 스크리닝하고, 그들을 면역원성에 대하여 스크리닝함으로써 백신으로서 유용성에 대하여 평가될 수 있다. 항원성 및 면역원성은 플라비바이러스 항체 또는 면역반응성 혈청으로 시험관 내에서 또는 생체 내에서 반응성을 이용하고, 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 통상적인 스크리닝 절차를 이용하여 평가될 수 있다.
뎅기 바이러스 백신
어떤 구현예에서, 키메라성 바이러스 및 핵산 키메라는 면역원 또는 백신으로서 유용한 생약독화 바이러스를 제공할 수 있다. 일부 구현예는 위험한 병원성 또는 치사 효과를 유발하지 않으면서, 뎅기-4 바이러스에 대한 높은 면역원성을 나타내는 키메라를 포함한다.
개체에서 DHF/DSS의 발생 빈도를 감소시키기 위하여, 4가 백신이 상기 바이러스의 4개의 모든 혈청형에 대한 동시 면역력을 제공하기 위하여 필요하다. 4가 백신은 본 발명의 생약독화 뎅기-2 바이러스와 다가 백신으로서의 투여에 대하여 적합한 약학적 담체에 전술한 뎅기-2/1, 뎅기-2/3, 및 뎅기-2/4 키메라를 병용함으로써 생산된다.
본 발명의 상기 키메라성 바이러스 또는 핵산 키메라는 독성이 있는 또는 약독화 DEN-2 바이러스 백본 내의 야생형 또는 생약독화 바이러스의 구조 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 키메라는 DEN-2 배경에서 그것의 후보 백신 유도체인 야생형 DEN-4 1036 바이러스의 상기 구조 단백질 유전자를 발현할 수 있다.
본 발명에 기재된 상기 키메라에서 사용된 바이러스는 본 기술 분야에 알려진 기술을 이용하여 성장될 수 있다. 그 후 생존력 및 성장 배양의 표현형 특징을 평가하기 위하여 바이러스 플라크 적정(titration)이 수행되고, 플라크가 계수된다. 야생형 바이러스는 약독화 후보 개시 재료을 유도하기 위하여 배양된 세포주를 통해 계대배양될 수 있다.
키메라성 감염성 클론은 이용가능한 다양한 뎅기 혈청형 클론으로 구성될 수 있다. 만일 원한다면 바이러스 특이적 cDNA 단편의 클로닝은 또한 달성될 수 있다. 상기 구조 단백질 또는 비구조 단백질 유전자를 함유하는 cDNA 단편은 뎅기 바이러스 RNA와 다양한 프라이머로부터 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 증폭된다. 증폭된 단편은 다른 중간 클론의 절단 위치로 클로닝된다. 그 후 중간 키메라성 뎅기 바이러스 클론은 삽입된 뎅기 바이러스-특이적 cDNA의 정확도를 확인하기 위하여 서열분석된다.
뎅기 혈청형 바이러스의 상기 구조 단백질 및/또는 비구조 단백질 유전자 영역을 벡터로 삽입하여 구성된 전체 게놈-길이 키메라성 플라스미드는 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다.
뉴클레오티드 및 아미노산 분석
상기 DEN-2 PDK-53 백신 바이러스의 NS1-53 돌연변이는 이 바이러스의 약독화 바이러스에 대하여 현저하며, 그 이유는 상기 DEN-2 16681 바이러스의 NS1-53-Gly이 현재까지 서열분석된 상기 진드기매개 바이러스를 포함하는 거의 모든 플라비바이러스에서 보존되기 때문이다. DEN-4 백신 바이러스는 또한 위치 253에서 상기 NS1 단백질에서 아미노산 돌연변이를 함유한다. DEN-4 PDK-48 백신 바이러스에서 Gln-to-His 돌연변이인 이 유전자자리는 뎅기 바이러스의 4개의 모든 야생형에서 Gln이다. 이 Gln 잔기는 상기 플라비바이러스속 내에 상기 뎅기 바이러스에 유일하다. 상기 NS1 단백질은 플라비바이러스 감염 세포로부터 분비되는 당단백이다. 그것은 상기 감염된 세포의 표면에 존재하고, NS1 특이적 항체가 바이러스 감염된 개체의 혈청에 존재한다. NS1 단백질 또는 수동적으로 NS1 특이적 항체로 면역력을 갖게 하는 동물의 보호가 보고되었다. 이 NS1 단백질은 초기 바이러스 RNA 복제에 참여하는 것으로 보인다.
상기 DEN-1, -2, -3 및 -4 약독화 균주의 NS2A, NS2B, NS4A, 및 NS4B 단백질에서 일어난 돌연변이는 자연에서 보존적이다. DE-2 및 DEN-4 백신 바이러스 각각의 NS4A-75 및 NS4A-95 돌연변이는 뎅기 바이러스 중에서 아미노산 보존 위치에서 일어나지만, 보통 플라비바이러스 중에서 일어나지 않는다.
상기 플라비바이러스의 NS3 단백질은 적어도 2개의 인식하는 기능을 보유한다: 상기 바이러스 프로티나제 및 RNA 헬리카제/NTPase. 상기 698-aa 긴(DEN-2 바이러스) NS3 단백질은 아미노-말단 세린 프로테아제 도메인(NS3-51-His, -75-Asp, -135-Ser 3가 촉매의)을 함유하고, 그 다음에 RNA 헬리카제/NTPase 기능에 대한 서열 모티프(NS3-196-GAGKT(서열번호: 147), -284-DEAH, -459-GRIGR)가 이어진다. 인식하는 모티프 내에서 일어난 DEN-1, DEN-2, 또는 DEN-3 바이러스의 NS3 단백질에서 상기 돌연변이는 아무것도 없다. DEN-1 PDK-13 바이러스에서 상기 NS3-510 Tyr의 Phe 돌연변이는 보존적이다. 상기 야생형 DEN-2, -3 및 -4 바이러스는 이 위치에서 Phe를 함유하기 때문에 Tyr의 Phe 돌연변이가 상기 DEN-1 바이러스의 약독화에 역할을 할 것 같지 않다. DEN-1 PDK-13 바이러스에서 NS3-182 Glu의 Lys 돌연변이는 대부분 모기-매개 플라비바이러스에서 Asp 또는 Glu로 보존된 위치에서 일어났고, 그것은 약독화에서 일부 역할을 할 수 있다. 이 돌연변이는 GAGKT 헬리카제 모티프의 상류 15번째 아미노산 잔기에 위치되었다. 이전 연구에서 언급한 바와 같이, DEN-2 16681 바이러스에서 상기 NS3-250-Glu는 황열병 바이러스를 제외한 모든 모기-매개 플라비바이러스에서 보존된다.
핵산 프로브는 선택적으로 상기 DEN-1, DEN-3 및 DEN-4 바이러스 또는 이들의 상보적인 서열을 암호화하는 핵산 분자와 혼성화한다. "선택적인" 또는 "선택적으로"는 상기 뎅기 바이러스의 적절한 검출을 예방하기 위하여 다른 핵산과 혼성화하지 않는 서열을 의미한다. 따라서, 혼성화하는 핵산의 설계에서 선택도는 시료에 존재하는 다른 성분에 따를 것이다. 상기 혼성화하는 핵산은 그것이 혼성화하는 핵산의 부분과 적어도 70% 상보성을 가져야 한다. 핵산을 기재하기 위하여 본 명세서에서 사용된 것과 같은, 상기 용어 "선택적으로 혼성화한다"는 가끔 무작위로 혼성화하는 핵산을 제외하며, 따라서 "특이적으로 혼성화하는"과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 상기 선택적으로 혼성화하는 핵산은 그것이 혼성화하는 서열의 부분과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 및 99%, 바람직하게 85% 이상인 상보성을 가질 수 있다.
상기 암호화된 핵산 또는 상기 핵산의 상보적 또는 반대, 가닥으로 선택적으로 혼성화하는 서열, 프로브 및 프라이머가 고려된다. 기능적인 종류-특이적 혼성화 능력이 유지되는 한, 핵산으로 특이적 혼성화는 상기 핵산에서 작은 변형 또는 치환이 일어날 수 있다. "프로브"는 그들의 검출 또는 증폭을 위하여 상보적인 핵산 서열과 선택적인 혼성화를 위하여 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 핵산 서열을 의미하고, 프로브는 약 5 내지 100개 뉴클레오티드, 또는 바람직하게는 약 10 내지 50개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 18 내지 24개 뉴클레오티드 길이로 다를 수 있다.
만일 프라이머로서 사용되면, 상기 조성물은 바람직하게는 원하는 영역을 증폭하기 위하여 상기 표적 분자의 다른 영역에 대하여 혼성화하는 적어도 2개의 핵산 분자를 포함한다. 상기 프로브 또는 프라이머의 길이에 따라, 상기 표적 영역은 70% 상보적 염기와 전체 상보성 사이의 범위일 수 있고, 가혹한 조건 하에서 여전히 혼성화한다. 예를 들면, 상기 뎅기 바이러스의 존재를 검출하는 목적으로, 상기 혼성화하는 핵산(프로브 또는 프라이머)와 그것이 혼성화하는 상기 서열 사이의 상보성 정도는 적어도 다른 생물 유래 핵산과 혼성화를 구별하기에 충분하다.
뎅기 DEN-4, DEN-3 또는 DEN-1 바이러스(예를 들면, 구조 성분)을 암호화하는 핵산 서열은 벡터, 예컨대 플라스미드로 삽입될 수 있고, 재조합 뎅기 바이러스 펩티드 및/또는 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 생산하기 위하여 살아있는 생물(예를 들면, 뎅기-2 백본으로)에서 재조합형으로 발현될 수 있다.
핵산 검출 방법
본 발명에 기재된 상기 백신 바이러스 각각에 대한 진단하는 빠른 유전적 시험이 본 발명에 의해 제공된다. 본 발명의 이 구현예는 바이러스혈증이 생긴 백신접종된 인간의 혈청으로부터 분리된 바이러스의 분석을 향상시키고, 상기 후보 백신 바이러스로 면역력을 갖게 된 비인간 영장류에서 바이러스혈증의 특성분석을 향상시킨다.
이 서열은 역-전사효소/중합효소 연쇄 반응(RT/PCR)을 이용함으로써 상기 바이러스 게놈 RNA 주형으로부터 증폭된 cDNA 앰플리콘의 검출을 제공하는 역할을 하는 진단 TaqMan 프로브뿐만 아니라, 하기 기재된 바와 같이 상기 cDNA 앰플리콘을 증폭하기 위하여 설계된 정방향 및 역방향 앰플리머를 포함한다. 특정한 예에서, 앰플리머 중 하나는 상기 앰플리머의 3'-말단 끝에서 백신 바이러스-특이적 돌연변이를 함유하기 위하여 설계되었고, 이는 상기 시험이 상기 백신 균주에 대하여 훨씬 더 특이적이고 효과적으로 하며, 그 이유는 상기 표적 위치에서 상기 프라이머의 연장 및 그 결과에 따른 증폭이 상기 바이러스 RNA 주형이 상기 특이적 돌연변이를 함유하는 경우에만 일어날 것이기 때문이다.
자동화된 PCR에 기초한 핵산 서열 검출 시스템, 또는 핵산 검출에 대한 다른 알려진 기술이 사용될 수 있다. 상기 TaqMan 분석은 시료 핵산 주형 유래 PCR로 발생된 앰플리콘의 자동화되고, 실시간 가시화 및 정량화를 가능하게 하는 매우 특이적이고 민감한 분석이다. TaqMan은 특이적 서열의 존재 또는 부재를 확인할 수 있다. 이 분석에서 정방향 및 역방향 프라이머가 상기 표적 돌연변이 위치의 상류 및 하류 각각을 풀기(anneal) 위하여 설계된다. 상기 앰플리머 중 어느 한쪽보다 약 10℃ 높은 용융 온도 및 상기 백신 바이러스 특이적 뉴클레오티드 돌연변이 또는 그것의 보완물(검출되는 RT/PCR 앰플리콘의 가닥에 따라)을 함유하는 것을 가지기 위하여 설계되는 특이적 검출기 프로브는 이 분석의 3번째 프라이머 성분으로 여겨진다.
상기 백신 바이러스 게놈 중 하나에서의 돌연변이된 유전자자리를 특이적으로 검출하기 위하여 설계된 프로브는 상기 프로브의 중간에 상기 백신 특이적 뉴클레오티드를 함유할 것이다. 만일 상기 바이러스 RNA 주형이 백신 바이러스 특이적일 경우, 이 프로브는 상기 TaqMan 분석에서 탐지가능한 형광을 야기할 것이다. 하지만, 야생형 DEN 바이러스로부터 게놈 RNA 주형은 상기 단일 뉴클레오티드 미스매치(상기 모 바이러스 DEN 바이러스의 경우에서) 또는 어쩌면 하나 이상의 미스매치(다른 야생형 DEN 바이러스에서 일어날 수 있는 것과 같은)때문에 프로브 혼성화의 효율이 감소될 것이고, 현저한 형광을 야기하지 않을 것이다. 상기 DNA 중합효소는 상기 리포터 염료를 방출하기 위하여 미스매치된 프로브를 분해하기보다는 RT/PCR 앰플리콘 주형으로부터 미스매치된 프로브를 대체할 가능성이 많다(TaqMan Allelic Discrimination assay, Applied Biosystems).
진단 유전 시험을 위한 한 전략은 분자 비콘(beacon)을 이용한다. 또한 상기 분자 비콘 전략은 앰플리콘의 RT/PCR 증폭을 위한 프라이머, 및 상기 프로브 말단에서 리포터 및 퀀쳐 염료를 함유하는 프로브에 의해 상기 앰플리콘 내의 특이적 서열의 검출을 이용한다. 이 분석에서, 상기 프로브는 스템-루프 구조를 형성한다. 상기 분자 비콘 분석은 TaqMan 분석에서 사용되는 것과 다른 퀀쳐 및 리포터 염료를 이용한다.
약학적 조성물
본 발명에서 구현예는 생체 내에서 약학적 투여에 적합한 생물학적으로 호환가능한 형태로 개체에 조성물의 투여를 제공한다. "생체 내에서 투여에 적합한 생물학적으로 호환가능한 형태"는 투여되는 상기 활성제의 형태(예를 들면, 상기 구현예의 약학적 화학 재료, 단백질, 유전자)를 의미하며, 임의의 독성 효과보다 상기 활성제의 치료 효과가 더 크다. 상기 치료적 조성물의 치료적으로 활성있는 양의 투여는 상기 원하는 결과를 달성하기 위하여 필요한 용량에서 및 시간 동안 효과적인 양으로 정의된다. 예를 들면, 치료적으로 활성있는 화합물의 양은 요인, 예컨대 질환 상태, 나이, 성 및 개인의 체중 및 상기 개인에서 원하는 반응을 끌어내기 위한 항체의 능력에 따라 다를 수 있다. 용량 체계는 최적 치료적 반응을 제공하기 위하여 조정될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 화합물(예를 들면, 상기 구현예의 약학적 화학 재료, 단백질, 펩티드 등)은 편리한 방법으로, 예를 들면 피하, 정맥, 경구 투여에 의해, 흡입, 피내(intradermal), 경피 적용, 질내 적용, 국부 적용, 비강내 또는 직장 투여로 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 상기 활성 화합물은 보호용 완충액(예를 들면, FTA, F127/트레할로스/알부민)에 함유될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 조성물은 경구 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 조성물은 정맥으로 투여될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 조성물은 비강내로, 예컨대 흡입으로 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 조성물은 니들-없는 시스템(예를 들면, Pharmajet®) 또는 다른 피내 투여 시스템을 이용하여 피내로 투여될 수 있다.
조성물은 적절한 담체 또는 희석제, 효소 억제제와 공-투여 또는 적절한 담체, 예컨대 리포좀으로 개체에 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 상기 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 희석제, 예컨대 염분이 함유된 및 수성 완충액 용액을 포함하는 것을 의도한다. 그것의 비활성화를 예방하기 위하여 상기 화합물에 미네랄을 코팅하거나, 상기 화합물과 미네랄을 공-투여하는 것이 필요할 수 있다. 상기 활성제는 또한 비경구적으로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 분산물은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일 내에 준비될 수 있다. 저장 및 사용의 일반적인 조건 하에, 이러한 제조물은 미생물의 성장을 예방하기 위하여 방부제 또는 다른 안정화 제형물(예를 들면, FTA)을 함유할 수 있다.
주입가능한 이용에 적합한 약학적 조성물은 본 기술 분야에 알려진 수단으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 살균한 수성 용액(물에 용해 가능함) 또는 분산물 및 살균한 주입가능한 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 살균 분말이 사용될 수 있다. 모든 경우에 있어서, 상기 조성물은 살균될 수 있고, 용이한 실린지어빌러티(syringability)가 존재하는 정도로 유체일 수 있다. 그것은 제조와 저장 조건 하에 안정할 것이고, 미생물, 예컨대 세균 및 곰팡이의 오염 활동에 대하여 보존될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 적합한 이들의 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산물 배지일 수 있다. 적절한 유동성이, 예를 들면 코팅, 예컨대 레시틴의 이용에 의해, 분산물의 경우에는 원하는 입자 크기의 유지를 위해, 및 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 예방은 가열, 상기 제제를 세제, 조사에 노출하거나, 다양한 항균제 또는 항진균 제제를 첨가함으로써 달성될 수 있다.
살균한 주입가능한 용액은 적절한 용매 단독 또는 상기 열거된 성분을 병용하여 필요한 양으로 활성 화합물(예를 들면, 하나 이상의 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하는 화합물)을 포함시킴으로써, 필요에 따라 그 후에 여과 살균하여 제조될 수 있다.
제형화시, 용액은 용량 제형물과 호환가능한 방식으로 및 치료적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 상기 제형물은 여러 가지 용량 형태, 예컨대 전술한 주입가능한 용액의 유형으로 쉽게 투여된다. 조성물이 특히 근육내, 피하, 피내, 비강내 및 복강내 투여에 적합한 것이 고려된다. 특정한 비율은, 예컨대 1:1, 1:2 또는 다른 비율(예를 들면, 주어진 뎅기 바이러스 혈청형의 PFU)로 구할 수 있다.
상기 활성있는 치료적 제제는 미리 결정된 혼합 비율로 제형화될 수 있다. 단일 투여량 또는 복수 투여량은 또한 주어진 상황(예를 들면, 여행, 뎅기열 발생 전에)에 대한 적절한 일정에 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 점비액(nasal solution) 또는 비강 스프레이, 에어로졸 또는 흡입제가 관심있는 상기 화합물을 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 방식의 투여에 적합한 추가적인 제형물은 좌약 및 질 좌약을 포함한다.
특정한 제형물은 부형제, 예를 들면 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 예컨대 지속적으로 방출하는 제형물 또는 코팅과 같이 생체로부터 빠른 제거에 대하여 활성 성분을 보호하는 담체로 제조될 수 있다. 이러한 담체는 제어된 방출 제형물, 예컨대 마이크로캡슐화된 전달 시스템, 및 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예컨대 에틸렌 비닐아세테이트, 폴리안히드라이드(polyanhydride), 폴리글리콜산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세트산 및 알려진 다른 것을 포함하지만, 이에 한정되지 아니한다.
약학적 조성물은 이식의 부작용을 억제하거나 완화하기 위하여 및/또는 거부를 감소시키거나 예방하기 위하여 효과적인 양으로 및 빈도로 투여된다. 처리의 정확한 용량 및 기간은 알려진 시험 프로토콜을 이용하여 경험적으로 결정될 수 있거나, 본 기술 분야에 알려진 모델 시스템에서 상기 조성물을 시험하고 그것으로부터 추정하여 결정될 수 있다. 또한 용량은 상기 중증도 조건에 따라 다를 수 있다. 약학적 조성물은 원하지 않는 부작용을 최소화하면서 치료적으로 유용한 효과를 가하기 위하여 일반적으로 제형화되고 투여된다. 보통, 약 102 내지 106 PFU 범위인 투여량이 초기 및 선택적으로 투여될 수 있고, 필요하다면 그 다음에 30일 내에 또는 180일 이후까지 2차 투여될 수 있다. 어떤 구현예에서, 개체는 본 발명에 개시된 1가, 2가, 3가 또는 4가 조성물을 수용할 수 있고, 상기 조성물은 단일 조성물 혼합물이거나 다른 뎅기 바이러스 혈청형의 미리 결정된 조성물을 갖는다. 일부 구현예에서, DEN2/4 키메라는 다른 뎅기 바이러스 혈청형, 예컨대 생약독화 뎅기-1보다 더 높은 농도로 존재할 수 있다.
임의의 특정한 개체를 위하여 특정한 용량 요법이 상기 필요한 개인에 따라 초과 시간 조정될 수 있는 것이 분명할 것이다.
한 구현예에서, 본 발명에 개시된 조성물은 개체에 피하로 또는 피내로 투여될 수 있다.
생약독화 뎅기 바이러스를 함유하는 상기 약학적 조성물은, 예를 들면 피하로, 근육내로, 비강내로, 경구로, 국부적으로, 경피로, 비경구적으로, 위장내로, 기관지로 및 치조를 통하여(transalveolarly) 개인, 특히 인간에 투여될 수 있다. 국부 투여는 세린 프로테아제의 억제제의 치료적으로 효과적인 양을 함유하는, 국부적으로 적용하는 크림, 겔, 린스 등을 통하여 달성된다. 경피 투여는 피부를 통과하고, 혈류로 들어가기 위하여 세린 프로테아제의 억제제를 허용할 수 있는 크림, 린스, 겔 등의 적용으로 달성된다. 게다가, 삼투 펌프가 투여를 위하여 사용될 수 있다. 상기 필요한 용량은 처리되는 특정한 조건, 투여 방법 및 생체로부터 분자의 제거 속도에 따라 다를 것이다.
본 발명의 방법의 어떤 구현예에서, 상기 개체는 포유동물, 예컨대 인간 또는 가축(veterinary) 및/또는 사육 동물 또는 가축(livestock) 또는 야생 동물일 수 있다.
치료 방법
본 발명의 한 구현예에서, 방법은 본 발명에서 고려된 생약독화 및/또는 키메라성 바이러스 구조체의 1가, 2가, 3가 또는 4가 제형물을 이용하여 뎅기 바이러스 혈청형(들)에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 제공한다.
본 발명의 구현예는 추가로 하기의 비제한적 예로 예시되고, 이는 이들의 범위로 제한을 부과하는 것과 같은 임의의 방법으로 이해되는 것은 아니다. 그와는 반대로, 수단(resort)은 다양한 다른 구현예, 변형 및 이들의 등가물을 가질 수 있는 것이 명확하게 이해되는 것이고, 본 발명의 설명을 읽은 후에, 본 발명의 의미 또는 첨부된 청구항의 범위로부터 벗어남 없이 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 그것들을 제안할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명에 제시된 어떤 구현예를 증명하기 위하여 포함된다. 하기 실시예에서 개시된 기술이 본 발명에 개시된 내용을 실행시에 잘 기능하는 확인된 기술을 나타내는 것이 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 인식되어야 하며, 따라서 그것의 실행을 위하여 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다. 하지만, 본 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명의 개시를 통하여, 개시된 특정한 구현예에서 많은 변경이 만들어질 수 있고, 본 발명의 의미 및 범위로부터 벗어남이 없이 같은 또는 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있는 것을 인식해야 한다.
실시예 1
일부 예시적인 방법에서, 본 발명에 나타낸 바와 같이 "마스터 바이러스 시드(MVS)"를 발생시키기 위하여 사용한 조성물이 개시된다. 이러한 조성물은 하나 이상의 생약독화 뎅기 바이러스, 예컨대 DEN-1, DEN-2, DEN-3, 및 DEN-4로부터 유래될 수 있다. 특정한 방법에서, 조성물은 본 발명에서 DENVax-1, DENVax-2, DENVax-3, 및 DENVax-4로 나타낸 개시된 특이적 구조체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 생약독화 뎅기 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 예시적 방법에서, 이러한 조성물을 발생시키고 특징화하기 위하여 사용된 전략이 제공된다. 다른 구현예에서, 4가 뎅기 바이러스 제형물 및 이러한 제형물의 유전적 및 표현형적 특성분석이 제공된다.
전-마스터(pre-master) DENVax 바이러스의 생산 및 분석
특정한 절차, 예컨대 뎅기 바이러스(예를 들면, DENVax)의 연속 증폭 및 정제가 전-마스터 뎅기 바이러스 시드를 발생시키기 위하여 수행되었다. 먼저, DENVax 바이러스를 전장(full-length) 재조합 DENVax cDNA로부터 전사된 바이러스 RNA를 생산이 증명된 세포(예를 들면, Vero 세포)로 형질감염에 의하여 다시 유도하였고, 결과적으로 P1(계대배양 1) 바이러스 시드를 얻었다. 그 후, 뎅기-1 내지 뎅기-4 각각으로부터 4개의 P1 바이러스를 증폭하였고, 후보 전-마스터 백신 P7 시드를 얻기 위하여 플라크를 정제하였다(표 1 참조). 뎅기 바이러스의 계대배양을 분석하기 위하여 특정한 시험을 수행하였다. 예를 들면, 전장 게놈 서열분석은 4개의 모든 P2(계대배양 2) 시드 바이러스가 그들의 상동성 조상인 연구-유래된, 연구-등급 후보 백신 바이러스와 유전적으로 동일한 것을 나타내었다. 원래의 플라크 표현형은 또한 상기 P2 바이러스에서 유지되었다. 6개의 플라크 정제된 바이러스(P3 A-F)가 상기 P2 시드로부터 각 뎅기 바이러스 혈청형(예를 들면, DENVax1-4)에 대하여 분리되었고, 각 단리된 플라크는 직접적으로 2회 이상 플라크 정제되었다. 각 바이러스의 3차 플라크 정제(P5)는 잠재적인 전-마스터 P7 DENVax 시드를 생산하기 위하여 Vero 세포에서 2회(P6 A-F 및 P7 A-F) 증폭되었다(표 1 참조).
WCB-Vero 세포에서 DENVax 바이러스의 cGMP 재유도의 예
계대배양 시드 생산/정제 특성분석
P1 전사된 바이러스 RNA로 WCB-Vero를 형질감염 플라크 적정
P2 P1 바이러스를 증폭 전체 게놈 서열
P3 6개의 플라크(A-F) 선택/P2 유래 혈청형 플라크 분석 플라크 정제
P4 P3 플라크 분석으로부터 플라크 A-F 선택 플라크 정제
P5 P4 플라크 분석으로부터 플라크 A-F 선택 플라크 정제
P6 P5 A-F 플라크 증폭 플라크 적정
P7 전-마스터 시드: P6 A-F 증폭 전체 게놈 서열,
TaqMAMA, 플라크 표현형
P8* MVS: 선택된 P7 바이러스 시드 증폭 전체 유전적 및 표현형 특성 분석
P9 WVS: P8 마스터 시드 바이러스 증폭 전체 게놈 서열, TaqMAMA
P10 BVS: P9 작용성 시드 바이러스 증폭 전체 게놈 서열, TaqMAMA
* 하나의 최적 P7 시드(A, B, C, D, E 또는 F)를 P8 MVS를 만들기 위하여 유전적 및 플라크 분석에 기초하여 선택하였다.
일부 시험을 P7 DENVax 시드를 특징화하기 위하여, 예컨대 상기 P7 시드의 게놈 서열 및 플라크 표현형 분석, 및 P2 시드와 비교를 추가로 수행하였다(표 2). 상기 P7 바이러스의 플라크 표현형은 상기 P2 시드의 것과 대개 유사하였다. 일부 예시적인 실험에서, 바이러스 역가를 모니터하였다. 바이러스 역가는 5개 바이러스를 제외하고 상기 P7 시드의 대부분에 대하여 6.0 log pfu/㎖ 이상에 도달하였다. Vero 세포에서 10회 이상의 연속 계대배양 후에 60개 이상의 후보 백신 바이러스 시드의 게놈 서열분석은 DENV-2 PDK-53 유전적 벡터의 3개의 주요한 약독화 결정체의 NS1-53 및 NS3-250에서 복귀 현상이 없는 것을 확인하였고, 이는 이러한 2개의 유전자자리가 후보 백신 바이러스 시드에서 매우 안정한 것을 제안한다. 이러한 2개의 위치에 대한 정방향 및 역방향 서열분석 모두로부터 발생된 24개의 후보 균주의 모든 서열 크로마토그램은 NS1-53 및 NS3-250 유전적 유전자자리에서 임의의 작은 뉴클레오티드 개체군 현상 없이 동일하였다. NS1 및 NS3 위치와 대조적으로, 5'NCR-57 약독화 유전자자리에서 다른 수준의 복귀가 복수의 연속적으로 계대배양된 연구 등급 백신 바이러스로부터 확인되었고, 이는 이 유전자자리가 세포 배양에서 복수의 계대배양 후에 NS1 및 NS3만큼 안정하지 않을 수 있음을 제안한다. 따라서, 민감성 미스매치 증폭 분석(sensitive mismatch amplification assay, TaqMAMA)을 실시간 RT-PCR로 상기 5'NCR-57 유전자자리에서 복귀 비율을 정확히 측정하기 위하여 개발하였다. 일부 연구에서, 상기 P7 시드 중 모든 24개의 5'NCR-57 복귀는 TaqMAMA에 의해 측정되었다. 상기 분석에서 각 바이러스에 대한 유입 바이러스 RNA의 농도에 따라, 상기 TaqMAMA의 민감도 한계는 0.01% 내지 0.07% 복귀 사이의 범위였고, 이는 공통 게놈 서열 분석에 의해 검출가능한 10-30% 복귀 민감도 한계보다 훨씬 더 민감한 것이다. 결과 데이터는 24개의 P7 바이러스 중 15개는 최소 또는 검출불가능한 복귀(< 0.07%)를 나타내고, 하나의 바이러스(DENVax-3-D)는 거의 100% 복귀를 나타내며, 8개 바이러스(DENVax-1 1개, DENVax-2 1개, DENVax-3 2개, 및 DENVax-4 4개)는 0.08% 내지 12.85%의 범위인 부분적 복귀를 나타내는 것을 예시한다(표 2). 전장 게놈 서열분석은 TaqMAMA으로 측정된 것과 같이 낮은 수준의 5'NCR57 복귀가 있는 P7 바이러스 24개 중 16개에 대해 수행되었다. 상기 모든 서열분석된 바이러스는 다른 2개의 DENVax 약독화 결정인자(NS1-53, NS3-250)를 유지하였고, 모두 원래의 가공된 재조합 cDNA 클론에는 존재하지 않았던 추가적인 돌연변이를 수득하였다(표 2). 한 예시적인 표적 백신 조성물에서, DENVax-1-A, DENVax-2-F, DENVax-3-F, 및 DENVax-4-F가 각 혈청형에 대한 표적 전-마스터 시드로 선택되었는데, 그 이유는 그들의 유전자형 및 플라크 표현형이 원래의 설계된 백신 재조합체의 것과 가장 밀접하게 유사했기 때문이다. 상기 DENVax-1-A, DENVax-2-F, 및 DENVax-4-F는 2개의 밀접하지 않은(non-synonymous) 돌연변이를 가지고, 상기 DENVax-3-F은 하나를 갖는다. 상기 증거는 이러한 4개의 전-마스터 시드에서 관찰되는 이러한 추가적인 돌연변이가 상기 바이러스에 대한 안전성 문제 또는 면역원성 변화를 유발하지 않음을 제안한다. 이러한 전-마스터 시드는 상기 MVS(표 1에서 P7로 표기된 마스터 시드)를 발생시키기 위하여 추가로 증폭되었다.본 발명에서 제공된 예시적인 방법은 백신 바이러스를 발생시키기 위하여 백신-증명된 Vero 세포를 형질감염시키는 순수한 원료로서 클로닝된 cDNA 플라스미드로부터 정제되고 시험관 내에서 전사된 바이러스 RNA를 사용하였다. 연속 플라크 정제 및 전체 게놈 서열 분석은 최적의 순도 및 유전적 안정성이 있는 가공된 백신 시드를 보장하기 위하여 제조방법 절차에 포함되었다. 6개의 클로닝된 바이러스를 각 DENVax 혈청형에 대한 잠재적인 전-마스터 시드로서 제조하였다. TaqMAMA 및 완전한 게놈 서열분석을 포함하는 게놈 분석뿐만 아니라 바이러스 플라크 표현형 특성분석을 통하여, 각 혈청형(혈청형 1-4)에 대한 마스터 바이러스 시드 생산으로 나아가기 위하여 전-마스터 시드를 선택하였다. 상기 선택된 전-마스터 시드는 그들의 게놈에 1개 또는 2개의 아미노산 치환이 있는 상기 5'NCR-57 유전자자리에서 검출불가능한 복귀(<0.01% 또는 <0.07%)를 가지며, 이전에 관찰된 작은 플라크 표현형을 유지하였다.
Figure pat00001
실시예 2
일부 예시적인 방법에서, 마스터 바이러스 시드, 작용성 바이러스 시드 및 벌크 바이러스 시드의 조성물뿐만 아니라 그들의 유전적 및 표현형 특성분석이 기재된다. 이러한 조성물이 임상 재료의 제조 및 최종적으로 상업적 백신 공급용으로 제공된다. 연속 플라크 정제 및 전체 게놈 서열 분석은 임상 시도 재료의 제조를 위해 최적의 안전성 및 유전적 안정성을 갖는 백신 시드 조성물을 보장하기 위하여 제조방법으로 포함되었다.
MVS, WVS, 및 BVS에 대한 생산 및 제조 품질 관리
일부 연구에서, 상기 4개의 DENVax의 MVS는 증명된 Vero 세포에서 상기 전-마스터 P7 시드를 증폭함으로써 생산되었다. 다른 연구에서, 세포 공장에서 다량의 WVS를 만들기 위하여 MVS가 이용되었다. 추가로, 상기 DENVax의 BVS 저장물(stock)은 상기 WVS로부터 증폭되었고, 인간 임상 시험을 위해 이용되는 4가 약물 생산 혼합물로 제형화되었다. 생산물 방출의 품질 관리는 동일성에 대한 모든 MVS, WVS, 및 BVS의 시험, 감염성 역가, 멸균율, 마이코플라즈마 및 시험관 내 및 생체 내에서 오염 인자(adventitious agent)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 일부 예시적인 방법에서 수행되었다. 모든 시드는 혈청형-특이적 RT-PCR 분석을 이용한 바이러스 동일성 시험을 통과하였으며, 이는 그들의 혈청형에 상응하는 양성 증폭 및 비상동성 혈청형에 대하여 음성을 나타내었다(데이터는 나타내지 않음). 검출가능한 마이코플라즈마 또는 오염 인자는 상기 MVS, WVS, 또는 BVS 저장물에서 검출되지 않았다.
상기 MVS, WVS, 및 BVS의 유전적 분석
특정한 예시적인 방법에서, 상기 선택된 전-MVS로부터 MVS 발생 후에 상기 선택된 (P7) 균주가 생산되었고, 해당 바이러스 RNA가 다시 서열분석되었다. 전장 게놈 서열분석은 DENVax-1에 대한 MVS가 그것의 전-마스터 시드와 동일하였음을 나타낸 반면, WVS 및 다음의 BVS는 E-483 및 NS4B-108에서 2개의 추가적인 치환을 수득하였다(표 2 및 표 3 참조). E-483에서의 Ala 치환은 상기 MVS 내의 유전자형의 일부를 나타냈지만, BVS에서는 우세한 유전자형이 되었다. DENVax-2 및 DENVax-3는 그들의 해당 전-마스터 시드와 동일하였다(표 2 및 표 3). 상기 DENVax-2 MVS는 그것의 전-마스터 시드와 동일하였고, 상기 WVS 및 BVS는 NS4A-36 및 NS4B-111에서 2개의 추가적인 돌연변이를 가졌다. 양쪽 돌연변이 모두는 WVS에서 부분적이었고, BVS에서는 주요 유전자형이었다. DENVax-3의 MVS는 다시 상기 전-마스터 시드와 다시 동일하였으나, 상기 WVS 및 BVS는 NS4A-23에서 추가적인 아미노산 치환을 함유하였다. 상기 DENVax-4 MVS는 MVS의 생산 동안, 유전자자리 NS2A-99에서 추가적인 아미노산 돌연변이를 수득하였다(Lys으로부터 Lys/Arg 혼합 유전자형)(표 3). 그것의 WVS 및 BVS는 상기 NS2A-99 Lys/Arg 혼합 유전자형을 유지하였고, 상기 BVS는 추가의 NS4B-238 Ser/Phe 혼합 유전자형을 가졌다. 공통 서열 결과는 또한 MVS, WVS뿐만 아니라 BV가 상기 5'NCR-57, NS1-53, 및 NS3-250 유전자자리에서 3개의 유전적 약독화 결정체를 유지하는 것을 확인하였다. TaqMAMA에 의해 적어도 안정한 약독화 유전자자리의 분석은 MVS에서 <0.7% 및 0.13% 사이, WVS에서 ≤0.07%, 및 BVS에서 <0.07 및 0.21% 사이의 5'NCR-57 복귀 비율을 나타내었다. 상기 5'NCR-57 유전자자리에서의 3% 복귀는 백신 로트(lot)의 수용을 위한 최대 허용 비율로 여겨졌다(표 3).
Figure pat00002
전체-게놈 서열 분석은 추가적인 아미노산 돌연변이가 DENVax-4 MVS에서 생겼지만, 다른 3개의 DENVax MVS 로트는 그들의 전-마스터 시드의 공통 게놈 서열을 유지하는 것을 나타내었다. 전반적으로, 상기 P1 시드로부터 전-마스터(P7) 시드로 유도할 때, 오직 1개 또는 2개의 밀접하지 않은 돌연변이가 주어진 시드에서 발생하였다. P1으로부터 MVS(P8) 시드까지는 2 내지 7개 뉴클레오티드 치환이 임의의 주어진 DENVax 시드에서 확인되었고, 이러한 치환 중 오직 2 내지 3개만이 아미노산 변경을 야기하였다. 따라서, 작은 변경이 일어났다. RNA 바이러스는 그들의 게놈 복제에서 오류 발생이 쉽고, 따라서 세포 계대배양 동안 플라비바이러스 게놈에서 유전적 치환은 예상치 못한 것은 아니다. 상기 MVS에서 사일런트(silent) 돌연변이는 바이러스 복제에 영향을 줄 수 있는 상기 5' 또는 3 'NCR 내에는 없다. 오직 상기 DENVax-2의 prM-52 Lys-Glu에서의 변경 및 DENVax-4의 NS2A-66 Asp-Gly에서의 상기 치환만이 보존적 변경이 아니었다. 상기 DENVax-4의 NS2A-66 돌연변이는 상기 DENV-2 PDK-53의 비구조 백본 부분 내에 있다. NS2A-66 유전자자리는 보통 다양한 DENV-2 균주에서 Asp이기는 하지만, 그것은 DENV-4에서는 보통 Gly이다. 상기 DENVax-4에서 Asp의 Gly 변경이 Vero 세포에서 상기 DENVax-4의 적합함에 대하여 적절한 것이 가능하다. 상기 DENVax-2 prM-52 돌연변이는 성숙한 바이러스 입자로부터 잘려나가는 prM의 C-말단 부분에 있다. 일부 예시적인 방법에서, 상기 MVS 시드 내의 상기 돌연변이가 상기 백신의 약독화 표현형을 현저하게 바꾸지 않는 것을 확인하기 위하여 표현형 특성분석을 수행하였다.
상기 DENVax 바이러스는 제조 공정 동안 높은 유전 안정성을 나타내었다. 5'NCR, NS1-53, 및 NS3-250에 위치된 상기 3개의 정의된 DENV-2 PDK-53 약독화 유전자자리는 백신 제조를 벌크화하기 위하여 전-마스터 균주로부터 상기 DENVax의 연속 계대배양시 상기 공통 게놈 서열에서 안정하게 유지하였다. 상기 5'NCR-57 유전자자리의 매우 민감한 TaqMAMA는 뎅기 바이러스 혈청형의 상기 MVS, WVS(P9/작용성), 및 BVS(백신용 벌크 바이러스 시드)에서 최소 또는 검출불가능한 복귀를 나타내었다. 상기 DENVax BVS 제조물(P10-등가물)의 5'NCR-57 복귀 비율은 Vero 세포에서 10회 연속 계대배양 후 연구-등급 백신 후보에서 진화한 상기 5'NCR-57 복귀 비율(4-74% 복귀)보다 현저히 낮았다. 본 발명에 제공된 상기 DENVax 시드의 대규모 제조를 위한 전략은 상기 후보 백신 바이러스 내에 상기 약독화 마커를 유지하는 유전적으로 안정한 백신 시드를 야기하였다.
DENVax MVS의 플라크 표현형
한 예시적인 방법에서, 상기 DENVax MVS의 플라크 표현형을 야생형 뎅기 바이러스 및 Vero 세포에서 그들의 상동성 연구-등급 키메라 바이러스와 비교하였다(도 2). DENVax-1, -2, 및 -3의 모든 MVS는 그들의 야생형 상동체(homolog)보다 현저히 작고, Vero 세포에서 그들의 상동성 연구-등급의 바이러스와 매우 유사한(0.4-mm 차이 내로) 플라크를 생산하였다. 또한 DENVax-4 MVS는 야생형 DENV-4보다 현저히 작았지만, 원래의 실험실 유래 D2/4-V 키메라보다 약간 컸다(0.9mm 차이).
도 2는 대조군 야생형 바이러스 및 연구-등급 백신 후보 바이러스와 비교하여 상기 DENVax MVS의 플라크 사이즈를 나타내는 예시적인 히스토그램을 나타낸다. 9pi일에 아가로스 오버레이 하의 Vero 세포에서 상기 바이러스 플라크의 평균 플라크 직경 ± SD(오차 막대)를 측정하였다. 검정색 막대로 나타낸 상기 야생형 DEN 바이러스 및 흰색 막대로 나타낸 이전에 공개된 연구-등급 백신 후보 바이러스는 회색 막대로 나타낸 DENVax 마스터 백신 시드에 대한 대조 및 비교를 위해 포함되었다.
DENVax MVS의 온도 민감성
다른 예시적인 방법에서, 온도 민감성이 상기 DENVax MVS에 대하여 Vero 세포에서 시험되었고, 그들의 상동성 야생형 및 원래의 연구-등급 키메라 백신 바이러스와 비교되었다. 상기 야생형(wt) DENV-3 16562는 온도 민감성이 아니었다. 상기 wt 뎅기 바이러스 혈청형 1 및 뎅기 바이러스 혈청형-4은 39℃에서 적당히 온도 민감성이었다(역가는 37℃에서보다 39℃에서 대략 1.0 log10 pfu/㎖ 더 낮았다, 도 3). Wt 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681은 시험된 wt 뎅기 바이러스들 중에서 가장 온도 민감성이었고, 39℃에서 100배 역가 하락을 야기하였다. DENVax-1, -2, 및 -3은 그들의 원래의 상동성 연구-등급 키메라 백신 바이러스만큼 온도 민감성이었다(도 2). 39℃에서의 역가는 이러한 DENVax 균주에 대하여 2.0 및 3.0 log10 pfu/㎖ 사이로 하락하였다. 또한 DENVax-4는 온도 민감성이었고, 역가에서 5배 감소를 나타내었다. 하지만, 원래의 연구-등급 D2/4-V는 역가에서 약 10배 감소를 나타내었다. 최종 안정화된 DENVax-4 MVS는 뎅기 바이러스의 온도 안정성을 향상시키는 것을 나타난 F127(및 이러한 제형물을 안정화하는 것으로 알려진 다른 제제(FTA))를 함유하였다. DENVax-4 MVS 내에 상기 F127가 존재하면 상기 Vero 배양 분석에서 상기 바이러스의 덜 확연한 온도 민감성에 기여할 것이다. 별도의 실험에서, F127가 부재한 MSV-유래 DENVax-4 균주의 온도 민감성이 추가로 평가되었다. 상기 균주로부터 상기 F127를 제거하기 위하여, 바이러스 RNA가 DENVax-4 벌크 바이러스 제조물로부터 분리되었으며, Vero 세포로 형질감염되었다. 이 DENVax-4 바이러스는 F127가 부재시 3pi일에 상기 D2/4V 연구 균주만큼 온도 민감성인 것을 나타내었다(1.5 log10 pfu/㎖ 감소된 역가)(도 3).
도 3은 DENVax MVS의 온도 민감성을 나타내는 예시적인 히스토그램을 나타낸다. 상기 야생형 뎅기 바이러스 및 이전에 공개된 연구-등급 백신 후보 바이러스가 비교를 위해 포함되었다. 상기 DENVax-4 MVS는 이 분석에서 상기 바이러스의 온도 민감성 결과를 가릴 수 있는 추가적인 F-127를 함유한다. F127가 부재한 대용 DENVax-4을 분석하는 별도의 실험이 또한 포함되었다. 상기 바이러스의 평균 역가 ± SD(오차 막대)는 37℃ 또는 39℃에서 반복 검증하였다.
모기 C6/36 세포에서 DENVax MVS 복제
일부 예시적인 방법에서, 상기 연구-등급 키메라 백신 바이러스가 이러한 모기 세포에서 상기 백본 DENV-2 PDK53 바이러스의 약독화 표현형을 유지한다는 지식을 갖고서, 시험관 내에서 약독화 표현형을 유지하는지 확인하기 위하여 C6/36 세포에서 성장시켰다. wt 뎅기 바이러스와 비교시, DENVax-1, DENVax-2 및 DENVax-4 MVS는 6pi일에 상기 DENVax MVS를 C6/36 세포에서 현저한 성장 감소(적어도 3 log10 pfu/㎖ 감소)를 나타내었다(도 4). 상기 DENVax-3 MSV는 또한 상기 wt DENV-3 16562와 비교하여 감소된 성장을 나타내었지만, 상기 감소는 뚜렷하지 않았다(1-2 log10 pfu/㎖ 감소). 하지만, 상기 DENVax-3 시드 로트의 C6/36 역가는 원래의 연구-등급 키메라 D2/3-V 백신 바이러스의 C6/36 역가와 유사하였다(1 log10 pfu/㎖ 차이 내로).
도 4는 wt 뎅기 바이러스(검정색 막대) 및 연구-등급 백신 바이러스(흰색 막대)와 비교하여 C6/36 세포에서 DENVax MVS(회색 막대)의 제한 성장을 플롯팅한 예시적인 히스토그램을 나타낸다. 상기 바이러스의 평균 역가 ± SD(오차 막대)는 C6/36 세포에서 6일 pi에서 복제되었다.
전체 모기에서 바이러스 감염, 전반(dissemination) 및 전염(transmission) 비율
일부 예시적인 방법에서, 상기 DENVax의 감염 및 전반 비율이 그들의 모 wt 뎅기 바이러스와 비교되었다. 특정 예시적인 실험에서, 경구 감염 실험이 Ae. aegypti 모기에서 수행되었다. 감염성 혈액 식사가 상기 바이러스 역가를 측정하기 위하여 역-적정되었고(back-titrated), 오직 모 뎅기 바이러스 및 각 혈청형에 대한 DENVax 사이의 상기 혈액 식사에서 유사한 바이러스 역가(1 log10 pfu/㎖ 차이 이하)가 있는 실험만이 표 4의 비교군에 대하여 포함되었다. DENVax-1, DENVax-2, 및 연구-등급 D2 PDK-53-VV45R은 경구 투여를 통해 모기를 감염시키지 않았고, 이는 그들의 모 바이러스, DENV-1 16007(44% 감염) 및 DENV-2 16681(43.3% 감염)과 현저하게 달랐다(p < 0.0001). 모기가 DENVax-1 및 -2에 의해 감염되지 않았기 때문에, 이러한 2개의 백신 바이러스에 대한 전반 문제가 별로 없었다. DENVax-4가 구강 투여를 통해 일부 모기를 감염시키는 반면(55마리 중 2마리), 상기 감염 비율은 그것의 모 wt 바이러스인 DENV-4 1036(50마리 중 8마리)보다 현저하게 낮았다(p < 0.05). DENVax-3은 5.2±0.02 log10 pfu/㎖의 혈액 식사 바이러스 역가가 있는 2개의 실험에서 임의의 모기를 감염시키지 않았고(표 4), 6.0 log10 pfu/㎖의 혈액 식사 바이러스 역가가 있는 별도의 실험에서, 오직 30마리 중 1마리 모기만이 감염되었다(데이터는 나타내지 않음). 하지만, wt 뎅기 바이러스-3 16562는 또한 5.2 log10 pfu/㎖에서 매우 낮은 감염 비율(8%)을 가졌고, 상기 비율은 6.2 log10 pfu/㎖에서 더 높은 혈액 식사 바이러스 역가(3%, 30마리 모기 중 양성 1마리, 데이터는 나타내지 않음)가 있는 별도의 실험에서 증가하지 않았다. 상기 야생형(wt) 뎅기 바이러스-3 및 뎅기 바이러스-4가 상기 wt 뎅기 바이러스-1 및 뎅기 바이러스-2보다 현저하게 낮은 감염 비율을 가지긴 했지만, 상기 감염된 모기에서 평균 바이러스 역가는 유사하였다(3.1 내지 3.9 log10 pfu/모기). 대조적으로, 상기 2개의 감염된 모기로부터 상기 DENVax-4 역가는 모두 최소였고(0.7 log10 pfu/모기), 이는 wt 뎅기 바이러스 혈청형-4 1036에 의해 감염된 모기로부터 역가보다 1,000배 낮았다(3.9 ±1.5 pfu/모기).
중장(midgut) 밖으로 감염된, 전반된 그 모기들에 대하여 바이러스가 다리에 존재하는지 확인함으로써 평가될 수 있다. 상기 4개의 모 DENV는 36.3% 및 62.5% 사이의 범위인 전반 비율을 야기하였고, 다리로부터 그들의 평균 바이러스 역가(log10 pfu에서)는 0.9±0.3 및 2.2±0.7 사이였다(음성 시료를 제외함). 상기 2개의 DENVax-4 감염된 모기는 모두 다리에 대하여 바이러스 전반을 야기하지 않았다(표 4). 전반된 바이러스는 다리에서 검출가능한 반면, 상기 4개의 wt 뎅기 바이러스는 경구 감염된 모기의 타액에서 검출가능하지 않았고, 이는 경구 투여 조건이 이러한 DENV의 전염 속도를 측정하기 위하여 충분히 민감하지 않을 수 있는 것을 제안한다. 따라서, 다른 예시적인 방법에서, 직접적인 IT 접종으로 매우 가혹한 인공적인 모기 감염을 이어서 수행하였다(표 4). DENVax-4를 제외하고, 모든 바이러스(wt 및 DENVax)는 상기 IT 접종된 Ae. aegypti의 100% 감염을 달성하였다. 상기 DENVax-4 접종원은 다른 3개의 바이러스 접종원보다 약간 낮은 바이러스 역가를 가졌지만, 이것은 여전히 상기 접종된 모기의 70%를 성공적으로 감염시켰다. IT 접종에 의해 달성된 높은 생체 감염 비율에도 불구하고, 4개의 모든 DENVax 바이러스는 상기 wt 뎅기 바이러스(43-87%, 표 4)에 비하여 현저하게 낮거나(p < 0.005), 검출가능하지 않은 전염 비율(0-10%)을 나타내었다. 경구 투여 후 상기 DENVax 바이러스는 감염 및 전반이 별로 나타나지 않았고, 상기 매우 가혹한 IT 결과는 Ae. aegypti에서 이러한 DENVax 바이러스의 최소 전염 능력을 확인하였다.
Figure pat00003
벡터 수용능은 생약독화 플라비바이러스 백신 바이러스에 대한 중요한 안전성 요소이다. 이전에, 상기 연구-등급 DENV-2 PDK-53-VV45R 바이러스 및 wt 유도체가 Ae. aegypti에서 시험되었고, 상기 NS1-53-Asp 약독화 돌연변이가 손상된 모기 복제에 대하여 우세한 결정인자였던 것으로 나타났다. 상기 DENV-2 PDK-53 백신의 다른 2개의 주요 약독화 유전자자리인 뉴클레오티드 5'NCR-57-T 및 NS3-250-Val은 또한 모기에서 복제에 대한 일부 저해 효과를 나타내었고, 따라서 모기 벡터 수용능에 대한 추가적인, 불필요한 제한을 제공한다. 본 발명에 기재된 일부 예시적인 방법은 4개의 모든 DENVax에 대한 상기 모기 경구 및 IT 감염 및 복제를 시험하기 위하여 사용하였다. DENVax-1, -2, 및 -3은 경구 감염을 통하여 임의의 Ae. aegypti 모기를 감염시키지 않았다(표 4). 상기 DENVax-4는 경구로 노출된 모기의, wt DENV-4 감염된 모기의 것보다 낮은 모기 생체에서 복제하는 평균 역가를 갖는 상기 wt DENV-4의 것보다 현저하게 낮은 수준인, 오직 3.6%만을 감염시켰다. 놀랍게도, DENVax-4는 상기 감염된 모기의 다리에서 검출되었고, 이는 DENVax-4가 경구 감염 후의 상기 모기 중장으로 전반될 수 없는 것을 제안한다. 상기 DENVax-1, -2, 및 -4에 대한 감염 비율은 그들의 wt 대응물보다 모두 덜 현저하지만, 상기 차이는 두 바이러스에 대한 매우 낮은 감염 비율때문에 DENVax-3 및 wt DENV-3 16562 사이에서 유의하지 않다. 태국 매솟주(Mae Sot Province)에서 함께 수집된 Ae. aegypti에서 평가된 DENV의 다른 wt 균주와 비교하여, DENVax를 제작하기 위해 사용된 상기 모 wt 뎅기 바이러스 균주는 경구 감염에 의해 낮은 감염성 및 전반 비율을 가지는 것으로 보였다. 황열병(YF) 17D 백신-기초한 키메라 Vax-DEN 백신을 제작하기 위해 사용된 wt DENV-1 PU0359, DENV-2 PU0218, DENV-3 PaH881/88, 및 DENV-41288은 47-77% 범위의 감염 비율을 가졌다. 대조적으로, 상기 YF 17D은 Ae. aegypti를 감염시킬 수 없었다. 상기 키메라 Vax 균주는 이러한 매우 감염성 wt DENV으로부터 prM-E를 함유하기는 했지만, 상기 키메라 Vax는 그들의 YF 17D 복제 백본의 모기 약독화 표현형을 유지한다. 본 발명에서 제공된 결과는 또한 DENV-2 PDK-53 백본의 모기 약독화가 상기 DENVax 균주에서 유지되었던 것을 나타내었다. 게다가, 본 발명에 기재된 조성물에 포함된 구조체에서 낮은 모기 감염성을 갖는 상기 wt 뎅기 바이러스 균주를 이용하여 추가적인 안전성 특징을 제공한다.
경구 감염 결과는 상기 DENVax가 최소의 모기 감염성 및 전반 능력을 가지는 것을 예시한다. 게다가, 더 민감하고 가혹한 IT 감염 실험은 DENVax가 Ae. aegypti에 의해 전염될 가능성을 추가로 분석하기 위하여 수행하였다. 상기 IT 결과는 4개의 모든 DENVax 바이러스가 그들의 wt 대응물에 비하여 검출가능하지 않은 또는 최소의 모기 전염 가능성을 나타내었다. 만일 (1) 벡터를 충분한 바이러스혈증 역가로 백신을 맞은 모기(vaccinee)에 공급하여 모기 중장을 감염시키고, (2) 상기 바이러스가 상기 중장 상피 내에서 복제할 수 있으며, 이어서 상기 중장 밖으로 전반되는 것이 가능하며, (3) 상기 전반된 바이러스가 타액선에서 복제할 수 있고, 전염을 위해 타액에서 충분한 바이러스가 타액으로 뱉어질 수 있는 경우, DENVax 전염은 이론상으로만 일어날 수 있을 것이다. 모기를 감염시키기 위해 필요한 인간 바이러스혈증의 임계값은 적절하게 수립되지 않았지만, 인간 바이러스혈증은 자연의 wt DENV 감염 후에 106-108 모기 감염성 투여량(mosquito infectious dose)50(MID50)/㎖일 수 있다. 이 MID50은 희석된 인간 혈장을 갖는 모기의 직접 IT 접종에 기초하였다. 비인간 영장류에서 DENVax의 분석은 DENVax 면역화 후에 바이러스혈증 역가가 매우 낮았고(2.4 log10 pfu/㎖ 이하), 2-7일 동안 지속되는 것을 나타내었다. 상기 DENVax의 낮은 바이러스혈증 수준 및 낮은 모기 감염, 전반 및 전염 능력을 고려해 볼 때, 이러한 백신 바이러스가 자연에서 모기로 전염될 수 있거나, 바이러스혈증을 유발할 수 있을 것 같지는 않다.
따라서, 임의의 상기 혈청형의 임의의 계대배양(P1-P10)이 1개, 2개, 3개 또는 4개의 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 대하여 안전하고 효과적인 백신을 발생시키기 위하여 조성물에 사용될 수 있는 것이 제안된다.
이유 마우스에서 신경병원성
상기 원래의 연구-등급 백신 바이러스는 사내 DVBD/CDC에서 유지되는 신생 ICR 마우스에서 신경병원성에 대하여 매우 약독화되었다. 모든 이러한 마우스는 각 백신 바이러스의 104 pfu로 ic(대뇌 뇌로) 시험에서 생존했다. 반면에, 상기 wt 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681 바이러스는 다양한 실험에서 이러한 CDC-ICR 마우스에서 62.5%-100% 치사율을 야기하였다. 일부 실험에서, Taconic Labs(Taconic-ICR)에서 얻어진 상업용 ICR 마우스가 신생 마우스에서 신경병원성을 연구하기 위하여 사용되었다. 신생 Taconic-ICR 마우스가 상기 이전의 CDC-ICR 마우스보다 뎅기 바이러스 혈청형-2 감염에 대하여 더 현저하게 예민하였던 것이 관찰되었다. 도 5의 A는 상기 바이러스의 104 pfu로 ic 시험된 CDC-ICR 콜로니 및 Taconic-ICR 신생 마우스에서 wt 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681의 신경병원성을 요약한다. 상기 Taconic-ICR 마우스(32마리 마우스에서 100% 치사율, 8.3 ± 0.5일의 평균 생존 시간)는 상기 이전의 CDC-ICR 마우스(72마리 마우스에서 91% 사망수, 14.6 ± 2.3일의 평균 생존 시간)보다 ic 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681 시험에 대해 더 예민하였다.
다른 예시적인 방법에서, 처음에 상기 DENVax MVS의 신경병원성을 평가하기 위하여, 상기 Taconic-ICR 마우스는 하나(n=16) 또는 두(n=31-32) 실험에서 wt 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681, D2 PDK-53 VV45R, D2/3-V, 또는 DENVax1-4 바이러스의 대략 104 pfu의 투여량으로 ic(대뇌 뇌로) 시험되었다(도 5의 B). 이 투여량에서, D2/3-V 연구 등급 바이러스뿐만 아니라, DENVax-1 및 DENVax-3 MVS는 완전히 약독화 신경병원성 표현형(병 또는 치사율 없음)을 나타내었다. 예상대로, wt 뎅기 바이러스 혈청형-2는 8.3 ± 0.8일의 평균 마우스 생존 시간(AST)으로, "치명적인" 것으로 나타났다. 이러한 뎅기 바이러스 혈청형-2-민감성 Taconic-ICR 마우스에서, 상기 D2 PDK-53-VV45R 연구 등급 바이러스는 81.3% 치사율을 야기하였다. 상기 DENVax-2 MVS 및 DENVax-4 MVS는 각각 9.8 ± 1.7, 10.2 ± 1.4, 및 11.3 ± 0.4일의 AST 값을 나타내면서, 상기 Taconic-ICR에서 균일하게 치명적이었다.
일부 예시적인 방법에서, wt 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681 바이러스의 상기 신경병원성은 10배 낮은 투여량(103 pfu, 도 5의 C)에서 D2 PDK-53 VV45R, DENVax-2 MVS 및 DENVax-4 MVS뿐만 아니라 D2/4-V 연구 등급 바이러스의 것과 비교되었다. 상기 wt 뎅기 바이러스 혈청형-2은 이 낮은 시험 투여량에서 9.0 ±1.4일의 AST로 균일하게 치명적인 신경병원성 표현형을 유지하였다. 중간 신경병원성 표현형 및 신경병원성 정도를 나타내는 상기 다른 4개의 바이러스는 혈청형-특이적이었다. 상기 D2 PDK-53-VV45R 바이러스 및 그것의 DENVax-2 MVS 동족은 현저한 약독화(각각 32.3%, 13.1 ± 3.8일의 AST로 생존; 및 31.2%, 10.5 ± 3.4일의 AST로 생존)를 나타내었다. 상기 DENVax-4 MVS 및 상기 연구 등급 D2/4-V 바이러스 모두는 신경병원성에 대하여 매우 약독화되었다(각각, 81.3%, 18.8 ± 5.8일의 AST로 생존; 및 100% 생존). 상기 결과는 DENVax-1 및 -3의 MVS가 신경병원성의 완전한 약독화를 나타낸 반면에, DENVax-2 및 -4 MVS 로트는 그들의 상응하는 연구-등급의 바이러스 백신 후보와 밀접하게 유사한 약독화 표현형을 유지하는 것을 제안했다.
도 5의 A 내지 C는 wt 뎅기 바이러스 혈청형-2 및 다른 약독화 뎅기 바이러스를 포함하는 다양한 조성물로 시험된 신생 마우스에서 신경병원성을 나타내는 예시적인 그래프를 나타낸다. 상기 바이러스의 104 pfu로 ic 시험된 CDC-ICR(n=72) 및 Taconic-ICR(n=32) 신생 마우스에서 wt 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681 바이러스의 신경병원성을 요약하는 많은 실험을 모은 결과(A). 104 pfu(B) 또는 103 pfu(C)의 투여량으로 Taconic-ICR 마우스에서 시험된 DENVax MVS의 신경병원성. 하나의 실험(n=16) 또는 2개의 모은 실험(n=31 또는 32)의 그룹당 시험된 동물의 수가 표시된다.
WVS 및 BVS의 플라크 표현형
특정한 연구를 수행하여 WVS 및 BVS와, MVS, wt 뎅기 바이러스 및 그들의 상응하는 실험실 유래인 Vero 세포에서 연구-등급 키메라를 비교하였다(도 6). 평균 플라크 크기를 wt DENV-1, -3, 및 -4의 감소된 수로부터가 아니라 각 백신 바이러스에 대하여 10개의 플라크로부터 계산하였다. DENVax-1, -2, 및 -3의 모든 MVS 바이러스는 그들의 wt 상동체보다 현저하게 작고, Vero 세포에서 그들의 상동성 연구-등급의 바이러스와 매우 유사한(0.4-mm 차이 내로) 플라크를 생산하였다. 또한 DENVax-4 MVS는 상기 wt DENV-4보다 현저하게 작았지만, 상기 원래의 실험실 유래된 D2/4-V 키메라보다 약간 컸다(0.9mm). 상기 DENVax-2은 제외하고, 상기 DENVax-1, -3, -4의 모든 WVS 및 BVS는 그들의 wt 상동체로부터 생산된 것보다 현저하게 작은 플라크 크기를 유지하였다. 상기 DENVax-2 WVS 및 BVS는 Vero 세포에서 wt DENV-2 바이러스의 플라크와 유사한 플라크를 생산하였지만, LLC-MK2 세포에서 시험시 상기 DENVax-2 가공된 시드는 모두 상기 wt DENV-2(1.4 ± 0.4)의 것보다 약간 작고, 상기 실험실 유래된 D2 PDK-53-VV45R(1.0 ± 0.3)와 유사한 플라크를 생산하였다(도 6).
작은 플라크 표현형, 온도 민감성, 모기 세포에서 감소된 복제, 모기에 의한 감소된 감염/전반/전염, 및 신생 ICR 마우스에서 감소된 신경병원성을 포함하는 바이러스 약독화의 표현형 마커의 평가가 상기 MVS 저장물 조성물에 대하여 평가되었다. 결과는 모든 상기 DENVax가 상기 원래의 연구-등급 백신 바이러스와 유사한 예상된 약독화 표현형을 유지하는 것을 나타내었다. 약독화에 원인이 있는 돌연변이가 모든 MVS, WVS 및 BV에서 보존되는 것을 고려해 볼 때, 그것은 인간 임상 시험을 위해 가공된 재료에서 유지되는 약독화 표현형이 예상될 수 있다.
도 6은 상기 DENVax MVS, WVS, 및 BVS의 플라크 크기를 나타내는 예시적인 히스토그램을 나타낸다. 9pi일에 아가로스 오버레이 하에 Vero 또는 LLC-MK2 세포에서 상기 바이러스 플라크의 평균 플라크 직경 ± SD(오차 막대)를 측정하였다. 상기 wt DENV 및 이전에 공개된 연구-등급의 백신 후보 바이러스가 대조 및 비교를 위해 포함되었다.
모기 C6/36 세포에서 바이러스 복제
이전의 연구는 상기 연구-등급 PDK-53-기초한 키메라성 백신 바이러스가 C6/36 세포에서 상기 백본 DENV-2 PDK53 바이러스의 약독화 표현형을 유지하는 것을 나타내었다. 일부 예시적인 방법에서, 상기 DENVax MSV, WVS, 및 BVS를 C6/36 세포에서 성장시켜 대규모 제조 후에 이 시험관 내에서 약독화 마커의 그들의 유지를 확인하였다. DENVax-3를 제외하고, wt 뎅기 바이러스에 비하여, 상기 가공된 시드는 C6/36 세포에서 6pi일에 현저한 성장 감소(적어도 3 log10 PFU/㎖ 감소)를 나타내었다(도 7). 상기 DENVax-3 시드는 또한 상기 wt DENV-3 16562에 비하여 감소된 성장을 나타내었지만, 상기 감소는 현저하지 않았다(1-2 log10 PFU/㎖ 감소). 하지만, 상기 DENVax-3 시드 로트의 역가는 상기 원래의 연구-등급의 키메라 D2/3-V 백신 바이러스와 유사하였다(1 log10 PFU/㎖ 차이 내로).
도 8은 C6/36 세포에서 DENVax MVS, WVS, 및 BVS의 제한된 성장을 플롯팅한 예시적인 히스토그램을 나타낸다. 상기 바이러스의 평균 역가 ± SD(오차 막대)는 7일 pi에 C6/36 세포에서 반복 검증하였다. 상기 wt 뎅기 바이러스 및 이전에 공개된 연구-등급의 백신 후보 바이러스가 비교군에 포함되었다.
이유 마우스에서 신경병원성
추가적인 실험을 수행하여 신생 ICR 마우스에서 신경병원성을 분석하였다. 104 PFU의 두개 내의(intracranial) 투여량에서, 상기 ICR 마우스에서 wt DENV-2 16681 및 상기 D2 PDK-53-VV45R에 대한 생존 비율은 각각 0% 및 18.8%였지만(도 9의 A), 상기 CDC ICR 마우스에서는 wt DENV-2 16681에 대하여 약 20% 및 D2 PDK-53-VV45R에 대하여 100%였다. 이 연구에서, 104 PFU의 투여량에서 상기 마우스에 대하여 DENVax-1 및 DENVax-3 MVS는 약독화되었지만(100% 생존), DENVax-2 및 DENVax-4의 MVS는 104 PFU 이상의 투여량에서 100% 치사율을 유발하였다(도 5의 A). 하지만, 103 PFU 바이러스 투여량에서 시험시, 상기 DENVax-2(31.3% 생존) 및 DENVax-4(81.3% 생존)는 wt 뎅기 바이러스 혈청형-2 16681(0% 생존)에 대해 감소된 신경병원성을 나타내었고, 그들의 생존 비율은 각각 상기 연구-등급의 백신 후보 D2 PKD-53-VV45R(32.3%) 및 D2/4-V(100%)와 유사하였다(도 9의 B). 이 연구에서 wt DENV-1, -3, 또는 -4가 비교군에 포함되지 않기는 했지만, 이전의 논문은 ic 경로로 상기 CDC-ICR 마우스에서 wt DENV-1 16007가 약독화되었던 반면에, wt DENV-3 16562 및 DENV-4 1036 모두는 상기 CDC-ICR 마우스에 대하여 매우 독성이 있는(0% 생존) 것을 나타내었다. 이러한 3개의 wt DENV는 더 예민한 Taconic ICR 마우스에서 유사한 또는 더 큰 병독성을 나타낼 가능성이 크다. 따라서, 상기 wt 뎅기 바이러스를 그들의 상동성 DENVax MVS들과 비교를 위해 포함하는 것은 정보력이 없는 것으로 여겨졌다. 이 연구는 4개의 모든 DENVax MVS 및 원래의 실험실 유래된 후보 백신 바이러스가 상기 wt DENV-2 16681에 대해 비슷한 마우스 약독화 표현형을 나타내는 것을 보여주었다.
도 9의 A 및 B는 신생 ICR 마우스에서 DENVax MVS의 신경병원성 데이터의 예시적인 그래프를 나타낸다. (A) 104 PFU 투여량에서 상기 바이러스의 IC 접종. (B) 103 PFU 투여량에서 상기 바이러스의 IC 접종.
상기 DENVax의 모든 시드 로트는 바람직하지 않은 제제 없이 동일성 및 멸균율에 대해 시험되었다. 전체-게놈 서열 분석은 상기 DENVax-4 MVS에서 하나의 추가 아미노산 돌연변이가 진화한 반면, 상기 다른 3개의 DENVax MVS은 그들의 전-마스터 시드의 공통 게놈 서열을 유지하는 것을 나타내었다. WVS 로트에서, 상기 DENVax-3는 추가 아미노산 돌연변이를 수득하였고, 다른 3개의 혈청형은 그들의 전-마스터 시드에 대해 2개의 추가 아미노산 치환을 누적하였다. 모든 상기 4개의 BVS의 게놈 서열은 모두 그들의 WVS 로트와 동일하였다. 상기 P2 시드로부터 상기 전-마스터(P7)까지 전반적으로, 주어진 시드에서 오직 1개 또는 2개의 비-사일런트 돌연변이가 발생하였다. 전-마스터 및 BCS(P10) 시드 사이에서 오직 1개 내지 2개 뉴클레오티드 치환만이 관찰되었고, 이들 모두는 잔기 E-483에서 보존된 글리신 및 알라닌을 야기한 단일 뉴클레오티드 변경을 제외하고는 NS2A, 4A, 또는 4B에서 발생하였다. P2에서 BVS(P10) 시드까지, 총 3개 내지 8개의 뉴클레오티드 치환이 임의의 주어진 DENVax 시드에서 확인되었고, 이러한 치환의 오직 2개 내지 4개만이 아미노산 변경을 야기하였다. 상기 BVS에서 상기 사일런트 돌연변이는 바이러스 복제에 영향을 줄 수 있는 5'- 또는 3'-NCR 영역 내에 없었다. 이러한 결과는 상기 DENVax 바이러스가 제조 동안 유전적으로 매우 안정하다는 것을 제안한다. 5'NCR, NS1-53, 및 NS3-250에 위치한 상기 3개의 정의된 DENV-2 PDK-53 약독화 유전자자리는 BVS 저장물을 발생시키기 위하여 상기 DENVax의 연속 계대배양시 상기 공통 게놈 서열에서 변하지 않은 채로 유지하였다. 상기 5'-NCR-57 유전자자리의 매우 민감한 TaqMAMA는 DENVax의 상기 MVS, WVS, 및 BVS에서 최소 또는 검출불가능한 복귀를 나타냈다. 0.21%의 최고 복귀 비율이 상기 DENVax-2 BVS에서 확인되었다. 상기 P10-등가물 BVS(<0.07% 내지 0.21%)의 복귀 비율은 Vero 세포에서 연속 계대배양 후에 다른 백신 후보에서 진화한 상기 복귀 비율(P10에 의해 4-74% 복귀)보다 현저하게 낮았다. 이것은 상기 DENVax 시드의 대규모 제조에 대한 이 전략이 상기 후보 백신 바이러스에서 유전적 안정성 및 약독화 마커의 유지를 유지하는 것에 대하여 성공적인 것을 제안한다.
본 발명에 개시된 MVS 저장물이 WVS 및 BVS 로트의 추가 제조에 이용될 것이기 때문에, 작은 플라크 표현형, 온도 민감성, 모기 세포에서 감소된 복제, 온전한 모기에서 감소된 감염/전반/전염, 신생 ICR 마우스에서 감소된 신경병독성을 포함하는 바이러스 약독화 표현형 평가의 전체 패널이 모든 MVS 또는 그들의 등가물 대용 저장물에 대하여 수행되었다. 상기 WVS 및 BVS 저장물에 대하여, 플라크 사이즈, 모기 세포에서 감염성 또한 수행하여 그들의 약독화를 확인하였다. 결과는 상기 DENVax의 4개의 혈청형의 모든 MVS 저장물이 원래의 실험실-유래된 백신 바이러스와 유사한, 상기 예상된 약독화 표현형, 예컨대 작은 플라크, C6/36 세포에서 감소된 복제 및 감소된 마우스 신경병원성을 유지하는 것을 나타내었다(도 6, 8 및 9). 상기 DENVax-4를 제외하고, DENVax의 모든 다른 3개 MVS 저장물은 도 3 및 도 7에서 나타낸 바와 같이 39℃에서 TS였다.
상기 WVS 및 BVS 저장물에 대하여, 2개의 약독화 표현형인 작은 플라크 및 C6/36 세포에서 감소된 복제가 분석 및 확인되었다. 상기 MVS 및 BVS 사이에서 매우 작은 유전적 변경이 있었기 때문에, 그들이 MVS로서 상기 약독화 표현형을 유지할 것이라는 것이 예상되었다. 본 발명에 기재된 실험에 더하여, Ag129 마우스 및 비인간 영장류에서 상기 가공된 DENVax의 안전성 및 면역원성이 시험되었다.
본 발명에서 예시적인 방법이 cGMP 하에 DENVax MVS, WVS, 및 BVS 저장물의 제조를 확인하기 위하여 제공된다. 상기 BVS 저장물은 현재 인간 임상 시험 평가에서 4가 DENVax를 제형화하기 위해 사용되었다. 상기 가공된 MVS의 유전적 안정성 및 안전성을 최적화하기 위하여 특유의 제조 전략이 일부 예시적인 방법에서 제공되었다. 상기 DENVax의 주요 약독화 유전자자리가 이전에 잘 특징화되었기 때문에, 매우 민감하고 정량가능한 SNP 분석인 TaqMAMA가 게놈 서열을 통합하기 위해 개발되었고, 상기 MVS를 만들기 위한 최적의 전-마스터 시드를 확인하기 위하여 TaqMAMA를 사용하였다. 상기 MVS의 유전적 및 표현형적 특성분석을 완전히 분석하여 이러한 바이러스가 상기 백신의 안전성에 대하여 바람직한 약독화를 유지하는 것을 확인하였다. 이것은 전-마스터에서 BVS 저장물까지 동안 내내 모든 주요한 약독화 유전적 유전자자리에 대하여 효율적으로 분석될 수 있는 유일한 생약독화 바이러스 백신일 수 있다. 본 발명에서 제공된 결과는 백신 안전성에서 전략적으로 설계된 생약독화 백신의 이점을 예시하였다.
도 10은 새로운 생약독화 바이러스와 이전에 발생된 생약독화 뎅기 바이러스를 비교하는 예시적인 표를 나타낸다. 돌연변이는, 여기서 대조군 바이러스(예를 들면, 16681), 또는 다른 생약독화 뎅기-2 바이러스와 다르게 표시된다.
재료 및 방법
바이러스 및 세포
DENV-1 16007, DENV-2 16681, DENV-3 16562, 및 DENV-4 1034가 야생형(wt) DENV 대조군으로서 제공되었고, 그들은 상기 4개의 재조합 DE Vax 백신 후보에 대하여 모(parental) 유전자형 바이러스였다. D2/1-V, D2 PDK-53-VV45R, D2/3-V, 및 D2/4-V로 표기되는 DENVax 조상 연구-등급의 바이러스가 이전에 제조되었고, 특징화되었다. 백신 생산을 위하여 상기 마스터 및 작용성 세포 은행을 만들기 위해서 사용된 Vero(아프리카 사바나 원숭이 신장) 세포는 백신 제조를 위해 세계보건기구(WHO)에 의해 특징화되었던 American Type Culture Collection(ATCC) CCL81 세포주(WCB-Vero 세포)로부터 유래되었다.
cDNA 클론으로부터 살아있는 재조합 DENVax 바이러스의 유도
cGMP 제조 조건 하에 상기 후보 백신 바이러스를 재-유도하기 위하여, 이전에 가공된 DENV 감염성 cDNA 클론인, pD2-PDK-53-W45R, pD2/1-V, pD2/4-V 및 상기 전체 게놈-길이 바이러스 cDNA를 함유하는 시험관 내에서-라이게이트된 pD2/3-V를 이용하여 이전에 기재된 바와 같이 시험관 내에서 전사로 새로운 바이러스 RNA 전사물을 만들었다. 간단하게, Xbal-선형화된 DENV 게놈 cDNA를 프로티나제 K로 처리하였고, 페놀/클로로포름으로 추출하였으며, 에탄올에 침전시켜 임의의 단백질을 제거하였고, 그 후 전사 전에 RNase-부재 Tris-EDTA 완충액에 부유시켰다. 시험관 내에서 전사는 AmpliScribe T7 고효율 전사 키트(Epicentre Technologies)를 이용하여 제조업자의 권장 프로토콜에 따라 수행하였다. RNA A-cap 유사체인 m7G(5')ppp(5')A(New England BioLabs)를 2시간 전사 반응 동안 포함시켜 상기 RNA 전사물에 5'-말단 A-cap을 첨가하였다. 그 후 상기 시료를 DNase Ⅰ으로 처리하여 주형 cDNA를 소화시켰고, 그 다음에 낮은 pH 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 하여 남은 DNA 및 단백질을 제거하였다. RNase-부재 물에 부유된 정제된 RNA 전사물을 20㎕ 분액으로 나누었고, 세포의 형질감염을 위한 준비까지 -80℃에서 보관하였다. 상기 RNA 전사물의 무결성 및 농도를 아가로스 젤 전기영동으로 분석하였다. 각 20-㎕ 분액은 전기천공법으로 0.4-1×107개의 생산-증명된 Vero 세포의 형질 감염을 허용하기 위해 충분한 게놈-길이 바이러스 RNA를 함유하는 것으로 추정되었다.
WCB-Vero 세포로 각 RNA 전사물의 형질감염을 Shantha Biotechnics에서 cGMP 시설에서 수행하였다. DENVax RNA 전사물을 해동하였고, Vero 세포 현탁액(1×107 세포/㎖) 400㎕와 혼합하였으며, Gene Pulser Xcell total system(BioRad Laboratories)에 의한 전기천공법을 위해 미리-냉장한 살균한 전기천공 큐빗(4-mm 간격)으로 이동시켰다. 각 시료를 250V/∞ Ohms/500μF에서 한번 펄스하였고, 실온에서 10-15분간 배양하였으며, 세포 성장 배지(10% FBS가 있는 MEM) 30㎖을 함유하는 75-cm2 플라스크로 이동시켰으며, 6 내지 11일 동안 36℃±1℃, 5% C02에서 배양하였다. 상기 배양 배지를 수확하였고, 원심분리로 투명하게 하였으며, 안정화하였고, 작은 분주로 -60℃ 이하에서 보관하였다. 형질감염으로부터의 결과물인 후보 백신 저장물(계대배양 수준 1에 대해 P1이라 일컬음)의 역가를 Vero 세포에서 적정 분석으로 확인하였고, 상기 DENVax 시드의 추가 증식을 위해 사용하였다.
DENVax 바이러스 시드의 제조
P1 바이러스 시드를 사용하여 DENVax 전-마스터, 마스터, 작용성, 및 벌크 바이러스 시드 로트를 가공된 로트의 최적의 유전적 안정성 및 안전성을 보장하도록 설계된 전략을 통하여 증식시켰다. 이 전략은 지속적인 시드 생산을 위한 최적의 복제 바이러스 개체군을 선별하기 위하여 3가지 연속 플라크 정제뿐만 아니라 다양한 계대배양 수준에서 바이러스의 유전적 분석을 포함하였다(표 1). 간단하게, 형질감염된 세포로부터 수확된 상기 P1 시드를 0.001의 MOI에서 Vero 세포의 감염으로 한번 증폭하여 P2 시드를 발생시켰다. 상기 P2 시드 저장물의 분액을 플라크 형태 및 완전한 바이러스 게놈 서열분석으로 평가하였다. 상기 유전적으로 확인된 P2 저장물을 플라크 적정 부분 이하에서 기재된 바와 같이 잘-단리된 플라크를 발생시키기 위하여 오버레이 배지로 Vero 세포 단층 위에 도말하였다. 뉴트럴 레드(neutral red)로 가시화한 후, 백신 바이러스의 4개의 혈청형 각각으로부터 6개의 개별 플라크를 분리하였고(플라크 클론 A 내지 F), 배양 배지 0.5㎖과 혼합하였다(계대배양 P3). 각 6개의 플라크 현탁액을 플라크 정제의 2개의 추가적인 라운드에 처리하였고, 그 결과 계대배양 P4 및 P5 각각에서 2배 및 3배 플라크 정제된 바이러스 시드를 생성하였다. 상기 P5 바이러스를 2번의 순차적인 Vero 계대배양을 통해 증폭하여 P7 시드 저장물을 생산하였다.
이전에 개시된 바와 같이 스팟 서열분석 및/또는 Taqman-기초한 미스매치된 증폭 돌연변이 분석(TaqMAMA)을 이용하여 상기 3개의 주요 DENVax 약독화 유전자자리의 유전적 분석 및 플라크 표현형 분석을 수행하여 모든 24개의 P7 시드를 선별하였다. 그 후 적절한 초기 특징을 보유하는 시드는 추가로 전체 게놈 서열분석으로 특징화하였다. 이러한 분석들의 결과로서, 각 DENVax 혈청형의 6개(클론 A-F) P7 시드 중 하나를 상기 DENV-2 PDK-53 약독화 돌연변이, 최소 게놈 서열 변경 및 예상된 플라크 표현형의 존재에 기초한 상기 전-마스터 시드로 선택하였다. 각 선택된 전-마스터 시드를 복수의 175cm2 플라스크 내의 Vero 세포에서 0.001 MOI에서 상기 바이러스의 1회 계대배양으로 마스터 바이러스 시드(MVS 또는 P8)로 확장시켰다. 상기 DENVax-4 MVS를 제외하고, 상기 마스터 바이러스 시드를 감염 후 8-10일에 수확하였다. 상기 MVS 저장물을 감염 후 6-10일에 수확하였고, 원심분리로 투명화시켰으며, 수크로스/포스페이트/글루타메이트 용액(각각 최종 농도 7.5% 수크로스, 3.4 mM 칼륨 디하이드로겐 포스페이트, 7.2 mM 디칼륨 하이드로겐 포스페이트, 5.4 mM 모노나트륨 글루타메이트) 및 0.95 내지 1.90% FBS(최종 농도)의 첨가로 안정화시켰다. DENVax-4 MVS를 다르게 제조하여 그것의 수율을 최적화하였다. 간단하게, 복수 플라스크의 세포를 DENV 바이러스 온도 안정성을 향상시키는 것으로 확인되었던 F-127™인 폴록사머 407(다른 EO-PO 블럭 공중합체가 평가되었고 본 발명에서 대체될 수 있음, 등록 특허 참조)의 0.1% 존재시 0.001 MOI에서 DENVax-4 전-마스터 시드로 감염시켰다. 감염성 배지를 6-10pi일에 수확하였고, 17% FBS(최종 농도)로 안정화시켰으며, 모으고, 냉동시켰다. 4개의 모든 DENVax MVS 저장물을 1㎖ 분액으로서 -60℃ 이하에 보관하였다.
상기 DENVax 작용성 바이러스 시드(WVS)를 0.001 MOI에서 상기 MVS의 Vero 세포 배양에서 1회 계대배양으로 제조하였다. 상기 절차는 그들이 복수층 세포 공장(6360cm2)에서 배양되는 것을 제외하고, MVS의 생산과 유사하였다. 상기 WVS 저장물을 10㎛ 및 0.45㎛ 필터를 통과하여 여과하였고, 상기 MVS를 위해 사용된 동일한 안정화제로 안정화시켰으며, 30㎖ PETG 병 또는 2.0㎖ 저온유리병으로 분액하였고, -60℃ 이하에 보관하였다.
특정한 방법에서, 벌크 바이러스 시드(BVS)를 융합성(confluent) Vero 세포의 복수의 세포 공장(각 6360cm2)에 0.001 MOI에 이르기 위해 희석된 WVS 90㎖를 감염시킴으로써 생산하였다. 상기 WVS 접종원의 희석액을 위해 사용된 배지는 혈청 없이 0.1% F-127™ 를 함유하였다. 1.5시간 흡착 후에, 세포를 PBS로 3회 세척하였고, 무혈청 DMEM 배지 800㎖을 각 세포 공장에 첨가하였으며, 상기 공장을 5(±0.5)% CO2에서 36(±1)℃에서 배양하였다. 4일 동안 배양 후, 배지의 작은 분액을 멸균율 시험용으로 수집하였다. 바이러스를 5 및 10pi일 사이에 수확하였고, 즉시 0.45㎛ 구멍 크기 필터를 통해 여과하여 투명화하였으며, 1L의 각 투명화된 바이러스 풀을 500㎖의 3x FTA 완충액(15% 트레할로스 최종 농도, 1.0% Pluronic® F-127™ 폴록사머 407, PBS 내의 0.1% 인간 알부민 USP, pH 7.4)의 첨가로 안정화시켰다. 상기 안정화된 바이러스를 1-L PETG 병에 나누었고, 다음 풀링(pooling) 및 품질 조절 시험을 위해 -60℃에 냉동 보관하였다. 105 PFU/㎖ 이상의 바이러스 역가 및 남아있는 DNA의 허용가능한 수준을 갖는 모든 안정화된 바이러스 수확물을 32℃에서 워터 배스에서 빠르게 해동하였고, 그 후 무균성으로 모았으며, 혼합하였다. 각 모은 1가 BVS를 라벨링된 PETG 용기로 나누었고, 추가로 사용할 때까지 -60℃ 이하에서 보관하였다.
제조 생산물 품질 관리
상기 MVS, WVS, 및 BVS 시드를 동일성, 멸균율 및 검출가능한 오염 인자에 대하여 시험하였다. 각 백신 저장물의 동일성을 DENVax 혈청형-특이적 프라이머로 RT-PCR하여 확인하였다. 상기 증폭된 cDNA 단편은 상기 각 4개의 DENVax 혈청형의 확인을 허용하기 위하여 상기 E/NS1 키메라 접합 위치(junction site)를 함유하였다. 각 시드를 4개의 모든 혈청형-특이적 RT-PCR 반응에서 시험하여 바이러스 동일성 및 비상동성 DENVax 혈청형으로 교차 오염이 없는 것을 확인하였다. 멸균율 시험을 USP 71(United States Pharmacopeia, section 71)에 따라 수행하였다. 마이코플라즈마 시험을 수행하였다.
그 후 바이러스 오염에 대한 시험관 내 및 생체 내 시험을 상기 시드의 제조 동안 투명화되지 않고, 안정화되지 않은 수집된 DENVax 수확물을 이용하여 모두 수행하였다. 수확된 감염성 배지를 36 ± 1℃에서 1시간 동안 DENV 토끼 폴리클로날 항혈청(Inviragen)으로 1차 중성화하여 상기 DENV를 불활성화시켰다. 시험관 내 시험을 위해, 상기 중성화된 시드를 3개의 표지 세포주인 MRC5, VERO 및 MA104로 25cm2 플라스크에서 접종하였다. 에코 바이러스(CPE 대조군) 또는 볼거리 바이러스(혈구흡착 대조군)를 양성 CPE 또는 혈구흡착 대조군으로 각각 이용하였다. 모든 세포를 총 14일 동안 CPE에 대하여 매일 모니터하였다. 14일의 종료일에서, 상기 배양 상등액을 제거하였고, 10㎖ 기니아 피그 적혈구(RBC) 용액(인산염 완충 식염수에 0.5% 기니아 피그 RBC 3㎖, 세포 성장 배지로 10㎖이 구성됨)으로 교체하였다. 그 후 상기 플라스크를 5 ± 3℃에서 30분 동안 배양하였고, 그 다음에 실온에서 30분 동안 배양하였다. 단층을 PBS로 세척하였고, 혈구흡착을 위한 RBC의 임의의 별모양 클럼프의 존재를 위해 10X 확대 하에 관찰하였다.
오염 인자에 대한 생체 내 시험을 이유 마우스, 이유 후(post-weaning) 마우스 및 기니아 피그에서 수행하였다. 이유 마우스에 복강내(ip) 주입을 통하여 상기 DENV-항혈청 중성화된 시드 시료의 0.1㎖ 또는 0.01㎖(각 투여군에서 10마리 마우스)을 접종하였다. 유사하게, 10마리 이유 후 마우스에 각 상기 시료의 0.5㎖ 또는 0.03㎖를 ip 접종하였다. 각 기니아 피그(5/군)를 5.0㎖로 ip 접종하였다. 이유 마우스를 접종 후 총 14일 동안 발병률 및 치사율에 대해 매일 관찰하였다. 이유 후 마우스를 28일 동안 관찰하였고, 기니아 피그를 접종 후 총 42일 동안 관찰하였다. 만일 상기 접종된 동물의 ≥80%가 상기 관찰 기간 동안 건강을 유지하는 경우, 상기 시험 조항은 허용 기준을 충족하였다.
오염물질에 대한 생체 내 시험도 또한 배아를 가진 계란에서 수행하였다. 모든 시료에 대하여, 10개의 배아를 가진 계란(9일 된)에 각 0.5㎖의 상기 DENV 항혈청-중성화된 시료를 요막액(allantoic fluid) 내로 접종하였고, 35℃에서 3일 동안 배양하였다. 이러한 10개의 알로부터 요막액을 수확하였고, 모았으며, 10개의 새로운 배아를 가진 알(10-11일 된; 0.5㎖/알)의 요막액으로 계대배양하였고, 35℃에서 추가로 3일 동안 배양하였다. 유사하게, 각 시료에 대하여, 10개의 배아를 가진 알(6-7일 된)에 각 알 당 0.5㎖(DENVax-2 1가 BVS) 또는 알 당 0.25㎖(DENVax-1, DENVax-3 및 DENVax-4 BVS)을 난황낭(yolk sac)으로 주입하여 접종하였으며, 35℃에서 9일 동안 배양하였다. 이러한 10개의 알로부터 난황낭을 수확하였고, 모았으며, 10% 현탁액을 10개의 새로운 배아를 가진 알(6-7일 된; 0.5㎖/알)의 난황낭으로 계대배양하였고, 35℃에서 추가로 9일 동안 배양하였다. 상기 요막액 내로 접종된 알(초기 및 계대배양 접종 모두)을 접종 3일 후에 생존력에 대하여 관찰하였다. 요막액의 풀(pool) 모두를 닭, 기니아 피그 및 인간 O형 적혈구를 이용하여 4℃ 및 25℃에서 혈구응집반응 활성을 시험하였다. 상기 난황낭 내로 접종된 알(초기 및 계대배양 접종 모두)을 접종 9일 후에 생존력에 대하여 관찰하였다.
바이러스 플라크 분석 및 면역포커스(immunofocus) 분석
바이러스 역가를 Vero 세포를 이용하여 플라크 분석 또는 면역포커스 분석으로 측정하였다. 플라크 분석을 이전에 기재된 바와 같이 6개 웰플레이트의 융합성 Vero 세포에서 이중 아가로스 오버레이에서 수행하였으며, 또한 그들을 사용하여 상기 DENVax 시드의 플라크 표현형을 평가하였다. 정확한 비교를 위하여, 모든 바이러스의 플라크 크기를 측정하였고, 동일한 시험에서 비교하였다. 9pi일에 뉴트럴 레드로 가시화한 후, 각 바이러스에 대해 10개까지의 잘 단리된 플라크를 특정하여 평균 플라크 크기를 계산하였다. wt DENV-1, -3, 및 -4의 경우에는 더 적은 플라크가 측정되었고, 그것의 더 큰 플라크 사이즈는 종종 10개의 잘 단리된 플라크의 측정을 허용하지 않았다.
4가 DENVax가 4개의 모든 DENV 혈청형을 함유하기 때문에, DENV 혈청형-특이적 면역포커스 분석을 개발하여 4가 제형물에서 각 DENVax 요소의 양을 평가하였다. 각 개별 DENVax MVS의 면역포커스 분석을 바이러스 적정 결과가 상기 두 분석 사이에서 비슷한 것을 보장하도록 상기 플라크 분석과 비교하였다. 상기 면역포커스 분석을 연속적으로 희석된 바이러스로 감염된 6웰 플레이트의 융합성 Vero 세포에서 수행하였다. 세포를 0.7% 높은 점착성 카르복시메틸 셀룰로오스(Sigma)를 함유하는 균형이 유지된 염분 배지(BSS/YE-LAH 배지)로 오버레이하였고, 7일 동안 37℃에서 5% CO2로 배양하였다. 오버레이를 제거한 후에, 세포 시트를 PBS로 3회 세척하였고, 30분 동안 -20℃에서 차가운 80% 아세톤으로 고정하였으며, PBS로 1회 세척하였고, PBS에 2.5%(w/v) 건조 탈지유, 0.5% Triton X-100, 0.05% Tween-20을 함유하는 차단 완충액으로 37℃에서 30분 동안 차단하였다. 차단된 세포를 희석된 DENV 혈청형-특이적 MAbs인 1F1(DENV-1), 3H5(DENV-2), 8A-1(DENV-3), 또는 1H10(DENV-4)로 37℃에서 1시간 동안 또는 4℃에서 하룻밤 동안 차단 완충액에서 배양하였고, 세척 완충액(PBS에 0.05% Tween-20)으로 3회 세척하였으며, 알카라인 포스파타제 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)가 결합된 순수-친화도 염소 항-마우스 IgG(Jackson Immuno Research Laboratories)로 37℃에서 45-60분 동안 배양하였다. 적절한 기질 전에 플레이트를 3회 세척하였고, 알카라인 포스파타제에 대한 1-Step NBT/BCIP plus suppressor(Pierce) 또는 HRP에 대한 Vector- VIP kit(Vector Labs)를 색 현상을 위해 첨가하였다. 초점이 완전히 현상될 때 색 현상을 물로 씻음으로써 중단하였다. 염색된 면역초점이 직접적으로 가시화되었으며 라이트 박스에서 계수되었다.
유전자 서열
상기 MVS 및 WVS의 전장 게놈을 서열분석하였다(하기 참조). 간단하게, 바이러스 RNA를 DENVax 시드로부터 QIAamp viral RNA kit(Qiagen)를 이용하여 추출하였으며, 상기 전체 게놈을 포함하는 오버래핑(overlapping) cDNA 단편을 Titan One Tube RT-PCR kit(Roche Applied Science, Inc.)를 이용하여 증폭하였다. 증폭된 cDNA 단편을 Bigdye(염료) Terminator v3.1 사이클 서열분석 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 정방향 및 역방향 프라이머 모두로 서열분석하기 전에 젤 정제하였다. 서열 반응물을 Bigdye(염료) XTerminator Purification 키트(Applied Biosystems)을 이용하여 깨끗히 하였고, DVBD/CDC에서 3130x1 유전자 분석기(Applied Biosystems)에서 작동시켰다. Lasergene SeqMan 소프트웨어(DNAStar, Inc)를 게놈 분석 및 비교에 이용하였다.
Taqman-기초한 미스매치 증폭 돌연변이 분석(TaqMAMA)
TaqMAMA는 상기 약독화의 5'NC-57 유전자자리에서 복귀 수준의 세밀한 평가를 허용하도록 개발된 민감하고 정량적인 단일 뉴클레오티드 다형성 분석으로서, 본 연구를 위해 추가로 최적화하였다. MVS 및 WVS로부터 추출된 바이러스 RNA를 wt 또는 백신 5TSTC-57 영역에 대하여 특이적인 프라이머/Taqman 프로브 세트 모두를 갖는 TaqMAMA로 분석하였다. DENV-2 wt 및 백신 서열을 검출하기 위해 사용된 정방향 프라이머는 각각 D2-41-GC 및 D2-40-TT였다. 각 정방향 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드는 각 바이러스에 대한 특이적 5'NCR-57 뉴클레오티드와 일치하는 반면에, 각 프라이머에서 상기 3'-말단 뉴클레오티드에 인접한 상기 뉴클레오티드는 미스매치 효과를 향상시키기 위하여 상기 DENV-2 바이러스 게놈 서열과 달랐다. wt 및 백신 세트 모두를 위한 역방향 프라이머인 CD-207, 및 상기 Taqman 프로브인 CD-169F는 동일하였다. 프라이머 및 프로브의 서열뿐만 아니라 사이클 조건은 이전에 기재하였다. 실시간 RT-PCR을 iQ5 또는 CFX-95 system(BioRad)으로 BioRad iScript RT-PCR(프로브용) 키트를 이용하여 바이러스 RNA 주형 5㎕, 각 프라이머 0.4 μM, 및 프로브 0.2 μM를 함유하는 25㎕ 반응에서 수행하였다. 각 wt- 및 백신-특이적 분석에 대한 3회 반응을 각 시료에 대하여 수행하였다. 게놈 카피 수를 각 바이러스 유전자형에 대하여 준비한 표준 곡선에 관하여 확인하였고, 여기서 상기 RNA 표준은 각 유전자형-특이적 cDNA의 nt1-2670을 함유하는 플라스미드로부터 유래한 전사물이었다. 게다가, 상기 분석의 특이성을 모든 실험에서 최소 교차-반응성을 보장하기 위하여 비상동성 유전자형 프라이머/프로브 세트로 각 RNA 표준을 시험함으로써 확인하였다. 상기 결과는 복귀를 나타내는 바이러스 게놈의 백분율로서 제공되었다. 이전에, 이 분석을 위한 유입 RNA 수준을 제한하였던 더 높은 교차-반응성 배경때문에, 원래의 검출 민감도는 약 0.1% 복귀였다(변별도(discrimination power)). 그 후, 상기 분석을 개선된 실시간 PCR 장비 및 반응 키트를 이용하여 추가로 최적화하였기 때문에, 상기 교차-반응 배경은 RNA 주형 유입의 매우 높은 수준(7-8 log10 카피)에서 상당히 감소하였다. 이 최적화는 0.01-0.07% 복귀에 이르기까지 검출 민감도의 현저한 개선을 야기하였다.
모기 C6/36 세포에서 바이러스 복제 및 포유류 Vero 세포에서 온도 민감성
4개의 DENVax MVS 저장물 및 wt DENV-1, -2, -3, 및 -4 바이러스의 복제 표현형을 C6/36 모기 세포(Aedes albopictus)에서 평가하였다. 6-웰 프레이트에서 성장시킨 C6/36 세포를 각 바이러스로 0.001 MOI에서 중복해서 감염시켰고, 2% FBS를 함유하는 DMEM 배지 4㎖/웰로 5% CO2 배양기에서 28℃에서 배양하였다. 상기 배양 상등액의 작은 분액을 6pi일에 각 바이러스에 대하여 수집하였고, 동일한 부피의 40% FBS를 함유하는 배지와 혼합하였으며, 바이러스 플라크 적정을 위한 준비까지 -80℃에서 보관하였다.
온도 민감성을 6웰 플레이트에서 Vero 세포의 39℃에서 바이러스 성장 대 37℃에서 성장을 비교함으로써 수행하였다. 세포를 0.001 MOI에서 37℃에서 각 바이러스로 4번 중복하여 감염시켰다. 바이러스 흡착 후에, 상기 감염된 배양물을 2% FBS를 함유하는 DMEM 배지 4㎖/웰로 2개의 분리된 5% CO2 배양기에서, 한 세트(중복된 플레이트)는 37℃에서 및 다른 세트는 39℃에서 배양하였다. 상기 배양 상등액의 분액(50㎕)을 5pi일에 수집하였고, 동이한 부피의 40% FBS를 함유하는 DMEM과 혼합하였으며, 바이러스 플라크 적정을 위한 준비까지 -80℃에서 보관하였다. 배양기 온도는 NIST-traceable factory-calibrated thermometers(-1 내지 51℃; ERTCO)로 보정하였다.
모기 감염, 전반 및 전염
본 연구를 위해 사용된 Aedes aegypti 모기는 태국 매솟(16' N, 33' E) 근처 마을로부터 2002년에 수립된 군집 유래였다. 유충으로부터 발생한 후, 성체 모기를 임의로 제공된 10% 수크로스 용액과 16:8(광:암) 광주기에서 28℃에서 유지하였다. 5일 내지 7일 된 암컷 모기를 감염성 혈액 식사 공급 또는 흉막 내(intrathoracic, IT) 접종을 위해 사용하였다. 새롭게 배양된 DENVax 및 wt DENV 분액을 수확시(임의의 냉동-해동 주기 없이) 즉시 사용하여 경구 감염을 위하여 하기에 나타낸 바와 같이 바이러스 혈액 식사를 만들었다. 남아있는 바이러스 상등액은 최종 농도 20%로 FBS로 보충하였으며, 분액을 추가로 바이러스 플라크 적정 및 IT 접종 실험을 위하여 -80℃에서 보관하였다. 이러한 실험을 위하여 상기 새롭게 제조된 DENVax 시드를 Vero 세포에서 전-마스터 시드로 증폭하였고, DENVax MVS 등가물로 간주하였다.
감염성 혈액 식사를 경구 감염 일자에 새로운 바이러스와 탈섬유소 닭 혈액(Colorado Serum Company)을 1:1 비율로 혼합함으로써 제조하였다. 모기를 하룻밤 동안 당-결핍시켰고, 그 후 상기 바이러스:혈액 혼합물을 Hemotek 막 공급 시스템(Discovery Workshops)를 이용하여 1시간 동안 제공하였다. 상기 혈액 식사의 50㎕ 분액을 바이러스 투여량의 역-적정을 위하여 -80℃에서 유지하였다. 완전히 혈액이 축적된 암컷을 차가운 마취 하에 골랐고, 임의로 제공된 10% 수크로스 용액을 갖는 상자에 두었다. 상자를 28℃에서 16:8h(광:암)의 광주기로 두었다. 14일 후에, 각 바이러스군으로부터 25-30마리 모기를 트리에틸아민(Flynap ®, Carolina Biological Supply Company)에 노출하여 마취시켰으며, 하나의 뒷다리를 제거하였고, 10% FBS 및 5% 페니실린/스트렙토마이신(각각 lOOU/㎖ 및 100㎍/㎖)을 갖는 0.5㎖ DMEM에 두었다. 마취된 모기의 입을 2.5% FBS 및 25% 수크로스 용액을 함유하는 모세관으로 넣음으로써 타액을 수집하였다. 모기를 적어도 15분 동안 침을 흘리도록 하였으며, 그 후 모세관 및 생체를 DMEM을 함유하는 분리된 관에 두었다. 모기 생체, 다리 및 타액을 그들을 감염성 바이러스에 대하여 적정하고, 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. IT 접종을 위하여, 모기를 차갑게-마취시켰고, 0.34㎕ 접종원으로 대략 50 pfu 바이러스로 접종하였다. 접종된 모기를 전술한 바와 같이 동일한 조건에서 7일 동안 유지하였다. 그 후 모기를 마취시켰고, 그들의 타액 및 생체를 전술한 바와 같이 수집하였다. 시료를 추가 처리할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
바이러스 적정을 위한 시료 처리를 위하여, 생체 및 다리 시료를 구리 코팅된 BBs(Crossman Corporation, NY)로 24회/초에서 4분 동안 믹서 밀을 이용하여 균질화하였고, 그 후 3,000 x g에서 3분 동안 원심분리하여 투명화시켰다. 타액 시료를 3,000 x g에서 3분 동안 원심분리하여 모세관으로부터 유체를 제거하였다. 상기 생체 및 다리 균질화물 및 타액 시료의 10배 희석을 플라크 분석으로 감염성 바이러스의 존재를 위해 시험하였다. 생체, 다리 및 타액으로부터 결과를 상기 감염, 전반 및 전염 비율을 각각 확인하는 것에 이용하였다.
마우스 신경병원성
지정 임신된 암컷 ICR 마우스를 Taconic Labs으로부터 구입하였고, 거의 정확한 한 배(litter) 새끼들의 출생 시간을 결정하기 위하여 매일 몇 차례씩 모니터하였다. 주어진 실험에서, 출생 후 대략 12-24시간, 바이러스(n=16)당 두 배(litter)의 8마리 새끼를 30-게이지 바늘을 이용하여 두개 내의(ic) 접종으로 20㎕의 희석제 내에 103 내지 104 pfu의 바이러스로 챌린지(challenge)하였다. 동물을 챌린지한 후에 적어도 32일 동안 적어도 매일 3회 모니터하였다. 제1 병 징후(거친 털, 휜 등, 체중 감소, 비정상적 움직임, 마비 또는 무기력)에서, 동물을 이소플루레인 가스로 치명적인 마취한 후, 그 후 경추 탈구하여 안락사시켰다. 감염 후 안락사 일자를 상기 동물에 대하여 "병/발병률에 대한 시간" 또는 "생존 시간"으로 나타내었다. 동물 실험을 DVBD/CDC IACUC-승인된 동물 프로토콜에 따라 수행하였다.
마스터 시드 바이러스의 유도
DENvax-1 마스터 바이러스 시드(MVS)
상기 키메라 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열 및 번역된 단백질의 추측 아미노산 서열이 본 발명에서 제공된다. prM-E 유전자(nt 457 내지 -2379, 밑줄친)의 대부분은 야생형(wt) DEN-1 16007 바이러스 특이적이다; 나머지 게놈은 DEN-2 PDK-53 바이러스 특이적이다. 모든 가공된 치환은 wt 바이러스(D1 16007 또는 D2 16681)와 다르며, 상기 MVS에서 검출된 추가 돌연변이(가공된 cDNA 클론으로부터 변경)가 표시되었다.
게놈 및 단백질에 포함된 치환:
D1(prM-E) 및 D2 백본 사이의 접합 위치:
a. MluI(nt 451-456): 가공된 사일런트 돌연변이, nt-453 A-to-G
b. NgoMIV(nt 2380-2385): 가공된 돌연변이, nt-2381/2382 TG-to-CC
(E-482 Val-to-Ala 변경을 야기함)
D2 PDK-53 바이러스 백본(wt D2 16681로부터 변경): 모든 굵은 글씨
a. 5'-비암호화 영역(NCR)-57(nt-57 C-to-T): 주요 약독화 유전자자리(붉은색)
b. NS1-53 Gly-to-Asp(nt-2579 G-to-A): 주요 약독화 유전자자리(붉은색)
c. NS2A-181 Leu-to-Phe(nt-4018 C-to-T)
d. NS3-250 Glu-to-Val(nt-5270 A-to-T): 주요 약독화 유전자자리(붉은색)
e. nt-5547(NS3 유전자) T-to-C 사일런트 돌연변이
f. NS4A-75 Gly-to-Ala(nt-6599 G-to-C)
*PDK-53의 nt-8571 C-to-T 사일런트 돌연변이는 상기 백신 바이러스에서 가공되지 않는다.
DEN-1 prM-E(wt D1 16007로부터 변경)
a. 천연 XbaⅠ 위치를 제거하기 위하여 가공된 nt-1575 T-to-C 사일런트 돌연변이
백신 시드에서 나타난 추가적인 치환(원래의 클론과 0.03% nt 다름)
a. NS2A-116 Ile-to-Leu(nt-3823 A-to-C, 굵은 글씨)
b. NS2B-92 Glu-to-Asp(nt-4407 A-to-T, 굵은 글씨)
c. nt-7311 A-to-G 사일런트 돌연변이(굵은 글씨)
Figure pat00004
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DENvax-2 마스터 바이러스 시드(MVS)
재조합 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열 및 번역된 단백질의 추측 아미노산 서열이 본 발명에서 제공된다. 상기 가공된 바이러스는 D2 PDK-53 바이러스에 기초한다. 모든 가공된 치환은 야생형 DEN-2 16681 바이러스(또한 PDK-53에 대한 상기 모 바이러스)와 다르며, 상기 MVS에서 검출된 추가 돌연변이(가공된 cDNA 클론으로부터 변경)가 표시되었다.
게놈 및 단백질에 포함된 치환:
*D2 PDK-53 바이러스 백본(wt D2 16681로부터 변경): 모두 굵은 글씨
a. 5'-비암호화 영역(NCR)-57(nt-57 C-to-T): 주요 약독화 유전자자리(붉은색)
b. prM-29 Asp-to-Val(nt-524 A-to-T)
c. nt-2055 C-to-T(E 유전자) 사일런트 돌연변이
d. NS1-53 Gly-to-Asp(nt-2579 G-to-A): 주요 약독화 유전자자리(붉은색)
e. NS2A-181 Leu-to-Phe(nt-4018 C-to-T)
f. NS3-250 Glu-to-Val(nt-5270 A-to-T): 주요 약독화 유전자자리(붉은색)
g. nt-5547(NS3 유전자) T-to-C 사일런트 돌연변이
h. NS4A-75 Gly-to-Ala(nt-6599 G-to-C)
* PDK-53의 nt-8571 C-to-T 사일런트 돌연변이는 상기 백신 바이러스에서 가공되지 않는다.
가공된 클론 마커(사일런트 돌연변이):
a. nt-900 T-to-C 사일런트 돌연변이: 감염성 클론 마커
백신 시드에서 나타난 추가 치환(원래의 클론과 0.02% nt 다름)
a. prM-52 Lys-to-Glu(nt-592 A-to-G), 굵은 글씨
b. NS5-412 Ile-to-Val(nt-8803 A-to-G), 굵은 글씨
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DENvax-3 Master 바이러스 시드(MVS)
상기 키메라 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열 및 번역된 단백질의 추측 아미노산 서열이 본 발명에서 제공된다. prM-E 유전자(nt- 457 내지 -2373, 밑줄친)의 대부분은 야생형(wt) DEN-3 16562 바이러스-특이적이었다; 나머지는 뉴클레오티드 서열은 DEN-2 PDK-53 바이러스-특이적이었다. DEN-3 바이러스의 E 단백질은 상기 DEN-2의 E 단백질보다 2개 적은 아미노산을 가졌다. 따라서, NgoMIV로부터 시작된 nt 위치는 상기 원래의 DEN-2 PDK-53 nt 위치보다 6nt 작다. 모든 가공된 치환은 wt 바이러스(DEN-3 16562 또는 DEN-2 16681)와 다르며, 추가의 돌연변이(가공된 cDNA 클론으로부터 변경)가 표시되었다.
게놈 및 단백질에 포함된 치환:
접합 위치:
a. MluI(nt 451-456): 가공된 사일런트 돌연변이, nt-453 A-to-G
b. NgoMIV(nt 2374-2379): 가공된 돌연변이, nt-2375/2376 TG-to-CC
(E-480 Val-to-Ala 변경을 야기함)
D2 PDK-53 바이러스 백본(wt D2 16681으로부터 변경): 굵은 글씨
a. 5'-비암호화 영역(NCR)-57(nt-57 C-to-T): 주요 약독화 유전자자리(붉은색)
b. NS1-53 Gly-to-Asp(nt-2573 G-to-A): 주요 약독화 유전자자리(붉은색)
c. NS2A-181 Leu-to-Phe(nt-4012 C-to-T)
d. NS3-250 Glu-to-Val(nt-5264 A-to-T): 주요 약독화 유전자자리(붉은색)
e. nt-5541(NS3 유전자) T-to-C 사일런트 돌연변이
f. NS4A-75 Gly-to-Ala(nt-6593 G-to-C)
* PDK-53의 nt-8565 C-to-T 사일런트 돌연변이는 상기 백신 바이러스에서 가공되지 않는다.
DEN-3 prM-E에서 가공된 돌연변이(wt D3 16562로부터 변경)
a. 가공된 nt-552 C-to-T 사일런트 돌연변이: 클론 마커
b. 배양에서 효율적인 복제를 위해 가공된 E-345 His-to-Leu(nt-1970 A-to-T)
백신 시드에서 나타난 추가적인 치환(원래의 클론과 0.02% nt 다름)
a. E-223 Thr-to-Ser 돌연변이(nt-1603 A-to-T, 굵은 글씨)
b. nt-7620 A-to-G 사일런트 돌연변이(굵은 글씨)
Figure pat00017
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DENvax-4 마스터 바이러스 시드(MVS)
상기 키메라 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열 및 번역된 단백질의 추측 아미노산 서열. 대부분 상기 prM-E 유전자(nt-457 내지 -2379, 밑줄친)는 야생형(wt) DEN-4 1036 바이러스-특이적이다; 나머지 뉴클레오티드 서열은 DEN-2 PDK-53 바이러스-특이적이다. 모든 가공된 치환은 wt 바이러스(DEN-3 16562 또는 DEN-2 16681)와 다르고, 추가 돌연변이(가공된 cDNA 클론으로부터 변경)가 표시된다.
게놈 및 단백질에 포함된 치환:
접합 위치:
a. MluI(nt 451-456): 가공된 사일런트 돌연변이, nt-453 A-to-G
b. NgoMIV(nt 2380-2385): 가공된 돌연변이, nt-2381/2382 TG-to-CC
(E-482 Val-to-Ala 변경을 야기함)
D2 PDK-53 바이러스 백본(wt D2 16681로부터 변경)
a. 5'-비암호화 영역(NCR)-57(nt-57 C-to-T): 주요 약독화 유전자자리(붉은색)
b. NS1-53 Gly-to-Asp(nt-2579 G-to-A): 주요 약독화 유전자자리(붉은색)
c. NS2A-181 Leu-to-Phe(nt-4018 C-to-T, 굵은 글씨)
d. NS3-250 Glu-to-Val(nt-5270 A-to-T): 주요 약독화 유전자자리(붉은색)
e. nt-5547(NS3 유전자) T-to-C 사일런트 돌연변이(굵은 글씨)
f. NS4A-75 Gly-to-Ala(nt-6599 G-to-C, 굵은 글씨)
* PDK-53의 nt-8571 C-to-T 사일런트 돌연변이는 상기 백신 바이러스에서 가공되지 않는다.
cDNA 클론에서 가공된 치환
a. 가공된 C-100 Arg-to-Ser(nt-396 A-to-C): 배양에서 바이러스 복제를 개선할 수 있다.
b. 가공된 nt-1401 A-to-G 사일런트 돌연변이
c. 가공된 E-364 Ala-to-Val(nt-2027 C-to-T): 배양에서 바이러스 복제를 개선할 수 있다.
d. 가공된 E-447 Met-to-Leu(nt-2275 A-to-C): 배양에서 바이러스 복제를 개선할 수 있다.
백신 시드에서 나타난 추가적인 치환(원래의 클론과 0.06% nt 다름)
a. nt-225(C 유전자) A-to-T 사일런트 돌연변이(굵은 글씨)
b. NS2A-66 Asp-to-Gly(nt-3674 A-to-G) 돌연변이(굵은 글씨)
c. NS2A-99 Lys-to-Lys/Arg 혼합(nt-3773 A-to-A/G 혼합, 굵은 글씨)
d. nt-5391 C-to-T(NS3 유전자) 사일런트 돌연변이(굵은 글씨)
e. NS4A-21 Ala-to-Val(nt-6437 C-to-T, 굵은 글씨)
f. nt-7026 T-to-C/T 혼합 사일런트 돌연변이(굵은 글씨)
g. nt-9750 A-to-C 사일런트 돌연변이(굵은 글씨)
Figure pat00025
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Figure pat00030
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Figure pat00032
<110> Inviragen, Inc. THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA AS REPRESENTED BY THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR DENGUE VIRUS CHIMERIC CONSTRUCTS IN VACCINES <130> 2022-FPA-1404D <150> 61/800,204 <151> 2013-03-15 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue virus serotype 1, BVS <400> 1 agttgttagt ctacgtggac cgacaaagac agattctttg agggagctaa gctcaatgta 60 gttctaacag ttttttaatt agagagcaga tctctgatga ataaccaacg gaaaaaggcg 120 aaaaacacgc ctttcaatat gctgaaacgc gagagaaacc gcgtgtcgac tgtgcaacag 180 ctgacaaaga gattctcact tggaatgctg cagggacgag gaccattaaa actgttcatg 240 gccctggtgg cgttccttcg tttcctaaca atcccaccaa cagcagggat attgaagaga 300 tggggaacaa ttaaaaaatc aaaagctatt aatgttttga gagggttcag gaaagagatt 360 ggaaggatgc tgaacatctt gaataggaga cgcagatctg caggcatgat cattatgctg 420 attccaacag tgatggcgtt ccatttaacc acgcgtgggg gagagccgca tatgatagtt 480 agcaagcagg aaagaggaaa gtcacttttg ttcaagacct ctgcaggtgt caacatgtgc 540 accctcattg cgatggattt gggagagttg tgtgaggaca cgatgaccta caaatgcccc 600 cggatcactg aggcggaacc agatgacgtt gactgttggt gcaatgccac ggacacatgg 660 gtgacctatg gaacgtgctc tcaaactggc gaacaccgac gagacaaacg ttccgtcgca 720 ttggccccac acgtggggct tggcctagaa acaagagccg aaacgtggat gtcctctgaa 780 ggtgcttgga aacagataca aaaagtagag acttgggctc tgagacatcc aggattcacg 840 gtgatagccc tttttctagc acatgccata ggaacatcca tcacccagaa agggatcatt 900 ttcattttgc tgatgctggt aacaccatct atggccatgc gatgcgtggg aataggcaac 960 agagacttcg tggaaggact gtcaggagca acatgggtgg atgtggtact ggagcatgga 1020 agttgcgtca ccaccatggc aaaaaacaaa ccaacactgg acattgaact cttgaagacg 1080 gaggtcacaa accctgcagt tctgcgtaaa ttgtgcattg aagctaaaat atcaaacacc 1140 accaccgatt cgagatgtcc aacacaagga gaagccacac tggtggaaga acaagacgcg 1200 aactttgtgt gccgacgaac gttcgtggac agaggctggg gcaatggctg tgggctattc 1260 ggaaaaggta gtctaataac gtgtgccaag tttaagtgtg tgacaaaact agaaggaaag 1320 atagttcaat atgaaaacct aaaatattca gtgatagtca ccgtccacac tggagatcag 1380 caccaggtgg gaaatgagac tacagaacat ggaacaactg caaccataac acctcaagct 1440 cctacgtcgg aaatacagct gaccgactac ggaaccctta cattagattg ttcacctagg 1500 acagggctag attttaacga gatggtgttg ctgacaatga aagaaagatc atggcttgtc 1560 cacaaacaat ggttcctaga cttaccactg ccttggacct ctggggcttc aacatcccaa 1620 gagacttgga acagacaaga tttactggtc acatttaaga cagctcatgc aaagaagcag 1680 gaagtagtcg tactaggatc acaagaagga gcaatgcaca ctgcgctgac tggagcgaca 1740 gaaatccaaa cgtcaggaac gacaacaatt ttcgcaggac acctaaaatg cagactaaaa 1800 atggacaaac taactttaaa agggatgtca tatgtgatgt gcacaggctc attcaagtta 1860 gagaaagaag tggctgagac ccagcatgga actgttctgg tgcaggttaa atatgaagga 1920 acagacgcac catgcaagat tcccttttcg acccaagatg agaaaggagc aacccagaat 1980 gggagattaa taacagccaa ccccatagtc actgacaaag aaaaaccagt caatattgag 2040 gcagaaccac cctttggtga gagctacatc gtggtaggag caggtgaaaa agctttgaaa 2100 ctaagctggt tcaagaaagg aagcagcata gggaaaatgt ttgaagcaac tgcccgagga 2160 gcacgaagga tggccattct gggagacacc gcatgggact tcggttctat aggaggagtg 2220 ttcacgtcta tgggaaaact ggtacaccag gtttttggaa ctgcatatgg agttttgttt 2280 agcggagttt cttggaccat gaaaatagga atagggattc tgctgacatg gctaggatta 2340 aattcaagga acacgtccct ttcgatgatg tgcatcgcag ccgccattgt gacactgtat 2400 ttgggagtca tggtgcaggc cgatagtggt tgcgttgtga gctggaaaaa caaagaactg 2460 aaatgtggca gtgggatttt catcacagac aacgtgcaca catggacaga acaatacaag 2520 ttccaaccag aatccccttc aaaactagct tcagctatcc agaaagccca tgaagaggac 2580 atttgtggaa tccgctcagt aacaagactg gagaatctga tgtggaaaca aataacacca 2640 gaattgaatc acattctatc agaaaatgag gtgaagttaa ctattatgac aggagacatc 2700 aaaggaatca tgcaggcagg aaaacgatct ctgcggcctc agcccactga gctgaagtat 2760 tcatggaaaa catggggcaa agcaaaaatg ctctctacag agtctcataa ccagaccttt 2820 ctcattgatg gccccgaaac agcagaatgc cccaacacaa atagagcttg gaattcgttg 2880 gaagttgaag actatggctt tggagtattc accaccaata tatggctaaa attgaaagaa 2940 aaacaggatg tattctgcga ctcaaaactc atgtcagcgg ccataaaaga caacagagcc 3000 gtccatgccg atatgggtta ttggatagaa agtgcactca atgacacatg gaagatagag 3060 aaagcctctt tcattgaagt taaaaactgc cactggccaa aatcacacac cctctggagc 3120 aatggagtgc tagaaagtga gatgataatt ccaaagaatc tcgctggacc agtgtctcaa 3180 cacaactata gaccaggcta ccatacacaa ataacaggac catggcatct aggtaagctt 3240 gagatggact ttgatttctg tgatggaaca acagtggtag tgactgagga ctgcggaaat 3300 agaggaccct ctttgagaac aaccactgcc tctggaaaac tcataacaga atggtgctgc 3360 cgatcttgca cattaccacc gctaagatac agaggtgagg atgggtgctg gtacgggatg 3420 gaaatcagac cattgaagga gaaagaagag aatttggtca actccttggt cacagctgga 3480 catgggcagg tcgacaactt ttcactagga gtcttgggaa tggcattgtt cctggaggaa 3540 atgcttagga cccgagtagg aacgaaacat gcaatactac tagttgcagt ttcttttgtg 3600 acattgatca cagggaacat gtcctttaga gacctgggaa gagtgatggt tatggtaggc 3660 gccactatga cggatgacat aggtatgggc gtgacttatc ttgccctact agcagccttc 3720 aaagtcagac caacttttgc agctggacta ctcttgagaa agctgacctc caaggaattg 3780 atgatgacta ctataggaat tgtactcctc tcccagagca ccctaccaga gaccattctt 3840 gagttgactg atgcgttagc cttaggcatg atggtcctca aaatggtgag aaatatggaa 3900 aagtatcaat tggcagtgac tatcatggct atcttgtgcg tcccaaacgc agtgatatta 3960 caaaacgcat ggaaagtgag ttgcacaata ttggcagtgg tgtccgtttc cccactgttc 4020 ttaacatcct cacagcaaaa aacagattgg ataccattag cattgacgat caaaggtctc 4080 aatccaacag ctatttttct aacaaccctc tcaagaacca gcaagaaaag gagctggcca 4140 ttaaatgagg ctatcatggc agtcgggatg gtgagcattt tagccagttc tctcctaaaa 4200 aatgatattc ccatgacagg accattagtg gctggagggc tcctcactgt gtgctacgtg 4260 ctcactggac gatcggccga tttggaactg gagagagcag ccgatgtcaa atgggaagac 4320 caggcagaga tatcaggaag cagtccaatc ctgtcaataa caatatcaga agatggtagc 4380 atgtcgataa aaaatgaaga ggaagatcaa acactgacca tactcattag aacaggattg 4440 ctggtgatct caggactttt tcctgtatca ataccaatca cggcagcagc atggtacctg 4500 tgggaagtga agaaacaacg ggccggagta ttgtgggatg ttccttcacc cccacccatg 4560 ggaaaggctg aactggaaga tggagcctat agaattaagc aaaaagggat tcttggatat 4620 tcccagatcg gagccggagt ttacaaagaa ggaacattcc atacaatgtg gcatgtcaca 4680 cgtggcgctg ttctaatgca taaaggaaag aggattgaac catcatgggc ggacgtcaag 4740 aaagacctaa tatcatatgg aggaggctgg aagttagaag gagaatggaa ggaaggagaa 4800 gaagtccagg tattggcact ggagcctgga aaaaatccaa gagccgtcca aacgaaacct 4860 ggtcttttca aaaccaacgc cggaacaata ggtgctgtat ctctggactt ttctcctgga 4920 acgtcaggat ctccaattat cgacaaaaaa ggaaaagttg tgggtcttta tggtaatggt 4980 gttgttacaa ggagtggagc atatgtgagt gctatagccc agactgaaaa aagcattgaa 5040 gacaacccag agatcgaaga tgacattttc cgaaagagaa gactgaccat catggacctc 5100 cacccaggag cgggaaagac gaagagatac cttccggcca tagtcagaga agctataaaa 5160 cggggtttga gaacattaat cttggccccc actagagttg tggcagctga aatggaggaa 5220 gcccttagag gacttccaat aagataccag accccagcca tcagagctgt gcacaccggg 5280 cgggagattg tggacctaat gtgtcatgcc acatttacca tgaggctgct atcaccagtt 5340 agagtgccaa actacaacct gattatcatg gacgaagccc atttcacaga cccagcaagt 5400 atagcagcta gaggatacat ctcaactcga gtggagatgg gtgaggcagc tgggattttt 5460 atgacagcca ctcccccggg aagcagagac ccatttcctc agagcaatgc accaatcata 5520 gatgaagaaa gagaaatccc tgaacgctcg tggaattccg gacatgaatg ggtcacggat 5580 tttaaaggga agactgtttg gttcgttcca agtataaaag caggaaatga tatagcagct 5640 tgcctgagga aaaatggaaa gaaagtgata caactcagta ggaagacctt tgattctgag 5700 tatgtcaaga ctagaaccaa tgattgggac ttcgtggtta caactgacat ttcagaaatg 5760 ggtgccaatt tcaaggctga gagggttata gaccccagac gctgcatgaa accagtcata 5820 ctaacagatg gtgaagagcg ggtgattctg gcaggaccta tgccagtgac ccactctagt 5880 gcagcacaaa gaagagggag aataggaaga aatccaaaaa atgagaatga ccagtacata 5940 tacatggggg aacctctgga aaatgatgaa gactgtgcac actggaaaga agctaaaatg 6000 ctcctagata acatcaacac gccagaagga atcattccta gcatgttcga accagagcgt 6060 gaaaaggtgg atgccattga tggcgaatac cgcttgagag gagaagcaag gaaaaccttt 6120 gtagacttaa tgagaagagg agacctacca gtctggttgg cctacagagt ggcagctgaa 6180 ggcatcaact acgcagacag aaggtggtgt tttgatggag tcaagaacaa ccaaatccta 6240 gaagaaaacg tggaagttga aatctggaca aaagaagggg aaaggaagaa attgaaaccc 6300 agatggttgg atgctaggat ctattctgac ccactggcgc taaaagaatt taaggaattt 6360 gcagccggaa gaaagtctct gaccctgaac ctaatcacag aaatgggtag gctcccaacc 6420 ttcatgactc agaaggcaag agacgcactg gacaacttag cagtgctgca cacggctgag 6480 gcaggtggaa gggcgtacaa ccatgctctc agtgaactgc cggagaccct ggagacattg 6540 cttttactga cacttctggc tacagtcacg ggagggatct ttttattctt gatgagcgca 6600 aggggcatag ggaagatgac cctgggaatg tgctgcataa tcacggctag catcctccta 6660 tggtacgcac aaatacagcc acactggata gcagcttcaa taatactgga gttttttctc 6720 atagttttgc ttattccaga acctgaaaaa cagagaacac cccaagacaa ccaactgacc 6780 tacgttgtca tagccatcct cacagtggtg gccgcaacca tggcaaacga gatgggtttc 6840 ctagaaaaaa cgaagaaaga tctcggattg ggaagcattg caacccagca acccgagagc 6900 aacatcctgg acatagatct acgtcctgca tcagcatgga cgctgtatgc cgtggccaca 6960 acatttgtta caccaatgtt gagacatagc attgaaaatt cctcagtgaa tgtgtcccta 7020 acagctatag ccaaccaagc cacagtgtta atgggtctcg ggaaaggatg gccattgtca 7080 aagatggaca tcggagttcc ccttctcgcc attggatgct actcacaagt caaccccata 7140 actctcatag cagctctttt cttattggta gcacattatg ccatcatagg gccaggactc 7200 caagcaaaag caaccagaga agctcagaaa agagcagcgg cgggcatcat gaaaaaccca 7260 actgtcgatg gaataacagt gattgaccta gatccaatac cttatgatcc gaagtttgaa 7320 aagcagttgg gacaagtaat gctcctagtc ctctgcgtga ctcaagtatt gatgatgagg 7380 actacatggg ctctgtgtga ggctttaacc ttagctaccg ggcccatctc cacattgtgg 7440 gaaggaaatc cagggaggtt ttggaacact accattgcgg tgtcaatggc taacattttt 7500 agagggagtt acttggccgg agctggactt ctcttttcta ttatgaagaa cacaaccaac 7560 acaagaaggg gaactggcaa cataggagag acgcttggag agaaatggaa aagccgattg 7620 aacgcattgg gaaaaagtga attccagatc tacaagaaaa gtggaatcca ggaagtggat 7680 agaaccttag caaaagaagg cattaaaaga ggagaaacgg accatcacgc tgtgtcgcga 7740 ggctcagcaa aactgagatg gttcgttgag agaaacatgg tcacaccaga agggaaagta 7800 gtggacctcg gttgtggcag aggaggctgg tcatactatt gtggaggact aaagaatgta 7860 agagaagtca aaggcctaac aaaaggagga ccaggacacg aagaacccat ccccatgtca 7920 acatatgggt ggaatctagt gcgtcttcaa agtggagttg acgttttctt catcccgcca 7980 gaaaagtgtg acacattatt gtgtgacata ggggagtcat caccaaatcc cacagtggaa 8040 gcaggacgaa cactcagagt ccttaactta gtagaaaatt ggttgaacaa caacactcaa 8100 ttttgcataa aggttctcaa cccatatatg ccctcagtca tagaaaaaat ggaagcacta 8160 caaaggaaat atggaggagc cttagtgagg aatccactct cacgaaactc cacacatgag 8220 atgtactggg tatccaatgc ttccgggaac atagtgtcat cagtgaacat gatttcaagg 8280 atgttgatca acagatttac aatgagatac aagaaagcca cttacgagcc ggatgttgac 8340 ctcggaagcg gaacccgtaa catcgggatt gaaagtgaga taccaaacct agatataatt 8400 gggaaaagaa tagaaaaaat aaagcaagag catgaaacat catggcacta tgaccaagac 8460 cacccataca aaacgtgggc ataccatggt agctatgaaa caaaacagac tggatcagca 8520 tcatccatgg tcaacggagt ggtcaggctg ctgacaaaac cttgggacgt cgtccccatg 8580 gtgacacaga tggcaatgac agacacgact ccatttggac aacagcgcgt ttttaaagag 8640 aaagtggaca cgagaaccca agaaccgaaa gaaggcacga agaaactaat gaaaataaca 8700 gcagagtggc tttggaaaga attagggaag aaaaagacac ccaggatgtg caccagagaa 8760 gaattcacaa gaaaggtgag aagcaatgca gccttggggg ccatattcac tgatgagaac 8820 aagtggaagt cggcacgtga ggctgttgaa gatagtaggt tttgggagct ggttgacaag 8880 gaaaggaatc tccatcttga aggaaagtgt gaaacatgtg tgtacaacat gatgggaaaa 8940 agagagaaga agctagggga attcggcaag gcaaaaggca gcagagccat atggtacatg 9000 tggcttggag cacgcttctt agagtttgaa gccctaggat tcttaaatga agatcactgg 9060 ttctccagag agaactccct gagtggagtg gaaggagaag ggctgcacaa gctaggttac 9120 attctaagag acgtgagcaa gaaagaggga ggagcaatgt atgccgatga caccgcagga 9180 tgggatacaa gaatcacact agaagaccta aaaaatgaag aaatggtaac aaaccacatg 9240 gaaggagaac acaagaaact agccgaggcc attttcaaac taacgtacca aaacaaggtg 9300 gtgcgtgtgc aaagaccaac accaagaggc acagtaatgg acatcatatc gagaagagac 9360 caaagaggta gtggacaagt tggcacctat ggactcaata ctttcaccaa tatggaagcc 9420 caactaatca gacagatgga gggagaagga gtctttaaaa gcattcagca cctaacaatc 9480 acagaagaaa tcgctgtgca aaactggtta gcaagagtgg ggcgcgaaag gttatcaaga 9540 atggccatca gtggagatga ttgtgttgtg aaacctttag atgacaggtt cgcaagcgct 9600 ttaacagctc taaatgacat gggaaagatt aggaaagaca tacaacaatg ggaaccttca 9660 agaggatgga atgattggac acaagtgccc ttctgttcac accatttcca tgagttaatc 9720 atgaaagacg gtcgcgtact cgttgttcca tgtagaaacc aagatgaact gattggcaga 9780 gcccgaatct cccaaggagc agggtggtct ttgcgggaga cggcctgttt ggggaagtct 9840 tacgcccaaa tgtggagctt gatgtacttc cacagacgcg acctcaggct ggcggcaaat 9900 gctatttgct cggcagtacc atcacattgg gttccaacaa gtcgaacaac ctggtccata 9960 catgctaaac atgaatggat gacaacggaa gacatgctga cagtctggaa cagggtgtgg 10020 attcaagaaa acccatggat ggaagacaaa actccagtgg aatcatggga ggaaatccca 10080 tacttgggga aaagagaaga ccaatggtgc ggctcattga ttgggttaac aagcagggcc 10140 acctgggcaa agaacatcca agcagcaata aatcaagtta gatcccttat aggcaatgaa 10200 gaatacacag attacatgcc atccatgaaa agattcagaa gagaagagga agaagcagga 10260 gttctgtggt agaaagcaaa actaacatga aacaaggcta gaagtcaggt cggattaagc 10320 catagtacgg aaaaaactat gctacctgtg agccccgtcc aaggacgtta aaagaagtca 10380 ggccatcata aatgccatag cttgagtaaa ctatgcagcc tgtagctcca cctgagaagg 10440 tgtaaaaaat ccgggaggcc acaaaccatg gaagctgtac gcatggcgta gtggactagc 10500 ggttagagga gacccctccc ttacaaatcg cagcaacaat gggggcccaa ggcgagatga 10560 agctgtagtc tcgctggaag gactagaggt tagaggagac ccccccgaaa caaaaaacag 10620 catattgacg ctgggaaaga ccagagatcc tgctgtctcc tcagcatcat tccaggcaca 10680 gaacgccaga aaatggaatg gtgctgttga atcaacaggt tct 10723 <210> 2 <211> 3464 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue virus serotype 1, BVS <400> 2 Met Asn Asn Gln Arg Lys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Phe Asn Met Leu 1 5 10 15 Lys Arg Glu Arg Asn Arg Val Ser Thr Val Gln Gln Leu Thr Lys Arg 20 25 30 Phe Ser Leu Gly Met Leu Gln Gly Arg Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met 35 40 45 Ala Leu Val Ala Phe Leu Arg Phe Leu Thr Ile Pro Pro Thr Ala Gly 50 55 60 Ile Leu Lys Arg Trp Gly Thr Ile Lys Lys Ser Lys Ala Ile Asn Val 65 70 75 80 Leu Arg Gly Phe Arg Lys Glu Ile Gly Arg Met Leu Asn Ile Leu Asn 85 90 95 Arg Arg Arg Arg Ser Ala Gly Met Ile Ile Met Leu Ile Pro Thr Val 100 105 110 Met Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Gly Gly Glu Pro His Met Ile Val 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Arg Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Ser Ala Gly 130 135 140 Val Asn Met Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys 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agtggggttt catggactat gaaaatcctc ataggagtca ttatcacatg gataggaatg 2340 aattcacgca gcacctcact gtctgtgaca ctagtattgg tgggaattgt gacactgtat 2400 ttgggagtca tggtgcaggc cgatagtggt tgcgttgtga gctggaaaaa caaagaactg 2460 aaatgtggca gtgggatttt catcacagac aacgtgcaca catggacaga acaatacaag 2520 ttccaaccag aatccccttc aaaactagct tcagctatcc agaaagccca tgaagaggac 2580 atttgtggaa tccgctcagt aacaagactg gagaatctga tgtggaaaca aataacacca 2640 gaattgaatc acattctatc agaaaatgag gtgaagttaa ctattatgac aggagacatc 2700 aaaggaatca tgcaggcagg aaaacgatct ctgcggcctc agcccactga gctgaagtat 2760 tcatggaaaa catggggcaa agcaaaaatg ctctctacag agtctcataa ccagaccttt 2820 ctcattgatg gccccgaaac agcagaatgc cccaacacaa atagagcttg gaattcgttg 2880 gaagttgaag actatggctt tggagtattc accaccaata tatggctaaa attgaaagaa 2940 aaacaggatg tattctgcga ctcaaaactc atgtcagcgg ccataaaaga caacagagcc 3000 gtccatgccg atatgggtta ttggatagaa agtgcactca atgacacatg gaagatagag 3060 aaagcctctt tcattgaagt taaaaactgc cactggccaa aatcacacac cctctggagc 3120 aatggagtgc tagaaagtga gatgataatt ccaaagaatc tcgctggacc agtgtctcaa 3180 cacaactata gaccaggcta ccatacacaa ataacaggac catggcatct aggtaagctt 3240 gagatggact ttgatttctg tgatggaaca acagtggtag tgactgagga ctgcggaaat 3300 agaggaccct ctttgagaac aaccactgcc tctggaaaac tcataacaga atggtgctgc 3360 cgatcttgca cattaccacc gctaagatac agaggtgagg atgggtgctg gtacgggatg 3420 gaaatcagac cattgaagga gaaagaagag aatttggtca actccttggt cacagctgga 3480 catgggcagg tcgacaactt ttcactagga gtcttgggaa tggcattgtt cctggaggaa 3540 atgcttagga cccgagtagg aacgaaacat gcaatactac tagttgcagt ttcttttgtg 3600 acattgatca cagggaacat gtcctttaga gacctgggaa gagtgatggt tatggtaggc 3660 gccactatga cggatgacat aggtatgggc gtgacttatc ttgccctact agcagccttc 3720 aaagtcagac caacttttgc agctggacta ctcttgagaa agctgacctc caaggaattg 3780 atgatgacta ctataggaat tgtactcctc tcccagagca ccataccaga gaccattctt 3840 gagttgactg atgcgttagc cttaggcatg atggtcctca aaatggtgag aaatatggaa 3900 aagtatcaat tggcagtgac tatcatggct atcttgtgcg tcccaaacgc agtgatatta 3960 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gaagtccagg tattggcact ggagcctgga aaaaatccaa gagccgtcca aacgaaacct 4860 ggtcttttca aaaccaacgc cggaacaata ggtgctgtat ctctggactt ttctcctgga 4920 acgtcaggat ctccaattat cgacaaaaaa ggaaaagttg tgggtcttta tggtaatggt 4980 gttgttacaa ggagtggagc atatgtgagt gctatagccc agactgaaaa aagcattgaa 5040 gacaacccag agatcgaaga tgacattttc cgaaagagaa gactgaccat catggacctc 5100 cacccaggag cgggaaagac gaagagatac cttccggcca tagtcagaga agctataaaa 5160 cggggtttga gaacattaat cttggccccc actagagttg tggcagctga aatggaggaa 5220 gcccttagag gacttccaat aagataccag accccagcca tcagagctgt gcacaccggg 5280 cgggagattg tggacctaat gtgtcatgcc acatttacca tgaggctgct atcaccagtt 5340 agagtgccaa actacaacct gattatcatg gacgaagccc atttcacaga cccagcaagt 5400 atagcagcta gaggatacat ctcaactcga gtggagatgg gtgaggcagc tgggattttt 5460 atgacagcca ctcccccggg aagcagagac ccatttcctc agagcaatgc accaatcata 5520 gatgaagaaa gagaaatccc tgaacgctcg tggaattccg gacatgaatg ggtcacggat 5580 tttaaaggga agactgtttg gttcgttcca agtataaaag caggaaatga tatagcagct 5640 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Thr Ser Arg Glu Leu Met Met Thr Thr 1220 1225 1230 Ile Gly Ile Val Leu Leu Ser Gln Ser Thr Ile Pro Glu Thr Ile Leu 1235 1240 1245 Glu Leu Thr Asp Ala Leu Ala Leu Gly Met Met Val Leu Lys Met Val 1250 1255 1260 Arg Asn Met Glu Lys Tyr Gln Leu Ala Val Thr Ile Met Ala Ile Leu 1265 1270 1275 1280 Cys Val Pro Asn Ala Val Ile Leu Gln Asn Ala Trp Lys Val Ser Cys 1285 1290 1295 Thr Ile Leu Ala Val Val Ser Val Ser Pro Leu Phe Leu Thr Ser Ser 1300 1305 1310 Gln Gln Lys Thr Asp Trp Ile Pro Leu Ala Leu Thr Ile Lys Gly Leu 1315 1320 1325 Asn Pro Thr Ala Ile Phe Leu Thr Thr Leu Ser Arg Thr Ser Lys Lys 1330 1335 1340 Arg Ser Trp Pro Leu Asn Glu Ala Ile Met Ala Val Gly Met Val Ser 1345 1350 1355 1360 Ile Leu Ala Ser Ser Leu Leu Lys Asn Asp Ile Pro Met Thr Gly Pro 1365 1370 1375 Leu Val Ala Gly Gly Leu Leu Thr Val Cys Tyr Val Leu Thr Gly Arg 1380 1385 1390 Ser Ala Asp Leu Glu Leu Glu Arg Ala Ala Asp Val Lys Trp Glu Asp 1395 1400 1405 Gln Ala Glu Ile Ser Gly Ser Ser Pro Ile Leu Ser Ile Thr Ile Ser 1410 1415 1420 Glu Asp Gly Ser Met Ser Ile Lys Asn Glu Glu Glu Glu Gln Thr Leu 1425 1430 1435 1440 Thr Ile Leu Ile Arg Thr Gly Leu Leu Val Ile Ser Gly Leu Phe Pro 1445 1450 1455 Val Ser Ile Pro Ile Thr Ala Ala Ala Trp Tyr Leu Trp Glu Val Lys 1460 1465 1470 Lys Gln Arg Ala Gly Val Leu Trp Asp Val Pro Ser Pro Pro Pro Met 1475 1480 1485 Gly Lys Ala Glu Leu Glu Asp Gly Ala Tyr Arg Ile Lys Gln Lys Gly 1490 1495 1500 Ile Leu Gly Tyr Ser Gln Ile Gly Ala Gly Val Tyr Lys Glu Gly Thr 1505 1510 1515 1520 Phe His Thr Met Trp His Val Thr Arg Gly Ala Val Leu Met His Lys 1525 1530 1535 Gly Lys Arg Ile Glu Pro Ser Trp Ala Asp Val Lys Lys Asp Leu Ile 1540 1545 1550 Ser Tyr Gly Gly Gly Trp Lys Leu Glu Gly Glu Trp Lys Glu Gly Glu 1555 1560 1565 Glu Val Gln Val Leu Ala Leu Glu Pro Gly Lys Asn Pro Arg Ala Val 1570 1575 1580 Gln Thr Lys Pro Gly Leu Phe Lys Thr Asn Ala Gly Thr Ile Gly Ala 1585 1590 1595 1600 Val Ser Leu Asp Phe Ser Pro Gly Thr Ser Gly Ser Pro Ile Ile Asp 1605 1610 1615 Lys Lys Gly Lys Val Val Gly Leu Tyr Gly Asn Gly Val Val Thr Arg 1620 1625 1630 Ser Gly Ala Tyr Val Ser Ala Ile Ala Gln Thr Glu Lys Ser Ile Glu 1635 1640 1645 Asp Asn Pro Glu Ile Glu Asp Asp Ile Phe Arg Lys Arg Arg Leu Thr 1650 1655 1660 Ile Met Asp Leu His Pro Gly Ala Gly Lys Thr Lys Arg Tyr Leu Pro 1665 1670 1675 1680 Ala Ile Val Arg Glu Ala Ile Lys Arg Gly Leu Arg Thr Leu Ile Leu 1685 1690 1695 Ala Pro Thr Arg Val Val Ala Ala Glu Met Glu Glu Ala Leu Arg Gly 1700 1705 1710 Leu Pro Ile Arg Tyr Gln Thr Pro Ala Ile Arg Ala Val His Thr Gly 1715 1720 1725 Arg Glu Ile Val Asp Leu Met Cys His Ala Thr Phe Thr Met Arg Leu 1730 1735 1740 Leu Ser Pro Val Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu Ile Ile Met Asp Glu 1745 1750 1755 1760 Ala His Phe Thr Asp Pro Ala Ser Ile Ala Ala Arg Gly Tyr Ile Ser 1765 1770 1775 Thr Arg Val Glu Met Gly Glu Ala Ala Gly Ile Phe Met Thr Ala Thr 1780 1785 1790 Pro Pro Gly Ser Arg Asp Pro Phe Pro Gln Ser Asn Ala Pro Ile Ile 1795 1800 1805 Asp Glu Glu Arg Glu Ile Pro Glu Arg Ser Trp Asn Ser Gly His Glu 1810 1815 1820 Trp Val Thr Asp Phe Lys Gly Lys Thr Val Trp Phe Val Pro Ser Ile 1825 1830 1835 1840 Lys Ala Gly Asn Asp Ile Ala Ala Cys Leu Arg Lys Asn Gly Lys Lys 1845 1850 1855 Val Ile Gln Leu Ser Arg Lys Thr Phe Asp Ser Glu Tyr Val Lys Thr 1860 1865 1870 Arg Thr Asn Asp Trp Asp Phe Val Val Thr Thr Asp Ile Ser Glu Met 1875 1880 1885 Gly Ala Asn Phe Lys Ala Glu Arg Val Ile Asp Pro Arg Arg Cys Met 1890 1895 1900 Lys Pro Val Ile Leu Thr Asp Gly Glu Glu Arg Val Ile Leu Ala Gly 1905 1910 1915 1920 Pro Met Pro Val Thr His Ser Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile 1925 1930 1935 Gly Arg Asn Pro Lys Asn Glu Asn Asp Gln Tyr Ile Tyr Met Gly Glu 1940 1945 1950 Pro Leu Glu Asn Asp Glu Asp Cys Ala His Trp Lys Glu Ala Lys Met 1955 1960 1965 Leu Leu Asp Asn Ile Asn Thr Pro Glu Gly Ile Ile Pro Ser Met Phe 1970 1975 1980 Glu Pro Glu Arg Glu Lys Val Asp Ala Ile Asp Gly Glu Tyr Arg Leu 1985 1990 1995 2000 Arg Gly Glu Ala Arg Lys Thr Phe Val Asp Leu Met Arg Arg Gly Asp 2005 2010 2015 Leu Pro Val Trp Leu Ala Tyr Arg Val Ala Ala Glu Gly Ile Asn Tyr 2020 2025 2030 Ala Asp Arg Arg Trp Cys Phe Asp Gly Val Lys Asn Asn Gln Ile Leu 2035 2040 2045 Glu Glu Asn Val Glu Val Glu Ile Trp Thr Lys Glu Gly Glu Arg Lys 2050 2055 2060 Lys Leu Lys Pro Arg Trp Leu Asp Ala Arg Ile Tyr Ser Asp Pro Leu 2065 2070 2075 2080 Ala Leu Lys Glu Phe Lys Glu Phe Ala Ala Gly Arg Lys Ser Leu Thr 2085 2090 2095 Leu Asn Leu Ile Thr Glu Met Gly Arg Leu Pro Thr Phe Met Thr Gln 2100 2105 2110 Lys Val Arg Asp Ala Leu Asp Asn Leu Ala Val Leu His Thr Ala Glu 2115 2120 2125 Ala Gly Gly Arg Ala Tyr Asn His Ala Leu Ser Glu Leu Pro Glu Thr 2130 2135 2140 Leu Glu Thr Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ala Thr Val Thr Gly Gly 2145 2150 2155 2160 Ile Phe Leu Phe Leu Met Ser Ala Arg Gly Ile Gly Lys Met Thr Leu 2165 2170 2175 Gly Met Cys Cys Ile Ile Thr Ala Ser Ile Leu Leu Trp Tyr Ala Gln 2180 2185 2190 Ile Gln Pro His Trp Ile Ala Ala Ser Ile Ile Leu Glu Phe Phe Leu 2195 2200 2205 Ile Val Leu Leu Ile Pro Glu Pro Glu Lys Gln Arg Thr Pro Gln Asp 2210 2215 2220 Asn Gln Leu Thr Tyr Val Val Ile Ala Ile Leu Thr Val Val Ala Ala 2225 2230 2235 2240 Thr Met Ala Asn Glu Met Gly Phe Leu Glu Lys Thr Lys Lys Asp Leu 2245 2250 2255 Gly Leu Gly Ser Ile Ala Thr Gln Gln Pro Glu Ser Asn Ile Leu Asp 2260 2265 2270 Ile Asp Leu Arg Pro Ala Ser Ala Trp Thr Leu Tyr Ala Val Ala Thr 2275 2280 2285 Thr Phe Val Thr Pro Met Leu Arg His Ser Ile Glu Asn Ser Ser Val 2290 2295 2300 Asn Val Ser Leu Thr Ala Ile Ala Asn Gln Ala Thr Val Leu Met Gly 2305 2310 2315 2320 Leu Gly Lys Gly Trp Pro Leu Ser Lys Met Asp Ile Gly Val Pro Leu 2325 2330 2335 Leu Ala Ile Gly Cys Tyr Ser Gln Val Asn Pro Ile Thr Leu Thr Ala 2340 2345 2350 Ala Leu Phe Leu Leu Val Ala His Tyr Ala Ile Ile Gly Pro Gly Leu 2355 2360 2365 Gln Ala Lys Ala Thr Arg Glu Ala Gln Lys Arg Ala Ala Ala Gly Ile 2370 2375 2380 Met Lys Asn Pro Thr Val Asp Gly Ile Thr Val Ile Asp Leu Asp Pro 2385 2390 2395 2400 Ile Pro Tyr Asp Pro Lys Phe Glu Lys Gln Leu Gly Gln Val Met Leu 2405 2410 2415 Leu Val Leu Cys Val Thr Gln Val Leu Met Met Arg Thr Thr Trp Ala 2420 2425 2430 Leu Cys Glu Ala Leu Thr Leu Ala Thr Gly Pro Ile Ser Thr Leu Trp 2435 2440 2445 Glu Gly Asn Pro Gly Arg Phe Trp Asn Thr Thr Ile Ala Val Ser Met 2450 2455 2460 Ala Asn Ile Phe Arg Gly Ser Tyr Leu Ala Gly Ala Gly Leu Leu Phe 2465 2470 2475 2480 Ser Ile Met Lys Asn Thr Thr Asn Thr Arg Arg Gly Thr Gly Asn Ile 2485 2490 2495 Gly Glu Thr Leu Gly Glu Lys Trp Lys Ser Arg Leu Asn Ala Leu Gly 2500 2505 2510 Lys Ser Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Lys Ser Gly Ile Gln Glu Val Asp 2515 2520 2525 Arg Thr Leu Ala Lys Glu Gly Ile Lys Arg Gly Glu Thr Asp His His 2530 2535 2540 Ala Val Ser Arg Gly Ser Ala Lys Leu Arg Trp Phe Val Glu Arg Asn 2545 2550 2555 2560 Met Val Thr Pro Glu Gly Lys Val Val Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly 2565 2570 2575 Gly Trp Ser Tyr Tyr Cys Gly Gly Leu Lys Asn Val Arg Glu Val Lys 2580 2585 2590 Gly Leu Thr Lys Gly Gly Pro Gly His Glu Glu Pro Ile Pro Met Ser 2595 2600 2605 Thr Tyr Gly Trp Asn Leu Val Arg Leu Gln Ser Gly Val Asp Val Phe 2610 2615 2620 Phe Ile Pro Pro Glu Lys Cys Asp Thr Leu Leu Cys Asp Ile Gly Glu 2625 2630 2635 2640 Ser Ser Pro Asn Pro Thr Val Glu Ala Gly Arg Thr Leu Arg Val Leu 2645 2650 2655 Asn Leu Val Glu Asn Trp Leu Asn Asn Asn Thr Gln Phe Cys Ile Lys 2660 2665 2670 Val Leu Asn Pro Tyr Met Pro Ser Val Ile Glu Lys Met Glu Ala Leu 2675 2680 2685 Gln Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Leu Val Arg Asn Pro Leu Ser Arg Asn 2690 2695 2700 Ser Thr His Glu Met Tyr Trp Val Ser Asn Ala Ser Gly Asn Ile Val 2705 2710 2715 2720 Ser Ser Val Asn Met Ile Ser Arg Met Leu Ile Asn Arg Phe Thr Met 2725 2730 2735 Arg Tyr Lys Lys Ala Thr Tyr Glu Pro Asp Val Asp Leu Gly Ser Gly 2740 2745 2750 Thr Arg Asn Ile Gly Ile Glu Ser Glu Ile Pro Asn Leu Asp Ile Ile 2755 2760 2765 Gly Lys Arg Ile Glu Lys Ile Lys Gln Glu His Glu Thr Ser Trp His 2770 2775 2780 Tyr Asp Gln Asp His Pro Tyr Lys Thr Trp Ala Tyr His Gly Ser Tyr 2785 2790 2795 2800 Glu Thr Lys Gln Thr Gly Ser Ala Ser Ser Met Val Asn Gly Val Val 2805 2810 2815 Arg Leu Leu Thr Lys Pro Trp Asp Val Val Pro Met Val Thr Gln Met 2820 2825 2830 Ala Met Thr Asp Thr Thr Pro Phe Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu 2835 2840 2845 Lys Val Asp Thr Arg Thr Gln Glu Pro Lys Glu Gly Thr Lys Lys Leu 2850 2855 2860 Met Lys Ile Thr Ala Glu Trp Leu Trp Lys Glu Leu Gly Lys Lys Lys 2865 2870 2875 2880 Thr Pro Arg Met Cys Thr Arg Glu Glu Phe Thr Arg Lys Val Arg Ser 2885 2890 2895 Asn Ala Ala Leu Gly Ala Ile Phe Thr Asp Glu Asn Lys Trp Lys Ser 2900 2905 2910 Ala Arg Glu Ala Val Glu Asp Ser Arg Phe Trp Glu Leu Val Asp Lys 2915 2920 2925 Glu Arg Asn Leu His Leu Glu Gly Lys Cys Glu Thr Cys Val Tyr Asn 2930 2935 2940 Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Leu Gly Glu Phe Gly Lys Ala Lys 2945 2950 2955 2960 Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala Arg Phe Leu Glu 2965 2970 2975 Phe Glu Ala Leu Gly Phe Leu Asn Glu Asp His Trp Phe Ser Arg Glu 2980 2985 2990 Asn Ser Leu Ser Gly Val Glu Gly Glu Gly Leu His Lys Leu Gly Tyr 2995 3000 3005 Ile Leu Arg Asp Val Ser Lys Lys Glu Gly Gly Ala Met Tyr Ala Asp 3010 3015 3020 Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg Ile Thr Leu Glu Asp Leu Lys Asn 3025 3030 3035 3040 Glu Glu Met Val Thr Asn His Met Glu Gly Glu His Lys Lys Leu Ala 3045 3050 3055 Glu Ala Ile Phe Lys Leu Thr Tyr Gln Asn Lys Val Val Arg Val Gln 3060 3065 3070 Arg Pro Thr Pro Arg Gly Thr Val Met Asp Ile Ile Ser Arg Arg Asp 3075 3080 3085 Gln Arg Gly Ser Gly Gln Val Gly Thr Tyr Gly Leu Asn Thr Phe Thr 3090 3095 3100 Asn Met Glu Ala Gln Leu Ile Arg Gln Met Glu Gly Glu Gly Val Phe 3105 3110 3115 3120 Lys Ser Ile Gln His Leu Thr Ile Thr Glu Glu Ile Ala Val Gln Asn 3125 3130 3135 Trp Leu Ala Arg Val Gly Arg Glu Arg Leu Ser Arg Met Ala Ile Ser 3140 3145 3150 Gly Asp Asp Cys Val Val Lys Pro Leu Asp Asp Arg Phe Ala Ser Ala 3155 3160 3165 Leu Thr Ala Leu Asn Asp Met Gly Lys Ile Arg Lys Asp Ile Gln Gln 3170 3175 3180 Trp Glu Pro Ser Arg Gly Trp Asn Asp Trp Thr Gln Val Pro Phe Cys 3185 3190 3195 3200 Ser His His Phe His Glu Leu Ile Met Lys Asp Gly Arg Val Leu Val 3205 3210 3215 Val Pro Cys Arg Asn Gln Asp Glu Leu Ile Gly Arg Ala Arg Ile Ser 3220 3225 3230 Gln Gly Ala Gly Trp Ser Leu Arg Glu Thr Ala Cys Leu Gly Lys Ser 3235 3240 3245 Tyr Ala Gln Met Trp Ser Leu Met Tyr Phe His Arg Arg Asp Leu Arg 3250 3255 3260 Leu Ala Ala Asn Ala Ile Cys Ser Ala Val Pro Ser His Trp Val Pro 3265 3270 3275 3280 Thr Ser Arg Thr Thr Trp Ser Ile His Ala Lys His Glu Trp Met Thr 3285 3290 3295 Thr Glu Asp Met Leu Thr Val Trp Asn Arg Val Trp Ile Gln Glu Asn 3300 3305 3310 Pro Trp Met Glu Asp Lys Thr Pro Val Glu Ser Trp Glu Glu Ile Pro 3315 3320 3325 Tyr Leu Gly Lys Arg Glu Asp Gln Trp Cys Gly Ser Leu Ile Gly Leu 3330 3335 3340 Thr Ser Arg Ala Thr Trp Ala Lys Asn Ile Gln Ala Ala Ile Asn Gln 3345 3350 3355 3360 Val Arg Ser Leu Ile Gly Asn Glu Glu Tyr Thr Asp Tyr Met Pro Ser 3365 3370 3375 Met Lys Arg Phe Arg Arg Glu Glu Glu Glu Ala Gly Val Leu Trp 3380 3385 3390

Claims (51)

  1. 변형된 생약독화(live, attenuated) 뎅기-2 바이러스 균주 PDK-53 유래의 비구조 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및 뎅기-1 유래의 적어도 하나의 구조 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 키메라로서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 NS2A 유전자의 아미노산 위치 116가 이소루신 대신에 루신인 핵산 위치 3823에서의 돌연변이를 포함하는 적어도 하나의 추가적인 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 NS2B의 아미노산 위치 92가 글루타민산 대신에 아스파르트산인 위치 4407에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 NS4B의 아미노산 위치 108이 트레오닌 대신에 이소루신인 위치 7148에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 위치 7311에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 제2 뉴클레오티드 서열은 뎅기-1 유래의 상기 E 단백질을 암호화하고, 뎅기-1은 상기 E 단백질의 아미노산 위치 483이 글리신 대신에 알라닌인, 위치 2384에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 핵산 키메라 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  7. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 핵산 키메라에 의해 암호화된 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  8. 청구항 6 및 청구항 7 중 어느 한 항의 조성물의 약학적으로 허용가능한 양을 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 상기 조성물은 개체 내에서 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 핵산 서열을 암호화하는 벡터.
  10. 변형된 생약독화 뎅기-2 바이러스 균주 PDK-53를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열로서, 상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 NS4A 유전자의 아미노산 위치 36이 알라닌 대신에 프롤린인 핵산 위치 6481에서의 돌연변이를 포함하는 적어도 하나의 추가적인 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 서열.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 NS4B의 아미노산 위치 111이 루신 대신에 페닐알라닌인, 위치 7156에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 서열.
  12. 청구항 10에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 NS5의 아미노산 위치 412가 이소루신 대신에 발린인, 위치 8803에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 서열.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 prM의 아미노산 위치 52가 라이신 대신에 글루타민산인, 위치 592에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 서열.
  14. 청구항 10 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 따른 핵산 키메라 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  15. 청구항 10 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  16. 청구항 14 및 청구항 15 중 어느 한 항의 조성물의 약학적으로 허용가능한 양을 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 상기 조성물은 개체 내에서 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  17. 청구항 10 내지 청구항 13 중 어느 한 항의 핵산 서열을 암호화하는 벡터.
  18. 변형된 생약독화 뎅기-2 바이러스 균주 PDK-53 유래의 비구조 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 뎅기-3 유래의 적어도 하나의 구조 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 키메라로서, 상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 N42A 유전자의 아미노산 위치 23이 아스파르트산 대신에 아스파라긴인 핵산 위치 6436에서의 돌연변이를 포함하는 적어도 하나의 추가적인 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  19. 청구항 16에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 위치 7620에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  20. 청구항 16에 있어서,
    상기 제2 뉴클레오티드 서열은 뎅기-3 유래의 E 단백질을 암호화하고, 상기뎅기-3은 상기 E 단백질의 아미노산 위치 223이 트레오닌 대신에 세린인 위치 1603에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  21. 청구항 18 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 따른 핵산 키메라 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  22. 청구항 18 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 따른 핵산 키메라에 의해 암호화된 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  23. 청구항 21 및 청구항 22 중 어느 한 항의 조성물의 약학적으로 허용가능한 양을 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 상기 조성물은 개체 내에서 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  24. 청구항 18 내지 청구항 20 중 어느 한 항의 핵산 서열을 암호화하는 벡터.
  25. 변형된 생약독화 뎅기-2 바이러스 균주 PDK-53 유래의 비구조 단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 뎅기-4 유래의 적어도 하나의 구조 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 키메라로서, 상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 NS2A 유전자의 아미노산 위치 66이 아스파르트산 대신에 글리신인 핵산 위치 3674에서의 돌연변이를 포함하는 적어도 하나의 추가적인 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  26. 청구항 22에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 NS2A의 아미노산 위치 99가 라이신 대신에 아르기닌인, 위치 3773에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  27. 청구항 22에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 위치 5391에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  28. 청구항 22에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 NS4A의 아미노산 위치 21이 알라닌 대신에 발린인 위치 6437에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  29. 청구항 22에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 위치 7026에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  30. 청구항 22에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 NS4B의 아미노산 위치 238이 세린 대신에 페닐알라닌인 위치 7538에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 헥산 키메라.
  31. 청구항 22에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 위치 9750에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  32. 청구항 22에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 위치 225에서의 돌연변이를 추가로 포함하는 핵산 키메라.
  33. 청구항 25 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 따른 핵산 키메라 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  34. 청구항 25 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 따른 핵산 키메라에 의해 암호화된 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  35. 청구항 33 및 청구항 34 중 어느 한 항의 조성물의 약학적으로 허용가능한 양을 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 상기 조성물은 개체 내에서 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  36. 청구항 25 내지 청구항 32 중 어느 한 항의 핵산 서열을 암호화하는 벡터.
  37. 서열번호 1, 7 및 10으로 나타내는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열.
  38. 청구항 33에 있어서,
    상기 핵산 키메라는 서열번호 2, 3, 8, 9, 11 또는 12로 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
  39. 청구항 37의 하나 이상의 핵산 서열 또는 청구항 38의 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
  40. 청구항 39에 있어서,
    생약독화 뎅기-2 바이러스를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  41. 청구항 40에 있어서,
    상기 생약독화 뎅기-2 바이러스는 서열번호 4의 핵산 서열, 또는 서열번호 5 및 6의 하나 이상의 아미노산 서열로 나타내는 면역원성 조성물.
  42. 청구항 40에 있어서,
    상기 조성물은 4개의 모든 뎅기 바이러스 혈청형(serotype)을 함유하는 4가 조성물인 면역원성 조성물.
  43. 청구항 39에 있어서,
    황열병 바이러스, 진드기매개뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, C형 간염 바이러스 및 이들의 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 플라비바이러스에 대한 면역원성 조성물을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  44. 청구항 1 내지 청구항 5, 청구항 10 내지 청구항 13, 청구항 18 내지 청구항 20 또는 청구항 25 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 핵산 서열; 또는 청구항 6, 7, 14, 15, 21, 22, 33 또는 34 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 조성물 및 용기를 포함하는 키트.
  45. 청구항 1 내지 청구항 5, 청구항 10 내지 청구항 13, 청구항 18 내지 청구항 20 또는 청구항 25 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 생약독화 바이러스.
  46. 핵산 서열 또는 표 3의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드.
  47. 핵산 서열 또는 하나 이상의 DENVax-1-A, DENVax-2-F, DENVax-3-F 및 DENVax-4-F를 포함하는 하나 이상의 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드.
  48. 핵산 서열 또는 청구항 47의 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  49. 청구항 48에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 보조제를 추가로 포함하는 조성물.
  50. 청구항 45의 하나 이상의 생약독화 바이러스 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  51. 청구항 50에 있어서,
    상기 조성물은 4개의 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 대하여 개체 내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 4가 뎅기 바이러스 조성물을 포함하는 조성물.
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