JP2023516009A - ウイルス調製物から宿主細胞ｄｎａを取り除く方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料から、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、糖及びタンパク質の存在下で、陰イオン交換クロマトグラフィによって宿主細胞ＤＮＡを取り除く方法と、宿主細胞培養液から、このような陰イオン交換クロマトグラフィ工程を用いて組換え感染性ウイルス粒子を精製する方法と、に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料から、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、糖及びタンパク質の存在下で、陰イオン交換クロマトグラフィによって宿主細胞ＤＮＡを取り除く方法と、宿主細胞培養液から、このような陰イオン交換クロマトグラフィ工程を用いて組換え感染性ウイルス粒子を精製する方法と、に関する。

ウイルス感染に対する防御としてのワクチンは、ヒトにおいて疾患が発生するのを低減させるために効果的に使用されている。ウイルスワクチンの最も成功している技術の１つは、弱められた、または弱毒化されたウイルス株（「弱毒化生ウイルス」）で動物またはヒトに免疫を付与する技術である。免疫付与後のウイルスの複製が制限されているため、弱毒化ウイルス株が疾患を引き起こすことはない。しかし、ウイルス複製が制限されていてもウイルス抗原の完全なレパートリを発現するには十分であり、ウイルスに対する強力かつ持続性の免疫応答を作り出すことができる。したがって、その後の病原ウイルス株への曝露に際して、免疫を付与された個体は疾患から保護される。これらの弱毒化生ウイルスワクチンは、公衆衛生にて使用される最も成功しているワクチンの１つである。

ワクチンに含まれる弱毒化生ウイルスを生成するために、通常、哺乳動物宿主細胞、例えばベロ細胞をウイルスに感染させ、その後ウイルスが細胞内で複製され、細胞上清への感染性ウイルス粒子の分泌がもたらされる。これらの感染性ウイルス粒子は、続いて不純物、例えば宿主細胞タンパク質及び宿主細胞ＤＮＡなどから分離される必要があり、その後、対象に免疫付与するために使用され得る。

ＷＯ０２／０２４８７６ Ａ２は、全粒子ワクチンの製造工程であって、感染した宿主細胞を、ヌクレアーゼ及びプロテアーゼの存在下で無血清培地にインキュベートする製造工程について開示している。

ＷＯ２００６／２２９６４ Ａ１は、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅサルフェートクロマトグラフィを使用した親和性クロマトグラフィによる、不活化西ナイルウイルスの精製について記載している。

ＷＯ２０１３／１０６３３７ Ａ１は、タンジェンシャルフローろ過、続いて結合及び溶出モードで実施する陰イオン交換クロマトグラフィによって、組換え感染性フラビウイルスのウイルス粒子を精製する方法について開示している。

ＷＯ２０１５／０９２２８７ Ａ１は、６．０未満のｐＨを有する酸性緩衝液を使用する陰イオン交換クロマトグラフィ工程の実施によって、エンベロープウイルスを精製する方法について記載している。同明細書はまた、陰イオン交換クロマトグラフィの前にタンジェンシャルフローろ過工程を適用することで、エンベロープウイルス精製の効率が大幅に改善されるという結果になると記載している。

それにもかかわらず、ワクチンに使用されるウイルス粒子から、宿主細胞のＤＮＡ及びタンパク質を効率的に除去することを可能にする方法が依然として必要とされている。

本発明は、感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料から宿主細胞ＤＮＡを効率的に除去する工程であって、宿主細胞ＤＮＡ除去の間のウイルス力価の損失を最小限にする工程を提供する。

したがって、本発明は、感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料から、宿主細胞ＤＮＡを取り除く方法であって、
（ａ）感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む前記試料を、１種以上の非イオン性界面活性剤、糖及びタンパク質を含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物に陰イオン交換クロマトグラフィを実施するステップと、を含む方法に関する。

一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、非イオン性三元ブロックコポリマー、例えばエチレンオキシド・プロピレンオキシド（ＥＯ－ＰＯ）ブロックコポリマーである。一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー４０７またはポロキサマー４０３である。一実施形態では、ステップ（ａ）の混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、糖は、トレハロース、グルコース、スクロース、フルクトース及びマルトースから選択され、好ましくはトレハロースである。一実施形態では、ステップ（ａ）の混合物における糖の濃度は、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、タンパク質はアルブミンであり、好ましくはヒト血清アルブミンである。一実施形態では、ステップ（ａ）の混合物におけるタンパク質の濃度は、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、組成物は、ポロキサマー４０７、トレハロース二水和物及びヒト血清アルブミンを含む。一実施形態では、ステップ（ａ）の混合物は、０．２ｗ／ｖ％のポロキサマー４０７、３ｗ／ｖ％のトレハロース二水和物、及び０．０２ｗ／ｖ％のヒト血清アルブミンを含む。

一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィは、フロースルーモードで操作される。一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィは、陰イオン交換クロマトグラフィ膜を使用する。一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィ膜は、第四級アンモニウム基を含む。

一実施形態では、感染性ウイルス粒子は、エンベロープ感染性ウイルス粒子である。一実施形態では、感染性ウイルス粒子は、感染性フラビウイルスのウイルス粒子である。一実施形態では、感染性ウイルス粒子は、感染性デングウイルスのウイルス粒子である。一実施形態では、感染性デングウイルスのウイルス粒子は、感染性弱毒化生デングウイルスのウイルス粒子、または感染性キメラデングウイルスのウイルス粒子である。

一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィの間に失われるウイルス力価は、５％未満である。

一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィによって、宿主細胞ＤＮＡ含有量が少なくとも１０倍低減する。

一実施形態では、本方法は、感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料を、エンドヌクレアーゼで処理するステップを含まない。

本発明はまた、宿主細胞培養液から感染性ウイルス粒子を精製する方法であって、
（ａ）前記宿主細胞培養液から、感染性ウイルス粒子を含有する宿主細胞培養液上清をハーベストするステップと、
（ｂ）ハーベストされた感染性ウイルス粒子を、１種以上の非イオン性界面活性剤、糖及びタンパク質を含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物に、１回以上の陰イオン交換クロマトグラフィステップを実施し、通過液を収集するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの通過液にタンジェンシャルフローろ過を実施し、未透過液を収集するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の未透過液から精製感染性デングウイルスのウイルス粒子を回収するステップと、を含む方法に関する。

一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、非イオン性三元ブロックコポリマー、例えばエチレンオキシド・プロピレンオキシド（ＥＯ－ＰＯ）ブロックコポリマーである。一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー４０７またはポロキサマー４０３である。一実施形態では、ステップ（ａ）の混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、糖は、トレハロース、グルコース、スクロース、フルクトース及びマルトースから選択され、好ましくはトレハロースである。一実施形態では、ステップ（ａ）の混合物における糖の濃度は、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、タンパク質はアルブミンであり、好ましくはヒト血清アルブミンである。一実施形態では、ステップ（ａ）の混合物におけるタンパク質の濃度は、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、組成物は、ポロキサマー４０７、トレハロース二水和物及びヒト血清アルブミンを含む。一実施形態では、混合物は、０．２ｗ／ｖ％のポロキサマー４０７、３ｗ／ｖ％のトレハロース二水和物、及び０．０２ｗ／ｖ％のヒト血清アルブミンを含む。

一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィは、陰イオン交換クロマトグラフィ膜を使用する。一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィ膜は、第四級アンモニウム基を含む。

一実施形態では、感染性ウイルス粒子は、エンベロープ感染性ウイルス粒子である。一実施形態では、感染性ウイルス粒子は、感染性フラビウイルスのウイルス粒子である。一実施形態では、感染性ウイルス粒子は、感染性デングウイルスのウイルス粒子である。一実施形態では、感染性デングウイルスのウイルス粒子は、感染性弱毒化生デングウイルスのウイルス粒子、または感染性キメラデングウイルスのウイルス粒子である。

一実施形態では、本方法は、感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料を、エンドヌクレアーゼで処理するステップを含まない。

一実施形態では、宿主細胞培養液はベロ細胞培養液である。

一実施形態では、感染性ウイルス粒子を含む宿主細胞培養液上清をハーベストした後に、深層ろ過を実施する。一実施形態では、深層ろ過は、０．４５μｍ及び０．２μｍのフィルターを介するものである。

一実施形態では、タンジェンシャルフローろ過は、１つ以上のＴＦＦ膜カセットを介するろ過を含む。一実施形態では、１つ以上のＴＦＦ膜カセットはセルロースろ材を含む。

本明細書及び請求項で、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、これらの表現は、その他の要素またはステップを除外しない。本発明の目的上、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の任意の実施形態であると考慮される。以下、ある群が、少なくとも一定数の実施形態を含むと定義される場合、この群はまた、所望によりこれらの実施形態のみからなる群も開示すると理解される。

単数名詞に関連する不定冠詞または定冠詞、例えば「ａ」または「ａｎ」、「ｔｈｅ」が使用される場合、これらは、明確に述べられない限り、その名詞の複数形を含む。逆もまた同様に、名詞の複数形が使用される場合、それは単数形にも言及する。

さらに、本明細書及び請求項における、用語「第１」、「第２」、「第３」、または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）などは、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも起こった順序、または経時的順序について記載しているわけではない。ここで使用される用語は、適切な状況の下で交換可能であり、本明細書に記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載または図示される順序とは別の順序で実施することができると理解すべきである。

本発明の文脈において示される任意の数値は、通常、問題となっている特徴の技術的作用を依然として確保できると当業者が理解するであろう正確度の間隔を伴う。本明細書で使用される場合、示される数値からのずれは、±１０％の範囲、好ましくは±５％の範囲である。示される数値的な間隔からの、±１０％、好ましくは±５％という上記のずれはまた、本明細書で数値に関して使用される、用語「約（ａｂｏｕｔ）」及び「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」でも表される。

本発明の方法によって、宿主細胞ＤＮＡは、感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料から取り除かれる。用語「宿主細胞ＤＮＡを取り除く」は、本発明の方法が実行された後の宿主細胞ＤＮＡの含有量が、本発明の方法が実行される前の宿主細胞ＤＮＡの含有量よりも小さいことを意味する。一実施形態では、本発明の方法は、宿主細胞ＤＮＡ含有量の少なくとも１０倍の低減をもたらす。好ましくは、本発明の方法は、宿主細胞ＤＮＡ含有量の、少なくとも１２倍または１５倍、より好ましくは少なくとも１８倍または２０倍、最も好ましくは少なくとも２２倍の低減をもたらす。倍の低減は、本方法が行われる前の試料中の宿主細胞ＤＮＡ含有量を、本方法が行われた後の試料中の宿主細胞ＤＮＡ含有量で割ることによって算出できる。

好ましくは、本発明の方法が実行された後の宿主細胞ＤＮＡの含有量は、宿主細胞ＤＮＡ含有量を決定するのに使用されるアッセイの検出限界よりも小さい。一実施形態では、本発明の方法が実行された後の宿主細胞ＤＮＡの含有量は、５０ｎｇ／ｍｌ以下である。

宿主細胞から得られた生体試料中の宿主細胞ＤＮＡ含有量を決定する方法は、当該技術分野において既知であり、ウイルス核酸ではなく、宿主細胞ＤＮＡに特異的に結合するプライマーを使用した定量ＰＣＲが挙げられる。宿主細胞ＤＮＡ含有量を決定するためのキットは、例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販されている。好ましくは、宿主細胞ＤＮＡ含有量を決定するのに、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（登録商標）染色剤が使用される。

「宿主細胞ＤＮＡ」は、感染性ウイルス粒子が生成された細胞に由来する。宿主細胞ＤＮＡは、ウイルス核酸の配列とは異なる核酸の配列のために、ウイルス核酸と区別され得る。一実施形態では、感染性ウイルス粒子を生成するのに、ベロ細胞が使用される。したがって、この実施形態では、宿主細胞ＤＮＡはベロ細胞に由来し、「ベロ細胞ＤＮＡ」とも呼ばれる。ベロ細胞ＤＮＡは、ウイルス核酸の配列とは異なる核酸の配列のために、ウイルス核酸と区別され得る。

用語「感染性ウイルス粒子」は、ウイルスが好適な宿主細胞、例えばベロ細胞に感染することができ、これらの宿主細胞中で複製し、結果としてさらなる感染性ウイルス粒子を産生するウイルス粒子を意味する。本発明の方法が行われても、ウイルスは、好適な宿主細胞に感染する能力を失わないため、本発明の方法により得られた精製ウイルス粒子は、依然として好適な宿主細胞に感染することができる。したがって、本発明の方法により得られたウイルス粒子は、感染性ウイルス性粒子である。本発明の方法は、とりわけウイルス粒子を不活性化するステップを含まない。ウイルス粒子を不活性化するステップ、例えばホルマリンまたはβ‐プロピオラクトンでの処理によるステップは、結果としてウイルス粒子の感染力消失をもたらす。用語「感染性ウイルス粒子」は、感染性ではないウイルス様粒子を含まない。一実施形態では、用語「感染性ウイルス粒子」は、弱毒化生ウイルスを含む。

一実施形態では、感染性ウイルス粒子はエンベロープウイルスに由来する。エンベロープウイルスの例としては、ポックスウイルス、オルソミクソウイルス、パラミキソウイルス及びフラビウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

「エンベロープウイルス」とは、外側の被膜またはエンベロープを有するウイルス粒子を意味する。エンベロープは、出芽過程の感染した宿主細胞に由来し、それによって新しく形成されたウイルス粒子は、細胞の細胞膜の一部から作られる外殻に包まれるようになる。ウイルスがエンベロープを獲得する出芽過程は、ウイルスが増殖するために使用された宿主細胞からの、ウイルス粒子の放出という結果をもたらす。

エンベロープオルソミクソウイルスの例としては、非限定的にインフルエンザウイルスＡ型が挙げられ、例えばＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２、及びＨ１０Ｎ７などの株が挙げられるが、これらに限定されない。

エンベロープパラミキソウイルスの例としては、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、麻疹ウイルス及びムンプスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態では、エンベロープウイルスとしては、フラビウイルス属のウイルスが挙げられる。フラビウイルス属は、エンベローププラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば西ナイル（ＷＮ）ウイルス、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ジカウイルス、デング熱ウイルス、黄熱ウイルス（ＹＦ）、キャサヌール森林病ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、中央ヨーロッパ型ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ－Ｗ）ウイルス、極東型ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ－ＦＥ）ウイルス、クンジンウイルス、チュレニー（Ｔｙｕｌｅｎｉｙ）ウイルス、ウンタヤ（Ｎｔａｙａ）ウイルス、ウガンダＳウイルス、モドックウイルス、ＢＶＤＶ（例えば、ＮＡＤＬ株及び８９０株）、ＣＳＦＶ Ａｌｆｏｒｔ １８７、ＢＤＶ ＢＤ３１ウイルス、及び／またはＧＢウイルスＡ型、Ｂ型及び／またはＣ型などを含む。

ある特定の実施形態では、感染性ウイルス粒子は、感染性デングウイルスのウイルス粒子である。デングウイルスは、フラビウイルス科の一本鎖、プラス鎖ＲＮＡウイルスである。体系的分類を表１に概説する。フラビウイルス科は、フラビウイルス、ヘパシウイルス及びペスチウイルスの３つの属を含む。フラビウイルス属には、病原性が高く潜在的な出血熱ウイルス、例えば黄熱ウイルス及びデングウイルス、ジカウイルス、脳炎ウイルス、例えば日本脳炎ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス及び西ナイルウイルス、ならびに多数の病原性の低いウイルスが含まれる。

フラビウイルスのゲノムは、５’末端から３’末端の方向で以下を含む：
・５’－非翻訳領域（５’－ＮＣＲ）、
・カプシドタンパク質（Ｃ）コーディング領域、
・前駆膜タンパク質（ｐｒＭ）コーディング領域、
・エンベロープタンパク質（Ｅ）コーディング領域、
・非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５）をコードする領域、及び
・３’非翻訳領域（３’－ＮＣＲ）。

ウイルスの構造タンパク質はＣ、ｐｒＭ及びＥであり、非構造タンパク質はＮＳ１～ＮＳ５である。構造タンパク質及び非構造タンパク質は、単一ポリタンパク質として翻訳され、細胞及びウイルスのプロテアーゼによって処理される。

本明細書で使用される場合、用語「デング血清型」とは、デングウイルスの種類を意味し、血清型は細胞表面抗原によって定義され、それゆえに当該技術分野において既知の血清学的方法によって、その他のデング血清型と区別されることができる。現在、デングウイルスの４種類の血清型、すなわちデング血清型１型（ＤＥＮＶ－１）、デング血清型２型（ＤＥＮＶ－２）、デング血清型３型（ＤＥＮＶ－３）及びデング血清型４型（ＤＥＮＶ－４）が知られている。

ある特定の実施形態では、感染性ウイルス粒子は弱毒化生デングウイルスである。本明細書において使用される場合、用語「弱毒化生デングウイルス」とは、変異により有毒性が低下した、生存可能で感染性のデングウイルスを意味する。弱毒化生デングウイルスは、すべての構成成分が同じデング血清型に由来するデングウイルスであることができ、または２種以上のデング血清型からの部分を有するキメラデングウイルスであることもできる。

一実施形態では、弱毒化生デングウイルスは、弱毒化生ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ウイルス株（ＴＤＶ－２）に由来する、分子的に特徴があり、クローンされたデング血清型２型株である。この弱毒化ＴＤＶ－２株は、もともとＭａｈｉｄｏｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｎｇｋｏｋ，Ｔｈａｉｌａｎｄ（Ｋｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３０（２）：３００－３０８）で単離された、弱毒化実験室由来ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ウイルス株の相補ＤＮＡクローン化によって生成された。ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３は、初代イヌ腎臓（ＰＤＫ）細胞における、３２℃での５３代連続継代によって生成された（Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂｕｌｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ．６５（２）：１８９－１９５）。一実施形態では、ＴＤＶ－２は、配列番号３のヌクレオチド配列、及び／または配列番号４のアミノ酸配列を有する。

弱毒化ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３株（ＴＤＶ－２の前駆体）は、野生型ウイルス株ＤＥＮ－２ １６６８１に由来し、以下の通り、野生型とは９つのヌクレオチドが異なる（Ｋｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３０（２）：３００－３０８）：
（ｉ）５’－非翻訳領域（ＮＣＲ）－５７（ｎｔ－５７ ＣからＴ）：主な弱毒化部位
（ｉｉ）ｐｒＭ－２９ ＡｓｐからＶａｌ（ｎｔ－５２４ ＡからＴ）
（ｉｉｉ）ｎｔ－２０５５ ＣからＴ（Ｅ遺伝子）サイレント突然変異
（ｉｖ）ＮＳ１－５３ ＧｌｙからＡｓｐ（ｎｔ－２５７９ ＧからＡ）：主な弱毒化部位
（ｖ）ＮＳ２Ａ－１８１ ＬｅｕからＰｈｅ（ｎｔ－４０１８ ＣからＴ）
（ｖｉ）ＮＳ３－２５０ ＧｌｕからＶａｌ（ｎｔ－５２７０ ＡからＴ）：主な弱毒化部位
（ｖｉｉ）ｎｔ－５５４７（ＮＳ３遺伝子）ＴからＣサイレント突然変異（ｖｉｉｉ）ＮＳ４Ａ－７５ ＧｌｙからＡｌａ （ｎｔ－６５９９ ＧからＣ）
（ｉｘ）ｎｔ－８５７１ ＣからＴ（ＮＳ５遺伝子）サイレント突然変異

５’非翻訳領域（ＮＣＲ）（ヌクレオチド５７）（突然変異（ｉ））、ＮＳ１（配列番号４のアミノ酸８２８）（突然変異（ｉｖ））、及びＮＳ３遺伝子（配列番号４のアミノ酸１７２５）（突然変異（ｖｉ））に位置する３つのヌクレオチド変化は、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３株の弱毒化表現型の基礎を形成する（Ｋｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３０：３００－３０８；Ｂｕｔｒａｐｅｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（７）：３１１１－３１１９）。

「ウイルス株」、特に「デングウイルス株」は、ウイルス、特にデングウイルスの遺伝子サブタイプであり、特異的な核酸配列を特徴とする。あるデング血清型は、同じ細胞表面抗原を有し、それゆえ同じ抗体により認識される、異なる核酸配列を有する異なる株を含んでもよい。デングウイルス株は、すべての構成成分が同じデング血清型に由来するデングウイルスであることができ、または２種以上のデング血清型からの部分を有するキメラデングウイルスであることもできる。

「キメラウイルス」または「キメラ株」または「キメラウイルス株」は、少なくとも２種の異なるウイルスからの部分を含む。一実施形態では、キメラウイルスは、デングウイルスのｐｒＭタンパク質及びＥタンパク質と、別のフラビウイルスからのその他のタンパク質と、を含む。一実施形態では、キメラウイルスは、デングウイルスのｐｒＭタンパク質及びＥタンパク質と、別のフラビウイルス、例えば黄熱ウイルス、ジカウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス及びダニ媒介性脳炎ウイルスからのその他のタンパク質と、を含む。一実施形態では、キメラウイルスは、デングウイルスのｐｒＭタンパク質及びＥタンパク質と、黄熱ウイルス株ＹＦ－１７Ｄからのその他のタンパク質と、を含む。このようなキメラウイルスは、市販の製品Ｄｅｎｇｖａｘｉａ（登録商標）に存在し、例えばＷＯ９８／３７９１１、ＷＯ０３／１０１３９７、ＷＯ２００７／０２１６７２、ＷＯ２００８／００７０２１、ＷＯ２００８／０４７０２３及びＷＯ２００８／０６５３１５に記載されている。

「キメラデングウイルス」または「キメラデング血清型株」または「キメラデング株」は、少なくとも２種の異なるデング血清型からの部分を含む。本明細書で使用される場合、キメラデングウイルスは、異なるフラビウイルス、例えば黄熱ウイルス、ジカウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス及びダニ媒介性脳炎ウイルスからの部分を含まない。特に、本明細書に記載されるキメラデングウイルスは、黄熱ウイルスからの部分を含まない。このようなキメラデングウイルスは、ＷＯ０１／０６０８４７ Ａ２、ＷＯ２０１４／１５０９３９ Ａ２及びＷＯ２０１７／１７９０１７ Ａ１に記載されている。

本明細書で使用される場合、「キメラデング血清型２／１株」または「ＤＥＮＶ－２／１キメラ」または「ＴＤＶ－１」とは、ＤＥＮＶ－２及びＤＥＮＶ－１からの部分を含むデングウイルスキメラ構造体を意味する。特に、キメラデング血清型２／１株では、ＤＥＮＶ－２からのｐｒＭタンパク質及びＥタンパク質は、ＤＥＮＶ－１からのｐｒＭタンパク質及びＥタンパク質に置き換わっている。一実施形態では、キメラデング血清型２／１株は、配列番号１のヌクレオチド配列及び／または配列番号２のアミノ酸配列を有する。

本明細書で使用される場合、「キメラデング血清型２／３株」または「ＤＥＮＶ－２／３キメラ」または「ＴＤＶ－３」とは、ＤＥＮＶ－２及びＤＥＮＶ－３からの部分を含むデングウイルスキメラ構造体を意味する。特に、キメラデング血清型２／３株では、ＤＥＮＶ－２からのｐｒＭタンパク質及びＥタンパク質は、ＤＥＮＶ－３からのｐｒＭタンパク質及びＥタンパク質に置き換わっている。一実施形態では、ＴＤＶ－３は、配列番号５のヌクレオチド配列及び／または配列番号６のアミノ酸配列を有する。

本明細書で使用される場合、「キメラデング血清型２／４株」または「ＤＥＮＶ－２／４キメラ」または「ＴＤＶ－４」とは、ＤＥＮＶ－２及びＤＥＮＶ－４からの部分を含むデングウイルスキメラ構造体を意味する。特に、キメラデング血清型２／４株では、ＤＥＮＶ－２からのｐｒＭタンパク質及びＥタンパク質は、ＤＥＮＶ－４からのｐｒＭタンパク質及びＥタンパク質に置き換わっている。一実施形態では、ＴＤＶ－４は、配列番号７のヌクレオチド配列及び／または配列番号８のアミノ酸配列を有する。

本発明の方法では、感染性ウイルス粒子を含む試料は、１種以上の非イオン性界面活性剤、糖及びタンパク質を含む組成物と混合される。本発明の方法の一実施形態では、感染性ウイルス粒子を含む試料は、非イオン性界面活性剤を含む組成物と混合される。本発明の方法の一実施形態では、感染性ウイルス粒子を含む試料は、非イオン性界面活性剤、糖及びタンパク質を含む組成物と混合される。

用語「非イオン性界面活性剤」は、正または負に荷電した（すなわちイオン性）官能基を含有しない界面活性剤を意味する。アニオン性及びカチオン性界面活性剤と対照的に、非イオン性界面活性剤は溶液中で電離しない。非イオン性界面活性剤は、ブロックコポリマー、ソルビタンエステル、エトキシル化もしくはプロポキシル化ソルビタンエステル、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）、アルコキシル化モノ－もしくはジ－アルキルアミン、脂肪酸モノエタノールアミド（ＦＡＭＡ）、脂肪酸ジエタノールアミド（ＦＡＤＡ）、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＥＦＡＭ）、プロポキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＰＦＡＭ）、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、またはグルコサミンのＮ－アシルＮ－アルキル誘導体（グルカミド、ＧＡもしくは脂肪酸グルカミド（ＦＡＧＡ））、及びこれらの組合せから選択されてよい。

非イオン性界面活性剤は、好ましくは高分子量非イオン性界面活性剤である。「高分子量」とは、１５００以上の分子量を意味する。一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、非イオン性三元ブロックコポリマーである。一実施形態では、界面活性剤は、非イオン性、親水性のポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（すなわちＥＯ－ＰＯブロックコポリマー）である。ＥＯ－ＰＯブロックコポリマーは、ポリエチレンオキシド（－ＣＦＩ２ＣＦＩ２０－所定のＥＯ）のブロックと、ポリプロピレンオキシド（－ＣＨ２ＣＨＣＨ３０－所定のＰＯ）のブロックと、を含むことができる。ＰＯブロックは、２つのＥＯブロックと、ＥＯｘ－ＰＯｙ－Ｅｏｘの配置で隣接することができる。ＰＯ構成成分が親水性であり、ＥＯ構成成分が疎水性であるため、コポリマーの全体的な親水性、分子量及び界面活性剤特性は、ＥＯｘ－ＰＯｙ－Ｅｏｘブロック構造中のｘ及びｙを変化させることによって調整できる。水溶液中では、ＥＯ－ＰＯブロックコポリマーは、ＰＯのコア及び親水性ＥＯ基のコロナを有するミセルに自己組織化する。

一実施形態では、非イオン性界面活性剤はポロキサマーである。ポロキサマーは、２つのポリ（エチレンオキシド）親水性鎖に挟まれた中央のポリ（プロピレンオキシド）疎水性鎖で構成される、非イオン性三元ブロックコポリマーである。ポリマーブロックの長さはカスタマイズすることができ、その結果、わずかに異なる特性を有する、異なるポロキサマーが得られる。

一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー４０７またはポロキサマー４０３である。好ましくは、非イオン性界面活性剤はポロキサマー４０７である。ポロキサマー４０７は、約５６つの反復単位を持つ中央プロピレングリコールブロックと、それぞれ約１０１つの反復単位を含む、隣接する２つの親水性ポリエチレングリコールブロックと、からなる三元ブロックコポリマーからなる親水性非イオン性界面活性剤である。ポロキサマー４０７はまた、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７及びＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ ＰＥ／Ｆ１２７という商標名によっても知られている。

感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０８ｗ／ｖ％～０．４ｗ／ｖ％であり、より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．１ｗ／ｖ％～０．３ｗ／ｖ％であり、最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．２ｗ／ｖ％である。

感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は、０．０８ｗ／ｖ％～０．４ｗ／ｖ％であり、より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は、０．１ｗ／ｖ％～０．３ｗ／ｖ％であり、最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は、０．２ｗ／ｖ％である。

感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は、０．０８ｗ／ｖ％～０．４ｗ／ｖ％であり、より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は、０．１ｗ／ｖ％～０．３ｗ／ｖ％であり、最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は、０．２ｗ／ｖ％である。

本明細書で使用される場合、用語「糖」は、単糖（例えばグルコース、ガラクトース、リボース、マンノース、ラムノース、タロース、キシロース、アロースまたはアラビノース）、二糖（例えばトレハロース、スクロース、マルトース、イソマルトース、セロビオース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース、キシロビオース、マンノビオース、ラクトースまたはフルクトース）、三糖（例えばアカルボース、ラフィノース、メレチトース、パノースまたはセロトリオース）及び糖高分子（例えばデキストラン、キサンタン、プルラン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、セロオリゴ糖、セルロース、マルトオリゴ糖、グリコーゲン、キトサンまたはキチン）を含む。さらに、本明細書で使用される、用語「糖」は、糖アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、アラビトール、エリトリトール、マルチトール、キシリトール、グリシトール、グリコール、ポリグリシトール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びグリセロールも含む。

一実施形態では、糖は非還元糖である。非還元糖は、酸化されることができるアルデヒド基またはケトン基を含有しない。非還元糖の例としては、スクロース及びトレハロースが挙げられる。一実施形態では、糖はトレハロースである。一実施形態では、糖はトレハロース二水和物である。

感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は、１．５ｗ／ｖ％～６ｗ／ｖ％であり、より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は、２ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％であり、最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は、３ｗ／ｖ％である。

感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は、１．５ｗ／ｖ％～６ｗ／ｖ％であり、より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は、２ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％であり、最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は、３ｗ／ｖ％である。

感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は、１．５ｗ／ｖ％～６ｗ／ｖ％であり、より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は、２ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％であり、最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は、３ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０８ｗ／ｖ％～０．４ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は、１．５ｗ／ｖ％～６ｗ／ｖ％である。より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．１ｗ／ｖ％～０．３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は、２ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％である。最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は０．２ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は３ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は、０．０８ｗ／ｖ％～０．４ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は、１．５ｗ／ｖ％～６ｗ／ｖ％である。より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は、０．１ｗ／ｖ％～０．３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は、２ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％である。最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は０．２ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は３ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は、０．０８ｗ／ｖ％～０．４ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は、１．５ｗ／ｖ％～６ｗ／ｖ％である。より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は、０．１ｗ／ｖ％～０．３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は、２ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％である。最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は０．２ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は３ｗ／ｖ％である。

感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物中に存在してもよいタンパク質は、本質的に不活性で、感染性ウイルス粒子と反応しない任意のタンパク質であってよい。とりわけ、タンパク質は、感染性ウイルス粒子の構造または感染力に影響を及ぼさない。一実施形態では、タンパク質は酵素または抗体でない。一実施形態では、タンパク質は構造タンパク質または血清タンパク質である。一実施形態では、タンパク質は、アルブミン、コラーゲン、加水分解コラーゲン、ゼラチン及び加水分解ゼラチンから選択される。

一実施形態では、タンパク質はアルブミンである。アルブミンは、とりわけ脊椎動物の血液中に存在する、球状非グリコシル化タンパク質の系統である。アルブミンは水溶性であり、濃縮食塩水中で適度に可溶性であり、加熱により変性を起こす。本発明の方法にて使用するための好適なアルブミンとしては、哺乳動物の血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン及びウシ血清アルブミンまたはラクトアルブミンが挙げられる。

一実施形態では、タンパク質はヒト血清アルブミンである。血清アルブミンは、脊椎動物血液において最も一般的なタンパク質の１つであり、複数の機能を有する。このタンパク質は、６６，５００Ｄの分子量を有する、５８５つのアミノ酸である。ヒト血清アルブミンはグリコシル化しておらず、単一の遊離チオール基を有する。ヒト血清アルブミンは、組換えヒト血清アルブミンでもよく、またはヒト血清から精製されるヒト血清アルブミンでもよい。好ましくは、ヒト血清から精製されるヒト血清アルブミンが使用される。

感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は、０．０１ｗ／ｖ％～０．０４ｗ／ｖ％であり、より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は、０．０１５ｗ／ｖ％～０．０３ｗ／ｖ％であり、最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は、０．０２ｗ／ｖ％である。

感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は、０．０１ｗ／ｖ％～０．０４ｗ／ｖ％であり、より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は、０．０１５ｗ／ｖ％～０．０３ｗ／ｖ％であり、最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は、０．０２ｗ／ｖ％である。

感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は、０．０１ｗ／ｖ％～０．０４ｗ／ｖ％であり、より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は、０．０１５ｗ／ｖ％～０．０３ｗ／ｖ％であり、最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は、０．０２ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０８ｗ／ｖ％～０．４ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は、０．０１ｗ／ｖ％～０．０４ｗ／ｖ％である。より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．１ｗ／ｖ％～０．３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は、０．０１５ｗ／ｖ％～０．０３ｗ／ｖ％である。最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における、非イオン性界面活性剤の濃度は０．２ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における、タンパク質の濃度は０．０２ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は、０．０８ｗ／ｖ％～０．４ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は、０．０１ｗ／ｖ％～０．０４ｗ／ｖ％である。より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は、０．１ｗ／ｖ％～０．３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は、０．０１５ｗ／ｖ％～０．０３ｗ／ｖ％である。最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は０．２ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は０．０２ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は、０．０８ｗ／ｖ％～０．４ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は、０．０１ｗ／ｖ％～０．０４ｗ／ｖ％である。より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は、０．１ｗ／ｖ％～０．３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は、０．０１５ｗ／ｖ％～０．０３ｗ／ｖ％である。最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は０．２ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は０．０２ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は、１．５ｗ／ｖ％～６ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は、０．０１ｗ／ｖ％～０．０４ｗ／ｖ％である。より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は、２ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は、０．０１５ｗ／ｖ％～０．０３ｗ／ｖ％である。最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は０．０２ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は、１．５ｗ／ｖ％～６ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は、０．０１ｗ／ｖ％～０．０４ｗ／ｖ％である。より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は、２ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は、０．０１５ｗ／ｖ％～０．０３ｗ／ｖ％である。最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は０．０２ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は、１．５ｗ／ｖ％～６ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は、０．０１ｗ／ｖ％～０．０４ｗ／ｖ％である。より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は、２ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は、０．０１５ｗ／ｖ％～０．０３ｗ／ｖ％である。最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は０．０２ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０８ｗ／ｖ％～０．４ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は、１．５ｗ／ｖ％～６ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は、０．０１ｗ／ｖ％～０．０４ｗ／ｖ％である。より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は、０．１ｗ／ｖ％～０．３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は、２ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は、０．０１５ｗ／ｖ％～０．０３ｗ／ｖ％である。最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性界面活性剤の濃度は０．２ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における糖の濃度は、３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるタンパク質の濃度は０．０２ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は、０．０８ｗ／ｖ％～０．４ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は、１．５ｗ／ｖ％～６ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は、０．０１ｗ／ｖ％～０．０４ｗ／ｖ％である。より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は、０．１ｗ／ｖ％～０．３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は、２ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は、０．０１５ｗ／ｖ％～０．０３ｗ／ｖ％である。最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度は、０．２ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物における非還元糖の濃度は、３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるアルブミンの濃度は、０．０２ｗ／ｖ％である。

一実施形態では、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である。好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は、０．０８ｗ／ｖ％～０．４ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は、１．５ｗ／ｖ％～６ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は、０．０１ｗ／ｖ％～０．０４ｗ／ｖ％である。より好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は、０．１ｗ／ｖ％～０．３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は、２ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は、０．０１５ｗ／ｖ％～０．０３ｗ／ｖ％である。最も好ましくは、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるポロキサマー４０７の濃度は０．２ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるトレハロース二水和物の濃度は３ｗ／ｖ％であり、感染性ウイルスの粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料との混合物におけるヒト血清アルブミンの濃度は０．０２ｗ／ｖ％である。

陰イオン交換クロマトグラフィは、試料中の構成成分と固定した官能基の電荷との間の電荷－電荷相互作用に依存する。陰イオン交換クロマトグラフィでは、試料中に存在する結合イオンは陰性であり、固定した官能基は陽性である。大部分のウイルスは、生理的ｐＨでは負に帯電しているため、固定した陽性基に結合する。一般的に用いられる陰イオン交換官能基は、Ｑ樹脂、第四級アミン及びＤＥＡＥ樹脂（ジエチルアミノエタン）である。しかし、一般的に、陰イオン交換クロマトグラフィステップは、すべて一般的な市販の陰イオン交換樹脂または陰イオン交換膜を用いて実施できる。

本発明のために使用可能な、典型的な強い陰イオン交換基としては、例えば、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）部分、第一級アミン（ＰＡ）、第四級アンモニウム（Ｑ）部分及びトリメチルアンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）基などの官能基が挙げられる。

第四級アミノエチル（ＱＡＥ）部分を有する樹脂としては、例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）、Ｓｅｌｅｃｔａｃｅｌ ＱＡＥ（セルロースの第四級アミノエチル誘導体、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ ＵＳＡから入手可能）他が挙げられる。第四級アンモニウム（Ｑ）部分を有する樹脂としては、例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ Ａｃｒｏｄｉｓｃ（Ｐａｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｅｒｍａｆｎｙから入手可能）、Ｍａｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｓｕｐｅｒ Ｑ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｑ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡから入手可能）が挙げられる。トリメチルアンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）基を有する樹脂としては、例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）が挙げられる。第一級アミン基を有する樹脂としては、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ ＳＴＩＣ第一級アミン樹脂（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）が挙げられる。

本発明の方法において、陰イオン交換クロマトグラフィステップは、第四級アンモニウム基を有する陰イオン交換クロマトグラフィ膜を用いて実施されることが好ましい。膜基材は、安定化、強化したセルロース及びポリエーテルスルホンから選択される。好ましくは、膜基材は、安定化、強化したセルロースである。好ましくは、膜基材は安定化、強化したセルロースであり、官能基は第四級アンモニウム基である。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィステップは、一体型支持体の使用を含まない。膜の公称孔径は、０．５μｍ～５μｍであり、好ましくは３μｍより大きい。膜面積は、２０～５０ｃｍ^２であり、好ましくは２５～４５ｃｍ^２、より好ましくは３０～４０ｃｍ^２であり、最も好ましくは３６ｃｍ^２である。流量は、１～５０ｍｌ／分、好ましくは１０～４０ｍｌ／分、より好ましくは３０ｍｌ／分である。最も好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィは、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ＳｉｎｇｌｅＳｔｅｐ膜を使用して実施される。

陰イオン交換クロマトグラフィは、結合及び溶出モード、またはフロースルーモードで実施されてよい。結合及び溶出モードでは、精製される物質は陰イオン交換基に結合し、一方で不純物は結合しない。精製される物質は、１つ以上のクロマトグラフィ条件、例えば緩衝液中の塩の条件、または緩衝液のｐＨなどを変えることで、陰イオン交換基から溶出させることができる。フロースルーモードでは、不純物は陰イオン交換基に結合し、一方で精製される物質は結合しないが、通過液から直接収集することができる。本発明では、陰イオン交換クロマトグラフィは、好ましくはフロースルーモードで実施される。これは、本発明では、宿主細胞ＤＮＡは、陰イオン交換基、好ましくは第四級アンモニウム基に結合し、感染性ウイルス粒子は通過液に存在することを意味する。

本発明の方法は、精製工程の間のウイルス力価の損失を最小限に抑える。一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィ工程の間に失われるウイルス力価は、５％未満である。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィ工程の間に失われるウイルス力価は、４％未満である。より好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィ工程の間に失われるウイルス力価は、３％未満である。最も好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィ工程の間に失われるウイルス力価は、２％または１．５％未満である。

ウイルス力価は、任意の当該技術分野において既知の方法によって決定できる。一実施形態では、ウイルスの力価は、当該技術分野において既知であるイムノフォーカスアッセイ（ｉｍｍｕｎｏ－ｆｏｃｕｓ ａｓｓａｙ）によって決定される。イムノフォーカスアッセイでは、ウイルスの連続的希釈液を、接着細胞、例えばベロ細胞の単層に適用する。感染性ウイルスが細胞に結合し、細胞によって吸収されることが可能となる一定時間後に、ウイルスの拡散を防ぎ、子ウイルスが、最初の感染細胞に隣接した細胞にのみ感染できるように、粘稠剤、例えばアガロースまたはカルボキシメチルセルロースを含有する上層を添加する。ウイルスの複製が可能となるインキュベーション時間の後、細胞を固定して、ウイルスのタンパク質を対象としたモノクローナル抗体、及び二次抗体、例えばアルカリホスファターゼでラベルした抗体を使用して染色する。フォーカスは、二次抗体に付着した酵素用の好適な基質、例えば５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－リン酸／ニトロブルーテトラゾリウムホスファターゼ基質を添加することによって染色する。プレート上のプラーク数は、細胞に適用された溶液中のウイルスの、プラーク形成単位に相当する。例えば、１．０００ｐｆｕ／μｌの濃度は、細胞に適用された１μｌの溶液が、細胞単層において１．０００つのプラークを生成するのに十分なウイルスを含有することを示す。

一部の先行技術の方法では、宿主細胞ＤＮＡは、ＤＮＡを分解できる酵素、例えばエンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼによる処理によって取り除かれる。宿主細胞ＤＮＡ除去のために一般的に使用されるエンドヌクレアーゼは、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅである。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅは、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓからの細胞外エンドヌクレアーゼの改質形態であり、例えばＳｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈまたはＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能である。本発明の方法は、酵素処理なしで宿主細胞ＤＮＡを効率的に取り除くため、本発明の方法は、感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料をヌクレアーゼで処理するステップを含まない。とりわけ、本発明の方法は、感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料をＢｅｎｚｏｎａｓｅで処理するステップを含まない。一実施形態では、本発明の方法は、いかなるエンドヌクレアーゼ処理のステップも含まない。

前に議論したように、感染性ウイルス粒子は、感染性ウイルスに感染させることができる宿主細胞中で調製され、そこでそれらが好適な条件下で維持されるとき、ウイルスを複製する。通常、哺乳動物宿主細胞が使用される。好適な哺乳動物宿主細胞としては、ベロ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞（２９３）、ＲＤ細胞、ＨＴ－１０８０細胞、Ａ５４９細胞、Ｃｏｓ－７細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞及びＭＲＣ－５細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、感染性ウイルス粒子の調製にベロ細胞が使用される。より好ましくは、ベロ細胞は、ＷＨＯ一般細胞バンク１０－８７に由来する。

感染性ウイルス粒子の生成に使用される宿主細胞は、宿主細胞の成長、及び宿主細胞内でのウイルスの複製を可能とする好適な条件下で培養される。一実施形態では、宿主細胞は、感染前に、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を有し、フェノールレッドなしのＤＭＥＭ中で培養される。一実施形態では、宿主細胞は、感染前に３６℃～３８℃の温度で培養される。一実施形態では、宿主細胞は、感染前に、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を有し、フェノールレッドなしのＤＭＥＭ中で、３６℃～３８℃の温度で培養される。

宿主細胞をウイルスに感染させるのに使用する培養液は、感染前に宿主細胞の培養に使用する培養液と異なってもよい。一実施形態では、宿主細胞を感染させるのに使用する培養液は、０．１％のＦ１２７を有するＤＭＥＭであってよい。

ウイルスへの感染の後に宿主細胞の培養に使用する培養液は、感染前に宿主細胞の培養に使用する培養液と異なってもよい。一実施形態では、感染後に宿主細胞の培養に使用する培養液は、０．１％のＦ１２７を有するＤＭＥＭであってよい。

宿主細胞を一定の時間培養した後、感染性ウイルス粒子を含有する細胞上清をハーベストしてもよい。一実施形態では、宿主細胞は４～１０日間培養され、その後、感染性ウイルス粒子を含有する細胞上清がハーベストされる。一実施形態では、感染性ウイルス粒子を含有する細胞上清は、培養の５日目、６日目、７日目、８日目、９日目または１０日目にハーベストされる。一実施形態では、感染性ウイルス粒子を含有する細胞上清を、培養の５日目、６日目、７日目、８日目、９日目及び１０日目にハーベストし、感染性ウイルス粒子を含有する細胞上清を５日目、６日目、７日目、８日目及び９日目にハーベストした後に、次のハーベストまで細胞がウイルス産生を続けることができるように、宿主細胞に新しい培養液を添加する。それぞれの日に得られた感染性ウイルス粒子を含有する細胞上清は、別々に精製されてもよく、またはそれぞれの日に得られた感染性ウイルス粒子を含有する細胞上清は、その他の日に得られた感染性ウイルス粒子を含有する細胞上清と混合され、続いて精製されてもよい。

宿主細胞培養液上清をハーベストした後、それに１回以上の深層ろ過ステップを行う。深層ろ過では、多孔質ろ材を使用して、液体から粒子及び固体を分離する。深層ろ過にて使用されてよいろ材としては、酢酸セルロース、ポリプロピレン、グラスファイバフリースで保護した酢酸セルロース及びポリエーテルスルホンが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、深層ろ過にて使用されるろ材は、ポリエーテルスルホンである。深層ろ過に使用されるフィルターは、０．１μｍ～１μｍ、好ましくは０．２μｍ～０．８μｍ、より好ましくは０．２μｍ～０．４５μｍの孔径を有してもよい。一実施形態では、フィルターは、０．２μｍ及び０．４５μｍの孔径を有する、ポリエーテルスルホンの異種二重層である。このようなフィルターは、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２として市販されている。

深層ろ過ステップの後、ハーベストした感染性ウイルス粒子を含有するろ液を、１種以上の界面活性剤、糖及びタンパク質を含む組成物と混合し、それによって混合物を提供する。一実施形態では、ろ液を、界面活性剤、糖及びタンパク質を含む組成物と混合し、それによって混合物を提供する。界面活性剤、糖及びタンパク質ならびに混合物中のそれらの濃度は、上述したように定義される。界面活性剤、糖及びタンパク質を含む組成物は、ろ液との混合によって希釈される。界面活性剤、糖及びタンパク質を含む組成物は、２倍～１０倍に、好ましくは３倍～８倍に、より好ましくは４倍～６倍に、最も好ましくは５倍に希釈される。希釈後の界面活性剤、糖及びタンパク質の最終的な濃度は、上に提供される。

陰イオン交換クロマトグラフィを行った後、感染性ウイルス粒子を含有する試料に、１回以上のタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）ステップ、好ましくは１回のＴＦＦステップを行う。ＴＦＦステップは、十分な作用強度を確保し、低分子量の不純物を除去するために、試料を濃縮するように作用する。ＴＦＦでは、供給材料の大半は、フィルター内ではなく、フィルターの表面を横切って接線方向に移動する。

ＴＦＦの好適なフィルター材料としては、架橋セルロース及びポリエーテルスルホンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、架橋セルロース系高分子が使用され、これはＨｙｄｒｏｓａｒｔの商品名でＳａｒｔｏｒｉｕｓから入手可能である。タンジェンシャルフローろ過にて使用されるフィルター材料の分離限界粒径によって、ろ液または未透過中に、特定の化合物が存在するかどうかを決定する。分離限界粒径は、精製されるウイルスのサイズの１／３～１／５より小さくてもよい。一実施形態では、分離限界粒径は５０～３００ｋＤａである。好ましくは、分離限界粒径は１００ｋＤａである。一実施形態では、１００ｋＤａの分離限界粒径を有する架橋セルロース系高分子フィルターが、ＴＦＦステップで使用される。したがって、感染性ウイルス粒子は未透過液中に存在する。

ＴＦＦ工程は、流量及び膜貫通圧力によって特徴づけることができる。流量は膜貫通圧力に比例し、膜及びフィルターケーキの抵抗と反比例する。流量は、供給流量／膜の単位面積、すなわちリットル／平方メートル／時（ＬＭＨ）として得られる。本発明のＴＦＦステップでは、流量は１００～５００ＬＭＨ、好ましくは１２０～４００ＬＭＨ、より好ましくは１５０～３００ＬＭＨである。最も好ましくは、流量は３００ＬＭＨである。したがって、本発明の方法のＴＦＦステップは、好ましくは、１００ｋＤａの分離限界粒径を有する架橋セルロース系高分子フィルター、及び３００ＬＭＨの流量を使用して行われる。膜貫通圧力（ＴＭＰ）は、膜を介した両側の差圧である。ＴＭＰは、０．２～０．５バール、好ましくは０．２５～０．４５バール、より好ましくは０．３５～０．４５バール、最も好ましくは０．３５～０．４０バールであってよい。したがって、本発明の方法のＴＦＦステップは、好ましくは１００ｋＤａの分離限界粒径を有する架橋セルロース系高分子フィルター、３００ＬＭＨの流量、及び０．３５～０．４０バールのＴＭＰを使用して行われる。

ＴＦＦに使用されるのは、一般的に、カートリッジフィルター及びカセットフィルターの２つの基本的なフィルター構造である。カートリッジフィルター（中空糸フィルターと呼ばれることが多い）では、膜は、一連の平行な中空糸により形成される。供給流は繊維の流路から通過し、透過液は繊維の外側で収集される。カセットフィルターでは、いくつかの膜の平板が、支持格子によって、互いに及びカセットハウジングから離して保持される。供給流は２つのシート間の空間を通過し、透過液はシートの反対側から収集される。本発明の方法のＴＦＦステップでは、カセットフィルターが使用されるのが好ましい。本発明の一実施形態では、ＴＦＦステップで中空糸フィルターを使用しない。

好ましくは、ＴＦＦステップはダイアフィルトレーションを排除する。また好ましくは、フィルター膜は緩衝液を用いて、１～５回、好ましくは２回フラッシングされる。フラッシングに使用する緩衝液は、非イオン性界面活性剤、非還元糖及びアルブミンを含む。好ましくは、フラッシングに使用する緩衝液は、ポロキサマー４０７、トレハロース二水和物及びヒト血清アルブミンを含む。フラッシングに使用する緩衝液は、０．５～３％の非イオン性界面活性剤、２０～４０％の非還元糖、及び０．０５～０．３％のアルブミンを含む。フラッシングに使用する緩衝液は、０．５～３％のポロキサマー４０７、２０～４０％のトレハロース二水和物、及び０．０５～０．３％のヒト血清アルブミンを含む。フラッシングに使用する緩衝液は、１％の非イオン性界面活性剤、２７％の非還元糖、及び０．１％のアルブミンを含む。フラッシングに使用する緩衝液は、１％のポロキサマー４０７、２７％のトレハロース二水和物、及び０．１％のヒト血清アルブミンを含む。

ＴＦＦステップでは、感染性ウイルス粒子を含有する溶液は、２倍～１０倍、好ましくは３倍～８倍、より好ましくは４倍～６倍、最も好ましくは５倍濃縮される。

ＴＦＦステップを行った後、精製感染性デングウイルスのウイルス粒子を未透過液から回収する。未透過液では、精製感染性ウイルス粒子は溶液中に存在する。精製感染性ウイルス粒子を含有する溶液を、１回以上ろ過してもよい。感染性ウイルス粒子を含有する溶液を、製剤の製造に使用する前に凍結してもよい。

一実施形態では、感染性ウイルス粒子を精製する方法は、製剤を調製するステップ（ｆ）をさらに含む。製剤は、１種を超えるの種類の感染性ウイルス粒子を含有してもよい。例えば、感染性ウイルス粒子が感染性デングウイルス粒子である場合、製剤はデングウイルスの１種を超える血清型を含有してもよい。好ましくは、製剤は、デングウイルスの４種すべての血清型を持つ感染性ウイルス粒子を含有する。それゆえ、この場合、製剤を調製するステップ（ｆ）は、４種のデング血清型を持つ感染性ウイルス粒子の混合を含んでもよい。製剤を調製するステップ（ｆ）はまた、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥による、製剤の乾燥形態の調製を含んでもよい。一実施形態では、製剤を調製するステップ（ｆ）は、４種のデング血清型を持つ感染性ウイルス粒子の混合と、混合物の凍結乾燥と、を含む。弱毒化生ウイルスを含有する混合物を凍結乾燥する方法は、当該技術分野において既知である。

一実施形態では、製剤は、ＴＦＦ未透過液と同じ構成成分を含むため、精製工程の後に、精製工程で使用した化合物を必ずしも除去する必要はない。それゆえ一実施形態では、製剤は、感染性ウイルス粒子、非イオン性界面活性剤、糖及びタンパク質を含む。好ましくは、製剤は、感染性ウイルス粒子、ポロキサマー４０７、トレハロース二水和物及びヒト血清アルブミンを含む。より好ましくは、製剤は、感染性デングウイルス粒子、ポロキサマー４０７、トレハロース二水和物及びヒト血清アルブミンを含む。最も好ましくは、製剤は、４種すべてのデング血清型を持つ感染性デングウイルス粒子、ポロキサマー４０７、トレハロース二水和物及びヒト血清アルブミンを含む。

以下の実施例は、請求項に記載される本発明の特定の態様及び実施形態を実証するために含まれる。しかしながら、以下の記載は例示のみを目的とし、いかなる形であれ本発明を限定するものとして受け取られるべきではないと、当業者によって理解されるべきである。

実施例１：デングウイルス株の調製
キメラデング株ＴＤＶ－１、－３及び－４を生成するのに使用される方法は、標準的な分子クローニング及びＤＮＡエンジニアリング法であり、Ｆｌｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７（２１）：１１４３６－１１４４７に記載されている。以下の周知の方法、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、ＰＣＲ、制限酵素消化、ＤＮＡ断片ライゲーション、エレクトロポレーションによる細菌形質転換、プラスミドＤＮＡ調製、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写、及びエレクトロポレーションによるベロ細胞のトランスフェクションを使用して、デング血清型１型、３型及び４型のｐｒＭ－Ｅ遺伝子を構成し、ＴＤＶ－２主鎖に導入した。異なるデング血清型は、Ｆｌｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬＯＳ Ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ Ｄｉ、７（５）：ｅ２２４３に記載されるように、別々に生育された。

実施例２：デングウイルス株の精製
ベロ細胞上清を、感染後５日目、６日目、７日目、８日目、９日目及び１０日目に収集し、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目に、ベロ細胞に新しい培養液を添加した。各日の採取物を、０．４５＋０．２μｍの孔径及び０．１ｍ^２の膜面積を有するＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルターを用いて清澄化した。

清澄化した採取物を、３％のポロキサマー４０７、４５％のトレハロース二水和物及び０．３％のヒト血清アルブミンを含む溶液（「３ｘ ＦＴＡ」）と混合した。具体的には、３ｘ ＦＴＡの１部を、ＦＴＡの最終的な濃度が０．２ｘ（０．２％のポロキサマー４０７、３％のトレハロース二水和物及び０．０２％のヒト血清アルブミン）であるように、清澄化した採取物の１４部と混合した。基材として安定化、強化されたセルロースを、イオン交換基として第四級アンモニウム基を有するＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ ＳｉｎｇｌｅＳｅｐナノ膜に、混合物を適用した。陰イオン交換クロマトグラフィをフロースルーモードで実施し、通過液を収集した。その後、ＴＦＦステップを、１００ｋＤａの膜分離を有するＦｌｙｄｒｏｓａｒｔ膜を用いて、３００ＬＭＨの供給流量及び０．３５～０．４０バールの膜貫通圧力で実施した。１％のポロキサマー４０７、２７％のトレハロース及び０．１％のＨＳＡを含有する緩衝液で膜を２回フラッシングし、孔径０．４５＋０．２μｍを有するＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルターを通して未透過液をろ過した。この方法で得られた試料を、「０．２ｘＦＴＡ安定化採取物（ＤＭＶ００８－２）」として下記表２に示す。

追実験では、清澄化した採取物をＦＴＡと混合せずに、清澄化した採取物に陰イオン交換クロマトグラフィをすぐに行った。基材として安定化、強化されたセルロースを、イオン交換基として第四級アンモニウム基を有するＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ ＳｉｎｇｌｅＳｅｐナノ膜に、清澄化した採取物を適用した。陰イオン交換クロマトグラフィをフロースルーモードで実施し、通過液を収集し、宿主細胞ＤＮＡ含有量を決定した。この試料を、「清澄化した採取物（ＤＭＶ００５－３）」として下記表２に示す。

宿主細胞ＤＮＡ含有量を、ベロ細胞ＤＮＡに特異的に結合するが、ウイルスの核酸及びＰｉｃｏｇｒｅｅｎ（登録商標）染色剤には結合しないプライマーを使用した、定量ＰＣＲによって決定した。ウイルスの力価を、イムノフォーカスアッセイによって決定した。

表２では、陰イオン交換クロマトグラフィ膜からの通過液が、アッセイの検出限界よりも低い、≦５０ｎｇ／ｍｌの宿主細胞ＤＮＡしか含まないことから分かるように、陰イオン交換クロマトグラフィが、試料中の宿主細胞ＤＮＡ濃度を大きく低下させることが示される。しかしながら、陰イオン交換クロマトグラフィ後のウイルス力価には、使用される供給材料によって大きな差があった。清澄化した採取物を、０．２Ｘ ＦＴＡの最終濃度になるようにＦＴＡと混合せずに、清澄化した採取物に陰イオン交換クロマトグラフィをすぐに行った場合、ウイルス力価の大きな損失、すなわち１．３３ｌｏｇ_１０ＰＦＵの低減が観察された。これに対して、清澄化した採取物を、０．２Ｘ ＦＴＡの最終濃度になるようにＦＴＡと混合し、その後、陰イオン交換クロマトグラフィを実施した場合、ウイルス力価の損失は最小限であった。

本発明の条項一覧

１．感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料から宿主細胞ＤＮＡを取り除く方法であって、
（ｃ）感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む前記試料を、１種以上の非イオン性界面活性剤、糖及びタンパク質を含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
（ｄ）ステップ（ａ）の混合物に陰イオン交換クロマトグラフィを実施するステップと、を含む方法。

２．非イオン性界面活性剤が非イオン性三元ブロックコポリマーである、条項１に記載の方法。

３．非イオン性界面活性剤が、エチレンオキシド・プロピレンオキシド（ＥＯ－ＰＯ）ブロックコポリマーである、条項１または２に記載の方法。

４．非イオン性界面活性剤が、ポロキサマー４０７またはポロキサマー４０３である、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

５．ステップ（ａ）の混合物における非イオン性界面活性剤の濃度が、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％である、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

６．糖が、トレハロース、グルコース、スクロース、フルクトース及びマルトースから選択され、好ましくはトレハロースである、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

７．ステップ（ａ）の混合物における糖の濃度が、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％である、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

８．タンパク質がアルブミンである、好ましくはヒト血清アルブミンである、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

９．ステップ（ａ）の混合物におけるタンパク質の濃度が、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

１０．組成物が、ポロキサマー４０７、トレハロース二水和物及びヒト血清アルブミンを含む、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

１１．ステップ（ａ）の混合物が、０．２ｗ／ｖ％のポロキサマー４０７、３ｗ／ｖ％のトレハロース二水和物、及び０．０２ｗ／ｖ％のヒト血清アルブミンを含む、条項１０に記載の方法。

１２．陰イオン交換クロマトグラフィが、フロースルーモードで操作される、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

１３．陰イオン交換クロマトグラフィが、陰イオン交換クロマトグラフィ膜を使用する、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

１４．陰イオン交換クロマトグラフィ膜が、第四級アンモニウム基を含む、条項１３に記載の方法。

１５．感染性ウイルス粒子が、エンベロープ感染性ウイルス粒子である、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

１６．感染性ウイルス粒子が、感染性フラビウイルスのウイルス粒子である、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

１７．感染性ウイルス粒子が、感染性デングウイルスのウイルス粒子である、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

１８．感染性デングウイルスのウイルス粒子が、感染性弱毒化生デングウイルスのウイルス粒子、または感染性キメラデングウイルスのウイルス粒子である、条項１７に記載の方法。

１９．陰イオン交換クロマトグラフィの間に、ウイルス力価の５％未満が失われる、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

２０．陰イオン交換クロマトグラフィによって、宿主細胞ＤＮＡ含有量が少なくとも１０倍低減される、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

２１．感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料を、エンドヌクレアーゼで処理するステップを含まない、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

２２．感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料から宿主細胞ＤＮＡを取り除く方法であって、
（ａ）感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む前記試料を、１種以上の非イオン性三元ブロックコポリマー、非還元糖及びアルブミンを含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物に陰イオン交換クロマトグラフィを実施するステップと、を含む方法。

２３．感染性デングウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料から宿主細胞ＤＮＡを取り除く方法であって、
（ａ）感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む前記試料を、非イオン性三元ブロックコポリマー、非還元糖及びアルブミンを含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物に陰イオン交換クロマトグラフィを実施するステップと、を含む方法。

２４．非イオン性三元ブロックコポリマーが、エチレンオキシド・プロピレンオキシド（ＥＯ－ＰＯ）ブロックコポリマーである、条項２２または２３に記載の方法。

２５．非イオン性三元ブロックコポリマーが、ポロキサマー４０７またはポロキサマー４０３である、条項２２から２４のいずれか１項に記載の方法。

２６．ステップ（ａ）の混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度が、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％である、条項２２から２５のいずれか１項に記載の方法。

２７．非還元糖がトレハロースである、条項２２から２６のいずれか１項に記載の方法。

２８．ステップ（ａ）の混合物における非還元糖の濃度が、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％である、条項２２から２７のいずれか１項に記載の方法。

２９．アルブミンがヒト血清アルブミンである、条項２２から２８のいずれか１項に記載の方法。

３０．ステップ（ａ）の混合物におけるアルブミンの濃度が、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である、条項２２から２９のいずれか１項に記載の方法。

３１．組成物が、ポロキサマー４０７、トレハロース二水和物及びヒト血清アルブミンを含む、条項２２から３０のいずれか１項に記載の方法。

３２．ステップ（ａ）の混合物が、０．２ｗ／ｖ％のポロキサマー４０７、３ｗ／ｖ％のトレハロース二水和物、及び０．０２ｗ／ｖ％のヒト血清アルブミンを含む、条項３１に記載の方法。

３３．陰イオン交換クロマトグラフィが、フロースルーモードで操作される、条項２２から３２のいずれか１項に記載の方法。

３４．陰イオン交換クロマトグラフィが、陰イオン交換クロマトグラフィ膜を使用する、条項２２から３３のいずれか１項に記載の方法。

３５．陰イオン交換クロマトグラフィ膜が、第四級アンモニウム基を含む、条項３４に記載の方法。

３６．感染性デングウイルスのウイルス粒子が、感染性弱毒化生デングウイルスのウイルス粒子、または感染性キメラデングウイルスのウイルス粒子である、条項２２から３５のいずれか１項に記載の方法。

３７．陰イオン交換クロマトグラフィの間に、ウイルス力価の５％未満が失われる、条項２２から３６のいずれか１項に記載の方法。

３８．陰イオン交換クロマトグラフィによって、宿主細胞ＤＮＡ含有量が少なくとも１０倍低減される、条項２２から３７のいずれか１項に記載の方法。

３９．感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料を、エンドヌクレアーゼで処理するステップを含まない、条項２２から３８のいずれか１項に記載の方法。

４０．感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料から宿主細胞ＤＮＡを取り除く方法であって、
（ａ）感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む前記試料を、０．２ｗ／ｖ％のポロキサマー４０７、３ｗ／ｖ％のトレハロース二水和物及び０．０２ｗ／ｖ％のヒト血清アルブミンを含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物に陰イオン交換クロマトグラフィを実施するステップと、を含む方法。

４１．陰イオン交換クロマトグラフィが、フロースルーモードで操作される、条項４０に記載の方法。

４２．陰イオン交換クロマトグラフィが、陰イオン交換クロマトグラフィ膜を使用する、条項４０または４１に記載の方法。

４３．陰イオン交換クロマトグラフィ膜が、第四級アンモニウム基を含む、条項４２に記載の方法。

４４．感染性デングウイルスのウイルス粒子が、感染性弱毒化生デングウイルスのウイルス粒子、または感染性キメラデングウイルスのウイルス粒子である、条項４０から４３のいずれか１項に記載の方法。

４５．陰イオン交換クロマトグラフィの間に、ウイルス力価の５％未満が失われる、条項４０から４４のいずれか１項に記載の方法。

４６．陰イオン交換クロマトグラフィによって、宿主細胞ＤＮＡ含有量が少なくとも１０倍低減される、条項４０から４５のいずれか１項に記載の方法。

４７．感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料を、エンドヌクレアーゼで処理するステップを含まない、条項４０から４６のいずれか１項に記載の方法。

４８．感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料から宿主細胞ＤＮＡを取り除く方法であって、
（ａ）感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む前記試料を、非イオン性三元ブロックコポリマー、非還元糖及びアルブミンを含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物に、第四級アンモニウム基を含む陰イオン交換膜を使用して、フロースルーモードで陰イオン交換クロマトグラフィを行うステップと、を含む方法。

４９．非イオン性三元ブロックコポリマーが、エチレンオキシド・プロピレンオキシド（ＥＯ－ＰＯ）ブロックコポリマーである、条項４８に記載の方法。

５０．非イオン性三元ブロックコポリマーが、ポロキサマー４０７またはポロキサマー４０３である、条項４８または４９に記載の方法。

５１．ステップ（ａ）の混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度が、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％である、条項４８から５０のいずれか１項に記載の方法。

５２．非還元糖がトレハロースである、条項４８から５１のいずれか１項に記載の方法。

５３．ステップ（ａ）の混合物における非還元糖の濃度が、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％である、条項４８から５２のいずれか１項に記載の方法。

５４．アルブミンがヒト血清アルブミンである、条項４８から５３のいずれか１項に記載の方法。

５５．ステップ（ａ）の混合物におけるアルブミンの濃度が、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である、条項４８から５４のいずれか１項に記載の方法。

５６．組成物が、ポロキサマー４０７、トレハロース二水和物及びヒト血清アルブミンを含む、条項４８から５５のいずれか１項に記載の方法。

５７．ステップ（ａ）の混合物が、０．２ｗ／ｖ％のポロキサマー４０７、３ｗ／ｖ％のトレハロース二水和物、及び０．０２ｗ／ｖ％のヒト血清アルブミンを含む、条項５６に記載の方法。

５８．感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料から宿主細胞ＤＮＡを取り除く方法であって、
（ａ）感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む前記試料を、０．２ｗ／ｖ％のポロキサマー４０７、３ｗ／ｖ％のトレハロース二水和物及び０．０２ｗ／ｖ％のヒト血清アルブミンを含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の混合物に、第四級アンモニウム基を含む陰イオン交換膜を使用して、フロースルーモードで陰イオン交換クロマトグラフィを行うステップと、を含む方法。

５９．宿主細胞培養液から、感染性デングウイルスのウイルス粒子を精製する方法であって、
（ａ）前記宿主細胞培養液から、感染性デングウイルスのウイルス粒子を含有する宿主細胞培養液上清をハーベストするステップと、
（ｂ）ハーベストした感染性デングウイルスのウイルス粒子を、１種以上の非イオン性三元ブロックコポリマー、非還元糖及びアルブミンを含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物に、１回以上の陰イオン交換クロマトグラフィステップを実施し、通過液を収集するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの通過液にタンジェンシャルフローろ過を実施し、未透過液を収集するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の未透過液から精製感染性デングウイルスのウイルス粒子を回収するステップと、を含む方法。

６０．宿主細胞培養液から、感染性デングウイルスのウイルス粒子を精製する方法であって、
（ａ）前記宿主細胞培養液から、感染性デングウイルスのウイルス粒子を含有する宿主細胞培養液上清をハーベストするステップと、
（ｂ）ハーベストした感染性デングウイルスのウイルス粒子を、非イオン性三元ブロックコポリマー、非還元糖及びアルブミンを含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物に、１回以上の陰イオン交換クロマトグラフィステップを実施し、通過液を収集するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの通過液にタンジェンシャルフローろ過を実施し、未透過液を収集するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の未透過液から精製感染性デングウイルスのウイルス粒子を回収するステップと、を含む方法。

６１．非イオン性三元ブロックコポリマーが、エチレンオキシド・プロピレンオキシド（ＥＯ－ＰＯ）ブロックコポリマーである、条項５９または６０に記載の方法。

６２．非イオン性三元ブロックコポリマーが、ポロキサマー４０７またはポロキサマー４０３である、条項５９から６１のいずれか１項に記載の方法。

６３．ステップ（ａ）の混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度が、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％である、条項５９から６２のいずれか１項に記載の方法。

６４．非還元糖がトレハロースである、条項５９から６３のいずれか１項に記載の方法。

６５．ステップ（ａ）の混合物における非還元糖の濃度が、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％である、条項５９から６４のいずれか１項に記載の方法。

６６．アルブミンがヒト血清アルブミンである、条項５９から６５のいずれか１項に記載の方法。

６７．ステップ（ａ）の混合物におけるアルブミンの濃度が、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である、条項５９から６６のいずれか１項に記載の方法。

６８．組成物が、ポロキサマー４０７、トレハロース及びヒト血清アルブミンを含む、条項５９から６７のいずれか１項に記載の方法。

６９．組成物が、０．２ｗ／ｖ％のポロキサマー４０７、３ｗ／ｖ％のトレハロース二水和物、及び０．０２ｗ／ｖ％のヒト血清アルブミンを含む、条項６８に記載の方法。

７０．陰イオン交換クロマトグラフィが、陰イオン交換クロマトグラフィ膜を使用する、条項５９から６９のいずれか１項に記載の方法。

７１．陰イオン交換クロマトグラフィ膜が、第四級アンモニウム基を含む、条項７０に記載の方法。

７２．感染性デングウイルスのウイルス粒子が、感染性弱毒化生デングウイルスのウイルス粒子、または感染性キメラデングウイルスのウイルス粒子である、条項５９から７１のいずれか１項に記載の方法。

７３．感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料を、エンドヌクレアーゼで処理するステップを含まない、条項５９から７２のいずれか１項に記載の方法。

７４．宿主細胞培養液がベロ細胞培養液である、条項５９から７３のいずれか１項に記載の方法。

７５．感染性デングウイルスのウイルス粒子を含む宿主細胞培養液上清をハーベストした後に、深層ろ過を実施する、条項５９から７４のいずれか１項に記載の方法。

７６．深層ろ過が、０．４５μｍ及び０．２μｍのフィルターを介するものである、条項７５に記載の方法。

７７．タンジェンシャルフローろ過が、１つ以上のＴＦＦ膜カセットを介したろ過を含む、条項５９から７６のいずれか１項に記載の方法。

７８．１つ以上のＴＦＦ膜カセットがセルロースろ材を含む、条項７７に記載の方法。

７９．宿主細胞培養液から、感染性デングウイルスのウイルス粒子を精製する方法であって、
（ａ）前記宿主細胞培養液から、感染性デングウイルスのウイルス粒子を含有する宿主細胞培養液上清をハーベストするステップと、
（ｂ）ハーベストした感染性デングウイルスのウイルス粒子を、０．２ｗ／ｖ％のポロキサマー４０７、３ｗ／ｖ％のトレハロース二水和物、及び０．０２ｗ／ｖ％のヒト血清アルブミンを含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物に、１回以上の陰イオン交換クロマトグラフィステップを実施し、通過液を収集するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの通過液にタンジェンシャルフローろ過を実施し、未透過液を収集するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の未透過液から精製感染性デングウイルスのウイルス粒子を回収するステップと、を含む方法。

８０．陰イオン交換クロマトグラフィが、陰イオン交換クロマトグラフィ膜を使用する、条項７９に記載の方法。

８１．陰イオン交換クロマトグラフィ膜が、第四級アンモニウム基を含む、条項８０に記載の方法。

８２．感染性デングウイルスのウイルス粒子が、感染性弱毒化生デングウイルスのウイルス粒子、または感染性キメラデングウイルスのウイルス粒子である、条項７９から８１のいずれか１項に記載の方法。

８３．感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料を、エンドヌクレアーゼで処理するステップを含まない、条項７９から８２のいずれか１項に記載の方法。

８４．宿主細胞培養液がベロ細胞培養液である、条項７９から８３のいずれか１項に記載の方法。

８５．感染性デングウイルスのウイルス粒子を含む宿主細胞培養液上清をハーベストした後に、深層ろ過を実施する、条項７９から８４のいずれか１項に記載の方法。

８６．深層ろ過が、０．４５μｍ及び０．２μｍのフィルターを介するものである、条項８５に記載の方法。

８７．タンジェンシャルフローろ過が、１つ以上のＴＦＦ膜カセットを介したろ過を含む、条項７９から８６のいずれか１項に記載の方法。

８８．１つ以上のＴＦＦ膜カセットがセルロースろ材を含む、条項８７に記載の方法。

８９．宿主細胞培養液から、感染性デングウイルスのウイルス粒子を精製する方法であって、
（ａ）前記宿主細胞培養液から、感染性デングウイルスのウイルス粒子を含有する宿主細胞培養液上清をハーベストするステップと、
（ｂ）ハーベストした感染性デングウイルスのウイルス粒子を、非イオン性三元ブロックコポリマー、非還元糖及びアルブミンを含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物に、第四級アンモニウム基を含む陰イオン交換膜を使用して、フロースルーモードで、１回以上の陰イオン交換クロマトグラフィステップを行い、通過液を収集するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの通過液にタンジェンシャルフローろ過を実施し、未透過液を収集するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の未透過液から精製感染性デングウイルスのウイルス粒子を回収するステップと、を含む方法。

９０．非イオン性三元ブロックコポリマーが、エチレンオキシド・プロピレンオキシド（ＥＯ－ＰＯ）ブロックコポリマーである、条項８９に記載の方法。

９１．非イオン性三元ブロックコポリマーが、ポロキサマー４０７またはポロキサマー４０３である、条項８９または９０に記載の方法。

９２．ステップ（ａ）の混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度が、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％である、条項８９から９１のいずれか１項に記載の方法。

９３．非還元糖がトレハロースである、条項８９から９２のいずれか１項に記載の方法。

９４．ステップ（ａ）の混合物における非還元糖の濃度が、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％である、条項８９から９３のいずれか１項に記載の方法。

９５．アルブミンがヒト血清アルブミンである、条項８９から９４のいずれか１項に記載の方法。

９６．ステップ（ａ）の混合物におけるアルブミンの濃度が、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である、条項８９から９５のいずれか１項に記載の方法。

９７．組成物が、ポロキサマー４０７、トレハロース及びヒト血清アルブミンを含む、条項８９から９６のいずれか１項に記載の方法。

９８．組成物が、０．２ｗ／ｖ％のポロキサマー４０７、３ｗ／ｖ％のトレハロース二水和物、及び０．０２ｗ／ｖ％のヒト血清アルブミンを含む、条項９７に記載の方法。

９９．感染性デングウイルスのウイルス粒子が、感染性弱毒化生デングウイルスのウイルス粒子、または感染性キメラデングウイルスのウイルス粒子である、条項８９から９８のいずれか１項に記載の方法。

１００．感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料を、エンドヌクレアーゼで処理するステップを含まない、条項８９から９９のいずれか１項に記載の方法。

１０１．宿主細胞培養液がベロ細胞培養液である、条項８９から１００のいずれか１項に記載の方法。

１０２．感染性デングウイルスのウイルス粒子を含む宿主細胞培養液上清をハーベストした後に、深層ろ過を実施する、条項８９から１０１のいずれか１項に記載の方法。

１０３．深層ろ過が、０．４５μｍ及び０．２μｍのフィルターを介するものである、条項１０２に記載の方法。

１０４．タンジェンシャルフローろ過が、１つ以上のＴＦＦ膜カセットを介したろ過を含む、条項８９から１０３のいずれか１項に記載の方法。

１０５．１つ以上のＴＦＦ膜カセットがセルロースろ材を含む、条項１０４に記載の方法。

１０６．宿主ベロ細胞培養液から、感染性デングウイルスのウイルス粒子を精製する方法であって、
（ａ）前記宿主ベロ細胞培養液から、感染性デングウイルスのウイルス粒子を含有する宿主ベロ細胞培養上清をハーベストするステップと、
（ｂ）ハーベストした感染性デングウイルスのウイルス粒子を、非イオン性三元ブロックコポリマー、非還元糖及びアルブミンを含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物に、第四級アンモニウム基を含む陰イオン交換膜を使用して、フロースルーモードで、１回以上の陰イオン交換クロマトグラフィステップを行い、通過液を収集するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの通過液に、セルロースろ材を含む１つ以上のＴＦＦ膜カセットを介したタンジェンシャルフローろ過を行い、未透過液を収集するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の未透過液から精製感染性デングウイルスのウイルス粒子を回収するステップと、を含む方法。

１０７．非イオン性三元ブロックコポリマーが、エチレンオキシド・プロピレンオキシド（ＥＯ－ＰＯ）ブロックコポリマーである、条項１０６に記載の方法。

１０８．非イオン性三元ブロックコポリマーが、ポロキサマー４０７またはポロキサマー４０３である、条項１０６または１０７に記載の方法。

１０９．ステップ（ａ）の混合物における非イオン性三元ブロックコポリマーの濃度が、０．０５ｗ／ｖ％～０．５ｗ／ｖ％である、条項１０６から１０８のいずれか１項に記載の方法。

１１０．非還元糖がトレハロースである、条項１０６から１０９のいずれか１項に記載の方法。

１１１．ステップ（ａ）の混合物における非還元糖の濃度が、１ｗ／ｖ％～７．５ｗ／ｖ％である、条項１０６から１１０のいずれか１項に記載の方法。

１１２．アルブミンがヒト血清アルブミンである、条項１０６から１１１のいずれか１項に記載の方法。

１１３．ステップ（ａ）の混合物におけるアルブミンの濃度が、０．００５ｗ／ｖ％～０．０５ｗ／ｖ％である、条項１０６から１１２のいずれか１項に記載の方法。

１１４．組成物が、ポロキサマー４０７、トレハロース及びヒト血清アルブミンを含む、条項１０６から１１３のいずれか１項に記載の方法。

１１５．組成物が、０．２ｗ／ｖ％のポロキサマー４０７、３ｗ／ｖ％のトレハロース二水和物、及び０．０２ｗ／ｖ％のヒト血清アルブミンを含む、条項１１４に記載の方法。

１１６．感染性デングウイルスのウイルス粒子が、感染性弱毒化生デングウイルスのウイルス粒子、または感染性キメラデングウイルスのウイルス粒子である、条項１０６から１１５のいずれか１項に記載の方法。

１１７．感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料を、エンドヌクレアーゼで処理するステップを含まない、条項１０６から１１６のいずれか１項に記載の方法。

１１８．感染性デングウイルスのウイルス粒子を含む宿主細胞培養液上清をハーベストした後に、深層ろ過を実施する、条項１０６から１１７のいずれか１項に記載の方法。

１１９．深層ろ過が、０．４５μｍ及び０．２μｍのフィルターを介するものである、条項１１８に記載の方法。

１２０．宿主ベロ細胞培養液から、感染性デングウイルスのウイルス粒子を精製する方法であって、
（ａ）前記宿主ベロ細胞培養液から、感染性デングウイルスのウイルス粒子を含有する宿主ベロ細胞培養上清をハーベストするステップと、
（ｂ）ハーベストした感染性デングウイルスのウイルス粒子を、０．２ｗ／ｖ％のポロキサマー４０７、３ｗ／ｖ％のトレハロース二水和物、及び０．０２ｗ／ｖ％のヒト血清アルブミンを含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物に、第四級アンモニウム基を含む陰イオン交換膜を使用して、フロースルーモードで、１回以上の陰イオン交換クロマトグラフィステップを行い、通過液を収集するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの通過液に、セルロースろ材を含む１つ以上のＴＦＦ膜カセットを介したタンジェンシャルフローろ過を行い、未透過液を収集するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の未透過液から精製感染性デングウイルスのウイルス粒子を回収するステップと、を含む方法。

１２１．感染性デングウイルスのウイルス粒子が、感染性弱毒化生デングウイルスのウイルス粒子、または感染性キメラデングウイルスのウイルス粒子である、条項１２０に記載の方法。

１２２．感染性デングウイルスのウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料を、エンドヌクレアーゼで処理するステップを含まない、条項１２０または１２１に記載の方法。

１２３．感染性デングウイルスのウイルス粒子を含む宿主細胞培養液上清をハーベストした後に、深層ろ過を実施する、条項１２０から１２２のいずれか１項に記載の方法。

１２４．深層ろ過が、０．４５μｍ及び０．２μｍのフィルターを介するものである、条項１２３に記載の方法。

Claims (18)

1. 感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む試料から宿主細胞ＤＮＡを取り除く方法であって、
   （ａ）感染性ウイルス粒子及び宿主細胞ＤＮＡを含む前記試料を、１種以上の非イオン性界面活性剤、糖及びタンパク質を含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
   （ｂ）ステップ（ａ）の前記混合物に陰イオン交換クロマトグラフィを実施するステップと、を含む前記方法。
2. 前記非イオン性界面活性剤が、ポロキサマー４０７またはポロキサマー４０３である、請求項１に記載の方法。
3. 前記糖が、トレハロース、グルコース、スクロース、フルクトース及びマルトースから選択され、好ましくはトレハロースである、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記タンパク質がアルブミンである、好ましくはヒト血清アルブミンである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記組成物が、ポロキサマー４０７、トレハロース二水和物及びヒト血清アルブミンを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記陰イオン交換クロマトグラフィが、フロースルーモードで操作される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記陰イオン交換クロマトグラフィが、陰イオン交換クロマトグラフィ膜を使用する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記感染性ウイルス粒子が、感染性デングウイルスのウイルス粒子である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
9. 宿主細胞培養液から、感染性ウイルス粒子を精製する方法であって、
   （ａ）前記宿主細胞培養液から、感染性ウイルス粒子を含有する前記宿主細胞培養液上清をハーベストするステップと、
   （ｂ）前記ハーベストした感染性ウイルス粒子を、１種以上の非イオン性界面活性剤、糖及びタンパク質を含む組成物と混合し、それによって混合物を提供するステップと、
   （ｃ）ステップ（ｂ）の前記混合物に、１回以上の陰イオン交換クロマトグラフィステップを実施し、通過液を収集するステップと、
   （ｄ）ステップ（ｃ）からの前記通過液にタンジェンシャルフローろ過を実施し、未透過液を収集するステップと、
   （ｅ）ステップ（ｄ）の前記未透過液から精製感染性ウイルス粒子を回収するステップと、を含む前記方法。
10. 前記非イオン性界面活性剤が、ポロキサマー４０７またはポロキサマー４０３である、請求項９に記載の方法。
11. 前記糖が、トレハロース、グルコース、スクロース、フルクトース及びマルトースから選択され、好ましくはトレハロースである、請求項９または１０に記載の方法。
12. 前記タンパク質がアルブミンである、好ましくはヒト血清アルブミンである、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記組成物が、ポロキサマー４０７、トレハロース及びヒト血清アルブミンを含む、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記陰イオン交換クロマトグラフィが、陰イオン交換クロマトグラフィ膜を使用する、請求項９～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記感染性ウイルス粒子が、感染性デングウイルスのウイルス粒子である、請求項９～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記宿主細胞培養液がベロ細胞培養液である、請求項９～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記感染性ウイルス粒子を含む前記宿主細胞培養液上清をハーベストした後に、深層ろ過を実施する、請求項９～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記タンジェンシャルフローろ過が、１つ以上のＴＦＦ膜カセットを介したろ過を含む、請求項９～１７のいずれか１項に記載の方法。