JP2016513469A5 - - Google Patents
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Claims (17)
- 非胚性組織から非胚性幹細胞を単離するための方法であって:
(1)(a)ノッチ(Notch)アゴニスト;
(b)ROCK(Rhoキナーゼ)阻害剤;
(c)骨形成タンパク質(BMP)アンタゴニスト;
(d)Wntアゴニスト;
(e)マイトジェニック増殖因子;及び、
(f)インスリン又はIGF;
を含む培地であって、
(g)TGFβ受容体阻害剤;及び
(h)ニコチンアミド又はその類似体;
の少なくとも1つを任意にさらに含んでもよい培地において、前記非胚性組織より解離した上皮細胞を、致死照射されたフィーダー細胞の第一集団および基底膜マトリックスと接触させて培養して、上皮細胞クローンを生成する工程と、
(2)前記上皮細胞クローンから単一細胞を単離する工程と、
(3)工程(2)からの単離された単一細胞を、前記培地において致死照射フィーダー細胞の第二集団および第二の基底膜マトリックスと接触させて個別に培養して、単一細胞クローンを生成する工程と、を含み、
ここで、前記単一細胞クローンのそれぞれは、前記非胚性幹細胞のクローン増殖物であり、それで前記非胚性幹細胞を単離する、前記方法。 - 前記非胚性組織が立方又は円柱上皮組織(好ましくは、成体の立方又は円柱上皮組織)である、請求項1に記載の方法。
- 前記非胚性幹細胞が成体幹細胞(p63を発現しない成体幹細胞のような)である、または、成体肺組織から単離された成体肺幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記単一細胞クローンから単一の非胚性幹細胞を単離する工程をさらに含む、または、前記単一細胞クローンの1つを培養して、前記非胚性幹細胞の系統の細胞系を産生する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記非胚性組織が、成体組織、胎児組織、もしくは哺乳動物組織(例、ヒト組織)である;または、肺、食道、胃、小腸、結腸、腸上皮化生、輸卵管、腎臓、膵臓、膀胱、又は肝臓、又はその一部/切片より入手されるか又はそれらに起源がある;請求項1に記載の方法。
- 前記非胚性組織が、疾患組織、障害組織、異常状態組織、又は前記疾患、障害、又は異常状態を有する患者からの組織である、請求項1に記載の方法。
- 工程(1)において、(上皮)細胞が前記非胚性組織から酵素での酵素消化により解離される、ここで当該酵素は所望によりコラゲナーゼ、プロテアーゼ、ディスパーゼ、プロナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、アキュターゼ(accutase)及び/又はトリプシンを含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(1)において、(上皮)細胞が、前記非胚性組織から、前記(上皮)細胞の周囲にある細胞外マトリックスを溶かすことによって解離される、請求項1に記載の方法。
- 前記フィーダー細胞が(フィーダー細胞層を形成する)3T3−J2細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記基底膜マトリックスがラミニン含有基底膜マトリックス(例、MATRIGELTM基底膜マトリックス(BD Biosciences))であり、好ましくは、増殖因子低下型である;所望により、前記基底膜マトリックスが、3次元成長を支持しないし、3次元成長を支持するのに必要な3次元マトリックスも形成しない、請求項1に記載の方法。
- (1)前記培地が、熱不活性化されない10% FBSをさらに含む;
(2)前記ノッチアゴニストがジャギド−1(Jagged-1)を含む;
(3)前記ROCK阻害剤が、Rhoキナーゼ阻害剤VI(Y−27632、(R)−(+)−trans−N−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド))、ファスジル(Fasudil)又はHA1071(5−(1,4−ジアゼパン−1−イルスルホニル)イソキノリン)、又はH1152((S)−(+)−2−メチル−1−[(4−メチル−5−イソキノリニル)スルホニル]−ヘキサヒドロ−1H−1,4−ジアゼピン二塩酸塩)を含む;
(4)前記BMPアンタゴニストが、ノギン(Noggin)、DAN、DANシスチンノットドメインを含むDAN様タンパク質(例、ケルベロス(Cerberus)及びグレムリン(Gremlin))、コーディン(Chordin)、コーディンドメインを含むコーディン様タンパク質、フォリスタチン(Follistatin)、フォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質、スクレロスチン/SOST、デコリン、又はα−2マクログロブリンを含む;
(5)前記Wntアゴニストが、R−スポンジン1、R−スポンジン2、R−スポンジン3、R−スポンジン4、R−スポンジン模倣体、Wntファミリータンパク質(例、Wnt−3a、Wnt5、Wnt−6a)、ノルリン(Norrin)、又はGSK阻害剤(例、CHIR99021)を含む;
(6)前記マイトジェニック増殖因子がEGF(及び/又は角化細胞増殖因子、TGFα、BDNF、HGF、bFGF)を含む;
(7)前記TGFβ受容体阻害剤が、SB431542(4−(4−(ベンゾ[d][1,3]ジオキソール−5−イル)−5−(ピリジン−2−イル)−1H−イミダゾール−2−イル)ベンズアミド)、A83−01、SB−505124、SB−525334、LY364947、SD−208、又はSJN2511を含む;または
(8)前記培地が、以下:Wnt3a、p38阻害剤(例えば、SB−202190、SB203580、VX−702、VX−745、PD−169316、RO−4402257およびBIRB−796)、N−アセチル−L−システイン、ガストリン、HGF、テストステロン(例えば、(ジヒドロ)テストステロン)、N2、B27、およびPGE2、の少なくとも1つを欠く;
請求項1に記載の方法。 - 前記TGFβ(シグナル伝達)阻害剤が、ALK5、ALK4、TGF−β受容体キナーゼ1、及びALK7からなる群より選択される1又はそれ以上のセリン/スレオニンタンパク質キナーゼへ結合してその活性を低下させる;所望により、前記TGFβ(シグナル伝達)阻害剤が、1nMと100μΜの間、10nMと100μΜの間、100nMと10μΜの間、又は概ね1μΜの濃度で加えられる、請求項1に記載の方法。
- 前記培地が、DMEM:F12が3:1の培地中、5μg/mL インスリン;2nMの(3,3’,5−トリヨード−L−チロニン);400ng/mL ヒドロコーチゾン;24.3μg/mL アデニン;10ng/mL EGF;10%ウシ胎仔血清(熱不活性化無し);1μM ジャギド−1;100ng/mL ノギン;125ng/mL R−スポンジン1;2.5μM Y−27632;及び1.35mM L−グルタミンを含み、所望により0.1nM コレラ腸管毒素をさらに含み;所望により、前記培地は(1)2μM SB431542、(2)10mM ニコチンアミド、または(3)2μM SB431542と10mMニコチンアミドをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- (1)前記非胚性組織が成体小腸であって、前記培地が10mM ニコチンアミドをさらに含む;
(2)前記非胚性組織が成体小腸であって、前記培地が2μM SB431542と10mMニコチンアミドをさらに含む;
(3)前記非胚性組織が成体小腸であって、前記培地が(1)2μM SB431542と、ガストリン(Gastrin)、PGE2、Wnt3aの1つ;又は(2)10mM ニコチンアミドとGSK3阻害剤;をさらに含む;
(4)前記非胚性組織が胎児小腸であって、前記培地が10mMニコチンアミドをさらに含む;または
(5)前記非胚性組織が胎児小腸であって、前記培地が、FGF受容体阻害剤;N−アセチル−L−システイン;p38阻害剤(例、SB−202190、SB−203580、VX−702、VX−745、PD−169316、RO−4402257、及びBIRB−796);ガストリン;PGE2;FGF受容体阻害剤;Shh;TGFβ;10mMニコチンアミドとTGFβ;10mMニコチンアミドとWnt3a;10mMニコチンアミドとGSK3阻害剤;又は10mMニコチンアミドと2μM SB431542;をさらに含む;
請求項13に記載の方法。 - (1)単一細胞として単離される時に、各々の前記単一細胞クローンの内の少なくとも約40%、50%、60%、70%、又は約80%の細胞が単一細胞クローンとして増殖可能である;
(2)前記非胚性幹細胞が、単一細胞として単離される場合に、約50世代より多く、約70世代より多く、約100世代より多く、約150世代より多く、約200世代より多く、約250世代より多く、約300世代より多く、約350世代より多く、又は約400又はこれ以上の世代の自己複製が可能である;
(3)前記非胚性幹細胞が前記非胚性組織の分化細胞種へ分化することが可能である;
(4)前記非胚性幹細胞が小腸幹細胞であって、(1)MUC又はPAS(杯細胞マーカー)、CHGA(神経内分泌細胞マーカー)、LYZ(パネート(Paneth)細胞マーカー)、MUC7、MUC13、及びKRT20より選択されるマーカーを発現する;及び/又は(2)水と栄養素を吸収する(分化腸細胞によるなど)、粘液を分泌する(分化杯細胞によるなど)、腸管ホルモンを分泌する(分化腸内分泌細胞によるなど)、又は抗菌物質を分泌する(分化パネート細胞によるなど)分化小腸細胞へ分化することが可能である;
(5)前記非胚性幹細胞が、SOX9、KRT19、KRT7、LGR5、CA9、FXYD2、CDH6、CLDN18、TSPAN8、BPIFB1、OLFM4、CDH17、及びPPARGC1Aより選択される1又はそれ以上の幹細胞マーカーを発現する;
(6)前記非胚性幹細胞が小腸幹細胞であって、OLFM4、SOX9、LGR5、CLDN18、CA9、BPIFB1、KRT19、CDH17、及びTSPAN8より選択される1以上のマーカーを発現する;
(7)前記非胚性幹細胞が前記非胚性組織における分化細胞種に関連したマーカー(複数)の発現を実質的に欠いている;
(8)前記非胚性幹細胞が小腸幹細胞であって、MUC又はPAS(杯細胞マーカー)、CHGA(神経内分泌細胞マーカー)、LYZ(パネート細胞マーカー)、MUC7、MUC13、及びKRT20より選択される、分化小腸細胞に関連したマーカーの発現を欠いている;または
(9)前記非胚性幹細胞が、核細胞質比が高い小円形細胞形状を特徴とする未熟な未分化形態を有する;
請求項1に記載の方法。 - 請求項1の方法に従って単離される非胚性幹細胞であって、
(a)ここで当該非胚性幹細胞は所望により、立方又は円柱上皮組織(好ましくは、成体立方又は円柱上皮組織)から単離される;
(b)ここで当該非胚性幹細胞は所望により、p63を発現しない成体幹細胞である;または
(c)ここで当該非胚性幹細胞は所望により、肺、食道、胃、小腸、結腸、腸上皮化生、輸卵管、腎臓、膵臓、膀胱、又は肝臓、又はその一部/切片から単離される;
前記非胚性幹細胞。 - 非胚性幹細胞の単一細胞クローンであって、
(a)ここで前記単一細胞クローン内の少なくとも約40%、50%、60%、70%、又は約80%の細胞は、単一細胞として単離された場合に、増殖して単一細胞クローンを産生可能である;
(b)ここで前記非胚性幹細胞は、単一細胞として単離された場合に、約50世代より多く、約70世代より多く、約100世代より多く、約150世代より多く、約200世代より多く、約250世代より多く、約300世代より多く、約350世代より多く、又は約400以上の世代の自己複製が可能である;
(c)ここで前記非胚性幹細胞は、前記非胚性幹細胞を単離する非胚性組織の分化細胞種へ分化することが可能であるか又は前記非胚性幹細胞が存在する非胚性組織の分化細胞種へ分化することが可能である;
(d)ここで前記非胚性幹細胞は、SOX9、KRT19、KRT7、LGR5、CA9、FXYD2、CDH6、CLDN18、TSPAN8、BPIFB1、OLFM4、CDH17、及びPPARGC1Aより選択される1以上の幹細胞マーカーを発現する;
(e)OLFM4、SOX9、LGR5、CLDN18、CA9、BPIFB1、KRT19、CDH17、及びTSPAN8より選択される1以上のマーカーを発現する;
(f)ここで前記非胚性幹細胞は、前記非胚性組織における分化細胞種に関連したマーカー(複数)の発現を実質的に欠いている;
(g)ここで前記非胚性幹細胞は、p63の発現を実質的に欠いている(又はp63を発現しない);または
(h)ここで前記非胚性幹細胞は、核細胞質比が高い小円形細胞形状を特徴とする未熟な未分化形態を有する;
前記単一細胞クローン。
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