JP2016510026A - グリコサミノグリカンを含有する医薬製剤 - Google Patents

Abstract

グリコサミノグリカンを含有する医薬製剤を提供する。この医薬製剤において、薬剤層を取り囲むグリコサミノグリカン層は腸疾患の治療効率を改善するために用いられる。ある実施形態において、上記のペレットはコア、コアを取り囲む薬剤層、薬剤層を取り囲むグリコサミノグリカン層、グリコサミノグリカン層を取り囲む隔離層及び隔離層を取り囲む腸溶コーティング層を備える。したがって、コア、薬剤層、グリコサミノグリカン層、隔離層及び腸溶コーティングの重量比は１００：１３７〜１４１：２５〜２９：９〜１３：６０〜６４であり、好ましくは１００：１３９：２７：１１：６２である。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本願は、２１０３年３月１５日に出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１８１７号に対して優先権を主張するものであり、この文献は参照により本明細書に援用される。

本開示は医薬製剤に関する。より具体的には、本開示は、グリコサミノグリカンを含有する医薬製剤に関する。

腸疾患の治療効率を改善しようと長年にわたって腸溶コーティングの開発がなされた結果、薬剤の使用量を削減できるようになった。しかしながら、薬剤の使用量をさらに削減するために、腸疾患の治療効率は依然として改善を必要としている。

メサラジン又は５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）としても知られるメサラミンは、消化管の炎症である潰瘍性大腸炎及び軽度〜中等度のクローン病の治療に使用される抗炎症薬である。メサラミンは腸特異的なアミノサリチル酸薬であり、腸で局所的に作用し、またその作用は腸を中心としているため、全身に及ぶ副作用は殆どない。サリチル酸の誘導体として、メサラミンは、フリーラジカル（有害となる可能性がある代謝副産物）を捕捉する抗酸化物質であるとも考えられている。Ｎ−アセチル−５−ＡＳＡは５−ＡＳＡの代謝産物である。吸収された５−ＡＳＡは、腸粘膜壁及び肝臓を通して速やかにアセチル化される。主として腎臓により、Ｎ−アセチル−５−ＡＳＡとして排出される。

特許文献１には、有効成分として５−アミノサリチル酸又はその医薬的に許容可能な塩若しくはエステルを含有している医薬組成物は、経口投与により、潰瘍性大腸炎又はクローン病を治療できると開示されている。特別な徐放性錠剤構成及びその調製が開示されている。この特許の欠点は、薬剤が腸内で自然に広がってしまい目的とする部位で特異的に分散しないことから、より良い治療成果を得るためにはより多い用量を必要とし、また炎症部に付着する薬剤量が少ないため治療効果が低くなることである。

特許文献２には、アニオン性ポリマーでコーティングした薬理学的に活性な物質を含有する固形の剤形、例えばカプセル、錠剤が開示されており、このアニオン性ポリマーは胃液及びｐＨ７より低い腸液には不溶性だが結腸液には十分な量で可溶であり、経口剤形は結腸に到達するまで原形を保つ。この発明ではｐＨ７を下回る環境で薬剤を特異的に放出しているが、障害が起きている部位で薬剤濃度を上昇させることは依然としてできない。この欠点は、上述のものと全く同じである。

特許文献３にも、特許文献２に実によく似た固形の剤形が開示されている。この特許は、前の特許により多くの限定条件を加えたに過ぎない。

特許文献４には腸管を治療するための経口投与可能な医薬ペレット製剤が開示されており、コアと腸溶コーティングとを備え、コアは、医薬的に活性な化合物としてアミノサリチル酸又はその医薬的に容認可能な塩若しくは誘導体を含むと開示されている。欠点はまたしても上述のものと全く同じである。

特許文献５には、有効成分である５−アミノ−サリチル酸を含有する放出制御経口医薬組成物が開示されている。この組成物は、（ａ）９０℃未満の融点を有する物質から成り、有効成分が少なくとも部分的に球体化している内方親油性マトリックスと、（ｂ）親油性マトリックスが分散している外方親水性マトリックスと、（ｃ）任意の他の賦形剤とを含む。欠点はまたしても上述のものと全く同じである。

特許文献６には、ヒト又は下等動物における経口投与用の固形単位剤形の医薬組成物が開示されている。この医薬組成物は、（ａ）安全且つ有効な量の治療的に活性な物質と、（ｂ）ポリ（メタクリル酸、メチルメタクリレート）１：２、ポリ（メタクリル酸、メチルメタクリレート）１：１及びこれらの混合物から成る群から選択される内方コーティング層と、（ｃ）腸溶ポリマー又はフィルムコーティング物質を含む外方コーティング層とを備える。しかしながら、欠点はまたしても上述のものと全く同じである。

特許文献７には、炎症性腸疾患を患う患者において炎症性腸疾患を治療するための組成物が開示されており、（ａ）治療量のＮ−アセチル−グルコサミンと（ｂ）薬理学的に許容可能な担体とを含み、患者に結腸経由で投与するように構成されている。この特許の欠点は、Ｎ−アセチル−グルコサミン以外の薬剤が足りないことである。このため、この組成物は、Ｎ−アセチル−グルコサミンともう一方の薬剤、例えばメサラミンとの間を互いに補うものを欠く。

上で挙げたこれらの特許の組成物は全て通常量の薬剤又はＮ−アセチル−グルコサミン下で使用しなくてはならないため、これらの組成物では、いずれか一方の一般的な治療用量（量）を削減することができない。

グリコサミノグリカンは、極めて数多くの供給源（例えば、雄鶏のトサカ、気管、へその緒、皮膚、関節液及び特定の細菌、例えば連鎖球菌種）から得られる。殆どのグリコサミノグリカンはＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルクロン酸及び／又はＮ−アセチルガラクトサミン等の糖の繰り返しから構成される（これらは非硫酸化グリコサミノグリカンとして知られる）。そのようなグリコサミノグリカンが硫黄基を有する場合は、硫黄化グリコサミノグリカンとして知られる。グリコサミノグリカンの例には、ヒアルロン酸（Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルクロン酸の繰り返し単位から成る）、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及びヘパリンが含まれ、全てＮ−アセチルグルコサミン又はアミノ糖、Ｎ−アセチルガラクトサミンを含有する。グリコサミノグリカンはプロテオグリカンにおいても提示され、プロテオグリカンは、ポリペプチド又はタンパク質コアに結合した多数のグリコサミノグリカン鎖を含有する構造体である。

米国特許第４９８０１７３号明細書 米国特許第５５４１１７０号明細書 米国特許第５５４１１７１号明細書 米国特許第６５５１６２０号明細書 米国特許第６７７３７２０号明細書 米国特許第６８９３６６２号明細書 米国特許第６０４６１７９号明細書

したがって、一態様において、本発明は、腸疾患の治療効率を改善するための、少なくともペレットを含有する医薬製剤を対象とする。

別の実施形態において、上記のペレットは、コアと、コアを取り囲む薬剤層と、薬剤層を取り囲むグリコサミノグリカン層と、グリコサミノグリカン層を取り囲む隔離層と、隔離層を取り囲む腸溶コーティング層とを備える。

したがって、コア、薬剤層、グリコサミノグリカン層、隔離層及び腸溶コーティングの重量比は、１００：１３７〜１４１：２５〜２９：９〜１３：６０〜６４、好ましくは１００：１３９：２７：１１：６２である。

ある実施形態において、上記のペレットは、コアと、コアを取り囲む薬剤層と、薬剤層を取り囲むグリコサミノグリカン層と、グリコサミノグリカン層を取り囲む腸溶コーティング層とを備える。

したがって、コア、薬剤層、グリコサミノグリカン層及び腸溶コーティングの重量比は、１００：１３７〜１４１：２５〜２９：６０〜６４、好ましくは１００：１３９：２７：６２である。

一実施形態において、上記のコアは、医薬的に許容可能な不活性物質、例えばセルロース、でんぷん、糖又は酸化ケイ素、好ましくは微結晶性セルロースを含む。

別の実施形態において、上記の薬剤層は、腸疾患を治療するための薬剤を含む。

別の実施形態において、上記の薬剤層は、メサラミン、緩下剤、止痢薬、グルココルチコイド、抗菌薬、免疫抑制剤、化学療法剤、抗がん剤、ペプチド、タンパク質、心血管治療薬、向精神薬、Ｈ２ブロッカー、抗喘息薬、抗ヒスタミン剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、抗生物質、抗炎症薬又はこれらの誘導体を含めた薬剤を含む。

さらに別の実施形態において、上記の薬剤層は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース又はポリビニルピロリドン等のバインダをさらに含む。

さらに別の実施形態において、グリコサミノグリカン層は例えば、ヒアルロン酸若しくはその塩、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸又はデルマタン硫酸を含む。

さらに別の実施形態において、隔離層は、少なくとも５．５のｐＨ値で溶解可能な疎水性ポリマーを含む。疎水性ポリマーは例えば、ポリ（メタクリル酸−コ−エチルアクリレート）１：１、ポリ（メタクリル酸−コ−メチルメタクリレート）１：１、ポリ（メチルアクリレート−コ−メチルメタクリレート−コ−メタクリル酸）７：３：１、酢酸フタル酸セルロース、セルロースアセテートスクシネート、メチルセルロースフタレート、メチルヒドロキシプロピル−セルロースフタレート、エチルヒドロキシセルロースフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、ポリビニルブチレートアセテート、ビニルアセテート無水マレイン酸コポリマー、スチレン−マレイン酸モノエステルコポリマー、メチルアクリレート−メタクリル酸コポリマー及びメタクリレート−メタクリル酸−オクチルアクリレートコポリマーになり得る。

さらに別の実施形態において、隔離層又は腸溶コーティング層は、少なくとも６．８のｐＨ値で溶解可能な腸溶ポリマー又はｐＨ耐性ポリマーを含む。腸溶ポリマーは例えば、酢酸フタル酸セルロース、セルロースアセテートスクシネート、メチルセルロースフタレート、エチルヒドロキシセルロースフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、ポリビニルブチレートアセテート、ビニルアセテート無水マレイン酸コポリマー、スチレン−マレイン酸モノエステルコポリマー、メチルアクリレート−メタクリル酸コポリマー、メタクリレート−メタクリル酸−オクチルアクリレートコポリマー又はこれらの組み合わせになり得る。

さらに別の実施形態において、ペレットはカプセル又は錠剤中にある。

上では、読み手が基本的なことを理解できるように開示を簡潔にまとめている。この要約は本開示の詳細にまで及んだ全体像ではなく、本発明の重要な／決定的な要素を明らかにしてもいなければ、本発明の範囲を定めてもいない。その唯一の目的は、後出のより詳細な説明の前置きとして、本明細書で開示の一部の概念を簡略化した形で示すことである。付随する特徴の多くは、以下の詳細な説明を添付の図面と共に参照して理解を深めるにつれてたやすくわかるようになる。

本発明の実施形態によるペレットの構造を示す図である。 本発明の別の実施形態によるペレットの構造を示す図である。 正常な及び損傷を受けた結腸組織におけるＨＡの親和性を蛍光インデックスにより示す（^＊ｐ＜０．０５）。 結腸組織生検時間、Ｃｏｌａｓａ（登録商標）（１ｍｌの溶液中に２０ｍｇのメサラミンを含有する注腸製剤のブランド）又はＨＡ−メサラミンを投与した後のメサラミン濃度プロファイルを示す。 ｐＨ６．８のバッファ溶液に溶解させたペレットの溶解プロファイルである。 ｐＨ４．５のバッファ溶液に溶解させたペレットの溶解プロファイルである。

以下の詳細な説明においては、説明を目的として、開示の実施形態の完全な理解が得られるように、非常に多くの具体的な細部について明記する。しかしながら、１つ以上の実施形態をこれらの具体的な細部なしに実践し得ることは明らかである。他の例においては、図を簡略化するために、周知の構造体及びデバイスを概略的に示す。

用語の定義
本明細書で使用の「被検体」は任意の動物である。被検体には、薬剤（例えば、メサラミン）治療を必要としている個体（患者）及び薬剤治療を必要としていない個体（例えば、正常で健康なボランティア）が含まれる。ヒトが好ましい被検体及び患者である。

「治療有効量」又は「有効量」の薬剤（例えば、メサラミン）とは、過度に有害な副作用を伴うことなく所望の薬理学的効果又は治療上の改善を得るのに必要な量である。薬剤（例えば、メサラミン）の有効量は、具体的な患者及び疾患に応じて当業者によって選択される。薬剤（例えば、メサラミン）代謝における差異、被検体の年齢、体重、全身状態、治療対象とする状態、治療対象とする状態の重症度、薬を処方する医師の判断により「有効量」又は「治療有効量」が被検体毎に異なり得ることがわかる。さらに、当業者ならば、担当薬物管理機関により承認された薬剤投与監督当局に登録された薬剤の添付文書又はラベルにしたがって「量」又は「用量」を明確に理解することができる。

「治療する」又は「治療」とは障害又は疾患のいかなる治療をも指し、例えばある障害又は疾患になりやすいがまだその障害又は疾患を患っているとは診断されていない被検体においてその障害又は疾患が生じるのを予防すること、障害又は疾患を阻害すること、例えば障害又は疾患の発症を止めること、障害又は疾患を緩和すること、障害又は疾患を後退させること、疾患又は障害によって引き起こされる状態を緩和すること、あるいは疾患又は障害の徴候を減少させることである。

序論
本発明は、炎症面に結合するヒアルロン酸（ＨＡ）の量が結腸組織の非炎症領域より多かったという発明者の過去の試験結果をベースとしている。さらに、試験結果は、ＨＡを、薬剤と混合した場合に、炎症及び／又はアレルギー及び／又は損傷の治療に適した薬剤（例えば、メサラミン）を担持させるための送達ビヒクルと見なすことができると示した。そのため、ＨＡとメサラミンとを組み合わせて使用すると、薬剤濃度は、非炎症領域より炎症面で高くなる。したがって、薬剤の用量を通常量より低下させることができ、また薬剤が治癒を必要とする場所に特に付着することから治療効果も大きく改善される。したがって、本発明は、上述の結果を踏まえて、本発明の製剤をさらに発展させるものである。

ペレットを含有する医薬製剤
したがって、本発明の態様は、腸疾患の治療効率を改善するための、少なくともペレットを含有する医薬製剤を提供することである。ペレットは放出制御製剤（遅延放出製剤としても知られる）であり、薬剤を長時間にわたって送達する、すなわち薬剤を投与直後以外の任意の時点で及び／又は即放性剤形で達成できる場所より遠位にある消化管の別の場所で放出するように設計される。

この医薬製剤における各ペレットの構造を図１Ａ又は１Ｂに示す。医薬製剤は、カプセル、錠剤又は少なくともペレットを必要とする他の種類の製剤を含む。すなわち、ペレットは、カプセルにカプセル封入又は錠剤に圧縮することができる。

図１Ａは、本発明のある実施形態におけるペレットの構造を示す図である。図１Ａにおいて、ペレット１００ａは内側から外側に向かって順にコア１１０、薬剤層１２０、グリコサミノグリカン層１３０、隔離層１４０及び腸溶コーティング層１５０を含む。コア１１０、薬剤層１２０、グリコサミノグリカン層１３０、隔離層１４０及び腸溶コーティング層１５０の重量比は表１に示す通りである。

コア１１０は、後続の層のコーティングを促進するためのコーティングシードとして使用される。したがって、コア１１０の直径は約５００〜８００μｍ、例えば７００μｍである。コア１１０の組成物は任意の医薬的に許容可能な不活性物質になり得て、例えばセルロース、でんぷん、糖又は二酸化ケイ素である。セルロースは例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボメチルセルロース又は微結晶性セルロースになり得る。でんぷんは例えば、トウモロコシでんぷん、小麦でんぷん、米でんぷん、ジャガイモでんぷん又はコーンスターチに又は由来になり得る。糖は例えば、マルトース、ラクトース、フルクトース、ガラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトール又はソルビトールになり得る。

薬剤層１２０は、腸疾患を治療するのに適した薬剤を含有する。例えば、腸炎を治療する場合、薬剤は、抗生物質又は鎮痙剤になり得る。消化性潰瘍を治療する場合、薬剤は、血液凝固薬、抗生物質、制酸剤、Ｈ２ブロッカー、カリウム水素イオンポンプブロッカー（ＰＰＩ）、細胞保護剤又は粘膜保護剤になり得る。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療する場合、薬剤は、ステロイド、免疫抑制剤、抗生物質、５−ＡＳＡ（５−アミノサリチル酸）及び誘導体又は抗炎症剤になり得る。したがって、薬剤は、例えば上記のもののいずれにもなり得る。好ましくは、薬剤層１２０中の薬剤は、正に帯電した官能基を有する。

薬剤層１２０は、薬剤の力をコア１１０に結合するためのバインダをさらに含み得る。バインダは例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース又はポリビニルピロリドンになり得る。

グリコサミノグリカン層１３０はグリコサミノグリカンを顕著に含有し、グリコサミノグリカンは薬剤層１２０中の薬剤と消化管内の腸粘膜とをつなぐために使用される。グリコサミノグリカンはヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸又はデルマタン硫酸になり得る。

ある実施形態において、グリコサミノグリカンはヒアルロン酸である。ヒアルロン酸（以下、ＨＡと省略）は、結合組織、上皮組織及び神経組織全体に広く分布しているアニオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンである。したがって、ＨＡは生体組織、例えば粘膜に対する高い親和性を有する。ＨＡは負に帯電したカルボキシレート基を有するため、ＨＡは正に帯電した官能基と相互作用可能である。したがって、薬剤層１２０中の薬剤が正に帯電した官能基を有するならば、腸疾患をより良好に治療し投与する薬剤の無駄を減らすために、ＨＡは薬剤と相互作用して薬剤を腸粘膜上に固定し、薬剤を特定の領域、例えば損傷部に集めることで薬剤の効果及び効率を高めることができる。この現象は、本発明の試験的な結果からも推論することができ、試験的な結果では、正常な領域より損傷を受けた領域においてより緊密な付着が見られた。

隔離層１４０は、ペレットの後の調製ステップ中にグリコサミノグリカン層１３０が水に接触しないように保護するために使用される。グリコサミノグリカン層１３０中のグリコサミノグリカンがＨＡの場合、ＨＡは水と接触するとすぐにＨＡ膜を形成してしまうため、ペレットが凝集してコーティングを妨害する問題が起きる。したがって、隔離層１４０に使用する物質は、少なくとも５．５のｐＨ値で溶解可能な疎水性ポリマーになり得る。

疎水性ポリマーは、ポリ（メタクリル酸−コ−エチルアクリレート）１：１、ポリ（メタクリル酸−コ−メチルメタクリレート）１：１、ポリ（メチルアクリレート−コ−メチルメタクリレート−コ−メタクリル酸）７：３：１、酢酸フタル酸セルロース、セルロースアセテートスクシネート、メチルセルロースフタレート、メチルヒドロキシプロピル−セルロースフタレート、エチルヒドロキシセルロースフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、ポリビニルブチレートアセテート、ビニルアセテート無水マレイン酸コポリマー、スチレン−マレイン酸モノエステルコポリマー、メチルアクリレート−メタクリル酸コポリマー又はメタクリレート−メタクリル酸−オクチルアクリレートコポリマーになり得る。これらの疎水性ポリマーは単体で又は組み合わせて又は上記のもの以外のポリマーと共に使用し得る。

腸溶コーティング１５０は腸溶ポリマーを顕著に含有し、腸溶ポリマーは、より酸性度の高い胃の環境と比較して酸性度が低い小腸、大腸又はその両方の環境において優先的に可溶である。ｐＨ依存性の溶解度プロファイルを示すいずれのアニオン性ポリマーも本発明の実践において腸溶コーティングとして使用し得ると予測される。ある実施形態において、腸溶ポリマーは、少なくとも６．８のｐＨ値で溶解可能である。腸溶ポリマーは、酢酸フタル酸セルロース、セルロースアセテートスクシネート、メチルセルロースフタレート、エチルヒドロキシセルロースフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、ポリビニルブチレートアセテート、ビニルアセテート無水マレイン酸コポリマー、スチレン−マレイン酸モノエステルコポリマー、メチルアクリレート−メタクリル酸コポリマー、メタクリレート−メタクリル酸−オクチルアクリレートコポリマー等になり得る。これらの腸溶ポリマーは、単体で又は組み合わせて、あるいは上記のもの以外のポリマーと共に使用し得る。

図１Ｂは、本発明の別の実施形態によるペレットの構造を示す図である。図１Ｂにおいては、図１Ａにおけるペレット１００ａの隔離層１４０を除外してペレット１００ｂの構造を形成している。

医薬製剤中のペレットの調製方法
本発明の別の態様は、カプセル又は錠剤を充填するペレットの調製方法を提供することである。図１Ａ又は１Ｂに示すペレット１００ａ又は１００ｂの各層は、流動床システム（Ｈｕｔｔｌｉｎ（ドイツ）から購入）によりコーティングされる。ペレット１００ａ又は１００ｂの各層のためのコーティング溶液については以下で説明する。

薬剤層１２０のコーティングのために、薬剤コーティング溶液を、以下のステップにより調製する。まず、上で挙げたバインダの少なくとも１種を水に添加し、撹拌することで粘度４．８〜７．２ｃＰ（センチポイズ）を有する透明な溶液を調製する。次に、バインダのこの透明な溶液に凝固防止剤及び薬剤を連続的に添加し、次に撹拌することで均一な薬剤コーティング溶液を調製する。凝固防止剤、例えばタルク（すなわち、水和ケイ酸マグネシウム）を使用することでペレットの凝集を回避する。

グリコサミノグリカン層１３０のコーティングのために、グリコサミノグリカンコーティング溶液を、以下のステップで調製する。まず、バインダをエタノール（９９．９％）に添加し、撹拌することで透明な溶液を調製する。次に、グリコサミノグリカンをバインダのこの透明な溶液に添加し、次に撹拌することで均一なグリコサミノグリカンコーティング懸濁液を調製する。バインダは、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ−Ｌ等）になり得る。

隔離層１４０のコーティングのために、隔離コーティング溶液を以下のステップで調製する。疎水性ポリマーをエタノール（９５％）に添加し、撹拌することで透明な溶液を調製する。次に、クエン酸トリエチル及びタルクを疎水性ポリマーの透明な溶液に添加し、撹拌することで均一な隔離コーティング溶液を調製する。

腸溶コーティング層１５０のコーティングのために、腸溶コーティング溶液を以下のステップで調製する。少なくとも腸溶ポリマー、水、グリセリルモノステアレート、クエン酸トリエチル及びポリソルベート８０（ＰｌａｓＡＣＲＹＬ−Ｔ２０）を含有するエマルション並びに水を混合することで均一な溶液を調製する。次に、溶液を６０メッシュの篩で濾過する。

実施形態１：結腸組織におけるＨＡの付着
手順：
（Ｉ）０．２５ｇの高分子量ヒアルロン酸ナトリウム粉末（ＨＨＡと省略。ＭＷ：２ＭＤａ、Ｆｒｅｄａ）及び０．２５ｇの低分子量ヒアルロン酸ナトリウム粉末（ＬＨＡと省略。ＭＷ：３５０ｋＤａ、Ｆｒｅｄａ）を５０ｍｌのＰＢＳバッファ（リン酸緩衝食塩水）にそれぞれ添加することで０．５％溶液を調製し、次に粉末が完全に溶解するまで６時間にわたって撹拌した。０．０５ｇのＬＨＡ粉末及び０．２ｇのＨＨＡ粉末（比２：８、平均ＭＷは１ＭＤａ。中分子量ヒアルロン酸ナトリウム粉末として示され、ＭＨＡと省略）を５０ｍｌのＰＢＳバッファに添加し、次に粉末が完全に溶解するまで６時間にわたって撹拌した。

（ＩＩ）蛍光ＨＡ（ＨＡ−ｆと省略）を以下のステップで調製した。
（１）ＭＥＳバッファ溶液：０．３９ｇのＭＥＳ遊離酸（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を１００ｍｌの再蒸留水に溶解させた。
（２）溶液Ａ：６５ｍｇのフルオレセインアミン粉末（異性体Ｉ、Ｆｌｕｋａ）を９ｍｌの９５％ＥｔＯＨ溶液に溶解させ、次に光を禁じた条件下で１０分間にわたって撹拌した。
（３）溶液Ｂ：３５９ｍｇのＥＤＣ粉末［Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミドヒドロクロリド、Ｓｉｇｍａ］を９ｍｌのＭＥＳバッファに溶解させ、次に１０分間にわたって撹拌した。
（４）溶液Ｃ：２１６ｍｇのＮＨＳ粉末（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓｉｇｍａ）を９ｍｌのＭＥＳバッファに溶解させ、次に１０分間にわたって撹拌した。
（５）３ｍｌの溶液Ａを５０ｍｌの０．５％ＨＡ溶液にゆっくりと滴下し、次に光を禁じた条件下で１０分間にわたって撹拌した。
（６）３ｍｌの溶液Ｂ及び５ｍｌの溶液Ｃを別々にステップ（５）の溶液に滴下し、次に光を禁じた条件下で１０分間にわたって撹拌した。
（７）０．０２ＭのＭＥＳバッファ溶液を、体積が１００ｍｌに達するまでステップ（６）の溶液にゆっくりと添加し、次に２４時間にわたって室温、光を禁じた条件下で撹拌した。
（８）反応後の生成物を、透析溶液として５Ｌの再蒸留水を使用した透析チューブ（ＭＷ：１２０００〜１４０００）に注ぎ、次に５日間にわたって４℃で光を禁じた条件下、１２時間毎に透析溶液を交換しながら透析溶液が蛍光を有さなくなるまで撹拌した。
（９）透析後の液体を５０ｍＬのプラスチック製遠心分離管に取り分け、次に−２０℃の冷蔵庫で一晩保存し、続いて凍結乾燥機において光を禁じた条件下で乾燥させた。
（１０）乾燥させたＨＡ−ｆ粉末を−２０℃の冷蔵庫で保存した。
（１１）５０ｍｇのＨＡ−ｆ粉末をゆっくりと１０ｍｌのＰＢＳバッファに添加し、次に粉末が完全に溶解するまで６時間にわたって撹拌した。

（ＩＩＩ）生後７〜８週間のＳＤラット（スプラーグ・ドーリーラット）の結腸組織をメスで切除し、次にＰＢＳバッファで洗浄し、続いて長さ３〜４ｃｍに切断し、最後にＰＢＳバッファに浸漬した。

（ＩＶ）ハブラシで２０回にわたって長手方向にこすり、次にＰＢＳバッファに浸漬することで損傷を受けた結腸組織を用意した。

（Ｖ）正常な及び損傷を受けた結腸組織を１２ウェルプレートに入れ、次に１ｍｌの０．５％ＨＡ−ｆ溶液を各ウェルに加え、２時間にわたって室温で振盪させた。２時間後に余分なＨＡ−ｆ溶液をチップで吸引し、次にＰＢＳバッファに１０分間にわたって浸漬し、続いてＰＢＳバッファを繰り返し３回にわたって除去した。

（ＶＩ）清浄化した結腸組織を内膜組織を上にして１２ウェルプレートに置き、次にＩＶＩＳ（生体内画像化装置、ＸＥＮＯＧＥＮ）のドックに置いた。デフォルトのパラメータをＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）として設定し、励起は４６５ｎｍ、発光は５００ｎｍであり、画像をソフトウェアによりキャプチャした。

（ＶＩＩ）表中の全ての値は、ｎ回の観察の平均値として表される。組織学的インデックスを、スチューデントのｔ検定により分析した。

結果：
図２は、正常な及び損傷を受けた結腸組織におけるＨＡの親和性を蛍光インデックスにより示す（^＊ｐ＜０．０５）。図２において、正常な結腸組織の蛍光インデックスは１と定義された。その他の結腸組織試験を、正常な結腸組織の蛍光インデックスによりキャリブレートした。結果は、同じ平均ＭＷを有するＨＡの付着量が、正常な結腸組織においてより損傷を受けた結腸組織で明らかに高かったことを示した（Ｐ＜０．０１）。３つの異なる平均分子量を有するＨＡ（すなわち、ＨＨＡ、ＭＨＡ、ＬＨＡ）の損傷を受けた結腸組織における異なる付着量を比較すると、損傷結腸組織による３５０ＫＤａのＨＡ（すなわち、ＬＨＡ）の付着の蛍光インデックスは、２ＭＤａ及び１ＭＤａのＭＷの残り２つのＨＡ（すなわち、ＨＨＡ、ＭＨＡ）のものより明らかに高かった。

実施形態２：異なるメサラミン製剤を腔内点滴注入した後のメサラミン結腸組織濃度の比較研究
手順：
（Ｉ）実験動物：
生後８週間のオスのＳＰＦグレードスプラーグ・ドーリーラット（２８０〜３３０ｇ）を、ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ．Ｌｔｄ．から調達した。

（ＩＩ）試験薬剤：
（Ａ）Ｃｏｌａｓａ（登録商標）浣腸剤（２０ｍｇ／ｍｌ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．Ａｓｉａ）
（Ｂ）５ｍｇ／ｍＬのメサラミンを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．２５％（ｗ／ｗ）ＨＡ混合物（８：２＝２０００ＫＤａ ＨＡ：３５０ＫＤａ ＨＡ）（ＨＡ−Ｍと省略）

（ＩＩＩ）試験薬剤の腔内点滴注入
Ｚｏｌｅｔｉｌ５０で軽く麻酔してから、ラットの腹側を外科用鋏で切開し、結腸を特定した。結腸を２区画（それぞれ２ｃｍ）、木綿糸で結び、０．５ｍｌの試験薬剤を、隔離した結腸区画の管腔内に注入した。０．５、１、１．５又は２時間後、ラットを屠殺し、結腸区画を取り出した。腔内点滴注入の各時点につき、３匹のラットを使用した。

（ＩＶ）試験片の準備
組織生検材料をＰＢＳ溶液で洗浄して表面の汚れを除去し、計量し、液体窒素で速やかに凍結させ、−８０℃で使用する時まで保存した。生検材料を粉砕し、５０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４溶液（ｐＨ７．４）を加えた。懸濁液に挿入したマイクロプローブを使用して１０秒間にわたって組織細胞を超音波で破壊し、次に超音波による破壊を２０秒間にわたって２５Ｗで全部で１０分間にわたって停止させた。ボルテックスによる混合後、試料を３０分間にわたって室温で静置することでタンパク質を沈殿させ、次に１３０００ｇで３０分間にわたって遠心分離した。

（Ｖ）結腸組織生検材料におけるメサラミン濃度の分析
メサラミンを、超高性能液体クロマトグラフィ（ＵＰＬＣ）により測定した。この方法は検証されている。Ｗａｔｅｒｓ（英国）のＡＣＱＵＩＴＹシステム及び蛍光検出装置（励起３１５ｎｍ、発光４３０ｎｍ）を用い、データをＥｍｐｏｗｅｒ２を使用して分析した。Ｗａｔｅｒｓ（英国）から購入したＡＣＱＵＩＴＹカラム（Ｃ１８、内径１００ｘ２．１ｍｍ、１．７μｍ粒子）をＶａｎ ｇｕａｒｄカラム（Ｃ１８、内径５ｘ２．１ｍｍ、１．７μｍ粒子、Ｗａｔｅｒｓ）で保護した。移動相は、トリエチルアミンを伴うｐＨ４．３の０．１Ｍの酢酸及びアセトニトリル（８５０：１５０）から成った。流量は０．２ｍＬ／分であり、得られた圧力は５４００ｐｓｉであり、分析を４０℃で行った。注入量は５μｌであった。試料をプロピオン酸無水物で誘導体化することで、メサラミンの蛍光特性を強化した。トリエチルアミンをイオン対化剤（ｉｏｎ ｐａｉｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として使用することでピーク対称性を向上させた。メサラミン分析のＵＰＬＣ法を、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌの公称線形範囲でのメサラミン測定について検証した。この研究で用いた方法の線形相関係数（Ｒ２）は１．００である。

結果：
図３は、結腸組織生検時間、Ｃｏｌａｓａ（登録商標）（１ｍｌの溶液中に２０ｍｇのメサラミンを含有する注腸製剤のブランド）又はＨＡ−メサラミン（ＨＡ−Ｍと省略）を投与した後のメサラミン濃度プロファイルを示す。図３において、Ｃｏｌａｓａ（登録商標）を点滴注入した後の結腸組織生検材料中のメサラミン（中央値）濃度は、１時間の点滴注入後にピークに達した。その後、メサラミン濃度は急速に低下した。それに対して、ＨＡ−Ｍは２時間の間、メサラミンを絶え間なく放出し、メサラミン濃度は上昇しており、２時間の点滴注入後のＣｏｌａｓａ（登録商標）のものよりずっと高かった。

この実施形態の結果から、ＨＡ−Ｍが、市販のメサラミン浣腸剤（Ｃｏｌａｓａ（登録商標））よりずっと長くメサラミンを放出し続けたことが明らかとなった。しかしながら、ＨＡ−ＭはＣｏｌａｓａ（登録商標）におけるメサラミン濃度の１／４しかメサラミンを含有していなかった。上のデータ結果は、ＨＡ−Ｍでは通常の治療有効量の１／４しかメサラミンを用いていないのに、ラットにおいて人工的に誘発させたＩＢＤの炎症を改善するほぼ同じ有効性を有することを示した。

実施形態３：ペレットの溶解試験
この実施形態においては、ペレットを、上述の調製方法にしたがって製造した。各層に使用した材料を以下の表２に挙げる。

次に、上記のペレットについて溶解実験を行った。この溶解実験においては、各溶解試験につき６個のカプセルを使用した。カプセルを溶解させるのに使用したバッファ溶液のｐＨ値はそれぞれ４．５、６．８であった。ｐＨ４．５のバッファ溶液を、ＫＨ_２ＰＯ_４及びＨ_３ＰＯ_４の溶液を混合することで調製し、ｐＨ６．８のバッファ溶液を、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＮａＯＨ及びＫＯＨの溶液を混合することで調製した。溶解試験を３７．０±０．５℃で行い、パドルを１００ｒｐｍで回転させた。溶解したメサラミンの濃度を検出するために、オンラインＵＶ検出器を３３０ｎｍに設定した。溶解したメサラミンの濃度を求めるために、様々な量のメサラミンをある量のｐＨ４．５又はｐＨ６．８のバッファ溶液に溶解させて標準試料とした。

図４Ａ、４Ｂは、ｐＨ６．８及びｐＨ４．５のバッファ溶液に溶解させたペレットの溶解プロファイルである。図４Ａにおいて、ペレットの溶解速度は９０分から急速に上昇した。しかしながら、図４Ｂにおいて、ペレットはｐＨ４．５のバッファ溶液に少なくとも２時間にわたって溶解しなかった。したがって、この実施形態のペレットがｐＨ６．８のバッファ溶液、すなわち腸内環境では溶解するが、ｐＨ４．５のバッファ溶液、すなわち胃内環境では溶解しないことがわかる。

実施形態４：大腸炎の場合のＤＮＢＳ誘発ブタモデルに対するペレット１００ａの治癒有効性
手順：
（Ｉ）ブタを、ＬＹ系統の雄ブタ（父方はランドレース種、母方はヨークシャー種）から選択した。試験中のブタの週齢は９週±１週であった。９頭のブタをＡ、Ｂ、Ｃの３つのグループに分けた。

（ＩＩ）試薬
（ａ）ブタを鎮静化させるための４０ｍｇ／ｍｌのＳｔｒｅｓｎｉｌ（Ｃｈｉｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．台湾）
（ｂ）ブタに麻酔をかけるための５０ｍｇ／ｍｌのＺｏｌｅｔｉｌ−５０（Ｖｉｒｂａｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、フランス）
（ｃ）Ｚｏｌｅｔｉｌ５０と組み合わせている間に唾液の分泌を阻害するための１ｍｇ／ｍｌのアトロピン（Ｔａｉ Ｙｕ Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．台湾）
（ｄ）５０％エタノールに溶解させた１５０ｍｇ／ｍｌの２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，米国）

（ＩＩＩ）試験薬剤：
グループＡ：カプセル内の腸用コーティングが施されたペレット１００ａ。有効成分量２００ｍｇの５−ＡＳＡ／カプセル。
グループＢ：コントロールとしてのでんぷんのカプセル
グループＣ：関連作用薬、商品名Ｐｅｎｔａｓａ、５００ｍｇの５−ＡＳＡ／カプセル

（ＩＶ）全てのブタを２日間絶食させた。１日目には、消化管内視鏡で大腸の状態を検査するためにブタに麻酔をかけた。

（Ｖ）４０ｍｌのＤＮＢＳ（１５０ｍｇ／ｍＬ）を直腸経由で投与し、大腸炎を誘発させるために１時間にわたって結腸で保持した。その後、残ったＤＮＢＳを抜き出し、次に１００ｍｌの蒸留水で直腸を洗浄した。

（ＶＩ）７、１４、３５及び４９日目に、肛門から４０、３５、２５、２０、１５、１０、５ｃｍの地点でのＤＮＢＳにより引き起こされた腸の状態を観察、記録した。

（ＶＩＩ）８日目に、グループに応じて、試験薬剤を１日２回、２８日間にわたって投与した。薬剤の毎日の投与時間は９：００〜１１：００及び１６：３０〜１８：３０であった。

（ＶＩＩＩ）血液試料を、ヘパリンリチウム抗凝固剤管により０日目（誘発前）、７日目（誘発後）、８日目（試験薬剤投与初日）並びに１２、１４及び３５日目に採取した。チューブを３０００ｒｐｍで遠心分離し、次に分析した。

（ＩＸ）３５日目に、炎症を起こした組織及び正常な組織を内視鏡生検で採取した（肛門から約５〜１０ｃｍ）。

結果：
期間終了までの異なるグループによる回復率の結果を表３に示す。表３から、グループＡ（ＨＡ＋４００ｍｇの５−ＡＳＡ／日）の回復率がグループＢ（プラセボ）及びグループＣ（１０００ｍｇの５−ＡＳＡ／日）より良好であることがわかる。この結果は、ＨＡ＋薬剤の効果により、使用する薬剤の用量又は量を削減できることを証明しており、上の実施形態２の結果と一致し、したがってペレット１００ａの製剤は、通常量の単剤よりずっと良好な治療効果を有する。

異なるグループの血漿における５−ＡＳＡ（すなわち、メサラミン）及びＮ−アセチル−５−ＡＳＡ（５−ＡＳＡの代謝産物）の濃度を表４に示す。血漿中の５−ＡＳＡ濃度が低ければ低いほど、副作用が少ない。表４において、グループＡの血漿における５−ＡＳＡ平均濃度はグループＣのものより低く、これはＨＡ＋薬剤の剤形では安全性問題が排除されることを意味する。

Claims (12)

1. 医薬的に許容可能な不活性物質を含むコアと、
   前記コアを取り囲む、腸疾患を治療するための治療有効量の薬剤を含む薬剤層と、
   前記薬剤層を直接取り囲む、グリコサミノグリカンを含むグリコサミノグリカン層と、
   前記グリコサミノグリカン層を取り囲む、少なくとも５．５のｐＨ値で溶解する疎水性ポリマーを含む隔離層と、
   前記隔離層を取り囲む、少なくとも６．８のｐＨ値で溶解する腸溶ポリマーを含む腸溶コーティング層
   とを備えるペレットを少なくとも含有する医薬製剤。
2. 前記コア、薬剤層、グリコサミノグリカン層、隔離層及び腸溶コーティングの重量比が１００：１３７〜１４１：２５〜２９：９〜１３：６０〜６４である、請求項１に記載の医薬製剤。
3. 医薬的に許容可能な不活性物質を含むコアと、
   前記コアを取り囲む、腸疾患を治療するための治療有効量の薬剤を含む薬剤層と、
   前記薬剤層を直接取り囲む、グリコサミノグリカンを含むグリコサミノグリカン層と、
   前記グリコサミノグリカン層を取り囲む、少なくとも６．８のｐＨ値で溶解する腸溶ポリマーを含む腸溶コーティング層
   とを備えるペレットを少なくとも含有する医薬製剤。
4. 前記コア、薬剤層、グリコサミノグリカン層及び腸溶コーティングの重量比が１００：１３７〜１４１：２５〜２９：６０〜６４である、請求項３に記載の医薬製剤。
5. 前記医薬的に許容可能な不活性物質が、セルロース、でんぷん、糖又は酸化ケイ素である、請求項１又は３に記載の医薬製剤。
6. 前記薬剤層がバインダをさらに含む、請求項１又は３に記載の医薬製剤。
7. 前記バインダが、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース又はポリビニルピロリドンである、請求項６に記載の医薬製剤。
8. 前記薬剤が、メサラミン、緩下剤、止痢薬、グルココルチコイド、抗菌薬、免疫抑制剤、化学療法剤、抗がん剤、ペプチド、タンパク質、心血管治療薬、向精神薬、Ｈ２ブロッカー、抗喘息薬、抗ヒスタミン剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、抗生物質、抗炎症薬及びこれらの誘導体から成る群から選択される、請求項１又は３に記載の医薬製剤。
9. 前記グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸若しくはその塩、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸又はデルマタン硫酸である、請求項１又は３に記載の医薬製剤。
10. 疎水性ポリマーが、ポリ（メタクリル酸−コ−エチルアクリレート）１：１、ポリ（メタクリル酸−コ−メチルメタクリレート）１：１、ポリ（メチルアクリレート−コ−メチルメタクリレート−コ−メタクリル酸）７：３：１、酢酸フタル酸セルロース、セルロースアセテートスクシネート、メチルセルロースフタレート、メチルヒドロキシプロピル−セルロースフタレート、エチルヒドロキシセルロースフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、ポリビニルブチレートアセテート、ビニルアセテート無水マレイン酸コポリマー、スチレン−マレイン酸モノエステルコポリマー、メチルアクリレート−メタクリル酸コポリマー及びメタクリレート−メタクリル酸−オクチルアクリレートコポリマーである、請求項１又は３に記載の医薬製剤。
11. 前記腸溶ポリマーが、酢酸フタル酸セルロース、セルロースアセテートスクシネート、メチルセルロースフタレート、メチルヒドロキシプロピル−セルロースフタレート、エチルヒドロキシセルロースフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、ポリビニルブチレートアセテート、ビニルアセテート無水マレイン酸コポリマー、スチレン−マレイン酸モノエステルコポリマー、メチルアクリレート−メタクリル酸コポリマー及びメタクリレート−メタクリル酸−オクチルアクリレートコポリマーから成る群から選択される、請求項１又は３に記載の医薬製剤。
12. 前記ペレットがカプセル又は錠剤中にある、請求項１又は３に記載の医薬製剤。

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