JP2016505537A - 二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体 - Google Patents

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Abstract

二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体、並びにその分子の製造方法及び使用方法である。上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ，ＥｒｂＢＩ又はＨＥＲＩ）は、ｃ−ｅｒｂＢＩ癌原遺伝子によってコードされている１７０ｋＤａのＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＥＧＦＲは、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）を含む、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーのメンバーである。ＥＧＦＲシグナル伝達は、リガンド結合に続くコンフォメーション変化の誘導、ホモ二量体化又は受容体の他のＥｒｂＢファミリーのメンバーとのヘテロ二量体化によって開始される。

Description

本発明は、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体、並びにその分子の製造方法及び使用方法に関する。
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢｌ又はＨＥＲ１）は、ｃ−ｅｒｂＢｌ癌原遺伝子によってコードされている１７０ｋＤａのＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＥＧＦＲは、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）を含む、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーのメンバーである。ＥＧＦＲによるシグナル伝達は、リガンド結合に続く、他のＥｒｂＢファミリーのメンバーによる受容体のコンフォメーション変化、ホモ二量体化、又はヘテロ二量体化、及び受容体のトランス自己リン酸化（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ，３７：３５３〜７３，２００８）によって開始され、これはシグナルトランスダクションのカスケードが開始され、最終的に細胞の増殖及び生存をはじめとする様々な細胞機能に影響を及ぼす。ＥＧＦＲの発現又はキナーゼ活性の増大は、広範なヒトの癌との関連が示されており、そのためＥＧＦＲは治療的介入の魅力的な標的となっている（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：６５５０〜６５６５，２０００；Ｇｒｕｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９５：８５１〜６７，２００３；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３３：３６９〜８５，２００６）。ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数及びタンパク質発現のいずれにおける増大も、非小細胞肺癌におけるＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるＩＲＥＳＳＡ（商標）（ゲフィチニブ）に対する好ましい応答と関連付けられている（Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １８：７５２〜６０，２００７）。
ＥＧＦＲ療法には、大腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療に承認されている小分子化合物及び抗ＥＧＦＲ抗体の両方が含まれる（Ｂａｓｅｌｇａ ａｎｄ Ａｒｔｅａｇａ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３：２４４５〜２４５９（２０００５；Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５９：７７５５〜７７６０，１９８４；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１：１３１ １〜１３１８；１９９５；Ｐｒｅｗｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，４：２９５７〜２９６６，１９９８）。
抗ＥＧＦＲ療法の有効性は、腫瘍のタイプ及び腫瘍におけるＥＧＦＲの変異／増幅状態に依存し得る。現在の療法の副作用には皮膚毒性が含まれ得る（Ｄｅ Ｒｏｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １１：７５３〜７６２，２０１０；Ｌｉｎａｒｄｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，６：３５２〜３６６，２００９；Ｌｉ ａｎｄ Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ，Ｔａｒｇ Ｏｎｃｏｌ ４：１０７〜１１９，２００９）。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に対する第２の選択療法として広く用いられているが、抵抗性経路のために１２ヶ月以内に効果がなくなることが多い（Ｒｉｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：８３９〜４４，２００６）。
ｃ−Ｍｅｔは、膜貫通チロシンキナーゼ受容体をコードする。これは、特定の発癌性物質による処置によって、構成的活性を示す融合タンパク質ＴＰＲ−ＭＥＴがもたらされることが見出された後、１９８４年に癌原遺伝子として初めて特定された（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１１：２９〜３３，１９８４）。ｃ−Ｍｅｔのリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）によるｃ−Ｍｅｔの活性化は、増殖、運動性、侵襲、転移、上皮間葉転換、血管新生／創傷治癒、及び組織再生をはじめとする過剰な細胞プロセスを刺激する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２２５：１〜２６，２００５；Ｐｅｔｅｒｓ ａｎｄ Ａｄｊｅｉ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ９：３１４〜２６，２０１２）。ｃ−Ｍｅｔは、ジスルフィド結合によって結合された５０ｋＤａのαサブユニットと１４０ｋＤａのβサブユニットにタンパク質分解によって切断される１本鎖タンパク質として合成される（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２：３０９〜３２５，２００３）。ｃ−Ｍｅｔは、ＲＯＮ及びＳｅａなどの他の膜受容体と構造的に似ている。ＨＧＦ：ｃ−Ｍｅｔ結合の正確な化学量論比は解明されていないが、一般的には、２個のＨＧＦ分子が２個のｃ−Ｍｅｔ分子と結合することが受容体の二量体化及びチロシン１２３０、１２３４、及び１２３５における自己リン酸化につながると考えられている（Ｓｔａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２３：２３２５〜２３３５，２００４）。遺伝子の増幅、変異、又は受容体過剰発現によって、リガンド独立性のｃ−Ｍｅｔの自己リン酸化も生じ得る。
ｃ−Ｍｅｔは、胃癌、肺癌、結腸癌、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌、膵臓癌、及び中枢神経系（ＣＮＳ）の癌など、多くのタイプの癌において増幅、変異、又は過剰発現することが多い。キナーゼドメインに通常限局されるミスセンス変異は、遺伝性乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）において、また散発性ＰＲＣＣの１３％において一般的に見られる（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：２３４３〜２３５０，１９９９）。ｃ−Ｍｅｔのセマフォリン又は細胞膜近傍ドメインに限局されるｃ−Ｍｅｔ変異は、胃癌、頭頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、ＮＳＣＬＣ及び甲状腺癌でしばしば見られる（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２：３０９〜３２５，２００３；Ｓａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，１９９９．２４：２９９〜３０５）。ｃ−Ｍｅｔの増幅が、脳腫瘍、結腸直腸癌、胃癌、及び肺癌において検出されており、これらは疾患の進行と相関していることが多い（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２：３０９〜３２５，２００３）。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び胃癌のそれぞれ最大で４％及び２０％がｃ−Ｍｅｔの増幅を示している（Ｓａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，１９９９．２４：２９９〜３０５：Ｓｉｅｒｒａ ａｎｄ Ｔｓａｏ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３：Ｓ２１〜３５，２０１１）。肺癌では遺伝子増幅が見られない場合であってもｃ−Ｍｅｔの過剰発現がしばしば認められる（Ｉｃｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，８７：１０６３〜９，１９９６）。更に、臨床試料では、肺腺癌のほぼ半分で、いずれも腫瘍増殖速度の亢進、転移及び予後不良との相関が示されている高レベルのｃ−Ｍｅｔ及びＨＧＦを示した（Ｓｉｅｒｒａ ａｎｄ Ｔｓａｏ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３：Ｓ２１〜３５，２０１１；Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ ６６：１９１５〜８，１９９８）。
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ受容体阻害剤に対して抵抗性となる全腫瘍の約６０％で、ｃ−Ｍｅｔの発現の増大、ｃ−Ｍｅｔの増幅、又はｃ−Ｍｅｔの唯一知られるリガンドであるＨＧＦの増大（Ｔｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，１７：７７〜８８，２０１０）が認められ、ｃ−Ｍｅｔを介したＥＧＦＲの補償的経路の存在を示唆している。ｃ−Ｍｅｔの増幅は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブに対して抵抗性となり、かつＨｅｒ３経路を介して高い生存率を示した、培養細胞中で最初に確認された（Ｅｎｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１６：１０３９〜４３，２００７）。このことは、未処置の患者６２人ではｃ−Ｍｅｔの増幅を示した患者がわずか２人であったのに対して、エルロチニブ又はゲフィチニブに対する耐性を獲得した４３人の患者のうち９人がｃ−Ｍｅｔの増幅を示す臨床サンプルで更に確認された。これら９人の処置患者のうち４人は、ＥＧＦＲ活性化変異であるＴ７９０Ｍも獲得しており、同時に存在する抵抗性経路を示す（Ｂｅａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０４：２０９３２〜７，２００７）。
癌におけるＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの個々の役割についてはよく確立されており、これらの標的を併用療法において魅力的なものとしている。いずれの受容体も、同じ生存経路及び抗アポトーシス経路（ＥＲＫ及びＡＫＴ）を介してシグナル伝達するものであり、したがって、このペアの組み合わせを阻害することで補償的経路が活性化される可能性を制限することが可能であり、これにより全体の有効性が向上する。ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔを標的とする併用療法は、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）とＮＳＣＬＣに対する抗ｃ−Ｍｅｔ一価抗体との組み合わせ（Ｓｐｉｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１ ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ２０１１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ．ｐ．７５０５）、及びＴａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）とｃ−Ｍｅｔの小分子阻害剤であるＡＲＱ−１９７との組み合わせ（Ａｄｊｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，１６：７８８〜９９，２０１１）を用いて臨床試験が行われている。併用療法又は二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子については、例えば、国際特許公開第ＷＯ２００８／１２７７１０号、同第ＷＯ２００９／１１１６９１号、同第ＷＯ２００９／１２６８３４号、同第ＷＯ２０１０／０３９２４８号、同第ＷＯ２０１０／１１５５５１号、及び米国特許出願公開第ＵＳ２００９／００４２９０６号に開示されている。
治療を目的とする、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路に拮抗する現在の小分子及び大分子の治療アプローチは、小分子阻害剤において見られる場合がある特異性の欠如の可能性、標的外活性の可能性、及び用量制限毒性のために最適とはいえない。一般的な一重特異性二価抗体は、膜結合受容体のクラスタリング及び下流シグナル伝達経路の望ましくない活性化につながり得る。完全長の重鎖（ハーフアーム）を有する一価抗体は、製造プロセスを著しく複雑でコストが嵩むものとする。
したがって、治療及び診断の両方を目的とした更なる一重特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ阻害剤が求められている。
本発明の一実施形態は、単離された二重特異性上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）／肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）抗体であって、
ＨＣ１定常ドメイン３（ＨＣ１ ＣＨ３）及びＨＣ１可変領域１（ＶＨ１）を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、
ＨＣ２定常ドメイン３（ＨＣ２ ＣＨ３）及びＨＣ２可変領域２（ＶＨ２）を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、
軽鎖可変領域（ＶＬ１）を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）と、
軽鎖可変領域（ＶＬ２）を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）と、を含み、前記ＶＨ１と前記ＶＬ１とが対合してＥＧＦＲと特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、前記ＶＨ２とＶＬ２とが対合してｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成し、前記ＨＣ１が前記ＨＣ１ ＣＨ３に少なくとも１個の置換を含み、前記ＨＣ２が前記ＨＣ２ ＣＨ３に少なくとも１個の置換を含み、前記ＨＣ１ ＣＨ３内の前記置換及び前記ＨＣ２ ＣＨ３内の前記置換が、残基の番号付けがＥＵインデックスに基づいたものである場合に、異なるアミノ酸残基の位置で生じる、二重特異性抗体である。
他の実施形態において、本発明は、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を提供し、その場合、抗体は、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ１９７５又はＳＫＭＥＳ−１細胞株における細胞外シグナル調節キナーゼ１及び２（ＥＲＫ１／２）のリン酸化を阻害し、そのＩＣ50値は、重鎖３（ＨＣ３）及び軽鎖３（ＬＣ３）を含むコントロール一価ＥＧＦＲ抗体と重鎖４（ＨＣ４）及び軽鎖４（ＬＣ４）を含むコントロール一価ｃ−Ｍｅｔ抗体との混合物によるＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ１９７５又はＳＫＭＥＳ−１細胞株におけるＥＲＫ１／２のリン酸化阻害のＩＣ50値と比較した場合に、少なくとも約１０倍低い、少なくとも約２０倍低い、少なくとも約３０倍低い、少なくとも約４０倍低い、少なくとも約５０倍低い、又は少なくとも約６０倍低いＩＣ50値であり、ただし、ＨＣ３とＨＣ１、ＬＣ３とＬＣ１、ＨＣ４とＨＣ２、及びＬＣ４とＬＣ２はそれぞれ同一のアミノ酸配列を有し、ＥＲＫ１／２のリン酸化は、抗ホスホＥＲＫ１／２抗体を捕捉抗体とし、電気化学発光化合物と接合された非リン酸化及びリン酸化ＥＲＫ１／２と結合する抗体を検出抗体として使用したサンドイッチイムノアッセイを用いて全細胞ライセート中で測定される。
他の実施形態において、本発明は、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を提供し、その場合、抗体は、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株におけるタンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）のＳｅｒ４７３におけるリン酸化を阻害し、そのＩＣ50値は、ＨＣ３及びＬＣ３を含むコントロール一価ＥＧＦＲ抗体とＨＣ４及びＬＣ４を含むコントロール一価ｃ−Ｍｅｔ抗体との混合物によるＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株におけるＡＫＴのＳｅｒ４７３におけるリン酸化の阻害のＩＣ50値と比較した場合に、少なくとも約７０倍低いＩＣ50値であり、ただし、ＨＣ３とＨＣ１、ＬＣ３とＬＣ１、ＨＣ４とＨＣ２、ＬＣ４とＬＣ２はそれぞれ同一のアミノ酸配列を有し、ＡＫＴのＳｅｒ４７３におけるリン酸化は、非リン酸化及びリン酸化ＡＫＴと結合する抗体を捕捉抗体とし、電気化学発光化合物と接合された抗ホスホＡＫＴ Ｓｅｒ４７３抗体を検出抗体として使用するサンドイッチイムノアッセイを用いて全細胞ライセート中で測定される。
他の実施形態において、本発明は、配列番号７３のＥＧＦＲとＥＧＦＲ残基Ｋ４８９、Ｉ４９１、Ｋ４６７及びＳ４９２で結合し、ｃ−Ｍｅｔと残基ＰＥＦＲＤＳＹＰＩＫＹＶＨＡＦ（配列番号２３８）及びＦＡＱＳＫＰＤＳＡＥＰＭＤＲＳＡ（配列番号２３９）で結合する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を提供する。
他の実施形態において、本発明は、ＮＣＩ−Ｈ２９２又はＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の増殖を、ＮＣＩ−Ｈ２９２又はＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞が低付着条件で増殖された場合のセツキシマブによるＮＣＩ−Ｈ２９２又はＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の増殖の阻害のＩＣ50値と比較した場合に、少なくとも約３００倍低い、少なくとも約４００倍低い、少なくとも約５００倍低い、少なくとも約６００倍低い、少なくとも約７００倍低い、又は少なくとも約８００倍低いＩＣ50値で阻害する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を提供する。
他の実施形態において、本発明は、二重特異性抗体及びセツキシマブが２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与された場合に、ＳＣＩＤ ＢｅｉｇｅマウスにおけるＨＧＦ発現ＳＫＭＥＳ−１細胞腫瘍の増殖を、セツキシマブと比較して３６日目に少なくとも５００倍低いＴ／Ｃ値（％）で阻害する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を提供する。
他の実施形態において、本発明は、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を提供し、その場合ＨＣ１ＣＨ３は、Ｋ４０９Ｒ又はＦ４０５Ｌの置換を含み、ＨＣ２ＣＨ３は、Ｋ４０９Ｒ又はＦ４０５Ｌの置換を含み、ここで残基の番号付けは、ＥＵインデックスに基づくものである。
他の実施形態において、本発明は、特定の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ、ＶＨ１、ＶＬ１、ＶＨ２、ＶＬ２、ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２及びＬＣ２配列を含む二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を提供する。
本発明の別の実施形態は、本発明のＨＣ１、ＨＣ２、ＬＣ１、又はＬＣ２をコードする単離された合成ポリヌクレオチドである。
本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
本発明の別の実施形態は、単離された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を生成する方法であって、
配列番号１９９の２本の重鎖及び配列番号２００の２本の軽鎖を含む単離された一重特異性二価抗ＥＧＦＲ抗体と、配列番号２０１の２本の重鎖及び配列番号２０２の２本の軽鎖を含む単離された一重特異性二価抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と、を約１：１のモル比の混合物として加え合わせることと、
前記混合物中に還元剤を導入することと、
前記混合物を約９０分〜約６時間インキュベートすることと、
前記還元剤を除去することと、
配列番号１９９の第１の重鎖及び配列番号２０１の第２の重鎖、並びに配列番号２００の第１の軽鎖及び配列番号２０２の第２の軽鎖を含む二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を精製することと、を含み、配列番号１９９の前記第１の重鎖が配列番号２００の前記第１の軽鎖と対合してＥＧＦＲと特異的に結合する第１の結合ドメインを形成し、配列番号２０１の前記第２の重鎖が配列番号２０２の前記第２の軽鎖と対合してｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する第２の結合ドメインを形成する、方法である。
本発明の別の実施形態は、本発明の二重特異性抗体と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
本発明の別の実施形態は、癌を有する対象を治療する方法であって、治療上の有効量の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を、治療を要する患者に癌を治療するのに充分な時間にわたって投与することを含む方法である。
本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔを発現する細胞の成長又は増殖を阻害する方法であって、細胞を本発明の二重特異性抗体と接触させることを含む方法である。
本発明の別の実施形態は、対象のＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍又は癌細胞の増殖又は転移を阻害する方法であって、前記対象に、有効量の本発明の二重特異性抗体を投与して、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍又は癌細胞の増殖又は転移を阻害することを含む方法である。
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのアミノ酸のアラインメント。ＢＣ及びＦＧループは、配列番号１８の残基２２〜２８及び７５〜８６を枠で囲んで示す。一部の変異体は、熱安定性を高めるＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｋ及びＥ８６Ｉ置換を含む（残基の番号付けはテンコン（配列番号１）に基づく）。 ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのアミノ酸のアラインメント。ＢＣ及びＦＧループは、配列番号１８の残基２２〜２８及び７５〜８６を枠で囲んで示す。一部の変異体は、熱安定性を高めるＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｋ及びＥ８６Ｉ置換を含む（残基の番号付けはテンコン（配列番号１）に基づく）。 テンコン２７の骨格（配列番号９９）及びランダム化されたＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧの別の表面を有するＴＣＬ１４ライブラリ（配列番号１００）の配列アラインメント。ループ残基は、枠で囲んで示す。ループ及び鎖は配列の上に示される。 ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの配列アラインメントＣループ及びＣＤ鎖、並びにＦループ及びＦＧ鎖は枠で囲んで示してあり、残基２９〜４３及び６５〜８１にわたっている。 一重特異性又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子で前処理し、ＨＧＦで刺激した、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害を示す。一重特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５、図にＡ５として示される）の単独、又はＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとの組合わせ（Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２、図に８３ｖ２として示される）と比較した場合に、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ１）の効能の有意な増大が認められた。 一重特異性又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子で前処理した細胞におけるＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害。高いレベルのＥＧＦＲ、ＮＣＩ−Ｈ２９２（図５Ａ）及びＨ５９６（図５Ｂ）を発現している細胞株では、抗ＥＧＦＲ一重特異性及び二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲのリン酸化の減少に同様の効能がある。ｃ−Ｍｅｔに対して低いレベルのＥＧＦＲを発現している細胞株であるＮＣＩ−Ｈ４４１（図５Ｃ）では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、一重特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン単独と比較してＥＧＦＲリン酸化の阻害効能を向上させている。ＥＧＦＲに対してｃ−Ｍｅｔのレベルが低い細胞株であるＮＣＩ−Ｈ２９２（図５Ｄ）及びＨ５９６（図５Ｅ）では、一重特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン単独と比較して、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子によってｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害効果は有意に増大している。この試験で使用した分子は、二重特異性ＥＣＢ５（図で１７−Ａ３として示される）、一重特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインＰ５３Ａ１Ｒ５−１７（図で１７として示される）、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子ＥＣＢ３（図で８３−Ｈ９として示される）、及び一重特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインＰ１１４ＡＲ７Ｐ９３−Ｈ９（図でＨ９として示される）であった。 二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子を６時間又は７２時間投与したマウスから単離された腫瘍における薬物力学的シグナル伝達いずれの分子も６時間後及び７２時間後にｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、及びＥＲＫのリン酸化を有意に低減させたが、阻害の程度は、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＦＮ３ドメインの親和性に依存した。二重特異性分子は、高親和性（図の８３はｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２である）又は中親和性（図の１７ｖ２はＰ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２である）のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを、高親和性（図のＡ３はＰ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３である）又は中親和性（図のＡ５はＰ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５である）のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと連結することによって生成した。 アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）と連結された親和性の異なる二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の血漿（上図）及び腫瘍（下図）への蓄積を、ＩＰ投与の６時間（左図）及び７２時間後（右図）に示す。投与６時間後に、中親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１７ｖ２）又は高親和性ＥＧＦＲ結合ドメイン（８３ｖ２）を有する二重特異性分子を投与したマウスにおいて腫瘍への蓄積は最大となった。二重特異性分子には、高親和性又は中親和性のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを、８３ｖ２−Ａ５−ＡＢＤ（ＥＣＢ１８；ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔに対して高／中）、８３ｖ２−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３８；高／高）、１７ｖ２−Ａ５（ＥＣＢ２８；中／中）、１７ｖ２−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３９；中／高）で組み込んだ。図中、８３ｖ２はｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２を指し、１７ｖ２はｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２を指し、Ａ３はｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３を指し、Ａ５はｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５を指す。 Ｈ２９２−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスに移植した。腫瘍が約８０ｍｍ3の平均体積に達した時点で、マウスに二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（２５ｍｇ／ｋｇ）又はＰＢＳ溶媒を週３回投与した。いずれの二重特異性分子も腫瘍増殖を低下させ、腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）はｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲに対する分子の親和性に依存した（高ＥＧＦＲ−高ｃＭｅｔは、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３（ＥＣＢ３８）を指し、高ＥＧＦＲ−中ｃＭｅｔは、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５（ＥＣＢ１８）を指し、中ＥＧＦＲ−高ｃＭｅｔは、ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３（ＥＣＢ３９）を指し、中ＥＧＦＲ−中ｃＭｅｔは、ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７−ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５（ＥＣＢ２８）を指す。） Ｈ２９２−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスに移植し、マウスを異なる治療薬で処置した。治療薬の抗腫瘍活性を示す（二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３８）を指す。他の治療薬は、クリゾチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、及びクリゾチニブとエルロチニブの併用である。） ＳＫＭＥＳ−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスに移植し、マウスを異なる治療薬で処置した。治療薬の抗腫瘍活性を、経時的な腫瘍サイズ（ｍｍ3）の変化として示す。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体ＥＭ１−ｍＡｂを、２０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、又は１ｍｇ／ｋｇを週２回、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、セツキシマブは２０ｍｇ／ｋｇを週２回腹腔内投与した。図の矢印は投与日を示す。抗体の後の数値は、投与した用量を示す。 ＨＣＣ８２７腫瘍異種移植片をヌードマウスに移植し、そのマウスを示した用量のエルロチニブ又はＥＭ１−ｍＡｂで処置した。ＥＭ１−ｍＡｂは週２回、エルロチニブは１日１回、４週間にわたって投与した。図の矢印は投与日を示す。治療薬の抗腫瘍活性を、経時的な腫瘍サイズ（ｍｍ3）の変化として示す。 ＳＮＵ−５腫瘍異種移植片をＣＢ１７／ＳＣＩＤマウスに移植し、そのマウスを１０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ、又は１０ｍｇ／ｋｇ若しくは１ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂで処置した。抗体は週２回、４週間にわたって投与した。図の矢印は投与日を示す。治療薬の抗腫瘍活性を、経時的な腫瘍サイズ（ｍｍ3）の変化として示す。 Ｈ１９７５−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をヌードマウスに移植し、そのマウスを１０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ、１０ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂ、５０ｍｇ／ｋｇのエルロチニブ、１５ｍｇ／ｋｇのアファチニブ、又は１０ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂと１５ｍｇ／ｋｇのアファチニブの組合わせで処置した。抗体は週２回、小分子は１日１回、３週間にわたって投与した。図の矢印は投与日を示す。治療薬の抗腫瘍活性を、経時的な腫瘍サイズ（ｍｍ3）の変化として示す。 ＨＣＣ８２７−ＥＲ１腫瘍異種移植片をヌードマウスに移植し、そのマウスを１０ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂ、２５ｍｇ／ｋｇのエルロチニブ、又はこれらの組合わせで処置した。ＥＭ１−ｍＡｂは週２回、エルロチニブは１日１回、１９日間にわたって投与した。図の矢印は投与日を示す。治療薬の抗腫瘍活性を、経時的な腫瘍サイズ（ｍｍ3）の変化として示す。 ２０ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂの単回投与後のＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスに移植されたＨ１９７５ＨＧＦ腫瘍異種移植片から単離した腫瘍ライセート中の平均のＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔレベル。受容体のレベルは、処置後の示された時間におけるＰＢＳコントロールの％として示した。 Ｈ１９７５−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をヌードマウスに移植し、そのマウスを１０ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂ、又はＦｃ受容体の結合がなくエフェクター機能が欠如した１０ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂ変異体ＩｇＧ２Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓで処置した。抗体は週２回、示された日に投与した。治療薬の抗腫瘍活性を、経時的な腫瘍サイズ（ｍｍ3）の変化として示す。
本明細書で使用するところの「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）ドメイン（ＦＮ３ドメイン）」なる用語は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体、及び原核細胞酵素を含む、タンパク質中に高頻度で見られるドメインを指す（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：８９９０〜８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５：１９１０〜１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１５６５９〜１５６６５，１９９０）。代表的なＦＮ３ドメインは、ヒトテネイシンＣに存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、及び例えば米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号に述べられる非天然合成ＦＮ３ドメインである。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号及びタンパク質名によって、例えば、テネイシンの第３ＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、又はフィブロネクチンの第１０ＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）と呼ばれる。
本明細書で使用するところの「置換する」若しくは「置換された」又は「変異する」若しくは「変異した」なる用語は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列における１以上のアミノ酸又はヌクレオチドを変更、欠失、挿入することによってその配列の変異体を生成することを指す。
本明細書で使用するところの「ランダム化する」若しくは「ランダム化された」又は「多様化された」若しくは「多様化する」なる用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列において少なくとも１つの置換、挿入、又は欠失を行うことを指す。
本明細書で使用するところの「変異体」なる用語は、例えば、置換、挿入、又は欠失等の１つ以上の修飾によって、基準ポリペプチド又は基準ポリヌクレオチドとは異なっている、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
本明細書で使用するところの「特異的に結合する」又は「特異的に結合している」なる用語は、所定の抗原と、約１×１０-6Ｍ以下、例えば約１×１０-7Ｍ以下、約１×１０-8Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、約１×１０-10Ｍ以下、約１×１０-11Ｍ以下、約１×１０-12Ｍ以下、又は約１×１０-13Ｍ以下の解離定数（ＫD）で結合する、本発明のＦＮ３ドメイン、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の能力を指す。一般的に、本発明のＦＮ３ドメイン、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、例えばＰｒｏｔｅｏｎ装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定される非特異的抗原（例えばＢＳＡ又はカゼイン）に対するそのＫDよりも少なくとも１０倍小さいＫDで所定の抗体（すなわち、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ）と結合する。したがって、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、各ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと、少なくとも約１×１０-6Ｍ以下、例えば約１×１０-7Ｍ以下、約１×１０-8Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、約１×１０-10Ｍ以下、約１×１０-11Ｍ以下、約１×１０-12Ｍ以下、又は約１×１０-13Ｍ以下の結合親和性（ＫD）で特異的に結合する。しかしながら、所定の抗原と結合する本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、他の関連する抗原、例えば他の種からの同じ所定の抗原（ホモログ）と交差反応性を有し得る。
「ライブラリ」なる用語は、変異体の集合を指す。ライブラリは、ポリペプチド又はポリヌクレオチド変異体からなり得る。
本明細書で使用するところの「安定性」なる用語は、例えば、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔなどの所定の抗原との結合などのその正常な機能活性の少なくとも１つを維持するように生理学的条件下で折り畳み状態を維持する分子の能力を指す。
本発明で使用するところの「上皮増殖因子受容体」又は「ＥＧＦＲ」とは、配列番号７３及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５２１９に示されるアミノ酸配列並びにその天然に存在する変異体を有するヒトＥＧＦＲ（ＨＥＲ１又はＥｒｂＢ１としても知られる（Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０９：４１８〜４２５，１９８４）を指す。このような変異体としては、よく知られたＥＧＦＲｖＩＩＩ及びその他の別の方法でスプライスされた変異体（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００５３３−１（野生型；配列番号７３及びＮＰ＿００５２１９と同じ）、Ｐ００５３３−２（Ｆ４０４Ｌ／Ｌ４０５Ｓ）、Ｐ００５３３−３（６２８〜７０５：ＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰ．．．ＧＥＡＰＮＱＡＬＬＲ→ＰＧＮＥＳＬＫＡＭＬ．．．ＳＶＩＩＴＡＳＳＣＨ、及び７０６〜１２１０を欠失）、Ｐ００５３３−４（Ｃ６２８Ｓ及び６２９〜１２１０を欠失）、変異体ＧｌｎＱ９８、Ｒ２６６、Ｋ５２１、Ｉ６７４、Ｇ９６２、及びＰ９８８（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＩＥＨＳ−ＳＮＰｓ，ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｊｅｃｔ，ＮＩＥＨＳ ＥＳ１５４７８）、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ、及びｄｅｌ（Ｅ７４６、Ａ７５０）で認識される）が挙げられる。
本明細書で使用するところの「ＥＧＦＲリガンド」には、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレグリン（ＡＲ）、及びエピレグリン（ＥＰＩ）などの、ＥＧＦＲのすべての（例えば生理学的な）リガンドが含まれる。
本明細書で使用するところの「上皮増殖因子（ＥＧＦ）」とは、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有する、５３個のアミノ酸からなる周知のヒトＥＧＦを指す。
本明細書で使用するところの「肝細胞増殖因子受容体」又は「ｃ−Ｍｅｔ」とは、配列番号１０１又はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１２０９７２に示されるアミノ酸配列を有するヒトｃ−Ｍｅｔ及びその天然の変異体を指す。
本明細書で使用するところの「肝細胞増殖因子」（ＨＧＦ）とは、切断されることによってジスルフィド結合によって連結されたα鎖とβ鎖の二量体を形成する、配列番号１０２に示されるアミノ酸配列を有する周知のヒトＨＧＦを指す。
本明細書で使用するところの「結合をブロックする」又は「結合を阻害する」とは、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ、及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦ、といったＥＧＦＲリガンドの結合をブロック又は阻害する、本発明のＦＮ３ドメイン、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の能力を互換可能に指し、これには部分的な及び完全なブロッキング／阻害が含まれる。本発明のＦＮ３ドメイン、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体による、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ、及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦ、といったＥＧＦＲリガンドのブロッキング／阻害は、ブロッキング又は阻害なしに、ＥＧＦＲリガンドのＥＧＦＲとの結合及び／又はＨＧＦのｃ−Ｍｅｔとの結合と比較してＥＧＦＲシグナル伝達及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達の正常なレベルを部分的又は完全に低減させる。本発明のＦＮ３ドメイン、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、阻害率が、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である場合に、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ、及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦ、といったＥＧＦＲリガンドの「結合をブロックする」。結合の阻害は、例えば、ＦＡＣＳを用い、及び本明細書に述べる方法を用いて、本発明のＦＮ３ドメイン、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体に曝露されたＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞でのビオチン化ＥＧＦの結合の阻害を測定するか、あるいは周知の方法及び本明細書に述べられる方法を用いてｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインでのビオチン化ＨＧＦの結合の阻害を測定するなど、周知の方法を用いて測定することができる。
「ＥＧＦＲシグナル伝達」なる用語は、ＥＧＦＲの少なくとも１つのチロシン残基の自己リン酸化につながる、ＥＧＦＲへのＥＧＦＲリガンドの結合によって誘導されるシグナルトランスダクションを指す。代表的なＥＧＦＲリガンドの１つにＥＧＦがある。
本明細書において使用するところの「ＥＧＦＲシグナル伝達を無効にする」とは、ＥＧＦなどのＥＧＦＲリガンドによって誘導されるＥＧＦＲシグナル伝達を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害する、本発明のＦＮ３ドメイン、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−ＭｅｔＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の能力を指す。
「ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達」なる用語は、ｃ−Ｍｅｔの少なくとも１つのチロシン残基の自己リン酸化につながる、ｃ−ＭｅｔへのＨＧＦの結合によって誘導されるシグナルトランスダクションのことを指す。通常、ＨＧＦの結合により、１２３０、１２３４、１２３５又は１３４９位の少なくとも１つのチロシン残基が自己リン酸化される。
本明細書において使用するところの「ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を無効にする」とは、ＨＧＦによって誘導されるｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害する、本発明のＦＮ３ドメイン、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の能力を指す。
本明細書で使用するところの「過剰発現する」、「過剰発現された」及び「過剰発現している」とは、同じ組織型の正常細胞と比較して表面上のＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔのレベルが測定可能なより高いレベルの癌又は悪性細胞のことを互換可能に指す。このような過剰発現は、遺伝子増幅によって、又は転写若しくは翻訳の増大によって引き起こされ得る。ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔの発現及び過剰発現は、例えば、生細胞又は溶解した細胞に対するＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、フローサイトメトリー、又はラジオイムノアッセイを用いた周知のアッセイを用いて測定することができる。これに代えるか、又はこれに加えて、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔをコードする核酸のレベルを、例えば、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、又はＰＣＲ法を用いて細胞内で測定することもできる。ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔは、細胞の表面上のＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔのレベルが、正常細胞と比較して少なくとも１．５倍である場合に過剰発現される。
本明細書で使用するところの「テンコン」とは、配列番号１に示される配列を有し、米国特許出願公開第ＵＳ２０１０／０２１６７０８号に述べられる、合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを指す。
本明細書で使用するところの「癌細胞」又は「腫瘍細胞」とは、新たな遺伝物質の取り込みを必ずしもともなわない、自然の又は誘導された表現型変化を有するインビボ、エクスビボ、及び組織内培養中の癌性、前癌性、又は形質転換細胞を指す。形質転換は、形質転換ウイルスによる感染及び新たなゲノム核酸の組み込み、又は外因性核酸の取り込みによって生じ得るが、自然に又は発癌性物質への曝露後にも生じ得るものであり、これにより内因性の遺伝子を変異させるものである。形質転換／癌は、例えば、インビトロ、インビボ、及びエクスビボの形態的変化、細胞の固定化、異常な増殖制御、病巣形成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マーカーレベル、侵襲性、ヌードマウスなどの適当な動物宿主における腫瘍増殖又は抑制などによって実証される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ．１９９４））。
「ベクター」なる用語は、生体系内で複製され得る、又はこうした系間を移動し得るポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは一般的に、生体系内でこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シグナル、又は選択マーカーなどの要素を含む。このような生体系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的要素を利用して再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを含むポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッドであってよい。
「発現ベクター」なる用語は、生体系又は再構成された生体系において、その発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を導くために使用することができるベクターを意味する。
「ポリヌクレオチド」なる用語は、糖−リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学構造により共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖を含む分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
「相補的ＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」とは、ゲノムＤＮＡ内に存在する介在イントロンが除去された、連続したエクソンを有する天然の成熟ｍＲＮＡ種に見られる配列要素の構成を共有する周知の合成ポリヌクレオチドを指す。開始メチオニンをコードするコドンは、ｃＤＮＡ内に存在してもしなくてもよい。ｃＤＮＡは、例えば逆転写により、又は合成遺伝子のアセンブリによって合成することができる。
本明細書で使用するところの「合成の」又は「非天然の」又は「人工の」とは、ポリヌクレオチド又はポリペプチド分子が天然に存在しないことを指す。
「ポリペプチド」又は「タンパク質」なる用語は、ペプチド結合により連結されてポリペプチドを生成する少なくとも２個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。約５０個未満のアミノ酸からなる小さなポリペプチドは、「ペプチド」と呼ばれる場合がある。
本明細書で使用するところの「二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子」又は「二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子」なる用語は、直接又はリンカーを介して互いに共有結合により連結されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと、別個のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと、を含む分子のことを指す。代表的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ結合分子は、ＥＧＦＲと特異的に結合する第１のＦＮ３ドメインと、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する第２のＦＮ３ドメインと、を含む。
本明細書で使用するところの「価」とは、分子内に、ある抗原に対する特異的な特定の数の結合部位が存在することを指す。したがって、「一価の」、「二価の」、「四価の」、及び「六価の」なる用語は、分子内に、ある抗原に対する特異的な１個、２個、４個、及び６個の結合部位がそれぞれ存在することを指す。
本明細書で使用するところの「混合物」とは、互いに共有結合によって連結されていない２以上のＦＮ３ドメインの試料又は調製物のことを指す。混合物は、２以上の同じＦＮ３ドメインからなってもよいし、異なるＦＮ３ドメインからなってもよい。本明細書で使用するところの混合物とは、ＥＧＦＲに対して一価であり、かつ／又はｃ−Ｍｅｔに対して一価である２以上の一価抗体の試料又は調製物も指す。
本明細書で使用するところの「ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤」なる用語は、ＥＧＦＲと特異的に結合する第１のドメインと、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する第２のドメインと、を含む分子を指す。ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する代表的な薬剤の１つに、二重特異性抗体がある。ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する別の例示的な二重特異性薬剤は、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと、別個のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと、を含む分子である。ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤は、１個のポリヌクレオチドで攻勢されてもよいし、１個を超えるポリヌクレオチドで構成されてもよい。
本明細書で使用するところの「二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体」又は「二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体」なる用語は、ＥＧＦＲと特異的に結合する第１のドメインと、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する第２のドメインと、を有する二重特異性抗体を指す。ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合するドメインは、通常はＶＨ／ＶＬのペアであり、二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔとの結合に関して一価である。
本明細書で使用するところの「抗体」なる用語は、広義の意味で用いられ、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト適合化、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗体フラグメント、二重特異性抗体又は多重特異性抗体、二量体、四量体又は多量体抗体、並びに一本鎖抗体を含む免疫グロブリン分子を含む。
免疫グロブリンは、重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの大きなクラスに分類することができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、及びＩｇＧ4のアイソタイプとして更に分類される。任意の脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）の２つの明確に異なるタイプのうちの一方に分類することができる。
「抗体フラグメント」なる用語は、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２及び３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２及び３、重鎖可変領域（ＶＨ）、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）などの重鎖及び／又は軽鎖の抗原結合部位を維持する免疫グロブリン分子の部分のことを指す。抗体フラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント；ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨＩドメインからなる一価のフラグメント；Ｆ（ａｂ）2フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；ＶＨ及びＣＨＩドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の１本のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６）が挙げられる。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、これらを操作して合成リンカーを介して互いに連結することで様々な種類の一本鎖抗体の設計を形成することが可能であり、その場合、ＶＨ／ＶＬドメインが分子内で、又はＶＨドメインとＶＬドメインとが別々の一本鎖の抗体コンストラクトによって発現される場合には分子間で組み合わさり、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又はダイアボディのような一価の抗原結合部位を形成するものであり、これについては、例えば国際特許公開第ＷＯ１９９８／４４００１号、同第ＷＯ１９８８／０１６４９号、同第ＷＯ１９９４／１３８０４号、及び同第ＷＯ１９９２／０１０４７に述べられている。これらの抗体フラグメントは当業者に周知の技術を用いて得られるものであり、こうしたフラグメントは、実用性に関して、完全長の抗体と同じ方法でスクリーニングされる。
「単離抗体」なる語句は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質上含まない抗体又は抗体フラグメントのことを指す（例えば、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する単離された二重特異性抗体は、ヒトＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質上含まない。）。しかしながら、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する単離抗体は、ヒトＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ、例えばＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）のＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔのオーソログなどの他の抗原との交差反応性を有し得る。更に、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質上含まない場合もある。
抗体可変領域は、３つの「抗原結合部位」が挟み込まれた「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、異なる用語で定義されている。すなわち、（ｉ）ＶＨ内の３個（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内の３個（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の可変性に基づいたものであり（Ｗｕ ａｎｄ Ｋａｂａｔ（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１〜５０，１９７０；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、（ｉｉ）ＶＨ内の３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内の３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ 及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１〜１７，１９８７）によって定義されるように、構造が高度に可変性の抗体の可変ドメインの領域を指す。他の用語としては、「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐａｒａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５〜７７，２００３）及び「特異性決定残基の使用」（ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ １７：１３２〜４３，２００４）がある。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）から、抗原結合部位の標準化番号付け及び定義が提供されている。ＣＤＲ、ＨＶ及びＩＭＧＴの表記間の対応については、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐａｒａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５〜７７，２００３に述べられている。
本明細書で使用するところの「Ｃｈｏｔｈｉａ残基」とは、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７〜４８，１９９７）に従って番号付けされた抗体ＶＬ残基及びＶＨ残基である。
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」とは、抗原結合部位として定義されている配列以外の可変領域の残りの配列である。抗原結合部位は上述のような様々な用語によって定義され得ることから、フレームワークの正確なアミノ酸配列は、抗原結合部位がどのように定義されるかによって決まる。
「ヒト化抗体」とは、抗原結合部位がヒト以外の種に由来し、かつ可変領域フレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。ヒト化抗体はフレームワーク領域内に置換を含む可能性があることから、フレームワークは、発現されるヒト免疫グロブリン又は生殖系列の遺伝子配列の正確なコピーではない可能性がある。
「ヒト適合化」抗体又は「ヒトフレームワーク適合化（ＨＦＡ）」抗体とは、米国特許出願公開第ＵＳ２００９／０１１８１２７号に述べられる方法にしたがって適合されたヒト化抗体を指す。ヒト適合化抗体は、最大のＣＤＲとＦＲとの類似性、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２ループ並びに軽鎖ＣＤＲ３ループの一部分の長さ適合性及び配列類似性に基づいてアクセプターとなるヒトフレームワークを選択することによってヒト化される。
「ヒト抗体」とは、フレームワーク及び抗原結合部位の両方がヒト由来の配列に由来する重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体を指す。抗体が定常領域を含む場合、その定常領域もヒト由来の配列に由来する。
ヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列の免疫グロブリン又は再構成された免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られたものである場合に、ヒト由来の配列に「由来する」重鎖又は軽鎖可変領域を含む。こうした系としては、ファージ上にディスプレイされるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及び本明細書に述べられるようなヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスなどのトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列又は再構成された免疫グロブリン配列と比較した場合に、例えば、自然に発生する体細胞変異又はフレームワーク又は抗原結合部位での意図的な置換の導入により、アミノ酸の差異を含み得る。一般的に、「ヒト抗体」は、アミノ酸配列が、ヒト生殖系列又は再構成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％一致している。いくつかの場合では、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７〜８６，２０００に述べられるようなヒトフレームワーク配列分析により誘導されるコンセンサスフレームワーク配列、又はＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５〜９６，２０１０及び国際特許公開第ＷＯ２００９／０８５４６２号に述べられるような、ファージ上にディスプレイされるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含み得る。抗原結合部位がヒト以外の種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
単離されたヒト化抗体は合成されたものでもよい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来するものであるが、合成ＣＤＲ及び／又は合成フレームワークを組み込んだファージディスプレイのようなシステムを用いて生成してもよく、又は抗体の特性を向上させるためにインビトロ変異生成されてもよく、結果として、インビボではヒト抗体生殖系列のレパートリーに自然に存在しない抗体が得られる。
本明細書で使用するところの「組換え抗体」なる用語には、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関して遺伝子導入又は染色体導入された動物（例えばマウス）又はそれから調製されたハイブリドーマ（以下に更に述べる）から単離される抗体、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離される抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリから単離される抗体、及びヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライスすることを伴う他の任意の手段によって調製、発現、生成、又は単離される抗体、あるいはＦａｂアーム交換を用いてインビトロで生成される抗体などの、組換え手段によって調製、発現、生成、又は単離されるすべての抗体が含まれる。
本明細書で使用するところの「モノクローナル抗体」なる用語は、単一の分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示すか、又は二重特異性モノクローナル抗体の場合では、２つの異なるエピトープに対して二重の結合特異性を示す。
本明細書で使用するところの「実質的に同一の」なる用語は、比較される２つの抗体可変領域のアミノ酸配列が同一であるか又は「わずかな差異」しかないことを意味する。わずかな差異とは、抗体の特性に悪影響を及ぼさない、抗体可変領域の配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸の置換である。本明細書に開示される可変領域の配列と実質上同一のアミノ酸配列は、本発明の範囲に含まれる。いくつかの実施形態では、配列同一性は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上高くてもよい。同一性（％）は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩｖ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）のＡｌｉｇｎＸモジュールの初期設定を使用してペアで整列させることによって決定することができる。本発明のタンパク質配列を問い合わせ配列として使用することで、例えば、関連する配列を特定するために公開データベース又は特許データベースでの検索を実行することができる。こうした検索を実行するために使用される代表的なプログラムとしては、初期設定を使用する、ＸＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴＰプログラム（ｈｔｔｐ＿／／ｗｗｗ＿ｎｃｂｉ＿ｎｌｍ／ｎｉｈ＿ｇｏｖ）、又はＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ（商標）（ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ、マサチューセッツ州ウェストボロー）スイートがある。
本明細書で使用するところの「エピトープ」なる用語は、抗体が特異的に結合する抗原の部分を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は多糖類側鎖などの部分の化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）表面集団からなり、特定の３次元構造特性及び特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、構造空間的単位を形成する連続的かつ／又は不連続的なアミノ酸で構成され得る。不連続的なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部分のアミノ酸は、タンパク質分子の折り畳みによって３次元空間において接近する。
本明細書で使用するところの「併用して」なる用語は、２以上の治療薬を、対象に、混合物中でともに、単独の薬剤として同時に、又は単独の薬剤として任意の順序で逐次投与できることを意味する。
本明細書の全体を通じて、抗体の定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、特に断りがない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に述べられるＥＵインデックスに従って行った。
物質の組成
本発明は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤を提供する。本発明は、本発明の二重特異性薬剤をコードするポリペプチド及びポリヌクレオチド、又はその相補的な核酸、ベクター、宿主細胞、並びにそれらの製造方法及び使用方法を提供する。
一重特異性及び二重特異性のＥＧＦＲ及び／又はｃ−ＭｅｔＦＮ３ドメイン含有結合分子
一重特異性ＥＧＦＲ ＦＮ３ドメイン含有結合性分子
本発明は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合し上皮増殖因子（ＥＧＦ）のＥＧＦＲとの結合をブロックするフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供するものであり、したがって、治療及び診断用途に広く用いられることができる。本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチド、又はその相補的な核酸、ベクター、宿主細胞、並びにそれらの製造方法及び使用方法を提供する。
本発明のＦＮ３ドメインは、高い親和性でＥＧＦＲと結合しＥＧＦＲシグナル伝達を阻害するため、小分子のＥＧＦＲ阻害剤と比較した場合に特異性及び低減された標的外毒性（off-target toxicity）の点で、また、従来の抗体治療と比較した場合に向上した組織浸透性の点で、利点をもたらし得る。
本発明の一実施形態は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し上皮増殖因子（ＥＧＦ）のＥＧＦＲとの結合をブロックする、単離されたフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである。
本発明のＦＮ３ドメインは、Ａ４３１細胞を用い、本発明のＦＮ３ドメインの存在下又は非存在下でインキュベートしたＡ４３１細胞に６００ｎＭのストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲートを使用して、結合したビオチン化ＥＧＦからの蛍光の量を検出する競合アッセイにおいて、約１×１０-7Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満、又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値で、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合をブロックすることができる。配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２２〜１３７のアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインなどの代表的なＦＮ３ドメインは、約１×１０-9Ｍ〜約１×１０-7ＭのＩＣ50値で、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合をブロックすることができる。本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いた本発明のＦＮ３ドメインの非存在下におけるＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合と比較した場合に、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％ブロックすることができる。
本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いた本発明のＦＮ３ドメインの非存在下におけるシグナル伝達のレベルと比較した場合に、ＥＧＦＲシグナル伝達を、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％阻害することができる。
ＥＧＦＲに対するＥＧＦなどのリガンドの結合は、受容体の二量体化、自己リン酸化、受容体の内部の細胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、並びにＤＮＡ合成の調節（遺伝子の活性化）及び細胞周期の進行又は細胞分裂に関与する複数のシグナルトランスダクション及びトランス活性化経路の開始を刺激する。ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害は、１以上のＥＧＦＲの下流のシグナル伝達経路の阻害につながり得るため、ＥＧＦＲを無効にすることは、細胞の増殖及び分化、血管新生、細胞運動性、並びに転移の阻害をはじめとする様々な作用を有し得る。
ＥＧＦＲシグナル伝達は、例えば、チロシンＹ１０６８、Ｙ１１４８、及びＹ１１７３のいずれかにおける受容体の自己リン酸化（Ｄｏｗｎｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１１：４８３〜５，１９８４）、並びに／又は天然若しくは合成基質のリン酸化を測定するなど、様々な周知の方法を用いて測定することができる。リン酸化は、ＥＬＩＳＡアッセイ又はホスホチロシン特異的抗体を用いたウェスタンプロットなどの周知の方法を用いて検出することができる。代表的なアッセイは、Ｐａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ ２８３：１４３３〜４４，１９９７及びＢａｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６２：１４３〜５０，１９９８、並びに本明細書に述べられるアッセイに見ることができる。
一実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞で測定した場合に、ＥＧＦＲの１１７３位のチロシン残基におけるＥＧＦ誘導ＥＧＦＲリン酸化を、約２．５×１０-6Ｍ未満、例えば、約１×１０-6Ｍ未満、約１×１０-7Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ、又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値で阻害する。
一実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞で測定した場合に、ＥＧＦＲの１１７３位のチロシン残基におけるＥＧＦ誘導ＥＧＦＲリン酸化を、約１．８×１０-8Ｍ〜約２．５×１０-6ＭのＩＣ50値で阻害する。このような代表的なＦＮ３ドメインには、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２２〜１３７のアミノ酸配列を有するものがある。
一実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、当業者により実施されるところの表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって測定される解離定数（ＫD）が約１×１０-8Ｍ未満、例えば約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満、約１×１０-12Ｍ、又は約１×１０-13Ｍ未満でヒトＥＧＦＲと結合する。特定の実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、約２×１０-10〜約１×１０-8ＭのＫDでヒトＥＧＦＲと結合する。ＥＧＦＲに対するＦＮ３ドメインの親和性は、任意の適当な方法を用いて実験的に測定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本明細書に述べられる方法を参照されたい。）測定される特定のＦＮ３ドメイン−抗原相互作用の親和性は、異なる条件（例えば浸透圧モル濃度、ｐＨ）下で測定される場合、異なり得る。そのため、親和性及びその他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫD、Ｋon、Ｋoff）の測定は、好ましくは、タンパク質骨格及び抗原の標準化溶液、並びに本明細書に述べられるバッファなどの標準化バッファを用いて行われる。
ＥＧＦＲと結合する本発明の代表的なＦＮ３ドメインとしては、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２２〜１３７のＦＮ３ドメインが挙げられる。
一実施形態では、ＥＧＦＲと特異的に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＥＧＦＲと特異的に結合するＦＮ３ドメインは、
配列ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含むＦＧループ（ただし、Ｘ9はＭ、又はＩである）と、
配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）を含むＢＣループ（ただし、
Ｘ1は、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＤであり、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｙ又はＷであり、
Ｘ3は、Ｐ、Ｄ又はＮであり、
Ｘ4は、Ｌ又は存在せず、
Ｘ5は、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり、
Ｘ6は、Ｇ、Ｄ又はＡであり、
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり、
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬである）と、を含む。
ＥＧＦＲと特異的に結合し、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する本発明のＦＮ３ドメインは、構造的要素として、配列ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７９）、又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含むＦＧループ（ただし、Ｘ9は、Ｍ、又はＩである）を含み得る。このようなＦＮ３ドメインは、アミノ酸８個又は９個の長さで、かつ配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）によって定義されるＢＣループを更に含んでよく、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞で測定した場合に約２．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値、又は約１．８×１０-8Ｍ〜約２．５×１０-6ＭのＩＣ50値でＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害することができる。
ＥＧＦＲと特異的に結合し、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する本発明のＦＮ３ドメインは、更に、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）、又は配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）、
（ただし、
Ｘ1は、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＤであり、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｙ又はＷであり、
Ｘ3は、Ｐ、Ｄ又はＮであり、
Ｘ4は、Ｌ又は存在せず、
Ｘ5は、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり、
Ｘ6は、Ｇ、Ｄ又はＡであり、
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり、
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ9は、Ｍ又はＩである）を含む。
周知の方法及び本明細書に述べられる方法を用いてＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを生成し、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する能力について試験することができる。
本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲと特異的に結合する単離されたＦＮ３ドメインであって、配列番号１８〜２９、配列番号１０７〜１１０、又は配列番号１２２〜１３７に示される配列を含むＦＮ３ドメインである。
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、例えば半減期延長分子の発現及び／又は接合を促進するために、特定のＦＮ３ドメインのＮ末端に連結された開始メチオニン（Ｍｅｔ）又はＣ末端に連結されたシステイン（Ｃｙｓ）を含む。
本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲと特異的に結合してＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合をブロックする単離されたフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであって、配列番号１のテンコン配列に基づいて設計されたライブラリから単離されたＦＮ３ドメインである。
一重特異性ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有結合性分子
本発明は、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合し、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合をブロックする、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供するものであり、したがって、治療及び診断用途で広く用いられ得る。本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチド、又はその相補的な核酸、ベクター、宿主細胞、並びにそれらの製造方法及び使用方法を提供する。
本発明のＦＮ３ドメインは高い親和性でｃ−Ｍｅｔと結合しｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を阻害するため、小分子のｃ−Ｍｅｔ阻害剤と比較した場合に特異性及び低減された標的外毒性（off-target toxicity）の点で、また、従来の抗体治療と比較した場合に向上した組織浸透性の点で、利点を与え得るものである。本発明のＦＮ３ドメインは一価であり、したがって他の二価の分子で生じ得る望ましくない受容体のクラスタリング及び活性化が防止される。
本発明の一実施形態は、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合し、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合をブロックする、単離されたフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである。
本発明のＦＮ３ドメインは、本発明のＦＮ３ドメインの存在下でｃ−ＭｅｔーＦｃ融合タンパク質に対するビオチン化ＨＧＦの結合の阻害を検出するアッセイにおいて、約１×１０-7Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満、又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値でｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合をブロックすることができる。代表的なＦＮ３ドメインは、約２×１０-10Ｍ〜約６×１０-8ＭのＩＣ50値でｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合をブロックすることができる。本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いた本発明のＦＮ３ドメインの非存在下におけるｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合と比較した場合に、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％ブロックすることができる。
本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いた本発明のＦＮ３ドメインの非存在下におけるシグナル伝達のレベルと比較した場合に、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％阻害することができる。
ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合は、受容体の二量体化、自己リン酸化、受容体の内部の細胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、並びにＤＮＡ合成の調節（遺伝子の活性化）及び細胞周期の進行又は細胞分裂に関与する複数のシグナルトランスダクション及びトランス活性化経路の開始を刺激する。ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達の阻害は、１以上のｃ−Ｍｅｔの下流のシグナル伝達経路の阻害につながり得るため、ｃ−Ｍｅｔを無効にすることは、細胞の増殖及び分化、血管新生、細胞運動性、並びに転移の阻害をはじめとする様々な作用を有し得る。
ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達は、例えば、チロシン残基Ｙ１２３０、Ｙ１２３４、Ｙ１２３５、若しくはＹ１３４９のうちの少なくとも１つにおける受容体の自己リン酸化、及び／又は天然若しくは合成基質のリン酸化を測定するなど、様々な周知の方法を用いて測定することができる。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又はウェスタンブロット中のホスホチロシンに対して特異的な抗体を使用して検出することができる。チロシンキナーゼ活性のアッセイは、例えば、Ｐａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ ２８３：１４３３〜４４，１９９７及びＢａｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６２：１４３〜５０，１９９８に述べられており、また、本明細書に述べられるアッセイである。
一実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞で測定した場合に、ｃ−Ｍｅｔの１３４９位の残基におけるＨＧＦ誘導ｃ−Ｍｅｔリン酸化を、約１×１０-6Ｍ未満、約１×１０-7Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ、又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値で阻害する。
一実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞で測定した場合に、ｃ−ＭｅｔチロシンＹ１３４９におけるＨＧＦ誘導ｃ−Ｍｅｔリン酸化を、約４×１０-9Ｍ〜約１×１０-6ＭのＩＣ50値で阻害する。
一実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、当業者により実施されるところの表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって測定される解離定数（ＫD）が、約１×１０-7Ｍ、１×１０-8Ｍ、１×１０-9Ｍ、１×１０-10Ｍ、１×１０-11Ｍ、１×１０-12Ｍ、１×１０-13Ｍ、１×１０-14Ｍ、又は１×１０-15Ｍ以下でヒトｃ−Ｍｅｔと結合する。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、約３×１０-10Ｍ〜約５×１０-8ＭのＫDでヒトｃ−Ｍｅｔと結合する。ｃ−Ｍｅｔに対するＦＮ３ドメインの親和性は、任意の適当な方法を用いて実験的に測定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本明細書に述べられる方法を参照されたい。）測定される特定のＦＮ３ドメイン−抗原相互作用の親和性は、異なる条件（例えば浸透圧モル濃度、ｐＨ）下で測定される場合、異なり得る。そのため、親和性及びその他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫD、Ｋon、Ｋoff）の測定は、好ましくは、タンパク質骨格及び抗原の標準化溶液、並びに本明細書に述べられるバッファなどの標準化バッファを用いて行われる。
ｃ−Ｍｅｔと結合する本発明の代表的なＦＮ３ドメインとしては、配列番号３２〜４９又は１１１〜１１４のアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインが挙げられる。
一実施形態では、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合するＦＮ３ドメインは、
配列ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16（配列番号１８４）を含むＣ鎖及びＣＤループ（ただし、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり、
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり、
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり、
Ｘ16は、Ｅ又はＤである）と、
配列ＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23（配列番号１８５）を含むＦ鎖及びＦＧループ（ただし、
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり、
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり、
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり、
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ21は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり、
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり、
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである）と、を含む。
ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合しｃ−Ｍｅｔの自己リン酸化を阻害する本発明のＦＮ３ドメインは、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）
（ただし、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり、
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり、
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり、
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり、
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり、
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり、
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり、
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり、
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ21は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり、
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり、
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである）を更に含む。
本発明の別の実施形態は、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する単離されたＦＮ３ドメインであって、配列番号３２〜４９、又は配列番号１１１〜１１４に示される配列を含むＦＮ３ドメインである。
本発明の別の実施形態は、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合しｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合をブロックする単離されたフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであって、配列番号１のテンコン配列に基づいて設計されたライブラリから単離されたＦＮ３ドメインである。
テンコン配列に基づいたライブラリからのＥＧＦＲ又はｃ−ＭｅｔＦＮ３ドメインの単離
テンコン（配列番号１）は、ヒトテネイシンＣの１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列より設計された、天然には存在しないフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２；米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号）。テンコンの結晶構造は、ＦＮ３ドメインに特徴的な７個のβ鎖を連結する６個の表面が露出したループを示し、これらのβ鎖は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧと呼ばれ、これらのループは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧループと呼ばれている（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８９：８９９０〜８９９２，１９９２；米国特許第６，６７３，９０１号）。これらのループ、又は各ループ内の選択された残基をランダム化することによって、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔと結合する新規な分子を選択するために使用することができるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構築することができる。表１に、テンコン（配列番号１）の各ループ及びβ鎖の位置及び配列を示す。
したがって、テンコン配列に基づいて設計されたライブラリは、以下に述べるライブラリＴＣＬ１又はＴＣＬ２のような、ランダム化されたＦＧループ、又はランダム化されたＢＣ及びＦＧループを有し得る。テンコンのＢＣループは、アミノ酸７個の長さであり、したがって、ＢＣループにおいて多様化されテンコン配列に基づいて設計されたライブラリでは１、２、３、４、５、６又は７個のアミノ酸をランダム化することができる。テンコンのＦＧループは、アミノ酸７個の長さであり、したがって、ＦＧループにおいて多様化されテンコン配列に基づいて設計されたライブラリでは１、２、３、４、５、６又は７個のアミノ酸をランダム化することができる。ループの残基の挿入及び／又は欠失によってテンコンライブラリ内のループにおける更なる多様性を実現することができる。例えば、ＦＧ及び／又はＢＣループを、アミノ酸１〜２２個だけ延長でき、又はアミノ酸１〜３個だけ短縮することができる。テンコン内のＦＧループがアミノ酸７個の長さであるのに対して、抗体重鎖内の対応するループは残基４〜２８個の範囲である。最大の多様性を与えるために、抗体ＣＤＲ３の残基４〜２８個の長さの範囲に対応するようにＦＧループの配列及び長さを多様化することができる。例えば、ＦＧループの長さを、更にアミノ酸１、２、３、４又は５個だけループを延長することによって更に多様化することができる。
テンコン配列に基づいて設計されたライブラリは、ＦＮ３ドメインの側面に形成され且つ２個以上のβ鎖と少なくとも１個のループを含む、ランダム化された別表面を有してもよい。このような別表面の１つは、Ｃ及びＦβ鎖内のアミノ酸とＣＤ及びＦＧループとによって形成される（Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面）。テンコンの別のＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面に基づいたライブラリの設計が図１に示されており、このようなライブラリの詳細な生成法については米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０２２６８３４号に述べられている。
テンコン配列に基づいて設計されたライブラリには、１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６位の残基（残基の番号付けは配列番号１に対応している）に置換を有し、高い熱安定性を示すテンコン変異体などの、テンコン変異体に基づいて設計されたライブラリも含まれる。代表的なテンコン変異体は米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に述べられており、配列番号１のテンコンと比較した場合に置換Ｅ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉを有するテンコン２７（配列番号９９）を含む。
テンコン及び他のＦＮ３配列に基づいたライブラリは、ランダムな又は所定のアミノ酸の組を用いて、選択された残基位置においてランダム化することができる。例えば、ランダム置換を有するライブラリ中の変異体は、２０種類の天然に存在するアミノ酸すべてをコードするＮＮＫコドンを用いて生成することができる。他の多様化スキームでは、ＤＶＫコドンを用いてアミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓをコードすることができる。あるいは、ＮＮＳコドンを用いて２０種類すべてのアミノ酸残基を生じさせ、同時に終止コドンの頻度を低減することができる。多様化しようとする位置に偏ったアミノ酸分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリは、例えば、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）テクノロジー（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を用いて合成することができる。このテクノロジーでは、数千の遺伝子合成プロセスに充分な普遍的な構成要素として機能する予め調製された二本鎖トリプレットのライブラリを使用する。トリプレットのライブラリは、任意の所望のＤＮＡ分子を構築するのに必要なすべての可能な配列の組合せを表す。コドン指定は、周知のＩＵＢコードによる。
本発明のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合するＦＮ３ドメインは、各タンパク質がそれをコードするＤＮＡと安定的に関連付けられた、インビトロ翻訳後に形成されたタンパク質ーＤＮＡ複合体のプールを生成するために、骨格タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントをＲｅｐＡをコードするＤＮＡフラグメントにライゲーションするためのｃｉｓディスプレイを用いてテンコンライブラリなどのＦＮ３ライブラリを生成することによって（米国特許第７，８４２，４７６号、Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１，２８０６〜２８１０，２００４）、また当該技術分野では既知の、及び実施例において述べられる任意の方法によってＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対する特異的結合についてライブラリをアッセイすることによって、単離することができる。使用できる代表的な周知の方法としては、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、並びに競合及び非競合アッセイがある（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する特定されたＦＮ３ドメインは、本明細書に述べられる方法を用いて、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合、又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合など、ＥＧＦＲリガンドをブロックする能力について、また、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を阻害する能力について更に特性評価される。
本発明のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合するＦＮ３ドメインは、任意のＦＮ３ドメインをテンプレートとして使用してライブラリを作製し、本明細書で提供される方法を用いてこのライブラリをＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する分子についてスクリーニングすることで生成することができる。使用できる代表的なＦＮ３ドメインとしては、テネイシンＣの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）（配列番号７５）、フィブコン（配列番号７６）、及びフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（配列番号７７）がある。インビトロでライブラリを発現又は翻訳するためには、標準的なクローニング及び発現方法を使用してライブラリをベクターにクローニングするか、又はライブラリの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成する。例えば、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４，４９３７〜４９４２，１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４，１２２９７〜１２３０２，１９９７）、又はその他の無細胞系（米国特許第５，６４３，７６８号）を利用することができる。ＦＮ３ドメイン変異体のライブラリは、例えば任意の適当なバクテリオファージの表面に見られる融合タンパク質として発現させることができる。バクテリオファージの表面に融合ポリペプチドを見せるための方法は周知のものである（米国特許出願公開第２０１１／０１１８１４４号、国際特許公開第ＷＯ２００９／０８５４６２号、米国特許第６，９６９，１０８号、米国特許第６，１７２，１９７号、米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第６，５８２，９１５号、米国特許第６，４７２，１４７号）。
本発明のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合するＦＮ３ドメインを修飾することによって、熱安定性、並びに熱による折り畳み及び展開の可逆性を向上させるなど、特性を向上させることができる。タンパク質及び酵素の見かけの熱安定性を高めるため、極めて類似性のある熱安定性配列との比較に基づく合理的設計、ジスルフィド架橋の安定化設計、αヘリックスの傾向を高める変異、塩橋の操作、タンパク質の表面電荷の改変、定方向進化、及びコンセンサス配列の組成を含む、いくつかの方法が応用されている（Ｌｅｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｙｓｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２，３７１〜３７５，２００１）。高い熱安定性は、発現されるタンパク質の収率を高め、溶解度又は活性を高め、免疫原性を低減させ、製造におけるコールドチェーンの必要性を最小限とすることができる。テンコン（配列番号１）の熱安定性を高めるために置換することが可能な残基としては、１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６位の残基があり、これらは米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に述べられている。これらの残基に対応した置換を、本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子に組み入れることができる。
本発明の別の実施形態は、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、１２２〜１３７に示される配列を含み、テンコン（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び８６位に対応する１以上の残基位置に置換を更に含む、ＥＧＦＲと特異的に結合しＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合をブロックする単離されたＦＮ３ドメインである。
本発明の別の実施形態は、配列番号３２〜４９、又は１１１〜１１４に示される配列を含み、テンコン（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び８６位に対応する１以上の残基位置に置換を含む、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合しｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合をブロックする単離されたＦＮ３ドメインである。
代表的な置換としては、置換Ｅ１１Ｎ、Ｅ１４Ｐ、Ｌ１７Ａ、Ｅ３７Ｐ、Ｎ４６Ｖ、Ｇ７３Ｙ 及びＥ８６Ｉがある（番号付けは配列番号１に基づく）。
特定の実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、テンコン（配列番号１）の置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及びＥ８６Ｉに対応する置換を含む。
ＥＧＦＲと特異的に結合するＦＮ３ドメイン（図１）は、テンコン（配列番号１）と比較した場合に長いＦＧループを有している。したがって、テンコン（配列番号１）の残基１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び８６に対応した残基は、配列番号２４のＦＮ３ドメインを除いて図１Ａ及び１Ｂに示されるＥＧＦＲ ＦＮ３ドメインの残基１１、１４、１７、３７、４６、７３及び９１であり、ＢＣループ内への１個のアミノ酸の挿入により、対応する残基は残基１１、１４、１７、３８、７４、及び９２である。
本発明の別の実施形態は、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２２〜１３７に示されるアミノ酸配列を含み、テンコン（配列番号１）の置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及びＥ８６Ｉに対応する置換を任意に有する、ＥＧＦＲと特異的に結合しＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合をブロックする単離されたＦＮ３ドメインである。
本発明の別の実施形態は、配列番号３４〜４９、又は１１１〜１１４に示されるアミノ酸配列を含み、テンコン（配列番号１）の置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及びＥ８６Ｉに対応する置換を任意に有する、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合しｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合をブロックする単離されたＦＮ３ドメインである。
タンパク質の安定性及びタンパク質の不安定性の測定は、タンパク質の完全性と同じか又は異なる側面として捉えることができる。タンパク質は、熱、紫外線又は電離放射線、溶液中の場合には周囲の浸透圧モル濃度及びｐＨの変化、微細孔径濾過、紫外線放射、γ線照射などの電離放射線、化学的又は熱的脱水、あるいはタンパク質構造の破壊を生じさせ得る他の任意の作用又は力による機械的剪断力によって生じる変性に対して感受性がある、つまり「不安定」である。分子の安定性は、標準的な方法を用いて決定することができる。例えば、分子の安定性は、標準的な方法を用いて、分子の半分が展開される摂氏温度（℃）である熱融解（Ｔｍ）温度を測定することによって決定することができる。一般的には、ＴＭが高いほど分子はより安定的している。熱以外に、化学環境もまた、タンパク質が特有の三次元構造を維持する能力を変化させる。
一実施形態では、本発明のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔと結合するＦＮ３ドメインは、ＴＭの増大によって測定される改変前の同じドメインと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％以上高い安定性を示す。
化学変性も同様に、様々な方法によって測定することができる。化学変性剤としては、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸グアニジニウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベンゼン、アセトニトリル）、塩類（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）、還元剤（例えばジチオスレイトール、βメルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン、及び水素化物、例えば水素化ホウ素ナトリウム）、非イオン性及びイオン性洗剤、酸（例えば塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ3ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えばリン脂質）、及び標的変性剤が挙げられる。変性の程度の定量化は、標的分子に結合する能力などの機能特性の喪失、又は凝集する傾向、それまで溶媒が到達できなかった残基の露出、若しくはジスルフィド結合の崩壊若しくは形成などの物理化学的特性に依存し得る。
一実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔと結合する本発明のＦＮ３ドメインは、化学的変性剤としてグアニジン塩酸塩を使用することによって測定し、操作前の同じ骨格と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％以上高い安定性を示す。増大した安定性は、周知の方法を用いて、増加する濃度のグアニジン塩酸塩で処理した際に減少するトリプトファン蛍光の関数として測定することができる。
本発明のＦＮ３ドメインは、単量体、二量体、若しくは多量体として、例えば標的分子結合の価数、したがってアビディティを増大させるための手段として、又は２以上の異なる標的分子に同時に結合する二重若しくは多重特異性骨格を生成するための手段として生成することができる。二量体及び多量体は、例えばアミノ酸リンカー、例えばポリグリシン、グリシン及びセリン、又はアラニン及びプロリンを含むリンカーを含めることにより、一重特異性、二重特異性又は多重特異性タンパク質骨格を連結することによって生成することができる。代表的なリンカーとしては、（ＧＳ）2、（配列番号７８）、（ＧＧＧＧＳ）5（配列番号７９）、（ＡＰ）2（配列番号８０）、（ＡＰ）5（配列番号８１）、（ＡＰ）10（配列番号８２）、（ＡＰ）20（配列番号８３）及びＡ（ＥＡＡＡＫ）5ＡＡＡ（配列番号８４）リンカーが挙げられる。二量体及び多量体は、互いにＮ〜Ｃ方向に連結することができる。ポリペプチドを新規の連結融合ポリペプチドに結合するための天然及び人工ペプチドリンカーの使用は、文献においてよく知られている（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５２６０〜５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８，７２５〜７３１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１０９〜１１６，１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）。
ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤
本発明のＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤は、小分子のＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ阻害剤と比較した場合に、特異性及び低減された標的外毒性の点で利点をもたらすことができる。本発明は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤が、ＥＧＦＲと結合する一重特異性薬剤とｃ−Ｍｅｔと結合する一重特異性薬剤との混合物と比較した場合に、大幅に向上した相乗的阻害作用をもたらすという驚くべき発見に少なくとも一部基づいてなされたものである。これらの分子は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに対して特異的親和性を有するように調節することで腫瘍への浸透性及び保持性を最大化することができる。ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤は、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））よりも効率的なＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔのシグナル伝達経路阻害をもたらし、より効率的に腫瘍増殖を阻害するものである。
ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する二重特異性薬剤は、ＥＧＦＲ結合ドメイン及びｃ−Ｍｅｔ結合ドメインを含む任意のポリペプチド又は多量体ポリペプチドによって形成されることができる。ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ結合ドメインは、抗体の抗原結合部位、抗体のＶＨ／ＶＬのペア、又はフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、フィブロネクチンＩＸ型（ＦＮ９）ドメインに基づいたドメインなどの別のタイプの結合分子、又はこれらの任意の組合わせであってよい。
ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ結合ポリペプチドは、既存の一重特異性ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ結合ポリペプチドから誘導してもよく、又は新たに単離されたものでもよい。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
本発明の一実施形態は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインを含む単離された二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、前記第１のＦＮ３ドメインは上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合しＥＧＦＲに対する上皮増殖因子（ＥＧＦ）の結合をブロックし、前記第２のＦＮ３ドメインは肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合しｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合をブロックする、単離された二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子である。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−ＭｅｔＦＮ３ドメイン含有分子は、本発明の任意のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと任意のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとを直接的に、又はリンカーを介して、共有結合により連結することによって生成することができる。したがって、二重特異性分子の第１のＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインについて上記に述べた特性を有し得るものであり、二重特異性分子の第２のＦＮ３ドメインは、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインについて上記に述べた特性を有し得るものである。
一実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘導ＥＧＦＲリン酸化を、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを使用してＡ４３１細胞で測定した場合に約２．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値で阻害し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ドメインは、ｃ−Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘導ｃ−Ｍｅｔリン酸化を、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを使用してＮＣＩ−Ｈ４４１細胞で測定した場合に約１．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値で阻害する。
別の実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘導ＥＧＦＲリン酸化を、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを使用してＡ４３１細胞で測定した場合に約１．８×１０-8Ｍ〜約２．５×１０-6ＭのＩＣ50値で阻害し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ドメインは、ｃ−Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘導ｃ−Ｍｅｔリン酸化を、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを使用してＮＣＩ−Ｈ４４１細胞で測定した場合に約４×１０-9Ｍ〜約１．５×１０-6ＭのＩＣ50値で阻害する。
別の実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、約１×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でヒトＥＧＦＲを結合し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ドメインは、約５×１０-8Ｍ未満のＫDでヒトｃ−Ｍｅｔを結合する。
ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの両方と結合する二重特異性分子では、第１のＦＮ３ドメインは、約２×１０-10〜約１×１０-8ＭのＫDでヒトＥＧＦＲを結合し、第２のＦＮ３ドメインは、約３×１０-10〜約５×１０-8ＭのＫDでヒトｃ−Ｍｅｔを結合する。
ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに対する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の親和性は、一重特異性分子について上述したように決定することができる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の第１のＦＮ３ドメインは、Ａ４３１細胞を用い、第１のＦＮ３ドメインの存在下又は非存在下でインキュベートしたＡ４３１細胞に対して６００ｎＭのストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲートを使用して、結合したビオチン化ＥＧＦからの蛍光の量を検出するアッセイにおいて、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を約１×１０-9Ｍ〜約１．５×１０-7ＭのＩＣ50値でブロックすることができる。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の第１のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いた第１のＦＮ３ドメインの非存在下におけるＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合と比較した場合に、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％ブロックすることができる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の第２のＦＮ３ドメインは、第２のＦＮ３ドメインの存在下でｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質に対するビオチン化ＨＧＦの結合の阻害を検出するアッセイにおいて、約２×１０-10Ｍ〜約６×１０-8ＭのＩＣ50値でｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合をブロックすることができる。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の第２のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いた第２のＦＮ３ドメインの非存在下におけるｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合と比較した場合に、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％ブロックすることができる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、同じアッセイ条件をを用いた本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の非存在下におけるシグナル伝達のレベルと比較した場合に、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％阻害することができる。
ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔシグナル伝達は、一重特異性分子について上記に述べた様々な周知の方法を用いて測定することができる。
ＥＧＦＲと特異的に結合する第１のＦＮ３ドメイン及びｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する第２のＦＮ３ドメインを含む本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、第１及び第２のＦＮ３ドメインの混合物により認められる相乗的阻害と比較して大幅に高いＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔシグナル伝達並びに腫瘍細胞増殖の相乗的阻害をもたらす。相乗的阻害は、例えば、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子によるＥＲＫリン酸化の阻害と、一方がＥＧＦＲと結合し他方がｃ−Ｍｅｔと結合する２種類の一重特異性分子の混合物によるＥＲＫリン酸化の阻害と、を測定することによって評価することができる。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、２種類の一重特異性ＦＮ３ドメインの混合物のＩＣ50値と比較した場合に少なくとも約１００倍小さい、例えば少なくとも５００、１０００、５０００又は１０，０００倍小さいＩＣ50値でＥＲＫリン酸化を阻害することができ、２種類の一重特異性ＦＮ３ドメインの混合物と比較して二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の少なくとも１００倍高い結合力を示すものである。代表的な二重特異性ＥＧＦＲ−ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、約５×１０-9以下のＩＣ50値でＥＲＫリン酸化を阻害することができる。ＥＲＫリン酸化は、標準的な方法及び本明細書に述べられる方法を用いて測定することができる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、７．５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを添加した１０％ ＦＢＳを含む培地によって誘導されるＮＣＩ−Ｈ２９２細胞の増殖の、第１のＦＮ３ドメインと第２のＦＮ３との混合物による阻害のＩＣ50値と比較した場合に、少なくとも３０倍低いＩＣ50値でＮＣＩ−Ｈ２９２細胞の増殖を阻害することができる。本発明の二重特異性分子は、第１のＦＮ３ドメインと第２のＦＮ３ドメインとの混合物による腫瘍細胞増殖の阻害のＩＣ50値と比較した場合に約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、又は約１０００倍低いＩＣ50値で腫瘍細胞増殖を阻害することができる。腫瘍細胞増殖の阻害は、標準的な方法及び本明細書に述べられる方法を用いて測定することができる。
本発明の別の実施形態は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインを含み、前記第１のＦＮ３ドメインが上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合しＥＧＦＲに対する上皮増殖因子（ＥＧＦ）の結合をブロックし、前記第２のＦＮ３ドメインが肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合しｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合をブロックする二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、
前記第１のＦＮ３ドメインが、
配列ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含むＦＧループ（ただし、Ｘ9はＭ、又はＩである）と、
配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）を含むＢＣループ（ただし、
Ｘ1は、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＤであり、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｙ又はＷであり、
Ｘ3は、Ｐ、Ｄ又はＮであり、
Ｘ4は、Ｌ又は存在せず、
Ｘ5は、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり、
Ｘ6は、Ｇ、Ｄ又はＡであり、
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり、
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬである）と、を含み、
前記第２のＦＮ３ドメインが、
配列ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16（配列番号１８４）を含むＣ鎖及びＣＤループ（ただし、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり、
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり、
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり、
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり、
Ｘ16は、Ｅ又はＤである）と、
配列ＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23（配列番号１８５）を含むＦ鎖及びＦＧループ（ただし、
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり、
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり、
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり、
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ21は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり、
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり、
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである）と、を含む、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子である。
別の実施形態では、二重特異性分子は、配列：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）、又は配列：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）
（ただし、配列番号１８２及び１８３中、
Ｘ1は、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＤであり、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｙ又はＷであり、
Ｘ3は、Ｐ、Ｄ又はＮであり、
Ｘ4は、Ｌ又は存在せず、
Ｘ5は、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり、
Ｘ6は、Ｇ、Ｄ又はＡであり、
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり、
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ9は、Ｍ又はＩである）を含む、ＥＧＦＲと結合する第１のＦＮ３ドメインを含む。
別の実施形態では、二重特異性分子は、配列：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）
（ただし、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり、
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり、
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり、
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり、
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり、
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり、
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり、
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり、
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ21は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり、
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり、
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ、Ｔ又はＬである）を含む、ｃ−Ｍｅｔと結合する第２のＦＮ３ドメインを含む。
代表的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、配列番号５０〜７２、１０６、１１８〜１２１、又は１３８〜１６７に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、ＥＧＦＲ自己リン酸化の阻害などのそれらの機能的特徴に関連した、配列ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）（ただしＸ9は、Ｍ又はＩである）を含む、ＥＧＦＲと結合する第１のＦＮ３ドメインのＦＧループのような特定の構造的特徴を含む。
一実施形態では、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−ＭｅｔＦＮ３ドメイン含有分子は、
ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘導ＥＧＦＲリン酸化を、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いてＨ２９２細胞で測定した場合に約８×１０-7Ｍ未満のＩＣ50値で阻害するか、
ｃ−Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘導ｃ−Ｍｅｔリン酸化を、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞で測定した場合に約８．４×１０-7Ｍ未満のＩＣ50値で阻害するか、
７．５ｎｇのＨＧＦを含む１０％ ＦＢＳにより誘導されるＨＧＦ誘導ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞増殖を約９．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値で阻害するか、
約２．０×１０-8Ｍ未満のＫDでＥＧＦＲと結合するか、又は
約２．０×１０-8Ｍ未満のＫDでｃ−Ｍｅｔと結合する。
別の実施形態では、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、
ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘導ＥＧＦＲリン酸化を、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いてＨ２９２細胞で測定した場合に約４．２×１０-9Ｍ〜８×１０-7ＭのＩＣ50値で阻害するか、
ｃ−Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘導ｃ−Ｍｅｔリン酸化を、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞で測定した場合に約２．４×１０-8Ｍから約８．４×１０-7ＭのＩＣ50値で阻害するか、
７．５ｎｇのＨＧＦを含む１０％ ＦＢＳにより誘導されるＨＧＦ誘導ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞増殖を約２．３×１０-8Ｍ〜約９．５×１０-6ＭのＩＣ50値で阻害するか、
約２×１０-10Ｍから約２×１０-8ＭのＫDでＥＧＦＲを結合するか、
約１×１０-9Ｍ〜約２．０×１０-8ＭのＫDでｃ−Ｍｅｔを結合する。
一実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、配列：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）を含むＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（ただし、
Ｘ1は、Ｄであり、
Ｘ2は、Ｄであり、
Ｘ3は、Ｐであり、
Ｘ4は、存在せず、
Ｘ5は、Ｈ又はＷであり、
Ｘ6は、Ａであり、
Ｘ7は、Ｆ
Ｘ8は、Ｙであり、
Ｘ9は、Ｍ又はＩである）と、
配列：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）を含むｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン
（ただし、
Ｘ10は、Ｗであり、
Ｘ11は、Ｆであり、
Ｘ12は、Ｆであり、
Ｘ13は、Ｖ又はＬであり、
Ｘ14は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ15は、Ｓ又はＫであり、
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり、
Ｘ17は、Ｖであり、
Ｘ18は、Ｎであり、
Ｘ19は、Ｌ又はＭであり、
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ21は、Ｓ又はＫであり、
Ｘ22は、Ｉであり、
Ｘ23は、Ｐである）と、を含む。
代表的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、配列番号５７、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７及び６８に示される配列を有するものである。
本発明の二重特異性分子は、上記に述べたテンコン（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する第１のＦＮ３ドメイン及び／又は第２のＦＮ３ドメインの１以上の残基位置に置換を、及び２９位に置換を更に含み得る。代表的な置換としては、置換Ｅ１１Ｎ、Ｅ１４Ｐ、Ｌ１７Ａ、Ｅ３７Ｐ、Ｎ４６Ｖ、Ｇ７３Ｙ、Ｅ８６Ｉ、及びＤ２９Ｅがある（番号付けは配列番号１に基づく）。当業者であれば、以下に述べられるような、側鎖において関連したアミノ酸のファミリー内のアミノ酸など、他のアミノ酸も置換に用いることができる点を認識するであろう。作製された変異体は、本明細書に述べられる方法を用いて、安定性並びにＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対する結合性について試験することができる。
一実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−ＭｅｔＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲと特異的に結合する第１のＦＮ３ドメインと、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する第２のＦＮ３ドメインと、を含み、前記第１のＦＮ３ドメインは配列：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ24ＶＴＸ25ＤＳＸ26ＲＬＳＷＤＤＰＸ27ＡＦＹＸ28ＳＦＬＩＱＹＱＸ29ＳＥＫＶＧＥＡＩＸ30ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＸ31ＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ32ＲＧＬＰＬＳＡＸ33ＦＴＴ（配列番号１８７）（ただし、
Ｘ24は、Ｅ、Ｎ又はＲであり、
Ｘ25は、Ｅ又はＰであり、
Ｘ26は、Ｌ又はＡであり、
Ｘ27は、Ｈ又はＷであり、
Ｘ28は、Ｅ又はＤであり、
Ｘ29は、Ｅ又はＰであり、
Ｘ30は、Ｎ又はＶであり、
Ｘ31は、Ｇ又はＹであり、
Ｘ32は、Ｍ又はＩであり、
Ｘ33は、Ｅ又はＩである）を含み、
第２のＦＮ３ドメインは配列：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ34ＶＴＸ35ＤＳＸ36ＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦＸ37ＦＸ38Ｘ39Ｘ40ＧＸ41ＡＩＸ42ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＸ43Ｘ44ＶＫＧＧＸ45ＩＳＰＰＬＳＡＸ46ＦＴＴ（配列番号１８８）（ただし、
Ｘ34は、Ｅ、Ｎ又はＲであり、
Ｘ35は、Ｅ又はＰであり、
Ｘ36は、Ｌ又はＡであり、
Ｘ37は、Ｅ又はＰであり、
Ｘ38は、Ｖ又はＬであり、
Ｘ39は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ40は、Ｓ又はＫであり、
Ｘ41は、Ｅ又はＤであり、
Ｘ42は、Ｎ又はＶであり、
Ｘ43は、Ｌ又はＭであり、
Ｘ44は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ45は、Ｓ又はＫであり、
Ｘ46は、Ｅ又はＩである）を含む。
他の実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のＦＮ３ドメインと、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のＦＮ３ドメインとを含む。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに対して特異的親和性を有するように調節することで腫瘍への蓄積を最大化することができる。
本発明の別の実施形態は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインを含む分子を含み、前記第１のＦＮ３ドメインは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合しＥＧＦＲに対する上皮増殖因子（ＥＧＦ）の結合をブロックし、前記第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合しｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合をブロックし、前記第１のＦＮ３ドメイン及び前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１のテンコン配列に基づいて設計されたライブラリから単離される。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、周知の方法を用いて本発明のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとを共有結合により連結することによって生成することができる。ＦＮ３ドメイン同士は、例えばポリグリシン、グリシン及びセリン、又はアラニン及びプロリンを含むリンカーなどのリンカーを介して連結することができる。代表的なリンカーとしては、（ＧＳ）2、（配列番号７８）、（ＧＧＧＧＳ）5（配列番号７９）、（ＡＰ）2（配列番号８０）、（ＡＰ）5（配列番号８１）、（ＡＰ）10（配列番号８２）、（ＡＰ）20（配列番号８３）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）5ＡＡＡ（配列番号８４）リンカーが挙げられる。ポリペプチドを新規の連結融合ポリペプチドに結合するための天然及び人工ペプチドリンカーの使用は、文献においてよく知られている（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５２６０〜５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８，７２５〜７３１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１０９〜１１６，１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、第１のＦＮ３ドメインのＣ末端から第２のＦＮ３ドメインのＮ末端へ、又は第２のＦＮ３ドメインのＣ末端から第１のＦＮ３ドメインのＮ末端へと互いに連結することができる。任意のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインをｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと共有結合により連結することができる。代表的なＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとしては、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、及び１２２〜１３７に示されるアミノ酸配列を有するドメインがあり、代表的なｃ〜Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとしては、配列番号３２〜４９、及び１１１〜１１４に示されるアミノ酸配列を有するドメインがある。二重特異性分子に連結されるＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、それらのＮ末端に開始メチオニン（Ｍｅｔ）を更に含んでもよい。
本発明の範囲には、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の変異体が含まれる。例えば、得られる変異体が、親分子と比較した場合にＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに対して同様の選択性及び効能を保持するかぎり、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子に置換を行うことができる。代表的な改変としては、例えば、親分子と同様の特性を有する変異体を生じる保存的置換がある。保存的置換とは、側鎖において関連したアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。遺伝子にコードされているアミノ酸は、（１）酸性アミノ酸（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）、（２）塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び（４）非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）の４つのファミリーに分類することができる。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、併せて芳香族アミノ酸として分類される場合もある。あるいは、アミノ酸レパートリーは、（１）酸性アミノ酸（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）、（２）塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）脂肪族アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）（セリンとスレオニンは、任意に脂肪族ヒドロキシルとして別に分類される）、（４）芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、（５）アミド（アスパラギン、グルタミン）、及び（６）硫黄含有アミノ酸（システイン及びメチオニン）として分類することができる（Ｓｔｒｙｅｒ（ｅｄ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９８１）。非保存的置換を、異なるクラスのアミノ酸間でのアミノ酸残基の置換に関与する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子に行って、二重特異性分子の特性を向上させることができる。ポリペプチド又はそのフラグメントのアミノ酸配列の変化が機能的なホモログを生じるか否かは、本明細書に述べられるアッセイを用いて、修飾されていないポリペプチド又はフラグメントと同様の方法で修飾ポリペプチド又はフラグメントが応答を生じる能力を評価することによって容易に判定することができる。１超の置換が生じたペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を同じ方法で容易に試験することができる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、例えば標的分子結合の価数、したがってアビディティを高めるための手段として、二量体又は多量体として生成することができる。多量体は、例えば周知の方法を用いてアミノ酸リンカーを組み込むことによって１以上のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと１以上のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとを連結して、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔのいずれかに対して少なくとも二重特異性の少なくとも３個の個々のＦＮ３ドメインを含む分子を形成することによって生成することができる。
本発明の別の実施形態は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインを含む分子を含み、前記第１のＦＮ３ドメインが、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合しＥＧＦＲに対する上皮増殖因子（ＥＧＦ）の結合をブロックし、前記第２のＦＮ３ドメインが、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合しｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合をブロックする、配列番号５０〜７２、１０６、又は１３８〜１６５に示されるアミノ酸配列を含む、二重特異性ＦＮ３ドメインである。
半減期延長部分
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子又は一重特異性ＥＧＦＲ若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、例えば共有結合による相互作用を介して他のサブユニットを組み込んでもよい。本発明の一態様では、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は半減期延長部分を更に含む。代表的な半減期延長部分には、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合タンパク質及び／又はドメイン、トランスフェリン、並びにこれらのフラグメント及び類似体、並びにＦｃ領域がある。代表的なアルブミン結合ドメインの１つを配列番号１１７に示す。
抗体に似た特性、特にＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ））のダウンレギュレーションといったＦｃエフェクター機能などのＦｃ領域と関連した特性を付与するため、抗体定常領域の全体又は一部を本発明の分子に結合することが可能であり、これらの活性をあずかるＦｃ内の残基を修飾することによって更に修飾することができる（概論については、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，６８５〜６９１，２００９を参照）。
本発明の二重特異性分子には、所望の特性を得るために、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばラウリン酸塩、ミリスチン酸塩、ステアリン酸塩、アラキジン酸塩、ベヘン酸塩、オレイン酸塩、アラキドン酸塩、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類）などの更なる部分を組み込むことができる。これらの部分は、タンパク質骨格のコード配列との直接的融合体であり得、標準的なクローニング及び発現技術によって生成することができる。あるいは、周知の化学的結合方法を用いて、組み換えにより生成された本発明の分子にこうした部分を結合させることもできる。
例えば、周知の方法を用いて、分子のＣ末端にシステイン残基を組み込み、このシステインにｐｅｇｙｌ基を結合させるにより、本発明の二重特異性分子又は一重特異性分子にｐｅｇｙｌ部分を付加することができる。Ｃ末端にシステインを有する代表的な二重特異性分子としては、配列番号１７０〜１７８に示されるアミノ酸配列を有するものがある。
更なる部分を組み込む本発明の一重特異性分子及び二重特異性分子は、複数の周知のアッセイによって機能性について比較することができる。例えば、Ｆｃドメイン及び／又はＦｃドメイン変異体の組み込みにより変化した一重特異性及び／又は二重特異性分子の特性は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、若しくはＦｃＲｎ受容体などの可溶形態の受容体を用いるか、又は例えばＡＤＣＣ若しくはＣＤＣを測定する周知の細胞に基づいたアッセイを用いるか、又はインビボモデルにおいて本発明の分子の薬物動態学的特性を評価することによって、Ｆｃ受容体結合アッセイにおいてアッセイすることができる。
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
本発明は、本発明のＥＧＦＲ結合若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子を、単離されたポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの一部として、又は直鎖状ＤＮＡ配列の一部としてコードする核酸を提供するものであり、インビトロ転写／翻訳で使用される直鎖状ＤＮＡ配列、組成物又はそれらの指向性変異誘発物質の原核細胞、真核細胞若しくは繊維状ファージ発現、分泌及び／若しくはディスプレイと適合するベクターが含まれる。本明細書では、特定の代表的なポリヌクレオチドを開示するが、遺伝コードの縮重又は所与の発現系におけるコドン選択性を考慮すれば、本発明のＥＧＦＲ結合若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子をコードする他のポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲に含まれるものである。
本発明の一実施形態は、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２２〜１３７のアミノ酸配列を有する、ＥＧＦＲと特異的に結合するＦＮ３ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドである。
本発明の一実施形態は、配列番号９７〜９８又は１６８〜１６９のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドである。
本発明の一実施形態は、配列番号３２〜４９、又は１１１〜１１４に示される配列のアミノ酸配列を有する、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合するＦＮ３ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドである。
本発明の一実施形態は、配列番号５０〜７２、１０６、１１８〜１２１、又は１３８〜１６５のアミノ酸配列を有する、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子をコードする単離されたポリヌクレオチドである。
本発明の一実施形態は、配列番号１１５〜１１６、又は１６６〜１６７のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成装置での固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成により生成され得、完全な一本鎖又は二本鎖分子として構築することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲの後に通常のクローニングを行うなどの他の方法によって生成することができる。特定の既知の配列のポリヌクレオチドを生成する又は得るための方法は、当該技術分野では周知である。
本発明のポリヌクレオチドは、プロモーター又はエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、ＲｅｐＡ結合を促進するｃｉｓ配列など、少なくとも１つの非コード配列を含み得る。ポリヌクレオチド配列はまた、タンパク質の精製又は検出を促進するための、例えばヒスチジンタグ若しくはＨＡタグなどのマーカー又はタグ配列、シグナル配列、ＲｅｐＡ、Ｆｃ、又はｐＩＸ若しくはｐＩＩＩなどのバクテリオファージコートタンパク質などの融合タンパク質パートナーをコードする更なるアミノ酸をコードする更なる配列を含んでもよい。
本発明の別の実施形態は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。こうしたベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物若しくは遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであってよい。こうしたベクターは、かかるベクターによってコードされているポリペプチドの発現を制御、調節、誘導、又は許容することができる核酸配列要素を含む発現ベクターであり得る。このような要素は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現系におけるコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含み得る。このような発現系は、当該技術分野では周知の細胞に基づく系であっても無細胞系であってもよい。
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。本発明の一重特異性ＥＧＦＲ結合若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−ＭｅｔＦＮ３ドメイン含有分子は、当該技術分野では周知であるように、細胞株、混合細胞株、不死化細胞、又は不死化細胞のクローン化集団によって任意に生成させることもできる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７〜２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２nd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４〜２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７〜２００１）を参照されたい。発現用に選択される宿主細胞は、哺乳類由来であってもよく、あるいはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅ Ｇ２、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はこれらの任意の誘導細胞、不死化若しくは形質転換細胞から選択してもよい。あるいは、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化することができない種又は生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、及び天然若しくは操作された大腸菌属、クレブシエラ属、又はシュードモナス属の菌株などの原核細胞又は生物から選択することもできる。
本発明の別の実施形態は、本発明のＥＧＦＲ若しくはｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する単離されたＦＮ３ドメイン、又は本発明の単離された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子を生成するための方法であって、本発明の単離された宿主細胞を、ＥＧＦＲ若しくはｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する単離されたＦＮ３ドメイン、又は単離された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子が発現される条件下で培養することと、前記ドメイン又は分子を精製することと、を含む方法である。
本発明のＥＧＦＲ若しくはｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメイン、又は単離された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、例えば、タンパク質Ａ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー、あるいは高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの周知の方法によって組換え細胞培養から精製することができる。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は新たに生成するか、又は既存の一重特異性の抗ＥＧＦＲ抗体及び抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を操作することができる。
二重特異性分子を操作するために使用することができる代表的な抗ＥＧＦＲ抗体としては、例えば、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ）、ニモツズマブ、ネシツムマブ、マツズマブ、及び例えば、米国特許第７，５９５，３７８号、米国特許第７，２４７，３０１号、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１４２号、米国特許第５，８９１，９９６号、米国特許第５，２１２，２９０号、米国特許第５，５５８，８６４号、又は米国特許第７，５８９，１８０に述べられるものがある。例えば、配列番号１８９又は１９１に示されるアミノ酸配列を有する抗体ＶＨドメイン及び配列番号１９０又は１９２に示されるアミノ酸配列を有する抗体ＶＬドメインを使用することができる。
二重特異性分子を操作するために使用することが可能な代表的な抗ｃ−Ｍｅｔ抗体としては、例えば、リロツムマブ、オナルツズマブ、フィクラツズマブ、及び例えば国際特許公開第ＷＯ２０１１／１１０６４２号、米国特許出願公開第２００４／０１６６５４４号、国際特許公開第ＷＯ２００５／０１６３８２号、又は国際特許公開第ＷＯ２００６／０１５３７１号に述べられるものがある。例えば、配列番号１９３又は１９５に示されるアミノ酸配列を有する抗体ＶＨドメイン及び配列番号１９４又は１９６に示されるアミノ酸配列を有する抗体ＶＬドメインを使用することができる。米国一般名（ＵＳＡＮ）により識別される抗体の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列が、ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ａｍａ−ａｓｓｎ＿ｏｒｇにおいて米国医学会より、又はＣＡＳ登録番号によって利用可能である。
一重特異性ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ結合可変ドメインは、例えば、ヒト免疫グロブリン、あるいはＦａｂ、１本鎖抗体（ｓｃＦＶ）又は合されない若しくは対合された抗体可変領域などのその一部をファージに発現させるように操作したファージディスプレイライブラリから新たに選択し（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７〜８６，２０００；Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２５４：６７〜８４，２００１；Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９〜３１４，１９９６；Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＩＴＡＳ（ＵＳＡ）９５：６１５７〜６１６２，１９９８；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：５８１，１９９１）、続いて、操作により二重特異性フォーマットとすることができる。一重特異性ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ結合可変ドメインは、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９７：３８５〜９６及び国際特許公開第ＷＯ０９／０８５４６２号に述べられるように、例えば抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をバクテリオファージｐＩＸコートタンパク質との融合タンパク質として発現するファージディスプレイライブラリから単離することができる。この抗体ライブラリを、ヒトＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメインとの結合についてスクリーニングし、得られた陽性クローンを更に特性評価し、クローンライセートからＦａｂを単離する。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当該技術分野では確立されたものである。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６９８号、米国特許第５，４２７，９０８号、米国特許第５号、５８０，７１７号、米国特許第５，９６９，１０８号、米国特許第６，１７２，１９７号、米国特許第５，８８５，７９３号、米国特許第６，５２１，４０４号、米国特許第６，５４４，７３１号、米国特許第６，５５５，３１３号、米国特許第６，５８２，９１５号、及び米国特許第６，５９３，０８１号を参照されたい。得られたＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔと結合する新たな可変領域は、本明細書に述べられる方法を用いて操作して二重特異性フォーマットとする。
二重特異性抗体フォーマット
本発明の抗体は２以上の抗原結合部位を有し、二重特異的である。本発明の二重特異性抗体には、完全長の抗体構造を有する抗体が含まれる。
本明細書で使用するところの「完全長の抗体」とは、２本の完全長の抗体重鎖と２本の完全長の抗体軽鎖とを有する抗体を指す。完全長の抗体重鎖（ＨＣ）は、周知の重鎖の可変及び定常ドメインＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。完全長の抗体軽鎖（ＬＣ）は、周知の軽鎖の可変及び定常ドメインＶＬ及びＣＬで構成される。完全長の抗体は、一方又は両方の重鎖にＣ末端リシン（Ｋ）を欠いていてもよい。
用語「Ｆａｂアーム」又は「半分子」とは、抗原と特異的に結合する重鎖／軽鎖の１つのペアを指す。
本明細書の完全長の二重特異性抗体は、無細胞環境中インビトロで、又は同時発現を用いて、異なる特異性を有する２個の抗体半分子のヘテロ二量体の形成に有利な条件とするために、各半分子の重鎖ＣＨ３の界面に置換を導入することにより２個の一重特異性二価抗体の間でＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を行うことで生成することができる。Ｆａｂアーム交換反応は、ＣＨ３ドメインのジスルフィド結合異性化反応及び解離／会合の結果として生じる。親一重特異性抗体のヒンジ領域内の重鎖ジスルフィド結合が還元される。一方の親一重特異性抗体の生じた遊離システインは、第２の親一重特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖間ジスルフィド結合を形成し、同時に親抗体のＣＨ３ドメインが解離／会合によって放出され再形成される。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインを、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化に有利となるように操作することができる。得られる生成物は、それぞれが異なるエピトープ、すなわちＥＧＦＲ上のエピトープ及びｃ−Ｍｅｔ上のエピトープを結合する２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
本明細書で使用するところの「ホモ二量体化」とは、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を指す。本明細書で使用するところの「ホモ二量体」とは、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を指す。
本明細書で使用するところの「ヘテロ二量体化」とは、非同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を指す。本明細書で使用するところの「ヘテロ二量体」とは、非同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を指す。
「ノブ・イン・ホール」法（例えば国際特許公開第ＷＯ ２００６／０２８９３６号を参照）を用いて完全長の二重特異性抗体を生成することができる。簡単に述べると、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸を、ＣＨ３ドメインの相互作用に影響を及ぼしてヘテロ二量体の形成を促進する位置で変異させることができる。小さい側鎖（ホール（穴））を有するアミノ酸を、第１の抗原と特異的に結合する抗体の重鎖に導入し、大きい側鎖（ノブ（突起））を有するアミノ酸を、第２の抗原と特異的に結合する抗体の重鎖に導入する。これら２種類の抗体を同時発現させると、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖とが選択的に相互作用する結果、ヘテロ二量体が形成される。「ノブ」及び「ホール」を形成する代表的なＣＨ３の置換のペアとしては（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメイン内の修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメイン内の修飾位置として表した場合）、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖがある。
米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に述べられるように、一方のＣＨ３表面の正電荷を有する残基及び第２のＣＨ３表面の負電荷を有する残基を置換することにより静電的相互作用を利用して重鎖のヘテロ二量体化を促進するなどの他の手法を使用することができる。他の手法では、ヘテロ二量体化を以下の置換によって促進することができる（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメイン内の修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメイン内の修飾位置として表した場合）。すなわち、Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に述べられる）。
上記に述べた方法以外に、本発明の二重特異性抗体は、国際特許公開第ＷＯ２０１１／１３１７４６号に述べられる方法にしたがって、２種類の一重特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域に非対称な変異を導入し、ジスルフィド結合異性化が生じるように還元的条件下で２種類の親一重特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することにより、無細胞環境中、インビトロで生成することができる。これらの方法では、第１の一重特異性二価抗体（例えば抗ｃ−Ｍｅｔ抗体）及び第２の一重特異性二価抗体（例えば抗ＥＧＦＲ抗体）を、ヘテロ二量体の安定性を高めるＣＨドメインの特定の置換を有するように操作する。その場合、これらの抗体を、ヒンジ領域のシステインがジスルフィド結合異性化されるのに充分な還元的条件下で一緒にインキュベートすることにより、Ｆａｂアーム交換によって二重特異性抗体を生成する。インキュベーションの条件は、非還元的条件に最適に戻すことができる。使用することが可能な代表的な還元剤としては、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン及びβ−メルカプトエタノールがあり、好ましくは、２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２５ｍＭの２−ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下、ｐＨ ５〜８、例えばｐＨ ７．０又はｐＨ ７．４で、最低でも２０℃の温度で少なくとも９０分間のインキュベーションを用いることができる。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、小分子のＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ阻害剤と比較した場合に特異性及び低減された標的外毒性の点で利点をもたらすことができる。本発明は、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体が、ＥＧＦＲ結合一重特異性抗体とｃ−Ｍｅｔ結合一重特異性抗体との混合物又は文献に記載されている二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体と比較した場合に、大幅に向上した相乗的阻害作用をもたらすという驚くべき発見に少なくとも一部基づいてなされたものである。アッセイに応じて、観察される相乗的作用は、約１４〜約８００倍超で変化した。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、セツキシマブ（エルビタックス（登録商標））よりも効率的なＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔのシグナル伝達経路阻害をもたらし、より効率的に腫瘍増殖を阻害するものである。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＥＧＦＲ活性化変異及び／又はゲフィチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤による治療に対する耐性をもたらすことが知られているＥＧＦＲの変異を有する腫瘍及び／又は腫瘍細胞株におけるＥＧＦＲシグナル伝達を阻害し、ＮＳＣＬＣなどの癌においてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による治療の際にアップレギュレートされ、補償的なシグナル伝達を提供することが特定されている経路である、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路を阻害する。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を直接阻害する以外に、増進した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）並びにＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ受容体の分解によって抗腫瘍活性を示す。現在のＥＧＦＲ治療（セツキシマブ及びパニツムマブ）とは異なり、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、増進したＡＤＣＣによって、ＫＲＡＳ変異を有する腫瘍細胞の死滅を誘導する。
国際特許公開第ＷＯ２０１０／１１５５５１号は、現在、第ＩＩＩ相臨床試験が行われている、セツキシマブのＥＧＦＲ結合ＶＨ／ＶＬペア及び抗体５Ｄ５（ＭｅｔＭａｂ、オナルツズマブ）のｃ−Ｍｅｔ結合ＶＨ／ＶＬペアを用いてＩｇＧーｓｃＦｖフォーマットにおいて操作された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体（ＢＳＡＢ０１）について述べている。ＢＳＡＢ０１は、親抗体と比較した場合に約２倍（相加的）増大したＡ４３１細胞増殖の阻害を示し（国際特許公開第ＷＯ２０１０／１１５５５１号の実施例７、図８ｂ）、２種類の親抗体の組合わせと比較した場合にＯｖａｒｃ−８細胞の増殖に対してある程度の相加的阻害を示す（阻害率１０％に対して１５％）（国際特許公開第ＷＯ２０１０／１１５５５１号の図１０ａ、実施例１６）。したがって、驚くべきことに、また予期せずして、本発明は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔシグナル伝達、癌細胞の生存、及び腫瘍増殖の阻害において顕著な相乗的作用を示す二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を提供するものである。何らの理論により束縛されることを望むものではないが、本発明の二重特異性抗体の顕著な相乗的作用は、ＥＧＦＲ結合アーム及びｃ−Ｍｅｔ結合アームの両方のエピトープ特異性に少なくとも一部起因するものであり、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔのホモ二量体だけではなく、ＥＧＦＲ／ＨＥＲｘヘテロ二量体によるシグナル伝達の阻害につながり得るものと考えられる。
本発明の一実施形態は、単離された二重特異性上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）／肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）抗体であって、
ａ）ＨＣ１定常ドメイン３（ＨＣ１ ＣＨ３）及びＨＣ１可変領域１（ＶＨ１）を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、
ｂ）ＨＣ２定常ドメイン３（ＨＣ２ ＣＨ３）及びＨＣ２可変領域２（ＶＨ２）を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、
ｃ）軽鎖可変領域（ＶＬ１）を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）と、
軽鎖可変領域（ＶＬ２）を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）と、を含み、ＶＨ１とＶＬ１とが対合してＥＧＦＲと特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２とが対合してｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＨＣ１が前記ＨＣ１ ＣＨ３に少なくとも１個の置換を含み、ＨＣ２がＨＣ２ ＣＨ３に少なくとも１個の置換を含み、ＨＣ１ ＣＨ３内の置換、及びＨＣ２ ＣＨ３内の置換が、残基の番号付けがＥＵインデックスに基づいたものである場合に、異なるアミノ酸残基の位置で生じる、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体である。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ１９７５又はＳＫＭＥＳ−１細胞株における細胞外シグナル関連キナーゼ１及び２（ＥＲＫ１／２）のリン酸化を阻害し、そのＩＣ50値は、重鎖３（ＨＣ３）及び軽鎖３（ＬＣ３）を含むコントロール一価ＥＧＦＲ抗体と重鎖４（ＨＣ４）及び軽鎖４（ＬＣ４）を含むコントロール一価ｃ−Ｍｅｔ抗体との混合物によるＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ１９７５又はＳＫＭＥＳ−１細胞株におけるＥＲＫ１／２のリン酸化の阻害のＩＣ50値と比較した場合に、少なくとも約１０倍低い、少なくとも約２０倍低い、少なくとも約３０倍低い、少なくとも約４０倍低い、少なくとも約５０倍低い、又は少なくとも約６０倍低いＩＣ50値であり、ただし、ＨＣ３とＨＣ１、ＬＣ３とＬＣ１、ＨＣ４とＨＣ２、ＬＣ４とＬＣ２はそれぞれ同一のアミノ酸配列を有し、ＥＲＫ１／２のリン酸化は、抗ホスホＥＲＫ１／２抗体を捕捉抗体とし、電気化学発光化合物と接合された非リン酸化及びリン酸化ＥＲＫ１／２と結合する抗体を検出抗体として使用するサンドイッチイムノアッセイを用いて全細胞ライセート中で測定される。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、阻害率をＥＲＫ１／２リン酸化の阻害によって評価した場合に、一重特異性ＥＧＦＲ抗体と一重特異性ｃ−Ｍｅｔ抗体の組合わせと比較してＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔシグナル伝達の相乗的でより顕著な阻害をもたらす。このような代表的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体としては、本発明の抗体ＥＭ１−ｍＡｂがある。
本明細書で使用するところの「コントロール一重特異性ＥＧＦＲ抗体」とは、試験される二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体のＥＧＦＲ結合Ｆａｂアームと同一のアミノ酸配列を有する、ＥＧＦＲと結合する第１のＦａｂアームを有するとともに、「不活性」であり、無関係／非関連抗原であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ１２０と結合する第２のＦａｂアームを有する抗体のことを指す。第２のＦａｂアームは、試験される二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体のＥＧＦＲ結合ＦａｂアームがＦ４０５Ｌ置換を含む場合、配列番号２０９の配列を有する軽鎖と配列番号１９８の配列を有する重鎖とを有する。第２のＦａｂアームは、試験される二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体のＥＧＦＲ結合ＦａｂアームがＫ４０９Ｒ置換を含む場合、配列番号２０９の配列を有する軽鎖と配列番号１９７の配列を有する重鎖とを有する。
本明細書で使用するところの「コントロール一重特異性ｃ−Ｍｅｔ抗体」とは、試験される二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体のｃ−Ｍｅｔ結合Ｆａｂアームと同一のアミノ酸配列を有する、ｃ−Ｍｅｔと結合する第１のＦａｂアームを有するとともに、「不活性」であり、無関係／非関連抗原であるＨＩＶ ｇｐ１２０と結合する第２のＦａｂアームを有する抗体のことを指す。第２のＦａｂアームは、試験される二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体のｃ−Ｍｅｔ結合ＦａｂアームがＦ４０５Ｌ置換を含む場合、配列番号２０９の配列を有する軽鎖と配列番号１９８の配列を有する重鎖とを有する。第２の不活性Ｆａｂアームは、試験される二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体のｃ−Ｍｅｔ結合ＦａｂアームがＫ４０９Ｒ置換を含む場合、配列番号２０９の配列を有する軽鎖と配列番号１９７の配列を有する重鎖とを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＥＲＫ１／２のリン酸化を、約２×１０-9Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、又は約１×１０-10Ｍ以下のＩＣ50値で阻害する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＥＲＫ１は、残基Ｔｈｒ２０２及びＴｙｒ２０４においてリン酸化され、ＥＲＫ２は残基Ｔｈｒ１８５及びＴｙｒ１９７においてリン酸化されている。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株におけるタンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）のＳｅｒ４７３におけるリン酸化を阻害し、そのＩＣ50値は、ＨＣ３及びＬＣ３を含むコントロール一価ＥＧＦＲ抗体とＨＣ４及びＬＣ４を含むコントロール一価ｃ−Ｍｅｔ抗体との混合物によるＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株におけるＡＫＴのＳｅｒ４７３におけるリン酸化阻害のＩＣ50値と比較した場合に、少なくとも約７０倍低いＩＣ50値であり、ただし、ＨＣ３とＨＣ１、ＬＣ３とＬＣ１、ＨＣ４とＨＣ２、及びＬＣ４とＬＣ２はそれぞれ同一のアミノ酸配列を有し、ＡＫＴのＳｅｒ４７３におけるリン酸化は、非リン酸化及びリン酸化ＡＫＴと結合する抗体を捕捉抗体とし、電気化学発光化合物と接合された抗ホスホＡＫＴ Ｓｅｒ４７３抗体を検出抗体として使用するサンドイッチイムノアッセイを用いて全細胞ライセート中で測定される。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株におけるタンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）のＴｈｒ３０８におけるリン酸化を阻害し、そのＩＣ50値は、ＨＣ３及びＬＣ３を含むコントロール一価ＥＧＦＲ抗体とＨＣ４及びＬＣ４を含むコントロール一価ｃ−Ｍｅｔ抗体との混合物によるＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株におけるＡＫＴのＴｈｒ３０８におけるリン酸化の阻害のＩＣ50値と比較した場合に、少なくとも約１００倍低いＩＣ50値であり、ただし、ＨＣ３とＨＣ１、ＬＣ３とＬＣ１、ＨＣ４とＨＣ２、及びＬＣ４とＬＣ２はそれぞれ同一のアミノ酸配列を有し、ＡＫＴのＴｈｒ３０８におけるリン酸化は、非リン酸化及びリン酸化ＡＫＴと結合する抗体を捕捉抗体とし、電気化学発光化合物と接合された抗ホスホＡＫＴ Ｔｈｒ３０８抗体を検出抗体として使用するサンドイッチイムノアッセイを用いて全細胞ライセート中で測定される。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、阻害率をＡＫＴリン酸化の阻害によって評価した場合に、一重特異性ＥＧＦＲ抗体と一重特異性ｃ−Ｍｅｔ抗体の組合わせと比較してＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔシグナル伝達の相乗的でより顕著な阻害をもたらす。このような代表的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体としては、本発明の抗体ＥＭ１−ｍＡｂがある。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＡＫＴのＳｅｒ４７３又はＴｈｒ３０８におけるリン酸化を約１×１０-9Ｍ以下のＩＣ50値で阻害する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号７３のＥＧＦＲとＥＧＦＲ残基Ｋ４８９、Ｉ４９１、Ｋ４６７及びＳ４９２において、並びにｃ−Ｍｅｔと残基ＰＥＦＲＤＳＹＰＩＫＹＶＨＡＦ（配列番号２３８）及びＦＡＱＳＫＰＤＳＡＥＰＭＤＲＳＡ（配列番号２３９）において結合する。このような代表的な二重特異性抗体として、ＥＭ１−ｍＡｂがある。二重特異性ＥＭ１抗体は、上記及び国際特許公開第ＷＯ２０１０／１１５５５１号に述べられるように、抗体ＢＳＡＢ０１と比較した場合にＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔと異なるエピトープで結合する。ＢＳＡＢ０１の親ＥＧＦＲ結合アーム（セツキシマブ）は、配列番号７３の完全長ＥＧＦＲの残基Ｒ３６７、Ｑ４０８、Ｑ４３２、Ｈ４３３、Ｆ４３６、Ｓ４４２、Ｓ４６４、Ｋ４６７、Ｋ４８９、Ｉ４９１、Ｓ４９２、及びＮ４９７に対応する、成熟ＥＧＦＲのＥＧＦＲアミノ酸残基Ｒ３５３、Ｑ３８４、Ｑ４０８、Ｈ４０９、Ｆ４１２、Ｓ４１８、Ｓ４４０、Ｋ４４３、Ｋ４６５、Ｉ４６７、Ｓ４６８、及びＮ４７３と結合する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ７：３０１〜３１１，２００５）。ＢＳＡＢ０１の親ｃ−Ｍｅｔ結合アーム（ｍＡｂ ５Ｄ５）は、ｃ−Ｍｅｔの残基３２５〜３４０ＰＧＡＱＬＡＲＱＩＧＡＳＬＮＤＤ（配列番号２４０）と結合する。ＥＭ１−ｍＡｂのＥＧＦＲ結合親抗体（２Ｆ８）のエピトープマッピングについては、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０２５６１４２Ａ１号に述べられている。セツキシマブ及び親２Ｆ８抗体は、部分的に重なるが別個のエピトープと結合する。
エピトープマッピングは標準的な方法を用いて行うことができる。例えば、個々の要素の両方の構造がわかっている場合、インシリコのタンパク質−タンパク質のドッキングを行って、適合する相互作用の部位を特定することができる。抗原抗体複合体で水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換を行うことによって、抗体が結合し得る抗原の領域をマッピングすることができる。抗原のセグメント及び点変異誘発を用いることにより、抗体の結合に重要なアミノ酸の位置を特定することができる。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を無効にする。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、同じアッセイ条件を用いた本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の非存在下におけるシグナル伝達のレベルと比較した場合に、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％無効にすることができる。
ＥＧＦＲに対するＥＧＦなどのリガンドの結合は、受容体の二量体化、自己リン酸化、受容体の内部の細胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、並びにＤＮＡ合成の調節（遺伝子の活性化）及び細胞周期の進行又は細胞分裂に関与する複数のシグナルトランスダクション及びトランス活性化経路の開始を刺激する。ＥＧＦＲシグナル伝達を無効にすることは、１以上のＥＧＦＲの下流のシグナル伝達経路の阻害につながり得るため、ＥＧＦＲを無効にすることは、細胞の増殖及び分化、血管新生、細胞運動性、及び転移の阻害、並びに下流のシグナル伝達経路の阻害をはじめとする様々な作用を有し得る。
ＥＧＦＲシグナル伝達及びＥＧＦＲシグナル伝達の無効は、例えば、本発明の二重特異性抗体によるチロシンＹ１０６８、Ｙ１１４８、及びＹ１１７３のいずれかにおける受容体の自己リン酸化（Ｄｏｗｎｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１１：４８３〜５，１９８４）、並びに／あるいは天然又は合成基質のリン酸化、並びに天然又は合成基質の自己リン酸化及び／又はリン酸化の阻害を測定するなど、様々な周知の方法を用いて測定することができる。リン酸化は、ＥＬＩＳＡアッセイ又はホスホチロシン特異的抗体を用いたウェスタンブロットなどの周知の方法を用いて検出することができる。代表的なアッセイは、Ｐａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ ２８３：１４３３〜４４，１９９７及びＢａｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６２：１４３〜５０，１９９８に見られ、更に本明細書に述べられる。
ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合は、受容体の二量体化、自己リン酸化、受容体の細胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、並びにＤＮＡ合成の調節（遺伝子の活性化）及び細胞周期の進行又は細胞分裂に関与する複数のシグナルトランスダクション及びトランス活性化経路の開始を刺激する。ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達の阻害は、１以上のｃ−Ｍｅｔの下流のシグナル伝達経路の阻害につながり得るため、ｃ−Ｍｅｔを無効にすることは、細胞の増殖及び分化、血管新生、細胞運動性、並びに転移の阻害をはじめとする様々な作用を有し得る。
ｃ−Ｍｅｔのシグナル伝達及びｃ−Ｍｅｔのシグナル伝達無効は、例えば、チロシン残基Ｙ１２３０、Ｙ１２３４、Ｙ１２３５、若しくはＹ１３４９の少なくとも１つにおける受容体の自己リン酸化、及び／又は天然若しくは合成基質のリン酸化を測定するなど、様々な周知の方法を用いて測定することができる。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又はウェスタンブロットでホスホチロシンに対する特異的な抗体を使用することなどにより検出することができる。代表的なアッセイは、Ｐａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ ２８３：１４３３〜４４，１９９７及びＢａｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６２：１４３〜５０，１９９８に見られ、更に本明細書に述べられる。
ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔのシグナル伝達は、ＥＲＫ１／２及びＡＫＴのリン酸化の阻害を測定するなど、本明細書に述べられるような様々な周知の方法を用いて測定することができる。Ｔｈｒ２０２及びＴｙｒ２０４におけるＥＲＫ１のリン酸化並びにＴｈｒ１８５及びＴｙｒ１８７におけるＥＲＫ２のリン酸化の阻害、並びにＳｅｒ４７３又はＴｈｒ３０８におけるＡＫＴの阻害は、例えば、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞のライセート中で、捕捉抗体が固相支持体上にコーティングされ、検出抗体がＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（ＭＳＤ）ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識などの電気化学的発光化合物と接合された、サンドイッチアッセイを用い、次いでプレートリーダーでシグナルを検出することによって測定することができる。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＮＣＩ−Ｈ２９２又はＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の増殖を、ＮＣＩ−Ｈ２９２又はＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞が低付着条件で増殖された場合のセツキシマブによるＮＣＩ−Ｈ２９２又はＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の増殖の阻害のＩＣ50値と比較した場合に、少なくとも約３００倍低い、少なくとも約４００倍低い、少なくとも約５００倍低い、少なくとも約６００倍低い、少なくとも約７００倍低い、又は少なくとも約８００倍低いＩＣ50値で阻害する。
細胞増殖の阻害は既知の方法によって評価することができる。例えば、細胞付着を防止又は低減するためにヒドロゲル又はバイオミメティックポリマー（例えばＣｏｒｎｉｎｇのＵｌｔｒａ Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔプレート）でコーティングされたプレートに細胞を播種し、７．５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦで誘導した細胞増殖に対する抗体の影響を、標準的な方法を用いた７２時間のインキュベーション後に細胞生存率（％）を測定することによって評価することができる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、一重特異性ＥＧＦＲ抗体と一重特異性ｃ−Ｍｅｔ抗体の組合わせ、及び標準的治療薬であるセツキシマブと比較した場合にＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔを発現する癌細胞の相乗的でより顕著な阻害をもたらす。このような代表的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体としては、本発明の抗体ＥＭ１−ｍＡｂがある。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、野生型ＥＧＦＲ及び野生型ｃ−Ｍｅｔを発現する癌細胞、並びにゲフィチニブなどの小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）による治療に対する耐性に寄与することが特定されているＥＧＦＲのＬ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ変異体を発現する癌細胞を阻害する。したがって、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、セツキシマブ及びＴＫＩと比較して、より広い患者集団において利益をもたらし得る。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、二重特異性抗体及びセツキシマブが２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与された場合に、ＳＣＩＤ ＢｅｉｇｅマウスにおけるＨＧＦ発現ＳＫＭＥＳ−１細胞腫瘍の増殖を、セツキシマブと比較して３６日目に少なくとも５００倍低いＴ／Ｃ値（％）で阻害する。
ＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスを用いた腫瘍異種移植モデルは周知である。ＳＫＭＥＳ−１細胞は、標準的な方法を用いてヒトＨＧＦを発現するように操作することができる。一般的に、ＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスでは、各動物の背部脇腹の皮下にＣｕｌｔｕｒｅｘなどの細胞外マトリクス中に包埋されたヒトＨＧＦを発現するＳＫＭＥＳ−１細胞を接種することができる。移植１週間後、同じ腫瘍体積を有する複数の群にマウスを分類した後、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体、コントロール又はベンチマーク抗体又は小分子を例えば週３回投与することができる。腫瘍体積を週２回記録し、腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）を、Ｔ／Ｃ値（％）を計算することによって観察することができる。Ｔ／Ｃ値（％）は抗腫瘍有効性の指標である。Ｔ及びＣは、それぞれ特定の日の処置群及びコントロール群の平均体積である。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、標準治療薬であるセツキシマブと比較した場合にインビボでの腫瘍殺滅において大幅に向上した有効性をもたらし、したがって、セツキシマブと比較した場合に患者集団において利益をもたらし得る。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、アイソタイプがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であるＨＣ１及びＨＣ２を含む。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、アイソタイプがＩｇＧ１であるＨＣ１及びＨＣ２を含む。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、残基の番号付けがＥＵインデックスに基づいたものである場合に、３５０、３６６、３６８、３７０、３９９、４０５、４０７、又は４０９位の残基に、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体のＨＣ１ ＣＨ３は少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、又は８個の置換を含み、ＨＣ２ ＣＨ３は少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、又は８個の置換を含む。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、残基の番号付けがＥＵインデックスに基づいたものである場合に、３５０、３７０、４０５、又は４０９位の残基に、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体のＨＣ１ ＣＨ３は少なくとも１個、２個、３個、又は４個の置換を含み、ＨＣ２ ＣＨ３は少なくとも１個、２個、３個、又は４個の置換を含む。
抗体のドメイン及び番号付けは周知のものである。２個のＣＨ３ドメイン（又はＣＨ３領域）は、互いに少なくとも１個のアミノ酸置換で異なる場合に非同一である。ＩｇＧ１のＣＨ３領域は、一般的にＩｇＧ１の残基３４１〜４４６からなる（残基の番号付けはＥＵインデックスに基づく）。代表的なＩｇＧ１の定常領域の１つを配列番号２０３に示す。ＣＨ３ドメインは、配列番号２０３の残基２２４〜３２９にわたり、ＥＵインデックスに基づく残基３４１〜４４６に対応する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、残基の番号付けがＥＵインデックスに基づいたものである場合に、４０５又は４０９位の残基に、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体のＨＣ１ ＣＨ３は少なくとも１個の置換を含み、ＨＣ２ ＣＨ３は少なくとも１個の置換を含む。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、残基の番号付けがＥＵインデックスに基づいたものである場合に、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体のＨＣ１ ＣＨ３はＫ４０９Ｒ又はＦ４０５Ｌの置換を含み、ＨＣ２ ＣＨ３はＫ４０９Ｒ又はＦ４０５Ｌの置換を含む。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体のＨＣ１ ＣＨ３はＦ４０５Ｌの置換を含み、ＨＣ２ ＣＨ３はＫ４０９Ｒの置換を含む。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３及びＨＣ２ ＣＨ３の置換は、３６６、３６８、３７０、３９９、４０５、４０７又は４０９位における置換である（残基の番号付けはＥＵインデックスに基づく）。これらの位置は、それぞれ配列番号２０３及び２０４の重鎖定常領域の直鎖の２４８、２５０、２５２、２８１、２８７、２８９及び２９１位の残基に対応している。
本明細書に述べられる特定の実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３の４０９位は、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸置換を有し、ＨＣ２ ＣＨ３の４０５位は、Ｐｈｅ以外のアミノ酸置換を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３の４０５位は、Ｐｈｅ以外のアミノ酸置換を有し、ＨＣ２ ＣＨ３の４０９位は、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸置換を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３の４０９位は、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸置換を有し、ＨＣ２ ＣＨ３の４０５位は、Ｐｈｅ、Ａｒｇ又はＧｌｙ以外のアミノ酸置換を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３の４０５位は、Ｐｈｅ、Ａｒｇ又はＧｌｙ以外のアミノ酸置換を有し、ＨＣ２ ＣＨ３の４０９位は、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸置換を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅを有し、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅ以外のアミノ酸を有し、４０９位にＬｙｓを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅ以外のアミノ酸を有し、４０９位にＬｙｓを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅを有し、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅを有し、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅ、Ａｒｇ又はＧｌｙ以外の置換を有し、４０９位にＬｙｓを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅ、Ａｒｇ又はＧｌｙ以外の置換を有し、４０９位にＬｙｓを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅを有し、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅを有し、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０５位にＬｅｕを有し、４０９位にＬｙｓを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０５位にＬｅｕを有し、４０９位にＬｙｓを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅを有し、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅを有し、４０９位にａＡｒｇを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅ、Ａｒｇ又はＧｌｙ以外のアミノ酸を有し、４０９位にＬｙｓを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅ、Ａｒｇ又はＧｌｙ以外のアミノ酸を有し、４０９位にＬｙｓを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅを有し、４０９位にＡｒｇを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅを有し、４０９位にＡｒｇを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０５位にＬｅｕを有し、４０９位にＬｙｓを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０５位にＬｅｕを有し、４０９位にＬｙｓを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅを有し、４０９位にＡｒｇを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅを有し、４０９位にＬｙｓを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０５位にＬｅｕを有し、４０９位にａＡｒｇを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０５位にＬｅｕを有し、４０９位にａＡｒｇを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０５位にＰｈｅを有し、４０９位にＬｙｓを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓを、３７０位にＴｈｒを、４０５位にＬｅｕを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓを、３７０位にＴｈｒを、４０５位にＬｅｕを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０９位にＡｒｇを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓを、３７０位にＴｈｒを、４０５位にＬｅｕを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓを、３７０位にＴｈｒを、４０５位にＬｅｕを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０９位にＡｒｇを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は３７０位にＬｙｓを、４０５位にＰｈｅを、４０９位にａＡｒｇを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓを、３７０位にＴｈｒを、４０５位にＬｅｕを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓを、３７０位にＴｈｒを、４０５位にＬｅｕを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は３７０位にＬｙｓを、４０５位にＰｈｅを、４０９位にＡｒｇを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸を有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０７位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｖａｌ又はＴｒｐを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｖａｌ又はＴｒｐを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０７位にＧｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ又はＴｒｐを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＧｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ又はＴｒｐを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒを、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０９位にＴｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸を、４０９位にＬｙｓを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒを、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒを、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０７位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｖａｌ又はＴｒｐを、４０９位にＬｙｓを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｖａｌ又はＴｒｐを、４０９位にＬｙｓを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は、４０７位にＴｙｒを、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒを、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０７位にＧｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ又はＴｒｐを、４０９位にＬｙｓを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＧｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ又はＴｒｐを、４０９位にＬｙｓを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒを、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒを、４０９位にＡｒｇを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸を、４０９位にＬｙｓを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸を、４０９位にＬｙｓを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒを、４０９位にＡｒｇを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒを、４０９位にＡｒｇを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０７位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｖａｌ又はＴｒｐを、４０９位にＬｙｓを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｖａｌ又はＴｒｐを、４０９位にＬｙｓを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒを、４０９位にＡｒｇを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒを、４０９位にＡｒｇを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０７位にＧｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ又はＴｒｐを、４０９位にＬｙｓを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０７位にＧｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ又はＴｒｐを、４０９位にＬｙｓを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０７位にＴｙｒを、４０９位にＡｒｇを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、ＨＣ２ ＣＨ３は（ｉ）３６８位にＰｈｅ、Ｌｅｕ若しくはＭｅｔ以外のアミノ酸を有するか、又は（ｉｉ）３７０位にＴｒｐを有するか、又は（ｉｉｉ）３９９位にＡｓｐ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ若しくはＧｌｎ以外のアミノ酸を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は（ｉ）３６８位にＰｈｅ、Ｌｅｕ若しくはＭｅｔ以外のアミノ酸を有するか、又は（ｉｉ）３７０位にＴｒｐを有するか、又は（ｉｉｉ）３９９位にＡｓｐ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ若しくはＧｌｎ以外のアミノ酸を有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ若しくはＭｅｔ以外のアミノ酸を有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０９位にＡｒｇ、Ａｌａ、Ｈｉｓ若しくはＧｌｙを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は（ｉ）３６８位にＬｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ若しくはＴｒｐを有するか、又は（ｉｉ）３７０位にＴｒｐを有するか、又は（ｉｉｉ）３９９位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ若しくはＴｙｒを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は（ｉ）３６８位にＬｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ若しくはＴｒｐを有するか、又は（ｉｉ）３７０位にＴｒｐを有するか、又は（ｉｉｉ）３９９位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ若しくはＴｙｒを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０９位にＡｒｇ、Ａｌａ、Ｈｉｓ若しくはＧｌｙを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は４０９位にＡｒｇを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は（ｉ）３６８位にＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ若しくはＴｒｐを有するか、又は（ｉｉ）３７０位にＴｒｐを有するか、又は（ｉｉｉ）３９９位にＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ若しくはＴｙｒを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３は（ｉ）３６８位にＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ若しくはＴｒｐを有するか、又は（ｉｉ）３７０位にＴｒｐを有するか、又は（ｉｉｉ）３９９位にＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ若しくはＴｙｒを有し、ＨＣ２ ＣＨ３は４０９位にＡｒｇを有する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、残基の番号付けがＥＵインデックスに基づいたものである場合、ＨＣ１ ＣＨ３はＫ４０９Ｒの置換又はＦ４０５Ｌの置換を含み、ＨＣ２ ＣＨ３はＫ４０９Ｒの置換又はＦ４０５Ｌの置換を含む。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、ＨＣ１ ＣＨ３はＦ４０５Ｌの置換を含み、ＨＣ２ ＣＨ３はＫ４０９Ｒの置換を含む。
置換は、標準的な方法を用いて抗体の定常ドメインのような分子に対して通常はＤＮＡレベルで行われる。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＶＨ１及びＶＬ１を含み、
前記ＶＨ１は、それぞれ配列番号２１０、２１１及び２１２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ ２（ＨＣＤＲ２）及びＨＣＤＲ ３（ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列を含み、
前記ＶＬ１は、それぞれ配列番号２１３、２１４及び２１５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ ２（ＬＣＤＲ２）及びＬＣＤＲ ３（ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＶＨ２及びＶＬ２を含み、
前記ＶＨ２は、それぞれ配列番号２１６、２１７及び２１８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、
前記ＶＬ２は、それぞれ配列番号２１９、２２０及び２２１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、それぞれ配列番号１８９、１９０、１９３及び１９４のＶＨ１、ＶＬ１、ＶＨ２及びＶＬ２のアミノ酸配列を含む。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、それぞれ配列番号１９９、２００、２０１及び２０２のＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２及びＬＣ２のアミノ酸配列を含み、ＨＣ１、ＨＣ２、又はＨＣ１及びＨＣ２の両方からＣ末端のリシンが任意に除去されていてもよい。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＶＨ１及びＶＬ１を含み、
前記ＶＨ１は、それぞれ配列番号２２２、２２３及び２２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、
前記ＶＬ１は、それぞれ配列番号２２５、２２６及び２２７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＶＨ２及びＶＬ２を含み、
前記ＶＨ２は、それぞれ配列番号２２８、２２９及び２３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、
前記ＶＬ２は、それぞれ配列番号２３１、２３２及び２３３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、それぞれ配列番号１９１、１９２、１９５及び１９６のＶＨ１、ＶＬ１、ＶＨ２及びＶＬ２のアミノ酸配列を含む。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、それぞれ配列番号２３４、２３５、２３６及び２３７のＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２及びＬＣ２のアミノ酸配列を含み、ＨＣ１、ＨＣ２、又はＨＣ１及びＨＣ２の両方からＣ末端のリシンが任意に除去されていてもよい。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、プレート上にコーティングされ且つ本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の存在下又は非存在下でインキュベートされた組換えヒトＥＧＦＲ又は組換えヒトｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインを用いた競合アッセイにおいて、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合及びｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満、又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値でブロックすることができる。本明細書に述べられる二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、同じアッセイ条件を用いた本明細書に述べられる本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の非存在下におけるＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合及びｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合と比較した場合に、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合及びｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％ブロックすることができる。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２及びＬＣ２を含み、前記ＨＣ１、前記ＬＣ１、前記ＨＣ２及び前記ＬＣ２は、それぞれ配列番号２０５、２０６、２０７及び２０８の配列を含む合成ポリヌクレオチドによりコードされている。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＣＨ３操作を用い、インビトロＦａｂアーム交換を用いて抗体を生成するなど、本明細書に述べられる方法を用いて生成することができる。代表的な二重特異性抗体は、２種類の一重特異性抗体から、７５ｍＭの２−メルカプトエタノールアミン（２−ＭＥＡ）の最終濃度を有するバッファ中でｐＨ ７．０〜７．４のＰＢＳ中の約１〜２０ｍｇ／ｍＬの各抗体を１：１のモル比で加え合わせ、２５〜３７℃で２〜６時間インキュベートした後、透析、ダイアフィルトレーション、タンジェンシャルフロー濾過、及びスピンセルフィルトレーション（spinned cell filtration）により２−ＭＥＡを除去することによって、生成することができる。二重特異性抗体の収率は、約８０％超、約９０％超、約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％超であり得る。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態は、単離された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を生成する方法であって、
配列番号１９９の２本の重鎖及び配列番号２００の２本の軽鎖を含む単離された一重特異性二価抗ＥＧＦＲ抗体と、配列番号２０１の２本の重鎖及び配列番号２０２の２本の軽鎖を含む単離された一重特異性二価抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と、を約１：１のモル比の混合物として加え合わせることと、
前記混合物中に還元剤を導入することと、
前記混合物を約９０分〜約６時間インキュベートすることと、
前記還元剤を除去することと、
配列番号１９９の第１の重鎖及び配列番号２０１の第２の重鎖、並びに配列番号２００の第１の軽鎖及び配列番号２０２の第２の軽鎖を含む二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を精製することと、を含み、配列番号１９９の前記第１の重鎖が配列番号２００の前記第１の軽鎖と対合してＥＧＦＲと特異的に結合する第１の結合ドメインを形成し、配列番号２０１の前記第２の重鎖が配列番号２０２の前記第２の軽鎖と対合してｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する第２の結合ドメインを形成する、方法を提供する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、前記還元剤は２−メルカプトエタノールアミン（２−ＭＥＡ）である。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、２−ＭＥＡは、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度で存在する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、前記インキュベートする工程は、約２５℃〜約３７℃の温度で行われる。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態は、ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２及びＬＣ２を含む単離された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体であって、前記ＨＣ１が配列番号１９９の配列を含み、前記ＬＣ１が配列番号２００の配列を含み、前記ＨＣ２が配列番号２０１の配列を含み、前記ＬＣ２が配列番号２０２の配列を含み、前記ＨＣ１、前記ＬＣ１、前記ＨＣ２及び／又は前記ＬＣ２が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の保存的アミノ酸置換を更に含む単離された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を提供する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態は、前記ＨＣ１、前記ＬＣ１、前記ＨＣ２及び前記ＬＣ２を含む単離された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体であって、前記ＨＣ１が配列番号２３４の配列を含み、前記ＬＣ１が配列番号２３５の配列を含み、前記ＨＣ２が配列番号２３６の配列を含み、前記ＬＣ２が配列番号２３７の配列を含み、前記ＨＣ１、前記ＬＣ１、前記ＨＣ２及び／又は前記ＬＣ２が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の保存的アミノ酸置換を更に含む単離された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を提供する。
ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２及びＬＣ２アミノ酸配列が本明細書に開示される抗体と大きく異ならない二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、本発明の範囲に含まれる。一般的に、これには、抗体の性質を不利に変化させることのない抗原結合部位又はフレームワークにおける同様の電荷、疎水性、立体化学的特性を有するアミノ酸による１以上の保存的アミノ酸置換が含まれる。保存的置換は、例えば安定性又は親和性といった抗体の特性を向上させるために行われてもよい。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を、例えばＶＨ１、ＶＬ１、ＶＨ２及び／又はＶＬ２に行うことができる。例えば、「保存的アミノ酸置換」では、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷にほとんど又はまったく影響しないように天然アミノ酸残基を非天然残基と置換することを伴い得る。更に、アラニンスキャニング変異誘発についてこれまでに述べられているように、ポリペプチド内の任意の天然残基をアラニンで置換することもできる（ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ ６４３：５５〜６７，１９９８；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３５：１〜２４，１９９８）。当業者であれば、所望のアミノ酸置換をこうした置換が望ましい時点で決定することができる。例えば、アミノ酸置換を用いることによってその分子配列の重要な残基を特定したり、又は本明細書に述べられる分子の親和性を増大若しくは減少させることができる。代表的な保存的アミノ酸置換については上記に述べた。
アミノ酸置換は、例えばＰＣＲ変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）によって行うことができる。例えばランダムコドン（ＮＮＫ）又は非ランダムコドン、例えば１１種類のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコードするＤＶＫコドンを用い、所望の性質を有する変異体についてライブラリをスクリーニングするなど、周知の方法を用いて変異体のライブラリを生成することができる。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、抗体の定常領域にアミノ酸置換を行うことができる。例えば、周知のＧ１ｍ１７アロタイプ、Ｇ１ｍ３アロタイプ若しくはＧ１ｍ１アロタイプ、又はこれらの組合わせなどの異なるＩｇＧ１のアロタイプを、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体に用いることができる。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の薬物動態学的特性を、抗体半減期を調節するＦｃドメインにおける置換によって向上させることができる。本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＨＣ１及び／又はＨＣ２に置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含み、ここで残基の番号付けは、ＥＵインデックスに基づくものである。Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換は、抗体半減期を延ばすことが示されている（Ｄａｌｌ'Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４〜２４，２００６）。
Ｆｃ領域に保存的置換及び／又は更なる置換を有する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を、本明細書に述べられる方法を用いてそれらの特性について試験する。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の免疫エフェクター特性を、当業者に既知の方法によるＦｃの修飾によって強化又は消失させることができる。例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貧食作用（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ））のダウンレギュレーションなどのＦｃエフェクター機能を、これらの活性にあずかるＦｃの残基を修飾することによってもたらす及び／又は制御することができる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞に結合した抗体を認識した後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応のことを指す。
ＡＤＣＣを誘導するモノクローナル抗体の能力をそのオリゴ糖成分を操作することによって増進させることができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３はＡｓｎ２９７においてＮーグリコシル化されており、大部分のグリカンは周知の二分枝型Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２又はＧ２Ｆのかたちとなっている。操作されていないＣＨＯ細胞によって産生される抗体は、通常、おおよそ少なくとも８５％のグリカンフコース含量を有している。Ｆｃ領域に結合された二分枝複合体型のオリゴ糖からコアとなるフコースを除去すると、抗原結合性又はＣＤＣ活性を変化させることなく、高められたＦｃγＲＩＩＩａの結合力により抗体のＡＤＣＣが増強される。このようなｍＡｂは、培養の浸透圧の調節（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４（：２４９〜６５，２０１２）、宿主細胞株として変異体ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の応用（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３〜２６７４０ ２００２）、宿主細胞株として変異体ＣＨＯ株ＥＢ６６の応用（Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ；２（４），２０１０；印刷物に先駆けたオンライン出版；ＰＭＩＤ：２０５６２５８２）、宿主細胞株としてラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の応用（Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６〜３４７３，２００３）、α１，６−フコシルトラスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な小分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１〜９０８，２００４）、又はβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩとゴルジα−マンノシダーゼＩＩ又は強力なα−マンノシダーゼＩ阻害剤であるキフネンシンとの同時発現（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：５０３２〜５０３６，２００６，Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９３：８５１〜８６１，２００６；Ｘｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９９：６５２〜６５，２００８）など、Ｆｃオリゴ糖の二分枝複合体型を有する比較的高度に脱フコシル化された抗体の効果的な発現につながることが報告されている異なる方法を用いて得ることが可能である。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体によって誘発されるＡＤＣＣも、抗体Ｆｃ内での特定の置換によって増強させることができる。代表的な置換としては、例えば米国特許第６７３７０５６号に述べられるアミノ酸の２５６、２９０、２９８、３１２、３５６、３３０、３３３、３３４、３６０、３７８又は４３０位における置換がある（残基の番号付けはＥＵインデックスに基づく）。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態では、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、約１％〜約１５％、例えば１５％、１４％、１３％、１２％、１１％１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％のフコース含量を有する二分枝型グリカン構造を有する。いくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、約５０％、４０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％。又は２０％のフコース含量を有するグリカン構造を有する。
「フコース含量」とは、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコース単糖の量を意味する。フコースの相対量は、すべての糖鎖構造に対するフコース含有構造の比率（％）である。これらは、例えば、１）国際特許公開第ＷＯ２００８／０７７５４６号に述べられるようにＮ−グリコシダーゼＦで処理した試料（例えば、複合体、ハイブリッド、並びにオリゴ及び高マンノース構造）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用する、２）Ａｓｎ２９７グリカンの酵素（enxymatic）による放出の後、誘導体化し、蛍光検出及び／又はＨＰＬＣ−ＭＳ（ＵＰＬＣ−ＭＳ）を用いてＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）による検出／定量化を行う、３）第１及び第２のＧｌｃＮＡｃ単糖間で切断し、フコースを第１のＧｌｃＮＡｃに結合したままにするＥｎｄｏ Ｓ又は他の酵素によるＡｓｎ２９７グリカンの処理を行うか又は行わない天然型又は還元型ｍＡｂのインタクトタンパク質分析、４）ｍＡｂの酵素消化（例えばトリプシン又はエンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃ）による構成ペプチドへの消化の後、ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＵＰＬＣ−ＭＳ）による分離、検出及び定量化を行う、５）ＰＮＧａｓｅ ＦによるＡｓｎ２９７の特異的酵素脱グリコシル化によるｍＡｂタンパク質からのｍＡｂオリゴ糖の分離、などの多くの方法によって特性評価及び定量化を行うことができる。このようにして放出されたオリゴ糖は、フルオロフォアで標識し、様々な補足的方法によって分離及び識別することが可能であるが、これらの方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法による実験質量の理論質量との比較によるグリカン構造の詳細な特性評価、イオン交換ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｃ）によるシアリル化度の測定、標準相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｎ）による親水度基準に基づいたオリゴ糖体形態の分離及び定量化、並びに高性能キャピラリー電気泳動レーザー誘導蛍光法（ＨＰＣＥ−ＬＩＦ）によるオリゴ糖の分離及び定量化を可能とするものである。
本出願で使用するところの「低フコース」又は「低フコース含量」とは、フコース含量が約１％〜１５％である抗体のことを指す。
本明細書で使用するところの「正常フコース」又は「正常フコース含量」とは、フコース含量が約５０％よりも高い、一般的に約８０％よりも高い、又は８５％よりも高い抗体のことを指す。
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に述べられる本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ結合抗体の重鎖及び軽鎖を、単離されたポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの一部として、又は直鎖状ＤＮＡ配列の一部としてコードする合成核酸を提供するものであり、インビトロ転写／翻訳で使用される直鎖状ＤＮＡ配列、組成物又はそれらの指向性変異誘発物質の原核細胞、真核細胞若しくは繊維状ファージにおける発現、分泌及び／若しくはディスプレイと適合するベクターが含まれる。
本明細書のいくつかの実施形態は、配列番号２０５、２０６、２０７又は２０８のポリヌクレオチド配列のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチドシンセサイザでの固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成により生成され、完全な一本鎖又は二本鎖分子として構築することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲの後に通常のクローニングを行うなどの他の方法によって生成することもできる。特定の既知の配列のポリヌクレオチドを生成する又は得るための技術は、当該技術分野では周知である。
本発明のポリヌクレオチドは、プロモーター又はエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、ＲｅｐＡ結合を促進するｃｉｓ配列など、少なくとも１つの非コード配列を含み得る。ポリヌクレオチド配列はまた、タンパク質の精製又は検出を促進するための、例えばヒスチジンタグ若しくはＨＡタグなどのマーカー又はタグ配列、シグナル配列、ＲｅｐＡ、Ｆｃ、又はｐＩＸ若しくはｐＩＩＩなどのバクテリオファージコートタンパク質などの融合タンパク質パートナーをコードする更なるアミノ酸をコードする更なる配列を含んでもよい。
本明細書に述べられるいくつかのの実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。こうしたベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであってよい。例えば、本発明の二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することができる。軽鎖及び重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにクローニングすることができる。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントを、免疫グロブリンポリペプチドを確実に発現させる発現ベクター内の制御配列に機能的に連結することができる。このような制御配列としては、シグナル配列、プロモーター（例えば、天然に関連付けられた又は異種由来のプロモーター）、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列が挙げられ、抗体を発現させるために選択される宿主細胞と適合するように選択することができる。ベクターが適当な宿主に組み込まれると、宿主を、組み込まれた合成ポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質の高レベルの発現に適した条件下に維持することができる。
好適な発現ベクターは一般的に、エピソームとして又は宿主染色体ＤＮＡの一部として宿主生物内で複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列によって形質転換された細胞の検出を可能とするためのアンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、又はネオマイシン耐性などの選択マーカーを含んでいる。
本明細書に述べられるいくつかの実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。「宿主細胞」なる用語は、ベクターが導入された細胞のことを指す。宿主細胞なる用語は、特定の対象細胞のみでなく、こうした細胞の子孫も指すものであることが理解される。特定の修飾は変異又は環境的影響のために後続の世代に生じ得ることから、こうした子孫は親細胞とは同じではない可能性があるが、本明細書で使用するところの「宿主細胞」なる用語の範囲にやはり含まれるものとする。このような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞又は古細菌細胞であることができる。
代表的な真核細胞としては、哺乳動物、昆虫、鳥類又は他の動物由来のものが挙げられる。哺乳動物真核細胞としては、ＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），バージニア州マナッサ、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），英国ウィルツシャー、サルスベリー，ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株などのハイブリドーマ又はミエローマ細胞株などの不死化細胞株が挙げられる。代表的なヒトミエローマ細胞株としては、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）がある。その他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、メリーランド州ウォーカーズビル）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体、及びＥＧＦＲ結合又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの使用
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ヒトの疾患、又は細胞、組織、臓器、体液、若しくは広くは宿主における特定の病理的状態を診断、監視、調節、治療、緩和し、その発病の予防の助けとなり、又はその症状を軽減するために使用することができる。本発明の方法は、あらゆる分類に属する動物患者を治療するのに使用することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。
本発明の一態様は、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔを発現する細胞の成長又は増殖を阻害するための方法であって、細胞を、本発明の単離された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体と接触させることを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象におけるＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍又は癌細胞の成長又は転移を阻害するための方法であって、前記対象に、有効量の本発明の単離された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を投与して、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍又は癌細胞の成長又は転移を阻害することを含む方法である。
本発明の別の態様は、癌を有する対象を治療する方法であって、癌を治療するのに十分な期間にわたってその治療を必要とする患者に、治療上の有効量の本発明の単離された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を投与することを含む方法である。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦ、可溶性ＥＧＦＲ、可溶性ｃ−Ｍｅｔ若しくはその他のＥＧＦＲリガンド又はＨＧＦの異常な活性化又は産生によって特徴付けられる任意の疾患又は障害、あるいはＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦ若しくは他のＥＧＦＲリガンド、又はＨＧＦの異常な活性化及び／又は産生が、前記疾患又は障害を有するか又はその素因を有する対象の細胞又は組織において生じている悪性腫瘍又は癌が関与する場合も関与しない場合もあるＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔの発現に関連した障害の治療に使用することができる。
本発明のｃ−Ｍｅｔと特異的に結合しｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合をブロックする本発明のＦＮ３ドメインは、癌及び良性腫瘍を含む腫瘍の治療に使用することができる。本発明のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインによる治療に適した癌としては、ｃ−Ｍｅｔを過剰発現するものが挙げられる。本発明のＦＮ３ドメインによる治療に適した代表的な癌としては、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、大腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頸部癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、皮膚癌、口腔癌、食道癌、腟癌、子宮頸癌、脾臓の癌、睾丸癌、及び胸腺の癌が挙げられる。
ＥＧＦＲと特異的に結合しＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合をブロックする本発明のＦＮ３ドメインは、癌及び良性腫瘍を含む腫瘍の治療に使用することができる。本発明のＦＮ３ドメインによる治療に適した癌としては、ＥＧＦＲ又はその変異体を過剰発現するものが挙げられる。本発明のＦＮ３ドメインによる治療に適した代表的な癌としては、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、大腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、皮膚癌、口腔癌、食道癌、腟癌、子宮頸癌、脾臓の癌、睾丸癌、及び胸腺の癌が挙げられる。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、癌及び良性腫瘍を含む腫瘍の治療に使用することができる。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体による治療に適した代表的な癌としては、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔを過剰発現するもの、ＥＧＦＲの活性及び／又は発現レベルの上昇（例えば、ＥＧＦＲを活性化する変異、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅、又はリガンド媒介によるＥＧＦＲ活性化など）並びにｃ−Ｍｅｔの活性及び／又は発現レベルの上昇（例えば、ｃ−Ｍｅｔを活性化する変異、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子の増幅、又はＨＧＦ媒介によるｃ−Ｍｅｔ活性化など）と関連した癌が挙げられる。
癌と関連付けることができる代表的なＥＧＦＲ活性化変異としては、チロシンキナーゼ活性の上昇、受容体のホモ二量体及びヘテロ二量体の形成、リガンド結合の増強などのＥＧＦＲの少なくとも１つの生物学的活性の増大につながる点変異、欠失変異、挿入変異、逆位、又は遺伝子増幅が挙げられる。変異は、ＥＧＦＲ遺伝子又はＥＧＦＲ遺伝子と関連する調節領域の任意の部分に位置し得るものであり、エクソン１８、１９、２０又は２１内の変異、及びキナーゼドメイン内の変異が含まれる。代表的なＥＧＦＲ活性化変異としては、Ｇ７１９Ａ、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ、又はＴ７９０Ｍの置換、Ｅ７４６〜Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８〜Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６とＡ７６７との間のＡｌａの挿入、Ｓ７６８とＶ７６９との間のＳＶＡ（Ｓｅｒ，Ｖａｌ，Ａｌａ）の挿入、及びＰ７７２とＨ７７３との間のＮＳ（Ａｓｎ，Ｓｅｒ）の挿入がある。ＥＧＦＲ活性化変異の他の例も当該技術分野において知られている（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０２７２０８３号を参照）。受容体のホモ及びヘテロ二量体、受容体リガンド、自己リン酸化部位、及びＥｒｂＢ媒介シグナル伝達に関与するシグナル伝達分子をはじめとするＥＧＦＲ及び他のＥｒｂＢ受容体に関する情報は、当該技術分野では既知である（例えば、Ｈｙｎｅｓ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ５：３４１〜３５４，２００５を参照）。
代表的なｃ−Ｍｅｔ活性化変異としては、チロシンキナーゼ活性の上昇、受容体のホモ二量体及びヘテロ二量体の形成、リガンド結合の増強などのｃ−Ｍｅｔタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性の増大につながる点変異、欠失変異、挿入変異、逆位、又は遺伝子増幅が挙げられる。変異は、ｃ−Ｍｅｔのキナーゼドメインにおける変異など、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子又はｃ−Ｍｅｔ遺伝子と関連する調節領域の任意の部分に位置し得るものである。代表的なｃ−Ｍｅｔ活性化変異としては、Ｎ３７５、Ｖ１３、Ｖ９２３、Ｒ１７５、Ｖ１３６、Ｌ２２９、Ｓ３２３、Ｒ９８８、Ｓ１０５８／Ｔ１０１０及びＥ１６８位の残基における変異がある。ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの変異を検出するための方法は周知である。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体などの本発明の二重特異性分子による治療に適した代表的な癌としては、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、小細胞肺癌、大腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頸部癌、咽頭癌、鼻の癌、膵臓癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、腟癌、子宮頸癌、脾臓の癌、睾丸癌、胃癌、胸腺の癌、結腸癌、甲状腺癌、肝臓癌（肝細胞癌（ＨＣＣ））、又は散発性若しくは遺伝性乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）が挙げられる。
本発明の別の態様は、癌を有する対象を治療する方法であって、治療上の有効量の本発明の単離された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を、治療を要する患者に癌を治療するのに充分な期間にわたって投与することを含み、前記対象は、ＣＤ１６の１５８位のフェニルアラニンについて同型である（遺伝子型ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ／Ｆ）か、又はＣＤ１６の１５８位のバリン及びフェニルアラニンについて異型である（遺伝子型ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ／Ｖ）方法である。ＣＤ１６は、Ｆｃγ受容体ＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）又は低親和性免疫グロブリンγＦｃ領域受容体ＩＩＩ−Ａアイソフォームとしても知られる。ＦｃγＲＩＩＩａタンパク質の１５８位の残基におけるバリン／フェニルアラニン（Ｖ／Ｆ）多型は、ヒトＩｇＧに対するＦｃγＲＩＩＩａの親和性に影響することが示されている。ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ／Ｆ又はＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ／Ｖの多型を有する受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ／Ｖと比較してＦｃとの弱い結合性、したがって低いＡＤＣＣを示す。ヒトＮ結合オリゴ糖にフコースが存在しないか又は低量である場合、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）に対する抗体の結合が高められるために、ＡＤＣＣを誘導する抗体の能力が高くなる（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３〜４０，２００２）。本発明の抗体は、約１％〜約１０％の低いフコース含量を有するものである。いくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、フコース含量が約５０％、４０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％のグリカン構造を有する。したがって、本発明の抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ／Ｆ又はＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ／Ｖの遺伝子型を有する患者の治療においてより高い有効性を示し得る。通常の方法を用いてＦｃγＲＩＩＩａの多型について患者を分析することができる。
本明細書に述べられるいくつかの方法では、本発明の抗体は、１以上のＥＧＦＲ阻害剤による治療に対して耐性を有するか又は耐性を獲得した癌を有する対象を治療するのに使用することができる。癌が耐性を獲得し得る代表的なＥＧＦＲ阻害剤としては、抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、マツズマブ、ニモツズマブ、小分子ＥＧＦＲ阻害剤であるＴａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）、ＩＲＥＳＳＡ（ゲフィニチブ）、ＥＫＢ−５６９（ペリチニブ、不可逆的ＥＧＦＲ ＴＫＩ）、ｐａｎ−ＥｒｂＢ及び他の受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ラパチニブ（ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤）、ペリチニブ（ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤）、バンデタニブ（ＺＤ６４７４、ＺＡＣＴＩＭＡ（商標）、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２及びＲＥＴ ＴＫＩ）、ＰＦ００２９９８０４（ダコミチニブ、不可逆的ｐａｎ−ＥｒｂＢ ＴＫＩ）、ＣＩ−１０３３（不可逆的ｐａｎ−ｅｒｂＢ ＴＫＩ）、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２、不可逆的ｐａｎ−ＥｒｂＢ ＴＫＩ）、ＡＶ−４１２（二重ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ２阻害剤）、ＥＸＥＬ−７６４７（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＧＥＶＧＲ及びＥｐｈＢ４阻害剤）、ＣＯ−１６８６（不可逆的変異体選択的ＥＧＦＲ ＴＫＩ）、ＡＺＤ９２９１（不可逆的変異体選択的ＥＧＦＲ ＴＫＩ）、並びにＨＫＩ−２７２（ネラチニブ、不可逆的ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２阻害剤）がある。本明細書に述べられる方法は、ゲフィニチブ、エルロチニブ、アファチニブ、ＣＯ−１６８６、ＡＺＤ９２９１及び／又はセツキシマブによる治療に対する耐性を有する癌の治療に使用することができる。使用可能な代表的な抗体の１つにＥＭ１−ｍＡｂがある。
本発明の別の態様は、癌を有する対象を治療する方法であって、治療上の有効量の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を、治療を要する患者に癌を治療するのに充分な期間にわたって投与することを含み、前記対象が、エルロチニブ、ゲフィニチブ、アファチニブ、ＣＯ−１６８６、ＡＺＤ９２９１又はセツキシマブによる治療に対する耐性を有するか又は耐性を獲得している、方法である。
様々な定性的及び／又は定量的方法を用いて、対象がＥＧＦＲ阻害剤による治療に対する耐性を有するか、耐性を生じたか、又は耐性を生じやすいかを判定することができる。ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性と関連付けることができる症状としては、例えば、患者の健康状態の悪化又は停滞、腫瘍のサイズの増大、腫瘍の増殖の低下の停止又は遅滞、及び／又は体内の１つの場所から他の臓器、組織若しくは細胞への癌性細胞の拡散が挙げられる。食欲低下、認知機能障害、うつ、呼吸困難、疲労感、ホルモン障害、好中球減少、疼痛、末梢神経障害、及び性機能障害などの、癌に関連した様々な症状の再発又は悪化もまた、患者が、ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性を生じたか又は生じやすいことの指標となり得る。癌に関連した症状は、癌のタイプに応じて異なり得る。例えば、子宮頸がんに関連した症状としては、異常出血、異常に重いおりもの、正常な月経周期と関係のない骨盤痛、膀胱痛又は排尿痛、及び性交、膣洗浄又は内診後の規則的な月経の間の出血を挙げることができる。肺癌に関連した症状としては、持続性咳嗽、喀血、息切れ、喘鳴をともなう胸痛、食欲低下、意図的でない体重減少、及び疲労感を挙げることができる。肝臓癌の症状としては、食欲及び体重の低下、腹痛（特に右上腹部から背中及び肩にかけての）、悪心嘔吐、一般的な衰弱及び疲労感、肝臓肥大、腹部膨満（腹水）、並びに皮膚及び白目の黄変（黄疸）を挙げることができる。腫瘍学の当業者であれば、特定の癌のタイプに関連した症状を直ちに特定することができる。
対象がＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性を生じたかを判定するための他の手段としては、癌細胞におけるＥＧＦＲリン酸化、ＥＲＫ１／２リン酸化、及び／又はＡＫＴリン酸化を調べることが挙げられ、その場合、増大したリン酸化は、対象がＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性を生じたか又は耐性を生じやすいことを示し得る。ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２及び／又はＡＫＴのリン酸化を測定する方法は周知であり、また本明細書に述べられる。ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性を生じた対象を特定するには、例えば、循環中のＨＧＦのレベルの増大、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子の活性化変異、又はｃ−Ｍｅｔ遺伝子の増幅に起因するｃ−Ｍｅｔ発現レベルの上昇又はｃ−Ｍｅｔ活性の上昇の検出を伴い得る。
本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲ活性化変異又はＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有するＮＳＣＬＣ腫瘍又は腫瘍転移を有する患者のＮＳＣＬＣを治療する方法であって、前記患者に、治療上の有効量の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を投与することを含む方法である。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、扁平上皮細胞癌、腺癌、及び大細胞癌を含む、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣの細胞は上皮の表現型を有する。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、１以上のＥＧＦＲ阻害剤による治療に対する耐性を獲得している。
ＮＳＣＬＣでは、ＥＧＦＲ遺伝子の特定の変異は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）に対する高い応答率（７０〜８０％）を伴う。エクソン１９の５個のアミノ酸の欠失又はＥＧＦＲの点変異Ｌ８５８Ｒは、ＥＧＦＲーＴＫＩ感受性と関連している（Ｎａｋａｔａ ａｎｄ Ｇｏｔｏｈ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ １６：７７１〜７８１，２０１２）。これらの変異は、ＥＧＦＲキナーゼ活性のリガンド非依存性活性化を生じる。ＥＧＦＲ活性化変異は、ＮＳＣＬＣ患者の１０〜３０％において生じ、東アジア人、女性、喫煙未経験者、及び腺癌の組織学的所見を有する患者において有意に多く見られる（Ｊａｎｎｅ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２（１４ Ｓｕｐｐｌ）：４４１６ｓ〜４４２０ｓ，２００６）。ＥＧＦＲ遺伝子の増幅もまた、ＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療後の反応と強く相関している（Ｃａｐｐｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９７：６４３〜５５，２００５）。
ＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣ患者の大半が、ＥＧＦＲ ＴＫＩ治療に初期には反応するものの、事実上すべての患者が耐性を獲得し、持続的な反応が妨げられる。５０〜６０％の患者が、ＥＧＦＲのキナーゼドメインの第２の部位の点変異（Ｔ７９０Ｍ）によって耐性を獲得する。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性を獲得した全腫瘍の約６０％で、ｃ−Ｍｅｔ発現の増大、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子の増幅、又はその唯一知られるリガンドであるＨＧＦの増大が見られる（Ｔｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，１７：７７〜８８，２０１０）。
本発明の別の実施形態は、癌を有する患者を治療する方法であって、治療上の有効量の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を、治療を要する患者に癌を治療するのに充分な時間にわたって投与することを含み、前記癌が、ＥＧＦＲ活性化変異、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅、循環中のＨＧＦのレベルの増大、ｃ−Ｍｅｔ活性化変異、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子の増幅、又は変異体ＫＲＡＳに関連している、方法である。
特定の実施形態では、ＥＧＦＲ活性化変異は、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸）、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ又はＴ７９０Ｍの置換、Ｅ７４６〜Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８〜Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６とＡ７６７との間のＡｌａ（Ａ）の挿入、Ｓ７６８とＶ７６９との間のＳｅｒ、Ｖａｌ及びＡｌａ（ＳＶＡ）の挿入、並びにＰ７７２とＨ７７３との間のＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入である。
本発明の別の実施形態は、癌を有する患者を治療する方法であって、治療上の有効量の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を、治療を要する患者に癌を治療するのに充分な時間にわたって投与することを含み、前記癌が、ＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、又は残基Ｅ７４６〜Ａ７５０の欠失（ｄｅｌ（Ｅ７４６，Ａ７５０））、ＥＧＦＲ増幅、又はｃ−Ｍｅｔ増幅に関連している、方法である。
いくつかの実施形態では、癌は、野生型ＥＧＦＲ及び野生型ｃ−Ｍｅｔに関連している。
いくつかの実施形態では、癌は、野生型ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの増幅に関連している。
いくつかの実施形態では、癌は、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ及びＴ７９０Ｍ変異及び野生型ｃ−Ｍｅｔに関連している。
いくつかの実施形態では、癌は、ＥＧＦＲ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４，Ａ７５０）及び野生型ｃ−Ｍｅｔに関連している。
いくつかの実施形態では、癌は、ＥＧＦＲ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４，Ａ７５０）及びｃ−Ｍｅｔ増幅に関連している。
いくつかの実施形態では、癌は、ＥＧＦＲ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４，Ａ７５０）、ＥＧＦＲ増幅、及びｃ−Ｍｅｔ増幅に関連している。
いくつかの実施形態では、患者は、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ及びＴ７９０Ｍ変異、並びに野生型ｃ−Ｍｅｔに関連したＮＳＣＬＣを有する。
いくつかの実施形態では、患者は、ＥＧＦＲ増幅及び野生型ｃ−Ｍｅｔに関連したＮＳＣＬＣを有する。
いくつかの実施形態では、患者は、ＥＧＦＲ増幅及びｃ−Ｍｅｔ増幅に関連したＮＳＣＬＣを有する。
いくつかの実施形態では、患者は、ＥＧＦＲ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４，Ａ７５０）及び野生型ｃ−Ｍｅｔに関連したＮＳＣＬＣを有する。
いくつかの実施形態では、患者は、ＥＧＦＲ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４，Ａ７５０）及びｃ−Ｍｅｔ増幅に関連したＮＳＣＬＣを有する。
いくつかの実施形態では、本発明のＥＭ１−ｍＡｂにより治療される。本発明のＥＭ１−ｍＡｂは、腫瘍が、Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、ｄｅｌ（Ｅ７４６，Ａ７５０）ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ増幅、野生型ｃ−Ｍｅｔ、及び／又はｃ−Ｍｅｔ増幅に関連している場合に、インビボ腫瘍動物モデルにおいて有効性を示す。ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔの増幅は、例えばサザンブロッティング、ＦＩＳＨ、又は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）によってＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ遺伝子のコピー数を決定するなどの標準的な方法によって評価することができる。
本発明の別の実施形態は、癌を有する患者を治療する方法であって、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の治療上の有効量を、治療を要する患者に癌を治療するのに充分な時間にわたって投与することを含み、前記癌が、ＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、又は残基Ｅ７４６〜Ａ７５０の欠失（ｄｅｌ（Ｅ７４６，Ａ７５０））、ＥＧＦＲ増幅、又はｃ−Ｍｅｔ増幅、及び変異体ＫＲＡＳに関連している、方法である。
いくつかの実施形態では、変異体ＫＲＡＳはＧ１２Ｖ置換を有する。ＫＲＡＳは、グアノシントリホスファターゼ（ＧＴＰａｓｅｓ）をコードするＲＡＳ癌原遺伝子のファミリーに属し、受容体の下流のＥＧＦＲシグナルトランスダクションを媒介する。したがって、活性化Ｇ１２Ｖ又はＧ１２Ｃ変異などの癌原遺伝子ＫＲＡＳ変異のある腫瘍は、ＥＧＦＲ抗体によって治療可能ではないことが予測される。抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブ及びパニツムマブによる臨床試験により、ＫＲＡＳ変異を有する結腸直腸腫瘍を有する患者はこれらの薬剤には応答しないことが示されている（Ｖａｎ Ｃｕｔｓｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３６０：１４０８〜１４１７，２００９；Ｌｉｅｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６：３７４〜３７９，２００８；Ａｍａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６：１６２６〜１６３４ｍ ２００８）。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、効果的なＡＤＣＣによりＫＲＡＳ変異体細胞株の殺滅を媒介するため、現在用いられている抗ＥＧＦＲ治療薬とは異なり、ＫＲＡＳ活性化変異に関連した癌を有する患者の治療において有効であると考えられる。このような抗体の代表的なものにＥＭ１−ｍＡｂがある。
「治療する」又は「治療」なる用語は、治療的処置又は予防的又は防止的措置の両方を指し、その目的は、癌の発生又は拡散といった望ましくない生理学的変化又は疾患を予防するか又は遅らせる（軽減する）ことである。本発明の目的において、有益又は望ましい臨床結果としては、これらに限定されるものではないが、検出可能か検出不能であるかにかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の軽減、疾患の安定した（すなわち悪化していない）状態、疾患の進行の遅延又は遅滞、病状の緩和又は軽減、及び寛解（部分的又は完全）が挙げられる。「治療」は、治療を受けない場合に予測される生存期間と比較して延長された生存期間も意味し得る。治療を要する患者には、状態若しくは疾患を既に有している者ばかりでなく、状態若しくは疾患を有する可能性の高い者、又は状態若しくは疾患を予防する必要のある者が含まれる。
「治療上の有効量」とは、望ましい治療結果を達成するうえで必要な用量及び時間で効果的な量のことを指す。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の治療上の有効量は、その個人の病状、年齢、性別、及び体重、並びに本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体がその個人において望ましい応答を生じさせる能力といった要因に応じて異なり得る。耐性にともなって低下又は弱まらせることができる有効な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ治療の代表的な指標としては、例えば、患者の健康状態の改善、腫瘍のサイズの減少又は縮小、腫瘍の増殖の停止又は遅滞、及び／あるいは体内の他の場所への癌細胞の転移がないことなどが挙げられる。
投与／医薬組成物
本発明は、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。治療用途では、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−ＭｅｔＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、有効量の前記ドメイン、分子、又は抗体を、医薬的に許容される担体中に有効成分として含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」なる用語は、活性化合物とともに投与される希釈剤、補助剤、賦形剤又は溶媒のことを指す。このような溶媒は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む水及び油などの液体であってよい。例えば０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は無菌であり、通常は粒子状物質を含まない。これらは、従来の周知の滅菌技術（例えば濾過）によって滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調節及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤など、生理学的条件に近づけるために必要な医薬的に許容される補助物質を含んでよい。こうした医薬製剤中の本発明の分子又は抗体の濃度は、約０．５重量％未満〜通常少なくとも約１重量％、最大で１５又は２０重量％と大きく異なり得るものであり、選択された特定の投与方法にしたがって、必要な用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択される。好適な溶媒及び製剤（他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む）については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１stＥｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ ６９１〜１０９２（特にｐｐ．９５８〜９８９を参照）に述べられている。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の治療用途での投与方法は、錠剤、カプセル、溶液、粉末、ゲル、粒子として、注射器、移植式装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、又は当該技術分野では周知の、当業者により認識される他の手段に入れられた製剤を用いる、非経口的投与、例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内又は皮下、肺、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）などの、薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路であってよい。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮による送達によって実現することができる。
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍｌ滅菌緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−ＭｅｔＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを含有するように調製することができる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、例えば、静脈内（ＩＶ）注入又はボーラス注射による非経口投与、筋肉内投与又は皮下投与又は腹腔内投与などの任意の好適な経路によって患者に投与することができる。ＩＶ注入は、最短で１５分間程度、多くの場合は、３０分間、６０分間、９０分間、又は更には２時間若しくは３時間にわたって投与することができる。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、疾患の部位（例えば腫瘍自体）に直接注入することもできる。癌を有する患者に投与される用量は、治療される疾患を軽減又は少なくとも部分的に停滞させるのに充分なものであり（治療上の有効量）、しばしば体重１ｋｇ当たり０．１〜１０ｍｇ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ｍｇ／ｋｇであってよいが、これよりも高い、例えば１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。例えば、５０、１００、２００、５００又は１０００ｍｇの固定された単位用量を投与してもよく、あるいは用量を、例えば４００、３００、２５０、２００又は１００ｍｇ／ｍ2といったように患者の体表面積に基づいたものとしてもよい。通常、癌の治療には１〜８回の用量（例えば１、２、３、４、５、６、７又は８回）を投与することができるが、１０、１２、２０回、又はそれ以上の用量を投与してもよい。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月又はそれ以上の期間の後、繰り返すことができる。長期的投与と同様、反復治療計画も可能である。反復投与は同じ用量又は異なる用量とすることができる。
例えば、静脈内注入用の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を含む医薬組成物を、８０ｋｇの患者への投与には、約２００ｍｌの無菌リンゲル液、及び約８ｍｇ〜約２４００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約１６００ｍｇ、又は約４００ｍｇ〜約８００ｍｇの二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を含むように作製することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための方法は周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにより詳しく述べられている。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、保存用に凍結乾燥し、使用に先立って適当な担体中で戻すことができる。この方法は、従来のタンパク質調製において有効であることが示されており、周知の凍結乾燥及びもどす方法を用いることができる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、第２の治療薬と併用して同時、逐次、又は別々に投与することができる。第２の治療薬は、化学療法薬又は標的抗癌治療薬とすることができる。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、１以上の任意の化学療法薬又は当業者には周知の他の抗癌治療薬と一緒に投与することができる。化学療法薬は癌の治療に有用な化学化合物であり、増殖阻害剤又は他の細胞傷害剤を含み、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、血管新生阻害剤などが挙げられる。化学療法薬の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））；アルキルスルホン酸塩、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ及びウレドーパ；エチレンイミン及びメチルアメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロロメラミンを含む）；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチェアミシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダムビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ぺプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン及びゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート及び５−ＦＵ；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン及びトリメトレキセート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン及びチオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン及びフロクスウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、ルネピチオスタン及びテストラクトン；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン及びトリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫＲ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド又はタキサンファミリーのメンバー、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））並びにこれらの類似体；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；受容体チロシンキナーゼ及び／又は血管新生の阻害剤（ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、パゾパニブ（ＶＯＴＲＩＥＮＴ（商標））、トセラニブ（ＰＡＬＬＡＤＩＡ（商標））、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（商標））、セドリラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ（登録商標））、レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３−４５０６）、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ゲフィニチブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標））、ＢＩＢＷ２９９２（ＴＯＶＯＫ（商標））、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標））、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）などを含む）；並びに上記のいずれかの医薬的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。やはりこの定義に含まれるものとして、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））などの抗エストロゲン剤；並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；並びに上記のいずれかの医薬的に許容される塩、酸、又は誘導体などの、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤がある。他の従来の細胞傷害性化学化合物（Ｗｉｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｃａｌａｂｒｅｓｉ ｅｔ ａＬ，ｅｄｓ．），Ｃｈａｐｔｅｒ １０，ＭｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに開示されるものなど）も本発明の方法に適用可能である。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体と併用することが可能な代表的な薬剤としては、チロシンキナーゼ阻害剤及び標的抗癌治療薬、例えばＩｒｅｓｓａ（登録商標）（ゲフィニチブ）及びＴａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）、並びにＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４又はＶＥＧＦの他のアンタゴニストが挙げられる。代表的なＨＥＲ２アンタゴニストとしては、ＣＰ−７２４−７１４、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）（トラスツズマブ）、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標）（パーツズマブ）、ＴＡＫ−１６５、ラパチニブ（ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤）、及びＧＷ−２８２９７４が挙げられる。代表的なＨＥＲ３アンタゴニストとしては、抗Ｈｅｒ３抗体が挙げられる（例えば米国特許出願公開第２００４／０１９７３３２号を参照）。代表的なＨＥＲ４アンタゴニストとしては、抗ＨＥＲ４ｓｉＲＮＡが挙げられる（例えばＭａａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １７：６７〜７９，２００６を参照）。代表的なＶＥＧＦアンタゴニストにはベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））がある。
小分子が本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体と併用される場合には、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、通常はより高い頻度、好ましくは１日１回投与されるが、１日２、３、４回、又はこれよりも多い回数も可能であり、２日おき、毎週、又は他の間隔も可能である。小分子薬剤は経口投与されることが多いが、例えばＩＶ注入又はボーラス注射又は皮下投与若しくは筋肉内投与による非経口投与も可能である。小分子薬剤の用量は、通常１０〜１０００ｍｇ、又は約１００、１５０、２００若しくは２５０ｍｇでよい。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体が第２の治療薬と併用して投与される場合、併用は任意の便宜のよい時間枠で行うことができる。例えば、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体及び第２の治療薬を同じ日に、更には同じ静脈内注入で患者に投与することができる。しかしながら、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体及び第２の治療薬は、１日ごとに交互に、又は１週ごとに交互に、２週ごとに交互に、又は１ヶ月ごとに交互に、といった要領で投与することもできる。いくつかの方法では、２つの薬剤が治療される患者の体内に検出可能な濃度で同時に存在する（例えば血清中に）ように、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体及び第２の治療薬は、時間的に充分に近くで投与される。いくつかの方法では、所定の時間にわたる多くの回数の投与からなる二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の全治療過程の後、又は前に、やはり多くの回数の投与からなる第２の治療薬の治療過程が行われる。いくつかの方法では、２番目に投与される二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体による治療は、患者が、最初に投与された第２の治療薬に対する耐性を有するか又は耐性を生じた時点で開始される。患者は、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体及び第２の治療薬の一方又は両方による治療過程を１回のみ受けるか又は複数回の治療過程を受けることができる。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の投与と第２の治療薬の投与との間に、１、２、若しくは数日間又は数週間の回復期間を用いてもよい。第２の治療薬について適当な治療レジメンが既に確立されている場合には、そのレジメンを本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体と組み合わせて用いることができる。例えば、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）は１００ｍｇ又は１５０ｍｇの丸剤として１日１回服用され、Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ゲフィチニブ）は２５０ｍｇの錠剤として１日１回服用される。
任意に第２の治療薬と併用される二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体は、外部放射線照射、強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）、並びにガンマナイフ、サイバーナイフ、Ｌｉｎａｃ及び組織内放射線（例えば移植放射性シード、ＧｌｉａＳｉｔｅバルーン）などの任意の形態の放射線手術を含む任意の形態の放射線治療、並びに／又は手術とともに投与することができる。放射線治療との併用は、頭頸部癌及び脳腫瘍に特に適切となり得る。
以上、本発明を一般論として説明したが、本発明の実施形態を、特許請求の範囲を限定するものとして解釈すべきではない以下の実施例に更に開示する。
実施例１テンコンライブラリの構築
テンコン（配列番号１）は、ヒトテネイシンＣの１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列より設計された免疫グロブリン様の骨格であるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２；米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号）。テンコンの結晶構造は、７個のβ鎖を連結する６個の表面が露出したループを示している。これらのループ、又は各ループ内の選択された残基をランダム化することによって、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構築し、これを用いて特定の標的と結合する新規の分子を選択することができる。
テンコン：
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓｌｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｎｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｋｇｇｈｒｓｎｐｌｓａｅｆｔｔ（配列番号１）：
ＴＣＬ１ライブラリの構築
ｃｉｓディスプレイシステム（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２）とともに使用するために、テンコン（配列番号１）のＦＧループのみをランダム化するように設計したライブラリ（ＴＣＬ１）を構築した。このシステムでは、Ｔａｃプロモーター、テンコンライブラリのコード配列、ＲｅｐＡコード配列、ｃｉｓエレメント、及びｏｒｉエレメントの配列を組み込む一本鎖ＤＮＡが生成される。インビトロ転写／翻訳系で発現させると、テンコン−ＲｅｐＡ融合タンパク質が、それがコードされたＤＮＡとｃｉｓで結合された複合体が生成される。その後、後述するように、標的分子と結合する複合体を単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する。
ｃｉｓディスプレイとともに使用するためのＴＣＬ１ライブラリの構築は、ＰＣＲを連続したラウンドで行って、最終的な直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子を１／２ずつ生成することによって行った（５'フラグメントがプロモーター及びテンコン配列を含むのに対して、３'フラグメントはＲｅｐＡ遺伝子並びにｃｉｓ及びｏｒｉエレメントを含む）。これらの１／２ずつを、制限消化によって合わせることによってコンストラクト全体を生成する。このＴＣＬ１ライブラリは、テンコンのＦＧループＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号８６）のみにランダムなアミノ酸を組み込むように設計した。このライブラリの構築にはＮＮＳコドンを使用して、ＦＧループに２０種類全てのアミノ酸及び１つの終止コドンの組み込みが可能になった。このＴＣＬ１ライブラリは、それぞれが、多様性を更に高めるために異なるランダム化されたＦＧループの長さ（７〜１２個の残基）を有する、６つの別個のサブライブラリを含む。テンコンに基づくライブラリの設計を表２に示す。
*ＴＡＰＤＡＡＦＤ：配列番号１の残基２２〜２８
**ＫＧＧＨＲＳＮ：配列番号８６
Ｘは、ＮＮＳコドンによってコードされている縮重アミノ酸を指す。
＃は、本文で述べられる「設計によるアミノ酸の分布」を指す。
ＴＣＬ１ライブラリを構築するため、ＰＣＲの連続したラウンドを行ってＴａｃプロモーターを付加し、ＦＧループに縮重性を組み入れ、最終的なアセンブリに必要な制限部位を付加した。最初に、プロモーター配列とＦＧループのテンコン配列５'を含むＤＮＡ配列を２段階でＰＣＲにより生成した。完全なテンコン遺伝子配列に対応するＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして、プライマーＰＯＰ２２２０（配列番号２）及びＴＣ５'ｔｏＦＧ（配列番号３）とともに使用した。この反応で得られたＰＣＲ産物をテンプレートとして、プライマー１３０ｍｅｒ（配列番号４）及びＴＣ５'ｔｏＦＧとともにＰＣＲ増幅の次のラウンドで使用して、５'及びプロモーター配列のテンコンへの付加を完了した。次に、第１の段階で生成されたＤＮＡ産物を、順方向プライマーＰＯＰ２２２２（配列番号５）及び縮重ヌクレオチドを含む逆方向プライマーＴＣＦ７（配列番号６）、ＴＣＦ８（配列番号７）、ＴＣＦ９（配列番号８）、ＴＣＦ１０（配列番号９）、ＴＣＦ１１（配列番号１０）、又はＴＣＦ１２（配列番号１１）を用いて増幅することによってＦＧループに多様性を導入した。ＰＣＲサイクルを最小の回数にとどめライブラリの多様性を最大とするために各サブライブラリについて、少なくとも８回の１００μＬのＰＣＲ反応を行った。少なくとも５μｇのこのＰＣＲ産物をゲル精製し、プライマーＰＯＰ２２２２（配列番号５）及びＰＯＰ２２３４（配列番号１２）とともに次のＰＣＲ段階で使用して、６ｘＨｉｓタグ及びＮｏｔＩ制限部位をテンコン配列の３'末端に付加した。このＰＣＲ反応は、わずか１５回のＰＣＲサイクル及び少なくとも５００ｎｇのテンプレートＤＮＡを用いて行った。得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｏｔＩ制限酵素で消化し、Ｑｉａｇｅｎカラムにより精製した。
ライブラリの３'フラグメントは、ＰｓｐＯＭＩ制限部位、ｒｅｐＡ遺伝子のコード領域、並びにｃｉｓ及びｏｒｉエレメントなどのディスプレイ用エレメントを含む一定のＤＮＡ配列である。このＤＮＡフラグメントを含むプラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＭ１３順方向プライマー及びＭ１３逆方向プライマーとともに使用してＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物をＰｓｐＯＭＩで一晩消化し、ゲル精製した。ライブラリＤＮＡの５'部分を、ｒｅｐＡ遺伝子を含む３'ＤＮＡにライゲーションするために、２ｐｍｏｌの５'ＤＮＡを等モル量の３'ｒｅｐＡ ＤＮＡと、ＮｏｔＩ及びＰｓｐＯＭＩ酵素並びにＴ４リガーゼの存在下でライゲーションした。３７℃で一晩ライゲーションした後、ライゲーションされたＤＮＡの少量をゲル泳動にかけてライゲーションの効率を確認した。ライゲーションしたライブラリ産物を１２個のＰＣＲ増幅物に分割し、ＰＯＰ２２５０（配列番号１３）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）のプライマーペアを用いて１２サイクルのＰＣＲ反応を行った。ＴＣＬ１ライブラリの各サブライブラリのＤＮＡ収率は３２〜３４μｇの範囲であった。
ライブラリの質を評価するため、少量の活性ライブラリをプライマーＴｃｏｎ５ｎｅｗ２（配列番号１５）及びＴｃｏｎ６（配列番号１６）で増幅し、リガーゼ非依存性クローニングによって修飾ｐＥＴベクターにクローニングした。このプラスミドＤＮＡをＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質導入し、ランダムに選択された９６個のコロニーをＴ７プロモータープライマーを用いて配列決定した。重複配列は認められなかった。全体で約７０〜８５％のクローンが、フレームシフト変異のない完全なプロモーター及びテンコンのコード配列を有していた。終止コドンを有するクローンを除外した機能配列の割合は、５９％〜８０％であった。
ＴＣＬ２ライブラリの構築
テンコンのＢＣループ及びＦＧループの両方がランダム化され、各位置のアミノ酸の分布が厳密に制御されたＴＣＬ２ライブラリを構築した。表３は、ＴＣＬ２ライブラリの所望のループ位置におけるアミノ酸の分布を示す。設計によるアミノ酸の分布には２つの目的があった。最初に、テンコンの結晶構造分析に基づき、かつ／又はホモロジーモデリングから、テンコンの折り畳み及び安定性にとって構造的に重要であると予測される残基にライブラリーを偏らせた。例えば、２９位は、この残基がテンコンの折り畳み構造の疎水性コアに埋め込まれていることから、疎水性アミノ酸のサブセットのみに固定した。設計の第２層は、アミノ酸の分布を、抗体の重鎖ＨＣＤＲ３に選択的に見られる残基の分布に近づくように偏らせることによって、親和性の高いバインダーを効率的に生成することを含んでいた（Ｂｉｒｔａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７７：１５１８〜２８，２００８；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １６：４７６〜８４，２００７）。この目的のための表３の「設計による分布」とは、以下のような分布を指す。すなわち、６％アラニン、６％アルギニン、３．９％アスパラギン、７．５％アスパラギン酸、２．５％グルタミン酸、１．５％グルタミン、１５％グリシン、２．３％ヒスチジン、２．５％イソロイシン、５％ロイシン、１．５％リシン、２．５％フェニルアラニン、４％プロリン、１０％セリン、４．５％トレオニン、４％トリプトファン、１７．３％チロシン、及び４％バリン。この分布には、メチオニン、システイン、及び終止コドンは含まれていない。
*残基の番号付けは、配列番号１のテンコン配列に基づく。
ＴＣＬ２ライブラリの５'フラグメントは、プロモーター、及びライブラリプール（Ｓｌｏｎｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）として化学合成されたテンコンのコード領域（配列番号１）を含んでいた。このＤＮＡのプールは、少なくとも１×１０11種類の異なるメンバーを含んでいた。フラグメントの末端において、ＲｅｐＡにライゲーションするためのＢｓａＩ制限部位を設計に組み込んだ。
ライブラリの３'フラグメントは、６ｘＨｉｓタグ、ｒｅｐＡ遺伝子のコード領域、及びｃｉｓエレメントを含むディスプレイ用のエレメントを含む一定のＤＮＡ配列であった。ＤＮＡは、既存のＤＮＡテンプレート（上記）及び／又はプライマーＬＳ１００８（配列番号１７）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）を用いてＰＣＲ反応によって調製した。完全なＴＣＬ２ライブラリを構築するため、全体で１μｇのＢｓａＩ消化した５'テンコンライブラリＤＮＡを同じ酵素による制限消化によって調製した３．５μｇの３'フラグメントにライゲーションした。一晩ライゲーションさせた後、ＤＮＡをＱｕｉａｇｅｎカラムにより精製し、２６０ｎｍで吸光度を測定することによりＤＮＡを定量した。このリガンドライブラリ産物を、プライマーペアＰＯＰ２２５０（配列番号１３）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）を用いて１２サイクルのＰＣＲ反応により増幅した。合計で、それぞれが５０ｎｇのライゲーションされたＤＮＡ産物をテンプレートとして含む７２回の反応を行った。ＴＣＬ２の活性ライブラリＤＮＡの全体の収率は、約１００μｇであった。活性ライブラリの少量を上記でＴＣＬ１について述べたようにサブクローニングして配列決定した。重複配列は認められなかった。これらの配列の約８０％が、フレームシフト変異のない完全なプロモーター及びテンコンのコード配列を含んでいた。
ＴＣＬ１４ライブラリの構築
上部（ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧ）及び下部（ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦ）ループ、例えば、ＦＮ３ドメイン内の報告されている結合表面は、ＦＮ３構造の中心を形成するβ鎖によって分離されている。ループのみによって形成される表面とは異なる形状を有するＦＮ３ドメインの２つの「側面」上に存在する別の表面は、２本の逆平行β鎖、Ｃ及びＦβ鎖、並びにＣＤ及びＦＧループによってＦＮ３ドメインの一方の側面に形成され、本明細書ではＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面と呼ぶ。
テンコンの別の表面をランダム化したライブラリを、Ｃ及びＦ鎖の選択された表面露出残基、並びに図１に示されるようなＣＤ及びＦＧル−プの一部をランダム化することによって生成した。テンコン（配列番号１）と比較した場合に以下の置換、すなわちＥ１１Ｒ Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、Ｅ８６Ｉを有するテンコンの変異体であるテンコン２７（配列番号９９）を使用してライブラリを生成した。このライブラリを構築するために使用した方法の詳細な説明は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０２２６８３４号に述べられている。
実施例２：ＥＧＦＲと結合し、ＥＧＦの結合を阻害するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの選択
ライブラリのスクリーニング
ｃｉｓディスプレイを用いて、ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリーからＥＧＦＲ結合ドメインを選択した。ＩｇＧ１ Ｆｃと融合されたＥＧＦＲの組換えヒト細胞外ドメイン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を標準的な方法を用いてビオチン化し、パンニングに使用した（配列番号７３の完全長ＥＧＦＲの残基２５〜６４５）。インビトロ転写及び翻訳（ＩＴＴ）を行うために、２〜６μｇのライブラリＤＮＡを、０．１ｍＭの全アミノ酸、１×Ｓ３０プレミックス成分、及び３０μＬのＳ３０エクストラクト（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、全体量を１００μＬとして３０℃でインキュベートした。１時間後、４５０μＬのブロッキング溶液（２％ウシ血清アルブミン、１００μｇ／ｍＬのニシン精子ＤＮＡ、及び１ｍｇ／ｍＬヘパリンを添加したＰＢＳ（ｐＨ ７．４））を加え、反応物を氷上で１５分間インキュベートした。ブロッキング溶液中で、組換えヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をビオチン化した組換えＥＧＦＲ−Ｆｃと室温で１時間混合することによって、ＥＧＦＲ−Ｆｃ：ＥＧＦ複合体をＥＧＦＲとＥＧＦとのモル比１：１及び１０：１で構築した。結合を行うために、５００μＬのブロックしたＩＴＴ反応液を１００μＬのＥＧＦＲ−Ｆｃ：ＥＧＦ複合体と混合し、室温で１時間インキュベートした後、結合した複合体を磁気ニュートラアビジン又はストレプトアビジンビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎｅ）によって沈降させた。結合しなかったライブラリのメンバーはＰＢＳＴ及びＰＢＳで連続して洗浄して除去した。洗浄後、６５℃に１０分間加熱することによりＤＮＡを結合した複合体から溶離させ、ＰＣＲにより増幅し、更なるパンニングのラウンドを行うために制限消化及びライゲーションによってＲｅｐＡをコードしたＤＮＡフラグメントに付加した。高親和性のバインダーを、各ラウンドにおける標的ＥＧＦＲ−Ｆｃの濃度を２００ｎＭから５０ｎＭに連続的に低下させ、洗浄のストリンジェンシーを上げることによって単離した。ラウンド４及び５では、１０倍モル過剰量の非ビオチン化ＥＧＦＲ−Ｆｃの存在下、ＰＢＳ中で一晩洗浄することによって、結合しなかった又は弱く結合したＦＮ３ドメインを除去した。
パンニングの後、選択したＦＮ３ドメインを、オリゴヌクレオチドＴｃｏｎ５ｎｅｗ２（配列番号１５）及びＴｃｏｎ６（配列番号１６）を用いてＰＣＲにより増幅し、リガーゼ非依存性クローニング部位を含むように改変したｐＥＴベクターにサブクローニングし、標準的な分子生物学の手法を用いてＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞に形質導入して大腸菌内で可溶性発現させた。精製及び検出を可能とするため、Ｃ末端ポリヒスチジンタグをコードする遺伝子配列を各ＦＣ３ドメインに付加した。培養物を３７℃の１ｍＬの９６穴ブロック内で、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを添加した２ＹＴ培地中で０．６〜０．８の光学密度にまで増殖させた後、ＩＰＴＧを１ｍＭまで加え、その時点で温度を３０℃まで下げた。約１６時間後に遠心分離によって細胞を収穫し、−２０℃で凍結させた。各ペレットを、０．６ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴ溶解バッファ（Ｎｏｖａｇｅｎ ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、室温で振盪しながら４５分間インキュベートすることによって、細胞溶解を行った。
細胞上のＥＧＦＲと結合するＦＮ３ドメインの選択
より生理学的な設定でＥＧＦＲと結合する異なるＦＮ３ドメインの能力を評価するために、Ａ４３１細胞と結合するＦＮ３ドメインの能力を測定した。Ａ４３１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、カタログ番号ＣＲＬ−１５５５）は、ＥＧＦＲを細胞１個当たり約２×１０6個の受容体で過剰発現する。細胞を不透明な黒色９６穴プレートに５，０００個／ウェルで播種し、加湿した５％ ＣＯ2雰囲気中、３７℃で一晩付着させた。ＦＮ３ドメインを発現している菌ライセートをＦＡＣＳ染色バッファ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に１，０００倍に希釈し、３重のプレート内で室温で１時間インキュベートした。ライセートを除去し、細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色バッファで３回洗浄した。細胞を５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色バッファに１：１００で希釈した抗ペンタＨｉｓ−Ａｌｅｘａ４８８抗体コンジュゲート（Ｑｉａｇｅｎ）と室温で２０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色バッファで３回洗浄した後、ウェルを１００μＬのＦＡＣＳ染色バッファで満たし、Ａｃｕｍｅｎ ｅＸ３リーダーを使用して４８８ｎｍで蛍光を読み取った。ＦＮ３ドメインを含む菌ライセートを、Ａ４３１細胞と結合する能力についてスクリーニングしたところ（ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリについて１３２０の粗菌ライセート）、５１６の陽性クローンが識別され、結合はバックグラウンドシグナルと比較して１０倍高かった。ＴＣＬ１４ライブラリから得た３００のライセートを結合についてスクリーニングしたところ、ＥＧＦＲに結合する５８個の固有のＦＮ３ドメイン配列が得られた。
細胞上のＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を阻害するＦＮ３ドメインの選択
ＥＧＦＲの結合の機序を更に特徴付けるため、ＥＧＦＲとＥＧＦ競合的に結合する異なる特定されたＦＮ３ドメインのクローンの能力を、Ａ４３１細胞を用いて測定し、Ａ４３１結合アッセイスクリーニングと並行して行った。Ａ４３１細胞を不透明な黒色９６穴プレートに５，０００個／ウェルで播種し、加湿した５％ ＣＯ2雰囲気中、３７℃で一晩付着させた。細胞を３重のプレート内で５０μＬ／ウェルの１：１，０００に希釈した菌ライセートと、室温で１時間インキュベートした。ビオチン化ＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｅ−３４７７）を３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度となるように各ウェルに加え、室温で１０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色バッファで３回洗浄した。細胞を５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色バッファに１：１００で希釈したストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と室温で２０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色バッファで３回洗浄した後、各ウェルを１００μＬのＦＡＣＳ染色バッファで満たし、Ａｃｕｍｅｎ ｅＸ３リーダーを使用して６００ｎｍで蛍光を読み取った。
ＦＮ３ドメインを含む菌ライセートを、上記に述べたＥＧＦ競合アッセイでスクリーニングした。ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリからの１３２０の粗菌ライセートをスクリーニングしたところ、ＥＧＦの結合を５０％以上阻害した４５１の陽性クローンが得られた。
ＥＧＦＲと結合する特定されたＦＮ３ドメインの発現及び精製
Ｈｉｓタグを有するＦＮ３ドメインをＨｉｓ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）ＨＰプレート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により清澄化した大腸菌ライセートから精製し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム、及び２５０ｍＭのイミダゾールを含むｐＨ ７．４のバッファ中に溶出させた。精製された試料を、ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）中に交換し、ＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）Ｇ−２５プレート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析を行った。
サイズ排除クロマトグラフィー分析
サイズ排除クロマトグラフィーを用いてＥＧＦＲと結合するＦＮ３ドメインの凝集状態を測定した。精製した各ＦＮ３ドメインのアリコート（１０μＬ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ５／１５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にＰＢＳ（ｐＨ ７．４）の移動相中で０．３ｍＬ／分の流速で注入した。カラムからの溶出を２８０ｎｍの吸光度でモニターした。ＳＥＣにより高度の凝集を示したＦＮ３ドメインは更なる分析から除外した。
ＥＧＦＲ−Ｆｃからの選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの解離速度
高親和性のバインダーの選択を容易にするために、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ−３６装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で選択したＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインをスクリーニングして、ＥＧＦＲ−Ｆｃとの結合における解離速度（ｋoff）が遅いものを特定した。５μｇ／ｍＬの濃度のヤギ抗ヒトＦｃＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中、３０μＬ／分の流速でチップ上の横方向の６つのリガンドチャネルすべてに、アミンカップリング（ｐＨ ５．０）により直接固定化した。固定化密度の平均は約１５００反応単位（ＲＵ）であり、異なるチャネル間での変動は５％未満であった。ＥＧＦＲ−Ｆｃは、縦リガンド方向に約６００ ＲＵの密度にまで抗ヒトＦｃ−ＩｇＧ表面上に捕捉された。試験したすべてのＦＮ３ドメインを１μＭの濃度に正規化し、水平方向のそれらの結合について試験した。スクリーニングのスループットを最大にするため、６つの分析物チャネルのすべてをＦＮ３ドメインに使用した。解離フェーズを１００μＬ／分の流速で１０分間モニターした。分析物と固定化されたＩｇＧ表面との非特異的結合をモニターするための基準としてスポット間の結合シグナルを用い、すべての結合反応から差し引いた。処理した結合データを１：１の単純なＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに局所的にフィッティングすることによって、捕捉されたＥＧＦＲ−Ｆｃに対する各ＦＮ３ドメインの結合についてｋoffを抽出した。
ＥＧＦにより刺激されるＥＧＦＲリン酸化の阻害
精製されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを、単一の濃度でＡ４３１細胞においてＥＧＦによって刺激されるＥＧＦＲのリン酸化を阻害する能力について試験した。ＥＧＦＲリン酸化は、ＥＧＦＲホスホ（Ｔｙｒ１１７３）キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用してモニターした。細胞を、透明な９６穴の組織培養処理したプレート（Ｎｕｎｃ）に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）とともにＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を含んだ１００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中、２０，０００個／ウェルで播種し、加湿した５％ ＣＯ2雰囲気中、３７℃で一晩付着させた。培地を完全に除去し、細胞を、加湿した５％ ＣＯ2雰囲気中、３７℃でＦＢＳを含まない１００μＬ／ウェルの培地中で一晩飢餓状態においた。次いで、細胞を、加湿した５％ ＣＯ2雰囲気中、３７℃で１時間、濃度２μＭのＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む１００μ／ウェルの予め加温した（３７℃）飢餓培地で処理した。コントロールは飢餓培地のみで処理した。細胞を、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２３６−ＥＧ）を含む１００μ／ウェルの予め加温した（３７℃）飢餓培地を加え、静かに混合することによって刺激し、最終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ及び１μＭのＥＧＦＲ結合ＦＮ３結合ドメインとして、３７℃、５％ ＣＯ2中で１５分間インキュベートした。１組のコントロールウェルは、ネガティブコントロールとして刺激を行わなかった。培地を完全に除去し、細胞を、製造者の指示に従って１００μＬ／ウェルのＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｌｙｓｉｓバッファ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）により、１０分間、室温で振盪しながら溶解した。チロシン１１７３がリン酸化されたＥＧＦＲを測定するように構成されたアッセイプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、製造者の指示に従って、提供されたブロッキング溶液により、室温で１．５〜２時間ブロッキングした。次いで、プレートを２００μＬ／ウェルの１×Ｔｒｉｓ Ｗａｓｈバッファ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で４回洗浄した。細胞ライセートのアリコート（３０μＬ／ウェル）をアッセイプレートに移し、それをプレートシーリングフィルム（ＶＷＲ）で覆い、室温で振盪しながら１時間インキュベートした。アッセイプレートを２００μＬ／２ウェルのＴｒｉｓ Ｗａｓｈバッファで４回洗浄した後、２５μＬの氷冷したＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を気泡が入らないように気をつけながら各ウェルに加えた。プレートを室温で振盪しながら１時間インキュベートした後、２００μＬ／ウェルのＴｒｉｓ Ｗａｓｈバッファで４回洗浄した。１５０μＬ／ウェルのＲｅａｄバッファ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を加え、製造者によりインストールされたアッセイ固有の初期設定値を用いてＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ ６０００装置（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読み取ることによってシグナルを検出した。ＥＧＦにより刺激されたポジティブコントロールのシグナルの阻害率（％）を各ＥＧＦＲ結合ドメインについて計算した。
ＥＧＦにより刺激されるＥＧＦＲのリン酸化の阻害を、ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリから得られた２３２個の特定されたクローンについて測定した。これらのクローンの２２個は、濃度１μＭでＥＧＦＲリン酸化を５０％阻害した。発現量が低いか又はサイズ排除クロマトグラフィーにより多量体であると判断されたクローンを除去した後、９つのクローンで更なる生物学的特性評価を行った。これらのクローンのＢＣ及びＦＧループの配列を表４に示す。９つの選択されたクローンのうち８つが、共通のＦＧループの配列（ＨＮＶＹＫＤＴＮＭＲＧＬ；配列番号９５）を有しており、複数のクローン間でＢＣループの配列に著しく類似した領域が認められた。
実施例３：ＥＧＦ結合を阻害するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの特性評価
大規模発現、精製、及びエンドトキシン除去
より多くの材料を詳しい特性評価に与えるため、表４に示されるＦＮ３ドメインを量産した。各ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン変異体を含む一晩培養物を用いて、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加し、一晩培養物を１／８０の希釈率で希釈した０．８ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス培地を新鮮培地に接種し、３７℃で振盪しながらインキュベートした。６００ｎｍの光学密度が約１．２〜１．５に達した時点でＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭにまで添加することによって培養物を誘導し、温度を３０℃にまで下げた。４時間後、細胞を遠心分離によって回収し、細胞ペレットを必要なときまで−８０℃で保存した。
細胞を溶解するために、解凍したペレットを、２５Ｕ／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１ｋＵ／ｍＬのｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した１ｘＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）に、ペレット１ｇ当たり５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）の比率で再懸濁した。溶解を室温で静かに攪拌しながら１時間進行させた後、４℃で５０分間、５６，０００Ｇで遠心分離した。上清を回収し、０．２μｍのフィルターで濾過し、次いでＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ｓクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｂｕｆｆｅｒ Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）で予め平衡化した５ｍＬのＨｉｓＴｒａＦＦカラムにロードしたカラムをカラム２０個分の体積のＢｕｆｆｅｒ Ａで洗浄し、更にカラム６個分の体積の１６％ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）で洗浄した。ＦＮ３ドメインをカラム１０個分の体積の５０％のＢで溶出し、カラム６個分の体積にわたって５０〜１００％で勾配させたＢを流した。ＦＮ３ドメインタンパク質を含む画分をプールし、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ １０Ｋ ＭＷＣＯ濃縮器を使用して濃縮し、濾過してから、ＰＢＳで予め平衡化したＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。サイズ排除カラムから溶出するタンパク質モノマーのピークを確保した。
ＡｃｔｉＣｌｅａｎ Ｅｔｏｘ樹脂（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）によるバッチアプローチを用いてエンドトキシンを除去した。エンドトキシンの除去に先立って、樹脂を１Ｎ ＮａＯＨで２時間、３７℃で（又は４℃で一晩）前処理し、ｐＨ指示紙で測定したときにｐＨが概ね７で安定するまでＰＢＳでよく洗った。精製されたタンパク質を０．２μｍのフィルターで濾過した後、１ｍＬの樹脂に対して１０ｍＬのタンパク質の比率で１ｍＬのＥｔｏｘ樹脂に加えた。エンドトキシンの樹脂への結合を、静かに回転させながら室温で少なくとも２時間進行させた。５００Ｇで２分間遠心分離して樹脂を除去し、タンパク質上清を確保した。ＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）−ＰＴＳ（商標）カートリッジを使用してエンドトキシンレベルを測定し、ＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）−ＭＣＳリーダー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）で分析した。エンドトキシンレベルが、最初のＥｔｏｘ処理後に５ＥＵ／ｍｇよりも高かった場合、エンドトキシンレベルが×５ＥＵ／ｍｇに低下するまで上記の手順を繰り返した。エンドトキシンレベルが５ＥＵ／ｍｇよりも高く、Ｅｔｏｘによる２回の連続的な処理後に安定化した場合、タンパク質が残留するエンドトキシンを除去するためのアニオン交換又は疎水性相互作用クロマトグラフィー条件が確立されたことになる。
選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＥＧＦＲ−Ｆｃに対する親和性（ＥＧＦＲ−Ｆｃ親和性）の測定
選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの組換えＥＧＦＲ細胞外ドメインに対する結合親和性に関して、Ｐｒｏｔｅｏｎ装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用し、表面プラズモン共鳴法によって更に特性評価を行った。アッセイのセットアップ（チップ調製、ＥＧＦＲ−Ｆｃ捕捉）は、解離速度分析について上記で述べたものと同様であった。選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを、１μＭの濃度で横方向に３倍の連続希釈シリーズで試験した。ベースラインの安定性をモニターするためにバッファ試料も注入した。各ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのすべての濃度における解離フェーズを、１００μＬ／分の流速で３０分間（解離速度スクリーニングからのｋoffが約１０-2ｓ-1のものについて）、又は１時間（ｋoffが約１０-3ｓ-1又はそれよりも遅いものについて）モニターした。２つの参照データのセットを、反応データから差し引いた。すなわち、１）ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと固定化されたＩｇＧ表面との非特異的相互作用について補正するためのスポット間シグナル、及び２）捕捉されたＥＧＦＲ−Ｆｃ表面の経時的な解離によるベースライン変動を補正するためのバッファチャネルシグナル。各ＦＮ３ドメインのすべての濃度における処理された結合データを、１：１の単純なＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに全体的にフィッティングすることによって、動力学（ｋon，ｋoff）及び親和性（ＫD）定数の推定値を抽出した。表５は、コンストラクトのそれぞれについて運動定数を示したものであり、親和性は２００ｐＭ〜９．６ｎＭで変化している。
選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの細胞上のＥＧＦＲとの結合（「Ａ４３１細胞結合アッセイ」）
Ａ４３１細胞を不透明な黒色９６穴プレートに５，０００個／ウェルで播種し、加湿した５％ ＣＯ2雰囲気中、３７℃で一晩付着させた。精製したＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１．５μＭ〜３０μＭ）を３重のプレート中で細胞（５０μＬ中）に１時間、室温で加えた。上清を除去し、細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色バッファで３回洗浄した。細胞を５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色バッファに１：１００で希釈した抗ペンタＨｉｓ−Ａｌｅｘａ４８８抗体コンジュゲート（Ｑｉａｇｅｎ）と室温で２０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色バッファで３回洗浄した後、ウェルを１００μＬのＦＡＣＳ染色バッファで満たし、Ａｃｕｍｅｎ ｅＸ３リーダーを使用して４８８ｎｍで蛍光を読み取った。データをＦＮ３ドメインのモル濃度の対数に対して生の蛍光シグナルとしてプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して変化する傾きを有するＳ字状用量反応曲線にフィッティングしてＥＣ50値を計算した。表５は、２．２ｎＭ〜２０μＭ超の範囲にわたるコンストラクトのそれぞれのＥＣ50を示す。
選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを使用した細胞上のＥＧＦＲへのＥＧＦの結合の阻害（Ａ４３１細胞ＥＧＦ競合アッセイ）
Ａ４３１細胞を不透明な黒色９６穴プレートに５，０００個／ウェルで播種し、加湿した５％ ＣＯ2雰囲気中、３７℃で一晩付着させた。精製したＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１．５μＭ〜３０μＭ）を３重のプレート中で細胞（５０μＬ／ウェル）に１時間、室温で加えた。ビオチン化ＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｅ−３４７７）を各ウェルに３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度となるように加え、室温で１０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色バッファで３回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ染色バッファに１：１００で希釈した５０μＬ／ウェルのストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と室温で２０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色バッファで３回洗浄した後、ウェルを１００μＬのＦＡＣＳ染色バッファで満たし、Ａｃｕｍｅｎ ｅＸ３リーダーを使用して６００ｎｍで蛍光を読み取った。データをＦＮ３ドメインのモル濃度の対数に対して生の蛍光シグナルとしてプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して変化する傾きを有するＳ字状用量反応曲線にフィッティングしてＥＣ50値を計算した。表５は、１．８ｎＭ〜１２１ｎＭの範囲にわたるＩＣ50値を示す。
ＥＧＦにより刺激されるＥＧＦＲリン酸化の阻害（ホスホＥＧＦＲアッセイ）
ＥＧＦにより刺激されるＥＧＦＲリン酸化を顕著に阻害する選択されたＦＮ３ドメインを、阻害のＩＣ50値を測定することによってより完全に評価した。ＥＧＦにより刺激されるＥＧＦＲリン酸化の阻害を、「ＥＧＦにより刺激されるＥＧＦＲリン酸化の阻害」において上述したように、異なるＦＮ３ドメイン濃度（０．５ｎＭ〜１０μＭ）で評価した。データをＦＮ３ドメインのモル濃度の対数に対して電気化学発光シグナルとしてプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、変化する傾きを有するＳ字状用量反応にデータをフィッティングすることによりＩＣ50値を求めた。表５は、１８ｎＭ〜２．５ｎＭ超の範囲にわたるＩＣ50値を示す。
ヒト腫瘍細胞増殖の阻害（ＮＣＩ−Ｈ２９２増殖及びＮＣＩ−Ｈ３２２増殖アッセイ）
ＥＧＦＲ依存型細胞増殖の阻害を、ＥＧＦＲを過剰発現するヒト腫瘍細胞株であるＮＣＩ−Ｈ２９２及びＮＣＩ−Ｈ３２２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、それぞれカタログ番号ＣＲＬ−１８４８及びＣＲＬ−５８０６）の、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインへの曝露後の生存率を測定することによって評価した。細胞を、不透明な白色の９６穴の組織培養処理したプレート（Ｎｕｎｃ）中、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加した、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む１００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に５００細胞／ウェル（ＮＣＩ−Ｈ２９２）又は１，０００細胞／ウェル（ＮＣＩ−Ｈ３２２）で播種し、加湿した５％ ＣＯ2雰囲気中、３７℃で一晩付着させた。細胞を、一定の濃度範囲のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む５μＬ／ウェルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えることにより処理した。コントロールは、５μＬ／ウェルのＰＢＳのみ、又はＰＢＳ中２５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸で処理した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ2で１２０時間インキュベートした。７５μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した後、プレートシェーカー上で２分間混合し、室温で更に１０分間、暗所でインキュベートすることによって生存細胞を検出した。プレートを、ルミネセンスモードに設定したＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、培地のみのブランクに対して０．５秒／ウェルの読み取り時間で読み取った。データを、ＦＮ３ドメインのモル濃度の対数に対するＰＢＳ処理した細胞の増殖率（％）としてプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、変化する傾きを有するＳ字状用量反応の式にデータをフィッティングすることにより、ＩＣ50値を求めた。表５は、それぞれＮＣＩ−Ｈ２９２及びＮＣＩ−Ｈ３２２細胞を使用した場合の５．９ｎＭ〜１．１５μＭ及び９．２ｎＭ〜３．１μＭ超の範囲にわたるＩＣ50値を示す。表５に、各アッセイにおけるＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの生物学的特性の概要を示す。
実施例４：ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの操作
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのサブセットを、各分子のコンフォメーション安定性を高めるように操作した。ＦＮ３ドメインの安定性を高めることが示されている変異Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及びＥ８６Ｉ（米国特許出願第ＵＳ２０１１／０２７４６２３号に述べられる）を、ＤＮＡ合成によってクローンであるＰ５４ＡＲ４−８３、Ｐ５４ＣＲ４−３１、及びＰ５４ＡＲ４−３７に組み込んだ。新たな変異体Ｐ５４ＡＲ５−８３ｖ２、Ｐ５４ＣＲ４３１−ｖ２、及びＰ５４ＡＲ４−３７ｖ２を上述したようにして発現させ、精製した。ＰＢＳ中で示差走査熱量測定を用いて各変異体の安定性を評価することによって、それを対応する親分子の安定性と比較した。表６は、Ｔmの平均の増大が１８．５℃と、各変異体分子が顕著に安定化されたことを示している。
実施例５：ｃ−Ｍｅｔと結合し、ＨＧＦ結合を阻害するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
ヒトｃ−Ｍｅｔのパンニング
ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合することが可能なＦＮ３ドメインを特定するために、ＴＣＬ１４ライブラリを、ビオチン化したヒトｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメイン（ｂｔ−ｃ−Ｍｅｔ）に対してスクリーニングした。選択を行うため、３μｇのＴＣＬ１４ライブラリを、大腸菌Ｓ３０ Ｌｉｎｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州マディソン）中でインビトロ転写及び翻訳（ＩＶＴＴ）し、発現されたライブラリーをＣｉｓブロック（２％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ミズーリ州セントルイス）、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１ｍｇ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））でブロッキングした。選択を行うため、ｂｔ−ｃ−Ｍｅｔを４００ｎＭ（ラウンド１）、２００ｎＭ（ラウンド２及び３）、並びに１００ｎＭ（ラウンド４及び５）の濃度で添加した。ニュートラアビジン磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，イリノイ州ロックフォード）（ラウンド１、３、及び５）又はストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ラウンド２及び４）を使用して、結合したライブラリのメンバーを回収し、ビーズを５００μＬのＰＢＳーＴで５〜１４回洗浄し、続いて５００μＬのＰＢＳで２回洗浄することによって、結合しなかったライブラリのメンバーを除去した。
更なる選択ラウンドを行って親和性が向上したＦＮ３ドメインの分子を特定した。簡単に述べると、ラウンド５からの回収分を上述のように調製し、以下の変更を行って更なる選択のラウンドを繰り返した。すなわち、ｂｔ−ｃ−Ｍｅｔでのインキュベーションを１時間から１５分に短縮し、ビーズ捕捉を２０分から１５分に短縮し、ｂｔーｃ−Ｍｅｔを２５ｎＭ（ラウンド６及び７）又は２．５ｎＭ（ラウンド８及び９）に減少させ、過剰量の非ビオチン化ｃ−Ｍｅｔの存在下で更なる１時間の洗浄を行った。これらの変更の目的は、大幅に低いＫDにつながる、潜在的により速い結合速度及びより遅い解離速度を有するバインダーを同時に選択することである。
ラウンド５、７、９の回収分を、ＴＣＯＮ６（配列番号３０）及びＴＣＯＮ５ Ｅ８６Ｉ短鎖（配列番号３１）プライマーを使用して、リガーゼ非依存性クローニング部位（ｐＥＴ１５４−ＬＩＣ）を含む修飾ｐＥＴ１５ベクター（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ギブスタウン）にＰＣＲによりクローニングし、標準的なプロトコルを用いた形質転換及びＩＰＴＧによる誘導（最終濃度１ｍＭ、３０℃で１６時間）の後、Ｃ末端にＨｉｓ６タグを有するタンパク質としてタンパク質を発現させた。細胞は、遠心分離して収穫した後、０．２ｍｇ／ｍＬのＣｈｉｃｋｅｎ Ｅｇｇ Ｗｈｉｔｅ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加されたＢｕｇｂｕｓｔｅｒ ＨＴ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で溶解させた。遠心分離して細菌溶解物を清澄化し、上清を新しい９６ディープウェルプレートに移した。
ｃ−ＭｅｔへのＨＧＦの結合を阻害するＦＮ３ドメインのスクリーニング
大腸菌ライセート中に存在するＦＮ３ドメインを、生化学的フォーマットで、精製されたｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインへのＨＧＦの結合を阻害する能力についてスクリーニングした。組換えヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃキメラ（ＰＢＳ中、０．５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）を、９６穴Ｗｈｉｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ）にコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＢｉｏｔｅｋプレートウォッシャーで、３００μｌ／ウェルの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で２回洗浄した。アッセイプレートを、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０（２００μＬ／ウェル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，イリノイ州ロックランド）で１時間、室温（ＲＴ）にて振盪しながらブロッキングし、再び３００μｌのＴＢＳ−Ｔで２回洗浄した。ＦＮ３ドメインのライセートをＨａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲｐｌｕｓロボティクスシステムを使用して、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０で（１：１０から１：１００，０００に）希釈した。ライセート（５０μＬ／ウェル）を１時間、室温で振盪しながらアッセイプレート上でインキュベートした。プレートを洗浄せずに、ｂｔ−ＨＧＦ（ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０中、１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル、ビオチン化したもの）をプレートに３０分間、室温で振盪しながら加えた。テンコン２７ライセートが入ったコントロールウェルには、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０又は希釈したｂｔ−ＨＧＦを入れた。次いで、プレートを３００μｌ／ウェルのＴＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＴＢＳ−Ｔ中、１：２０００，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，ペンシルベニア州ウェストグローブ）と３０〜４０分間、室温で振盪しながらインキュベートした。再びプレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。シグナルを発生させるために、製造者の指示に従って調製したＰＯＤ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（５０μＬ／ウェル，ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，インディアナ州インディアナポリス）をプレートに加え、約３分以内にＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを用いてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｍ５で発光を読み取った。以下の計算式により阻害率（％）を求めた：１００−（（ＲＬＵ試料−平均ＲＬＵbt-HGFを加えないコントロール）／（平均ＲＬＵbt-HGFコントロール−平均ＲＬＵbt-HGFを加えないコントロール）×１００）５０％以上の阻害率（％）の値をヒットとみなした。
ＦＮ３ドメインの高スループット発現及び精製
Ｈｉｓタグを有するＦＮ３ドメインを、清澄化した大腸菌ライセートからＨｉｓ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）ＨＰプレート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム、及び２５０ｍＭのイミダゾールを含むｐＨ ７．４のバッファ中に溶出させた。精製された試料をＰＢＳ（ｐＨ ７．４）に交換し、ＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）Ｇ−２５プレート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析を行った。
ｃ−ＭｅｔへのＨＧＦ結合の阻害のＩＣ50の決定
選択されたＦＮ３ドメインについてＨＧＦ競合アッセイで更に特性評価した。上述のアッセイを用いて、精製されたＦＮ３ドメインの用量反応曲線を作成した（５μＭの開始濃度）。阻害率（％）の値を計算した。データをＦＮ３ドメインのモル濃度の対数に対して阻害率（％）としてプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４を使用して、変化する傾きを有するＳ字状用量反応にデータをフィッティングすることによりＩＣ50値を求めた。
ラウンド５から、１：１０の希釈度で活性を示し、０．５〜１５００ｎＭの範囲のＩＣ50値を有する３５個の固有の配列が特定された。ラウンド７からは、１：１００の希釈度で活性を有し、０．１６〜２．９ｎＭの範囲のＩＣ50値を有する３９個の固有の配列が得られた。ラウンド９からは、ヒットが１：１０００の希釈度で活性であると定義された６６個の固有の配列が特定された。ラウンド９では、０．２ｎＭの低いＩＣ50値が認められた（表８）。
ｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃに対する選択されたｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの親和性（ＥＧＦＲ−Ｆｃ親和性）の決定
アッセイにおいてｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃを使用した点以外は、選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの親和性の決定について実施例３で述べたように、選択されたｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの親和性を決定した。
実施例６：ｃ−Ｍｅｔと結合し、ＨＧＦの結合を阻害するＦＮ３ドメインの特性評価
実施例２で上述したようにＦＮ３ドメインを発現させ、精製した。実施例１及び２でそれぞれ上述したようにサイズ排除クロマトグラフィー及び動態解析を行った。表７は、Ｃ鎖、ＣＤループ、Ｆ鎖、及びＦＧループの配列、並びに各ドメインの全アミノ酸配列の配列番号を示す。
Ｃループ残基は、示される配列番号の残基２８〜３７に相当する。
ＣＤ鎖残基は、示される配列番号の残基３８〜４３に相当する。
Ｆループ残基は、示される配列番号の残基６５〜７４に相当する。
ＦＧ鎖残基は、示される配列番号の残基７５〜８１に相当する。
細胞上のｃ−Ｍｅｔへの選択されたｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの結合（「Ｈ４４１細胞結合アッセイ」）
ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞（カタログ番号ＨＴＢ−１７４、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナッサス）を、Ｐｏｌｙ−Ｄ−リシンでコーティングした黒色透明９６穴プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンホセ）に２０，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ ＣＯ2で一晩付着させた。精製したＦＮ３ドメイン（５０μＬ／ウェル、０〜１０００ｎＭ）を細胞に２重のプレート内で１時間、４℃で加えた。上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ染色バッファ（１５０μＬ／ウェル、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５４６５７）で３回洗浄した。細胞を、ビオチン化抗ＨＩＳ抗体（ＦＡＣＳ染色バッファ中に１：１６０で希釈、５０μＬ／ウェル、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＭ０５０）と３０分間、４℃でインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ染色バッファ（１５０μＬ／ウェル）で３回洗浄した後、ウェルを抗マウスＩｇＧ１−Ａｌｅｘａ ４８８接合抗体（ＦＡＣＳ染色バッファ中に１：８０で希釈、５０μＬ／ウェル、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ２１１２１）と３０分間、４℃でインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ染色バッファ（１５０μＬ／ウェル）で３回洗浄し、ＦＡＣＳ染色バッファ（５０μＬ／ウェル）中に放置した。全蛍光を、Ａｃｕｍｅｎ ｅＸ３リーダーを用いて測定した。データをＦＮ３ドメインのモル濃度の対数に対して生の蛍光シグナルとしてプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して変化する傾きを有するＳ字状用量反応曲線にフィッティングしてＥＣ50値を計算した。表８に示されるように、ＦＮ３ドメインは、１．４ｎＭ〜２２．０ｎＭのＥＣ50値を有し、広範囲の結合活性を示すことが分かった。
ＨＧＦにより刺激されるｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害
精製したＦＮ３ドメインを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（メリーランド州ゲイザースバーグ）からのｃ−Ｍｅｔホスホ（Ｔｙｒ１３４９）キットを使用し、ＮＣＩ−Ｈ４４１中で、ＨＧＦにより刺激されるｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害する能力について試験した。細胞を、透明な９６穴の組織培養処理したプレートに、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する１００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ及びＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む）中に２０，０００個／ウェルで播種し、加湿した５％ ＣＯ2雰囲気中、３７℃で、一晩付着させた。培地を完全に除去し、細胞を無血清ＲＰＭＩ培地（１００μＬ／ウェル）中、３７℃、５％ ＣＯ2で一晩飢餓状態においた。この後、細胞に、ＦＮ３ドメインを２０μＭ以下の濃度で含む新鮮な無血清ＲＰＭＩ培地（１００μＬ／ウェル）を３７℃、５％ ＣＯ2で１時間補充した。コントロールは培地のみで処理した。細胞を、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＨＧＦ（１００μＬ／ウェル、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２９４−ＨＧＮ）で刺激し、３７℃、５％ ＣＯ2で１５分間インキュベートした。１組のコントロールウェルは、ネガティブコントロールとして刺激を行わなかった。次いで、培地を完全に除去し、細胞を、製造者の指示に従ってＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｌｙｓｉｓバッファ（５０μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で、１０分間、室温で振盪しながら溶解した。リン酸化されたｃ−Ｍｅｔを測定するように構成されたアッセイプレートを、製造者の指示にしたがって提供されたブロッキング溶液により、室温で１時間ブロッキングした。次いで、プレートをＴｒｉｓ Ｗａｓｈバッファ（２００μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で３回洗浄した。細胞ライセート（３０μＬ／ウェル）をアッセイプレートに移し、室温で振盪しながら１時間インキュベートした。次いで、アッセイプレートをＴｒｉｓＷａｓｈバッファで４回洗浄した後、氷冷したＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２５μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を各ウェルに１時間、室温で振盪しながら加えた。プレートを再びＴｒｉｓＷａｓｈバッファで４回洗い流した。１５０ Ｒｅａｄバッファ（１５０μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を加え、製造者によりインストールされたアッセイ固有の初期設定値を用いてＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ ６０００装置（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読み取ることによって、シグナルを検出した。データをＦＮ３ドメインのモル濃度の対数に対して電気化学発光シグナルとしてプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４を使用して変化する傾きを有するＳ字状用量反応にデータをフィッティングすることによりＩＣ50値を求めた。表８に示されるように、ＦＮ３ドメインは、４．６ｎＭ〜１４１５ｎＭの範囲のＩＣ50値でリン酸化されたｃ−Ｍｅｔを阻害することが示された。
ヒト腫瘍細胞の増殖又は生存の阻害
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインへの曝露後、Ｕ８７−ＭＧ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、カタログ番号ＨＴＢ−１４）の生存率を測定することによって、ｃ−Ｍｅｔ依存性細胞増殖の阻害を評価した。細胞を、不透明な白色９６穴の組織培養処理したプレート（Ｎｕｎｃ）中、１０％ ＦＢＳを添加した１００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ培地中に８０００細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ ＣＯ2で一晩付着させた。播種の２４時間後に培地を吸引し、細胞に無血清ＲＰＭＩ培地を補充した。血清飢餓処理の２４時間後に、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（３０μＬ／ウェル）を含む無血清培地を加えることによって細胞を処理した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ2で７２時間インキュベートした。１００μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた後、プレートシェーカー上で１０分間混合することにより、生存細胞を検出した。プレートを、ルミネセンスモードに設定したＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、０．５秒／ウェルの読み取り時間で読み取った。データをＦＮ３ドメインのモル濃度の対数に対して生のルミネセンス単位（ＲＬＵ）としてプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４を使用して変化する傾きを有するＳ字状用量反応の式にデータをフィッティングすることにより、ＩＣ50値を求めた。表８には、１ｎＭ〜１０００ｎＭ超の範囲のＩＣ５０値が示されている。ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの特性を表８にまとめて示す。
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの熱安定性
ＰＢＳ中で示差走査熱量測定法を用いて各ＦＮ３ドメインの安定性を評価した。実験の結果を表９に示す。
実施例７．二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の生成及び特性評価
二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の生成
実施例１〜６で述べたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの多数の組み合わせを、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの両方と結合することが可能な二重特異性分子として連結した。更に、配列番号１０７〜１１０に示されるアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン及び配列番号１１１〜１１４に示されるアミノ酸配列を有するｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを調製し、二重特異性分子として連結した。以下のフォーマット、すなわち、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインに続いてペプチドリンカー、及びこれに続いてｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、が維持されるように、配列番号５０〜７２及び１０６（表１０）に述べられるアミノ酸配列をコードする合成遺伝子を調製した。精製を助けるために、ポリヒスチジンタグをＣ末端に組み込んだ。表１０に示される分子以外に、２個のＦＮ３ドメインの間のリンカーを、表１１に示されるものにしたがって、長さ、配列の組成、及び構造に基づいて変えた。多くの他のリンカーを、こうしたＦＮ３ドメイン同士を連結するために用い得ることが想定される。ＩＭＡＣ及びゲル濾過クロマトグラフィー工程を用い、一重特異性ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインについて述べたように二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子を発現させ、大腸菌から精製した。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は一重分子単独と比較して効能が高められ、アビディティを示唆している。
ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、９６穴プレート中、１０％ ＦＢＳを含んだＲＰＭＩ培地中に播種した。２４時間後、培地を無血清ＲＰＭＩと交換した。血清飢餓処理の２４時間後、細胞を異なる濃度のＦＮ３ドメインで処理した。すなわち、高親和性の一重特異性ＥＧＦＲ ＦＮ３ドメイン（Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２）、弱親和性の一重特異性ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５）、２つの一重特異性のＥＧＦＲ ＦＮ３ドメインとｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインとの混合物、又は高親和性ＥＧＦＲ ＦＮ３ドメインに連結された低親和性ｃ−ＭｅｔvＦＮ３ドメインからなる二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ１）のいずれかである。細胞を１時間、一重特異性又は二重特異性分子で処理した後、ＥＧＦ、ＨＧＦ、又はＥＧＦとＨＧＦとの組み合わせで１５分間、３７℃、５％ ＣＯ2で刺激した。細胞をＭＳＤ Ｌｙｓｉｓバッファで溶解し、上記に述べたように、製造者の指示に従って適当なＭＳＤアッセイプレートを使用して、細胞シグナル伝達を評価した。
低親和性のｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインは、ＩＣ50＝６１０ｎＭでｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害した（図４）。予想されたように、ＥＧＦＲ ＦＮ３ドメインは、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害することはできず、一重特異性分子の混合物は、ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン単独と同じようであった。しかしながら、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、ＩＣ50＝１ｎＭでｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害し（図４）、ｃ−Ｍｅｔ一重特異性単独の場合に対して効能が対数で２ログ超高められた。
アビディティ効果によりｃ−Ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲリン酸化の阻害を高める二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の能力について、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲの密度及び比率を変えて複数の細胞型において評価を行った（図５）。ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ４４１、又はＮＣＩ−Ｈ５９６細胞を、９６穴プレート中、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中に播種した。２４時間後、培地を無血清ＲＰＭＩと交換した。血清飢餓処理の２４時間後、細胞を異なる濃度の一重特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、一重特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２とＰ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３とからなるＥＣＢ５）のいずれかで処理した。細胞を１時間、一重特異性又は二重特異性分子で処理した後、ＥＧＦ、ＨＧＦ、又はＥＧＦとＨＧＦとの組み合わせで１５分間、３７℃、５％ ＣＯ2で刺激した。細胞をＭＳＤ Ｌｙｓｉｓバッファで溶解し、上記に述べたように、製造者の指示に従って適当なＭＳＤアッセイプレートを使用して、細胞シグナル伝達を評価した。
図５（Ａ〜Ｃ）は、３つの異なる細胞株において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子と比較して一重特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを使用した場合のＥＧＦＲの阻害を示す。ＥＧＦＲリン酸化アッセイでアビディティを評価するために、中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１．９ｎＭ）（Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２）を、高親和性のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと連結された同じＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（０．４ｎＭ）（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３）と比較した。ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＨ５９６細胞では、ＥＧＦＲのリン酸化の阻害は一重特異性分子及び二重特異性分子で同等であった（図５Ａ及び５Ｂ）が、これは、これらの細胞株ではｃ−Ｍｅｔ受容体に対するＥＧＦＲ受容体の比が大きいためと考えられる。この理論を検証するために、ＥＧＦＲよりも多くのｃ−Ｍｅｔ受容体を示すＮＣＩ−Ｈ４４１細胞においてＥＧＦＲリン酸化の阻害の評価を行った。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子でＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を処理したところ、ＥＧＦＲリン酸化の阻害のＩＣ50は、一重特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較して３０倍低下した（図５Ｃ）。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子により効能が高められる可能性について、ＥＧＦＲに対して高い親和性を有し（０．２６ｎＭ）、ｃ−Ｍｅｔに対して中程度の親和性を有する（１０．１ｎＭ）分子を用いたｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイで評価を行った。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞及びＮＣＩ−Ｈ５９６細胞の両方で、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害は、二重特異性分子により、一重特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと比較してそれぞれ１３４倍及び１０１２倍高くなった（図３Ｄ及び３Ｅ）。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子によるＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害効能の増大が、シグナル伝達及び増殖の阻害の増大につながったことが確認された。これらの実験では、ＦＮ３ ＥＧＦＲ結合ドメインとｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとの混合物を、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子と比較した。表１２及び１３に示されるように、ＥＲＫリン酸化（表１２）及びＮＣＩ−Ｈ２９２細胞の増殖（表１３）に対するＩＣ50値は、細胞を二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子で処理した場合に一重特異性バインダーの混合物で処理した場合と比較して低下した。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子のＥＲＫリン酸化の阻害に関するＩＣ50は、２種類の一重特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとの混合物に対して１４３倍低かったが、このことは、このアッセイにおける分子の効能に対するアビディティの効果を示すものである。表１２では、一重特異性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン及びｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは完全には活性を阻害してはおらず、したがって示されているＩＣ50値は下限値とみなすべきである。この増殖アッセイは、異なる組み合わせのＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを、混合物として又は二重特異性フォーマットで連結されたものとして使用して行った。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の増殖の阻害に関するＩＣ50は、一重特異性の親ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの混合物に対して３４〜２３６倍低かった。このことは、受容体のレベルで見られるアビディティ効果（図４及び図５）が、細胞シグナル伝達（表１２）及び細胞増殖（表１３）の阻害の向上につながることを裏付けるものであった。
インビボ腫瘍異種移植：ＰＫ／ＰＤ
インビボでの一重特異性及び二重特異性ＦＮ３ドメイン分子の有効性を調べるため、ヒトＨＧＦを分泌するように腫瘍細胞を操作した（マウスＨＧＦはヒトｃ−Ｍｅｔに結合しない）。レンチウイルス感染（ヒトＨＧＦを発現するレンチウイルスＤＮＡベクター（アクセッション番号Ｘ１６３２２）及びＧｅｎｅｃｏｐｏｅｉａからのレンチウイルスパッケージングキット）を利用して、ヒトＨＧＦをＮＣＩ−Ｈ２９２細胞内で安定的に発現させた。感染後、ＨＧＦ発現細胞を４μｇ／ｍＬプロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で選択した。ヒトＨＧＦタンパク質を、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙからのアッセイプレートを用いて、プールした細胞の馴化培地中で検出した。
ヒトＨＧＦを発現しているＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（Ｃｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）中、２．０×１０6細胞を体積２００μＬ）を各ＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスの背部脇腹に皮下接種した。腫瘍体積が１５０〜２５０ｍｍ3の範囲となるまで腫瘍を週２回測定した。次いで、マウスに、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（半減期を延ばすためにアルブミン結合ドメインと連結したもの）及びＰＢＳ溶媒を単回腹腔内投与した。投与６時間又は７２時間後に腫瘍を摘出し、直ちに液体窒素中で凍結した。心穿刺により、３．８％クエン酸塩を含むプロテアーゼ阻害剤中に血液試料を採取した。採取直後に血液試料を遠心分離し、得られた血漿を試料チューブに移して−８０℃で保存した。腫瘍を秤量し、細片に切断し、ＲＩＰＡバッファと、ＨＡＬＴプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ）、５０ｍＭフッ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ活性化オルトバナジウム酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、及び１ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）と、を含有するＬｙｓｉｎｇ ＭａｔｒｉｘＡチューブ（ＬＭＡ）中で溶解した。ＬＭＡマトリクスからライセートを除去し、遠心して不溶性タンパク質を除去した。可溶性の腫瘍タンパク質をＢＣＡタンパク質アッセイによって定量し、腫瘍溶解バッファ中に同じタンパク質濃度となるように希釈した。リン酸化されたｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＥＲＫを、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙからのアッセイプレートを用いて測定した（製造者のプロトコルに従い、上記に述べたのと同様にして）。
図６に、実験結果を示す。各二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、リン酸化されたｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＥＲＫの濃度を６時間後及び７２時間後の両方において大幅に低減させた。図６に示されるデータは、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲの両方を同時に阻害することの重要性、並びに各受容体に対する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の親和性が下流のＥＲＫの阻害にどのような役割を果たしているかを示している。高親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（図中、「８」として示されるＰ５４ＡＲ４−８３ｖ２、ＫD＝０．２６ｎＭ）を含む分子は、中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（図中、「１７」として示されるＰ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２、ＫD＝１．９ｎＭ）を含む分子と比較して、６時間後、及び７２時間後の両方で、ＥＧＦＲのリン酸化を大きく阻害した。試験した４つの二重特異性分子はいずれも、親和性と関係なく、６時間後の時点でＥＲＫのリン酸化を完全に阻害した。７２時間後の時点では、強い親和性のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（図中、「Ａ３」として示されるＰ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３、ＫD＝０．４ｎＭ）を含む分子は、中程度の親和性のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（図中、「Ａ５」として示されるＰ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５、ＫD＝１０．１ｎＭ、図６）と比較してＥＲＫのリン酸化を大幅に阻害した。
各二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の濃度を、血液中及び腫瘍中に投与した６時間後及び７２時間後に測定した（図７）。興味深い点として、中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ドメイン（Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２、ＫD＝１．９ｎＭ）と高親和性のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３、ＫD＝０．４ｎＭ）を有する二重特異性分子は、他の分子と比較して６時間後に顕著に多くの腫瘍への蓄積が見られたが、その差は７２時間後までには減少した。腫瘍の外側の細胞はＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの両方の表面発現レベルが低いために、中程度の親和性のＥＧＦＲ分子は、より親和性が高いＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較して正常組織にそれほど強く結合しないものと仮説することができる。したがって、腫瘍内では、結合することが可能なより多くの遊離した中親和度のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインが存在する。したがって、各受容体に対する適切な親和性を特定することによって、全身毒性が低く、腫瘍への蓄積性が高い治療薬を特定することが可能となり得る。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子による腫瘍有効性試験
ヒトＨＧＦを発現しているＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（Ｃｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）中、２．０×１０6細胞を２００μＬ）を各ＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスの背部脇腹に皮下接種した。移植の１週間後、マウスを同等の腫瘍体積を有する群に分類した（平均腫瘍体積＝７７．９＋／−１．７ｍｍ3）。マウスに週３回、二重特異性分子を投与し、腫瘍体積を週２回記録した。腫瘍増殖の阻害（ＴＧＩ）が、４つの異なる二重特異性分子で認められ、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲに対する異なる親和性を示した。図８は、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインが中親和性である場合、高親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む分子で処理したマウスにおいて、中親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較して、腫瘍増殖の遅れとしてのｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲの両方の阻害の効果が認められたことを示している（白抜きの三角形と塗りつぶしの三角形；Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５とＰ５３Ａ１Ｒ５−１７−Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５との比較）。更に、このデータは、高親和性又は中親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのいずれかを含む二重特異性分子として高親和性のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを有することの重要性を示しているが、高親和性のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは最も高い有効性を示した（破線の灰色及び黒い線；Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３と、Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２−Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３）。
二重特異性分子及び他のＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ阻害剤の有効性
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ３８）並びにそれぞれ単一の薬剤として、小分子阻害剤であるクリゾチニブ（ｃ−Ｍｅｔ阻害剤）及びエルロチニブ（ＥＧＦＲ阻害剤）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）、並びにクリゾチニブとエルロチニブの組み合わせのインビボでの治療上の有効性を、ＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅマウスにおける皮下Ｈ２９２−ＨＧＦヒト肺癌異種移植モデルの処置において評価した。
Ｈ２９２−ＨＧＦ細胞を、ウシ胎児血清（１０％ ｖ／ｖ）及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃、空気中５％ ＣＯ2の雰囲気中、インビトロで維持した。細胞をトリプシンーＥＤＴＡ処理によって週２回、定期的に継代培養した。指数増殖期に増殖する細胞を収穫し、腫瘍接種用にカウントした。
各マウスの右脇腹領域に、Ｃｕｌｔｒｅｘ（１：１）を加えた０．１ｍｌのＰＢＳ中でＨ２９２ーＨＧＦ腫瘍細胞（２×１０6）を皮下接種して腫瘍を発生させた。平均腫瘍サイズが１３９ｍｍ3に達した時点で処置を開始した。各試験群の被験物質投与及び動物の数を以下の実験計画表に示す。腫瘍細胞の接種日を０日目として示した。表１４に、処置群を示す。
Ｎ＝動物数、ｐ．ｏ．＝経口投与、ｉ．ｐ．＝腹腔内注射３回／週、週の１、３、及び５日目に投与した。
ＱＤ＝１日１回、Ｑ４ｄ＝４日に１回、クリゾチニブとエルロチニブの組み合わせの間隔は０．５時間、投与体積は体重に基づいて調整（１０ｌ／ｇ）、ａ＝グループ分け後１４日目に投与を行わなかった。
処置の開始に先立って、全動物の体重を測定し、腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は与えられる任意の処置の効果に影響し得ることから、マウスを腫瘍体積に基づいてランダム化ブロック計画を用いて各群に割り振った。これにより、すべての群をベースラインで比較することが確実となる。ランダム化ブロック計画を用いて実験動物を各群に割り振った。最初に、実験動物を初期の腫瘍体積に基づいて一様なブロックに分けた。次に、各ブロック内で、処置に対する実験動物のランダム化を行った。ランダム化ブロック計画を用いて実験動物を割り振ることで、各動物がある所定の処置に割り振られる確率が同じとなり、したがって系統誤差が低減される。
定期的なモニタリングの時点において、運動性などの正常行動、食餌及び水の消費量の目視による推定、体重増加／減少（体重は週２回測定した）、目／体毛のつやに対する腫瘍増殖及び処置のあらゆる影響、並びにその他の任意の異常な影響について動物を調べた。
エンドポイントは、腫瘍増殖を遅らすことができるか、又は腫瘍を有するマウスを治癒することができるかとした。腫瘍サイズを週２回、キャリパーを使用して２次元で測定し、体積を式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ2（ただし、ａ及びｂはそれぞれ腫瘍の長径及び短径である）を用いてｍｍ3で表した。次いで、腫瘍サイズを用いてＴ−Ｃ及びＴ／Ｃ値を計算した。Ｔ−Ｃは、Ｔを処置群の平均腫瘍サイズが１０００ｍｍ3に達するのに要した時間（日）とし、Ｃをコントロール群の平均腫瘍サイズがそれと同じサイズに達するのに要した時間（日）として計算した。Ｔ／Ｃ値（％）は抗腫瘍効果の指標であり、Ｔ及びＣはそれぞれ、任意の日における処置群及びコントロール群の平均腫瘍体積とした。完全腫瘍縮小（ＣＲ）は、腫瘍が触診限界（６２．５ｍｍ3）未満にまで縮小することとして定義される。部分腫瘍縮小（ＰＲ）は、腫瘍が初期腫瘍体積から縮小することとして定義される。ＣＰ又はＰＲが恒久的とみなされるためには、３回以上の連続した腫瘍測定においてＣＲ又はＰＲが最低限持続することが必要とされる。
体重減少が２０％を上回るか、又はその群の平均腫瘍サイズが２０００ｍｍ3を上回った動物は安楽死させた。最終投与後、２週間観察した後、試験を終了した。
各時点における各群の腫瘍体積について得られた、平均値及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を含む要約統計量を、表１５に示す。一元配置分散分析に続いてＧａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌ検定（等分散性を仮定しない）を用いた個々の比較を行って、各群間の腫瘍体積の差の統計的分析を評価した。データはすべて、ＳＰＳＳ １８．０を用いて分析した。ｐ<０．０５を統計的に有意とみなした。
溶媒処置群（グループ１）の平均腫瘍サイズは、腫瘍接種後２３日目に１，７５８ｍｍ3に達した。２５ｍｇ／ｋｇ用量レベルの二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子による処置（グループ２）は、すべてのマウスで、連続した３回以上の腫瘍測定において恒久的な完全な腫瘍縮小（ＣＲ）につながった（平均ＴＶ＝２３ｍｍ3，Ｔ／Ｃ値＝１％、２３日目の溶媒群と比較してｐ＝０．００４）。
５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルの単一薬剤としてのクリゾチニブによる処置（グループ３）は抗腫瘍活性を示さず、平均腫瘍サイズは２３日目で２，１０２ｍｍ3であった（Ｔ／Ｃ値＝１２０％、溶媒群と比較した場合のｐ＝０．９４４）。
５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルの単一薬剤としてのエルロチニブによる処置（グループ４）は軽度の抗腫瘍活性を示したが、溶媒群と比較して有意な差は見られなかった。平均腫瘍サイズは２３日目で１，１２２ｍｍ3であり（Ｔ／Ｃ値＝６４％、溶媒群と比較した場合のｐ＝０．４２９）、溶媒群と比較して１，０００ｍｍ3の腫瘍サイズでの腫瘍増殖の遅れは４日であった。
クリゾチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ、グループ５）とエルロチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ、グループ５）の組み合わせは顕著な抗腫瘍活性を示し、平均腫瘍サイズは２３日目で２６５ｍｍ3であり（Ｔ／Ｃ＝１５％；ｐ＝０．００８）、溶媒群と比較して１，０００ｍｍ3の腫瘍サイズでの腫瘍増殖の遅れは１７日であった。
単一薬剤としての１ｍｇ／マウスの用量レベルのセツキシマブ（グループ６）は顕著な抗腫瘍活性を示し、平均腫瘍サイズは２３日目で４８５ｍｍ3であり（Ｔ／Ｃ＝２８％、ｐ＝０．０１８）、溶媒群と比較して１，０００ｍｍ3の腫瘍サイズでの腫瘍増殖の遅れは１７日であった。図１５及び１６に、様々な治療の抗腫瘍活性を示す。
溶媒群では中度から重度の体重減少が認められたが、これは腫瘍の負荷の増大によるものである可能性がある。２３日目までに体重減少（ＢＷＬ）が２０％を上回った時点でマウス３匹が死亡し、マウス１匹を安楽死させた。グループ２では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子のわずかな毒性が認められた。処置期間中にＢＷＬが２０％を上回った時点でマウス３匹を安楽死させた。２週間の観察期間において処置をやめた時点で体重は徐々に回復した。溶媒群と比較してより重度の体重減少がクリゾチニブ又はエルロチニブによる単一薬剤治療群で認められ、処置に関連した毒性であることが示唆された。クリゾチニブとエルロチニブの組み合わせに対しては、投与段階中に概して耐性があったが、重度の体重損失が試験の終了時に認められ、これは、非処置期間における速い腫瘍増殖の回復によるものである可能性がある。セツキシマブの単一薬剤療法に関しては試験で十分に耐性があり、腫瘍増殖の回復による体重損失は、試験の終了時にのみ認められた。
要約すると、２５ｍｇ／ｋｇの二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（３回／週×３週間）によって、ＳＣＩＤ／ＢｅｉｇｅマウスのＨ２９２−ＨＧＦヒト肺癌異種移植モデルにおいて完全な応答が生じた。この処置は１０匹のマウスのうちの７匹で耐性があり、１０匹のマウスのうちの３匹で重度の体重損失を生じた。図９は、処置後の各時点における腫瘍サイズに対する様々な治療の影響を示している。
実施例８：二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の半減期の延長
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は他のポリマーによる修飾、アルブミンとの結合、アルブミン又は他の血清タンパク質と結合するタンパク質ドメインとの融合、アルブミンとの遺伝子融合、ＩｇＧ Ｆｃドメインとの融合、及び長鎖の非構造化アミノ酸配列との融合などの、腎臓での濾過を低減させ、それによりタンパク質の血清半減期を延ばすための多くの方法がこれまでに述べられてきた。
分子のＣ末端に遊離システインを組み込むことによって流体力学的半径を増大させるために、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子をＰＥＧにより修飾した。最も一般的には、システイン残基の遊離チオール基を用いて、標準的な方法によってマレイミド又はヨードアセトアミド基で官能化されたＰＥＧ分子を結合する。１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、又は４０，０００ｋＤａの直鎖状ＰＥＧなどの異なる形態のＰＥＧを用いてタンパク質を修飾することができる。これらの分子量の分枝したＰＥＧ分子を修飾に用いることもできる。場合によっては、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子内の一級アミンによってＰＥＧ基を結合させることもできる。
ＰＥＧ化以外に、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の半減期を、これらのタンパク質を、天然に存在する３重らせん結束血清アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）又はコンセンサスアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤＣｏｎ）との融合分子として生成することにより延長した。これらのタンパク質ドメインを、表１２に示されるリンカーのいずれかによってｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインのＣ末端に連結した。ＡＢＤ又はＡＢＤＣｏｎドメインは、一次配列中でＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとの間に配置することもできる。
実施例９：選択された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の特性評価
選択された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子を、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの両方に対する親和性、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの自己リン酸化を阻害する能力、並びにＨＧＦ細胞の増殖に対する影響について特性評価した。組換えＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインに対する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の結合親和性を、実施例３に記載のプロトコルにしたがってＰｒｏｔｅｏｎ装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用して表面プラズモン共鳴法によって更に評価した。特性評価の結果を表１７に示す。
実施例１０二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の生成
複数の一重特異性ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ抗体を、そのＦｃ領域にＦｃ置換Ｋ４０９Ｒ又はＦ４０５Ｌ（番号付けはＥＵインデックスに基づく）を有するＩｇＧ１−κとして発現させた。一重特異性抗体は、一方の細胞株が、フコシル化能力が低下しているために抗体の多糖鎖のフコース含量が１〜１５％であるような抗体を生じる２つのＣＨＯ細胞株で発現させた。
一重特異性抗体は、ＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム）を使用し、標準的な方法により精製した。溶出後、プールをＤ−ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）中に透析した。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を、インビトロＦａｂアーム交換（国際特許公開第ＷＯ２０１１／１３１７４６号に記載）で一重特異性ＥＧＦＲ ｍＡｂと一重特異性ｃ−Ｍｅｔ ｍＡｂを組み合わせることによって生成した。簡単に述べると、ＰＢＳ（ｐＨ ７〜７．４）及び７５ｍＭの２−メルカプトエタノールアミン（２−ＭＥＡ）中、約１〜２０ｍｇ／ｍｌの各抗体を１：１のモル比で互いに混合し、２５〜３７℃で２〜６時間インキュベートした後、標準的な方法により、２−ＭＥＡを透析、ダイアフィルトレーション、タンジェンシャルフロー濾過、及び／又はスピンセルフィルトレーション（spinned cell filtration）により除去した。
複数の一重特異性抗ＥＧＦＲ抗体及び抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を、マトリクス中でインビトロＦａｂアーム交換で組み合わせることによって二重特異性抗体を生成し、これを後で更に特性評価した。生成された二重特異性抗体を、以下のようなアッセイを用いた４ステップの方法を用いてランク付けした。すなわち、ステップ１：ＦＡＣＳアッセイでのＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ１９７５及びＡ５４９細胞との結合。ステップ２：Ａ５４９細胞におけるｐＭｅｔリン酸化の阻害。ステップ３：ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＫＰ４及びＮＣＩ−Ｈ４４１細胞における増殖の阻害。ステップ４：Ａ５４９及びＳＮＵ−５細胞におけるＥＧＦＲリン酸化の阻害。注目すべき点として、親抗体の特性は二重特異性抗体で保存されていなかった。例えば、二重特異性抗体に特定のＥＧＦＲ結合アームが存在することで、ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害の消失若しくは低下、又は亢進につながった。これらの特性評価試験に基づき、選択ペアを選択した。
配列番号１８９のＶＨ及び配列番号１９０のＶＬを有する抗ＥＧＦＲ抗体２Ｆ８のＶＨ及びＶＬ領域（抗体２Ｆ８については国際特許公開第ＷＯ２００２／１００３４８号に述べられている）と、Ｋ４０９Ｒ置換を有するＩｇＧ１定常領域とを含む一重特異性二価抗ＥＧＦＲ抗体Ｅ１−Ｋ４０９Ｒを生成した。
配列番号１８９のＶＨ及び配列番号１９０のＶＬを有する抗ＥＧＦＲ抗体２Ｆ８のＶＨ及びＶＬ領域（抗体２Ｆ８については国際特許公開第ＷＯ２００２／１００３４８号に述べられている）と、Ｆ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域とを含む一重特異性二価抗ＥＧＦＲ抗体Ｅ１−Ｆ４０５Ｌを生成した。
配列番号１９１のＶＨ及び配列番号１９２のＶＬを有する抗ＥＧＦＲ抗体０１８のＶＨ及びＶＬ領域（抗体０１８については国際特許公開第ＷＯ２００９／０３０２３９号に述べられている）と、Ｋ４０９Ｒ置換を有するＩｇＧ１定常領域とを含む一重特異性二価抗ＥＧＦＲ抗体Ｅ２−Ｋ４０９Ｒを生成した。
配列番号１９１のＶＨ及び配列番号１９２のＶＬを有する抗ＥＧＦＲ抗体０１８のＶＨ及びＶＬ領域（抗体０１８については国際特許公開第ＷＯ２００９／０３０２３９号に述べられている）と、Ｆ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域とを含む一重特異性二価抗ＥＧＦＲ抗体Ｅ２−Ｆ４０５Ｌを生成した。
配列番号１９３のＶＨ及び配列番号１９４のＶＬを有する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体０６９のＶＨ及びＶＬ領域（抗体０６９については国際特許公開第ＷＯ２０１１／１１０６４２号に述べられている）と、Ｋ４０９Ｒ置換を有するＩｇＧ１定常領域とを含む一重特異性二価抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｍ１−Ｋ４０９Ｒを生成した。
配列番号１９３のＶＨ及び配列番号１９４のＶＬを有する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体０６９のＶＨ及びＶＬ領域（抗体０６９については国際特許公開第ＷＯ２０１１／１１０６４２号に述べられている）と、Ｆ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域とを含む一重特異性二価抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｍ１−Ｆ４０５Ｌを生成した。
配列番号１９５のＶＨ及び配列番号１９６のＶＬを有する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体０５８のＶＨ及びＶＬ領域（抗体０５８については国際特許公開第ＷＯ２０１１／１１０６４２号に述べられている）と、Ｋ４０９Ｒ置換を有するＩｇＧ１定常領域とを含む一重特異性抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｍ２−Ｋ４０９Ｒを生成した。
配列番号１９５のＶＨ及び配列番号１９６のＶＬを有する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体０５８のＶＨ及びＶＬ領域（抗体０５８については国際特許公開第ＷＯ２０１１／１１０６４２号に述べられている）と、Ｆ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域とを含む一重特異性抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｍ２−Ｆ４０５Ｌを生成した。
これらの抗体のＶＨ、ＶＬ、ＨＣ及びＬＣ配列を以下に示す。
配列番号１８９ ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｅ１ ＶＨ
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＤＤＧＳＹＫＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＩＴＭＶＲＧＶＭＫＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１９０ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｅ１ ＶＬ
ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＳＡＬＶＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＥＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１９１ ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｅ２ ＶＨ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ ＳＹＷＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮ ＩＫＫＤＧＳＥＫＹＹ ＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬ ＧＷＧＷＧＷＹＦＤＬ ＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１９２ ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｅ２ ＶＬ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴ ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ ＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳ ＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰ ＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤ ＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰ ＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱ ＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１９３ ｃＭｅｔ ｍＡｂ Ｍ１ ＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＥＴＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＨＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＹＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＲＧＴＮＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１９４ ｃＭｅｔ ｍＡｂ Ｍ１ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＷＬＡＷＦＱＨＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＬＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＳＦＰ−ＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ
配列番号１９５ ｃＭｅｔ ｍＡｂ Ｍ２ ＶＨ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＤＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＥＧＬＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮＱＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１９６ ｃＭｅｔ ｍＡｂ Ｍ２ ＶＬ
ＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＬＳＳＡＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＴＳＹＰＱＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ
配列番号１９９ＥＭ１−ｍＡｂ Ｈ１（抗ＥＧＦＲ，４０５Ｌ）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＤＤＧＳＹＫＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＩＴＭＶＲＧＶＭＫＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２００ＥＭ−１ ｍＡｂ Ｌ１
ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＳＡＬＶＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＥＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２０１ ＥＭ−１ ｍＡｂ Ｈ２（Ｋ４０９Ｒ，抗ｃＭｅｔ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＥＴＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＨＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＹＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＲＧＴＮＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２０２ ＥＭ−１ ｍＡｂ Ｌ２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＷＬＡＷＦＱＨＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＬＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＳＦＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２３４ Ｅ２ ｍＡｂ ＨＣ１（ＥＧＦＲ−Ｆ４０５Ｌ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ ＳＹＷＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮ ＩＫＫＤＧＳＥＫＹＹ ＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬ ＧＷＧＷＧＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２３５Ｅ２ ｍＡｂ ＬＣ１（ＥＧＦＲ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴ ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ ＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳ ＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰ ＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤ ＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰ ＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱ ＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２３６ Ｅ２ ｍＡｂ ＨＣ２（ｃ−Ｍｅｔ−Ｋ４０９Ｒ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＤＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＥＧＬＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮＱＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２３７
Ｅ２ ｍＡｂ ＬＣ２（ｃＭｅｔ）
ＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＬＳＳＡＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＴＳＹＰＱＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
生成された一重特異性抗ＥＧＦＲ抗体とｃ−Ｍｅｔ抗体とを混合してマトリクス中でインビトロＦａｂアーム交換に供し、異なるアッセイで特性評価を行った。二重特異性抗体ＥＭ１−ｍＡｂは、ｍＡｂ Ｅ１−Ｆ４０５ＬのＥＧＦＲ結合アームと、ｍＡｂ Ｍ１−Ｋ４０９Ｒのｃ−Ｍｅｔ結合アームを含む。二重特異性抗体ＥＭ２−ｍＡｂは、ｍＡｂ Ｅ２−Ｆ４０５ＬのＥＧＦＲ結合アームと、ｍＡｂ Ｍ２−Ｋ４０９Ｒのｃ−Ｍｅｔ結合アームを含む。二重特異性抗体ＥＭ３−ｍＡｂは、ｍＡｂ Ｅ１−Ｋ４０９ＲのＥＧＦＲ結合アームと、ｍＡｂ Ｍ１−Ｆ４０５Ｌのｃ−Ｍｅｔ結合アームを含む。二重特異性抗体ＥＭ４−ｍＡｂは、ｍＡｂ Ｅ２−Ｋ４０９ＲのＥＧＦＲ結合アームと、ｍＡｂ Ｍ２−Ｆ４０５Ｌのｃ−Ｍｅｔ結合アームを含む。ＥＭ１−ｍＡｂ及びＥＭ３−ｍＡｂは、同等の特性を有していた。
二重特異性ＥＭ１−ｍＡｂを、糖タンパク質のフコシル化能力が低下しているためにフコシル含量が約１〜１５％であるようなＣＨＯ細胞株中で培養した。Ｆｃ領域に結合された二分枝複合体型のオリゴ糖からコアとなるフコースを除去すると、抗原結合性又はＣＤＣ活性を変化させることなく、高められたＦｃγＲＩＩＩａの結合力により抗体のＡＤＣＣが大幅に増強される。このようなｍＡｂは、二分枝複合体型Ｆｃオリゴ糖を有する比較的高度に脱フコシル化された治療用抗体の効果的な発現につながることが報告されている異なる方法を用いて得ることが可能であり、上記に述べたもので上述してある。
実施例１１二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の精製
インビトロＦａｂアーム交換の後で、標準的な方法により疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて二重特異性ＥＭ１−ｍＡｂを更に精製することによって、残留する親のｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲ抗体を最小限にした。
実施例１２二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の特性評価
ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ二重特異性抗体ＥＭ１−ｍＡｂを、ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化、ＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化、ＥＲＫ１／２リン酸化、ＡＫＴリン酸化、リガンド結合の阻害、及び細胞生存率を含むその特性について異なるアッセイで試験した。ＥＭ１−ｍＡｂの特性を、コントロールとしての一価のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ結合抗体、並びにエルロチニブ（ＣＡＳ １８３３２１−７４−６；チロシンキナーゼ阻害剤）及びセツキシマブ（ＣＡＳ ２０５９２３−５６−４）などの既知のＥＧＦＲ阻害剤と比較した。
ＥＭ１−ｍＡｂ抗体の親抗体は二価であることから、コントロールの一価のＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ抗体は、二重特異性ＥＭ１−ｍＡｂの相乗効果及びアビディティを、対応するコントロール一価分子の混合物と対比して正確に比較するために、無関係／関連性のない抗原と結合するＦａｂアームと組み合わされた二重特異性フォーマットで生成した。
コントロールの一価のＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ抗体を生成するため、配列番号１９８の重鎖と配列番号２０９の軽鎖を含む一重特異性抗ＨＩＶ ｇｐ１２０抗体ｇｐ１２０−Ｋ４０９Ｒを生成した。配列番号１９７の重鎖と配列番号２０９の軽鎖を含む一重特異性抗ＨＩＶ ｇｐ１２０抗体ｇｐ１２０−Ｋ４０９Ｌを生成した。
コントロールの一価の抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｅ１−Ｆ４０５Ｌ−ｇｐ１２０−Ｋ４０９Ｒを、Ｅ１−Ｆ４０５Ｌとｇｐ１２０−Ｋ４０９Ｒとの間のインビトロＦａｂアーム交換によって生成し、コントロールの一価の抗−ｃＭｅｔ ｍＡｂ Ｍ１−Ｋ４０９Ｒ−ｇｐ１２０−Ｆ４０５Ｌを、Ｍ１−Ｋ４０９Ｒとｇｐ１２０−Ｆ４０５Ｌとの間のインビトロＦａｂアーム交換によって生成して、上記に述べたようにして精製した。
以下の細胞株を、二重特異性抗体の特性評価に用いた。すなわち、ＮＣＩ−Ｈ２９２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、カタログ番号ＣＲＬ−１８４８）、ＮＣＩ−Ｈ１９７５（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−５９０８）、ＳＫＭＥＳ−１（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−５８）、Ａ４３１（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１５５５）、ＮＣＩ−Ｈ４４１（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−１７４）、ＮＣＩ−Ｈ３２５５（ＤＣＴＤ ｔｕｍｏｒ／ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，ＮＣＩ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＮＣＩ−Ｎａｖｙ Ｍｅｄｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｓｕｐｐｌ ２４，１９９６；Ｔｒａｃｙ Ｓ．ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４：７２４１〜４，２００４；Ｓｈｉｍａｍｕｒａ Ｔ．ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５：６４０１〜８，２００５）及びＨＣＣ−８２７（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２８６８）。ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＳＫＭＥＳ−１細胞は、野生型ＥＧＦＲ及び野生型ｃ−Ｍｅｔの両方を発現する。ＮＣＩ−３２５５は変異体Ｌ８５８Ｒ ＥＧＦＲを発現し、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの増幅を示す。Ｈ１９７５は、変異体Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ及び野生型ｃ−Ｍｅｔを発現する。ＨＣＣ−８２７は、Δ（Ｅ７４６，Ａ７５０）ＥＧＦＲを発現し、ＥＧＦＲの増幅を示す。細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ９７５、ＮＣＩ−Ｈ４４１及びＮＣＩ−Ｈ３２５５は、本明細書ではそれぞれ互換可能にＨ２９２、Ｈ９７５、Ｈ４４１及びＨ３２５５と呼ばれる。
細胞上のＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに対する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の結合（Ａ４３１細胞結合アッセイ）
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体ＥＭ１−ｍＡｂを、実施例３（Ａ４３１細胞結合アッセイ）及び実施例６（Ｈ４４１細胞結合アッセイ）で述べたプロトコルを用いて細胞上のＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔとの結合について試験した。セツキシマブ及びＥＧＦＲに対して一価のコントロール抗体Ｅ１−Ｆ４０５Ｌ−ｇｐ１２０−Ｋ４０９Ｒを、Ａ４３１細胞におけるコントロールとして用いた。セツキシマブのＥＣ50値は、５．０ｎＭであった。表１８に、結合のＥＣ50値を示す。ＥＭ１−ｍＡｂは、二価一重特異性の親コントロール抗体と比較した場合、１．９倍（Ａ４３１細胞）及び２．３倍（Ｈ４４１細胞）の結合力の低下を示した。セツキシマブは、二価の親コントロール抗体と同等であった。ＥＭ１−ｍＡｂは、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの一価の結合のために、親ｍＡｂの値よりも高いＥＣ50の結合値を示している。ＥＭ１−ｍＡｂは、単一のアームのＥ１／不活性アーム及びＥ２／不活性アームの二重特異性一価ｍＡｂと同様の結合のＥＣ50値を有している。
受容体へのリガンド結合の阻害
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、二重特異性抗体を、ＥＧＦＲ細胞外ドメインに対するＥＧＦの結合及びｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインに対するＨＧＦの結合をブロックする能力について試験した。組換えヒトＥＧＦ Ｒ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号３４４−ＥＲ−０５０）又はヒトＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号２９４−ＨＧＮ−０２５／ＣＦ）をＭＳＤ ＨｉｇｈＢｉｎｄプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、メリーランド州ゲイザースバーグ）に室温で２時間コーティングした。ＭＳＤ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａバッファ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、メリーランド州ゲイザースバーグ）を各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを０．１Ｍ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ ７．４）で３回洗浄した後、蛍光色素標識（ＭＳＤ）したＥＧＦ又はビオチン化したＨＧＦタンパク質と、異なる濃度の抗体と、の混合物を加えた。ルテニウム標識したＥＧＦタンパク質を、１ｎＭ〜４μＭまで濃度を増大させた異なる抗体と室温で３０分間インキュベートした。室温で穏やかに振盪しながら２時間インキュベートした後、プレートを０．１Ｍ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ ７．４）で３回洗った。ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔを希釈して分注し、ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ６０００によってシグナルを分析した。ＨＧＦ阻害アッセイは、１０ｎＭのビオチン化ＨＧＦを、１ｎＭ〜２μＭまで濃度を増大させた異なる抗体と室温で３０分間インキュベートした点以外は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ阻害アッセイと同様にして行った。
ＥＭ１−ｍＡｂは、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を、５０ｎＭのＥＧＦの存在下ではＩＣ50値１０．７ｎＭ±１．２で、また、８０ｎＭのＥＧＦの存在下ではＩＣ50値１０．６±１．５ｎＭで阻害した。親二価抗体は、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を、５０ｎＭのＥＧＦの存在下ではＩＣ50値０．１４±１．５ｎＭで、また、８０ｎＭのＥＧＦの存在下ではＩＣ50値１．７±１．４ｎＭで阻害した。ＥＭ１−ｍＡｂは、親二価ｍＡｂと比較してＥＭ１−ｍＡｂの一価の結合のために、ＥＧＦＲ細胞外ドメインに対するＥＧＦの結合のより弱い阻害を示した。
ＥＭ１−ｍＡｂは、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を、ＩＣ50値２９．９±１．５ｎＭで阻害した。親二価抗体は、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を、ＩＣ50値１４．８±１．６ｎＭで阻害した。ＥＭ１−ｍＡｂは、親二価ｍＡｂと比較してＥＭ１−ｍＡｂの一価の結合のために、ｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインに対するＨＧＦの結合のより弱い阻害を示した。
ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化及びＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害
ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害に対するＩＣ50値を決定するために抗体を試験した。ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化及びＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害を、実施例２（「ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害」）及び実施例６（「ＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害」）で述べたように異なる抗体濃度（０．０３５〜最終濃度７００ｎＭ）で評価した。いくつかの実施形態では、同じ細胞ライセートをＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔのリン酸化の両方の検出に使用できるように、ＥＧＦ及びＨＧＦの両方を細胞に加えた。
ＥＧＦＲに対して一価のコントロールとしての抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｅ１−Ｆ４０５Ｌ−ｇｐ１２０−Ｋ４０９Ｒ及び低フコース含量の親二価抗ＥＧＦＲ抗体を、コントロール抗体として使用した。表１９に、アッセイのＩＣ50値を示す。
*抗体は低フコース含量を有していた。
一価抗体の混合物と比較したＥＭ１−ｍＡｂによるｐＥＲＫ及びｐＡＫＴの阻害の増大（ｍＡｂ ｐＥＲＫアッセイ）（ｍＡｂ ｐＡＫＴアッセイ）
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体による効能の増大の可能性について、ｐＥＲＫ及びｐＡＫＴの下流のシグナル伝達に対するｍＡｂの影響を評価することによって評価を行った。これらの実験では、一価のコントロールＥＧＦＲ抗体と一価のコントロールｃ−Ｍｅｔ抗体の混合物を、二重特異性ＥＭ１−ｍＡｂと比較した。細胞を、透明な９６ウェルの組織培養処理したプレート（Ｎｕｎｃ）中、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、及び７．５ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２９４−ＨＧＮ）を添加した、ＧｌｕｔａＭＡＸ及び２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ培地中に播種し、加湿した５％ＣＯ2雰囲気中、３７℃で一晩付着させた。細胞は血清飢餓処理を行わなかった。細胞を、異なる濃度（０．１１〜最終濃度７００ｎＭ）の一価コントロール抗体又はＥＭ１−ｍＡｂで３０分間（ｐＥＲＫアッセイ）又は１時間（ｐＡｋｔアッセイ）、処理した。
細胞を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙより販売される以下のキットを使用し、製造者の指示に従ってｐＥＲＫ又はｐＡＫＴレベルについて評価した。すなわち、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４；Ｔｈｒ１８５／Ｔｙｒ１８７）アッセイ用全細胞ライセートキット（カタログ番号Ｋ１５１ＤＷＤ）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）アッセイ用全細胞ライセートキット（カタログ番号Ｋ１５１ＣＡＤ）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）アッセイ用全細胞ライセートキット（カタログ番号Ｋ１５１ＤＹＤ）。ｐＥＲＫアッセイでは、細胞を溶解し、全細胞ライセートを、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体（残基Ｔｈｒ２０２及びＴｙｒ２０４でリン酸化されたＥＲＫ１、及び残基Ｔｈｒ１８５及びＴｙｒ１８７でリン酸化されたＥＲＫ２を認識する）でコーティングされたプレートに加え、リン酸化されたＥＲＫ１／２を、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）試薬と接合した抗全ＥＲＫ１／２抗体により検出した。ｐＡＫＴ Ｓｅｒ４７３アッセイでは、捕捉抗体は抗全ＡＫＴ抗体とし、検出抗体は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）試薬と接合した抗ｐＡＫＴ Ｓｅｒ４７３抗体とした。ｐＡＫＴ Ｔｈｒ３０８アッセイでは、捕捉抗体は抗全ＡＫＴ抗体とし、検出抗体は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）試薬と接合した抗ｐＡＫＴ Ｔｈｒ３０８抗体とした。
各プレートを、製造者によりインストールされたアッセイ固有の初期設定を用いて ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ ６０００装置（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読み取った。データを抗体濃度の対数に対して電気化学発光シグナルとしてプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを使用して変化する傾きを有するＳ字状用量反応曲線にデータをフィッティングすることによりＩＣ50値を求めた。これらのアッセイでは、ＮＣＩ−Ｈ２９２、Ｈ１９７５、及びＳＫＭＥＳ−１細胞株を使用した。
二重特異性ＥＭ１−ｍＡｂによるＥＲＫリン酸化の阻害のＩＣ50は、試験した細胞株に応じて、２つの一価コントロール抗体の混合物と比べて約１４〜６３倍低かった（表２０）。２つの一価コントロール抗体の混合物と比較して向上したＥＭ１−ｍＡｂｄの効能は、これらの細胞株に対するＥＭ１−ｍＡｂの増大した結合性による協調的すなわち親和性効果を示している。ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株におけるＳｅｒ４７５（ｐＡＫＴＳ４７５）及びＴｈｒ３０８（ｐＡＫＴＴ３０８）ＡＫＴのリン酸化の阻害のＩＣ50は、２つの一価コントロール抗体の混合物と比較した場合に、それぞれ７５倍及び１２２倍低かった（表２１）。２つの一価コントロール抗体の混合物と比較して向上したＥＭ１−ｍＡｂｄの効能は、これらの細胞株に対するＥＭ１−ｍＡｂの増大した結合性による協調的すなわち親和性効果を示している。したがって、ＥＭ１−ｍＡｂの二重特異性によって、下流のシグナル伝達エフェクタに増大した作用がもたらされた。
抗体によるヒト腫瘍細胞の増殖又は生存率の阻害
ｃ−Ｍｅｔ依存性細胞増殖の阻害を、二重特異性ＥＭ１−ｍＡｂへの曝露後に異なる腫瘍細胞の生存率を測定することによって評価した。この試験では、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＫＭＥＳ−１、ＮＣＩ−Ｈ１９７５及びＮＣＩ−Ｈ３２５５細胞を使用した。
細胞は標準的な２Ｄ及び低付着フォーマットで培養した。エルロチニブ及びセツキシマブをコントロールとして使用した。表２２にアッセイのＩＣ50値をまとめて示す。
抗体によるヒト腫瘍細胞増殖又は生存率の阻害（標準２Ｄフォーマット）
細胞増殖の阻害を、２つのフォーマットで抗体に曝露した後で、ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＮＣＩ−Ｈ１９７５の生存率を測定することによって評価した。標準２Ｄフォーマットでは、細胞を、不透明な白色の９６ウェルの組織培養処理したプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）中、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、及び１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加した、ＧｌｕｔａＭＡＸ及び２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に播種し、３７℃、５％ ＣＯ2で一晩付着させた。細胞を、ＨＧＦ（７．５ｎｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２９４−ＨＧＦ）とともに、異なる濃度の抗体（０．０３５〜最終濃度７００ｎＭ）で処理してから、３７℃、５％ ＣＯ2で７２時間インキュベートした。一部のウェルは、コントロールとしてＨＧＦによっても抗体によっても処理しないままとした。生存細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検出し、データを、実施例３の「ヒト腫瘍細胞増殖の阻害（ＮＣＩ−Ｈ２９２増殖及びＮＣＩ−Ｈ３２２増殖アッセイ）」で述べたように分析した。
抗体によるヒト腫瘍細胞増殖又は生存率の阻害（低付着フォーマット）
低付着条件での生存率を評価するため、細胞を、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）中、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、及び１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加した、ＧｌｕｔａＭＡＸ及び２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含む５０μＬ／ウェルのＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に播種し、３７℃、５％ ＣＯ2で一晩付着させた。細胞を、ＨＧＦ（７．５ｎｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号２９４−ＨＧＮ）とともに、異なる濃度の抗体（０．０３５〜最終濃度７００ｎＭ）で処理してから、３７℃、５％ ＣＯ2で７２時間インキュベートした。一部のウェルは、コントロールとしてＨＧＦによっても抗体によっても処理しないままとした。生存細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検出し、発光を読み取る前にライセートを不透明な白色の９６ウェルの組織培養処理したプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に移した点以外は、実施例３の「ヒト腫瘍細胞増殖の阻害（ＮＣＩ−Ｈ２９２増殖及びＮＣＩ−Ｈ３２２増殖アッセイ）」で述べたようにデータを分析した。
ＥＭ１−ｍＡｂは、標準２Ｄ培養ではＮＣＩ−Ｈ２９２の増殖を３１ｎＭのＩＣ50で、低付着条件では０．６４ｎＭのＩＣ50で阻害した。ＥＭ１−ｍＡｂは、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の増殖を、標準２Ｄでは７００ｎＭよりも高いＩＣ50で、低付着培養では０．８〜１．３５ｎＭでそれぞれ阻害した。野生型ＥＧＦＲ及びｃＭｅｔの両方を発現するＮＣＩ−Ｈ２９２細胞では、ＥＭ１−ｍＡｂは、セツキシマブと比較して標準２Ｄで２２倍を上回る高い効能を、低付着培養条件では、約３３０倍高い効能を有していた。Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異体、及び野生型ｃＭｅｔを発現するＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞では、ＥＭ１−ｍＡｂは、低付着培養条件のセツキシマブと比較して少なくとも５１８倍高い効能を有していた。表２２に、各アッセイの概要を示す。
エルロチニブとＥＭ１−ｍＡｂの組み合わせは、ＥＧＦＲ変異体細胞株の増殖の阻害において効率的である
エルロチニブとＥＭ１−ｍＡｂの組み合わせによる細胞増殖の阻害を、標準２Ｄ培養条件及び低付着フォーマットの両方で評価した。ＮＣＩ−Ｈ３２５５及びＨＣＣ−８２７細胞を、上記の「抗体によるヒト腫瘍細胞増殖又は生存率の阻害」で述べたように播種した。ＨＧＦ（７．５ｎｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２９４−ＨＧＮ）を、抗体による処理とともに細胞に加えた。細胞を、異なる濃度の抗体（０．１１〜最終濃度７００ｎＭ）、又はエルロチニブ（０．４６〜最終濃度３０００ｎＭ）、又はエルロチニブと抗体の組み合わせ（固定された比でそれぞれの量を増加させて使用（例えば、最低濃度の組み合わせ＝最低濃度の抗体（０．１１ｎＭ）＋最低濃度のエルロチニブ（０．４６ｎＭ））によって処理した。一部のウェルは、コントロールとしてＨＧＦによっても抗体によっても処理しないままとした。細胞を、３７℃、５％ ＣＯ2で７２時間インキュベートしてから、生存細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検出し、上記で「ヒト腫瘍細胞増殖の阻害（ＮＣＩ−Ｈ２９２増殖及びＮＣＩ−Ｈ３２２増殖アッセイ）」において述べたようにデータを分析した。表２３に、実験結果をまとめて示す。表中、組み合わせのＩＣ50値は、括弧内に示されているものに応じて、抗体又はエルロチニブのいずれかに対するものである。
ＮＣＩ−Ｈ３２５５及びＨＣＣ−８２７細胞（ＥＧＦＲ変異体細胞株）の両方において、ＥＭ１−ｍＡｂをエルロチニブに加えることによって、細胞生存率の阻害の効能が増大し、かつより効果的となり、その結果、全体的な生存細胞の数が少なくなった。標準２Ｄ条件を用いたＮＣＩ−Ｈ３２５５細胞では、エルロチニブ単独でのＩＣ50は１２２ｎＭであったのに対して、組み合わせでは４９ｎＭであった。同様に、ＨＣＣ−８２７細胞では、エルロチニブ単独でのＩＣ50は２７ｎＭであったのに対して、組み合わせでは１５ｎＭであった。また、エルロチニブとＥＭ１−ｍＡｂの組み合わせは、エルロチニブとセツキシマブの組み合わせよりも効果的であった。したがって、ＨＧＦの存在下では、ＥＭ１−ｍＡｂを加えることにより、このアッセイにおけるエルロチニブの効果が高められた。
ＮＣＩ−Ｈ３２５５細胞は、Ｌ８５８Ｒ変異体ＥＧＦＲ及び増幅されたｃＭｅｔを発現する。ＨＣＣ−８２７細胞は、７４６位及び７５０位のアミノ酸が欠失したＥＧＦＲ変異体及び野生型ｃ−Ｍｅｔを発現する。ＥＭ１−ｍＡｂは、標準培養又は低付着培養のいずれかで、エルロチニブ単独よりもエルロチニブの存在下でＨＣＣ−８２７及びＮＣＩ−３２５５の生存率に強い影響をもたらす。
実施例１３インビトロ細胞株におけるＥＭ１−ｍＡｂの抗体媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）
ＡＤＣＣアッセイを、前述のように行った（Ｓｃａｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４：１５２４〜１５３４ ２００７）。簡単に述べると、ヒト血液からＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ勾配により精製し、ＡＤＣＣアッセイ用のエフェクター細胞として使用した。ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ１９７５又はＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を標的細胞として、エフェクター細胞５０個に対して標的細胞１個の比で使用した。標的細胞をＢＡＴＤＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により３７℃で２０分間前標識し、２回洗浄し、ＤＭＥＭ、１０％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁した。標的（１×１０4細胞）とエフェクター細胞（０．５×１０6細胞）を合わせ、１００μｌの細胞を９６ウェルＵ字底プレートのウェルに加えた。追加の１００μｌを、野生型及びプロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクトとともに、又はこれらなしで加えた。試料はすべて、二重に行った。プレートを２００Ｇで３分間遠心分離し、３７℃で２時間インキュベートしてから、２００Ｇで３分間再び遠心分離した。各ウェル当たり合計２０μＬの上清を除去し、ＤＥＬＰＨＩＡ Ｅｕｒｏｐｉｕｍ系試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）２００μＬを加えることによって細胞の溶解を測定した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０１ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して蛍光を測定した。データを、０．６７％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）により最大細胞毒性に対して正規化し、下式を用いて抗体の非存在下での標的細胞からのＢＡＴＤＡの自然放出により最小コントロールを求めた。すなわち（実験放出量−自然放出量）／（最大放出量−自然放出量）×１００％。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ５を使用して、Ｓ字状用量応答モデルにフィッティングした。
ＥＭ１−ｍＡｂ及び比較試料のＡＤＣＣの結果を、表２４（ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞）、表２５（ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞）及び表２６（ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞）及び表２７（ＮＣＩ−Ｈ１９９３細胞）に要約し、得られたＥＣ50値及び最大の溶解率を示した。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞は、野生型（ＷＴ）ＥＧＦＲ、ＷＴ ｃ−Ｍｅｔ、及びＷＴ ＫＲＡＳを発現し、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞は、変異体ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒ Ｔ７９０Ｍ）、ＷＴ ｃＭｅｔ及びＷＴ ＫＲＡＳを発現し、ＮＣＩ−Ｈ４４１は、ＷＴ ＥＧＦＲ、ＷＴ ｃＭｅｔ、及び変異体ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）を発現し、ＮＣＩ−Ｈ１９９３細胞は、ＷＴ ＥＧＦＲ、増幅ｃＭｅｔ、ＷＴ ＫＲＡＳを発現する。ＫＲＡＳは、ＧＴＰａｓｅ ＫＲａｓとして、また、Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログとしても知られている。
ＥＭ１−ｍＡｂは、より低いＥＣ50値を有することにより示されるように、セツキシマブ及びＥＭ１−ｍＡｂの正常フコース型よりも高いＡＤＣＣ応答の効能を有している。ＥＭ１−ｍＡｂは、得られた最大溶解度に関して、セツキシマブ及び正常フコース型二重特異性ｍＡｂよりも高い有効性を有している。表２４〜２７のプロファイルより、ＥＭ−１ ｍＡｂは、変異体及び野生型のＥＧＦＲ、正常及び増幅されたｃ−Ｍｅｔのレベルを有する野生型、並びに野生型及び変異体ＫＲＡＳを有する細胞にＡＤＣＣ活性を有することが分かる。
実施例１４ ＥＭ１−ｍＡｂによる腫瘍有効性試験
腫瘍増殖に対するＥＭ１−ｍＡｂの有効性試験を、実施例７の「二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子による腫瘍有効性試験」で述べたように行った。簡単に述べると、２×１０6個のＮＣＩ−Ｈ２９２−ＨＧＦ細胞を、雌性ＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスの皮下（ｓ．ｃ．）にＣｕｌｔｒｅｘとともにを移植した。移植７日後に、マウスを腫瘍体積によって各群１０匹の５群に分類した。１群当たりの開始平均腫瘍体積が６２〜６６ｍｍ3（小さい腫瘍）の範囲となった後、投与を開始した。ＰＢＳ又は治療用抗体を週２回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。
この有効性の評価では、ヒトＨＧＦ（肝細胞増殖因子）をトランスフェクトしたヒト扁平上皮細胞癌であるＳＫＭＥＳ−ＨＧＦも使用した。１０×１０6個のこれらの細胞を雌性ＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスの皮下に移植した。移植１２日後に、これらのマウスを腫瘍体積によって各群８匹の５群に分類した。１群当たりの開始平均腫瘍体積が９８〜１０１ｍｍ3（大きい腫瘍）の範囲となった時点で、最初の試験を開始した。ＰＢＳ又は治療用ｍＡｂを週２回、４週間にわたって腹腔内投与した。大きなサイズの腫瘍での試験では、腫瘍体積が約２００〜３００ｍｍ3となった後、マウスを２群に分けることによって分類した。次に、これらのマウスをセツキシマブ（２０ｍｇ／ｋｇ）又はＥＭ１−ｍＡｂ（２０ｍｇ／ｋｇ）を週２回（３週間）腹腔内投与して処置した。
データの概要を表２８に示す。図１０に経時的な分子の有効性を示す。ＥＭ１−ｍＡｂは、Ｈ２９２−ＨＧＦの小腫瘍モデル並びにＳＫＭＥＳ−ＨＧＦの小腫瘍及び大腫瘍モデルにおいてセツキシマブと比較して高い腫瘍抑制プロファイルを有している。
表２９にＳＫＭＥＳ−ＨＧＦ腫瘍からの処置群における腫瘍サイズを示し、表３０に抗腫瘍活性を示す。
ＥＭ１−ｍＡｂは、ＳＫＭＥＳ−ＨＧＦモデルにおいて１ｍｇ／ｋｇまで下げた複数の用量で腫瘍増殖を９７％以上阻害した。セツキシマブは初期において非常に効果的であった（２０ｍｇ／ｋｇで８８％ ＴＧＩ）が、投与の終了後、セツキシマブで処置された腫瘍は再増殖した。これに対して、５又は２０ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂで処置した腫瘍は、試験期間（２ヶ月以上）にわたって再増殖しなかった。
実施例１５インビトロでのＥＭ１−ｍＡｂによる細胞遊走の阻害
方法
腫瘍細胞の遊走の阻害に対するＥＭ−ｍＡｂ及びコントロール一価抗体の影響をＮＩＨ−１６５０細胞で評価した。ＥＧＦＲ変異体腫瘍細胞株Ｈ１６５０（エクソン１９に変異を有する（欠失Ｅ７４６、Ａ７５０）肺細気管支肺胞性癌細胞を、通常の培養条件下（３７℃、５％ ＣＯ2、湿度９５％）で組織培養フラスコ中で培養した。すべての培地及び添加物質は、細胞の供給元により推奨されるものとした（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，米国バージニア州マナッサス）。
１０，０００細胞／ウェルのＨ１６５０肺腫瘍細胞を「Ｕ」字底Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ（ＵＬＡ）９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国、テュークスベリー）に２００μＬ／ウェルで播種することによってスフェロイドを生成した。これらのプレートは、２４時間以内（３７℃、５％ ＣＯ2でのインキュベーションにより）に１個の細胞スフェロイドの自然形成を刺激し、これらのスフェロイドを４日間、通常の培養条件下で増殖させた。
丸底９６穴プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を滅菌水中、０．１％ゼラチン（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、ビルリカ）で１時間、３７℃でコーティングした。化合物評価試験では、４日目の１０，０００個の細胞からなる腫瘍スフェロイド（Ｈ１６５０及びＮＣＩ−Ｈ１９７５）を、コーティングされた丸底プレートに移し、２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）により連続希釈した、ＥＭ１−ｍＡｂ、コントロールの低フコース含量の一価抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｅ１−Ｆ４０５Ｌ−ｇｐ１２０−Ｋ４０９Ｒ、コントロールの低フコース含量の一価抗ｃＭｅｔ ｍＡｂ Ｍ１−Ｋ４０９Ｒ−ｇｐ１２０−Ｆ４０５Ｌ、及び２種類の一価抗体Ｅ１−Ｆ４０５Ｌ−ｇｐ１２０−Ｋ４０９Ｒ及びＭ１−Ｋ４０９Ｒ−ｇｐ１２０−Ｆ４０５Ｌの組み合わせ（低フコースで生成したもの）で処理した。コントロールは、ＩｇＧ1κアイソタイプコントロール（最も高濃度の薬物処理細胞に等しい濃度）である溶媒で処理した。化合物の作用を、４８時間後に、対物２倍の完全自動化Ｏｐｅｒｅｔｔａ高含量イメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅr）で明視野像を用いて、遊走細胞によって覆われた面積を測定することにより分析した。処理の効果による細胞遊走の阻害率（全面積）を、媒質のみのコントロールの値で割ることによってデータを正規化してコントロールに対する細胞遊走率（％）を得ることにより評価した。したがって、１未満の値は細胞遊走に対して阻害的とみなされる。
結果
ＥＭ１−ｍＡｂは、コントロールの一価の抗ＥＧＲＦ及び抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｅ１−Ｆ４０５Ｌ−ｇｐ１２０−Ｋ４０９Ｒ及びＭ１−Ｋ４０９Ｒ−ｇｐ１２０−Ｆ４０５Ｌの組み合わせと比較した場合に、Ｈ１６５０（Ｌ８５８Ｒ ＥＧＦＲ変異体）及びＨ１９７５（Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異体）細胞における細胞遊走の強い相乗的阻害を示したＨ１６５０細胞では、ＥＭ１−ｍＡｂの高い方から６つの濃度で、アイソタイプコントロールと比較して細胞遊走が有意に阻害された（ｐ＜０．００１）。ＥＭ１−ｍＡｂのＥＣ50値が０．２３ｎＭであったのに対して、一重特異性コントロール抗体の組み合わせのＥＣ50値は４．３９ｎＭであった。したがって、ＥＭ１−ｍＡｂは、Ｈ１６５０細胞の遊走を阻害するうえで一価のコントロール抗体の組み合わせと比較して約１９倍より効率的であった。ＥＭ１−ｍＡｂの細胞遊走阻害のレベルは、Ｈ１６５０及びＨ１９７５細胞に対する一重特異性コントロールｍＡｂの組み合わせよりも優れていた。表３１に、アッセイのＥＣ50値を示す。
*抗体は低フコース含量を有する
実施例１６抗ｃ−Ｍｅｔ抗体０６９及び５Ｄ５のエピトープマッピング
抗ｃ−Ｍｅｔ ｍＡｂ ０６９結合エピトープを、直鎖状及び拘束型ＣＬＩＰＳペプチド技術を用いてマッピングした。これらのペプチドでヒトｃＭｅｔのＳＥＭＡ、ＰＳＩ及びＩｇドメインをスキャンした。標準的なＦｍｏｃ化学反応を用いて上記のｃ−Ｍｅｔのアミノ酸配列を使用して直鎖状及びＣＬＩＰＳペプチドを合成し、スカベンジャーを含む三フッ素酸を用いて脱保護した。Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｌｉｎｋｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ（ＣＬＩＰＳ）技術（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ２０：２８３，２００７）を用い、拘束型ペプチドを化学骨格上で合成することによってコンフォーメーショナルエピトープを再構築した。直鎖状及び拘束型ペプチドを、ＰＥＰＳＣＡＮ ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡ（Ｓｌｏｏｔｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ １，８７〜９６，１９９６）を用いてＰＥＰＳＣＡＮカードに結合させてスクリーニングを行った。抗ｃ−Ｍｅｔ ｍａｂ０６９結合エピトープは、ｃ−Ｍｅｔのアミノ酸２３９〜２５３ ＰＥＦＲＤＳＹＰＩＫＹＶＨＡＦ（配列番号２３８）及び３４６〜３６１ ＦＡＱＳＫＰＤＳＡＥＰＭＤＲＳＡ（配列番号２３９）からなる不連続エピトープである。ｃ−Ｍｅｔアミノ酸配列を配列番号２０１に示す。
同様の方法を用いて、ｍＡｂ ５Ｄ５（ＭｅｔＭａｂ，オナルツズマブ）エピトープをマッピングした。ｍＡｂ ５Ｄ５はｃ−Ｍｅｔ残基３２５〜３４０ ＰＧＡＱＬＡＲＱＩＧＡＳＬＮＤＤ（配列番号２４０）に結合する。
実施例１７ ＥＭ１−ｍＡｂによるインビボ腫瘍有効性試験
腫瘍増殖に対するＥＭ１−ｍＡｂの有効性試験を、ＥＧＦＲ変異又はＥＧＦＲ及び／若しくはｃ−Ｍｅｔ増幅を有する更なる腫瘍細胞株を用いて実施例７の「二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子による腫瘍有効性試験」及び実施例１４で述べたように行った。簡単に述べると、ＳＮＵ−５、Ｈ１９７５、ＨＣＣ８２７細胞、ヒトＨＧＦを発現するＨ１９７５細胞、又は、エルロチニブに対する高い耐性について選択されたＨＣＣ８２７細胞のクローン（ＨＣＣ８２７−ＥＲ１細胞）を雌性ヌードマウスの皮下（ｓ．ｃ．）に移植したが、ＳＮＵ−５細胞はＣＲ１７／ＳＣＩＤマウスに移植した。マウスに、ＰＢＳ若しくはＥＭ１−ｍＡｂ、セツキシマブ（ＣＡＳ ２０５９２３−５６−４）、エルロチニブ（ＣＡＳ １８３３２１−７４−６）、アファチニブ（ＣＡＳ ４３９０８１−１８−２）、又はＥＭ−１ｍＡｂとアファチニブ、及びＥＭ−１ｍＡｂとエルロチニブの組み合わせを、表３２に示される用量及びスケジュールで腹腔内投与した。抗腫瘍有効性を、１００−Ｔ／Ｃ（％）（Ｔ＝実施例７に述べたような特定の日における処理群の平均腫瘍サイズ、Ｃ＝コントロール群の平均腫瘍サイズ）として計算したＴＧＩ（％）（組織増殖阻害率）として測定した。
一次ＥＧＦＲ活性化変異（ＥＧＦＲ ＴＫＩに対する耐性を有さない）を有する腫瘍（ＨＣＣ８２７腫瘍、ＥＧＦＲ ｄｅｌ（Ｅ７４６，Ａ７５０））では、１０ｍｇ／ｋｇで投与されたＥＭ１−ｍＡｂは、腫瘍増殖を８２％阻害した。エルロチニブはこのモデルでは同様に効果的であり、エルロチニブとＥＭ１−ｍＡｂの組み合わせも同様に効果的であった。図１１に、ＨＣＣ８２７腫瘍モデルにおける経時的な治療剤の有効性を示す。
野生型ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ遺伝子の増幅を有する腫瘍（胃癌モデルＳＮＵ−５）では、ＥＭ１−ｍＡｂは、完全腫瘍縮小をともなう抗腫瘍活性を示した（一元配置分散分析に続いてＧａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌ法を用いた個々の比較により溶媒と比較した場合、３４日目で９８％のＴＧＩ（ｐ＜０．０１））。このモデルでは、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂであるセツキシマブの抗腫瘍活性はより低く、３４日目で４９％であった。図１２に、ＳＮＵ−５モデルにおける経時的な治療剤の有効性を示す。
一次ＥＧＦＲ活性化変異及び腫瘍を第１世代ＥＧＦＲ ＴＫＩに対して抵抗性にするＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣモデルにおいてＥＭ１−ｍＡｂを試験した（Ｈ１９７５モデル）。ＥＭ１−ｍＡｂは、Ｐｒｉｓｍ ３．０３によるＬｏｎｇｒａｎｋ分析を用いてＰＢＳ溶媒と比較した場合に、ヌードマウスに移植されたＨ１９７５細胞株モデルにおいて５７％ ＴＧＩで腫瘍増殖を阻害した（ｐ＜０．０００１）。予想されたとおり、エルロチニブは、Ｔ７９０Ｍを有するこのモデルでは有効ではなかった。アフィチニブは、ＥＭ１−ｍＡｂと同程度に有効であった（５７％ ＴＧＩ）。セツキシマブ及びＥＭ１−ｍＡｂとアフィチニブとの組み合わせが最も有効であり、それぞれ９１％及び９６％の腫瘍増殖阻害率で腫瘍を縮小させた（Ｐｒｉｓｍ ３．０３によるＬｏｎｇｒａｎｋ分析を用いてＰＢＳと比較したセツキシマブ、及びＰＢＳ＋アフィチニブ溶媒群と比較したＥＭ１−ｍＡｂ＋アフィチニブの両方で、ｐ＜０．０００１）。マウスＨＧＦはヒトｃ−Ｍｅｔに結合しないため、このモデルでは、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路は活性化されていない。
レンチウイルストランスダクション系を用いてヒトＨＧＦを発現するように操作した複数のモデルにおいてＥＭ１−ｍＡｂを試験した。マウスＨＧＦは移植されたヒト腫瘍細胞上のヒトｃ−Ｍｅｔを活性化しないことから、これによりｃ−Ｍｅｔ経路のリガンド活性化をインビボでモデル化することが可能である。ＳＫＭＥＳ−ＨＧＦモデルの結果を実施例１４及び図１０に示し、ＴＧＩ（％）を表３２にまとめて示す。ＥＭ１−ｍＡｂは、Ｈ１９７５−ＨＧＦモデルにおける腫瘍増殖を７１％阻害した（Ｐｒｉｓｍ ３．０３によるＬｏｎｇｒａｎｋ分析を用いてＰＢＳ溶媒と比較した場合にｐ＜０．０００１）。このモデルでは、アフィチニブ、エルロチニブ、及びセツキシマブは有効性がより低かった。ＥＭ１−ｍＡｂとアフィチニブの組合わせは極めて有効であった（Ｐｒｉｓｍ ３．０３によるＬｏｎｇｒａｎｋ分析を用いてＰＢＳ＋アフィチニブ溶媒群と比較した場合に９６％ ＴＧＩ、ｐ＜０．０００１）。図１３に、Ｈ１９７５−ＨＧＦモデルにおける経時的な分子の有効性を示す。したがって、エルロチニブ、アフィチニブ、及びセツキシマブは、ｃ−Ｍｅｔ経路が活性化されている腫瘍モデルでは抗腫瘍有効性を失う。
ＥＭ１−ｍＡｂを、一次ＥＧＦＲ活性化変異及びｃ−Ｍｅｔ遺伝子増幅による第１世代ＥＧＦＲ ＴＫ１（エルロチニブ）に対する高い耐性によって特徴付けられる腫瘍モデル（ＨＣＣ８２７−ＥＲ１モデル）において試験した。１０ｍｇ／ｋｇで投与されたＥＭ１−ｍＡｂは、移植されたＨＣＣ８２７−ＥＲ１腫瘍を２５日目で８６％ ＴＧＩで部分縮小させ、エルロチニブ単独（２５日目で６５％ ＴＧＩ）よりも有効性が高かった。ＥＭ１−ｍＡｂとエルロチニブの組合わせでは、有効性はそれ以上高くならなかった。図１４に経時的な分子の有効性を示す。
したがって、ＥＭ１−ｍＡｂは、野生型ＥＧＦＲを有する腫瘍モデル、一次活性化ＥＧＦＲ変異を有する腫瘍モデル、ＥＧＦＲ治療剤に対する耐性をともなうＥＧＦＲ変異Ｔ７９０Ｍを有する腫瘍モデル、並びに、ｃ−Ｍｅｔがリガンド依存的（自己分泌ＨＧＦ発現）又はリガンド非依存的（ｃ−Ｍｅｔ遺伝子の増幅）に活性化されているモデルにおいて有効性を示した。ＥＭ１−ｍＡｂとエルロチニブ又はアフィチニブとの組合わせでは、特定の腫瘍モデルにおいて有効性が高くなり得る。
ＢＩＷ＝週２回
ＱＤ＝１日１回
ＷＴ＝野生型
ＡＭＰ＝増幅された
実施例１８インビボでのＥＧＦＲ及びｃ−ＭｅｔのＥＭ１−ｍＡｂ誘導分解
腫瘍内におけるＥＭ１−ｍＡｂのＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの両方との関与を実証するため、２０ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂの単回投与後の異なる時点においてＨ１９７５−ＨＧＦ腫瘍から試料を採取した。腫瘍ライセートを調製し、全タンパク質に対して正規化し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた。ゲルをニトロセルロースに移し、ＥＧＦＲ（マウス（ｍＡｂ）抗ヒトＥＧＦＲ（ＥＧＦ−Ｒ２）；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カタログ番号）又はｃ−Ｍｅｔ（マウス（ｍＡｂ）抗ヒトＭｅｔ（Ｌ４１Ｇ３）；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カタログ番号３１４８）についてウエスタンブロットを行った。ＥＧＦＲレベルはＧＡＰＤＨに対して正規化し、ｃ−Ｍｅｔレベルはアクチンに対して正規化した。ＥＧＦＲで処理した腫瘍の受容体のレベルをＰＢＳで処理した腫瘍の受容体のレベルと比較して全受容体の比率（％）を求めた。ＥＭ１−ｍＡｂ処理によって、Ｈ１９７５−ＨＧＦ腫瘍における全ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ受容体レベルは、分析を行った時点に応じてコントロールの２０％〜６０％に減少した。図１５は、経時的にＰＢＳと比較した平均の受容体レベルを示す。ｐＥＧＦＲ、ｐｃ−Ｍｅｔ及びｐＡＫＴもＥＭ１の単回投与の７２時間後に減少した。
実施例１９ ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ二重特異性ｍＡｂのＩｇＧ1及びＩｇＧ2δ変異体アイソフォームを比較する抗腫瘍活性
Ｈ１９７５−ＨＧＦモデルで観察された有効性に対するエフェクター機能の寄与をより深く理解するために、ＥＭ１−ｍＡｂと、ＩｇＧ２にエフェクターサイレンシング置換Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ（国際特許公開特許第ＷＯ２０１１／０６６５０１号に述べられる置換）（番号付けはＥＵインデックスに基づく）を有するＩｇＧ２ Ｆｃを有するＥＭ１−ｍＡｂの変異体との比較を行った。Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換を有するＩｇＧ２抗体は、Ｆｃ受容体ともエフェクター細胞（ＮＫ細胞及びマクロファージなど）とも相互作用しない。ＥＭ１−ｍＡｂのＩｇＧ２ Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異体で観察された活性の喪失は、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰなどのエフェクター介在機構が寄与する抗腫瘍活性を表し得る。上述のＨ１９７５−ＨＧＦモデルへの腫瘍細胞移植後３２日目に、親ＥＭ１−ｍＡｂと比較した場合にＩｇＧ２ Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ変異体による抗腫瘍活性の喪失の兆候が認められ、エフェクター介在機構がＥＭ１−ｍＡｂの機能に寄与していることが示唆された。図１６に、分子の抗腫瘍活性を示す。
配列番号７３，ＰＲＴ，ヒト、ＥＧＦＲ（アミノ酸２４個のシグナル配列を含む。成熟タンパク質は残基２５から開始）
配列番号７５，ＰＲＴ，ヒト、テネイシンＣ
＞配列番号１０１
ＰＲＴ
ヒト
ｃＭｅｔ
＞配列番号１７９
ＰＲＴ
人工配列
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＦＧループ
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ；
ただし、Ｘ9は、Ｍ又はＩである。
＞配列番号１８０
ＰＲＴ
人工配列
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＦＧループ
ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０），
＞配列番号１８１
ＰＲＴ
人工配列
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＢＣループ
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）;ただし、
Ｘ1は、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＤであり、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｙ又はＷであり、
Ｘ3は、Ｐ、Ｄ又はＮであり、
Ｘ4は、Ｌ又は存在せず、
Ｘ5は、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり、
Ｘ6は、Ｇ、Ｄ又はＡであり、
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり、
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬである。
＞配列番号１８２
ＰＲＴ
人工配列
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２），
Ｘ1は、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＤであり、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｙ又はＷであり、
Ｘ3は、Ｐ、Ｄ又はＮであり、
Ｘ4は、Ｌ又は存在せず、
Ｘ5は、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり、
Ｘ6は、Ｇ、Ｄ又はＡであり、
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり、
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ9は、Ｍ又はＩである。
＞配列番号１８３
ＰＲＴ
人工配列
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３），
ただし、
Ｘ1は、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＤであり、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｙ又はＷであり、
Ｘ3は、Ｐ、Ｄ又はＮであり、
Ｘ4は、Ｌ又は存在せず、
Ｘ5は、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり、
Ｘ6は、Ｇ、Ｄ又はＡであり、
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり、
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬである。
＞配列番号１８４
ＰＲＴ
人工配列
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインのＣ鎖及びＣＤループの配列
ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11Ｅ Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16（配列番号１８４），ただし、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり、
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり、
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり、
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり、
Ｘ16は、Ｅ又はＤである。
＞配列番号１８５
ＰＲＴ
人工配列
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインのＦ鎖及びＦＧループ
ＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20Ｖ ＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23（配列番号１８５），ただし
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり、
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり、
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり、
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ21は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり、
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり、
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである。
＞配列番号１８６
ＰＲＴ
人工配列
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）、
ただし、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり、
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり、
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり、
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり、
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり、
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり、
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり、
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり、
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり、
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ21は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり、
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり、
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである。
＞配列番号１８７
ＰＲＴ
人工配列
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−ＭｅｔＦＮ３ドメイン含有分子のＥＧＦＲ ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ24ＶＴＸ25ＤＳＸ26ＲＬＳＷＤＤＰＸ27ＡＦＹＸ28ＳＦＬＩＱＹＱＸ29ＳＥＫＶＧＥＡＩＸ30ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＸ31ＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ32ＲＧＬＰＬＳＡＸ33ＦＴＴ（配列番号１８７）ただし、
Ｘ24は、Ｅ、Ｎ又はＲであり、
Ｘ25は、Ｅ又はＰであり、
Ｘ26は、Ｌ又はＡであり、
Ｘ27は、Ｈ又はＷであり、
Ｘ28は、Ｅ又はＤであり、
Ｘ29は、Ｅ又はＰであり、
Ｘ30は、Ｎ又はＶであり、
Ｘ31は、Ｇ又はＹであり、
Ｘ32は、Ｍ又はＩであり、
Ｘ33は、Ｅ又はＩである。
＞配列番号１８８
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−ＭｅｔＦＮ３ドメイン含有分子のｃ−ＭｅｔＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ34ＶＴＸ35ＤＳＸ36ＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦＸ37ＦＸ38Ｘ39Ｘ40ＧＸ41ＡＩＸ42ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＸ43Ｘ44ＶＫＧＧＸ45ＩＳＰＰＬＳＡＸ46ＦＴＴ（配列番号１８８）；ただし、
Ｘ34は、Ｅ、Ｎ又はＲであり、
Ｘ35は、Ｅ又はＰであり、
Ｘ36は、Ｌ又はＡであり、
Ｘ37は、Ｅ又はＰであり、
Ｘ38は、Ｖ又はＬであり、
Ｘ39は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ40は、Ｓ又はＫであり、
Ｘ41は、Ｅ又はＤであり、
Ｘ42は、Ｎ又はＶであり、
Ｘ43は、Ｌ又はＭであり、
Ｘ44は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ45は、Ｓ又はＫであり、
Ｘ46は、Ｅ又はＩである。
＞配列番号１８９
ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｅ１ ＶＨ
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＤＤＧＳＹＫＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ
ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＩＴＭＶＲＧＶＭＫＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
＞配列番号１９０
ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｅ１ ＶＬ
ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＳＡＬＶＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＥＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ
ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞配列番号１９１
ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｅ２ ＶＨ
１ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ ＳＹＷＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮ ＩＫＫＤＧＳＥＫＹＹ
６１ ＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬ ＧＷＧＷＧＷＹＦＤＬ ＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳ
１２１ Ｓ
＞配列番号１９２
ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｅ２ ＶＬ
１ ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴ ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ ＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳ ＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰ ＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤ ＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡ
６１ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰ ＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱ ＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫ
＞配列番号１９３
ｃＭｅｔ ｍＡｂ Ｍ１ ＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＥＴＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＨＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＹＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＲＧＴＮＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
＞配列番号１９４
ｃＭｅｔ ｍＡｂ Ｍ１ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＷＬＡＷＦＱＨＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＬＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＳＦＰ−ＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ
＞配列番号１９５
ｃＭｅｔ ｍＡｂ Ｍ２ ＶＨ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＤＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＥＧＬＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮＱＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
＞配列番号１９６
ｃＭｅｔ ｍＡｂ Ｍ２ ＶＬ
ＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＬＳＳＡＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＴＳＹＰＱＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ
＞配列番号１９７
Ｆ４０５Ｌを有するＧｐ１２０重鎖
ｑｖｑｌｖｑｓｇａｅｖｋｋｐｇａｓｖｋｖｓｃｑａｓｇｙｒｆｓｎｆｖｉｈｗｖｒｑａｐｇｑｒｆｅｗｍｇｗｉｎｐｙｎｇｎｋｅｆｓａｋｆｑｄｒｖｔｆｔａｄｔｓａｎｔａｙｍｅｌｒｓｌｒｓａｄｔａｖｙｙｃａｒｖｇｐｙｓｗｄｄｓｐｑｄｎｙｙｍｄｖｗｇｋｇｔｔｖｉｖｓｓａｓｔｋｇｐｓｖｆｐｌａｐｓｓｋｓｔｓｇｇｔａａｌｇｃｌｖｋｄｙｆｐｅｐｖｔｖｓｗｎｓｇａｌｔｓｇｖｈｔｆｐａｖｌｑｓｓｇｌｙｓｌｓｓｖｖｔｖｐｓｓｓｌｇｔｑｔｙｉｃｎｖｎｈｋｐｓｎｔｋｖｄｋｒｖｅｐｋｓｃｄｋｔｈｔｃｐｐｃｐａｐｅｌｌｇｇｐｓｖｆｌｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｈｅｄｐｅｖｋｆｎｗｙｖｄｇｖｅｖｈｎａｋｔｋｐｒｅｅｑｙｎｓｔｙｒｖｖｓｖｌｔｖｌｈｑｄｗｌｎｇｋｅｙｋｃｋｖｓｎｋａｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋａｋｇｑｐｒｅｐｑｖｙｔｌｐｐｓｒｅｅｍｔｋｎｑｖｓｌｔｃｌｖｋｇｆｙｐｓｄｉａｖｅｗｅｓｎｇｑｐｅｎｎｙｋｔｔｐｐｖｌｄｓｄｇｓｆｌｌｙｓｋｌｔｖｄｋｓｒｗｑｑｇｎｖｆｓｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｌｓｌｓｐｇｋ
＞配列番号１９８
Ｋ４０９Ｒを有するＧｐ１２０重鎖
ｑｖｑｌｖｑｓｇａｅｖｋｋｐｇａｓｖｋｖｓｃｑａｓｇｙｒｆｓｎｆｖｉｈｗｖｒｑａｐｇｑｒｆｅｗｍｇｗｉｎｐｙｎｇｎｋｅｆｓａｋｆｑｄｒｖｔｆｔａｄｔｓａｎｔａｙｍｅｌｒｓｌｒｓａｄｔａｖｙｙｃａｒｖｇｐｙｓｗｄｄｓｐｑｄｎｙｙｍｄｖｗｇｋｇｔｔｖｉｖｓｓａｓｔｋｇｐｓｖｆｐｌａｐｓｓｋｓｔｓｇｇｔａａｌｇｃｌｖｋｄｙｆｐｅｐｖｔｖｓｗｎｓｇａｌｔｓｇｖｈｔｆｐａｖｌｑｓｓｇｌｙｓｌｓｓｖｖｔｖｐｓｓｓｌｇｔｑｔｙｉｃｎｖｎｈｋｐｓｎｔｋｖｄｋｒｖｅｐｋｓｃｄｋｔｈｔｃｐｐｃｐａｐｅｌｌｇｇｐｓｖｆｌｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｈｅｄｐｅｖｋｆｎｗｙｖｄｇｖｅｖｈｎａｋｔｋｐｒｅｅｑｙｎｓｔｙｒｖｖｓｖｌｔｖｌｈｑｄｗｌｎｇｋｅｙｋｃｋｖｓｎｋａｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋａｋｇｑｐｒｅｐｑｖｙｔｌｐｐｓｒｅｅｍｔｋｎｑｖｓｌｔｃｌｖｋｇｆｙｐｓｄｉａｖｅｗｅｓｎｇｑｐｅｎｎｙｋｔｔｐｐｖｌｄｓｄｇｓｆｆｌｙｓｒｌｔｖｄｋｓｒｗｑｑｇｎｖｆｓｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｌｓｌｓｐｇｋ
＞配列番号１９９
ＥＭ１−ｍＡｂ Ｈ１（抗ＥＧＦＲ，４０５Ｌ）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＤＤＧＳＹＫＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＩＴＭＶＲＧＶＭＫＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
＞配列番号２００
ＥＭ−１ ｍＡｂ Ｌ１
ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＳＡＬＶＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＥＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
＞配列番号２０１
ＥＭ−１ ｍＡｂ Ｈ２（Ｋ４０９Ｒ，抗ｃＭｅｔ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＥＴＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＨＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＹＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＲＧＴＮＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
＞配列番号２０２
ＥＭ−１ ｍＡｂ Ｌ２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＷＬＡＷＦＱＨＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＬＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＳＦＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
＞配列番号２０３
Ｈ１定常領域
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
＞配列番号２０４
Ｈ２定常領域
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
＞配列番号２０５
ＥＭ１−ｍＡｂ Ｈ１ ｃＤＮＡ ｐｄｒ００００１５４９９
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｃｇａｇａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｇｇｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｃｇｇｃａｇａａｇｃｃｔｇａｇｇｃｔｇｔｃｃｔｇｃｇｃｃｇｃｃａｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｔｔｃａｇｃａｃｃｔａｃｇｇｃａｔｇｃａｃｔｇｇｇｔｇｃｇｇｃａｇｇｃｃｃｃａｇｇｃａａｇｇｇｃｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｇｇｃｃｇｔｇａｔｃｔｇｇｇａｃｇａｃｇｇｃａｇｃｔａｃａａｇｔａｃｔａｃｇｇｃｇａｃａｇｃｇｔｇａａｇｇｇｃａｇｇｔｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｇｇａｃａａｃａｇｃａａｇａａｃａｃｃｃｔｇｔａｃｃｔｇｃａｇａｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｇｇｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｃａｇｇｇａｃｇｇｃａｔｃａｃｃａｔｇｇｔｇｃｇｇｇｇｃｇｔｇａｔｇａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃｇｃｃａｇｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａａｇｃｇｔｇｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃｃｃｃｃａｇｃａｇｃａａｇａｇｃａｃｃａｇｃｇｇｃｇｇｃａｃａｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｇａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａｇｃｃａｇｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｃｔｇｇａａｃｔｃｔｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃｔｃｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｃｇｃｃｇｔｇｃｔｇｃａｇａｇｃａｇｃｇｇｃｃｔｇｔａｃａｇｃｃｔｇａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｇｃａｇｃｃｔｇｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｃｔａｃａｔｃｔｇｃａａｃｇｔｇａａｃｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａｇａｇｔｇｇａｇｃｃｃａａｇａｇｃｔｇｃｇａｃａａｇａｃｃｃａｃａｃｃｔｇｃｃｃｃｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｇａｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃｇｇａｃｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃｃａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃａｇｃａｇｇａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａｇｇａｃｃｃａｇａｇｇｔｇａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｃａａｃｇｃｃａａｇａｃｃａａｇｃｃｃａｇａｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇｔｃｃｇｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａａｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａａａａｇａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃａｃｇｇｇａｇｃｃｃｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｃａｇｃｃｇｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇａｃｃｔｇｔｃｔｇｇｔｇａａｇｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｃｇｇｃｃａｇｃｃｃｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｃｃｃｃｃｃａｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｃａｇｃｔｔｃｃｔｃｃｔｇｔａｃａｇｃａａｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇｔｃｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｃａａｃｇｔｇｔｔｃａｇｃｔｇｃａｇｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇａａｇｔｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇａｇｃｃｃｃｇｇｃａａａｔｇａ
＞配列番号２０６
ＥＭ１−ｍＡｂ Ｌ１ ｃＤＮＡ ｐＤＲ００００１５４９９
ａｔｃｃａｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｃａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃｇｃｃａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａｃｃｇｇｇｔｇａｃｃａｔｃａｃｃｔｇｃｃｇｇｇｃｃａｇｃｃａｇｇａｃａｔｃａｇｃａｇｃｇｃｃｃｔｇｇｔｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａｇｃｃｃｇｇｃａａｇｇｃｃｃｃｃａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｔｇｃｃｃａｇｃｃｇｇｔｔｃａｇｃｇｇｃａｇｃｇａｇａｇｃｇｇｃａｃｃｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃａｃｃｔａｃｔａｃｔｇｃｃａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃｔａｃｃｃｃｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｇｃｇｇｃｇｇａａｃａａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａａｇｃｇｔａｃｇｇｔｇｇｃｃｇｃｔｃｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃｃａｇｃｇａｃｇａｇｃａｇｃｔｇａａｇａｇｃｇｇｃａｃｃｇｃｃａｇｃｇｔｇｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｃａａｃｔｔｃｔａｃｃｃｃｃｇｇｇａｇｇｃｃａａｇｇｔｇｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｃａａｃｇｃｃｃｔｇｃａｇａｇｃｇｇｃａａｃａｇｃｃａｇｇａｇａｇｃｇｔｃａｃｃｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃｔｃｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｇａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｃｃｔｇｔｃｃａａｇｇｃｃｇａｃｔａｃｇａｇａａｇｃａｃａａｇｇｔｇｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａｇｇｔｇａｃｃｃａｃｃａｇｇｇｃｃｔｇｔｃｃａｇｃｃｃｃｇｔｇａｃｃａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇｃｇａｇｔｇｃｔｇａ
＞配列番号２０７
ＥＭ−１ ｍＡｂ Ｈ２ ｃＤＮＡ ｐＤＲ００００１６５８４
ｃａｇｇｔｔｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇｔｃｔｇｇａｇｃｔｇａｇｇｔｇａａｇａａｇｃｃｔｇｇｇｇｃｃｔｃａｇｔｇａａｇｇｔｃｔｃｃｔｇｃｇａｇａｃｔｔｃｔｇｇｔｔａｃａｃｃｔｔｔａｃｃａｇｃｔａｔｇｇｔａｔｃａｇｃｔｇｇｇｔｇｃｇａｃａｇｇｃｃｃｃｔｇｇａｃａｃｇｇｇｃｔｔｇａｇｔｇｇａｔｇｇｇａｔｇｇａｔｃａｇｃｇｃｔｔａｃａａｔｇｇｔｔａｃａｃａａａｃｔａｔｇｃａｃａｇａａｇｃｔｃｃａｇｇｇｃａｇｇｇｔｃａｃｃａｔｇａｃｃａｃａｇａｃａｃａｔｃｃａｃｇａｇｃａｃａｇｃｃｔａｃａｔｇｇａｇｃｔｇａｇｇａｇｃｃｔｇａｇａｔｃｔｇａｃｇａｃａｃｇｇｃｃｇｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｇｃｇａｇａｇａｔｃｔｇａｇａｇｇａａｃｔａａｃｔａｃｔｔｔｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇａａｃｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａｇｃｃｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａａｇｃｇｔｇｔｔｃｃｃｔｃｔｇｇｃｃｃｃｃａｇｃａｇｃａａｇａｇｃａｃａｔｃｔｇｇｃｇｇａａｃａｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｇａａａｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａｇｃｃｃｇｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｃｔｇｇａａｃｔｃｔｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｔｃｃａｇｃｃｇｔｇｃｔｇｃａｇａｇｃａｇｃｇｇｃｃｔｇｔａｃａｇｃｃｔｇｔｃｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｃｔａｃａｔｃｔｇｃａａｃｇｔｇａａｃｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇｃｇｇｇｔｇｇａａｃｃｃａａｇａｇｃｔｇｃｇａｃａａｇａｃｃｃａｃａｃｃｔｇｔｃｃｃｃｃｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇａａｃｔｇｃｔｇｇｇｃｇｇａｃｃｃｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃａａａｇｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃａｇｃｃｇｇａｃｃｃｃｃｇａａｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇｔｃｃｃａｃｇａｇｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｇａａｇｔｔｃａａｔｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａａｇｔｇｃａｃａａｃｇｃｃａａｇａｃｃａａｇｃｃｃａｇａｇａｇｇａａｃａｇｔａｃａａｃａｇｃａｃｃｔａｃｃｇｇｇｔｇｇｔｇｔｃｃｇｔｇｃｔｇａｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａａｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔｇｃｔｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｃｃｇｃｇａｇｃｃｔｃａｇｇｔｇｔａｃａｃａｃｔｇｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｇｇｇａａｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇａｃｃｔｇｔｃｔｇｇｔｇａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｔａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａａｔｇｇｇａｇａｇｃａａｃｇｇａｃａｇｃｃｃｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｃｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔａｃｔｃｔｃｇｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃｃｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇａａａｃｇｔｇｔｔｃａｇｃｔｇｃａｇｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇａａｇｔｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇａｇｃｃｃｃｇｇｇａａｇｔｇａ
＞配列番号２０８
ＥＭ−１ ｍＡｂ Ｌ２ ｃＤＮＡ ｐＤＲ００００１６５８４
ｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇｔｃｃｃｃｃｔｃｃｔｃｃｇｔｇｔｃｃｇｃｃｔｃｔｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇａｇｔｇａｃｃａｔｃａｃｃｔｇｔｃｇｇｇｃｃｔｃｃｃａｇｇｇｃａｔｃｔｃｃａａｃｔｇｇｃｔｇｇｃｃｔｇｇｔｔｃｃａｇｃａｃａａｇｃｃｃｇｇｃａａｇｇｃｃｃｃｃａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃｇｃｃｇｃｃｔｃｃｔｃｃｃｔｇｃｔｇｔｃｃｇｇｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇａｔｔｃｔｃｃｇｇｃｔｃｔｇｇｃｔｃｃｇｇｃａｃｃｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃａｃｃｔａｃｔａｃｔｇｃｃａｇｃａｇｇｃｃａａｃｔｃｃｔｔｃｃｃｃａｔｃａｃｃｔｔｃｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃｇｇｃｔｇｇａａａｔｃａａｇｃｇｔａｃｇｇｔｇｇｃｃｇｃｔｃｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃｃａｇｃｇａｃｇａｇｃａｇｃｔｇａａｇａｇｃｇｇｃａｃｃｇｃｃａｇｃｇｔｇｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｃａａｃｔｔｃｔａｃｃｃｃｃｇｇｇａｇｇｃｃａａｇｇｔｇｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｃａａｃｇｃｃｃｔｇｃａｇａｇｃｇｇｃａａｃａｇｃｃａｇｇａｇａｇｃｇｔｃａｃｃｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃｔｃｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｇａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｃｃｔｇｔｃｃａａｇｇｃｃｇａｃｔａｃｇａｇａａｇｃａｃａａｇｇｔｇｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａｇｇｔｇａｃｃｃａｃｃａｇｇｇｃｃｔｇｔｃｃａｇｃｃｃｃｇｔｇａｃｃａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇｃｇａｇｔｇｃｔｇａ
＞配列番号２０９
Ｇｐ１２０軽鎖
Ｅｉｖｌｔｑｓｐｇｔｌｓｌｓｐｇｅｒａｔｆｓｃｒｓｓｈｓｉｒｓｒｒｖａｗｙｑｈｋｐｇｑａｐｒｌｖｉｈｇｖｓｎｒａｓｇｉｓｄｒｆｓｇｓｇｓｇｔｄｆｔｌｔｉｔｒｖｅｐｅｄｆａｌｙｙｃｑｖｙｇａｓｓｙｔｆｇｑｇｔｋｌｅｒｋｒｔｖａａｐｓｖｆｉｆｐｐｓｄｅｑｌｋｓｇｔａｓｖｖｃｌｌｎｎｆｙｐｒｅａｋｖｑｗｋｖｄｎａｌｑｓｇｎｓｑｅｓｖｔｅｑｄｓｋｄｓｔｙｓｌｓｓｔｌｔｌｓｋａｄｙｅｋｈｋｖｙａｃｅｖｔｈｑｇｌｓｓｐｖｔｋｓｆｎｒｇｅｃ
＞配列番号２１０
Ｅ１ ＨＣ１ ＨＣＤＲ１
ＴＹＧＭＨ
＞配列番号２１１
Ｅ１ ＨＣ１ ＨＣＤＲ２
ＶＩＷＤＤＧＳＹＫＹＹＧＤＳＶＫＧ
＞配列番号２１２
Ｅ１ ＨＣ１ ＨＣＤＲ３
ＤＧＩＴＭＶＲＧＶＭＫＤＹＦＤＹ
＞配列番号２１３
Ｅ１ ＬＣ１ ＬＣＤＲ１
ＲＡＳＱＤＩＳＳＡＬＶ
＞配列番号２１４
Ｅ１ ＬＣ１ ＬＣＤＲ２
ＤＡＳＳＬＥＳ
＞配列番号２１５
Ｅ１ ＬＣ１ ＬＣＤＲ３
ＱＱＦＮＳＹＰＬＴ
＞配列番号２１６
Ｅ１ ＨＣ２ ＨＣＤＲ１
ＳＹＧＩＳ
＞配列番号２１７
Ｅ１ ＨＣ２ ＨＣＤＲ２
ＷＩＳＡＹＮＧＹＴＮＹＡＱＫＬＱＧ
＞配列番号２１８
Ｅ１ ＨＣ２ ＨＣＤＲ３
ＤＬＲＧＴＮＹＦＤＹ
＞配列番号２１９
Ｅ１ ＬＣ２ ＬＣＤＲ１
ＲＡＳＱＧＩＳＮＷＬＡ
＞配列番号２２０
Ｅ１ ＬＣ２ ＬＣＤＲ２
ＡＡＳＳＬＬＳ
＞配列番号２２１
Ｅ１ ＬＣ２ ＬＣＤＲ３
ＱＱＡＮＳＦＰＩＴ
＞配列番号２２２
Ｅ２ ｍＡＢ ＨＣ１ ＨＣＤＲ１
ＳＹＷＭＮ
＞配列番号２２３
Ｅ２ ｍＡｂ ＨＣ１ ＨＣＤＲ２
ＮＩＫＫＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ
＞配列番号２２４
Ｅ２ ｍＡｂ ＨＣ１ ＨＣＤＲ３
ＤＬＧＷＧＷＧＷＹＦＤＬ
＞配列番号２２５
Ｅ２ ｍＡＢ ＬＣ１ ＬＣＤＲ１
ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ
＞配列番号２２６
Ｅ２ ｍＡｂ ＬＣ１ ＬＣＤＲ２
ＤＡＳＮＲＡＴ
＞配列番号２２７
Ｅ２ ｍＡｂ ＬＣ１ ＬＣＤＲ３
ＱＱＲＳＮＷＰＰＴ
＞配列番号２２８
Ｅ２ ｍＡＢ ＨＣ２ ＨＣＤＲ１
ＤＹＹＭＹ
＞配列番号２２９
Ｅ２ ｍＡｂ ＨＣ２ ＨＣＤＲ２
ＴＩＳＤＤＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ
＞配列番号２３０
Ｅ２ ｍＡｂ ＨＣ２ ＨＣＤＲ３
ＥＧＬＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮＱＤＹ
＞配列番号２３１
Ｅ２ ｍＡＢ ＬＣ２ ＬＣＤＲ１
ＲＡＳＱＧＬＳＳＡＬＡ
＞配列番号２３２
Ｅ２ ｍＡｂ ＬＣ２ ＬＣＤＲ２
ＤＡＳＳＬＥＳ
＞配列番号２３３
Ｅ２ ｍＡｂ ＬＣ２ ＬＣＤＲ３
ＱＱＦＴＳＹＰＱＩＴ
＞配列番号２３４
Ｅ２ ｍＡｂ ＨＣ１（ＥＧＦＲ−Ｆ４０５Ｌ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ ＳＹＷＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮ ＩＫＫＤＧＳＥＫＹＹ
ＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬ ＧＷＧＷＧＷＹＦＤＬ ＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
＞配列番号２３５
Ｅ２ ｍＡｂ ＬＣ１（ＥＧＦＲ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴ ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ ＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳ ＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰ ＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤ ＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡ
ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰ ＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱ ＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫ ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
＞配列番号２３６
Ｅ２ ｍＡｂ ＨＣ２（ｃ−Ｍｅｔ−Ｋ４０９Ｒ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＤＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＥＧＬＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮＱＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
＞配列番号２３７
Ｅ２ ｍＡｂ ＬＣ２（ｃＭｅｔ）
ＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＬＳＳＡＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＴＳＹＰＱＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
＞配列番号２３８
ｍＡｂ ０６９のｃ−Ｍｅｔ不連続エピトープ
ＰＥＦＲＤＳＹＰＩＫＹＶＨＡＦ
＞配列番号２３９
ｍＡｂ ０６９のｃ−Ｍｅｔ不連続エピトープ
ＦＡＱＳＫＰＤＳＡＥＰＭＤＲＳＡ
＞配列番号２４０
５Ｄ５ ｍＡｂエピトープ
ＰＧＡＱＬＡＲＱＩＧＡＳＬＮＤＤ

Claims (65)

  1. 単離された二重特異性上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）／肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）抗体であって、
    ａ）ＨＣ１定常ドメイン３（ＨＣ１ ＣＨ３）及びＨＣ１可変領域１（ＶＨ１）を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、
    ｂ）ＨＣ２定常ドメイン３（ＨＣ２ ＣＨ３）及びＨＣ２可変領域２（ＶＨ２）を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、
    ｃ）軽鎖可変領域（ＶＬ１）を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）と、
    ｄ）軽鎖可変領域（ＶＬ２）を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）と、
    を含み、
    前記ＶＨ１と前記ＶＬ１とが対合してＥＧＦＲと特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、前記ＶＨ２と前記ＶＬ２とが対合してｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成し、前記ＨＣ１が前記ＨＣ１ ＣＨ３に少なくとも１個の置換を含み、前記ＨＣ２が前記ＨＣ２ ＣＨ３に少なくとも１個の置換を含み、前記ＨＣ１ ＣＨ３内の前記置換及び前記ＨＣ２ ＣＨ３内の前記置換が、残基の番号付けがＥＵインデックスに基づいたものである場合に、異なるアミノ酸残基の位置で生じる、二重特異性抗体。
  2. 前記抗体が、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ１９７５又はＳＫＭＥＳ−１細胞株における細胞外シグナル調節キナーゼ１及び２（ＥＲＫ１／２）のリン酸化を阻害し、そのＩＣ50値は、重鎖３（ＨＣ３）及び軽鎖３（ＬＣ３）を含むコントロール一価ＥＧＦＲ抗体と重鎖４（ＨＣ４）及び軽鎖４（ＬＣ４）を含むコントロール一価ｃ−Ｍｅｔ抗体との混合物によるＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ１９７５又はＳＫＭＥＳ−１細胞株におけるＥＲＫ１／２のリン酸化阻害のＩＣ50値と比較した場合に、少なくとも約１０倍低い、少なくとも約２０倍低い、少なくとも約３０倍低い、少なくとも約４０倍低い、少なくとも約５０倍低い、又は少なくとも約６０倍低いＩＣ50値であり、
    前記ＨＣ３と前記ＨＣ１、前記ＬＣ３と前記ＬＣ１、前記ＨＣ４と前記ＨＣ２、及び前記ＬＣ４と前記ＬＣ２が、それぞれ同一のアミノ酸配列を有し、
    前記ＥＲＫ１／２のリン酸化が、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体を捕捉抗体とし、電気化学発光化合物と接合された非リン酸化及びリン酸化ＥＲＫ１／２と結合する抗体を検出抗体として使用したサンドイッチイムノアッセイを用いて全細胞ライセート中で測定される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
  3. 前記抗体が、ＥＲＫ１／２のリン酸化を、約２×１０-9Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、又は約１×１０-10Ｍ以下のＩＣ50値で阻害する、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。
  4. ＥＲＫ１が残基Ｔｈｒ２０２及びＴｙｒ２０４においてリン酸化され、ＥＲＫ２が残基Ｔｈｒ１８５及びＴｙｒ１９７においてリン酸化される、請求項２又は３に記載の二重特異性抗体。
  5. 前記抗体が、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株におけるタンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）のＳｅｒ４７３におけるリン酸化を阻害し、そのＩＣ50値は、前記ＨＣ３及び前記ＬＣ３を含むコントロール一価ＥＧＦＲ抗体と前記ＨＣ４及び前記ＬＣ４を含むコントロール一価ｃ−Ｍｅｔ抗体との混合物によるＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株におけるＡＫＴのＳｅｒ４７３におけるリン酸化の阻害のＩＣ50値と比較した場合に、少なくとも約７０倍低いＩＣ50値であり、
    前記ＨＣ３と前記ＨＣ１、前記ＬＣ３と前記ＬＣ１、前記ＨＣ４と前記ＨＣ２、及び前記ＬＣ４と前記ＬＣ２が、それぞれ同一のアミノ酸配列を有し、
    ＡＫＴのＳｅｒ４７３におけるリン酸化が、非リン酸化又はリン酸化ＡＫＴと結合する抗体を捕捉抗体とし、電気化学発光化合物と接合された抗リン酸化ＡＫＴ Ｓｅｒ４７３抗体を検出抗体として使用したサンドイッチイムノアッセイを用いて全細胞ライセート中で測定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  6. 前記抗体が、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株におけるＡＫＴのＴｈｒ３０８におけるリン酸化を阻害し、そのＩＣ50値は、前記ＨＣ３及び前記ＬＣ３を含むコントロール一価ＥＧＦＲ抗体と前記ＨＣ４及び前記ＬＣ４を含むコントロール一価ｃ−Ｍｅｔ抗体との混合物によるＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株におけるＡＫＴのＴｈｒ３０８におけるリン酸化阻害のＩＣ50値と比較した場合に、少なくとも約１００倍低いＩＣ50値であり、
    前記ＨＣ３と前記ＨＣ１、前記ＬＣ３と前記ＬＣ１、前記ＨＣ４と前記ＨＣ２、及び前記ＬＣ４と前記ＬＣ２が、それぞれ同一のアミノ酸配列を有し、
    前記ＡＫＴのＴｈｒ３０８におけるリン酸化が、非リン酸化又はリン酸化ＡＫＴと結合する抗体を捕捉抗体とし、電気化学発光化合物と接合された抗リン酸化ＡＫＴ Ｔｈｒ３０８抗体を検出抗体として使用したサンドイッチイムノアッセイを用いて全細胞ライセート中で測定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  7. 前記抗体が、ＡＫＴのＳｅｒ４７３又はＴｈｒ３０８におけるリン酸化を約１×１０-9 Ｍ以下のＩＣ50値で阻害する、請求項５又は６に記載の二重特異性抗体。
  8. 前記ＨＣ１、前記ＬＣ１、前記ＨＣ２及び前記ＬＣ２が、それぞれ配列番号１９９、２００、２０１及び２０２のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣ１、前記ＨＣ２、又は前記ＨＣ１及び前記ＨＣ２の両方からＣ末端のリシンが任意に除去されていてもよい、請求項１〜７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  9. 前記二重特異性抗体が、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＥＧＦＲとＥＧＦＲ残基Ｋ４８９、Ｉ４９１、Ｋ４６７及びＳ４９２において結合し、ｃ−Ｍｅｔと残基ＰＥＦＲＤＳＹＰＩＫＹＶＨＡＦ（配列番号２３８）及びＦＡＱＳＫＰＤＳＡＥＰＭＤＲＳＡ（配列番号２３９）において結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  10. 前記抗体が、ＮＣＩ−Ｈ２９２又はＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の増殖を阻害し、そのＩＣ50値は、ＮＣＩ−Ｈ２９２又はＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞が低付着条件で増殖された場合のセツキシマブによるＮＣＩ−Ｈ２９２又はＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の増殖阻害のＩＣ50値と比較した場合に、少なくとも約３００倍低い、少なくとも約４００倍低い、少なくとも約５００倍低い、少なくとも約６００倍低い、少なくとも約７００倍低い、又は少なくとも約８００倍低いＩＣ50値である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  11. 前記抗体が、前記二重特異性抗体とセツキシマブが２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与された場合に、ＳＣＩＤ ＢｅｉｇｅマウスにおけるＨＧＦ発現ＳＫＭＥＳ−１細胞腫瘍の増殖を、セツキシマブと比較して３６日目に少なくとも５００倍低いＴ／Ｃ値（％）で阻害する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  12. 前記抗体が、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を無効にする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  13. 前記ＨＣ１及び前記ＨＣ２が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  14. 前記ＨＣ１及び前記ＨＣ２が、ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１３に記載の二重特異性抗体。
  15. 残基の番号付けがＥＵインデックスに基づいたものである場合に、３５０、３６６、３６８、３７０、３９９、４０５、４０７、又は４０９位の残基に、前記ＨＣ１ ＣＨ３が少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、又は８個の置換を含み、前記ＨＣ２ ＣＨ３が少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、又は８個の置換を含む、請求項１３又は１４に記載の二重特異性抗体。
  16. ３５０、３７０、４０５又は４０９位の残基に、前記ＨＣ１ ＣＨ３が少なくとも１個、２個、３個、又は４個の置換を含み、前記ＨＣ２ ＣＨ３が少なくとも１個、２個、３個、又は４個の置換を含む、請求項１５に記載の二重特異性抗体。
  17. ４０５又は４０９位の残基に、前記ＨＣ１ ＣＨ３が少なくとも１個の置換を含み、前記ＨＣ２ ＣＨ３が少なくとも１個の置換を含む、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
  18. 前記ＨＣ１ ＣＨ３が、Ｋ４０９Ｒ又はＦ４０５Ｌの置換を含み、前記ＨＣ２ ＣＨ３が、Ｋ４０９Ｒ又はＦ４０５Ｌの置換を含む、請求項１７に記載の二重特異性抗体。
  19. 前記ＨＣ１ ＣＨ３が前記Ｆ４０５Ｌの置換を含み、前記ＨＣ２ ＣＨ３が前記Ｋ４０９Ｒの置換を含む、請求項１８に記載の二重特異性抗体。
  20. ａ）前記ＶＨ１が、それぞれ配列番号２１０、２１１及び２１２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記ＶＬ１が、それぞれ配列番号２１３、２１４及び２１５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  21. ａ）前記ＶＨ２が、それぞれ配列番号２１６、２１７及び２１８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記ＶＬ２が、それぞれ配列番号２１９、２２０及び２２１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の二重特異性抗体。
  22. 前記ＶＨ１、前記ＶＬ１、前記ＶＨ２及び前記ＶＬ２が、それぞれ配列番号１８９、１９０、１９３及び１９４のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の二重特異性抗体。
  23. ａ）前記ＶＨ１が、それぞれ配列番号２２２、２２３及び２２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記ＶＬ１が、それぞれ配列番号２２５、２２６及び２２７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、請求項１〜７又は請求項９〜１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  24. ａ）前記ＶＨ２が、それぞれ配列番号２２８、２２９及び２３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記ＶＬ２が、それぞれ配列番号２３１、２３２及び２３３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の二重特異性抗体。
  25. 前記ＶＨ１、前記ＶＬ１、前記ＶＨ２及び前記ＶＬ２が、それぞれ配列番号１９１、１９２、１９５及び１９６のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の二重特異性抗体。
  26. 前記ＨＣ１、前記ＬＣ１、前記ＨＣ２及び前記ＬＣ２が、それぞれ配列番号２３４、２３５、２３６及び２３７のアミノ酸配列を含む、前記ＨＣ１、前記ＨＣ２、又は前記ＨＣ１及び前記ＨＣ２の両方からＣ末端のリシンが任意に除去されていてもよい、請求項２５に記載の二重特異性抗体。
  27. 前記ＨＣ１、前記ＬＣ１、前記ＨＣ２及び前記ＬＣ２に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の保存的アミノ酸置換を更に含む、請求項２２又は２６に記載の二重特異性抗体。
  28. 前記ＨＣ１及び／又は前記ＨＣ２に置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含み、残基の番号付けがＥＵインデックスに基づくものである、請求項２７に記載の二重特異性抗体。
  29. 前記抗体が、フコース含量が約１％〜約１５％の二分枝型グリカン構造を有する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  30. 前記ＨＣ１、前記ＬＣ１、前記ＨＣ２及び前記ＬＣ２が、それぞれ配列番号２０５、２０６、２０７及び２０８の配列を含む合成ポリヌクレオチドによりコードされている、請求項２に記載の二重特異性抗体。
  31. 請求項８又は２６に記載の前記ＨＣ１、前記ＬＣ１、前記ＨＣ２及び前記ＬＣ２をコードする、単離された合成ポリヌクレオチド。
  32. 配列番号２０５、２０６、２０７又は２０８のポリヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  33. 請求項３１又は３２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  34. 請求項３３に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
  35. 請求項８に記載の単離された二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を生成する方法であって、
    ａ）配列番号１９９の２本の重鎖及び配列番号２００の２本の軽鎖を含む単離された一重特異性二価抗ＥＧＦＲ抗体と、配列番号２０１の２本の重鎖及び配列番号２０２の２本の軽鎖を含む単離された一重特異性二価抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と、を約１：１のモル比の混合物として加え合わせることと、
    ｂ）前記混合物中に還元剤を導入することと、
    ｃ）前記混合物を約９０分〜約６時間インキュベートすることと、
    ｄ）前記還元剤を除去することと、
    ｅ）配列番号１９９の第１の重鎖及び配列番号２０１の第２の重鎖、並びに配列番号２００の第１の軽鎖及び配列番号２０２の第２の軽鎖を含む二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体を精製することと、
    を含み、
    配列番号１９９の前記第１の重鎖が配列番号２００の前記第１の軽鎖と対合してＥＧＦＲと特異的に結合する第１の結合ドメインを形成し、配列番号２０１の前記第２の重鎖が配列番号２０２の前記第２の軽鎖と対合してｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する第２の結合ドメインを形成する、方法。
  36. 前記還元剤が、２−メルカプトエタノールアミン（２−ＭＥＡ）である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記２−ＭＥＡが、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度で存在する、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記インキュベートする工程が、約２５℃〜約３７℃の温度で行われる、請求項３７に記載の方法。
  39. 請求項１〜３０のいずれかに記載の二重特異性抗体と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  40. 癌を有する対象を治療する方法であって、請求項２、８又は２６に記載の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体の治療上の有効量を、治療を要する患者に癌を治療するのに充分な時間にわたって投与することを含む、方法。
  41. 前記癌が、ＥＧＦＲ活性化変異、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅、循環中のＨＧＦレベルの増大、ｃ−Ｍｅｔ活性化変異、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子の増幅、又は変異体ＫＲＡＳに関連している、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ＥＧＦＲ活性化変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸）、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ又はＴ７９０Ｍの置換、Ｅ７４６〜Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８〜Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６とＡ７６７との間のＡｌａ（Ａ）の挿入、Ｓ７６８とＶ７６９との間のＳｅｒ、Ｖａｌ及びＡｌａ（ＳＶＡ）の挿入、並びにＰ７７２とＨ７７３との間のＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ＥＧＦＲ活性化変異が、Ｌ８５８Ｒ、ｄｅｌ（Ｅ４７６，Ａ７５０）及び／又はＴ７９０Ｍの置換である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記変異体ＫＲＡＳが、Ｇ１２Ｖ又はＧ１２Ｃの置換を有する、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記変異体ＫＲＡＳが、Ｇ１２Ｖの置換を有する、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記対象が、エルロチニブ、ゲフィニチブ、アファチニブ、ＣＯ−１６８６、ＡＺＤ９１９２又はセツキシマブによる治療に対する耐性を有するか又は耐性を獲得している、請求項４１に記載の方法。
  47. 前記癌が、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、小細胞肺癌、大腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頸部癌、咽頭癌、鼻の癌、膵臓癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、腟癌、子宮頸癌、脾臓の癌、睾丸癌、胃癌、胸腺の癌、結腸癌、甲状腺癌、肝臓癌、肝細胞癌（ＨＣＣ））、又は散発性若しくは遺伝性乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）である、請求項４１に記載の方法。
  48. 前記対象が、ＣＤ１６の１５８位のフェニルアラニンについてホモであるか、又はＣＤ１６の１５８位のバリン及びフェニルアラニンについてヘテロである、請求項４０に記載の方法。
  49. 第２の治療薬を投与することを含む、請求項４７に記載の方法。
  50. 前記第２の治療薬が、化学療法薬又は標的抗癌治療薬である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記化学療法薬が、シスプラチン又はビンブラスチンである、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記化学療法薬又は前記標的抗癌治療薬が、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４又はＶＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記チロシンキナーゼ阻害剤が、エルロチニブ、ゲフィチニブ、又はアファチニブである、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記第２の治療薬が、同時、逐次、又は別々に投与される、請求項４９に記載の方法。
  55. ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔを発現する細胞の成長又は増殖を阻害する方法であって、前記細胞を請求項２、８又は２６に記載の二重特異性抗体と接触させることを含む、方法。
  56. 対象のＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍又は癌細胞の増殖又は転移を阻害する方法であって、前記対象に、有効量の請求項２、８又は２６に記載の二重特異性抗体を投与して、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍又は癌細胞の増殖又は転移を阻害することを含む、方法。
  57. 前記ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍が、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、小細胞肺癌、大腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頸部癌、咽頭癌、鼻の癌、膵臓癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、腟癌、子宮頸癌、脾臓の癌、睾丸癌、胃癌、胸腺の癌、結腸癌、甲状腺癌、肝臓癌、肝細胞癌（ＨＣＣ））、又は散発性若しくは遺伝性乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）である、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍が、ＥＧＦＲ活性化変異、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅、循環中のＨＧＦレベルの増大、ｃ−Ｍｅｔ活性化変異、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子の増幅、又は変異体ＫＲＡＳに関連している、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記ＥＧＦＲ活性化変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸）、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ又はＴ７９０Ｍの置換、Ｅ７４６〜Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８〜Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６とＡ７６７との間のＡｌａ（Ａ）の挿入、Ｓ７６８とＶ７６９との間のＳｅｒ、Ｖａｌ及びＡｌａ（ＳＶＡ）の挿入、並びにＰ７７２とＨ７７３との間のＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記ＥＧＦＲ活性化変異が、Ｌ８５８Ｒ、ｄｅｌ（Ｅ４７６，Ａ７５０）及び／又はＴ７９０Ｍの置換である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記変異体ＫＲＡＳがＧ１２Ｖ又はＧ１２Ｃの置換を有する、請求項５８に記載の方法。
  62. 前記変異体ＫＲＡＳがＧ１２Ｖの置換を有する、請求項６１に記載の方法。
  63. 治療のための、請求項１〜３０のいずれかに記載の二重特異性抗体の使用。
  64. 癌の治療において使用するための、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  65. 前記癌が、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、小細胞肺癌、大腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頸部癌、咽頭癌、鼻の癌、膵臓癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、腟癌、子宮頸癌、脾臓の癌、睾丸癌、胃癌、胸腺の癌、結腸癌、甲状腺癌、肝臓癌、肝細胞癌（ＨＣＣ））、又は散発性若しくは遺伝性乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）である、請求項６４に記載の使用のための請求項１〜３０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
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