JP2016128405A - Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 - Google Patents
Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016128405A JP2016128405A JP2015237469A JP2015237469A JP2016128405A JP 2016128405 A JP2016128405 A JP 2016128405A JP 2015237469 A JP2015237469 A JP 2015237469A JP 2015237469 A JP2015237469 A JP 2015237469A JP 2016128405 A JP2016128405 A JP 2016128405A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- cytotoxic
- epitope
- carbon atoms
- alkenyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
- A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4727—Mucins, e.g. human intestinal mucin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
- C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Abstract
Description
[01] 本出願は、米国仮特許出願60/488,447(2003年7月21日出願)による優先権を主
張する。
[02] 本発明は、ネズミ抗CA6グリコトープ(glycotope)モノクローナル抗体、お
よびそのヒト化またはリサーフェシング(表面再建)した(resurfaced)バージョンに関する。本発明はまた、前記の抗CA6グリコトープモノクローナル抗体のエピトープ結合フラグメント、および前記の抗CA6グリコトープモノクローナル抗体のヒト化またはリサーフェシングしたバージョンのエピトープ結合フラグメントに関する。
[04] 周囲の癌以外の細胞および組織に害を与えることなく標的癌細胞を特異的に破壊する抗癌療法薬を開発する試みは多数あった。そのような療法薬は、ヒト患者の癌療法を大幅に改良する可能性をもつ。
;Ghose et al., Targeted Drugs 1-22(E. Goldberg編, 1983);Diener et al., Antibody mediated delivery systems 1-23(J. Rodwell編, 1988);Pietersz et al., Antibody mediated delivery systems 25-53(J. Rodwell編, 1988);Bumol et al., Antibody mediated delivery systems 55-79(J. Rodwell編, 1988))。細胞結合剤の選択によ
り、癌細胞表面に発現する分子の発現プロフィールに基づいて特定のタイプの癌細胞のみを認識して結合するようにこれらの細胞毒性コンジュゲートを設計できる。
et al., 2 Appl. Biochem. 25-35 (1980);Manabi et al., 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1985);Dillman et al., 46 Cancer Res. 4886-4891 (1986);Shoval et al., 85
Proc. Natl. Acad. Sci. 8276-8280 (1988))、またはポリグルタミン酸(Tsukada et al., 73 J. Natl. Canc. Inst. 721-729 (1984);Kato et al., 27 J. Med. Chem. 1602-1607 (1984);Tsukada et al., 52 Br. J. Cancer 111-116 (1985))。
[09] そのために本発明は、癌細胞表面に発現した分子/受容体を認識して結合する抗体の開発、ならびに抗体などの細胞結合剤および細胞毒性物質を含む、癌細胞表面に発現した分子/受容体を特異的にターゲティングする新規な細胞毒性コンジュゲートの開発を目的とする。
[11] 本発明は、Muc1ムチン受容体の新規なCA6シアログリコトープを特異的に認識して結合する抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む。他の態様において本発明は、Muc1ムチン受容体の新規なCA6シアログリコトープ(”CA6グリコトープ”)を認識するヒト化抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む。
特異的な細胞毒性をもつプロドラッグを形成できる。したがって、そのような抗体および低分子高毒性薬物(たとえばメイタンシノイド類、タキサン(taxane)類、およびCC−1065類似体)を含む細胞毒性コンジュゲートを、腫瘍、たとえば胸部腫瘍および卵巣腫瘍の処置のための療法薬として使用できる。
[15] SEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:8により表わされるアミノ酸配列:
[16] 同様に、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、またはSEQ ID NO:11により表わされるアミノ酸配列:
[17] 他の態様においては、SEQ ID NO:8:
[18] 同様に、それぞれSEQ ID NO:10、またはSEQ ID NO:11:
[19] 本発明のヒト化DS6抗体およびそのエピトープ結合フラグメントは、L鎖および/またはH鎖アミノ酸残基の1以上の位置(表1の星印の残基により定められる)における置換をも含むことができる。これらの位置は、ヒト残基に交換する必要のあるネズミ表面フレームワーク残基であって、CDRから5Å以内にある残基を表わす。たとえば、ネズミ配列(SEQ ID NO:7)の第1アミノ酸残基Qは、抗体をヒト化するためにEに置換された(SEQ ID NO:8)。しかし、この残基はCDRに近接するので、抗体の親和性を維持するためにネズミ残基Qへの復帰変異が必要となる可能性がある。
細胞毒性コンジュゲートは有効な殺細胞薬を形成する。
C−1065類似体である。
[24] より好ましくは、細胞結合剤はヒト化した抗CA6抗体DS6であり、細胞毒性物質はメイタンシン化合物、たとえばDM1またはDM4である。
[27] 本発明はさらに、本発明の療法用組成物を用いて癌を伴う対象を処置する方法を含む。好ましい態様において、細胞毒性コンジュゲートは抗CA6抗体および細胞毒性物質を含む。より好ましい態様において、細胞毒性コンジュゲートはヒト化DS6抗体−DM1コンジュゲート、ヒト化DS6抗体−DM4コンジュゲート、またはヒト化DS6抗体−タキサンコンジュゲートを含み、このコンジュゲートを医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤と共に投与する。
質もしくは療法薬と組み合わせて投与することにより、癌を伴う対象を処置する方法をも提供する。癌は、たとえば胸部癌(乳癌)、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、骨肉腫、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌、膵臓癌、CA6を発現する肉腫もしくは癌、またはCA6グリコトープを主に発現する他の癌であってまだ判定されていないもののうち1種類以上であってよい。
[62] 本発明は、特に抗CA6モノクローナル抗体、抗CA6ヒト化抗体、および抗CA6抗体フラグメントを提供する。本発明の抗体および抗体フラグメントはそれぞれ、細胞表面のCA6グリコトープを特異的に認識して結合するように設計される。多くのヒト腫瘍がCA6を発現することが知られている:漿液性卵巣癌の95%、子宮内膜様卵巣癌の50%、子宮頸部の新生物の50%、子宮内膜の新生物の69%、外陰の新生物の80%、胸部癌の60%、膵臓腫瘍の67%、および尿路上皮の腫瘍の48%;しかし、正常なヒト組織が発現することは稀である。
エピトープが存在するタンパク質はCA6エピトープを含むN−結合炭水化物をもつ80kDaのタンパク質であると誤って同定した;その際、彼らはハイブリドーマ上清を同定に用いた。その後、本発明者らは精製したDS6を用いて、CA6エピトープは250kDaを超える非ジスルフィド結合−糖タンパク質のO−結合炭水化物上にあることを立証した。さらに、この糖タンパク質をムチンMuc1と同定した。異なるMuc1対立遺伝
子は可変数タンデム反復配列(VNTR)ドメインに異なる数のタンデム反復配列をもつので、細胞はしばしばサイズの異なる2つの別個のMuc1タンパク質を発現する(Taylor-Papadimitriou, Biochim. Biophys. Acta 1455 (2-3): 301-13 (1999))。VNTRドメインの反復数の相異およびグリコシル化の相異のため、Muc1の分子量は細胞系毎に異なる。
ことは、CA6がシアル酸依存性グリコトープ、すなわち”シアログリコトープ”であることを示す。
細胞結合剤
[71] 療法薬としての本発明化合物の有効性は、適切な細胞結合剤を慎重に選択することに依存する。細胞結合剤は、現在知られている、または将来知られる、いかなる種類であってもよく、これにはペプチドおよび非ペプチドが含まれる。細胞結合剤は、細胞を特異的または非特異的に結合しうるいかなる化合物であってもよい。一般に、これらは抗体(特にモノクローナル抗体)、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、ビタミン、栄養輸送分子(たとえばトランスフェリン)、または他のいずれかの細胞結合性の分子もしくは物質であってよい。
(a)ポリクローナル抗体;
(b)モノクローナル抗体;
(c)抗体のフラグメント、たとえばFab、Fab’、およびF(ab’)2、Fv(Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983);Spring et al., J. Immunol. 113: 470-478 (1974);Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (1960));
(d)インターフェロン(たとえばα、β、γ);
(e)リンホカイン、たとえばIL−2、IL−3、IL−4、IL−6;
(f)ホルモン、たとえばインスリン、TRH(チロトロピン放出ホルモン)、MSH(メラニン細胞刺激ホルモン)、ステロイドホルモン、たとえばアンドロゲンおよびエストロゲン;
(g)増殖因子、たとえばコロニー刺激因子、たとえばEGF、TGF−α、FGF、VEGF、G−CSF、M−CSFおよびGM−CSF(Burgess, Immunology Today 5: 155-158 (1984));
(h)トランスフェリン(O'Keefe et al., J. Biol. Chem. 260: 932-937 (1985));ならびに
(i)ビタミン、たとえば葉酸類。
[73] 適切な細胞結合剤の選択は、標的とする個々の細胞集団に依存する事項であるが、適切な抗体を入手または調製できれば一般に抗体が好ましく、モノクローナル抗体がより好ましい。
の場合βシート構造をとり、各フレームワーク領域は3つのCDRにより連結し、CDRはβシート構造を連結するループを形成し、場合によりβシート構造の一部を形成する。各鎖中のCDRはフレームワーク領域によって近接した状態に保持され、他方の鎖のCDRと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(E.A.Kabat et al., Sequences of
Immunological Interest, 第5版, 1991, NIH)。
ヒト化またはリサーフェシングしたDS6抗体
[78] 好ましくは、ヒト化した抗CA6抗体を本発明の細胞結合剤として使用する。そのようなヒト化抗体の好ましい態様は、ヒト化DS6抗体またはそのエピトープ結合フラグメントである。
の全体を本明細書に援用する。要約すると、好ましい方法においては、(1)抗体H鎖およびL鎖可変部プールの位置アラインメントを作成して、H鎖およびL鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組の位置を求め、その際すべての可変部についてのアラインメント位置が少なくとも約98%同一であり;(2)げっ歯類の抗体(またはそのフラグメント)について、H鎖およびL鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基を決定し;(3)げっ歯類の表面露出した一組のアミノ酸残基に最も近い同一性を有する、H鎖およびL鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基を同定し;(4)工程(2)で決定した、H鎖およびL鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基において、げっ歯類抗体の相補性決定領域のいずれかの残基のいずれかの原子から5Å以内にあるアミノ酸残基以外を、工程(3)で決定したH鎖およびL鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基で置換し;こうして(5)結合特異性をもつヒト化したげっ歯類抗体を製造する。
(veneering)またはリサーフェシング(EP 0 592 106;EP 519 596;Padlan E.A., 1991, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498;Studnika G.M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814;Roguska M.A. et al., 1994, PNAS 91: 969-973)、および連鎖シャフリング(USP 5,565,332)。ヒト抗体は、ファージディスプレー法を含めた多様
な既知方法により調製できる。USP 4,444,887、4,716,111、5,545,806、および5,814,318;ならびに国際特許出願公開WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO
96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741も参照(これらの参考文献の全体を本明細
書に援用する)。
[87] H鎖CDRをAbMモデリングソフトウェアにより決定すると、それらはSEQ
ID NO:20〜22:
[88] 同態様において、ヒト化抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、SEQ
ID NO:4〜6により表わされるアミノ酸配列:
[89] SEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:8により表わされるアミノ酸配列:
[90] 同様に、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、またはSEQ ID NO:11により表わされるアミノ酸配列:
[91] 他の態様においては、SEQ ID NO:8:
[92] 同様に、それぞれSEQ ID NO:10、またはSEQ ID NO:11:
[93] 本発明のヒト化抗体およびそのエピトープ結合フラグメントは、muDS6の結合親和性および特異性を保持するために、L鎖および/またはH鎖可変部のCDRに近接するヒト表面アミノ酸残基の1以上の位置において、対応する表1の星印の残基(Kabat番号表示)により定められるmuDS6表面残基で交換されたバージョンをも含む。
[98] 本発明の抗体には、前記に述べた全長抗体およびエピトープ結合フラグメントの両方が含まれる。本明細書中で用いる”抗体フラグメント”には、全長抗体が認識するエピトープに結合する能力を保持する抗体部分がいずれも含まれ、一般に”エピトープ結合フラグメント”と呼ばれる。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab’およびF(ab’)2、Fd、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(dsFv)、ならびにVLまたはVH領域を含むフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。一本鎖抗体を含めたエピトープ結合フラグメントは、可変部(1以上)を単独で、または下記のものの全体もしくは一部と組み合わせて含むことができる:ヒンジ部、CH1、CH2、およびCH3ドメイン。
)またはペプシン(F(ab’)2フラグメント)などの酵素を用いるタンパク質分解開裂により調製することができる。
も1つのフラグメントに連結した抗体H鎖可変部(VH)の少なくとも1つのフラグメントを含む、エピトープ結合フラグメントである。リンカーは、一本鎖抗体フラグメントが由来する全抗体の標的分子結合特異性を維持するように、(VL)および(VH)領域が連結した際にそれらの適正な三次元フォールディングが確実に起きるように選択された短かいフレキシブルペプチドであってよい。(VL)または(VH)配列のカルボキシル末端は、相補的な(VL)または(VH)配列のアミノ酸末端に、リンカーにより共有結合していてもよい。
1つの可変部または相補性決定領域(CDR)をもつが、これらの抗体の定常ドメインの一部または全部を欠如する、アミノ酸配列を含む。これらの定常ドメインは抗原結合には必要ないが、全抗体の構造の主要部分を構成する。したがって一本鎖抗体フラグメントは、定常ドメインの一部または全部を含む抗体の使用に伴う問題の一部を克服することができる。たとえば一本鎖抗体フラグメントは、生体分子とH鎖定常部の不都合な相互作用または他の目的外の生物活性がないという傾向をもつ。さらに、一本鎖抗体フラグメントは全抗体よりかなり小さく、したがって毛管透過性が全抗体より大きいので、一本鎖抗体フラグメントはより効率的に標的抗原結合部位に局在化して結合することができる。また、抗体フラグメントは原核細胞において比較的大規模に産生することができ、したがってそれらの製造が容易になる。さらに、相対的に小さいサイズの一本鎖抗体フラグメントは、全抗体よりレシピエントにおいて免疫反応を誘発する可能性がより少ない。
ディスプレーライブラリー、またはこれらに類する方法で調製できる。これらのタンパク質は、たとえば真核細胞、または細菌を含めた原核細胞において産生できる。本発明のエピトープ結合フラグメントは、当技術分野で既知の種々のファージディスプレー法によっても調製できる。ファージディスプレー法では、機能性抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に、機能性抗体ドメインを表示させる。特に、そのようなファージを用いて、レパトアまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー(たとえばヒトまたはネズミ)から発現するエピトープ結合ドメインを表示させることができる。目的抗原を結合するエピトープ結合ドメインを発現するファージを、抗原により、たとえば固体表面またはビーズに結合または捕獲させた標識抗原により、選択または同定することができる。これらの方法に用いるファージは一般に、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質のいずれかに組換え融合させたFab、Fvまたはジスルフィド安定化Fv抗体ドメインをもつファージから発現させたfdおよびM13結合ドメインを含む、繊維状ファージである。
ー法の例には、下記に開示されるものが含まれる;
[105] ファージを選択した後、前記フラグメントをコードするファージ領域を単離し
、選択した宿主(哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む)において、たとえば下記に詳述する組換えDNA法で発現させることにより、エピトープ結合フラグメントを製造できる。たとえば、下記に開示される当技術分野で既知の方法によりFab、Fab’およびF(ab’)2フラグメントを組換え製造する技術も使用できる;国際特許出願公開WO 92/22324;Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6): 864-869;Sawai et al., 1995, AJRI 34: 26-34;およびBetter et al., 1988, Science 240: 1041-1043;これらの参考文献の全体を本明細書に援用する。一本鎖Fvおよび抗体を製造
するために使用できる技術の例には、USP 4,946,778および5,258,498;Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203: 46-88;Shu et al., 1993, PNAS 90: 7995-7999;Skerra et al., 1988, Science 240: 1038-1040に記載のものが含まれる。
[106] 本発明には、抗CA6抗体およびヒト化した抗CA6抗体の機能均等物も含ま
れる。用語”機能均等物”には、たとえば相同配列をもつ抗体、キメラ抗体、人工抗体および修飾抗体が含まれ、その際、機能均等物はそれぞれ、CA6に結合する能力により規定される。”抗体フラグメント”と呼ばれる分子グループと”機能均等物”と呼ばれるグループに重複があることは、当業者に理解されるであろう。機能均等物を製造する方法は、たとえば国際特許出願公開WO 93/21319;欧州特許出願239,400;国際特許出願公開WO 89/09622;欧州特許出願338,745;および欧州特許出願EP 332,424に開示されており、これらそれぞれの全体を本明細書に援用する。
のアミノ酸配列との配列相同性をもつアミノ酸配列を有する抗体である。好ましくは、相同性は本発明の抗CA6抗体およびヒト化した抗CA6抗体の可変部のアミノ酸配列との相同性である。本明細書中のアミノ酸配列に適用する”配列相同性”は、たとえばPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988)によるFASTA検索法により判定して、他のアミノ酸配列との少なくとも約90%、91%、92%、93
%、または94%の配列相同性、より好ましくは少なくとも約95%、96%、97%、98%、または99%の配列相同性をもつ配列と定義される。
るものである。たとえばネズミモノクローナル抗体に由来する可変部をもつ抗体をヒト免疫グロブリン定常部と対合させる。キメラ抗体の作製方法は当技術分野で既知である。たとえばMorrison, 1985, Science 229: 1202;Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214;Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: 191-202;USP 5,807,715;4,816,567;および4,816,397を参照;それらの全体を本明細書に援用する。
ムワークドメイン中へ置換することにより作製できる;たとえば国際特許出願公開WO 92/22653を参照。ヒト化キメラ抗体は、実質的または全体的に、対応するヒト抗体領域に由
来する定常部および相補性決定領域(CDR)以外の可変部と、実質的または全体的にヒト以外の哺乳動物に由来するCDRをもつ。
ラボディーおよびmruが含まれる(Winter, G. and Milstein, C., 1991, Nature 349:
293-299;Hudson, P.J., 1999, Current Opinion in Immunology 11: 548-557による概
説を参照);これらはそれぞれ抗原結合能をもつ。一本鎖Fvフラグメント(scFv)の場合、抗体のVHおよびVLドメインがフレキシブルペプチドにより連結される。一般にこのリンカーペプチドはアミノ酸残基約15個の長さである。リンカーがこれよりはるかに小さく、たとえばアミノ酸5個の場合、ジアボディーが形成され、これは二価scFv二量体である。リンカーをアミノ酸残基3個未満に短かくすると、トリアボディーおよびテトラボディーと呼ばれる三量体および四量体構造が形成される。抗体の最小結合単位は、CDR、一般にH鎖のCDR2であり、これは別個に使用できるのに十分な特異的認識能および結合能をもつ。そのようなフラグメントは、分子認識単位、すなわちmruと呼ばれる。そのようなmru数個を短かいリンカーペプチドで結合させ、したがって1個のmruより高いアビディティーをもつ人工的な結合タンパク質を形成することができる。
を共有結合させることにより修飾された抗体も含まれる。たとえば修飾抗体には、たとえばグリコシル化、ペジル化(pegylation)、リン酸化、アミド化、既知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解開裂、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への結合などにより修飾された抗体が含まれる。共有結合は抗体が抗イディオタイプ応答を発するのを妨げない。これらの修飾は既知の方法により実施でき、これには特異的な化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが含まれるが、これらに限定されない。さらに、修飾抗体は1以上の非古典アミノ酸を含むことができる。
換することにより製造できる。たとえば異なるH鎖の置換により、特定の一組のCDRについて異なるクラスの抗体が得られ、これによりたとえばIgG1−4、IgM、IgA1−2、IgD、IgE抗体タイプおよびイソタイプを製造することができる。同様に、特定の一組のCDRを完全合成フレームワーク内に埋め込むことにより、本発明の範囲に含まれる人工抗体を製造できる。
を囲む可変部および/または定常部の配列内における変異、欠失および/または挿入によって容易に製造できる。
可能な、CA6への結合度をもつ分子が含まれる。検出可能な結合度には、CA6へのネズミDS6抗体の結合能の少なくとも10〜100%の範囲、好ましくは少なくとも50%、60%または70%、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%または99%のすべての数値が含まれる。
[115] CDRは、エピトープ認識および抗体結合にとって第1に重要である。しかし
、抗体がそれのコグネイトエピトープを認識して結合する能力を妨げることなく、CDRを構成する残基を交換することができる。たとえばエピトープ認識には影響を与えずにエピトープに対する抗体の結合親和性を高める交換を行うことができる。
り高い親和性で結合する、改良バージョンのネズミおよびヒト両方の抗体が含まれる。
[117] 幾つかの研究は、一次抗体配列の知見に基づいて抗体の配列内の多様な位置に
1以上のアミノ酸交換を導入することが、抗体の特性、たとえば結合および発現レベルに及ぼす影響を探索した(Yang, W.P. et al., 1995, J. Mol. Biol., 254, 392-403;Rader, C. et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 8910-8915;Vaughan, T.J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539)。
カセット変異誘発、誤りがちなPCR、DNAシャフリング、または大腸菌(E.coli)のミューテーター株などの方法で、H鎖およびL鎖遺伝子のCDR1、CDR2、CDR3またはフレームワーク領域の配列を変化させることにより、一次抗体の均等物が形成された(Vaughan, T.J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539;Adey, N.B. et al.,”Phage Display of Peptides and Proteins”,1996, 16章, pp.277-291, 編者Kay, B.K. et al., Academic Press)。一次抗体の配列を変化させるこれらの方法により、二次抗体の親和性が改良された
に記載する抗体配列を用いて、CA6に対する改良された親和性など、改良された機能をもつ抗CA6抗体を開発することができる。
をもつ抗体の選択のための標準法により製造された、改良された特性をもつ抗体も含まれる。
[121] 本発明の細胞毒性コンジュゲートに用いられる細胞毒性物質は、細胞死に至ら
せ、または細胞死を誘発し、または何らかの様式で細胞の生存性を低下させる、いかなる化合物であってもよい。好ましい細胞毒性物質には、たとえば後記に定めるメイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体、タキソイド類、CC−1065およびCC−1065類似体、ドラスタチン(dolastatin)およびドラスタチン類似体が含まれる。これらの細胞毒性物質を、本明細書に開示する抗体、抗体フラグメント、機能均等物、改良された抗体およびそれらの類似体にコンジュゲートさせる。
ドラッグを抗体に結合させるために、連結基を用いる。適切な連結基は当技術分野で周知であり、これにはジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基が含まれる。好ましい連結基は、ジスルフィド基およびチオエーテル基である。たとえばジスルフィド交換反応を用いて、または抗体と薬物またはプロドラッグの間にチオエーテル結合を形成することにより、コンジュゲートを構築できる。
[123] 細胞毒性コンジュゲートを形成するために本発明に使用できる細胞毒性物質に
は、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体が含まれる。適切なメイタンシノイドの例には、メイタンシノール(maytansinol)およびメイタンシノール類似体が含まれ
る。メイタンシノイドは、微小管形成を阻害し、哺乳動物細胞に対して毒性の高い薬物である。
の位置に修飾をもつものが含まれる。そのような適切なメイタンシノイド類は、下記USP
に記載されている:
ものが含まれる:
[126] (1)C−19−デクロロ(USP 4,256,746)(アンサマイトシン(ansamytocin)P2のLAH還元により製造);
[127] (2)C−20−ヒドロキシ(またはC−20−デメチル)+/−C−19−
デクロロ(USP 4,361,650および4,307,016)(ストレプトミセス属(Streptomyces)もしくはアクチノミセス属(Actinomyces)を用いる脱メチル、またはLAHを用いる脱クロ
ロにより製造);および
[128] (3)C−20−デメトキシ,C−20−アシルオキシ(−OCOR)+/−
デクロロ(USP 4,294,757)(塩化アシルを用いるアシル化により製造)。
のが含まれる:
[130] (1)C−9−SH(USP 4,424,219)(メイタンシノールとH2SまたはP2S5の反応により製造);
[131] (2)C−14−アルコキシメチル(デメトキシ/CH2OR)(USP 4,331,5
98);
[132] (3)C−14−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル(CH2OHま
たはCH2OAc)(USP 4,450,254)(ノカルディア属(Nocardia)から製造);
[133] (4)C−15−ヒドロキシ/アシルオキシ(USP 4,364,866)(ストレプトミセス属によるメイタンシノールの変換により製造);
[134] (5)C−15−メトキシ(USP 4,313,946および4,315,929)(トレビア・ヌ
ーディフロラ(Trewia nudiflora)から単離);
[135] (6)C−18−N−デメチル(USP 4,362,663および4,322,348)(ストレプ
トミセス属によるメイタンシノールの脱メチルにより製造);および
[136] (7)4,5−デオキシ(USP 4,371,533)(メイタンシノールの三塩化チタン/LAH還元により製造)。
イタンシノイド(DM1)、正式にはN2’−デアセチル−N2’−(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−メイタンシンと呼ばれるものを細胞毒性物質として使用する。DM1は、下記の構造式(I)により表わされる:
有メイタンシノイドN2’−デアセチル−N2’−(4−メチル−4−メルカプト−1−オキソペンチル)−メイタンシンを細胞毒性物質として使用する。DM4は、下記の構造式(II)により表わされる:
子を保有する炭素原子におけるモノまたはジ−アルキル置換をもつチオール−およびジスルフィド含有メイタンシノイドが含まれる。これらには、下記をもつメイタンシノイドが
含まれる:C−3、C−14ヒドロキシメチル、C−15ヒドロキシ、またはC−20デスメチル、アシル基がヒンダードスルフヒドリル基を保有するアシル化アミノ酸側鎖、その際チオール官能基を保有するアシル基の炭素原子は1または2つの置換基をもち、それらの置換基はCH3、C2H5、1〜10個の炭素原子をもつ直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子をもつ環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらに置換基の1つはHであってもよく、アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子の間に少なくとも3個の炭素原子長さの直鎖をもつ。
含まれる:
Y’は、
R1およびR2は、それぞれ独立して、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらにR2はHであってもよく;
A、B、Dは、3〜10個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基であり;
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11およびR12は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり;
l、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuは、それぞれ独立して0または1〜5の整数であり、ただしl、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuのうち少なくとも2つはいかなる場合にもゼロではなく;
Zは、H、SRまたは−CORであり、ここでRは1〜10個の炭素原子を有する直鎖
アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基である。
R1がメチルであり、R2がHであり、ZがHである;
R1およびR2がメチルであり、ZがHである;
R1がメチルであり、R2がHであり、Zが−SCH3である;
R1およびR2がメチルであり、Zが−SCH3である。
IV−D,L)により表わされる化合物も含まれる:
Yは、
R1およびR2は、それぞれ独立して、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらにR2はHであってもよく;
R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり;
l、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく;
Zは、H、SRまたは−CORであり、ここでRは1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基であり;
Mayは、C−3の側鎖、C−14ヒドロキシメチル、C−15ヒドロキシを有する、またはC−20デスメチルであるメイタンシノイドを表わす。
下記の式(IV−L)、(IV−D)および(IV−D,L)の化合物が含まれる:
R1がメチルであり、R2がHであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmがそれぞれ1であり、nが0であり、ZがHである;
R1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmが1であり、nが0であり、ZがHである;
R1がメチルであり、R2がHであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmがそれぞれ1であり、nが0であり、Zが−SCH3である;
R1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmが1であり、nが0であり、Zが−SCH3である。
[145] そのような他のメイタンシン類には、式(V)により表わされる化合物も含ま
れる:
Yは、
R1およびR2は、それぞれ独立して、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらにR2はHであってもよく;
R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり;
l、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく;
Zは、H、SRまたは−CORであり、ここでRは1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基である。
R1がメチルであり、R2がHであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり;lおよびmがそれぞれ1であり;nが0であり;ZがHである;
R1およびR2がメチルであり;R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり;lおよびmが1であり;nが0であり;ZがHである;
R1がメチルであり、R2がHであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmがそれぞれ1であり、nが0であり、Zが−SCH3である;
R1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmが1であり、nが0であり、Zが−SCH3である。
たは(VI−D,L)により表わされる化合物が含まれる:
Y2は、
R1およびR2は、それぞれ独立して、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらにR2はHであってもよく;
R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖環式アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり;
l、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく;
Z2は、SRまたはCORであり、ここでRは1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基であり;
Mayは、メイタンシノイドである。
含まれる:
Y2’は、
R1およびR2は、それぞれ独立して、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらにR2はHであってもよく;
A、BおよびDは、それぞれ独立して、3〜10個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基であり;
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11およびR12は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり;
l、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuは、それぞれ独立して0または1〜5の整数であり、ただしl、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuのうち少なくとも2つはいかなる場合にもゼロではなく;
Z2は、SRまたは−CORであり、ここでRは1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基である。
VII)の化合物が含まれる。
[150] 前記のメイタンシノイド類を、抗CA6抗体DS6またはその相同体もしくは
フラグメントにコンジュゲートさせることができる。その際、メイタンシノイドのC−3
にあるアシル化アミノ酸側鎖のアシル基にあるチオール−もしくはジスルフィド官能基、C−14ヒドロキシメチル、C−15ヒドロキシ、またはC−20デスメチルを用いて、抗体をメイタンシノイドに結合させ、その際、アシル化アミノ酸側鎖のアシル基のチオール−もしくはジスルフィド官能基は1または2つの置換基をもつ炭素原子にあり、それらの置換基はCH3、C2H5、1〜10個の炭素原子をもつ直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子をもつ分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらに置換基の1つはHであってもよく、アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子の間に少なくとも3個の炭素原子長さの直鎖をもつ。
ンジュゲートした抗CA6抗体DS6またはその相同体もしくはフラグメントを含むものである:
Y1’は、
A、BおよびDは、それぞれ独立して、3〜10個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基であり;
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11およびR12は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり;
l、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuは、それぞれ独立して0または1〜5の整数であり、ただしl、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuのうち少なくとも2つはいかなる場合にも非ゼロではない。
がメチルである。
[153] 本発明のより好ましいコンジュゲートは、式(IX−L)、(IX−D)また
は(IX−D,L)のメイタンシノイドにコンジュゲートした抗CA6抗体DS6またはその相同体もしくはフラグメントを含むものである:
Y1は、
R1およびR2は、それぞれ独立して、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらにR2はHであってもよく;
R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり;
l、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく;
Mayは、C−3の側鎖、C−14ヒドロキシメチル、C−15ヒドロキシを有する、またはC−20デスメチルであるメイタンシノイドを表わす。
下記の式(IX−L)、(IX−D)および(IX−D,L)の化合物が含まれる:
R1がメチルであり、R2がHであるか、あるいはR1およびR2がメチルである;
R1がメチルであり、R2がHであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり;lおよびmがそれぞれ1であり;nが0である;
R1およびR2がメチルであり;R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり;lおよびmが1であり;nが0である。
[156] 本発明のより好ましいコンジュゲートは、式(X)のメイタンシノイドにコン
ジュゲートした抗CA6抗体DS6またはその相同体もしくはフラグメントを含むものである:
[157] 特に好ましいものは、前記化合物においてR1がHであり、R2がメチルであ
り、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmがそれぞれ1であり、nが0である化合物である。
り、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmが1であり、nが0である化合物である。
[160] 出願中の米国特許出願10/849,136(2004年5月20日出願)に教示される各メイタンシノイドも、本発明の細胞毒性コンジュゲート中に使用できる。米国特許出願10/849,136の開示内容全体を本明細書に援用する。
[161] メイタンシノイド類を細胞結合剤、たとえばDS6抗体に連結するために、メ
イタンシノイド類は連結部分を含む。連結部分には、完全に有効なメイタンシノイド類を特定の部位で放出しうる化学結合が含まれる。適切な化学結合は当技術分野で周知であり、これにはジスルフィド結合、酸不安定結合、光不安定結合、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基が含まれる。好ましいものはジスルフィド結合である。
基はジスルフィド結合連結部分を介してメイタンシノイドに共有結合することができる。
[163] 特に好ましい反応性化学基は、N−スクシンイミジルエステルおよびN−スル
ホスクシンイミジルエステルである。
タンシノールおよびその類似体のC−3エステルであって、連結部分はジスルフィド結合を含み、反応性化学基はN−スクシンイミジルエステルまたはN−スルホスクシンイミジルエステルを含む。
用できる。たとえば、ヒドロキシ基をもつC−3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC−14位、ヒドロキシで修飾されたC−15位、およびヒドロキシ基をもつC−20位がすべて有用であると予想される。しかし、C−3位が好ましく、メイタンシノールのC−3位が特に好ましい。
む連結部分に関連して記載するが、他のメイタンシノイド類を使用できるのと同様に、他の化学結合(前記)をもつ連結部分も本発明に関して使用できることは当業者に理解されるであろう。他の化学結合の具体例には、酸不安定結合、光不安定結合、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基が含まれる。USP 5,208,020(本明細書に援用する)
の開示内容は、そのような結合をもつメイタンシノイド類の製造を教示している。
ノイド誘導体の合成は、USP 6,441,163および6,333,410、ならびに米国特許出願10/161,651に記載されており、それぞれを本明細書に援用する。
6抗体と反応させて、細胞毒性コンジュゲートを製造する。これらのコンジュゲートは、HPLCまたはゲル濾過により精製できる。
優れた方法が、USP 6,333,410、ならびに米国特許出願09/867,598、10/161,651および10/024,290に提示されており、それぞれの全体を本明細書に援用する。
つメイタンシノイドの過剰モルと共にインキュベートしてもよい。過剰のアミン(たとえばエタノールアミン、タウリンなど)の添加により、反応混合物を反応停止することができる。次いでメイタンシノイド−抗体コンジュゲートをゲル濾過により精製することができる。
0nmにおける吸光度の比を分光光度法で測定することにより判定できる。平均1〜10個のメイタンシノイド分子/抗体分子が好ましい。
胞系の増殖を抑制する活性についてインビトロで評価することができる。たとえばヒト類表皮癌細胞系A−431、ヒト小細胞肺癌細胞系SW2、ヒト胸部腫瘍細胞系SKBR3、およびバーキットリンパ腫細胞系Namalwaなどの細胞系を用いて、これらの化合物の細胞毒性を容易に評価することができる。評価すべき細胞を本発明化合物に24時間曝露し、細胞の生存率を既知の方法による直接アッセイ法で測定することができる。次いでアッセイ結果からIC50値を計算できる。
[173] PEG連結基を用いてメイタンシノイド類を細胞結合剤に結合させることもで
きる;米国特許出願10/024,290に記載。これらのPEG連結基は、水および非水性溶媒の両方に可溶性であり、1以上の細胞毒性物質を細胞結合剤に結合させるために使用できる。PEG連結基の例にはヘテロ二官能性PEGリンカーが含まれ、これはこのリンカーの反対側の末端において、一端では官能性スルフヒドリル基またはジスルフィド基により、他端では活性エステルにより、細胞毒性物質と細胞結合剤に結合する。
な詳細について再び米国特許出願10/024,290を援用する。反応性PEG部分をもつ1以上の細胞毒性物質を細胞結合剤と反応させることにより合成を開始し、それぞれの反応性PEG部分の末端活性エステルを細胞結合剤のアミノ酸残基で置換して、PEG連結基により細胞結合剤に共有結合した1以上の細胞毒性物質を含む細胞毒性コンジュゲートを得る。
[175] 本発明による細胞毒性コンジュゲート中に用いる細胞毒性物質は、タキサン類
またはその誘導体であってもよい。
セル(paclitaxel)(タキソール、Taxol)、および半合成誘導体ドセタキセル(docetaxel)(タキソテレ、Taxotere)の2種類の化合物を含む化合物群である。タキサン類は有糸分裂紡錘体毒であり、チューブリンの開重合を阻害して細胞死に至らせる。ドセタキセルおよびパクリタキセルは癌の処置に有用な薬剤であるが、正常細胞に対するそれらの非特異的毒性のため、それらの抗腫瘍活性には限界がある。さらに、パクリタキセルおよびドセタキセルなどの化合物自体は、細胞結合剤のコンジュゲート中に使用するのに十分なほど有効ではない。
)のタキサンである:
びタキサン類を細胞結合剤、たとえば抗体にコンジュゲートさせる方法は、USP 5,416,064、5,475,092、6,340,701、6,372,738および6,436,931、ならびに米国特許出願10/024,290、10/144,042、10/207,814、10/210,112および10/369,563に詳述されている。
[179] 本発明による細胞毒性コンジュゲート中に用いられる細胞毒性物質は、CC−
1065またはその誘導体であってもよい。
(1982))。CC−1065およびその類似体は、USP 6,372,738、6,340,701、5,846,545
および5,585,499に開示されている。
性またはDNAインターカレーション活性と相関する。これら2つの活性は、この分子の別個の部分にある。たとえばアルキル化活性はシクロプロパピロロインドール(CPI)サブユニット中に含まれ、DNA結合活性は2つのピロロインドールサブユニット中にある。
使用には限界がある。CC−1065をマウスに投与すると、遅延性肝毒性を生じ、12.5μg/kgの静脈内1回投与後、50日目に死亡した{V.L. Reynolds et al., J. Antibiotics, XXIX, 319-334 (1986)}。これは、遅延毒性を生じない類似体を開発する試みに拍車をかけ、CC−1065をモデルとしたより単純な類似体が報告された{M.A. Warpehoski et al., J. Med. Chem., 31, 590-603 (1988)}。
)部分で置換された{D.L.Boger et al., J. Org. Chem., 55, 5823-5833 (1990);D.L. Boger et al., BioOrg. Med. Chem. Lett., 1, 115-120 (1991)}。これらの化合物は、
マウスにおいて遅延毒性を生じることなく親化合物の高いインビトロ力価を保持している。CC−1065と同様にこれらの化合物はアルキル化剤であり、DNAの副溝に共有結合様式で結合して、細胞死に至らせる。しかし、最も有望な類似体アドゼレシン(Adozelesin)およびカルゼレシン(Carzelesin)の臨床評価は、失望すべき結果をもたらした{B.F.Foster et al., Investigational New Drugs, 13, 321-326 (1996);I. Wolff et al., Clin. Cancer Res., 2, 1717-1723 (1996)}。これらの薬物はそれらの高い全身毒性
のため、低い療法効果を示す。
によりインビボ分布を変化させ、標的外の組織に対する毒性を低下させ、これにより全身毒性を低下させることによって、大幅に改良できる。この目標を達成するために、CC−1065の類似体および誘導体と、腫瘍細胞を特異的にターゲティングする細胞結合剤のコンジュゲートが報告された{USP;5,475,092;5,585,499;5,846,545}。これらのコンジュゲートは一般に、インビトロでの高い標的特異的毒性、およびマウスのヒト腫瘍異種移植モデルにおける著しい抗腫瘍活性を示す{R.V.J. Chari et al., Cancer Res., 55, 4079-4084 (1995)}。
する方法、およびこれらの類似体を細胞結合剤、たとえば抗体にコンジュゲートさせる方法は、USP 5,475,092、5,846,545、5,585,499、6,534,660および6,586,618、ならびに米
国特許出願10/116,053および10/265,452に詳述されている。
[186] メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビン
ブラスチン、メルファラン、マイトマイシンC、およびクロラムブシル、カリケアマイシン(calicheamicin)、ツブリシン(tubulysin)およびツブリシン類似体、デュオカルマイシン(duocarmycin)およびデュオカルマイシン類似体、ドラスタチンおよびドラスタ
チン類似体も、本発明のコンジュゲートの製造に適切である。これらの薬物分子も、中間キャリヤー分子、たとえば血清アルブミンにより、抗体分子に連結させることができる。たとえば米国特許出願09/740991に記載されるドキサルビシンおよびダウノルビシン化合
物も、有用な細胞毒性物質であろう。
[187] 本発明は、下記のものを含む療法用組成物をも提供する:
(a)有効量の1種類以上の細胞毒性コンジュゲート、および
(b)医薬的に許容できるキャリヤー。
的細胞を含む組織と、有効量の細胞毒性コンジュゲートとを、または細胞毒性コンジュゲートを単独でまたは他の細胞毒性物質もしくは療法薬と組み合わせて含む療法剤とを、接触させることを含む方法をも提供する。
む。
[190] 細胞毒性コンジュゲートを、インビトロ力価および特異性について、これまで
に記載された方法で評価することができる(たとえばR.V.J. Chari et al., Cancer Res., 55, 4079-4084 (1995)を参照)。抗腫瘍活性は、マウスのヒト腫瘍異種移植モデルにおいて、同様にこれまでに記載された方法で評価することができる(たとえばLiu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 8618-8623 (1996)を参照)。
いて決定できる。本明細書中で用いるキャリヤーには、希釈剤および賦形剤が含まれる。
[192] 適切なキャリヤー、希釈剤および/または賦形剤の例には、下記のものが含ま
れる:(1)ダルベッコのリン酸緩衝食塩水、pH約7.4、1〜25mg/mlのヒト血清アルブミンを含有するもの、または含有しないもの、(2)0.9%の食塩水(0.9% w/vの塩化ナトリウム(NaCl))、および(3)5%(w/v)のデキストロース;酸化防止剤、たとえばトリプタミン(tryptamine)および安定剤Tween 20を含有してもよい。
スビボで実施できる。本明細書中で用いる増殖阻害は、短期間または長期間のいずれであっても、細胞の増殖を遅延させ、細胞の生存性を低下させ、細胞死に至らせ、細胞を溶解し、および細胞死を誘発することを意味する。
る前に罹患または悪性細胞を殺すための処理;骨髄を移植する前にコンピテントT細胞を殺して移植片対宿主疾患(GVHD)を防止するための処理;目的変異体以外の標的抗原を発現しないすべての細胞を殺すため、または不都合な抗原を発現する変異体を殺すための、細胞培養物の処理。
[196] 臨床エクスビボ使用の例は、癌の処置または自己免疫疾患の処置に際して自己
移植前に骨髄から腫瘍細胞またはリンパ球様細胞を除去すること、あるいは移植片対宿主疾患(GVHD)を防止するために移植前に自己または同種異系骨髄または組織からコンピテントT細胞および他のリンパ球様細胞を除去することである。処理は、下記に従って実施できる。骨髄を患者または他の個体から採取し、次いで本発明の細胞毒性物質を添加した血清含有培地中でインキュベートする。濃度約10μM〜1pM、約30分〜約48時間、37℃である。濃度およびインキュベーション時間の厳密な条件、すなわち用量は、当業者が容易に決定できる。インキュベーション後、骨髄細胞を血清含有培地で洗浄し、既知の方法に従って静脈内注入により患者に戻す。患者が骨髄の採取時と処理済み細胞の再注入時との間に他の処置、たとえば切除化学療法または全身照射のコースを受ける場合、処置済み骨髄細胞を標準的な医療装置により液体窒素中に凍結保存しておく。
調製し、これを無菌性および内毒素濃度について検査する。細胞毒性コンジュゲート投与のための適切なプロトコルの例は、下記のとおりである。コンジュゲートを週1回、4週間、静脈内ボーラスとして毎週投与する。ボーラス用量を50〜100mlの生理食塩水中において投与し、これに5〜10mlのヒト血清アルブミンを添加してもよい。投与量は、静脈内に1回当たり10μg〜100mg(1日100ng〜1mg/kg)である。より好ましくは、投与量は50μg〜30mgである。最も好ましくは、投与量は1〜20mgである。4週間の処置後、患者は週1回基準の処置を継続して受けることができる。投与経路、賦形剤、希釈剤、投与量、時間などに関する具体的な臨床プロトコルは、当業者が臨床状況に基づいて決定できる。
病的状態の例には、たとえば下記を含めたいずれかのタイプの悪性疾患が含まれる:肺癌、胸部癌、結腸癌、前立腺癌、腎癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌およびリンパ器官の癌、骨肉腫、滑膜癌、CA6を発現する肉腫または癌、ならびにCA6グリコトープを主に発現する他の癌であってまだ判定されていないもの;自己免疫疾患、たとえば全身性狼瘡、リウマチ様関節炎、および多発硬化症;移植片拒絶、たとえば腎移植片拒絶、肝移植片拒絶、肺移植片拒絶、心臓移植片拒絶、および骨髄移植片拒絶;移植片対宿主疾患;ウイルス感染症、たとえばmV感染症、HIV感染症、エイズなど;ならびに寄生虫感染症、たとえばジアルジア症、アメーバ症、住血吸虫症、ならびに当業者が判定する他の疾患。
[199] 本発明には、たとえば前記の細胞毒性コンジュゲートおよび特定の細胞タイプ
を殺すのにその細胞毒性コンジュゲートを使用するための指示を含むキットも含まれる。指示には、細胞毒性コンジュゲートをインビトロ、インビボまたはエクスビボで使用するための指示が含まれる。
備えている。細胞毒性コンジュゲートは、キットに収容できる凍結乾燥した形、液状または他の形状であってよい。キットには、キット中の指示に述べられた方法を実施するのに必要な他の構成部材、たとえば凍結乾燥粉末を再構成するための無菌溶液、患者に投与する前に細胞毒性コンジュゲートと組み合わせる他の薬剤、およびコンジュゲートを患者に投与するのを補助する用具を収容してもよい。
[201] 本発明はさらに、研究または診断用途に使用するためにさらに標識したモノク
ローナル抗体、ヒト化抗体、およびそのエピトープ結合フラグメントを提供する。好ましい態様において、標識は放射性標識、発蛍光団、発色団、造影剤または金属イオンである。
投与し、対象の体内における標識の分布を測定またはモニターする診断法も提供される。
[203] 本発明の広い範囲は以下の実施例を参照すると最も良く理解される。これらは
本発明を特定の態様に限定するためのものではない。
[204] フローサイトメトリー分析を用いて、DS6エピトープであるCA6を細胞表
面に局在化させた。ヒト細胞系は下記のもの以外をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手した:OVCAR5細胞(Kearse et al., Int. J. Cancer 88(6): 866-872 (2000))、OVCAR8およびIGROV1細胞(M. Seiden, Massachusetts General Hospital)。すべての細胞を、4mMのL−グルタミン、50U/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン(Cambrex Bio Science、メーン
州ロックランド)および10% v/vのウシ胎仔血清(Atlas Biologicals、コロラド
州フォート・コリンズ)を補充したRPMI 1640(以下、培地と呼ぶ)で増殖させた。細胞を37℃、5%CO2、加湿インキュベーター内に維持した。
ト内でFACS緩衝液(2%のヤギ血清、RPMI)中に調製した系列希釈濃度のDS6抗体と共にインキュベートした。細胞を卓上型遠心機により1500rpm、4℃で5分間遠心した。培地を除去した後、次いでウェルに150μlのFACS緩衝液を再充填した。次いでこの洗浄工程を繰り返した。FITC標識したヤギ抗マウスIgG(Jackson Immunoresearch)をFACS緩衝液に1:100希釈し、細胞と共に氷上で1時間インキュベートした。信号の光減退を防ぐために、プレートに箔で蓋をした。2回の洗浄後、細胞を1%ホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメーターにより分析した。
由来する細胞系には主にCA6エピトープがみられた(表3)。しかし、他の腫瘍タイプの若干の細胞系が示すCA6発現は限定されていた。DS6抗体は135.6pMの見掛けKDで結合する(PC−3細胞において、表3)。抗原陽性細胞における結合曲線(図1)の最大平均蛍光(表3)は、抗原の相対密度を示唆する。
実施例2:DS6エピトープの特性解明
[207] タンパク質分解(プロナーゼおよびプロテイナーゼK)および/または糖分解
(ノイラミニダーゼおよび過ヨウ素酸)処理により消化したCA6陽性細胞溶解物(Caov−3)のドットブロットをイムノブロッティングすることにより、DS6の抗原CA6の特性を分析した。陽性対照として、多様なタイプのエピトープを認識する他の抗体を、抗原陽性細胞系の溶解物について試験した(Caov−3とCM1;Colo205とC242;SKMEL28とR24)。CM1は、Muc1の可変数タンデム反復ドメイン(VNTR)のタンパク質エピトープを認識する抗体であり、したがってタンパク質エピトープについての対照となる。C242は、Muc1上の新規な結腸直腸癌特異的なシアル酸依存性グリコトープ(CanAg)に結合し、タンパク質上のグリコトープについての対照となる。R24は、黒色腫に特異的なGD3ガングリオシドに結合し、したがって非タンパク質骨格上のグリコトープについての対照となる。
養プレートに接種した。培地(30mL/プレート)を細胞溶解前日に交換した。改変RIPA緩衝液(50mMのトリス−HCl、pH7.6、150mMのNaCl、5mMのEDTA、1%のNP40、0.25%のデオキシコール酸ナトリウム)、プロテアーゼ阻害薬(PMSF、ペプスタチンA、ロイペプチン、およびアプロチニン)、およびPBSを、氷上で予冷した。培地をプレートから吸引した後、細胞を10mlの冷却PBSで2回洗浄した。以後のすべての工程を氷上および/または4℃の低温室内で実施した。最後のPBS洗浄後、細胞を1〜2mLの溶解用緩衝液(RIPA緩衝液に新たにプロテアーゼ阻害薬を添加して、最終濃度1mMのPMSF、1μMのペプスタチンA、10μ
g/mlのロイペプチン、および2μg/mlのアプロチニンにしたもの)中で溶解した。溶解物を細胞リフターによりプレートから掻き取り、懸濁液を18G注射針で吸引排出(5〜10回)することにより摩砕処理した。溶解物を10分間回転させ、次いで微量遠心機により最大速度(13K rpm)で10分間遠心した。ペレットを廃棄し、次いで上清をBradfordタンパク質アッセイキット(Biorad)によりアッセイした。
滴下した。スポットを約30秒間風乾した。それぞれが1個のスポットを含むように、膜を細断した。スポットを、プロナーゼ(1mg/mlの酵素、50mMのトリス、pH7.5、5mMのCaCl2)、プロテイナーゼK(1mg/mlの酵素、50mMのトリス、pH7.5、5mMのCaCl2)、ノイラミニダーゼ(20mU/mlの酵素、50mMの酢酸ナトリウム、pH7.5、5mMのCaCl2、100μg/mlのBSA)、または過ヨウ素酸(20mM、0.5Mの酢酸ナトリウム、pH5)の存在下に37℃で1時間インキュベートした。試薬はRoche(酵素)およびVWR(過ヨウ素酸)から購入された。膜をT−TBS洗浄用緩衝液(0.1%Tween 20、1×TBS)中で洗浄し(5分)、遮断用緩衝液(3%のBSA、T−TBS)中、室温で2時間遮断し、遮断用緩衝液中2μg/mlの第1抗体(すなわちDS6、CM1、C242、R24)と共に4℃で一夜インキュベートした。膜をT−TBS中で5分間、3回洗浄し、次いでHRPコンジュゲートしたヤギ抗マウス(またはヒト)IgG第2抗体(Jackson Immunoresearch;遮断用緩衝液中に1:2000希釈)中、室温で1時間インキュベートした。これらのイムノブロットを3回洗浄し、ECLシステム(Amersham)により現像した。
ピトープを認識する抗体について予想されたとおりタンパク質分解処理により破壊されたが、糖分解消化物は影響を受けないことを示した。C242信号は、タンパク質上のグリコトープを認識する抗体について予想されたとおり、タンパク質分解または糖分解のいずれの処理によっても破壊された。タンパク質分解処理により影響されなかったR24信号は、ガングリオシドを認識する抗体について予想されたとおり、ノイラミニダーゼまたは過ヨウ素酸処理により破壊された。消化したCaov−3溶解物のドットブロットのDS6イムノブロットは、タンパク質分解および糖分解のいずれの化合物による処理においても信号消失を示した。したがって、C242と同様に、DS6はタンパク質コア上の炭水化物エピトープに結合する。さらに、DS6イムノブロットの信号はノイラミニダーゼ処理に感受性であった。したがって、CanAgと同様に、CA6はシアル酸依存性グリコトープである。
ポットし、化学的脱グリコシル剤トリフルオロメタンスルホン酸(TFMSA)により、窒素下に周囲温度で5分間処理した。ブロットをT−TBSで洗浄し、CM1またはDS6でイムノブロッティングした(図3)。DS6信号は酸処理に際して破壊され、CA6がグリコトープである証拠がさらに得られた。TFMSA処理に際してCM1信号が増強したのは、この酸処理がフィルター上のタンパク質に影響を及ぼさないことを指摘し、かつ糖分解処理はCM1が認識するタンパク質エピトープを露出させたことを示唆する。
N−グリカナーゼ、O−グリカナーゼおよび/またはシアリダーゼで消化した(図4)。Caov−3細胞溶解物(100μg、30μl)を100℃で5分間、SDSおよびβ−メルカプトエタノールを含有する変性用緩衝液(Glyko)2.5μlと共にインキュベ
ートした。変性した溶解物を次いで1μlのN−グリカナーゼ、O−グリカナーゼおよび/またはシアリダーゼA(Glyko)により37℃で1時間消化した。消化した溶解物を次
いでニトロセルロース上にスポットし(2μl)、前記と同様にイムノブロッティングし
た。
た。しかし、シアリダーゼで消化した試料は信号を発生しなかった。O−グリカナーゼはシアリダーゼによる前処理なしではシアル化O−結合炭水化物を消化できないので、O−グリカナーゼ単独で処理した試料のDS6信号には影響がなかった。これに対し、N−グリカナーゼは、活性にとってグリコシド酵素による前処理を必要としない。N−グリカナーゼ処理がDS6信号に影響を及ぼさないという事実は、CA6エピトープがシアル化O−結合炭水化物鎖上に存在する可能性が最も高いことを示唆する。
[214] CA6シアログリコトープが存在する抗原を同定するために、DS6免疫沈降
物をSDS−PAGEおよびウェスタンブロット法により分析した。細胞溶解物の上清(1mL/試料;3〜5mgのタンパク質)を、4℃で1〜2時間回転させながら、1mlのRIPA緩衝液で平衡化したプロテインGビーズ(30μl)により予備清澄化した。以後のすべての工程を氷上および/または4℃の低温室内で実施した。予備清澄処理済みビーズを微量遠心機で短時間(2〜3秒)遠心した。予備清澄化した上清を新たな試験管に移し、2μgのDS6と共に回転させながら一夜インキュベートした。新たな平衡化したプロテインGビーズ(30μl)を溶解物に添加し、回転させながら1時間インキュベートした。このビーズ−溶解物懸濁液を微量遠心機で短時間遠心し、所望によりこの免疫沈降後溶解物の試料を採取した。ビーズを1mlのRIPA緩衝液で5〜10回洗浄した。
ノイラミニダーゼ(Roche)、50mMの酢酸ナトリウム、pH5、5mMのCaCl2
、100μg/mlのBSA)または30μlの過ヨウ素酸(20mMの過ヨウ素酸(VWR)、0.5Mの酢酸ナトリウム、pH5)により37℃で1時間消化した。次いでそれ
らを30μlの2×試料装填用緩衝液(β−メルカプトエタノールを含有)に再懸濁した。ビーズを5分間煮沸し、装填用緩衝液の上清を4−12%または4−20%トリス−グリシンゲル(Invitrogen)に装填した。ゲルをLaemli電気泳動用緩衝液中、125vで1.5時間展開した。Mini Transブロット転写装置(Biorad)により、20mAで一夜、ゲル試料を0.2μmのニトロセルロース膜(Invitrogen)上へ転写した。前記の実施例2に記載したように、膜をDS6でイムノブロッティングした。
−グリカナーゼおよび/またはシアリダーゼA(Glyko)により酵素消化した。ビーズを
27μlのインキュベーション用緩衝液および2μlの変性溶液(Glyko)に再懸濁し、
100℃で5分間インキュベートした。室温に冷却した後、界面活性剤溶液(2μl)を添加し、試料を1μlのN−グリカナーゼ、O−グリカナーゼおよび/またはシアリダーゼAと共に37℃で4時間インキュベートした。5×試料装填用緩衝液(7μl)を添加した後、試料を5分間煮沸した。試料を前記と同様にSDS−PAGE処理し、イムノブロッティングした。
ドを免疫沈降させる(図5A、BおよびC)。ある細胞系(すなわちT−47D)ではダブレットがみられる。この>250kDaのバンドは、ノイラミニダーゼまたは過ヨウ素酸で処理したCaov−3免疫沈降物中では破壊されており(図5AおよびB)、これはCA6エピトープがこの>250kDaのバンド上にあることを示唆する。>250kDaのバンドは免疫沈降物のN−グリカナーゼ処理に不感受性であることも示され、これはCA6がO−結合炭水化物上にあることと一致する(図5F)。250kDaのバンドが
CA6抗原であることをさらに支持するものは、DS6の抗原が陰性である細胞からはDS6はそのようなバンドを免疫沈降しないという事実である(図5DおよびE)。
子量が高く、O−結合炭水化物特異的な糖分解酵素に対して感受性であるので、CA6抗原はムチンであると思われた。ムチンの過剰発現は特に胸部および卵巣の腫瘍において解明されており、DS6の主な腫瘍反応性と一致する。さらに、CA6はCanAg(Muc1上のシアログリコトープ)と同様に過ヨウ素酸沈降に不感受性であり、これはCA6抗原が著しくO−グリコシル化されていることを示唆する。あるDS6発現細胞系においてDS6が>250kDaのダブレットを免疫沈降させたという所見は、CA6がMuc1であることを示唆した。ヒトMuc1の特色は、タンデム反復配列の個数が異なる2つのMuc1対立遺伝子の存在により分子量の異なる2つのMuc1タンパク質が生成することである。
6免疫沈降物をSDS−PAGE処理し、DS6またはMuc1 VNTR抗体CM1でイムノブロッティングした。図6Aから分かるように、CM1はDS6が免疫沈降させた>250kDaのバンドと強く反応する。図6Bでは、HeLa細胞溶解物からのDS6およびCM1の免疫沈降物が、DS6またはCM1のいずれで免疫沈降させた場合にも同じ>250kDaのダブレットを示す。これらの結果は、CA6エピトープが実際にMuc−1タンパク質上にあることを指摘する。HeLa(およびT−47D)細胞にみられるDS6ダブレットは、タンデム反復配列の個数が異なる別個の対立遺伝子によりMuc−1発現が支配されているという事実により説明できる。
プに結合する。Caov−3溶解物のドットブロットをトリフルオロメタンスルホン酸(TFMSA)で化学的に脱グリコシルすると、DS6信号が破壊された(図3)。しかし、この同じ処理によりCM1信号は増強した。脱グリコシルは、CM1抗体に対する隠れたエピトープを露出させた可能性がある。さらに、DS6およびCM1のフローサイトメトリー結合の結果を比較すると(表4)、CA6エピトープはMuc1を発現するすべての細胞上に存在するわけではないことが立証される。高濃度のMuc1 CanAgシアログリコトープを発現することが知られている細胞系Colo205(表3)にCA6エピトープが存在しない点に注目すると、興味深い。
実施例4:放出されたCA6エピトープの定量分析
[221] CA6エピトープは、多くの癌患者において血流中へ放出されることが知られ
ている分子Muc1上に存在するので、そのような濃度がDS6抗体療法の妨げとなるかを判定するために定量操作を行った。循環抗体が抗原に結合すると、血中から免疫複合体が急速にクリアランスされると考えられる。抗体投与量の有意部分が急速に循環から排除されると、腫瘍に到達する量が減少し、抗体療法薬の抗腫瘍活性が低下する可能性がある。有効性の高い細胞毒性化合物に抗体をコンジュゲートさせると、コンジュゲートの急速なクリアランスは非特異的毒性を高める可能性がある。したがって、抗体−低分子薬物コンジュゲート、たとえばDS6−DM1の場合、高濃度の放出抗原が抗腫瘍効果を低下させ、かつ用量を制限する毒性を高める可能性があると予想された。
す影響に関する情報が得られた。たとえばher2/neuを発現する転移性乳癌の治療に用いられる抗体トラスツヅマブ(ハーセプチン、Herceptin)を用いた臨床試験で、H
er2/neu濃度が500ng/mL未満の場合はトラスツヅマブクリアランスの薬物動態は変化しないことが示された(Pegram et al., J. Clin. Oncol. 16(8): 2659-71 (1998))。放出されたHer2/neuの分子量が110,000ダルトンであると仮定すると、4.5nM未満のモル濃度の放出Her2/neuは薬物動態にほとんど影響しないと思われる。
ンを用いた臨床試験でみられるものとの相関性を調べるために、Muc1上のシアログリコトープのように複雑な放出エピトープのモル濃度を求めるための方法を開発した。まず、DS6のための簡単なサンドイッチELISAアッセイ法を確立した。このアッセイ法の概念を図7Aに示す。DS6を用いて、CA6エピトープをもつMuc1を捕獲した。各Muc1分子が複数のCA6エピトープをもつので、ビオチニル化DS6もトレーサー抗体として用いた。捕獲されたCA6に結合したビオチニル化DS6を、基質としてのABTSを用いてストレプトアビジン−HRPにより検出した。卵巣癌患者の血清から、または乳癌患者において放出Muc1をモニターするために用いる市販のMuc1試験キット(CA15−3)より得た標準品から、CA6エピトープを捕獲した。DS6の単位/
mlをCA15−3標準品の単位/mlと等しく任意に設定した。
を示す。得られた曲線は、CA15−3アッセイにおいてCA15−3標準品を用いて得たものときわめて類似する。DS6の単位/mlをCA6のモル濃度に換算するためには、信号をDS6のピコグラム数に換算するビオチニル化DS6標準曲線が必要である。CA6エピトープとビオチニル化DS6抗体の化学量論的量を1:1、ビオチニル化DS6の分子量を160,000ダルトンと仮定して、試料の添加体積当たり捕獲されたCA6のモル数を計算することができる。
別法を表わす。図8Aでは、ヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体を用いてビオチニル化DS6を捕獲し、これを図7に示したサンドイッチELISAに用いたものと同じ方法で検出する。図8Bに示した方法では、ビオチニル化DS6を直接にELISAプレート上に配置し、図8Aと同様に検出する。図8Cにみられるように、各方法で作成したビオチニル化DS6標準曲線は良く一致する。
にCA125 ELISAを用いて放出CA125の単位/mlを測定することにより、卵巣癌患者の治療をモニターする。血清試料についてCA125状態を求めた。一般にCA15−3 ELISAを用い、DS6が認識するものとは異なるエピトープを認識する抗体の捕獲および検出を利用して放出Muc1の単位/mlを測定することにより、乳癌患者をモニターする。表5では、卵巣癌患者の血清試料においてCA15−3を測定する。
2 市販のCA15−3標準品により測定(1 CA15−3 U=1 DS6 U)
3 ヤギ抗マウスIgGおよびビオチン−DS6標準曲線
4 ビオチン−DS6標準曲線
[228] 表5に報告したCA15−3値については、CanAg Diagnosticsから市販される
CA15−3エンザイムイムノアッセイキットを用いた。DS6の単位/mlについては、CA15−3標準品(CanAg Diagnosticsから市販されるCA15−3エンザイムイム
ノアッセイキットより)をDS6サンドイッチELISAに用いて標準曲線を作成した。DS6の単位/mlをCA15−3の単位/mlと等しく任意に設定した。最後の2欄において、放出CA6のピコモル濃度(pM)は、図8Cに示したビオチニル化DS6の標準曲線を用いて計算された。
タンシン臨床試験に参加した患者について処置前に報告されたものである(Tolcher et al., J. Clin. Oncol. 21(2): 211-22 (2003))。DS6について記載したものと同様なELISAアッセイにより、CanAg標準品を用いてCanAg標準曲線を作成した。C242を用いてCanAg標準品を捕獲した。捕獲したCanAgの検出は、ビオチニル化C242トレーサーを用い、続いて基質としてのABTSを用いてストレプトアビジン−HRPで現像することにより達成された。ビオチニル化DS6について行ったようにビオチニル化−C242標準曲線を作成し、循環CanAgエピトープの単位/mlをモル濃度に換算することができた。表6に、カンツヅマブメルタンシン臨床試験患者からのCanAg濃度および対応する循環CanAgモル濃度計算値を報告する。
2 ヤギ抗マウスIgGおよびビオチン−C242標準曲線
4 ビオチン−C242標準曲線
[230] 卵巣癌患者における放出CA6のpM濃度とCanAg陽性癌患者における放
出CanAgについて計算したものとを比較すると、一般に放出CA6濃度は放出CanAg濃度と類似することが示される。さらに、卵巣癌患者の血清試料16中2つだけが4.5nMより高い濃度をもつ(信号が標準曲線の範囲外にある血清試料5および9);これは、これより高いとHer2/neu陽性乳癌患者についての臨床試験でハーセプチンの薬物動態に変化がみられた濃度である。4.5nMより高いCanAg濃度は、臨床試験患者37人中3人のみにみられた。この臨床試験では、放出CanAg濃度とより急速なカンツヅマブメルタンシンクリアランスの相関性はなかった。ただし、最高CanAg濃度(31240U/ml)の患者は、輸注後8時間しかサンプリングしなかった。これらの結果は、Muc1の特定のエピトープ、たとえばCA6およびCanAgは癌患者に
おいて放出されるが、抗体療法処置を妨げる濃度で放出されるわけではないことを示す。
[231] ネズミモノクローナル抗体、たとえばDS6は、ヒトの免疫系により異物と認
識されるので、臨床設定での有用性に限界がある。患者はヒト抗ネズミ抗体(HAMA)を急速に発現し、その結果ネズミ抗体は急速にクリアランスされる。このため、ネズミDS6(muDS6)の可変部をリサーフェシングしてヒト化DS6(huDS6)抗体を作製した。
ブリドーマ細胞の周密T175フラスコから、Quiagen RNeasy miniprepキットにより全
RNAを精製した。RNA濃度をUV分光光度法により測定し、4〜5μgの全RNAについて、Gibco Superscript IIキットおよびランダム四量体プライマーを用いてRT反応を行った。
はRT反応ミックスをそのまま使用した。3’側L鎖プライマー、HindKL
+T、M=A+C、R=A+G、W=A+T、V=A+C+G、N=A+T+G+C)。
[234] 10%DMSOを補充した以外は、PCR反応は標準的であった(50μlの
反応ミックスが、最終濃度1×の反応用緩衝液(ROCHE)、各2mMのdNTP、各1m
Mのプライマー、2μlのRT反応体、5μlのDMSO、および0.5μlのTaq(ROCHE)を含有)。MJ researchサーモサイクラーにより、Wang Z et al.,(J. Immunol Methods, 1月13日; 233 (1-2): 167-77 (2000))から応用したプログラムを用いてPCR
反応を実施した:1)94℃、3分;2)94℃、15秒;3)45℃、1分;4)72℃、2分;5)工程2に戻って29回;6)最終延長工程72℃、10分で終了。PCRプライマーにより作製したPCR生成物を、制限酵素によりpBluescript II SK+(Stratagene)中へクローニングした。Seqwright配列決定サービスによりH鎖およびL鎖クローンの配列を決定した。
行った。縮重PCRクローンから決定したDS6のL鎖およびH鎖cDNA配列をNCBI Blast検索フェブサイトに入力し、提示したシグナル配列をもつネズミ抗体配列を保存した。これらのシグナルペプチドから、関連DNA配列間で保存されている延長配列を用いてPCRプライマーを設計した。EcoR1制限部位をリーダー配列プライマー(表7)に付加し、これらを前記のRT−PCR反応に用いた。
々のL鎖およびH鎖クローンの配列を決定した。L鎖およびH鎖両方のRT−PCRクローンについて1つの配列のみが得られた。これらの配列は、ネズミDS6 L鎖およびH鎖配列を増幅してシグナル配列に延長することができるプライマーを設計するのに十分であった。これらのフォローアップPCR反応から得た後続クローンにより、最初の縮重プライマーにより変化した可変部の5’末端配列が確認された。種々のcDNAクローンからの累積結果により、図9に示す最終的なネズミDS6 L鎖およびH鎖配列が得られた。KabatおよびAbM定義を用いて、3つのL鎖およびH鎖CDRを同定した(図9および10)。NCBI IgBlastデータベースの検索により、muDS6抗体のL鎖可変部はネズミIgV?ap4生殖系列遺伝子に由来する可能性が最も高く、H鎖可変部はネズミIgVh J558.41生殖系列遺伝子に由来する可能性が最も高いことが示された(図11)。
[237] Pedersenら(1994)およびRoguskaら(1996)が記載した抗体リサーフェシング法は、ネズミ抗体可変配列の表面残基を推定することから始まる。表面残基は、その全表面積の少なくとも30%に水分子が到達できるアミノ酸と定義される。muDS6の表面残基を見いだすための構造が未決定であったので、本発明者らは10種類の抗体を127の抗体構造ファイル中で最も相同性の高い配列とアラインさせた(図12)。アラインしたこれらの配列について、各Kabat位置に対する溶媒アクセシビリティーを平均した(図
13AおよびB)。
グする2つの同一残基を含む抗体サブセットの比較により、第2ラウンドの分析を行った(図13AおよびB)。第2ラウンドの分析後、muDS6のH鎖についての推定表面残基21個は23個に増加し、30%より高い推定表面アクセシビリティーをもつ残基のリストにTyr3およびLys23が加えられた。本発明者らがリサーフェシングした大部分の抗体においてH鎖CDR1のKabat定義を用いるが、DS6については計算に際して故意にではなくAbM定義を用いたので、H鎖残基T28は他の場合と同様なフレームワーク表面残基と定義されなかった。第2ラウンドの分析Ala80の表面アクセシビリティーが30.5%から27.8%に低下したので、L鎖表面位置の数は16から15に減少した。合わせて、muDS6のH鎖およびL鎖可変部配列は38個の推定表面アクセシブルフレームワーク残基をもつ。
[239] ネズミDS6可変部の表面位置を、Kabatデータベースにおいてヒト抗体
配列の対応する位置と比較した(Johnson G., Wu TT. Nucleic Acids Res. 1月1日; 29 (1): 205-6 (2001))。抗体データベース処理ソフトウェア(Searle, 1998)を用いて、天然H鎖およびL鎖ヒト抗体対から表面残基を抽出してアラインした。特にCDRから5Å以内にある位置を考慮して最も同一性の高い表面残基をもつヒト抗体可変部表面を、ネズミDS6抗体可変部表面残基と交換するために選択した。
[240] H鎖およびL鎖対合配列を単一の哺乳動物発現ベクター中へクローニングした
。ヒト可変配列に対するPCRプライマーにより、ヒトシグナル配列をpBluescript IIクローニングベクター中に付加できる制限部位を形成した。次いで、それぞれL鎖またはH鎖についてEcoR1およびBsiWIまたはHindIIIおよびApaIを用いて、哺乳動物発現プラスミド中へこれらの可変配列をクローニングした(図14)。L鎖可変配列をヒトIgKappa定常部上へ読み枠を一致させてクローニングし、H鎖可変配列をヒトIgGamma1定常部配列中へクローニングした。最終発現プラスミドにおいて、ヒトCMVプロモーターはL鎖およびH鎖両方のcDNA配列の発現を誘発する。
[241] 現在では大部分のヒト化に際し、問題となる可能性のある残基としてCDRに
近接する残基を同定するために対象抗体の分子モデルを構築する。リサーフェシングした抗体の数が増えており、問題の想定に際して歴史的経験から作業することは少なくともモデル構築と同程度に有効であるので、DS6については分子モデルを構築しなかった。その代わりにネズミDS6表面残基を従来リサーフェシングされた抗体のものと比較し、抗体の結合活性に対する影響について低リスク残基から高リスク残基までを同定した。
て、類似の残基セットについてCDRから5Å以内にあるものを繰り返し同定する。このデータを用いて、CDRに近接していると思われるネズミDS6残基、およびおそらく5Å以内にあるものを、表1に挙げる。これらの位置の多くも従来のヒト化に際して交換されたが、H鎖の位置74のみはこれまで結合活性を失わせた。ネズミ抗体の結合活性を保存するために、huC242およびhuB4の両方においてこの位置のネズミ残基は保持された。他方、ヒト化6.2G5C6においては、この同一位置を対応するヒト残基に交換しても活性は失われなかった(6.2G5C6は抗IGF1−R抗体であり、しばしば単に抗C6と呼ばれる)。表1の残基はいずれもヒト化抗体において問題を提起する可能
性があるが、H鎖残基P73はこの位置における従来の経験のため特に問題である。
[243] muDS6をリサーフェシングするための候補となるヒト抗体表面を、Kab
at抗体配列データベースからSRソフトウェアを用いて求めた。このソフトウェアは、抗体データベースに対して特定の残基位置のみを検索するためのインターフェースを提供する。天然対を保存するために、L鎖およびH鎖両方の表面残基を相互比較した。配列同一性をランク付けするために、Kabatデータベースから最も相同性の高いヒト表面をアラインした。SR Kabatデータベースソフトウェアによりアラインしたトップ3つの表面を表2に示す。次いでこれらの表面を比較して、表1で同定した残基にするために必要な交換が最少であるのはどのヒト表面であるかを同定した。抗Rh(D)抗体28E4は表面残基交換の必要な数が最も少なく(合計11)、問題となる可能性のある残基のリストに含まれるのはこれらのうち3個のみである。28E4抗体は最も相同性の高いヒト表面を提供するので、muDS6をリサーフェシングするための最良の候補である。
[244] PCR変異誘発により、前記11個の表面残基をDS6のものと交換した。リ
サーフェシングしたヒトDS6遺伝子を構築するために、ネズミDS6可変部cDNAクローンにPCR変異誘を行った。リサーフェシングしたDS6に必要なアミノ酸変化を生じさせるために、下記の表8に示すヒト化用プライマーセットを設計した。
反応ミックスが、最終濃度1×の反応用緩衝液(ROCHE)、各2mMのdNTP、各1m
Mのプライマー、100ngの鋳型、5μlのDMSO、および0.5μlのTaq(ROCHE)を含有)。MJ researchサーモサイクラーで下記のプログラムを用いて操作した:1)94℃、3分;2)94℃、15秒;3)55℃、1分;4)72℃、1分;5)工程2に戻って29回;6)最終延長工程72℃、4分で終了。PCR生成物をそれらに対応する制限酵素で消化し、pBluescriptクローニングベクター中へクローニングした。アミノ酸の変化を確認するために、クローンの配列を決定した。
構築した:1つはヒト28E4 T73を含むもの、1つはネズミP73を保持したもの。両バージョンのヒト化DS6において、他の10個の表面残基をネズミのものからヒト28E4残基に交換した(表2)。通常の命名法に従えば、最もヒトに近いものはバージョン1.0である。これは11個すべてのヒト表面残基をもつからである。さらにバージョンが必要な場合、ネズミP73を保持したH鎖バージョンをバージョン1.2と命名し、バージョン1.1は最大数のネズミ残基を含むバージョンのために残しておく。2つのヒト化バージョンのアミノ酸配列をネズミDS6アミノ酸配列とアラインさせて図15AおよびBに示す。両方のヒト化DS6抗体遺伝子を、一過性および安定トランスフェクションのために抗体発現プラスミド(図14)中へクローニングした。ヒト化バージョンv1.0とv1.2のL鎖可変部のcDNA配列およびアミノ酸配列は同一であり、図16に示される。ヒト化バージョンv1.0およびv1.2のH鎖cDNA配列およびアミノ酸配列を図17AおよびBに示す。
[247] ヒト化バージョンがmuDS6の結合親和性を保持しているかどうかを判定す
るためには、抗体を発現させ、精製する必要があった。CHO細胞に各抗体発現プラスミドをトランスフェクションした。huDS6の一過性発現レベルはきわめて低かったので、安定な細胞系を選択した。
内で非選択培地(Alpha MEM+ヌクレオチド(Gibco);4mMのL−グルタミ
ン、50U/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン、および10% v/vのFBSを補充したもの)に接種し、37℃、5%CO2の加湿インキュベーターに入れた。翌日、PolyfectトランスフェクションのためのQuiagen推奨プロトコ
ル改変版を用いて、細胞にhuDS6 v1.0およびv1.2発現プラスミドをトランスフェクションした。非選択培地を細胞から吸引した。プレートを7mlの予熱(37℃)PBSで洗浄し、20mlの非選択培地を補給した。プラスミドDNA(11μg)を800μlのハイブリドーマSFM(Gibco)中へ希釈した。次いで70μlのPoly
fect(Quiagen)をこのDNA/SFM混合物に添加した。次いでPolyfect
混合物を数秒間穏やかに渦撹拌し、周囲温度で10分間インキュベートした。非選択培地(2.7ml)を混合物に添加した。最終混合物を、接種した細胞と共に24時間インキュベートした。
プシン処理し、計数した。次いで細胞を96ウェルプレート内の選択培地(Alpha MEM−ヌクレオチド;4mMのL−グルタミン、50U/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン、10% v/vのFBS、1.25mg/mlのG418を補充したもの)(250μl/ウェル)に、種々の密度(1800、600、200、および67個/ウェル)で接種した。必要ならば培地を補充しながら、細胞を2〜3週間インキュベートした。定量ELISAにより、ウェルを抗体産生レベルについてスクリーニングした。Immunolon 2HB 96ウェルプレートをヤギ抗ヒトIgG F(ab)2抗体(Jackson Immunoresearch;1μg/ウェル、50mM炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)100μl中)でコーティングし、周囲温度で揺動しながら1.5時間インキュベートした。以後のすべての工程を周囲温度で実施した。ウェルをT−TBS(0.1%Tween 20、TBS)で2回洗浄し、200μlの遮断用緩衝液(1%BSA、T−TBS)で1時間遮断した。ウェルをT−TBSで2回洗浄した。別のプレート内で、抗体標準品EM164(100ng/ml)および培養上清を遮断用緩衝液により系列希釈した(1:2または1:3)。これらの希釈液(100μl)をELISAプレートに移し、1時間インキュベートした。ウェルをT−TBSで3回洗浄し、遮断用緩衝液中に1:3000希釈したヤギ抗ヒトIgG Fc−AP(Jackson Immunoresear
ch)100μlと共に45分間インキュベートした。ウェルをT−TBSで5回洗浄した後、100μlのPNPP現像試薬(10mg/mlのPNPP(p−ニトロフェニルホスフェート・二ナトリウム塩;Pierce)、0.1Mのジエタノールアミン、pH10.3の緩衝液)により25分間現像した。405nmにおける吸光度をELISAプレートリーダーで測定した。標準曲線の直線部分の吸光度の読み(培養上清の)を用いて、抗体濃度を判定した。
細胞ストックを調製した。精製するのに十分な量を産生させるために、細胞を30mlの選択培地で15cmのプレートに展延し(約1×106個/プレート)、1週間インキュベートした。培養上清を250mlのコニカルチューブ中へ採集し、卓上型遠心機で遠心し(2000rpm、5分、4℃)、次いで0.2μmの濾過装置により無菌的に濾過した。
終pH8.0にした。Hi Trap rProtein Aカラム(Amersham)を20〜50カラム体積の結合用緩衝液で平衡化した。上清を蠕動ポンプでカラムに装入した。次いでカラムを50カラム体積の結合用緩衝液で洗浄した。結合した抗体を溶離用緩衝液(100Mmの酢酸、50mMのNaCl、pH3)により、フラクションコレクターに取り付けた試験管中へ溶離した。溶出した抗体を、次いで中和用緩衝液(2MのK2HPO4、pH10.0)により中和し、次いでPBS中で一夜透析した。透析した抗体を0.2μmのシリンジフィルターにより濾過した。280nmにおける吸光度を測定して最終タンパク質濃度を判定した。
。第1組の実験では、CA6発現細胞系WISHへの直接結合を測定した。図18Aに示すように、キメラDS6、huDS6 v1.0、およびhuDS6 v1.2は、それぞれ3.15nM、3.71nM、および4.2nMの見掛けKDをもつきわめて類似した親和性を示す;これは、リサーフェシングがCDRを撹乱しなかったことを示唆する。これらの親和性は、図18Bに示すmuDS6のもの(Kd=1.93nM)よりわずかに低いだけである。
[253] DS6抗体(8mg/ml)を8倍モル過剰のN−スクシンイミジル−4−(
2−ピリジルジチオ)ペンタノエート(SPP)により修飾して、ジチオピリジル基を導入した。95% v/vの緩衝液A(50mMのKPi、50mMのNaCl、2mMの
EDTA、pH6.5)および5% v/vのDMA中、室温で2時間、反応を実施した。わずかに膨張した反応混合物をNAPまたはSephadex G25カラム(緩衝液A中で平衡化)によりゲル濾過した。280nmにおける抗体の吸光度、ならびに280および343nmにおけるDTT放出2−メルカプトピリジン(Spy)の吸光度を測定することにより、修飾度を判定した。次いで抗体2.5mg/mLの修飾DS6を、Spyより1.7倍モル過剰のN2’−デアセチル−N2’−(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−メイタンシン(L−DM1)を用いてコンジュゲートさせた。この反応は、DMA(3% v/v)を含む緩衝液A(97% v/v)中で実施された。反応物を室温で一夜、約20時間インキュベートした。不透明な反応混合物を遠心し(1162×g、10分)、次いで緩衝液B(1×PBS、pH6.5)中で平衡化したNAP−25またはS300(Tandem 3、3×26/10脱塩用カラム、G25媒体)カラムにより上清をゲル濾過した。ペレットを廃棄した。コンジュゲートを0.22μmのMillex−GVフィルターにより無菌的に濾過し、Slide−A−Lyzerを含む緩衝液B中で透析した。濾過した材料の252nmおよび280nm両方における吸光度を測定することにより、DS6の分子当たり連結したDM1分子の個数を判定した。DM1/抗体比は4.36であることが認められ、コンジュゲートDS6の工程収率は55%であった。コンジュゲート抗体の濃度は1.32mg/mLであった。この精製コンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により生化学的に解明し、92%が単量体であることが認められた。精製コンジュゲート中のDM1の分析は、99%が抗体に共有結合していることを示した。図20に、Cao−3細胞へのDS6−DM1コンジュゲートおよび非修飾DS6のフローサイトメトリー結合は、DS6のコンジュゲーションにより親和性がわずかに低下したにすぎないことを示す。
[254] 裸の抗体としてのDS6は、細胞培養において増殖または成長の阻害活性を示
さなかった(図21)。しかし、ヤギ抗ヒトIgG H鎖およびL鎖へのDM1コンジュゲートの存在下でDS6を細胞と共にインキュベートすると、DS6はこのコンジュゲートを細胞へ効果的にターゲティングおよび送達して間接的な細胞毒性を生じるのにきわめて有効である(図21)。裸のDS6に固有の活性をさらに試験するために、ネズミおよびヒト化DS6を用いる補体依存性細胞毒性(CDC)アッセイを実施した。HPACおよびZR−75−1細胞(25000個/ウェル)を、96ウェルプレート内で、5%ヒトまたはウサギ血清ならびに種々の希釈度のネズミまたはヒトDS6の存在下に、200μlのRHBP培地(RPMI−1640;0.1%のBSA、20mMのHEPES(pH7.2〜7.4)、100U/mlのペニシリン、および100ug/mlのストレプトマイシン)に接種した。細胞を37℃で2時間インキュベートした。次いでAlamar Blue(最終濃度10%)試薬(Biosource)を上清に添加した。細胞を5〜2
4時間インキュベートした後、蛍光を測定した。ネズミおよびヒト化DS6は両方とも、補体依存性細胞毒性(CDC)アッセイに影響を及ぼさなかった(図22)。これは、DS6を療法に使用するためには毒性エフェクター分子へのコンジュゲーションが必要なことを示唆する。
ンシノイドにコンジュゲートしたDS6抗体の細胞毒性を検査した。6ウェルプレート上で、培地中に希釈したコンジュゲート2ml中に細胞(1000〜2500個/ウェル)を接種して、コロニー形成アッセイを実施した。一般に3×10−11〜3×10−9Mの数種類の濃度のコンジュゲートに細胞を連続曝露し、37℃、6%CO2の加湿チャンバー内で5〜9日間インキュベートした。ウェルをPBSで洗浄し、コロニーを1% w/vクリスタルバイオレット/10% v/vホルムアルデヒド/PBS溶液で染色した。次いで、結合しなかった色素を蒸留水でウェルから十分に洗い去り、プレートを自然乾燥させた。Leica StereoZoom 4解剖顕微鏡によりコロニーを計数した
。
のPE/非処理細胞のPEとして生存率を計算した。細胞生存率をコンジュゲートのモル濃度に対してグラフにすることにより、IC50濃度を判定した。コロニー形成アッセイ(図23)において、DS6−DM1は800pMの推定IC50でCao−3細胞を殺すのに有効であった。抗原陰性細胞A375は、試験したDS6−DM1の最高濃度3×10−9Mのコンジュゲートにより、わずかしか影響を受けなかった;これは、コンジュゲートの殺細胞活性が特異的に抗原発現細胞に向けられていることを立証する。しかし、他の多くのDS6陽性細胞系は、メイタンシンに対して明らかに感受性であるにもかかわらず免疫コンジュゲートに対して格別感受性ではなかった。子宮頸部細胞系(HeLa、KB、およびWISH)はコンジュゲートに対して感受性であったが、特定数の卵巣および胸部細胞系のみが細胞毒効果を示した。膵臓細胞系は影響を受けないように思われた。
/ウェルの密度で接種した。裸のDS6またはDS6−DM1免疫コンジュゲートの系列希釈液と共に、細胞を培地200μlに接種した。試料を三重に試験した。次いで細胞と抗体/コンジュゲートの混合物を2〜7日間インキュベートした時点で、MTT([3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)]アッセイにより細胞の生存率を評価した。MTT(50μg/ウェル)を培養上清に添加し、37℃で3〜4時間インキュベートした。培地を除去し、MTTホルマザンをDMSO(175μl/ウェル)に溶解した。540〜545nmにおける吸光度を測定した。MTT細胞生存率アッセイ(図24C)において、免疫コンジュゲートは1.61nMの推定IC50でCao−3細胞を効果的に殺すことができた。効果のない裸の抗体と比較して、最高濃度のコンジュゲートを含むウェルには生存細胞が含まれなかった(図21および24)。
、BおよびD〜I)。多くの場合、若干の細胞毒性がみられたが、コンジュゲートは全細胞集団を完全に殺すことはできなかった(WISH細胞を除く)。BT−20、OVCAR5、およびHPAC細胞は特に抵抗性であった:最高濃度のコンジュゲート(32nM)のウェルにおいて、50%を超える細胞がなお生存していた。
[259] DS6−DM1コンジュゲートのインビボ活性を立証するために、SCIDマ
ウスにヒト腫瘍異種移植体を樹立した。ヒト子宮頸癌細胞系KBの皮下モデルを開発した。KB細胞をインビトロ増殖させ、採集し、無血清培地100μL中5×106個を各マウスの右肩下に注射し、6日間増殖させて平均腫瘍体積144±125mm3になった時点で薬物処理を開始した。マウスに、PBS、DM1 150μg/kgのコンジュゲート、またはDM1 225μg/kgのコンジュゲート(各群2匹のマウス)を6日間、毎日、静脈内投与した。処理期間中、1日1回、中毒反応をモニターした。処理期間中、腫瘍体積(図25A)および対応する体重(図25B)をモニターした。
れに対し、コンジュゲートで処理したマウスは両群とも完全な腫瘍退縮を示した;225μg/kgおよび150μg/kg投与群で、それぞれ処理開始後14日目および18日目。150μg/kg投与量では、腫瘍遅延が約70日間であった。225μg/kgの処理では120日目に試験を終了した時点で腫瘍再発の証拠はなかったので、治癒した。図25Bにみられるように、150μg/kg群のマウスは体重減少を示さなかった;これは、この用量が十分に耐容されることを示した。高い方の用量では、マウスは3%の一
時的な体重減少を生じたにすぎない。5日間の処理期間中、マウスは目に見える中毒徴候を示さなかった。これらを合わせると、この試験はDS6−DM1処理によりマウスのKB異種移植腫瘍を無毒性用量で治癒しうることを立証する。
図26参照)。異種移植体の形成に用いた腫瘍細胞系は、ある程度のインビトロメイタンシン感受性およびCA6エピトープ密度を示した(下記の表9を参照)。OVCAR5細胞およびTOV−21Gは卵巣腫瘍細胞系である;HPACは膵臓腫瘍細胞系である;HeLaは子宮頸部腫瘍細胞系である。OVCAR5およびTOV−21G細胞は低い表面CA6発現を示す;HeLa細胞は中間レベルの表面CA6発現を示す;HPACは高いCA6表面発現密度を示す。TOV−21GおよびHPAC細胞はメイタンシン感受性である;OVCAR5およびHeLa細胞はメイタンシン感受性が2〜7倍低い。
[262] 前記の4細胞系をインビトロ増殖させ、採集し、無血清培地100μL中1×
107個を各マウスの右肩下に注射し(各モデル当たり6匹のマウス)、6日間増殖させて、平均腫瘍体積がOVCAR5の被験群および対照群についてはそれぞれ57.6±6.7および90.2±13.4mm3、HPACの被験群および対照群についてはそれぞれ147±29.6および176.2±18.9mm3、HeLaの被験群および対照群についてはそれぞれ194.3±37.2および201.7±71.7mm3、TOV−21Gの被験群および対照群についてはそれぞれ96.6±22.8および155.6±13.4mm3になった時点で、薬物処理を開始した。各モデルについて3匹の対照マウスを週1回のPBSで2回、3匹の被験マウスを週1回のコンジュゲート(DM1 600μg/kg)で2回、静脈内処理した。処理期間中、1日1回、中毒反応をモニターし、処理期間中、腫瘍体積および体重をモニターした。種々のモデルについてのコンジュゲート効果を図26A、C、EおよびGにグラフで示し、対応する体重を図26B、D、FおよびHにプロットする。OVCAR5、TOV−21GおよびHPAC細胞系は、各モデルのPBS対照にみられるように、進行性腫瘍を形成した。HeLaモデルは、対数増殖開始前に約3週間の遅滞期があった。すべてのモデルにおいて、DS6−DM1コンジ
ュゲート処理によりすべてのマウスで腫瘍が完全に退縮した。TOV−21G、HPACおよびHeLaモデルについて、マウスは61日目に腫瘍のない状態を維持している。OVCAR5モデルでは、腫瘍接種後、約45日目に腫瘍が再発した。したがって、このモデルではDS6−DM1処理が腫瘍増殖を約34日間遅延させている。OVCAR5細胞はメイタンシン感受性がより低く、かつCA6エピトープ発現が低いので、この増殖遅延は重要である。CA6エピトープ密度がより高いモデル、またはより高いメイタンシン感受性をもつモデルでは、腫瘍退縮がより著しい。2回投与しただけである点に注目することが重要である。体重減少はみられなかったので、この試験に採用した投与計画は明らかにマウスに対する毒性がなかった。追加またはより多量のコンジュゲートの投与により治癒を達成できると思われる。
スの腹腔内(IP)モデルとしてヒト疾患と同様に進行増殖して腫瘍結節を形成し、腹水を産生する。IPモデルにおける活性を立証するために、OVCAR5 IP腫瘍を伴うマウスをDS6−DM1により処理した(図27)。OVCAR5細胞をインビトロ増殖させ、採集し、無血清培地100μL中1×107個を腹腔内注射した。腫瘍を6日間増殖させた時点で処理を開始した。マウスを週1回で2週間、PBSまたはDM1 600μg/kg量のDS6−DM1コンジュゲートで処理し、腹膜疾患により生じる体重減少をモニターした。28日目までにPBS群のマウスは20%を超える体重が減少し、安楽死させた。処理群は体重減少が20%を超えた後、45日目に安楽死させた。この試験は、OVCAR5はメイタンシンに対する感受性がより低く、かつ細胞当たりのCA6エピトープが少ないという事実にもかかわらず、DS6−DM1が進行性OVCAR5モデルにおいて腫瘍の増殖を遅延しうることを立証する。採用した投与計画は目に見える中毒徴候を誘発しなかったので、追加およびより多量を用いてさらに腫瘍増殖の遅延または治癒を達成できると思われる。
[264] DS6をN−スルホスクシンイミジル4−ニトロ−2−ピリジル−ペンタノエ
ート(SSNPP)リンカーにより修飾した。90%緩衝液A中50mgのDS6抗体に、DMA中10当量のSSNPPを添加した。抗体の最終濃度は8mg/mlであった。反応物を室温で4時間撹拌し、次いでG25クロマトグラフィーにより精製した。分光光度法で280nm(抗体)および325(リンカー)における吸光により、抗体の修飾度を測定し、リンカー3.82/抗体をもつことが認められた。抗体の回収量は43.3mgであり、87%の収率が得られた。DS6−ニトロSPPのコンジュゲートをタキソイドMM1−202(1812P.16)とコンジュゲートさせた。42mg規模で、90%の緩衝液A、10%のDM1中においてコンジュゲーションを実施した。前記のタキソイドを0.43当量/リンカー(各回)で4回、約20時間かけて添加した。この時点までに反応物は顕著に混濁した。G25精製の後、約64%の収率で回収された生成コンジュゲートはタキソイド約4.3/抗体を含み、未反応リンカー約1当量が残っていた。未反応リンカーを不活性化するために、一夜撹拌しながら1当量のシステイン/未反応リンカーをコンジュゲートに添加した。システインを添加すると明瞭な黄色の呈色が認められ、チオピリジンの遊離が指示された。次いで反応溶液を緩衝液B/0.01% Tween 20中で透析し、続いて緩衝液B単独中で数日間かけてさらに透析した。最終コンジュゲートは薬物2.86/抗体を含んでいた。抗体回収量は14.7mgであり、全体として35%の収率が得られた。コンジュゲートをさらにSECにより生化学的に解明し、単量体89%、二量体10.5%、およびより高分子量の凝集体0.5%を含むことが認められた。
体の結合を比較したフローサイトメトリー分析の結果を図28に示す。この結果は、DS6がタキサンにコンジュゲートした場合に結合活性を保持することを示す。
子を保有する炭素原子におけるモノまたはジ−アルキル置換をもつチオール−およびジスルフィド含有メイタンシノイドが含まれる。これらには、下記をもつメイタンシノイドが含まれる:C−3、C−14ヒドロキシメチル、C−15ヒドロキシ、またはC−20デスメチル、アシル基がヒンダードスルフヒドリル基を保有するアシル化アミノ酸側鎖、その際チオール官能基を保有するアシル基の炭素原子は1または2つの置換基をもち、それらの置換基はCH3、C2H5、1〜10個の炭素原子をもつ直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子をもつ環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらに置換基の1つはHであってもよく、アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子の間に少なくとも3個の炭素原子長さの直鎖をもつ。
VII)の化合物が含まれる。
[150] 前記のメイタンシノイド類を、抗CA6抗体DS6またはその相同体もしくは
フラグメントにコンジュゲートさせることができる。その際、メイタンシノイドのC−3にあるアシル化アミノ酸側鎖のアシル基にあるチオール−もしくはジスルフィド官能基、C−14ヒドロキシメチル、C−15ヒドロキシ、またはC−20デスメチルを用いて、抗体をメイタンシノイドに結合させ、その際、アシル化アミノ酸側鎖のアシル基のチオール−もしくはジスルフィド官能基は1または2つの置換基をもつ炭素原子にあり、それらの置換基はCH3、C2H5、1〜10個の炭素原子をもつ直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子をもつ分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり、さらに置換基の1つはHであってもよく、アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子の間に少なくとも3個の炭素原子長さの直鎖をもつ。
A、BおよびDは、それぞれ独立して、3〜10個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくは複素環式基であり;
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11およびR12は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくは複素環式基であり;
l、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuは、それぞれ独立して0または1〜5の整数であり、ただしl、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuのうち少なくとも2つ
はいかなる場合にもゼロではない。
Claims (97)
- L鎖可変部またはそのフラグメントが、SEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:8のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項3に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
- L鎖可変部またはそのフラグメントが、SEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する、請求項3に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
- H鎖可変部またはそのフラグメントが、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:11のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項6に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
- H鎖可変部またはそのフラグメントが、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する、請求項6に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
- 請求項1、2、3または6のいずれか1項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1、2、3または6のいずれか1項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントのL鎖またはH鎖をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項9に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項10に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- ベクターが該抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを発現する発現ベクターである、請求項11に記載のベクター。
- ベクターが該抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを発現する発現ベクターである、請求項12に記載のベクター。
- 下記を含むリサーフェシング法により作製された、CA6グリコトープに結合するヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメント:
(a)げっ歯類およびヒトの抗体H鎖およびL鎖可変部のプールのx線結晶学的構造により得た相対アクセシビリティー分布から位置アラインメントを作成して、H鎖およびL鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組の位置を求め、その際げっ歯類およびヒトのすべての可変部のアラインメント位置が少なくとも約98%同一であり;
(b)げっ歯類の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントについて、工程(a)で求めたH鎖およびL鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組の位置を用いて、H鎖およびL鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基を決定し;
(c)ヒト抗体アミノ酸配列から、工程(b)で決定したH鎖およびL鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基に最も近い同一性を有する、H鎖およびL鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基を同定し;
(d)げっ歯類の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの可変部フレームワークアミノ酸配列において、工程(b)で決定したH鎖およびL鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基を、工程(c)で同定したH鎖およびL鎖可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基で置換し;
(e)げっ歯類の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの可変部、および工程(d)で特定した置換により得られたげっ歯類の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの可変部の三次元モデルを構築し;
(f)工程(e)で構築した三次元モデルを比較し、工程(b)または(c)で決定した組から、げっ歯類の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの相補性決定領域のいずれかの残基のいずれかの原子から5Å以内にあるアミノ酸残基を同定し;
(g)工程(f)で同定したいずれかの残基をヒトのアミノ酸残基から元のげっ歯類のアミノ酸残基に交換し、これにより表面に露出したアミノ酸残基のヒト化用の一組を決定し;
(h)工程(b)で決定したげっ歯類抗体可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基を、工程(g)で決定したヒト化用の、可変部フレームワーク表面に露出した一組のアミノ酸残基で置換し;そして
(i)CA6グリコトープに結合するヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを作製する。 - ヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメントがエピトープ結合フラグメントである、請求項15に記載のヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
- エピトープ結合フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fdフラグメント、一本鎖Fv(scFv)フラグメント、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdFv)フラグメント、およびVLまたはVHドメインのいずれかを含むフラグメントよりなる群から選択される、請求項16に記載のヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
- 表面に露出したアミノ酸残基が、溶媒アクセシビリティー30%を超える残基である、請求項15または16に記載のヒト化したげっ歯類抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
- CA6グリコトープ発現細胞に結合する改良された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントであって、下記により作製される改良された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント:
(a)SEQ ID NO:1〜11:
(b)該DNAポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列の少なくとも1つの残基を変化させるように、(a)のDNAポリヌクレオチドに少なくとも1つのヌクレオチドの変異、欠失または挿入を導入し;
(c)(b)のDNAポリヌクレオチドがコードする抗体または抗体フラグメントを発現させ;そして
(d)発現した抗体または抗体フラグメントをCA6グリコトープ発現細胞への結合親和性の改良についてスクリーニングし、これにより、改良された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを得る。 - 少なくとも1つのヌクレオチドの変異、欠失または挿入を、オリゴヌクレオチド仲介による部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、誤りがちなPCR、DNAシャフリング、および大腸菌(E.coli)のミューテーター株の使用よりなる群から選択される方法により行う、請求項23に記載の改良された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
- 細胞結合剤および細胞毒性物質を含み、細胞結合剤がCA6グリコトープに結合する、細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞結合剤と細胞毒性物質が共有結合している、請求項25に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞結合剤と細胞毒性物質がPEG連結基により共有結合している、請求項25に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞結合剤と細胞毒性物質が、細胞毒性物質のチオールまたはジスルフィド官能基により共有結合している、請求項25に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞結合剤が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体のフラグメント、ヒト化またはリサーフェシングした抗体、抗体の機能均等物、改良された抗体、インターフェロン、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、トランスフェリンおよびビタミンよりなる群から選択されるメンバーである、請求項25に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 抗体のフラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fdフラグメント、一本鎖Fv(scFv)フラグメント、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdFv)フラグメント、およびVLまたはVHドメインのいずれかを含むフラグメントよりなる群から選択される、請求項29に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞結合剤が、抗CA6モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントである、請求項25に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞結合剤が、ネズミ抗CA6モノクローナル抗体DS6またはそのエピトープ結合フラグメントである、請求項25に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞結合剤が、ヒト化バージョンのネズミ抗CA6モノクローナル抗体DS6またはそのエピトープ結合フラグメントである、請求項25に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞毒性物質が、メイタンシノイド化合物、タキソイド化合物、CC−1065化合物、ドラスタチン化合物、ダウノルビシン化合物、およびドキソルビシン化合物よりなる群から選択されるメンバーである、請求項25に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞毒性物質が、式(III)のメイタンシン:
Y’は、
R1およびR2は、それぞれ独立して、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2はHであってもよく;
A、B、Dは、3〜10個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり;
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11およびR12は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり;
l、m、n、o、p、q、r、sおよびtは、それぞれ独立して0または1〜5の整数であり、ただしl、m、n、o、p、q、r、sおよびtのうち少なくとも2つはいかなる場合にもゼロではなく;
Zは、H、SRまたは−CORであり、ここでRは1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基である]である、請求項34に記載の細胞毒性コンジュゲート。 - R1がHであり、R2がメチルであり、ZがHである、請求項37に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- R1およびR2がメチルであり、ZがHである、請求項37に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- R1がHであり、R2がメチルであり、Zが−SCH3である、請求項37に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- R1およびR2がメチルであり、Zが−SCH3である、請求項37に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞毒性物質が、式(IV−L)、(IV−D)および(IV−D,L)よりなる群から選択されるメイタンシン:
Yは、
R1およびR2は、それぞれ独立して、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2はHであってもよく;
R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり;
l、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく;
Zは、H、SRまたは−CORであり、ここでRは1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり;
Mayは、C−3の側鎖、C−14ヒドロキシメチル、C−15ヒドロキシを有する、またはC−20デスメチルであるメイタンシノイド類を表わす]である、請求項34に記載の細胞毒性コンジュゲート。 - R1がHであり、R2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmがそれぞれ1であり、nが0であり、ZがHである、請求項42に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- R1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmが1であり、nが0であり、ZがHである、請求項42に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- R1がHであり、R2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmがそれぞれ1であり、nが0であり、Zが−SCH3である、請求項42に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- R1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmが1であり、nが0であり、Zが−SCH3である、請求項42に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞毒性物質が、式(IV−L)で表わされる、請求項42に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞毒性物質が、式(V)のメイタンシン:
Yは、
R1およびR2は、それぞれ独立して、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2はHであってもよく;
R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり;
l、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく;
Zは、H、SRまたは−CORであり、ここでRは1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基である]である、請求項34に記載の細胞毒性コンジュゲート。 - R1がHであり、R2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり;lおよびmがそれぞれ1であり;nが0であり;ZがHである、請求項48に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- R1およびR2がメチルであり;R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり;lおよびmが1であり;nが0であり;ZがHである、請求項48に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- R1がHであり、R2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmがそれぞれ1であり、nが0であり、Zが−SCH3である、請求項48に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- R1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmが1であり、nが0であり、Zが−SCH3である、請求項48に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞毒性物質が、式(VI−L)、(VI−D)および(VI−D,L)よりなる群から選択されるメイタンシン:
Y2は、
R1およびR2は、それぞれ独立して、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2はHであってもよく;
R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖環式アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり;
l、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく;
Z2は、SRまたはCORであり、ここでRは1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり;
Mayは、メイタンシノイド類である]である、請求項34に記載の細胞毒性コンジュゲート。 - 細胞毒性物質が、式(VII)のメイタンシン:
Y2’は、
R1およびR2は、それぞれ独立して、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2はHであってもよく;
A、BおよびDは、それぞれ独立して、3〜10個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり;
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11およびR12は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり;
l、m、n、o、p、q、r、sおよびtは、それぞれ独立して0または1〜5の整数であり、ただしl、m、n、o、p、q、r、sおよびtのうち少なくとも2つはいかなる場合にもゼロではなく;
Z2は、SRまたは−CORであり、ここでRは1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基である]である、請求項34に記載の細胞毒性コンジュゲート。 - R1がHであり、R2がメチルである、請求項54に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞毒性物質が、式(VIII)のメイタンシン:
Y1’は、
A、BおよびDは、それぞれ独立して、3〜10個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換されたアリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり;
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11およびR12は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり;
l、m、n、o、p、q、r、sおよびtは、それぞれ独立して0または1〜5の整数であり、ただしl、m、n、o、p、q、r、sおよびtのうち少なくとも2つはいかなる場合にも非ゼロではない]である、請求項34に記載の細胞毒性コンジュゲート。 - R1がHであり、R2がメチルである、請求項56に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- R1およびR2がメチルである、請求項56に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞毒性物質が、式(IX−L)、(IX−D)および(IX−D,L)よりなる群から選択されるメイタンシン:
Y1は、
R1およびR2は、それぞれ独立して、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2はHであってもよく;
R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり;
l、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく;
Mayは、C−3の側鎖、C−14ヒドロキシメチル、C−15ヒドロキシを有する、またはC−20デスメチルであるメイタンシノイド類を表わす]である、請求項34に記載の細胞毒性コンジュゲート。 - R1がHであり、R2がメチルであるか、あるいはR1およびR2がメチルである、請求項59に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- R1がHであり、R2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり;lおよびmがそれぞれ1であり;nが0である、請求項59に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- R1およびR2がメチルであり;R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり;lおよびmが1であり;nが0である、請求項59に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞毒性物質が、式(IX−L)で表わされる、請求項60に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞毒性物質が、式(IX−L)で表わされる、請求項61に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞毒性物質が、式(IX−L)で表わされる、請求項62に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞毒性物質が、式(X)のメイタンシン:
Y1は、
R1およびR2は、それぞれ独立して、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり、さらにR2はHであってもよく;
R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、それぞれ独立して、H、CH3、C2H5、1〜10個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、3〜10個の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキル基であり;
l、mおよびnは、それぞれ独立して1〜5の整数であり、さらにnは0であってもよく;
Mayは、C−3の側鎖、C−14ヒドロキシメチル、C−15ヒドロキシを有する、またはC−20デスメチルであるメイタンシノイド類を表わす]である、請求項34に記載の細胞毒性コンジュゲート。 - R1がHであり、R2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり、lおよびmがそれぞれ1であり、nが0である、請求項66に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- R1およびR2がメチルであり;R5、R6、R7およびR8がそれぞれHであり;lおよびmが1であり;nが0である、請求項66に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- 細胞結合剤が、ヒト化バージョンのネズミ抗CA6モノクローナル抗体DS6またはそのエピトープ結合フラグメントであり、かつ細胞毒性物質がDM1またはDM4である、請求項25に記載の細胞毒性コンジュゲート。
- CA6グリコトープ発現細胞の増殖を阻害する方法であって、CA6グリコトープ発現細胞を請求項25に記載の細胞毒性コンジュゲートと接触させることを含む方法。
- CA6グリコトープ発現細胞の増殖を阻害するための請求項71に記載の方法であって、細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としての抗CA6モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのDM1またはDM4を含む方法。
- CA6グリコトープ発現細胞の増殖を阻害するための請求項71に記載の方法であって、細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としての抗CA6モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのタキサン類を含む方法。
- CA6グリコトープ発現細胞の増殖を阻害するための請求項71に記載の方法であって、細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体DS6またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのDM1またはDM4を含む方法。
- CA6グリコトープ発現細胞の増殖を阻害するための請求項71に記載の方法であって、細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体DS6またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのタキサン類を含む方法。
- CA6グリコトープ発現細胞の増殖を阻害するための請求項71に記載の方法であって、増殖の阻害により細胞が死滅する方法。
- CA6グリコトープ発現細胞の増殖を阻害するための請求項71に記載の方法であって、インビボ、インビトロまたはエクスビボで実施する方法。
- 請求項25に記載の細胞毒性コンジュゲートおよび医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含む、療法用組成物。
- 細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体DS6またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのDM1またはDM4を含む、請求項78に記載の療法用組成物。
- 細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体DS6ま
たはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのタキサン類を含む、請求項78に記載の療法用組成物。 - 癌を伴う対象の処置方法であって、癌を伴う対象に療法有効量の請求項78に記載の療法用組成物を投与し、癌を伴う対象をこれにより処置する方法。
- 細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体DS6またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのDM1またはDM4を含む、請求項81に記載の癌を伴う対象の処置方法。
- 細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体DS6またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのタキサン類を含む、請求項81に記載の癌を伴う対象の処置方法。
- 癌が、CA6グリコトープを発現または過剰発現する癌である、請求項81に記載の癌を伴う対象の処置方法。
- 癌が、漿液性卵巣癌、子宮内膜様卵巣癌、子宮頸部の新生物、子宮内膜の新生物、外陰の新生物、胸部癌、膵臓腫瘍、および尿路上皮の腫瘍よりなる群から選択される、請求項81に記載の癌を伴う対象の処置方法。
- 請求項25に記載の細胞毒性コンジュゲートを含み、さらに
a)細胞毒性コンジュゲートを収容するコンパートメント;および
b)キットを使用するための指示
を含むキット。 - 細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体DS6またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのDM1またはDM4を含む、請求項86に記載のキット。
- 細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体DS6またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのタキサン類を含む、請求項86に記載のキット。
- 指示が、癌を伴う対象を処置するための指示を含む、請求項86に記載のキット。
- 癌が、CA6グリコトープを発現または過剰発現する癌である、請求項89に記載のキット。
- 癌が、漿液性卵巣癌、子宮内膜様卵巣癌、子宮頸部の新生物、子宮内膜の新生物、外陰の新生物、胸部癌、膵臓腫瘍、および尿路上皮の腫瘍よりなる群から選択される、請求項90に記載のキット。
- 請求項78に記載の療法用組成物を含み、さらに
a)療法用組成物を収容するコンパートメント;および
b)キットを使用するための指示
を含むキット。 - 細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体DS6またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのDM1またはDM4を
含む、請求項92に記載のキット。 - 細胞毒性コンジュゲートが細胞結合剤としてのヒト化バージョンのネズミ抗体DS6またはそのエピトープ結合フラグメントおよび細胞毒性物質としてのタキサン類を含む、請求項92に記載のキット。
- 指示が、癌を伴う対象を処置するための指示を含む、請求項92に記載のキット。
- 癌が、CA6グリコトープを発現または過剰発現する癌である、請求項95に記載のキット。
- 癌が、漿液性卵巣癌、子宮内膜様卵巣癌、子宮頸部の新生物、子宮内膜の新生物、外陰の新生物、胸部癌、膵臓腫瘍、および尿路上皮の腫瘍よりなる群から選択される、請求項96に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US48844703P | 2003-07-21 | 2003-07-21 | |
US60/488,447 | 2003-07-21 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014133794A Division JP5997727B2 (ja) | 2003-07-21 | 2014-06-30 | Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017033672A Division JP2017123857A (ja) | 2003-07-21 | 2017-02-24 | Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016128405A true JP2016128405A (ja) | 2016-07-14 |
JP6144749B2 JP6144749B2 (ja) | 2017-06-07 |
Family
ID=34102763
Family Applications (5)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006521193A Pending JP2007503202A (ja) | 2003-07-21 | 2004-07-21 | Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 |
JP2010262151A Expired - Fee Related JP5643619B2 (ja) | 2003-07-21 | 2010-11-25 | Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 |
JP2014133794A Expired - Fee Related JP5997727B2 (ja) | 2003-07-21 | 2014-06-30 | Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 |
JP2015237469A Expired - Fee Related JP6144749B2 (ja) | 2003-07-21 | 2015-12-04 | Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 |
JP2017033672A Pending JP2017123857A (ja) | 2003-07-21 | 2017-02-24 | Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 |
Family Applications Before (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006521193A Pending JP2007503202A (ja) | 2003-07-21 | 2004-07-21 | Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 |
JP2010262151A Expired - Fee Related JP5643619B2 (ja) | 2003-07-21 | 2010-11-25 | Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 |
JP2014133794A Expired - Fee Related JP5997727B2 (ja) | 2003-07-21 | 2014-06-30 | Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017033672A Pending JP2017123857A (ja) | 2003-07-21 | 2017-02-24 | Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20050123549A1 (ja) |
EP (1) | EP1660513B9 (ja) |
JP (5) | JP2007503202A (ja) |
KR (5) | KR101263950B1 (ja) |
CN (3) | CN1922199B (ja) |
AT (1) | ATE496944T1 (ja) |
AU (1) | AU2004258955C1 (ja) |
BR (1) | BRPI0412879A8 (ja) |
CA (1) | CA2532430C (ja) |
CR (1) | CR8207A (ja) |
CY (1) | CY1111938T1 (ja) |
DE (1) | DE602004031239D1 (ja) |
DK (1) | DK1660513T5 (ja) |
EA (1) | EA014640B1 (ja) |
EC (1) | ECSP066294A (ja) |
ES (1) | ES2360403T3 (ja) |
HK (2) | HK1098160A1 (ja) |
HR (1) | HRP20110302T1 (ja) |
IL (2) | IL172982A (ja) |
MX (2) | MXPA06000830A (ja) |
NO (1) | NO339324B1 (ja) |
NZ (3) | NZ580855A (ja) |
PL (1) | PL1660513T3 (ja) |
PT (1) | PT1660513E (ja) |
SI (1) | SI1660513T1 (ja) |
WO (1) | WO2005009369A2 (ja) |
ZA (1) | ZA200600375B (ja) |
Families Citing this family (55)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7097840B2 (en) | 2000-03-16 | 2006-08-29 | Genentech, Inc. | Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates |
US9539348B2 (en) | 2000-08-18 | 2017-01-10 | East Carolina University | Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof |
US6596503B1 (en) | 2000-08-18 | 2003-07-22 | East Carolina University | Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof |
US8088387B2 (en) | 2003-10-10 | 2012-01-03 | Immunogen Inc. | Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates |
US7276497B2 (en) | 2003-05-20 | 2007-10-02 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising new maytansinoids |
CA2525130C (en) * | 2003-05-20 | 2014-04-15 | Immunogen, Inc. | Improved cytotoxic agents comprising new maytansinoids |
US7834155B2 (en) | 2003-07-21 | 2010-11-16 | Immunogen Inc. | CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same |
CA2486285C (en) * | 2004-08-30 | 2017-03-07 | Viktor S. Goldmakher | Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof |
EP1917034A4 (en) * | 2005-08-22 | 2009-04-29 | Immunogen Inc | CA6 ANTIGEN-SPECIFIC CYTOTOXIC CONJUGATE AND METHOD OF ITS APPLICATION |
CN104804094A (zh) * | 2005-08-22 | 2015-07-29 | 伊缪诺金公司 | Ca6抗原特异性细胞毒性偶联物及其应用方法 |
SI2019104T1 (sl) | 2007-07-19 | 2013-12-31 | Sanofi | Citotoksična sredstva, ki obsegajo nove tomaimicinske derivate, in njihova terapevtska uporaba |
EP2801584B1 (en) * | 2007-12-26 | 2019-07-10 | Biotest AG | Agents targeting CD138 and uses thereof |
PT2242772E (pt) * | 2007-12-26 | 2015-02-09 | Biotest Ag | Imunoconjugados dirigidos contra cd138 e as suas utilizações |
JP2011508738A (ja) * | 2007-12-26 | 2011-03-17 | バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト | Cd138発現腫瘍細胞のターゲティングを向上させる方法及び剤 |
US9011864B2 (en) * | 2007-12-26 | 2015-04-21 | Biotest Ag | Method of decreasing cytotoxic side-effects and improving efficacy of immunoconjugates |
US8236319B2 (en) | 2008-04-30 | 2012-08-07 | Immunogen, Inc. | Cross-linkers and their uses |
NZ596807A (en) * | 2009-05-06 | 2013-09-27 | Biotest Ag | Uses of immunoconjugates targeting cd138 |
FR2947269B1 (fr) | 2009-06-29 | 2013-01-18 | Sanofi Aventis | Nouveaux composes anticancereux |
FR2949469A1 (fr) | 2009-08-25 | 2011-03-04 | Sanofi Aventis | Derives anticancereux, leur preparation et leur application en therapeutique |
TW201117814A (en) | 2009-10-02 | 2011-06-01 | Sanofi Aventis | New maytansinoids and the use of said maytansinoids to prepare conjugates with an antibody |
CN102933231B (zh) | 2010-02-10 | 2015-07-29 | 伊缪诺金公司 | Cd20抗体及其用途 |
FR2963007B1 (fr) | 2010-07-26 | 2013-04-05 | Sanofi Aventis | Derives anticancereux, leur preparation et leur application therapeutique |
RU2606016C2 (ru) * | 2011-01-14 | 2017-01-10 | Редвуд Байосайнс, Инк. | Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения |
WO2012143499A2 (de) | 2011-04-21 | 2012-10-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Neue binder-wirkstoff konjugate (adcs) und ihre verwendung |
WO2013043452A1 (en) * | 2011-09-20 | 2013-03-28 | Eli Lilly And Company | Anti-c-met antibodies |
BR112014013694A2 (pt) | 2011-12-08 | 2017-06-13 | Biotest Ag | método para tratar uma doença, e, kit |
JP2012161321A (ja) * | 2012-03-30 | 2012-08-30 | Immunogen Inc | Ca6抗原特異的細胞傷害性コンジュゲート、および該コンジュゲートを用いる方法 |
US9353150B2 (en) | 2012-12-04 | 2016-05-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment |
JP2016515093A (ja) * | 2013-02-05 | 2016-05-26 | サノフイ | 抗体−薬物コンジュゲート療法とともに使用するための免疫イメージング剤 |
SI2953977T1 (en) | 2013-02-05 | 2018-02-28 | Sanofi | An immuno-contrast agent for use in antibody-drug conjugate therapy |
US9989524B2 (en) | 2013-02-05 | 2018-06-05 | Sanofi | Immuno imaging agent for use with antibody-drug conjugate therapy |
WO2014144826A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Beckman Coulter, Inc. | Systems and methods for panel design in flow cytometry |
CN105592861A (zh) * | 2013-08-02 | 2016-05-18 | 赛诺菲 | 抗Muc1类美登素免疫偶联抗体用于治疗实体瘤的用途 |
SG11201604758PA (en) | 2013-12-23 | 2016-07-28 | Bayer Pharma AG | Antibody drug conjugates (adcs) with kinesin spindel protein (ksp) |
KR20160125515A (ko) * | 2014-03-12 | 2016-10-31 | 노파르티스 아게 | 면역접합체의 제조를 위한 항체의 변형에 사용되는 특정 부위 |
KR102626976B1 (ko) | 2014-09-02 | 2024-01-18 | 이뮤노젠 아이엔씨 | 항체 약물 컨쥬게이트 조성물의 제형화 방법 |
JP2017527562A (ja) | 2014-09-03 | 2017-09-21 | イミュノジェン・インコーポレーテッド | 細胞毒性ベンゾジアゼピン誘導体 |
ES2815353T3 (es) | 2014-09-03 | 2021-03-29 | Immunogen Inc | Derivados de benzodiazepina citotóxicos |
MX2017017172A (es) | 2015-06-22 | 2018-02-23 | Bayer Pharma AG | Conjugados de ligador-principio activo (adcs) y conjugados de ligador-profarmaco (apdcs) con grupos enzimaticamente escindibles. |
WO2017060322A2 (en) | 2015-10-10 | 2017-04-13 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Ptefb-inhibitor-adc |
JP2019501139A (ja) | 2015-11-25 | 2019-01-17 | イミュノジェン・インコーポレーテッド | 医薬製剤及びその使用 |
SG11201808167VA (en) | 2016-03-24 | 2018-10-30 | Bayer Pharma AG | Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups |
US10918627B2 (en) | 2016-05-11 | 2021-02-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs |
JP7022707B2 (ja) | 2016-06-15 | 2022-02-18 | バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト | Ksp阻害剤および抗cd123抗体を含む特異的抗体-薬物-コンジュゲート(adc) |
CA3047522A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors |
CN110312533B (zh) | 2016-12-21 | 2023-11-03 | 拜耳公司 | 具有酶促可裂解的基团的细胞毒性活性剂的前药 |
WO2018114578A1 (de) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen |
JP7106560B2 (ja) | 2017-02-28 | 2022-07-26 | イミュノジェン・インコーポレーテッド | 自己犠牲型ペプチドリンカーを有するメイタンシノイド誘導体及びそのコンジュゲート |
WO2018195243A1 (en) | 2017-04-20 | 2018-10-25 | Immunogen, Inc. | Cytotoxic benzodiazepine derivatives and conjugates thereof |
US11932650B2 (en) | 2017-05-11 | 2024-03-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis |
US10640508B2 (en) | 2017-10-13 | 2020-05-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers |
WO2019133652A1 (en) | 2017-12-28 | 2019-07-04 | Immunogen, Inc. | Benzodiazepine derivatives |
CA3133155A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | Fundacio Privada Institut D'investigacio Oncologica De Vall Hebron | Combination therapy for the treatment for cancer |
WO2020247054A1 (en) | 2019-06-05 | 2020-12-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof |
WO2023150677A2 (en) * | 2022-02-03 | 2023-08-10 | Igm Biosciences, Inc. | Anti-cd38 binding molecules and uses thereof |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06510671A (ja) * | 1991-09-23 | 1994-12-01 | メディカル リサーチ カウンシル | キメラ抗体の製造−組合せアプローチ |
WO2002016401A2 (en) * | 2000-08-18 | 2002-02-28 | East Carolina University | Monoclonal antibody ds6, tumor-associated antigen ca6, and methods of use thereof |
WO2002098883A1 (en) * | 2001-05-31 | 2002-12-12 | Immunogen, Inc. | Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents |
WO2003043583A2 (en) * | 2001-11-20 | 2003-05-30 | Seattle Genetics, Inc. | Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies |
WO2003057160A2 (en) * | 2002-01-02 | 2003-07-17 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5618920A (en) * | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
CA2026147C (en) * | 1989-10-25 | 2006-02-07 | Ravi J. Chari | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
US5208020A (en) * | 1989-10-25 | 1993-05-04 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
GB8928874D0 (en) * | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
US5639641A (en) * | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
CA2149329C (en) * | 1992-11-13 | 2008-07-15 | Darrell R. Anderson | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma |
US20030143233A1 (en) * | 1999-06-07 | 2003-07-31 | Neorx Corporation | Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof |
AU765588C (en) * | 1999-11-24 | 2004-12-16 | Immunogen, Inc. | Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use |
US6333410B1 (en) * | 2000-08-18 | 2001-12-25 | Immunogen, Inc. | Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids |
EP1258255A1 (en) * | 2001-05-18 | 2002-11-20 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid |
CA2462790A1 (en) * | 2001-10-04 | 2003-04-10 | Immunex Corporation | Ul16 binding protein 4 |
US6716821B2 (en) * | 2001-12-21 | 2004-04-06 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same |
KR101424624B1 (ko) * | 2003-05-14 | 2014-07-31 | 이뮤노젠 아이엔씨 | 약물 콘쥬게이트 조성물 |
-
2004
- 2004-07-21 AU AU2004258955A patent/AU2004258955C1/en not_active Ceased
- 2004-07-21 KR KR1020067001429A patent/KR101263950B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2004-07-21 US US10/895,135 patent/US20050123549A1/en not_active Abandoned
- 2004-07-21 NZ NZ580855A patent/NZ580855A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-07-21 JP JP2006521193A patent/JP2007503202A/ja active Pending
- 2004-07-21 PT PT04778714T patent/PT1660513E/pt unknown
- 2004-07-21 MX MXPA06000830A patent/MXPA06000830A/es active IP Right Grant
- 2004-07-21 DK DK04778714.8T patent/DK1660513T5/da active
- 2004-07-21 SI SI200431646T patent/SI1660513T1/sl unknown
- 2004-07-21 ES ES04778714T patent/ES2360403T3/es active Active
- 2004-07-21 KR KR1020157031117A patent/KR101672664B1/ko active IP Right Grant
- 2004-07-21 BR BRPI0412879A patent/BRPI0412879A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2004-07-21 KR KR1020147008527A patent/KR101565721B1/ko active IP Right Grant
- 2004-07-21 CA CA2532430A patent/CA2532430C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-07-21 CN CN2004800243313A patent/CN1922199B/zh active Active
- 2004-07-21 WO PCT/US2004/023340 patent/WO2005009369A2/en active Application Filing
- 2004-07-21 EP EP04778714A patent/EP1660513B9/en active Active
- 2004-07-21 NZ NZ612796A patent/NZ612796A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-07-21 KR KR1020127024607A patent/KR20120113811A/ko active Search and Examination
- 2004-07-21 NZ NZ598504A patent/NZ598504A/xx not_active IP Right Cessation
- 2004-07-21 PL PL04778714T patent/PL1660513T3/pl unknown
- 2004-07-21 CN CN201310444419.1A patent/CN103554261B/zh active Active
- 2004-07-21 KR KR1020127013238A patent/KR20120059657A/ko not_active Application Discontinuation
- 2004-07-21 CN CN201310020230.XA patent/CN103145844B/zh active Active
- 2004-07-21 EA EA200600275A patent/EA014640B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-07-21 DE DE602004031239T patent/DE602004031239D1/de active Active
- 2004-07-21 AT AT04778714T patent/ATE496944T1/de active
-
2006
- 2006-01-05 IL IL172982A patent/IL172982A/en active IP Right Grant
- 2006-01-13 ZA ZA2006/00375A patent/ZA200600375B/en unknown
- 2006-01-19 EC EC2006006294A patent/ECSP066294A/es unknown
- 2006-01-20 CR CR8207A patent/CR8207A/es unknown
- 2006-01-20 MX MX2011000245A patent/MX336469B/es unknown
- 2006-02-20 NO NO20060812A patent/NO339324B1/no not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-04-26 HK HK07104440.1A patent/HK1098160A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2007-04-26 HK HK13113291.4A patent/HK1185891A1/zh not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-11-25 JP JP2010262151A patent/JP5643619B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-04-21 CY CY20111100408T patent/CY1111938T1/el unknown
- 2011-04-22 HR HR20110302T patent/HRP20110302T1/hr unknown
-
2014
- 2014-06-30 JP JP2014133794A patent/JP5997727B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-10-29 IL IL242336A patent/IL242336A/en active IP Right Grant
- 2015-12-04 JP JP2015237469A patent/JP6144749B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2017
- 2017-02-24 JP JP2017033672A patent/JP2017123857A/ja active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06510671A (ja) * | 1991-09-23 | 1994-12-01 | メディカル リサーチ カウンシル | キメラ抗体の製造−組合せアプローチ |
WO2002016401A2 (en) * | 2000-08-18 | 2002-02-28 | East Carolina University | Monoclonal antibody ds6, tumor-associated antigen ca6, and methods of use thereof |
US6596503B1 (en) * | 2000-08-18 | 2003-07-22 | East Carolina University | Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof |
WO2002098883A1 (en) * | 2001-05-31 | 2002-12-12 | Immunogen, Inc. | Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents |
WO2003043583A2 (en) * | 2001-11-20 | 2003-05-30 | Seattle Genetics, Inc. | Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies |
WO2003057160A2 (en) * | 2002-01-02 | 2003-07-17 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
BIOTECHNOLOGY, (1992), 10, [7], P.779-783, JPN6013012136, ISSN: 0003445911 * |
GENE, (1996), 169, [2], P.147-155, JPN6013012140, ISSN: 0003445913 * |
HUM. ANTIBODIES, (1999), 9, [1], P.61-65, JPN6010036622, ISSN: 0003537232 * |
INT. J. CANCER, (2000), 88, [6], P.866-872, JPN6010036621, ISSN: 0003537233 * |
J. IMMUNOL., (1995), 154, [7], P.3310-3319, JPN6013012146, ISSN: 0003445915 * |
J. IMMUNOL., (1995), 155, [4], P.1994-2004, JPN6013012144, ISSN: 0003445914 * |
J. MOL. BIOL., (1992), 226, [3], P.889-896, JPN6013012148, ISSN: 0003445916 * |
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, (1994), 91, [9], P.3809-3813, JPN6013012137, ISSN: 0003445912 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6144749B2 (ja) | Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 | |
US9822183B2 (en) | CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same | |
JP2009504193A (ja) | Ca6抗原特異的細胞傷害性コンジュゲート、および該コンジュゲートを用いる方法 | |
AU2012201260B2 (en) | A CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same | |
CN104804094A (zh) | Ca6抗原特异性细胞毒性偶联物及其应用方法 | |
JP2012161321A (ja) | Ca6抗原特異的細胞傷害性コンジュゲート、および該コンジュゲートを用いる方法 | |
PAYNE et al. | Patent 2615761 Summary | |
KR20080039917A (ko) | Ca6 항원-특이적인 세포독성 컨쥬게이트 및 이를사용하는 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20161124 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170224 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170412 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170511 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6144749 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |