NO339324B1 - Humansiert antistoff eller epitopbindende fragment derav som binder CA6 glykotopen; polynucleotid og ekspresjons vektor som koder for antistoffet eller fragmentene; cytotoksisk konjugat derav; anvendelse av konjugatet til fremstillingen av et medikament; sett derav; en in vitro fremgangsmåte for inhibering av veksten av en celle som uttrykker CA6-glykotopen og en fremgangsmåte for å detektere CA6 glykotopen. - Google Patents

Humansiert antistoff eller epitopbindende fragment derav som binder CA6 glykotopen; polynucleotid og ekspresjons vektor som koder for antistoffet eller fragmentene; cytotoksisk konjugat derav; anvendelse av konjugatet til fremstillingen av et medikament; sett derav; en in vitro fremgangsmåte for inhibering av veksten av en celle som uttrykker CA6-glykotopen og en fremgangsmåte for å detektere CA6 glykotopen. Download PDF

Info

Publication number
NO339324B1
NO339324B1 NO20060812A NO20060812A NO339324B1 NO 339324 B1 NO339324 B1 NO 339324B1 NO 20060812 A NO20060812 A NO 20060812A NO 20060812 A NO20060812 A NO 20060812A NO 339324 B1 NO339324 B1 NO 339324B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
antibody
cytotoxic
carbon atoms
alkenyl
epitope
Prior art date
Application number
NO20060812A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20060812L (no
Inventor
Daniel J Tavares
Gillian Payne
Philip Chun
Original Assignee
Immunogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34102763&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO339324(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immunogen Inc filed Critical Immunogen Inc
Publication of NO20060812L publication Critical patent/NO20060812L/no
Publication of NO339324B1 publication Critical patent/NO339324B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4727—Mucins, e.g. human intestinal mucin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Description

Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse er rettet mot et monoklonalt anti-CA6-glykotop-antistoff fra mus og humaniserte og overflatemodifiserte versjoner derav. Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot epitop-bindende fragmenter av anti-CA6-glykotop monoklonalt antistoff, så vel som epitopbindende fragmenter av humaniserte eller overflatemodifiserte versjoner av det monoklonale anti-CA6-glykotopantistoff.
Foreliggende oppfinnelse er videre rettet mot cytotoksiske konjugater som omfatter et cellebindende middel og et cytotoksisk middel, terapeutiske preparater som omfatter konjugatet, fremgangsmåter for anvendelse av konjugatene for inhibering av cellevekst og behandling av sykdom, og et sett som omfatter det cytotoksiske konjugatet. Nærmere bestemt er det celle-bindende midlet et monoklonalt antistoff eller et epitop-bindende fragment derav som gjenkjenner og binder til CA6-glykotopen eller en humanisert eller overflatemodifisert versjon derav.
Oppfinnelsens bakgrunn
Det har vært tallrike forsøk på å utvikle terapeutiske antikreftmidler som spesifikt ødelegger målkreftceller uten å skade omliggende ikke-kreft-celler og -vev. Slike terapeutiske midler har potensialet for å vesentlig forbedre behandlingen av kreft hos humane pasienter.
Én lovende tilnærming har vært å koble cellebindende midler, slik som monoklonale antistoffer, til cytotoksiske legemidler (Sela et al., i Immunoconjugates, 189-216 (C. Vogel, red., 1987); Ghose et al., i Targeted Drugs, 1-22 (E. Goldberg, red., 1983); Diener et al., i Antibody mediated delivery systems, 1-23 (J. Rodwell, red., 1988); Pietersz et al., i Antibody mediated delivery systems, 25-53 (J. Rodwell, red., 1988); Bumol et al., i Antibody mediated delivery systems, 55-79 (J. Rodwell, red., 1988). Avhengig av valget av cellebindende middel kan disse cytotoksiske konjugatene utformes slik at de gjenkjenner og binder kun spesifikke typer av kreftceller, basert på ekspresjonsprofilen av molekyler som uttrykkes på overflaten av slike celler.
Cytotoksiske legemidler, slik som metotreksat, daunorubicin, doksorubicin, vinkristin, vinblastin, melfalan, mitomycin C og klorambucil er blitt anvendt i slike cytotoksiske konjugater, koblet til en rekke murine monoklonale antistoffer. I noen tilfeller var legemiddelmolekylene koblet til antistoffmolekylene ved et intermediært bærermolekyl, slik som serumalbumin (Garnett et al., 46, Cancer Res., 2407-2412 (1986); Ohkawa et al., 23, Cancer Immunol. Immunother., 81-86 (1986); Endo et al., 47, Cancer Res., 1076-1080
(1980)); dekstran (Hurwitz et al., 2, Appl. Biochem., 25-35 (1980); Manabi et al., 34, Biochem. Pharmacol., 289-291 (1985); Dillman et al., 46, Cancer Res., 4886-4891 (1986); Shoval et al., 85, Proe. Nati. Acad. Sei., 8276-8280 (1988)) eller polyglutaminsyre (Tsukada et al., 73, J. Nati. Canc. Inst., 721-729 (1984); Kato et al., 27, J. Med. Chem., 1602-1607
(1984); Tsukada et al., 52, Br. J. Cancer, 111-116 (1985)).
Som et eksempel på ett spesifikt konjugat som har vist seg lovende, er konjugatet av C242-antistoffet, rettet mot CanAg, et antigen som uttrykkes på kolorektale og pankreatiske tumorer, og maytansinderivatet DM1 (Liu et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 93:8618-8623 (1996)). In wtro-evaluering av dette konjugatet indikerte at dets bindingsaffinitet for CanAg uttrykt på celleoverflaten var høy med en tilsynelatende Kd-verdi på 3 x 10<11>M, og dets cytotoksiske aktivitet overfor CanAg-positive celler var høy med en IC50på 6 x 10<11>M. Denne cytotoksisiteten var antigenavhengig, siden den kunne blokkeres med et overskudd av ikke-konjugert antistoff, og siden antigen-negative celler var mer enn 100 ganger mindre sensitive overfor konjugatet. Andre eksempler på antistoff-DMl-konjugater med både høy affinitet mot de angjeldende målceller og høy antigenselektiv cytotoksisitet inkluderer de av huN901, en humanisert versjon av antistoff mot humant CD56; huMy9-6, en humanisert versjon av antistoff mot humant CD33; huC242, en humanisert versjon av antistoff mot CanAg-Mucl epitopen; huJ591, et deimmunisert antistoff mot PSMA; trastuzumab, et humanisert antistoff mot Her2/neu; og bivatuzumab, et humanisert antistoff mot CD44v6.
Utvikling av ytterligere cytotoksiske konjugater som spesifikt gjenkjenner spesielle typer av kreftceller, vil være viktig i den stadige forbedring av fremgangsmåter som anvendes for behandling av pasienter med kreft.
For dette formål er foreliggende oppfinnelse rettet mot utvikling av antistoffer som gjenkjenner og binder molekyler/reseptorer uttrykt på overflaten av kreftceller, og mot utvikling av nye cytotoksiske konjugater som omfatter cellebindende midler, slik som antistoffer, og cytotoksiske midler som spesifikt er rettet mot molekylene/reseptorene som uttrykkes på overflaten av kreftceller.
Nærmere bestemt er foreliggende oppfinnelse rettet mot karakterisering av en ny CA6-sialoglykotop på Mucl-mucinreseptoren uttrykt på kreftceller, og mot tilveie-bringelse av antistoffer, fortrinnsvis humaniserte antistoffer, som gjenkjenner den nye CA6-sialoglykotopen på Mucl-mucinet, og som kan anvendes for å inhibere veksten av en celle som uttrykker CA6-glykotopen i konteksten av et cytotoksisk middel.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer humaniserte antistoffer som spesifikt gjenkjenner og binder en ny CA6-sialoglykotop på Mucl-mucinreseptoren eller et epitop-bindende fragment derav. I en annen utførelsesform inkluderer foreliggende oppfinnelse et humanisert antistoff eller et epitopbindende fragment derav som gjenkjenner den nye CA6-sialoglykotopen ("CA6-glykotopen") på Mucl-mucinreseptoren. I et første aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et humanisert antistoff ifølge krav 1.
Oppfinnelsen vedrører overflatemodifiserte eller humaniserte versjoner av det murine anti-CA6-monoklonale antistoffet, DS6 hvor overflateeksponerte aminosyrerester i antistoffet eller dets epitopbindende fragmenter er erstattet i både lette og tunge kjeder, for nærmere å ligne på kjente humane antistoffoverflater. De humaniserte antistoffene og epitopbindende fragmenter derav ifølge foreliggende oppfinnelse har forbedrede egenskaper ved at de er mye mindre immunogene (eller fullstendig ikke-immunogene) i humane individer som de administreres til enn fullstendige murine versjoner. De humaniserte DS6-antistoffene og epitopbindende fragmenter derav ifølge foreliggende oppfinnelse gjenkjenner således spesifikt en ny sialoglykotop på Mucl-mucinreseptoren, det vil si CA6-glykotopen, mens de ikke er immunogene for et menneske. De humaniserte antistoffene og epitopbindende fragmenter derav kan konjugeres til et legemiddel, slik som et maytansinoid, for å danne av en prodroge som har spesifikk cytotoksisitet mot antigen uttrykkende celler ved å målrette legemidlet til Mucl-CA6-sialoglykotopen. Cytotoksiske konjugater omfattende slike antistoffer og små, svært toksiske legemidler (f.eks. maytansinoider, taxaner og CC-1065-analoger) kan således anvendes som terapeutika for behandling av tumorer, slik som bryst- og ovarie-tumorer.
De humaniserte versjonene av DS6-antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse er fullt utkarakteriserther med hensyn til deres respektive aminosyresekvenser for både lette og tunge kjeders variable områder, DNA-sekvensen til genene for den lette og tunge kjedens variable områder, identifiseringen av CDR, identifiseringen av deres overflate-aminosyrer og beskrivelse av et middel for deres ekspresjon i rekombinant form.
Det humaniserte DS6-antistoffet eller et epitopbindende fragment derav har en tung kjede som inkluderer CDRer som har aminosyresekvenser representert ved SEQ ID NO: 1, 21 og 3: og har en lett kjede som omfatter CDRer som har aminosyresekvenser representert ved SEQ ID NO: 4-6:
Det humaniserte DS6-antistoffer og epitop-bindende fragmenter derav har også et lett kjede variabelt område som har en aminosyresekvens som deler minst 90 % sekvens-identitet med en aminosyresekvens representert ved SEQ ID NO: 8:
EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG
På tilsvarende måte harde humaniserte DS6-antistoffene og epitopbindende fragmentene derav et tung kjede variabelt område som har en aminosyresekvens som deler minst 90 % sekvensidentitet med en aminosyresekvens representert ved SEQ ID NO: 10 eller SEQ ID NO: 11:
I en annen utførelsesformsform tilveiebringes humaniserte DS6-antistoffer og epitopbindende fragmenter derav som har et humanisert eller overflatemodifisert, lett kjede variabelt område med en aminosyresekvens som tilsvarer SEQ ID NO: 8:
På tilsvarende måte tilveiebringes humaniserte DS6-antistoffer og epitopbindende fragmenter derav med et humanisert eller overflatemodifisert, tung kjede variabelt område med en aminosyresekvens som tilsvarer SEQ ID NO: 10 eller SEQ ID NO: 11:
De humaniserte DS6-antistoffene og epitopbindende fragmenter derav ifølge foreliggende oppfinnelse kan også inkludere substitusjoner av den lette og/eller den tunge kjedens aminosyrerester i én eller flere posisjoner definert ved de stjernemerkede aminosyrerestene i tabell 1, som representerer aminosyrerestene i overflaten av rammeverksområdet fra mus som ligger innen 5 Ångstrøm fra et CDR og som må endres til en human aminosyrerest. For eksempel er den første aminosyrerest Q i musesekvensen (SEQ ID NO: 7) blitt erstattet med E (SEQ ID NO: 8) for humanisering av antistoffet. I og med at denne aminosyreresten ligger så nær et CDR, kan imidlertid en tilbake-mutasjon til museaminosyreresten Q være nødvendig for å opprettholde antistoffets affinitet.
Dette er videre vist i tabell 2, hvor overflateaminosyrerester i variable områder i muDS6 er vist sammenstilt med de tre mest homologe overflateaminosyrerestene i humane variable områder. Aminosyrerestene i tabell 1 tilsvarer de understrekede aminosyrerestene i tabell 2.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre cytotoksiske konjugater som
omfatter (1) et cellebindende middel som gjenkjenner og binder CA6-glykotopen, og (2) et cytotoksisk middel. I de cytotoksiske konjugatene har det cellebindende midlet høy affinitet for CA6-glykotopen, og det cytotoksiske midlet har høy grad av cytotoksisitet for celler som uttrykker CA6-glykotopen, slik at de cytotoksiske konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse utgjør effektive drepende midler.
Det cellebindende midlet er det humanisert anti-CA6-antistoffet eller et epitop-bindende fragment derav i følge kravene 1-3, hvor et cytotoksisk middel er kovalent festet, direkte eller via en kløyvbar eller ikke-kløyvbar linker, til antistoffet eller det epitopbindende fragment derav. I mer foretrukne utførelsesformer er det cellebindende midlet det humaniserte antistoffet ifølge kravene, og det cytotoksiske middel er en taxol, et maytansinoid, CC-1065 eller en CC-1065-analog.
I foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen er det cellebindende midlet det humanisert antistoffet ifølge kravene, og det cytotoksiske middel er et cytotoksisk medikament, slik som et maytansinoid eller et taxan.
Mer foretrukket er det cellebindende midlet det humaniserte antistoffet ifølge kravene, og det cytotoksiske middel er en maytansinforbindelse, f.eks. DM1 eller DM4.
Den foreliggende oppfinnelsen inkluderer også en in vitro fremgangsmåte for inhibering av veksten av en celle som uttrykker CA6-glykotopen ifølge krav 52. Fremgangsmåten for inhibering av vekst av cellen som uttrykker CA6-glykotopen fører til cellens død.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en terapeutisk sammensetning som omfatter det cytotoksiske konjugatet og et farmasøytisk akseptabelt bærestoff eller en eksipiens.
Foreliggende oppfinnelse inkluderer videre terapeutisk sammensetninger for anvendelse ved fremstilling av et medikament for behandling av kreft. Det cytotoksiske konjugatet omfatter et humanisert antistoff ifølge kravene og et cytotoksisk middel. I mer foretrukne utførelsesformer omfatter det cytotoksiske konjugatet et humanisert DS6-antistoff-DMl-konjugat, humanisert DS6-antistoff-DM4-konjugat eller et humanisert DS6-antistoff-taxankonjugat, hvor det humaniserte DS6 antistoffet er antistoffet ifølge kravene og konjugatet administreres sammen med et farmasøytisk akseptabelt bærestoff eller en eksipiens.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også et sett som omfatter et konjugat av et humanisert anti-CA6-antistoff og cytotoksisk middel, og instruksjoner for anvendelse av dette. Det humaniserte anti-CA6-antistoffet er det humaniserte DS6-antistoffet ifølge krav 1-3, det cytotoksiske midlet er en maytansinforbindelse, slik som DM1 eller DM4, eller et taxan, og instruksjonene er for anvendelse av konjugatene for behandling av et individ med kreft. Settet kan også inkludere komponenter som er nødvendige for fremstilling av en farmasøytisk akseptabel formulering, slik som et fortynningsmiddel dersom konjugatet foreligger i frysetørket tilstand eller konsentrert form, og for administreringen av utformingen.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også derivater av antistoffer som spesifikt binder og gjenkjenner CA6-glykotopen. I foretrukne utførelsesformer fremstilles antistoffderivatene ved å overflate modifisere eller humanisere antistoffer som binder CA6-glykotopen, hvor derivatene har redusert immunogenisitet overfor verten.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre humaniserte antistoffer eller fragmenter derav, som videre er merket for anvendelse i forskning eller diagnostiske applikasjoner. I foretrukne utførelsesformer er markøren en radioaktiv gruppe, en fluorofor, en kromofor, et billeddannende middel eller et metallion.
En fremgangsmåte for diagnose av kreft kan omfatte anvendelsen av de merkede humaniserte antistoffene eller epitopbindende fragmenter derav, administrert til et individ som mistenkes for å ha kreft, og hvor fordelingen av markøren i individets kropp måles eller monitoreres.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også terapeutiske eller farmasøytiske sammensetninger og medikamenter for behandling av kreft, hvor de terapeutiske eller farmasøytiske sammensetningene og medikamentene enten alene eller i kombinasjon med andre cytotoksiske eller terapeutiske midler hvor sammensetningene og medikamentene omfatter det humaniserte antistoff-konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse. Krefttypen kan være én eller flere av for eksempel brystkreft, kolonkreft, ovariekarsinom, endometriumkreft, osteosarkom, cervixkreft, prostatakreft, lungekreft, synovialkarsinom, bukspyttkjertelkreft, et sarkom eller et karsinom hvor CA6 uttrykkes, eller en annen ennå ikke bestemt kreftform hvor CA6-glykotopen uttrykkes hovedsakelig.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser resultatene fra undersøkelser utført for å bestemme DS6-antistoffets evne til å bindes til overflaten av utvalgte kreftcellelinjer. Fluorescensen av cellelinjer inkubert med DS6-primærantistoffet og FITC-konjugert anti-mus-IgG(H+L)-sekundærantistoffer ble målt ved flowcytometri. DS6-antistoffet bandt Caov-3-celler (figur IA) og T-47D-celler (figur IB) med en tilsynelatende Kd på 1,848 nM henholdsvis 2,586 nM. De antigen-negative cellelinjene SK-OV-3 (figur 1C) og Colo205 (figur ID) viste ingen antigenspesifikk binding. Figur 2 viser resultatene fra en dot-blot-analyse av epitopekspresjonen. Caov-3-cellelysat (figur 2A og figur 2B), SKMEL28-cellelysat (figur 2C) og Colo205-cellelysat (figur 2D) ble hver for seg overført til cellulosemembraner og så inkubert enkeltvis med pronase, proteinase K, neuraminidase eller perjodsyre. Membranene ble så immunblottet med DS6-antistoff (figur 2A), CMl-antistoff (figur 2B), R24-antistoff (figur 2C) eller C242-antistoff (figur 2D). Figur 3 viser resultatene fra en dot-blot-analyse av ekspresjonen av DS6-antigen. Caov-3-cellelysater ble enkeltvis overført til PVDF-membraner og så inkubert i nærvær av trifluormetansulfonsyre (TFMSA). Membranene ble så immunblottet med CM1-antistoff (1 og 2) eller DS6-antistoff (3 og 4). Figur 4 viser resultatene fra glykotopanalyse av DS6-antigenet. Caov-3-lysater forbehandlet med N-glykanase ("N-gly"), O-glykanase ("O-gly") og/eller sialidase ("S") ble overført til nitrocellulose og så immunblottet med DS6-antistoff eller CM 1-antistoff (Mue-1-VNTR). Figur 5 viser resultatene fra western-blot-analyse av DS6-antigenet. Cellelysater ble immunpresipitert ("IP") og immunblottet med DS6-antistoff. Antigenet tilsvarer et proteinbånd med molekylvekt > 250 kDa som observeres i antigenpositive Caov-3-celler (figur 5A og figur 5B) og T47D-celler (figur 5C). De antigen-negative cellelinjene SK-OV-3 (figur 5D) og Colo205 (figur 5E) inneholder ikke dette båndet. Etter immunpresipiteringen ble protein G-kuler fra Caov-3-cellelysater inkubert med neuraminidase ("N", figur 5A) eller perjodsyre ("PA", figur 5D). Antistoffkontroller ("a"), pre-IP ("Lys")-lysatkontroll og post-IP-"flow-fly"("FT")-lysatkontroll ble analysert i samme gel. Caov-3-immunpresipiteringer ble også inkubert med N-glykanase ("N-gly"), O-glykanase ("O-gly") og/eller sialidase ("S") (se figur 5F), hvor blottet alternativt ble analysert med biotinylert DS6 og streptavidin-HRP. Figur 6 viser resultatene fra immunpresipiteringer og/eller immunblotting av DS6-antistoff og CMl-antistoff på cellelysater fra Caov-3 (figur 6A) og HeLa (figur 6B). Overlappende CMI- og DS6-western-blot-signaler viser at DS6-antigenet foreligger på Mucl-proteinet. I HeLa-lysater skyldes Mucl-dobbeltbåndet Mucl-ekspresjon fra atskilte alleler som har forskjellige antall tandemrepetisjoner. Figur 7 viser en DS6-antistoff-"sandwich"-ELISA-utforming (figur 7A) og en standardkurve (figur 7B). Standardkurven ble fremstilt ved anvendelse av kjente konsentrasjoner av kommersielt tilgjengelige CA15-3-standarder (hvor 1 CA15-3-enhet = 1 DS6-enhet). Figur 8 viser kvantitative ELISA-standardkurver. Standardkurvene for signalet fra påvisningsantistoffet (streptavidin-HRP/biotin-DS6) (figur 8C) ble fremstilt ved anvendelse av kjente konsentrasjoner av biotin-DS6, enten innfanget av platebundet anti-muse-IgG fra geit (figur 8A) eller bundet direkte til ELISA-platen (figur 8B). Figur 9 viser cDNA- og aminosyresekvensen til lettkjedens (figur 9A) og tungkjedens (figur 9B) variable område i DS6-antistoff fra mus. De tre CDR i hver sekvens er understreket (Kabat-definisjoner). Figur 10 viser lettkjedens (figur 10A) og tungkjedens (figur 10B) CDR i DS6-antistofffra mus, bestemt utfra Kabat-definisjoner. Modelleringsprogramvaren AbM giren noe forskjellig definisjon for tungkjedens CDR (figur 10C). Figur 11 viser aminosyresekvensene for lettkjeden ("muDS6LC") (aminosyrerestene 1-95 i SEQ ID NO: 7) og tungkjeden ("muDS6HC") (aminosyrerestene 1- 98 i SEQ ID NO: 9) fra DS6-antistoff fra mus sammenstilt med kimcellelinjesekvensene for genene for IgV?ap4 (SEQ ID NO: 23) og IgVhJ558.41 (SEQ ID NO: 24). Grått indikerer sekvensforskjeller. Figur 12 viser de ti lettkjede- og tungkjedeantistoffsekvensene som er mest homologe med det murine DS6 (muDS6) lettkjede ("muDS6LC") og tungkjede ("muDS6HC") sekvensen som har løste strukturfiler i Brookhaven-databasen. Sekvensene er sammenstilt i rekkefølge fra den mest til den minst homologe. Figur 13 viser resultater for overflatetilgjengelighet og beregninger for prediktering av hvilke rammeverksaminosyrerester i lettkjedens variable område i museantistoffet DS6 som er overflatetilgjengelige. Posisjonene med 25-35 % gjennomsnittlig overflatetilgjengelighet er markert (<*>??<*>) og ble underkastet en andre analyse-runde. DS6-antistoffets lettkjede variable område (figur 13A) og tungkjede variable område (figur 13B). Figur 14 viser et kart over pattedyrekspresjonsplasmidet prDS6 vl.O. Dette plasmid ble anvendt for oppbygging og ekspresjon av rekombinante, kimære og humaniserte DS6-antistoffer. Figur 15 viser aminosyresekvensen til murint ("muDS6") og humanisert ("huDS6") (vl.O og vi.2) DS6-antistoff lettkjede (figur 15A) og tungkjede (figur 15B) variable domener Figur 16 viser cDNA- og aminosyresekvensen til lettkjedens variable område i det humaniserte DS6-antistoff ("huDS6") (vl.O og vi.2). Figur 17 viser cDNA- og aminosyresekvensen til tungkjedens variable område i det humaniserte DS6-antistoff ("huDS6") (vl.O figur 17A) (vi.2, figur 17B). Figur 18 viser flowcytometriske bindingskurver for muDS6- og huDS6-kloner fra en analyse utført på WISH-celler. Bindingsaffiniteten (figur 18A) forden kimære, humane DS6-klon vl.O og den humane DS6-klon vi.2 (Kd = 3,15, 3,71 henholdsvis 4,20 nM) er sammenlignbar med bindingsaffiniteten til nakent og biotinylert muse-DS6 (figur 18B) (Kd = 1,93 henholdsvis 2,80 nM). Figur 19 viser resultatene fra en konkurransebindingsanalyse av huDS6- og muDS6-antistoff. (Figur 19A) WISH-celler ble inkubert med biotin-muDS6 og streptavidin-DTAF for fremstilling av en bindingskurve med en tilsynelatende Kd på 6,76 nM. (Figur 19B) varierende konsentrasjoner av nakent muDS6, huDS6 vl.O og huDS6 vi.2 ble kombinert med 2 nM biotin-muDS6 og sekundærantistoffet streptavidin-DTAF. Figur 20 viser resultatene fra en bestemmelse av bindingsaffiniteten for ikke-konjugert DS6-antistoff sammenlignet med et DS6-antistoff-DMl-konjugat. Resultatene viste at konjugering til DM1 ikke på uheldig måte påvirker antistoffets bindingsaffinitet. Den tilsynelatende Kd for DS6-antistoff-DMl-konjugatet (3,902 nM) ("DS6-DM1") var noe høyere enn for nakent antistoff (2,020 nM) ("DS6"). Figur 21 viser resultatene fra en indirekte celleviabilitetsanalyse ved anvendelse av DS6-antistoff i nærvær eller fravær av anti-muse-IgG(H+L)-DMl-konjugat (2° Ab-DMl). Antigenpositive Caov-3-celler ble drept på en DS6-antistoffavhengig måte (IC50= 424,9 pM) bare i nærvær av det sekundære konjugat ("DS6 + 2° Ab-DMl"). Figur 22 viser resultatene fra en komplementavhengig cytotoksisitets(CDC)-analyse av DS6-antistoff og humanisert DS6-antistoff. Resultatene viste at det ikke var noen CDC-mediert virkning av DS6-antistoff eller humanisert DS6-antistoff (vl.O og vi.2) på HPAC-celler (figur 22A) og ZR-75-l-celler (figur 22B). Figur 23 viser resultatene fra en in wtro-cytotoksisitetsanalyse av et DS6-antistoff-DMl-konjugat sammenlignet med fritt maytansin. I en klonogen analyse ble DS6-antigenpositive kreftcellelinjer fra ovarium (figur 23A), bryst (figur 23B), cervix (figur 23C) og bukspyttkjertel (figur 23D) testet for cytotoksisitet ved kontinuerlig eksponering overfor et DS6-antistoff-DMl-konjugat (venstre felter). Disse cellelinjene ble testet på tilsvarende måte for maytansin-følsomhet ved en 72 timers eksponering overfor fritt maytansin (høyre felter). De testede ovariekreftcellelinjene var OVCAR5, TOV-21G, Caov-4 og Caov-3. De testede brystkreftcellelinjene varT47D, BT-20 og BT-483. Cervixkreftcellelinjene som ble testet var KB, HeLa og WISH. De testede bukspyttkjertelkreftcellelinjene var HPAC, Hs766T og HPAF-II. Figur 24 viser resultatene fra en in wtro-cytotoksisitetsanalyse av et DS6-antistoff-DMl-konjugat. I en MTT-celleviabilitetsanalyse ble humane ovariekreftceller (figur 24A, figur 24B og figur 24C), bryst kreftceller (figur 24D og figur 24E), cervixkreftceller (figur 24F og figur 24G) og bukspyttkjertelkreftceller (figur 24H og figur 241) drept på en DS6-antistoff-DMl-konjugatavhengig måte. Nakent DS6 påvirket ikke veksten av disse cellene på en ugunstig måte, noe som indikerer at DMl-konjugering er nødvendig for cytotoksisiteten. Figur 25A viser resultatene fra en in wVo-antitumorvirkningsanalyse av et DS6-antistoff-DMl-konjugat på etablerte subkutane KB-tumorxenotransplantater. Tumorceller ble inokulert på dag 0, og den første behandling ble gitt på dag 6. Immunkonjugatbehandlingen fortsatte daglig med i alt fem doser. PBS-kontrolldyr ble avlivet etter at tumorvolumet overskred 1500 mm<3>. Konjugatet ble tilført i en dose på 150 eller 225 ug/kg DM1, noe som tilsvarer en antistoffkonsentrasjon på 5,7 henholdsvis 8,5 mg/kg. Musenes kroppsvekt (figur 25B) ble fulgt gjennom undersøkelsen. Figur 26 viser resultatene fra en antitumorvirkningsundersøkelse av DS6-antistoff-DMl-konjugat på etablerte subkutane tumorxenotransplantater. OVCAR5-celler (figur 26A og figur 26B), TOV-21G-celler (figur 26C og figur 26D), HPAC-celler (figur 26E og figur 26F) og HeLa-celler (figur 26G og figur 26H) ble inokulert på dag 0, og immunkonjugatbehandlingen ble gitt på dagene 6 og 13. PBS-kontrolldyr ble avlivet når tumorvolumet overskred 1000 mm<3>. Konjugatet ble tilført i en dose på 600 ug/kg DM1, noe som tilsvarer en antistoffkonsentrasjon på 27,7 mg/kg. Tumorvolumet (figur 26A, figur 26C, figur 26E og figur 26G) og musenes kroppsvekt (figur 26B, figur 26D, figur 26F og figur 26H) ble fulgt gjennom studien. Figur 27 viser resultatene fra en in wVo-virkningsanalyse av et DS6-antistoff-DMl-konjugat på intraperitoneale OVCAR5-tumorer. Tumorceller ble injisert intraperitonealt på dag 0, og immunkonjugatbehandlingen ble gitt på dagene 6 og 13. Dyrene ble avlivet så fort kroppsvektreduksjonen oversteg 20 %. Figur 28 viser den flowcytometriske bindingskurven fra en studie av bindingsaffiniteten av nakent og taxan konjugert DS6-antistoff overfor HeLa-celler. Taxan-konjugering (MM1-202) påvirker ikke på uheldig måte antistoffets bindingsaffinitet. Den tilsynelatende Kd for DS6-MMl-202-konjugatet (1,24 nM) var noe høyere enn for det nakne DS6-antistoff (620 pM).
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer blant annet humaniserte anti-CA6-antistoffer og epitop-bindende fragmenter derav ifølge krav 1. Hvert av antistoffene og antistoffragmentene ifølge foreliggende oppfinnelse er utformet for spesifikk gjenkjenning og binding av CA6-glykotopen på overflaten av en celle. CA6 er kjent å uttrykkes av mange humane tumorer: 95 % av alle serøse ovariekarsinomer, 50 % av alle endometrioide ovariekarsinomer, 50 % av alle neoplasmer i cervix uteri, 69 % av alle neoplasmer i endometriet, 80 % av alle neoplasmer i vulva, 60 % av alle brystkarsinomer, 67 % av alle bukspyttkjerteltumorer og 48 % av alle tumorer i urotel, men uttrykkes sjelden av normalt humant vev.
En rapport fra Kearse et al., Int. J. Cancer, 88(6):866-872 (2000), feil-identifiserte proteinet som CA6-epitopen foreligger på som et protein på 80 kDa med et N-koblet karbohydrat som inneholdt CA6-epitopen, når de anvendte en hybridom-supernatant for karakterisering av det. Ved anvendelse av renset DS6 har vi senere påvist at CA6-epitopen foreligger på et O-koblet karbohydrat på et ikke-disulfidsammenbundet glykoprotein med molekylvekt høyere enn 250 kDa. Dessuten ble glykoproteinet identifisert som mucinet Mucl. Siden forskjellige Mucl-alleler har forskjellige antall tandemrepetisjoner i variabelt antall tandemrepetisjoner (VNTR) uttrykker domeneceller ofte to forskjellige Mucl-proteiner med forskjellig størrelse (Taylor-Papadimitriou, Biochim. Biophys. Acta, J455(2-3):301-313 (1999). Grunnet forskjeller i antall repetisjoner i VNTR-domenet samt forskjeller i glykosylering så varierer molekylvekten av Mucl fra cellelinje til cellelinje.
CA6-immunreaktivitetens følsomhet overfor perjodsyre indikerer at CA6 er en karbohydratepitop, "glykotop". At CA6-immunreaktiviteten i tillegg er følsom overfor behandling med neuraminidase fra Vibrio cholerae, indikerer at CA6-epitopen er en sialinsyreavhengig glykotop, således en "sialoglykotop".
Detaljer vedrørende karakterisering av CA6 kan finnes i eksempel 2 (se nedenfor). Ytterligere detaljer vedrørende CA6 kan finnes i WO 02/16401; Wennerberg et al., Am. J. Pathol., 143( 4) : 1050-1054 (1993); Smith et al., Human Antibodies, 9:61-65
(1999); Kearse et al., Int. J. Cancer, 88(6):866-872 (2000); Smith et al., Int. J Gynecol.
Pathol., 20(3):260-6 (2001); og Smith et al., Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol., 10( 2) : 152-8 (2002).
Foreliggende oppfinnelse omfatter også cytotoksiske konjugater som omfatter to primærbestanddeler. Den første bestanddelen er et cellebindende middel ifølge kravene som gjenkjenner og binder CA6-glykotopen. Det cellebindende midlet bør gjenkjenne CA6-sialoglykotopen på Mucl med høy grad av spesifisitet, slik at de cytotoksiske konjugatene kun gjenkjenner og bindes til celler som de er beregnet på. En høy grad av spesifisitet vil gjøre at konjugatene kan fungere på en målstyrt måte, med få bivirkninger grunnet uspesifikk binding.
I en annen utførelsesform gjenkjenner det cellebindende midlet ifølge foreliggende oppfinnelse også CA6-glykotopen med høy grad av affinitet, slik at konjugatene er i kontakt med målcellen i et tidsrom som er tilstrekkelig til at den cytotoksiske del av konjugatet kan virke på cellen og/eller slik at konjugatene får tilstrekkelig tid til å internaliseres av cellen.
De cytotoksiske konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et humanisert DS6-antistoff eller et epitopbindende fragment derav ifølge kravene. DS6-antistoffet kan gjenkjenne CA6 med høy grad av spesifisitet og styrer det cytotoksiske middel til en unormal celle eller et vev, f.eks. kreftceller, på en målstyrt måte.
Den andre bestanddelen av de cytotoksiske konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse er et cytotoksisk middel. I foretrukne utførelsesformer er det cytotoksiske middel en taxol, et maytansinoid, slik som DM1 eller DM4, CC-1065 eller en CC-1065-analog. I foretrukne utførelsesformer er de cellebindende midlene ifølge foreliggende oppfinnelse kovalent bundet, direkte eller via en kløyvbar eller ikke kløyvbar linker, til det cytotoksiske middel.
De cellebindende midlene, de cytotoksiske midler og linkere er diskutert mer detaljert nedenfor.
Cellebindende midler
Effektiviteten av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse som terapeutiske midler avhenger av en nøye utvelgelse av et egnet cellebindende middel. Cellebindende midler inkluderer peptider og ikke-peptider. Cellebindende midler kan være hvilken som helst forbindelse som kan bindes til en celle, enten på en spesifikk eller uspesifikk måte. Generelt kan disse være antistoffer (fortrinnsvis monoklonale antistoffer), lymfokiner, hormoner, vekstfaktorer, vitaminer, næringsmiddeltransportmolekyler (slik som transferrin) eller hvilket som helst annet cellebindende molekyl eller hvilken som helst annen cellebindende forbindelse.
Mer spesifikke eksempler på cellebindende midler inkluderer:
(a) polyklonale antistoffer; (b) monoklonale antistoffer; (c) antistoffragmenter, f.eks. Fab, Fab' og F(ab')2, Fv (Parham, J. Immunol., 131:2895-2902 (1983); Spring et al., J. Immunol., 113:470- 478 (1974); Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys., 89:230-244 (1960)); (d) interferoner (f.eks. alfa, beta, gamma); (e) lymfokiner, f.eks. IL-2, IL-3, IL-4, IL-6; (f) hormoner som insulin, TRH (tyrotropinfrigjørende hormon), MSH (melanocyttstimulerende hormon), steroidhormoner, f.eks. androgener og østrogener; (g) vekstfaktorer og kolonistimulerende faktorer, f.eks. EGF, TGF-alfa, FGF, VEGF, G-CSF, M-CSF og GM-CSF (Burgess, Immunology Today, 5:155-158 (1984)); (h) transferrin (0'Keefe et al., J. Biol. Chem., 260:932-937 (1985)); og (i) vitaminer, slik som folat.
Antistoffer
Monoklonalt antistoffteknikker tillater fremstilling av ekstremt spesifikke cellebindende midler i form av spesifikke monoklonale antistoffer. Spesielt velkjent innen faget er teknikker for fremstilling av monoklonale antistoffer dannet ved immunisering av mus, rotter, hamstere eller hvilket som helst annet pattedyr med antigenet av interesse, f.eks. den intakte målcelle, antigener isolert fra målcellen, hele virus, svekkede hele virus og virusproteiner, f.eks. viruskappeproteiner. Sensitiviserte humane celler kan også anvendes. En annen fremgangsmåte for fremstilling av monoklonale antistoffer er anvendelse av bakteriofagbiblioteker over scFv (enkeltkjedede variable områder), fortrinnsvis humane scFv (se f.eks. Griffiths et al., US patentskrifter nr. 5 885 793 og 5 969 108; McCafferty et al., WO 92/01047; Liming et al., WO 99/06587).
Et typisk antistoff består av to identiske tungkjeder og to identiske lettkjeder som er sammenbundet via disulfidbindinger. Det variable området er en del av antistoffets tungkjeder og lettkjeder som avviker i sekvens mellom forskjellige antistoffer og som samarbeider når det gjelder et gitt antistoffs binding av spesifisitet for sitt antigen. Variabiliteten er vanligvis ikke jevnt fordelt mellom antistoffets variable områder. Den er typisk konsentrert innenfor tre segmenter i et variabelt område som kalles komplementaritetsbestemmende områder (CDR) eller hypervariable områder, både i lettkjedens og tungkjedens variable område. De mer konserverte delene av de variable områdene betegnes rammeverksområdene. De variable områder i tungkjeden og lettkjeden omfatter fire rammeverksområder, som hovedsakelig inntaren betaplatekonfigurasjon, hvor hvert rammeverksområde er bundet til de tre CDR som danner løkker som sammenbinder betaplatestrukturen, og som i noen tilfeller utgjør en del av betaplatestrukturen. CDR i hver av kjedene holdes nær hverandre av rammeverksområdene og bidrar sammen med CDR fra den andre kjeden til dannelse av antistoffets antigenbindende sete (E.A. Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5. utg., 1991, NIH).
Det konstante området er en del av tungkjeden. Selv om dette området ikke direkte deltar i binding av et antistoff til et antigen, viser det forskjellige effektorfunksjoner, slik som deltakelse av antistoffet i antistoffavhengig cellulær toksisitet.
Det murine antistoff DS6 er beskrevet i US patentskrift nr. 6 596 503 (ATCC-deponeringsnummer PTA-4449).
Humaniserte eller overflatemodifiserte DS6- antistoffer
Et humanisert anti-CA6-antistoff anvendes som det cellebindende midlet ifølge foreliggende oppfinnelse. Foretrukket utførelsesformer av slike humaniserte antistoff er de som er tilveiebragt ifølge krav 1-3 (humanisert DS6-antistoff eller et epitopbindende fragment derav).
Målet med humaniseringen er å redusere immunogenisiteten til et xenogent antistoff, slik som et museantistoff, for tilførsel til et menneske, samtidig som antistoffets fulle antigenbindende affinitet og spesifisitet bibeholdes.
Humaniserte antistoffer kan fremstilles ved anvendelse av flere teknologier, slik som overflatemodifisering og CDR-transplantering. Som anvendt her, benytter overlatemodifiseringsteknologien en kombinasjon av molekylær modellering, statistisk analyse og mutagenese for endring av ikke-CDR-overflater i antistoffets variable områder, slik at de ligner overflatene til kjente antistoffer hos målverten.
Strategier og fremgangsmåter for overflatemodifisering av antistoffer og andre fremgangsmåter for å redusere antistoffers immunogenisitet i en annen vert beskrives i US patentskrift nr. 5 639 641 (Pedersen et al.). Kort beskrevet utføres følgende i en foretrukket fremgangsmåte: (1) posisjonssammenstillinger av en gruppe variable tungkjede- og lettkjedeområder fremstilles for erholdelse av et sett av overflateeksponerte rammeverks-posisjoner i tungkjedens og lettkjedens variable områder, hvor sammenstillingsposisjonene for alle variable områder minst er ca. 90 % identiske; (2) et sett av overflateeksponerte rammeverksaminosyrerester fra tungkjedens og lettkjedens variable områder defineres for et gnagerantistoff (eller et fragment derav); (3) et sett av overflateeksponerte rammeverksaminosyrerester fra tungkjedens og lettkjedens variable områder som i størst mulig grad er identisk med settet av overflateeksponerte aminosyrerester fra gnagersekvensene, påvises; (4) settet av overflateeksponerte rammeverksaminosyrerester fra tungkjedens og lettkjedens variable områder definert i trinn (2) erstattes med settet av overflateeksponerte rammeverksaminosyrerester fra tungkjedens og lettkjedens variable områder påvist i trinn (3), bortsett fra de aminosyrerester som ligger innenfor 5 Å fra hvilket som helst atom i hvilken som helst aminosyrerest i gnagerantistoffets komplementaritetsbestemmende områder; og (5) det humaniserte gnagerantistoff med bindingsspesifisitet fremstilles.
Antistoffer kan humaniseres ved anvendelse av en rekke andre teknikker, innbefattet CDR-transplantering (EP 0 239 400; WO 91/09967; US patentskrifter nr. 5 530 101 og 5 585 089), fernissering eller overflatemodifisering (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E.A., 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka, G.M. et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; Roguska, M.A. et al., 1994, PNAS, 9i:969-973) kjedestokking (US patentskrift nr. 5 565 332). Humane antistoffer kan fremstilles ved en rekke fremgangsmåter kjent innen faget, innbefattet bakteriofagfremvisningsfremgangsmåter. Se også US patentskrifter nr. 4 444 887, 4 716 111, 5 545 806 og 5 814 318, og de internasjonale patentsøknadene WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 og WO 91/10741.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer humaniserte antistoffer eller fragmenter derav som gjenkjenner en ny sialoglykotop (CA6-glykotopen) på mucinet Mucl. I en annen utførelsesform harde humaniserte antistoffene eller de epitopbindende fragmenter derav i tillegg evnen til å inhibere vekst av en celle som uttrykker CA6-glykotopen.
Oppfinnelsen tilveiebringer overflatemodifiserte eller humaniserte versjoner av DS6-antistoffet ifølge kravene hvor overflateeksponerte aminosyrerester i antistoffet eller fragmenter derav er erstattet både i lett- og tungkjedene, for i større grad å ligne på kjente humane antistoffoverflater. De humaniserte DS6-antistoffene eller de epitopbindende fragmenter derav ifølge foreliggende oppfinnelse har forbedrede egenskaper. For eksempel gjenkjenner humaniserte DS6-antistoffer eller epitopbindende fragmenter derav spesifikt en ny sialoglykotop (CA6-glykotopen) på mucin Mucl. Mer foretrukket harde humaniserte DS6-antistoffene eller de epitopbindende fragmenter derav i tillegg evnen til å inhibere vekst av en celle som uttrykker CA6-glykotopen. Det humaniserte antistoff eller et epitop-bindende fragment derav kan konjugeres til et medikament, f.eks. et maytansinoid, for dannelse av en prodroge med spesifikk cytotoksisitet overfor antigenuttrykkende celler ved at medikamentet styres til den nye Mucl-sialoglykotopen CA6. Cytotoksiske konjugater som omfatter slike antistoffer og et lite, svært toksisk medikament (f.eks. maytansinoider, taxanerog CC-1065-analoger) kan anvendes som medikamenter eller for å behandle tumorer, slik som brysttumorer og ovarietumorer.
De humaniserte versjonene av DS6-antistoffet er også fullt utkarakterisertheri når det gjelder aminosyresekvensen til de variable områder i både lettkjeden og tungkjeden, DNA-sekvensene for lettkjedens og tungkjedens variable områder, påvisning av CDR, påvisning av overflateaminosyrene og beskrivelse av et middel for ekspresjon av dem
i rekombinant form.
I én utførelsesform er det tilveiebragt det humanisert antistoffet eller et epitopbindende fragment derav med en tungkjede som omfatter DCR med aminosyresekvenser representert ved SEQ ID NO: 1, 21 og3:
Når den tunge kjedens CDR bestemmes ved hjelp av modelleringsprogramvaren AbM, er de representert ved SEQ ID NO: 20-22:
I den samme utførelsesformen har det humaniserte antistoff eller det epitopbindende fragment derav en lettkjede som omfatter CDR med aminosyresekvensene representert ved SEQ ID NO: 4-6:
De humaniserte antistoffene og epitopbindende fragmenter derav har også et lettkjede variabelt område som har en aminosyresekvens som deler minst 90 % sekvensidentitet med en aminosyresekvens representert ved SEQ ID NO: 8:
De humaniserte antistoffene og epitopbindende fragmenter derav tilveiebringes med et tungkjede variabelt område som har en aminosyresekvens som deler minst 90 % sekvensidentitet med en aminosyresekvens representert ved SEQ ID NO: 10 eller SEQ ID NO: 11:
I en annen utførelsesform tilveiebringes humaniserte antistoffer og epitopbindende fragmenter derav med et humanisert eller overflatemodifisert, lettkjede variabelt område med en aminosyresekvens som tilsvarer SEQ ID NO: 8:
På tilsvarende måte tilveiebringes humaniserte antistoffer og epitopbindende fragmenter derav med et humanisert eller overflatemodifisert, tungkjede variabelt område med en aminosyresekvens som tilsvarer SEQ ID NO: 10 eller SEQ ID NO: 11:
De humaniserte antistoffene og de epitopbindende fragmenter derav ifølge foreliggende oppfinnelse kan også omfatte versjoner av lettkjedens og/eller tungkjedens variable områder hvor humane overflateaminosyrerester som ligger nær CDR, er erstattet med de tilsvarende muDS6-overflateaminosyrerester i én eller flere posisjoner definert ved aminosyrerestene i tabell 1 (Kabat-nummerering) som er markert med en stjerne for å bi-beholde bindingsaffiniteten og spesifisiteten til muDS6.
Den primære aminosyresekvens og DNA-sekvensen til DS6-antistoffets lettkjede og tungkjede og til humaniserte versjoner derav beskrives her. Fortrinnsvis vil antistoffene og fragmentene tilveiebragt ved denne oppfinnelsen som spesifikt bindes til CA6 også antagonisere reseptorens biologiske aktivitet. Mer foretrukket er slike antistoffer videre i det vesentlige frie for agonistaktivitet. Således kan antistoffer og antistoffragmenter ifølge foreliggende oppfinnelse avvike fra DS6-antistoffet eller de humaniserte derivater derav når det gjelder aminosyresekvensen i rammeverksområdene, CDR og/eller lettkjede og tungkjede, og fortsatt ligge innenfor foreliggende oppfinnelses område.
CDR i DS6-antistoffet påvises ved modulering, og de molekylære strukturer er blitt prediktert.
Muse lettkjede IgV?ap4 kimcellelinje genet og tungkjede IgVhJ558.41 kimcellelinje genet fra hvilke DS6 sannsynligvis er avledet, er vist i fig. 11 sammenstilt med sekvensen til DS6-antistoffet. Sammenligningen påviser sannsynlige somatiske mutasjoner i DS6-antistoffet, innbefattet flere i CDR-områdene.
Sekvensen til tungkjedens og lettkjedens variable område i DS6-antistoffet og sekvensene til CDR-områdene i DS6-antistoffet var ikke tidligere kjent og er gitt i figurene 9A og 9B. Slik informasjon kan anvendes for fremstilling av humaniserte versjoner av DS6-antistoffet.
Antistoffragmenter
Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter både full-lengde-antistoffene diskutert ovenfor og epitopbindende fragmenter av disse. Som anvendt her, omfatter "antistoffragmenter" hvilken som helst del av et antistoff som bibeholder evnen til å bindes til epitopen som gjenkjennes av fullengdeantistoffet, generelt betegnet "epitopbindende fragmenter". Eksempler på antistoffragmenter omfatter Fab, Fab' og F(ab')2, Fd, enkeltkjedede Fv (scFv), enkeltkjedede antistoffer, disulfidsammenbundne Fv (dsFv) og fragmenter som omfatter enten et VL- eller VH-område. Epitopbindende fragmenter, innbefattende enkeltkjedede antistoffer, kan omfatte ett eller flere av de variable områdene, alene eller i kombinasjon med hele eller en del av følgende: hengselområdet, CHl-domenet, CH2-domenet og CH3-domenet.
Slike fragmenter kan omfatte ett av eller begge Fab-fragmentene eller F(ab')2-fragmentet. Antistoffragmentene inneholder fortrinnsvis alle seks CDR fra det intakte antistoff, selv om fragmenter som inneholder færre enn alle slike områder, f.eks. tre, fire eller fem CDR, også er funksjonelle. Videre kan fragmentene tilføre eller kombinere medlemmer av hvilke som helst av følgende immunglobulinklasser: IgG, IgM, IgA, IgD eller IgE, samt underklassene av disse.
Fab- og F(ab')2-fragmenter kan fremstilles ved proteolytisk kløyving ved anvendelse av enzymer som papain (Fab-fragmenter) eller pepsin (F(ab')2-fragmenter).
De enkeltkjedede Fv(scFv)-fragmentene er epitopbindende fragmenter som inneholder minst ett fragment av et antistoffs variable tungkjedeområde (VH) koblet til minst ett fragment av et antistoffs variable lettkjedeområde (VL). Linkeren kan være et kort, fleksibelt peptid som er utvalgt for å sikre at den korrekte tredimensjonale folding av (VL)- og (VH)-områdene skjer når de er sammenkoblet, slik at man bibeholder målmolekyl-bindingsspesifisiteten til det intakte antistoff som det enkeltkjedede antistoffragment er avledet fra. Karboksylenden av (VL)- eller (VH)-sekvensen kan være kovalent koblet via en linker til aminoenden av en komplementær (VL)- eller (VH)-sekvens.
Enkeltkjedede antistoffragmenter ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder aminosyresekvenser som omfatter de variable eller komplementaritetsbestemmende områder (CDR) i de intakte antistoffene som er beskrevet i foreliggende beskrivelse, men mangler noen av eller alle de bastante domenene i disse antistoffene. Disse konstante domenene er ikke nødvendige for antigenbinding, men utgjør en hoveddel av strukturen til intakte antistoffer. Enkeltkjedede antistoffragmenter kan følgelig overvinne noen av problemene som er forbundet med anvendelse av antistoffer som inneholder en del av eller et helt konstant domene. For eksempel er ofte enkeltkjedede antistoffragmenter frie for uønskede interaksjoner mellom biologiske molekyler og tungkjedens konstante område eller annen uønsket biologisk aktivitet. I tillegg er enkeltkjedede antistoffragmenter betydelig mindre enn intakte antistoffer og kan følgelig ha høyere kapillær permeabilitet enn intakte antistoffer, noe som tillater mer effektiv lokalisering og binding av enkeltkjedede antistoffragmenter til målampligenbindingsseter. Videre kan antistoffragmenter fremstilles i relativt stor skala i prokaryote celler, noe som forenkler produksjonen. Videre gjør enkeltkjedede antistoffragmenters relativt lille størrelse det mindre sannsynlig at de vil utløse en immunrespons hos en mottaker enn intakte antistoffer.
Enkeltkjedede antistoffragmenter kan fremstilles ved molekylær kloning, bakteriofagfremvisningsantistoffbiblioteker eller tilsvarende teknikker som er vel kjent blant fagfolk. Disse proteinene kan f.eks. fremstilles i eukaryote celler eller prokaryote celler, innbefattet bakterier. De epitopbindende fragmenter ifølge foreliggende oppfinnelse kan også fremstilles ved anvendelse av forskjellige bakteriofagfremvisningsfremgangsmåter som er kjent innen faget. I bakteriofagfremvisningsfremgangsmåter fremvises funksjonelle antistoffdomener på overflaten av bakteriofagpartikler som bærer polynukleotidsekvensene som koder for dem. Nærmere bestemt kan slike bakteriofager anvendes for fremvisning av epitopbindende domener, uttrykt fra et repertoar eller et kombinatorisk antistoffbibliotek (f.eks. fra mus eller menneske). Bakteriofag som uttrykker et epitopbindende domene som binder antigenet av interesse, kan utvelges eller påvises med antigen, f.eks. ved anvendelse av merket antigen som er bundet eller innfanget til en fast overflate eller en kule. Bakteriofag som anvendes i disse fremgangsmåtene, er typisk filamentøs bakteriofag, innbefattet fd og M13, hvor bindende domener uttrykt fra bakteriofag med Fab, Fv eller di-sulfidstabiliserte Fv-antistoffdomener rekombinant koblet til enten bakteriofag-gen III-protein eller bakteriofag-gen Vlll-protein.
Eksempler på bakteriofagfremvisningsfremgangsmåter som kan anvendes for fremstilling av de epitopbindende fragmenter ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter fremgangsmåtene beskrevet av Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41- 50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene, J87:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology, 57:191-280; PCT-publikasjon WO92(014047; PCT-publikasjonene WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982 og WO 95/20401; og US patentskrifter nr. 5 698 426, 5 223 409, 5 403 484, 5 580 717, 5 427 908, 5 750 753, 5 821 047, 5 571 698, 5 427 908, 5 516 637, 5 780 225, 5 658 727, 5 733 743 og 5 969 108.
Etter bakteriofagseleksjon kan områdene i bakteriofagen som koder for fragmentene isoleres og anvendes for fremstilling av de epitopbindende fragmenter ved ekspresjon i en utvalgt vert, innbefattet pattedyrceller, insektceller, planteceller, gjær og bakterier, ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi, f.eks. som beskrevet i detalj nedenfor. Foreksempel kan teknikker for rekombinant fremstilling av Fab-, Fab'- og F(ab')2-fragmenter også benyttes ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent innen faget, f.eks. fremgangsmåtene som beskrives i PCT-publikasjon WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques, J2(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI, 34:26-34; og Better et al., 1988, Science, 240:1041-1043. Eksempler på teknikker som kan anvendes for fremstilling av enkeltkjedede Fv og antistoffer, omfatter teknikkene beskrevet i US patentskrifter nr. 4 946 778 og 5 258 498; Huston et al., 1991, Methods in Enzymology, 203:46-88; Shu et al., 1993, PNAS, 90:7995-7999; Skerra et al., 1988, Science, 240:1038-1040.
Funksjonelle ekvivalenter
Begrepet "funksjonelle ekvivalenter" omfatter f.eks. antistoffer med homologe sekvenser, primære antistoffer, kunstige antistoffer og modifiserte antistoffer, hvor hver funksjonell ekvivalent er definert ut fra evnen til å bindes til CA6. Den erfarne fagperson vil forstå at det er et overlapp mellom gruppen av molekyler som betegnes "antistoff-fragmenter" og gruppen som betegnes "funksjonelle ekvivalenter". Fremgangsmåter for fremstilling av funksjonelle ekvivalenter beskrives f.eks. i PCT-søknad WO 93/21319, europeisk patentsøknad nr. 239 400, PCT-søknad WO 89/096222, europeisk patentsøknad nr. 338 741 og europeisk patentsøknad EP 332 424.
Antistoffer med homologe sekvenser er antistoffer med aminosyresekvenser som har sekvenshomologi med aminosyresekvensen til et anti-CA6-antistoff og et humanisert anti-CA6-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Homologien foreligger fortrinnsvis med aminosyresekvensen til de variable områdene i anti-CA6-antistoffet og det humaniserte anti-CA6-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. "Sekvenshomologi" benyttet i forbindelse med en aminosyresekvens er her definert som en sekvens som viser minst ca. 90 %, 91 %, 92 %, 93 % eller 94 % sekvenshomologi, mer foretrukket minst ca. 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvenshomologi med en annen aminosyresekvens, bestemt f.eks. med FASTA-søkefremgangsmåten i samsvar med Pearson og Lipman, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85, 2444-2448 (1988).
Som anvendt heri, er et kimært antistoff et antistoff hvor forskjellige deler er avledet fra forskjellige dyrearter, f.eks. et antistoff med et variabelt område avledet fra et monoklonalt museantistoff, paret med et konstant område fra et humant immunglobulin. Fremgangsmåter for fremstilling av kimære antistoffer er kjent innen faget. Se f.eks. Morrison, 1985, Science, 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques, 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods, J25:191-202; US patentskrifter nr. 5 807 715, 4 816 567 og 4 816 397.
Humaniserte former av kimære antistoffer fremstilles ved å innføre de komplementaritetsbestemmende områder fra f.eks. et museantistoff inn i et humant rammeverksdomene, se f.eks. PCT-publikasjon WO 92/22653. Humaniserte kimærantistoffer har fortrinnsvis konstante områder og variable områder, bortsett fra de komplementaritetsbestemmende områder (CDR), som i det vesentlige eller utelukkende er avledet fra de tilsvarende humane antistoffområdene, mens de foreliggende CDR i det vesentlige eller utelukkende er avledet fra et pattedyr som ikke er et menneske.
Kunstige antistoffer omfatter scFv-fragmenter, diastoffer, triastoffer, tetrastoffer og mru (se oversiktsartikler av Winter, G. og Milstein, C, 1991, Nature, 349:293-299; Hudson, P.J., 1999, Current Opinion in Immunology, J:/:548-557), som alle har antigenbindende evne. I det enkeltkjedede Fv-fragment (scFv) er VH- and VL-domenet fra et antistoff sammenkoblet via et fleksibelt peptid. Dette linkerpeptidet er typisk ca. 15 aminosyrerester langt. Dersom linkeren er svært mye kortere, f.eks. fem aminosyrer, dannes diastoffer som er bivalente scFv-dimerer. Dersom linkeren reduseres til mindre enn tre aminosyrerester, dannes det trimere og tetramere strukturer som betegnes triastoffer og tetrastoffer. Den minste bindende enhet fra et antistoff er et CDR, typisk CDR2 fra tungkjeden, som har tilstrekkelig spesifikk gjenkjenningsevne og bindingsevne til at det kan benyttes separat. Et slikt fragment kalles en molekylær gjenkjenningsenhet eller mru. Flere slike mru kan sammenkobles med korte linkerpeptider slik at det dannes et kunstig bindende protein med høyere aviditet enn en enkelt mru.
De funksjonelle ekvivalentene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også modifiserte antistoffer, det vil si antistoffer som er modifisert ved kovalent tilkobling av hvilken som helst molekyltype til antistoffet. Modifiserte antistoffer omfatter f.eks. antistoffer som er blitt modifisert ved f.eks. glykosylering, acetylering, pegylering, fosforylering, amidering, derivatisering med kjente beskyttelsesgrupper/blokkerende grupper, proteolytisk kløyving, binding til en cellulær ligand eller et annet protein osv. Den kovalente tilkoblingen forhindrer ikke at antistoffet utløser en anti-idiotypisk respons. Disse modifikasjonene kan utføres ved kjente teknikker, innbefattet, men ikke begrenset til, spesifikk kjemisk kløyving, acetylering, formylering, metabolsk syntese av tunikamycin osv. I tillegg kan de modifiserte antistoffene inneholde én eller flere ikke-klassiske aminosyrer.
Funksjonelle ekvivalenter kan fremstilles ved ensidig utbytting av forskjellige CDR på forskjellige kjeder i forskjellige rammeverksområder. Således er forskjellige antistoff klasser mulige for et gitt sett av CDR ved innføring av forskjellige tungkjeder, hvorved f.eks. IgGl-4-, IgM-, IgaAl-2-, IgD- og IgE-antistofftyper og -isotyper kan fremstilles. På tilsvarende måte kan kunstige antistoffer som ligger innenfor foreliggende oppfinnelses område, fremstilles ved å innbake et gitt sett av CDR i et fullt ut syntetisk rammeverk.
Funksjonelle ekvivalenter kan lett fremstilles ved mutering, delesjon og/eller insersjon i sekvensene til et variabelt og/eller konstant område som flankerer et gitt sett av CDR, ved anvendelse av et bredt utvalg av fremgangsmåter som er kjent innen faget.
Antistoffragmentene og de funksjonelle ekvivalentene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter molekyler med en påvisbar grad av binding til CA6, sammenlignet med DS6-antistoffet. En påvisbar grad av binding omfatter alle verdier i området fra minst 10 til 100 %, fortrinnsvis minst 50 %, 60 % eller 70 %, mer foretrukket minst 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % eller 99 % av bindingsevnen til museantistoffet DS6 overfor CA6.
Forbedrede antistoffer
CDR-områdene er av primær betydning for epitopgjenkjenning og antistoff-binding. Endringer kan imidlertid innføres i aminosyrerester som inngår i CDR uten å forstyrre antistoffets evne til å gjenkjenne og bindes til den tilhørende epitop. For eksempel kan det innføres endringer som ikke påvirker epitopgjenkjenningen, men som likevel gir antistoffet en høyere bindingsaffinitet for epitopen.
Flere studier har undersøkt virkningene av å innføre én eller flere aminosyre-endringer i forskjellige posisjoner i sekvensen til et antistoff, basert på kjennskap til den primære antistoffsekvens og på dens egenskaper, f.eks. når det gjelder binding og ekspresjonsnivå (Yang, W.P. et al., 1995, J. Mol. Biol., 254, 392-403; Rader, C. et al., 1998, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 95, 8910-8915; Vaughan, T.J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539).
I disse undersøkelsene er ekvivalenter av primærantistoffet blitt fremstilt ved å endre sekvensen til tungkjede- og lettkjedegenet i CDRl-området, CDR2-området, CDR3-området eller rammeverksområdet ved anvendelse av fremgangsmåter som oligonukleo-tidformidlet setestyrt mutagenese, kassettmutagenese, feilinnførende PCR, DNA-stokking eller mutatorstammer av E. coli (Vaughan, T.J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539; Adey, N.B. et al., 1996, kap. 16, s. 277-291, i "Phage Display of Peptides and Proteins", red. Kay, B.K. et al., Academic Press). Disse fremgangsmåtene for endring av primærantistoffets sekvens har ført til forbedret affinitet av de sekundære antistoffer (Gram, H. et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89, 3576-3580; Boder, E.T. et al., 2000, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 97, 10701-10705; Davies, J. og Riechmann, L, 1996, Immuno-technology, 2, 169-179; Thompson, J. et al., 1996, J. Mol. Biol., 256, 77-88; Short, M.K. et al., 2002, J. Biol. Chem., 277, 16365-16370; Furukawa, K. et al., 2001, J. Biol. Chem., 276, 27622-27628).
Ved en tilsvarende styrt strategi for endring av én eller flere aminosyrerester i antistoffet kan antistoffsekvensene som beskrives i foreliggende oppfinnelse, anvendes for utvikling av anti-CA6-antistoffer med forbedrede funksjoner, innbefattet forbedret affinitet for CA6.
Forbedrede antistoffer omfatter også antistoffer med forbedrede egenskaper, fremstilt ved standardteknikker for immunisering av dyr, dannelse av hybridomer og utvelgelse av antistoffer med spesifikke egenskaper.
C<y>totoksiske midler
Det cytotoksiske midlet som anvendes i det cytotoksiske konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse, kan være hvilken som helst forbindelse som fører til en celles død, som induserer celledød eller som på en eller annen måte reduserer cellens levedyktighet. Foretrukne cytotoksiske midler omfatter f.eks. maytansinoider og maytansinoidanaloger, taxoider, CC-1065 og CC-1065-analoger, dolastatin og dolastatinanaloger, definert nedenfor. Disse cytotoksiske midlene er konjugert til antistoffene, antistoffragmentene, de funksjonelle ekvivalentene, de forbedrede antistoffene og deres analoger, som beskrevet heri.
De cytotoksiske konjugatene kan fremstilles ved in wtro-fremgangsmåter. For å koble et medikament eller promedikament til antistoffet benyttes en linkergruppe. Egnede linkergrupper er vel kjent innen faget og omfatter disulfidgrupper, tioetergrupper, syrelabile grupper, lyslabile grupper, peptidaselabile grupper og esteraselabile grupper. Foretrukne linkergrupper er disulfidgrupper og tioetergrupper. Konjugater kan f.eks. fremstilles ved anvendelse av en disulfidutbyttingsreaksjon eller ved å danne en tioeterbinding mellom antistoffet og medikamentet eller prodrogen.
Ma<y>tansinoider
Blant de cytotoksiske midlene som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse for dannelse av et cytotoksisk konjugat, er maytansinoider og maytansinoidanaloger. Eksempler på egnede maytansinoider inkluderer maytansinol og maytansinolanaloger. Maytansinoider er medikamenter som inhiberer dannelsen av mikrotubuli, og som er svært toksiske for pattedyrceller.
Eksempler på egnede maytansinolanaloger inkluderer analoger som har en modifisert aromatisk ring og analoger med modifikasjoner i andre posisjoner. Slike egnede
maytansinoider er beskrevet i US patentskrifter nr. 4 424 219, 4 256 746, 4 294 757,
4 307 016, 4 313 946, 4 315 929, 4 331 598, 4 361 650, 4 362 663, 4 364 866, 4 450 254, 4 322 348, 4 371 533, 6 333 410, 5 475 092, 5 585 499 og 5 846 545.
Spesifikke eksempler på egnede analoger av maytansinol med en modifisert aromatisk ring omfatter: (1) C-19-deklor (US patentskrift nr. 4 256 746) (fremstilt ved LAH-reduksjon av ansamytocin P2); (2) C-20-hydroksy (eller C-20-demetyl) +/- C-19-deklor (US patentskrifter nr. 4 361 650 og 4 307 016) (fremstilt ved demetylering ved anvendelse av Streptomyces eller Actinomyces eller deklorering ved anvendelse av LAH); og (3) C-20-demetoksy, C-20-acyloksy (-OCOR) +/- deklor (US patentskrift
nr. 4 294 757) (fremstilt ved acylering med acylklorider).
Spesifikke eksempler på egnede analoger av maytansinol som har modifikasjoner i andre posisjoner, omfatter:
(1) C-9-SH (US patentskrift nr. nr. 4 424 219)
(fremstilt ved å la maytansinol reagere med H2S eller P2S5);
(2) C-14-alkoksymetyl (demetoksy/CH2OR) (US patentskrift nr.
4 331 598); (3) C-14-hydroksymetyl eller acyloksymetyl (CH2OH eller CH2OAc) (US patentskrift nr. 4 450 254) (fremstilt fra Nocardia) ; (4) C-15-hydroksy/acyloksy (US patentskrift nr. 4 364 866) (fremstilt ved omdannelse av maytansinol ved Streptomyces) ; (5) C-15-metoksy (US patentskrifter nr. 4 313 946 og 4 315 929) (isolert fra Trema nudiflora) ; (6) C-18-N-demetyl (US patentskrifter nr. 4 362 663 og 4 322 348) (fremstilt ved demetylering av maytansinol ved Streptomyces) ; og (7) 4,5-deoksy (US patentskrift nr. 4 371 533) (fremstilt ved reduksjon av
maytansinol med titantriklorid/LAH).
I en foretrukket utførelse benytter de cytotoksiske konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse det tiolholdige maytansinoid (DM1), formell betegnelse N<2->deacetyl-N<2->(3-merkapto-l-oksopropyl)maytansin, som cytotoksisk middel. DM1 er representert ved følgende strukturformel (I):
I en annen foretrukket utførelsesform benytter de cytotoksiske konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse det tiolholdige maytansinoid N<2->deacetyl-N<2->(4-metyl-4-merkapto-l-oksopentyl)maytansin som cytotoksisk middel. DM4 er representert ved følgende strukturformel (II):
I andre utførelsesformer av oppfinnelsen kan andre maytansiner, innbefattet tiol- og disulfidholdige maytansinoider med en mono- eller dialkylsubstitusjon på karbonatomet som bærer svovelatomet, anvendes. Disse inkluderer et maytansinoid som i posisjon C-3, C-14-hydroksymetyl, C-15-hydroksy ellerC-20-desmetyl haren acylert aminosyresidekjede med en acylgruppe som bærer en hindret sulfhydrylgruppe, hvor karbonatomet i acylgruppen som bærer tiolfunksjonaliteen har én eller to substituenter, hvor substituentene er CH3, C2H5, uforgrenet eller forgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor videre én av substituentene kan være H, og hvor acylgruppen har en lineær kjedelengde på minst tre karbonatomer mellom karbonylfunksjonaliteten og svovelatomet.
Slike andre maytansiner inkluderer forbindelser representert ved formel (III):
hvor:
Y' står for
hvor:
Ri og R2uavhengig av hverandre er CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor R2i tillegg kan være H;
A, B og D er sykloalkyl eller sykloalkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk, aromatisk radikal eller heterosyklisk radikal;
R3, R4, R5, R6, R7, Ra, R9,Rio/Rn og Ri2er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl
med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosykloalkyl-radikal;
I, m, n, o, p, q, r, s, t og u er uavhengig av hverandre 0 eller et helt tall på 1-5, forutsatt at minst to av I, m, n, o, p, q, r, s, t og u ikke er 0 samtidig; og
Z er H, SR eller -COR, hvor R er uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal.
Foretrukne utførelsesformer med formel (III) omfatter forbindelser med formel (III) hvor:
Ri er metyl, R2er H, og Z er H.
Ri og R2er metyl, og Z er H.
Ri er metyl, R2er H, og Z er -SCH3.
Ri og R2er metyl, og Z er -SCH3.
Slike andre maytansiner omfatter også forbindelser representert ved formel (IV-L), (IV-D) eller (IV-D,L): hvor:
hvor:
Ri og R2uavhengig av hverandre er CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor R2i tillegg kan være H;
R3/R4/R5/R«/R7og R8er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal;
I, m og n er uavhengig av hverandre et helt tall på 1-5, og hvor n i tillegg kan være 0;
Z er H, SR eller -COR, hvor R er uforgrenet eller forgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosykloalkyl-radikal; og
May står for et maytansinoid som bærer sidekjeden i posisjon C-3, C14-hydroksymetyl, C-15-hydroksy eller C-20-desmetyl.
Foretrukne utførelsesformer av formlene (IV-L), (IV-D) og (IV-D,L) omfatter forbindelser med formlene (IV-L), (IV-D) og (IV-D,L) hvor: Ri er metyl; R2er H; R5, R6, R7 og R8er alle H; I og m er begge 1; n er 0; og Z er H.
Ri og R2er metyl; R5, R6, R7og R8er alle H; I og m er 1; n er 0; og Z er H.
Ri er metyl; R2er H; R5, R6, R7 og R8er alle H; I og m er begge 1; n er 0; og Z er -SCH3.
Ri og R2er metyl; R5, R6, R7og R8er alle H; I og m er 1; n er 0; og Z er - SCH3.
Det cytotoksiske middel er fortrinnsvis representert ved formel (IV-L).
Slike andre maytansiner omfatter også forbindelser representert ved formel
(V):
hvor:
hvor:
Ri og R2uavhengig av hverandre er CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor R2i tillegg kan være H;
R3/R4/R5/1*6/ R7og R8er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal I;
I, m og n er uavhengig av hverandre et helt tall på 1-5, og hvor n i tillegg kan være 0; og
Z er H, SR eller -COR, hvor R er uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal.
Foretrukne utførelsesformer av formel (V) omfatter forbindelser med formel (V) hvor: Ri er metyl; R2er H; R5, R6, R7 og R8er alle H; I og m er begge 1; n er 0; og Z er H.
Ri og R2er metyl; R5, R6, R7og R8er alle H; I og m er 1; n er 0; og Z is H.
Ri er metyl; R2er H; R5, R6, R7 og R8er alle H; I og m er begge 1; n er 0; og Z er -SCH3.
Ri og R2er metyl; R5, R6, R7og R8er alle H; I og m er 1; n er 0; og Z er - SCH3.
Slike andre maytansiner omfatter videre forbindelser representert ved formel (VI-L), (VI-D) eller (VI-D,L): hvor:
hvor:
Ri og R2uavhengig av hverandre er CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor R2i tillegg kan være H;
R3, R4, R5, R6, R7og R8er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet, syklisk alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal;
I, m og n er uavhengig av hverandre et helt tall på 1-5, og hvor n i tillegg kan være 0;
Z2er SR eller COR, hvor R er uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal; og
May er et maytansinoid.
Slike andre maytansiner omfatter også forbindelser representert ved formel
(VII):
hvor:
Y2' står for
hvor:
Ri og R2uavhengig av hverandre er CH3, C2H5, uforgrenet eller forgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor R2i tillegg kan være H;
A, B og D er uavhengig av hverandre sykloalkyl eller sykloalkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal;
R3, R4, R5, R6, R7, Ra, R9,Rio/Rnog Ri2er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal;
I, m, n, o, p, q, r, s, t og u er uavhengig av hverandre 0 eller et helt tall på 1-5, forutsatt at minst to av I, m, n, o, p, q, r, s, t og u ikke er 0 samtidig; og
Z2er SR eller -COR, hvor R er uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal.
Foretrukne utførelsesformer av formel (VII) omfatter forbindelser med formel (VII) hvor Ri er metyl, og R2er H.
De ovenfor nevnte maytansinoider kan konjugeres til anti-CA6-antistoff DS6 eller en homolog eller et fragment derav, hvor antistoffet er bundet til maytansinoidet ved anvendelse av tiol- eller disulfidgruppen som foreligger på acylgruppen på en acylert aminosyresidekjede som foreligger i posisjon C-3, C-14-hydroksymetyl, C-15-hydroksy eller C-20-desmetyl i maytansinoidet, og hvor acylgruppen på den acylerte aminosyresidekjede har sin tiol- eller disulfidgruppe plassert på et karbonatom som har én eller to substituenter, hvor substituentene er CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor en av substituentene i tillegg kan være H, og hvor acylgruppen har en lineær kjedelengde på minst tre karbonatomer mellom karbonylgruppen og svovelatomet.
Et foretrukket konjugat ifølge foreliggende oppfinnelse er et konjugat som omfatter anti-CA6-antistoffet DS6 eller en homolog eller et fragment derav, konjugert til et maytansinoid med formel (VIII):
hvor:
Yi' står for
(CR7R8)i(CR9=CRio)p(C=C)qA0(CR5R6)mDu(CRii=CRi2)r(C=C)sBt(CR3PM)nCRiR2S-,
hvor:
A, B og D uavhengig av hverandre er sykloalkyl eller sykloalkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal;
R3/ 1*4/ 1*5/ 1*6/ 1*7/ 1*8/ l*9/l*io/l*ii og Rt2er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller heterosyklisk aromatisk-eller heterosyklisk-radikal; og
I, m, n, o, p, q, r, s, t og u er uavhengig av hverandre 0 eller et helt tall på 1-5, forutsatt at minst to av I, m, n, o, p, q, r, s, t og u ikke er 0 samtidig.
Fortrinnsvis er Ri metyl og R2er H eller Ri og R2er metyl.
Et enda mer foretrukket konjugat ifølge foreliggende oppfinnelse er konjugatet som omfatter anti-CA6-antistoffet DS6 eller en homolog eller et fragment derav, konjugert til et maytansinoid med formel (IX-L), (IX-D) eller (IX-D,L): hvor:
hvor:
Ri og R2uavhengig av hverandre er CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor R2i tillegg kan være H;
R3, R4, R5, R6, R7og R8er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal;
I, m og n er uavhengig av hverandre et helt tall på 1-5, og hvor n i tillegg kan være 0; og
May står for en maytansinol som bærer sidekjeden i posisjon C-3, C-14-hydroksymetyl, C-15-hydroksy eller C-20-desmetyl.
Foretrukne utførelsesformer av formlene (IX-L), (IX-D) og (IX-D,L) omfatter forbindelser med formlene (IX-L), (IX-D) og (IX-D,L) hvor: Ri er metyl; og R2er H; eller Ri og R2er metyl;
Ri er metyl; R2er H; R5, R6, R7 og R8er alle H; I og m er begge 1; og n er 0;
Ri og R2er metyl; R5, R6, R7og R8er alle H; I og m er 1; og n er 0.
Det cytotoksisk middel er fortrinnsvis representert ved formel (IX-L).
Et ytterligere foretrukket konjugat ifølge foreliggende oppfinnelse er konjugatet som omfatter anti-CA6-antistoff DS6 eller en homolog eller et fragment derav, konjugert til et maytansinoid med formel (X):
hvor substituentene er som definert for formel (IX) ovenfor.
Spesielt foretrukket er hvilken som helst av de ovenfor beskrevne forbindelser hvor Ri er H; R2er metyl; R5, R6, R7og R8er alle H; I og m er begge 1; og n er 0.
Ytterligere spesielt foretrukket er hvilken som helst av de ovenfor beskrevne forbindelser hvor Ri og R2er metyl; R5, R6, R7og R8er alle H; I og m er 1; og n er 0.
Videre foretrekkes L-aminoacylstereoisomeren.
Hvilket som helst av maytansinoidene som beskrives i den hittil ikke avgjorte US patentpublikasjonen 2004235840, kan også anvendes i det cytotoksiske konjugat ifølge foreliggende oppfinnelse.
Disulfidholdiqe linkergrupper
For tilkobling av maytansinoidet til et cellebindende middel, f.eks. antistoff DS6, omfatter maytansinoidet en linkergruppe. Linkergruppen inneholderen kjemisk binding som tillater frigjøring av fullt ut aktive maytansinoider i et gitt sete. Egnede kjemiske bindinger er vel kjent innen faget og omfatter disulfidbindinger, syrelabile bindinger, lyslabile bindinger, peptidaselabile bindinger og este ra se la bi le bindinger. Disulfidbindinger foretrekkes.
Linkergruppen omfatter også en reaktiv kjemisk gruppe. I en foretrukket utførelse kan den reaktive kjemiske gruppen være kovalent bundet til maytansinoidet via en disulfidbindingslinkergruppe.
Spesielt foretrukne reaktive kjemiske grupperer N-suksinimidylestere og N-sulfosuksinimidylestere.
Spesielt foretrukne maytansinoider omfattende en linkerrest som inneholder en reaktiv kjemisk gruppe, er C-3-estere av maytansinol og analoger derav, hvor linkerresten inneholder en disulfidbinding og den reaktive kjemiske gruppen omfatter en N-suksinimidyl- eller N-sulfosuksinimidylester.
Mange posisjoner i maytansinoider kan fungere som posisjon for kjemisk tilkobling av linkerresten. For eksempel forventes C-3-posisjonen med en hydroksylgruppe, C-14-posisjonen modifisert med hydroksymetyl, C-15-posisjonen modifisert med hydroksy og C-20-posisjonen med en hydroksygruppe alle å være anvendbare. Imidlertid foretrekkes posisjon C-3, og C3-posisjonen i maytansinol foretrekkes spesielt.
Selv om syntesen av estere av maytansinol med en linkerrest er beskrevet ut fra disulfidbindingsholdige linkerrester, vil en fagperson forstå at linkerrester med andre kjemiske bindinger (som beskrevet ovenfor) også kan anvendes i foreliggende oppfinnelse, og det kan også andre maytansinoider. Spesifikke eksempler på andre kjemiske bindinger omfatter syrelabile bindinger, lyslabile bindinger, peptidaselabile bindinger og esteraselabile bindinger. Beskrivelsen i US patentskrift nr. 5 208 020, som inkorporeres heri, beskriver fremstillingen av maytansinoider med slike bindinger.
Syntesen av maytansinoider og maytansinoidderivater med en disulfidrest som bærer en reaktiv gruppe, er beskrevet i US patentskrifter nr. 6 441 163 og 6 333 410, samt i US publikasjon US 2003055226.
Maytansinoidene som inneholder den reaktive gruppe, f.eks. DM1, får reagere med et antistoff, f.eks. antistoff DS6, slik at det dannes cytotoksiske konjugater. Disse konjugatene kan renses ved HPLC eller gelfiltrering.
Flere utmerkede reaksjonsskjemaer for fremstilling av slike antistoff-maytansinoidkonjugater gis i US patentskrift nr. 6 333 410, US 6 441 163 og US publikasjon US 2003055226 og US 2004001838.
Generelt kan en løsning av et antistoff i en vandig buffer inkuberes med et molart overskudd av maytansinoider med en disulfidrest som bærer en reaktiv gruppe. Reaksjonen kan stanses ved tilsetning av overskudd av amin (f.eks. etanolamin, taurin osv.). Maytansinoid-antistoffkonjugatet kan så renses ved gelfiltrering.
Antall maytansinoidmolekyler som er bundet pr. antistoffmolekyl, kan bestemmes ved spektrofotometrisk måling av forholdet mellom absorbansen ved 252 nm og ved 280 nm. Et gjennomsnittlig antall på 1-10 maytansinoidmolekyler/antistoffmolekyl foretrekkes.
Konjugater av antistoffer og maytansinoidmedikamenter kan evalueres for evnen til å undertrykke proliferasjon av forskjellige uønskede cellelinjer in vitro. For eksempel kan cellelinjer som den humane epidermoide karsinomlinjen A-431, den humane småcellede lungekreftcellelinjen SW2, den humane brysttumorlinjen SKBR3 og Burkitts lymfom-linjen Namalwa lett anvendes for å anslå cytotoksisiteten av disse forbindelsene. Cellene som skal evalueres, kan eksponeres overfor forbindelsene i 24 timer, og den overlevende andel av celler kan måles i direkte analyser ved kjente fremgangsmåter. IC50-verdier kan så beregnes ut fra resultatene fra analysene.
PEG- holdiqe linkergrupper
Maytansinoider kan også kobles til cellebindende midler ved anvendelse av PEG-linkergrupper, som beskrevet i US publikasjon US 2004001838. Disse PEG-linker-gruppene er løselige i både vann og ikke-vandige løsningsmidler og kan anvendes for kobling av ett eller flere cytotoksiske midler til et cellebindende middel. Eksempler på PEG-linkergrupper omfatter heterobifunksjonelle PEG-linkere som bindes til cytotoksiske midler og cellebindende midler i motsatte ender av linkerne via en funksjonell sulfhydryl- eller disulfidgruppe i én ende og en aktiv ester i den andre enden.
Som et generelt eksempel på syntese av et cytotoksisk konjugat ved anvendelse av en PEG-linkergruppe vises det igjen til US publikasjon US 2004001838 for spesifikke detaljer. Syntesen begynner ved å la ett eller flere cytotoksiske midler som bærer en reaktiv PEG-gruppe, reagere med et cellebindende middel, noe som fører til at den terminale aktive ester i hver av de reaktive PEG-gruppene forskyves av en aminosyrerest i det cellebindende midlet, slik at det dannes et cytotoksisk konjugat som omfatter ett eller flere cytotoksiske midler kovalent bundet til et cellebindende middel via en PEG-linkergruppe.
Taxaner
Det cytotoksiske middel som anvendes i de cytotoksiske konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan også være et taxan eller et taxanderivat.
Taxaner er en familie av forbindelser som omfatter paklitaxel (Taxol), et cytotoksisk naturprodukt, og docetaxel (Taxotere), et semisyntetisk derivat, to forbindelser som hyppig anvendes ved behandling av kreft. Taxaner er mitosespindelgifter som inhiberer depolymerisering av tubulin, noe som fører til celledød. Selv om docetaxel og paklitaxel er anvendbare midler ved behandling av kreft, er antitumoraktiviteten begrenset grunnet deres uspesifikke toksisitet overfor normale celler. Videre er forbindelser som paklitaxel og docetaxel i seg selv ikke tilstrekkelig aktive til å kunne anvendes i konjugater med cellebindende midler.
Et foretrukket taxan for anvendelse ved fremstilling av cytotoksiske konjugater er taxanet med formel (XI):
Fremgangsmåter for syntese av taxaner som kan anvendes i de cytotoksiske konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse, samt fremgangsmåter for konjugering av taxanene til cellebindende midler, f.eks. antistoffer, er beskrevet i detalj i US patentskrifter nr. 5 416 064, 5 475 092, 6 340 701, 6 372 738 og 6 436 931; samt i US publikasjoner US 2004001838, US 6 596 757, US 1 715 795, WO 2004/013093 og US 2004024049.
CC- 1065- analoqer
Det cytotoksiske middel som anvendes i de cytotoksiske konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan også være CC-1065 eller et derivat derav. CC-1065 er et kraftig antibiotisk antitumormiddel som kan isoleres fra dyrkningsvæske fra Streptomyces zelensis. CC-1065 er ca. 1000 ganger mer aktivt in vitro enn vanlig anvendte antikreftmedikamenter som doksorubicin, metotreksat og vinkristin (B.K. Bhuyan et al., Cancer Res., 42, 3532-3537 (1982)). CC-1065 og analoger derav er beskrevet i US patentskrifter nr. 6 372 738, 6 340 701, 5 846 545 og 5 585 499.
Den cytotoksiske aktivitet av CC-1065 er blitt korrelert til forbindelsens alkyleringsaktivitet og dens DNA-bindende eller DNA-interkalerende aktivitet. Disse to aktivitetene er knyttet til separate deler av molekylet. Således foreligger den alkylerende aktivitet i syklopropapyrroloindol(CPI)-subenheten, mens den DNA-bindende aktivitet er knyttet til de to pyrroloindolsubenhetene.
Selv om CC-1065 har visse attraktive egenskaper som cytotoksisk middel, har forbindelsen begrensninger når det gjelder terapeutisk anvendelse. Tilførsel av CC-1065 til mus ga en forsinket hepatotoksisitet som førte til døden på dag 50 etter en enkelt intravenøs dose på 12,5 ug/kg (V.L. Reynolds et al., J. Antibiotics, XXIX, 319-334 (1986)). Dette har ansporet forsøk på utvikling av analoger som ikke gir forsinket toksisitet, og syntesen av enklere analoger modellert på CC-1065 er blitt beskrevet (M.A. Warpehoski et al., J. Med. Chem., 31, 590-603 (1988)).
I en annen serie av analoger ble CPI-gruppen erstattet med en syklopropabenzindol(CBI)gruppe (D.L Boger et al., J. Org. Chem., 55, 5823-5833, (1990); D.L. Boger et al., BioOrg. Med. Chem. Lett., 1, 115-120 (1991)). Disse forbindelsene opp-rettholder den høye in Wtro-aktiviteten til utgangsmedikamentet uten å gi forsinket toksisitet hos mus. I likhet med CC-1065 er disse forbindelsene alkyleringsmidler som bindes til den lille furen i DNA på en kovalent måte og gir celledød. Imidlertid har klinisk evaluering av de mest lovende analogene, Adozelesin and Carzelesin, ført til skuffende resultater (B.F. Fosteret al., Investigational New Drugs, 13, 321-326 (1996); I. Wolff et al., Clin. Cancer Res., 2, 1717-1723 (1996)). Disse medikamentene viser dårlige terapeutiske virkninger grunnet den høye systemiske toksisitet.
Den terapeutiske virkningen av CC-1065-analoger kan i stor grad forbedres ved å endre in wVo-fordelingen ved målstyrt tilførsel til tumorsetet, noe som fører til lavere toksisitet overfor ikke-målvev og således lavere systemisk toksisitet. For å oppnå dette målet er konjugater av analoger og derivater av CC-1065 og cellebindende midler som spesifikt er rettet mot tumorceller, blitt beskrevet (US patentskrifter nr. 5 475 092, 5 585 499 og 5 846 545). Disse konjugatene viser typisk høy målspesifikk cytotoksisitet in vitro og en eksepsjonell antitumoraktivitet i humane tumorxenotransplantatmodeller i mus (R.V.J. Chari et al., Cancer Res., 55, 4079-4084 (1995)).
Fremgangsmåter for syntese av CC-1065-analoger som kan anvendes i de cytotoksiske konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse, samt fremgangsmåter for konjugering av analogene til cellebindende midler, f.eks. antistoffer, er beskrevet i detalj i US patentskrifter nr. 5 475 092, 5 846 545, 5 585 499, 6 534 660 og 6 586 618, samt i US publikasjoner US 2003199519 og US 2003195365.
Andre leaemilder
Legemilder som metotreksat, daunorubicin, doksorubicin, vinkristin, vinblastin, melfalan, mitomycin C, klorambucil, calicheamicin, tubulysin og tubulysinanaloger, duokarmycin og duokarmycinanaloger, dolastatin og dolastatinanaloger er også egnet for fremstilling av konjugater ifølge foreliggende oppfinnelse. Legemiddelmolekylene kan også kobles til antistoffmolekylene via et intermediært bæremolekyl, slik som serumalbumin. Doksorubicin- og daunorubicinforbindelser, som er beskrevet for eksempel i US publikasjon US 20010036923, kan også være anvendbare cytotoksiske midler.
Terapeutisk sammensetning
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en terapeutisk sammensetning som omfatter: (a) en effektiv mengde av ett eller flere cytotoksiske konjugater, og (b) et farmasøytisk akseptabelt bærestoff.
På tilsvarende måte tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en in vitro fremgangsmåte for inhibering av veksten av utvalgte cellepopulasjoner, som omfatter å sette målcellene eller vev som inneholder målcellene i forbindelse med en effektiv mengde av et cytotoksisk konjugat eller et terapeutisk middel som omfatter et cytotoksisk konjugat, enten alene eller i kombinasjon med andre cytotoksiske eller terapeutiske midler.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også medikamenter og sammensetninger for behandling av et individ med kreft, medikamentene og sammensetningene omfatter den terapeutiske sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse.
Cytotoksiske konjugater kan evalueres for in wtro-aktivitet og -spesifisitet ved fremgangsmåter som er beskrevet tidligere (se f.eks. R.V.J. Chari et al., Cancer Res., 55, 4079-4084 (1995)). Antitumoraktiviteten kan evalueres i humane tumorxenotransplantatmodeller i mus ved fremgangsmåter som også er beskrevet tidligere (se f.eks. Liu et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 93:8618-8623 (1996)).
Egnede farmasøytisk akseptable bærestoffer er vel kjent og kan utvelges av gjennomsnittsfagpersoner ut fra hva den kliniske situasjon krever. Som anvendt heri, omfatter bærestoffer fortynningsmidler og eksipienser.
Eksempler på egnede bærestoffer, fortynningsmidler og/eller eksipienser omfatter: (1) Dulbeccos fosfatbufrede saltvann, pH~7,4, med eller uten ca. 1 mg/ml til 25 mg/ml humant serumalbumin; (2) 0,9 % saltvann (0,9 % (vekt/vol) natriumklorid (NaCI)); og (3) 5 % (vekt/vol) dekstrose; og kan også inneholde en antioksidant, f.eks. tryptamin, og et stabiliseringsmiddel, f.eks. Tween 20.
Fremgangsmåten for inhibering av veksten av utvalgte cellepopulasjoner kan utøves in vitro, in vivo eller ex vivo. Som anvendt heri, betyr inhibering av vekst å få en celle til å vokse langsommere, redusere cellens levedyktighet og få cellen til å dø, lysere en celle og å indusere celledød, enten over et kort eller langt tidsrom.
Eksempler på in wtro-anvendelser omfatter behandling av autolog benmarg før transplantasjon tilbake til samme pasient for å drepe syke eller ondartede celler; behandling av benmarg før transplantasjon for å drepe kompetente T-celler og forhindre transplantat versus vert sykdom (GVHD); behandling av cellekulturer for å drepe alle celler, bortsett fra ønskede varianter som ikke uttrykker målantigenet; eller for å drepe varianter som uttrykker uønsket antigen.
Betingelsene for ikke-klinisk in wtro-anvendelse kan lett fastsettes av en gjennomsnittsfag person.
Eksempler på klinisk ex wVo-anvendelse er fjerning av tumorceller eller lymfoide celler fra benmarg før autolog transplantasjon ved kreftbehandling eller ved behandling av autoimmun sykdom, eller for fjerning av T-celler eller andre lymfoide celler fra autolog eller allogeneisk benmarg før transplantasjon for å forhindre transplantat versus vert sykdom (GVHD). Behandlingen kan utføres som følger. Benmarg høstes fra pasienten eller et annet individ og inkuberes så i medium inneholdende serum tilsatt det cytotoksiske middel ifølge oppfinnelsen. Konsentrasjonen vil variere fra ca. 10 nM til 1 pM over et tidsrom fra ca. 30 minutter til ca. 48 timer ved ca. 37 °C. De nøyaktige betingelsene når det gjelder konsentrasjon og inkubasjonstid, det vil si dosen, kan lett fastsettes av en gjennomsnittsfag person. Etter inkuberingen vaskes benmargscellene med medium tilsatt serum og føres tilbake til pasienten ved i.v. infusjon ifølge kjente fremgangsmåter. I de tilfeller hvor pasienten gis annen behandling, f.eks. som en kur med ablativ kjemoterapi eller total kroppsbestråling mellom tidspunktet hvor margen høstes og de behandlede cellene reinfunderes, lagres de behandlede benmargscellene nedfrosset i flytende nitrogen ved anvendelse av standard medisinsk utstyr.
For klinisk in wVo-anvendelse vil det cytotoksiske konjugat ifølge oppfinnelsen leveres som løsninger som er analysert for sterilitet og endotoksinnivå. Eksempler på egnede fremgangsmåter for tilførsel av cytotoksisk konjugat er som følger: Konjugatene gis ukentlig i 4 uker som en i.v. bolus hver uke. Bolusdosene gis i 50-100 ml normalt saltvann som kan være tilsatt 5-10 ml humant serumalbumin. Dosene vil være fra 10 ug til 100 mg pr. tilførsel i.v. (et område fra 100 ng til 1 mg/kg pr. dag). Mer foretrukket vil dosene variere fra 50 ug til 30 mg. Mest foretrukket vil dosene variere fra 1 mg til 20 mg. Etter 4 ukers behandling kan pasientene fortsatt gis behandling ukentlig. Spesifikke kliniske fremgangsmåter når det gjelder tilførselsvei, eksipienser, fortynningsmidler, doser, tider osv., kan fastsettes av en gjennomsnittsfagperson ut fra hva den kliniske situasjon tilsier.
Eksempler på medisinske tilstander som kan behandles med medikamentene og sammensetningene beskrevet her, inkluderer ondartede tilstander av enhver type, innbefattet f.eks. kreft i lunge, bryst, kolon, prostata, nyre, bukspyttkjertel, ovarier, cervix og lymfatiske organer, osteosarkom, synovialkarsinom, et sarkom eller et karsinom hvor CA6 uttrykkes, og andre, ennå ikke påviste, kreftformer hvor CA6-glykotopen hovedsakelig uttrykkes; autoimmune sykdommer, f.eks. systemisk lupus, reumatoid artritt og multippel sklerose; transplantatrejeksjoner, f.eks. nyretransplantatrejeksjon, levertransplantatrejeksjon, lungetransplantatrejeksjon, hjertetransplantatrejeksjon og benmargstransplantatrejeksjon; transplantat versus vert sykdom; virusinfeksjoner, f.eks. mV-infeksjon, HIV-infeksjon, AIDS osv.; og parasittinfeksjoner, f.eks. giardiasis, amoebiasis, schistosomiasis og andre, som bestemt av en gjennomsnittsfagperson.
Sett
Foreliggende oppfinnelse omfatter også sett som f.eks. omfatter et foreskrevet cytotoksisk konjugat og instruksjoner for anvendelse av det cytotoksiske konjugat for dreping av ikke-celletyper. Instruksjonene kan omfatte retningslinjer for anvendelse av de cytotoksiske konjugatene in vitro, in vivo eller ex vivo.
Settet vil typisk ha en avdeling som inneholder det cytotoksiske konjugat. Det cytotoksiske konjugat kan foreligge i frysetørket form, flytende form eller en annen form som er egnet til å inngå i et sett. Settet kan også inneholde ytterligere elementer som er nødvendige for å utføre fremgangsmåten som er beskrevet i settets instruksjoner, f.eks. en sterilisert løsning for rekonstituering av et frysetørket pulver, ytterligere reagenser som skal blandes med det cytotoksiske konjugat før tilførsel til en pasient og hjelpemidler for tilførsel av konjugatet til en pasient.
Ytterli<g>ere utførelsesformer
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre humaniserte antistoffer og epitopbindende fragmenter, som videre er merket for anvendelse innen forskning eller i diagnostiske anvendelser. I foretrukne utførelsesformer er merkingen en radioaktiv merking, en fluorofor, en kromofor, et billeddannende middel eller et metallion.
Det tilveiebringes også en fremgangsmåte for diagnose hvor de merkede antistoffene eller epitopbindende fragmenter derav tilføres til et individ som mistenkes for å ha kreft, og hvor fordelingen av merking i individets kropp måles eller følges.
Eksempler
Det brede omfang av foreliggende oppfinnelse vil best forstås ved henvisning til de påfølgende eksempler.
Eksempel 1 Påvisning av antiqenpositive og antiqenneqative cellelinjer ved flowcvto-metriske bindinqsanalvser
Flowcytometrisk analyse ble anvendt for lokalisering av DS6-epitopen CA6 til celleoverflaten. Humane cellelinjer ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC), bortsett fra cellelinjene OVCAR5 (Kearse et al., Int. J. Cancer, 88(6):866-872 (2000)), OVCAR8 og IGROV1 (M. Seiden, Massachusetts General Hospital). Alle celler ble dyrket i RPMI-1640 tilsatt 4 mM L-glutamin, 50 U/ml penicillin, 50ug/ml streptomycin (Cambrex BioScience, Rockland, ME) og 10 % (vol/vol) føtalt, bovint serum (Atlas Biologicals, Fort Collins, CO), i det påfølgende betegnet dyrkningsmedium. Cellene ble dyrket i en fuktgjort inkubator ved 37 °C og 5 % C02.
Celler (1-2 x IO"<5>celler/brønn) ble inkubert på is i 3-4 timer med seriefortynnede konsentrasjoner av DS6-antistoff fremstilt i FACS-buffer (2 % geiteserum, RPMI) i 96-brønners plater. Cellene ble nedsentrifugert i en bordsentrifuge ved 1500 rpm i 5 minutter ved 4 °C. Etter fjerning av mediet ble brønnene fylt med 150 ul FACS-buffer. Vasketrinnet ble så gjentatt. FITC-merket anti-muse-IgG fra geit (Jackson Immunoresearch) ble fortynnet 1:100 med FACS-buffer og inkubert med cellene i 1 time på is. Platen ble dekket med folie for å forhindre lysbleking av signalet. Etter to gangers vask ble cellene fiksert med 1 % formaldehyd og analysert i et flowcytometer.
CA6-epitopen ble hovedsakelig funnet i cellelinjer med opphav i ovarier, bryst, cervix og bukspyttkjertel (tabell 3), som forventet ut fra immunhistokjemisk analyse av tumoren. Imidlertid viste noen cellelinjer fra tumortyper begrenset CA6-ekspresjon. DS6-antistoffet bindes med en tilsynelatende KDpå 135,6 pM (til PC-3-celler, tabell 3). Den maksimale gjennomsnittlige fluorescens (tabell 3) i bindingskurvene (figur 1) i de antigenpositive cellelinjene antyder den relative antigentetthet.
Eksempel 2 Karakterisering av DS6- epitopen
Egenskapene til DS6-antigenet, CA6, ble analysert ved immunblotting av dot-blott av CA6-positive cellelysater (Caov-3), kløyvd ved proteolytisk (pronase og proteinase K) og/eller glykolytisk (neuraminidase og perjodsyre) behandling. Som positive kontroller ble andre antistoffer som gjenkjenner et utvalg av epitoptyper, analysert på lysater fra antigenpositive cellelinjer (Caov-3 og CMI, Colo205 og C242, SKMEL28 og R24). CMI er et antistoff som gjenkjenner en proteinepitop i domenet for variabelt antall tandemrepetisjoner (VNTR) i Mucl og utgjør således en kontroll for en proteinepitop. C242 bindes til en ny colorektal, kreftspesifikk sialinsyreavhengig glykotop på Mucl (CanAg) og utgjør en kontroll for en glykotop på et protein. R24 bindes til GD3-gangliosidet, som er spesifikt for melanom, og utgjør således en kontroll for en glykotop på en ikke-proteinbærer.
Caov-3-celler, Colo205-celler og SKMEL28-celler ble utsådd i 15 cm vevsdyrkningsskåler. Dyrkningsmediet (30 ml/skål) ble fornyet dagen før lysering. En modifisert RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,6, 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 1 % NP40, 0,25 % natriumdeoksycholat), proteaseinhibitorer (PMSF, pepstatin A, leupeptin og aprotinin) og PBS ble på forhånd avkjølt på is. Etter avsuging av dyrkningsmediet fra skålene ble cellene vasket to ganger med 10 ml avkjølt PBS. Alle de påfølgende trinn ble utført på is og/eller i et 4 °C kjølerom. Etter avsuging av siste PBS-vask ble cellene lysert i 1-2 ml lyseringsbuffer (RIPA-buffer med nylig tilsatt proteaseinhibitorer til en endelig konsentrasjon på 1 mM PMSF, 1 nM pepstatin A, 10 ug/ml leupeptin og 2 ng/ml aprotinin). Lysatene ble skrapt av platene ved anvendelse av en celleløfter og triturert ved å pipettere suspensjonene opp og ned (5-10 ganger) med en 18G-kanyle. Lysatene ble rotert i 10 minutter og så sentrifugert i en mikrosentrifuge ved maksimal hastighet (13K rpm) i 10 minutter. Nedsentrifugert materiale ble fjernet, og supernatantene ble analysert ved anvendelse av et Bradford-proteinanalysesett (Biorad).
Lysatene (2 ul) ble pipettert direkte på tørre 0,2 nm nitrocellulosemembraner. Flekkene fikk lufttørke i ca. 30 minutter. Membranen ble kuttet i biter som hver inneholdt en enkelt flekk. Flekkene ble inkubert i nærvær av pronase (1 mg/ml enzym, 50 mM Tris, pH 7,5, 5 mM CaCI2), proteinase K (1 mg/ml enzym, 50 mM Tris, pH 7,5, 5 mM CaCI2), neuraminidase (20 mU/ml enzym, 50 mM natriumacetat, pH 5, 5 mM CaCI2, 100 ng/ml BSA) eller perjodsyre (20 mM, 0,5 M natriumacetat, pH 5) i 1 time ved 37 °C. Reagensene ble erholdt fra Roche (enzymer) og VWR (perjodsyre). Membranene ble vasket (5 minutter)
i T-TBS-vaskebuffer (0,1 % Tween 20, 1 x TBS), blokkert i blokkeringsbuffer (3 % BSA, T-TBS) i 2 timer ved romtemperatur og inkubert over natten med 2 ng/ml primærantistoff (det vil si DS6, CMI, C242, R24) i blokkeringsbuffer ved 4 °C. Membranene ble vasket tre ganger, hver gang i 5 minutter, i T-TBS og så inkubert med HRP-konjugert antimuse(eller menneske)-IgG-sekundærantistoff fra geit (Jackson Immunoresearch, 1:2000 fortynning i blokkeringsbuffer) i 1 time ved romtemperatur. Immunblottene ble vasket tre ganger og fremkalt ved anvendelse av et ECL-system (Amersham).
Immunblottene (figur 2) av de kløyvde kontrollysatene viste at CMl-signalet ble ødelagt ved de proteolytiske behandlingene, mens signalene fra de glykolytiske kløyvingene ikke ble påvirket, som forventet for et antistoff som gjenkjenner en proteinepitop. C242-signalet ble ødelagt ved både de proteolytiske og de glykolytiske behandlingene, som forventet for et antistoff som gjenkjenner en glykotop som foreligger på et protein. R24-signalet, som ikke ble påvirket av de proteolytiske behandlingene, ble fjernet ved behandling med neuraminidase eller perjodase, som forventet for et antistoff som gjenkjenner et gangliosid. DS6-immunblottet fra de kløyvde Caov-3-lysat-dot-blottene viste tap av signal ved behandling med både de proteolytiske og glykolytiske forbindelsene. I likhet med C242 bindes følgelig DS6 til en karbohydratepitop på en proteinkjerne. Videre var signalet i DS6-immunblottet følsomt overfor behandling med neuraminidase. Følgelig er CA6 i likhet med CanAg en sialinsyreavhengig glykotop.
For å bekrefte karbohydrategenskapene til CA6 ble Caov-3-lysat pipettert til PVDF-membraner og behandlet med det kjemiske deglykosyleringsmidlet trifluormetansulfonsyre (TFMSA) under nitrogen ved romtemperatur i 5 minutter. Blottet ble vasket med T-TBS og immunblottet med enten CMI eller DS6 (figur 3). DS6-signalet ble ødelagt ved syrebehandlingen, noe som ytterligere viser at CA6 er en glykotop. Forsterkningen av CMl-signalet ved behandling med TFSMA viserat syrebehandlingen ikke påvirket proteinet på filteret, og antyder at denne glykolytiske behandlingen eksponerte proteinepitopen som gjenkjennes av CMI.
For ytterligere å undersøke strukturen av karbohydratet som CA6 er forbundet med ble dot-blott behandlet med N-glykanase, O-glykanase og/eller sialidase (figur 4). Caov-3-cellelysater (100 ng, 30 ni) ble inkubert ved 100 °C i 5 minutter med 2,5 ni denatureringsbuffer (Glyko) tilsatt SDS og p-merkaptoetanol. De denaturerte lysatene ble så behandlet med 1 n' N-glykanase, O-glykanase og/eller sialidase A (Glyko) ved 37 °C i 1 time. De behandlede lysater ble så pipettert (2 ni) på nitrocellulose og immunblottet som beskrevet ovenfor.
N-glykanase hadde ingen åpenbar virkning på DS6-immunblottsignalene. Prøver behandlet med sialidase ga imidlertid intet signal. Siden O-glykanase ikke kan avspalte sialyserte, O-koblede karbohydrater uten forbehandling med sialidase, vil DS6-signalet i prøver behandlet med O-glykanase alene ikke påvirkes. I motsetning til dette krever N-glykanase ingen forbehandling med glykolytiske enzymer for aktivitet. Det faktum at N-glykanasebehandling ikke påvirker DS6-signalet, tyder på at CA6-epitopen sannsynligvis foreligger på sialyerte, O-koblede karbohydratkjeder.
Eksempel 3 Identifisering av antigenet som CA6- epitopen foreligger på
For å identifisere antigenet som CA6-sialoglykotopen foreligger på ble DS6-immunpresipiteringer analysert ved SDS-PAGE og western-blotting. Cellelysatsupernatanter (1 ml/prøve, 3-5 mg protein) ble klaret på forhånd med protein G-kuler (30 ni) ekvilibrert med 1 ml RIPA-buffer i 1-2 timer under rotasjon ved 4 °C. Alle påfølgende trinn ble utført på is og/eller i et 4 °C kjølerom. De forklarede kulene ble raskt sentrifugert ned (2-3 sekunder) i en mikrosentrifuge. De forklarede supernatanter ble overført til nye rør og inkubert over natten med 2 ng DS6 under rotasjon. Friske, ekvilibrerte protein G-kuler (30 ni) ble tilsatt til lysatene og inkubert i 1 time under rotasjon. Kulelysatsuspensjonene ble raskt sentrifugert i en mikrosentrifuge, og hvor ønskelig ble prøver av lysater etter immunpresipitering uttatt. Kulene ble vasket 5-10 ganger med 1 ml RIPA-buffer.
Immunutfelte DS6-prøver ble så behandlet med 30 ni neuraminidase (20 mU neuraminidase (Roche), 50 mM natriumacetat, pH 5, 5 mM CaCI2, 100ng/ml BSA) eller 30 ni perjodsyre (20 mM perjodsyre (VWR), 0,5 M natriumacetat, pH 5) i 1 time ved 37 °C. De ble så resuspendert i 30 ni 2 x prøvepåsettingsbuffer (inneholdende p-merkaptoetanol). Kulene ble kokt i 5 minutter, og supernatanten med påsettingsbuffer ble satt på 4-12 % eller 4-20 % Tris-glysingeler (Invitrogen). Gelene ble fraksjonert i Laemmli-elektroforesebuffer ved 125 V i 1,5 timer. Gelprøvene ble overført over natten ved 20 mA til 0,2 nm nitrocellulosemembraner (Invitrogen) ved anvendelse av et Mini Trans-blott-overføringsapparat (Biorad). Membranene ble immunblottet med DS6, som beskrevet ovenfor i eksempel 2.
Alternativt ble de immunutfelte kulene først denaturert og så enzymatisk behandlet med N-glykanase, O-glykanase og/eller sialidase A (Glyko). Kulene ble resuspendert i 27 ni inkuberingsbuffer og 2 ni denatureringsløsning (Glyko) og inkubert ved 100 °C i 5 minutter. Etter avkjøling til romtemperatur ble detergentløsning (2 nO tilsatt, og prøvene ble inkubert med 1 ni N-glykanase, O-glykanase og/eller sialidase A ved 37 °C i 4 timer. Etter tilsetning av 5 x prøvepåsettingsbuffer (7 ni) ble prøvene kokt i 5 minutter. Prøvene ble fraksjonert ved SDS-PAGE og immunblottet som beskrevet ovenfor.
DS6 immunutfeller et proteinbånd på > 250 kDa som kan observeres i antigenpositive cellelysater (figurene 5A, B og C). I noen cellelinjer (det vil si T-47D)
observeres en dublett. Båndet på > 250 kDa var fjernet i Caov-3-immunpresipiteringer som var behandlet med neuraminidase eller perjodsyre (figurene 5A og B), noe som tyder på at CA6-epitopen foreligger på > 250 kDa-båndet. > 250 kDa-båndet ble også vist ikke å være følsomt overfor N-glykanasebehandling av immunpresipiteringer, i samsvar med at CA6 foreligger på et O-koblet karbohydrat (figur 5F). Nok en støtte for at 250 kDa-båndet er CA6-antigenet, er det faktum at DS6 ikke immunutfeller et slikt bånd fra DS6-antigennegative celler (figurene 5D og E).
Flere forskjellige indisier tydet på at CA6-antigenet var Mucl. Grunnet den høye molekylvekten og følsomheten overfor glykolytiske enzymer spesifikke for O-koblet karbohydrat virket det sannsynlig at CA6-antigenet var et mucin. Mucinoverekspresjon er godtkarakteriserti tumorer, særlig i bryst og ovarier, i samsvar med den fremtredende tumorreaktivitet av DS6. Videre er CA6 i likhet med CanAg (en sialoglykotop på Mucl) ikke følsom for perklorsyreutfelling, noe som tyder på at CA6-antigenet er omfattende O- glykosylert. Den observasjon at DS6 i noen DS6-uttrykkende cellelinjer immunutfelte en dublett på > 250 kDa, tydet på at CA6 var Mucl. Et kjennetegn på Mucl hos mennesker er forekomsten av to atskilte Mucl-alleler som er forskjellige når det gjelder antall tandemrepetisjoner, noe som fører til ekspresjon av to Mucl-proteiner med forskjellig molekylvekt.
For å analysere hvorvidt CA6 foreligger på Mucl ble DS6-immunpresipiteringer fra Caov-3-lysat fraksjonert ved SDS-PAGE og immunblottet med enten DS6 eller et Mucl-VNTR-antistoff, CMI. Som figur 6A viser, reagerer CMI kraftig med > 250 kDa-båndet som immunutfelles med DS6. I figur 6B viser DS6- og CMl-immunpresipiteringer fra HeLa-cellelysat den samme > 250 kDa-dublett ved immunblotting med enten DS6 eller CMI. Disse resultatene viser at CA6-epitopen faktisk foreligger på Mucl-proteinet. DS6-dubletten som observeres i Hel_a(og T-47D)-celler, kan forklares ved det faktum at Mucl-ekspresjonen skjer fra atskilte alleler med et forskjellig antall tandemrepetisjoner.
Selv om CMI og DS6 bindes til det samme Mucl-protein, er de atskilte epitoper. Kjemisk deglykosylering av dot-blott av Caov-3-lysat med trifluormetansulfonsyre (TFMSA) fjernet DS6-signalet (figur 3). Den samme behandlingen forsterket imidlertid CMl-signalet. Deglykosylering kan ha blottlagt skjulte epitoper for CMI-antistoffet. Videre viser en sammenligning av de flowcytometriske bindingsresultatene for DS6 og CMI (tabell 4) at CA6-epitopen ikke foreligger på alle celler som uttrykker Mucl. Det er av interesse å bemerke at CA6-epitopen ikke uttrykkes på Colo205 (tabell 3), en cellelinje som vites å uttrykke Mucl-CanAg-sialoglykotopen i høyt nivå.
Eksempel 4 Kvantitativ analyse av frigjort CA6- epitop
Siden CA6-epitopen foreligger på Mucl, et molekyl som vites å frigjøres til blodstrømmen hos mange kreftpasienter, ble en kvantitativ tilnærming benyttet for å bestemme hvorvidt nivået ville kunne være hindrende for DS6-antistoffbehandling. Binding av sirkulerende antistoff til antigen antas å føre til hurtig fjerning av immunkomplekser fra blodet. Dersom en signifikant andel av den tilførte antistoffdose hurtig fjernes fra sirkulasjonen, vil sannsynligvis mengden som når tumoren reduseres, noe som fører til redusert antitumoraktivitet av et terapeutisk antistoff. Dersom antistoffet er konjugert til en svært kraftig cytotoksisk forbindelse, kan den hurtige fjerningen av konjugatet muligens gi økt uspesifikk toksisitet. Når det gjelder konjugater av antistoff og lite medikament som DS6-DM1, ville følgelig et høyt nivå av frigjort antigen forventes å både redusere antitumorvirkningen og forhøye den dosebegrensende toksisitet.
Nyere kliniske utprøvinger av terapeutiske antistoffer har gitt informasjon vedrørende virkningen av konsentrasjonen av frigjort antigen på farmakokinetikken. I f.eks. kliniske forsøk med trastuzumab (Herceptin), et antistoff som anvendes for behandling av her2/neu-uttrykkende metastatisk brystkreft, ble farmakokinetikken for uttømming av trastuzumab vist å ikke endres dersom nivået av frigjort Her2/neu var lavere enn 500 ng/ml (Pegram et al., J. Clin. Oncol., J6(8):2659-71 (1998). Dersom man antar en molekylvekt av frigjort Her2/neu på 110 000 dalton, ser en molar konsentrasjon av frigjort Her2/neu som er lavere enn 4,5 nM ut til å ha liten virkning på farmakokinetikken.
I et annet eksempel viste et klinisk forsøk med cantuzumabmertansin (huC242-DMl) at det ikke var noen korrelasjon mellom nivået av CanAg (C242-epitop) frigjort før behandlingen og farmakokinetikken for uttømming av antistoffet (Tolcher et al., J. Clin. Oncol., 2J(2):211-22 (2003). CanAg-epitopen er i likhet med CA6-epitopen som gjenkjennes av DS6, en unik tumorspesifikk, O-koblet sialoglykotop på Mucl. CanAg-epitopens heterogene natur gjør det imidlertid vanskelig å kvantifisere molart. I den generelle populasjonen varierer Mucl-alleler i lengde, avhengig av antall tandemrepetisjoner i domenet for variabelt antall tandemrepetisjoner (VNTR). Flere seter for O-koblet glykosylering foreligger i hver tandemrepetisjon. Noe som bidrar til kompleksiteten når det gjelder CanAg-ekspresjon, er variasjonen fra celle til celle når det gjelder iboende glykosyltransferaseaktivitet. Således er et bredt utvalg av CanAg-epitoper pr. Mucl-molekyl mulig, selv hos en enkelt pasient. Videre vil antall CanAg-epitoper pr. Mucl-molekyl være forskjellig i en populasjon av pasienter. Av denne grunn måles frigjort CanAg i serumprøver ved sandwich-ELISA, hvor frigjort Mucl med CanAg-epitop innfanges av C242 og påvises med et biotinylert C242/streptavidin-HRP-system. Frigjort CanAg kvantifiseres i standardiserte enheter (U) som er proporsjonale med antall epitoper pr. ml serum, snarere enn ved en molar konsentrasjon av Mucl. Analogt med dette opptrer en tilsvarende situasjon for kvantifisering av frigjorte CA6-epitoper. For trastuzumab er det i motsetning til dette kun én epitop pr. frigjort Her2/neu-molekyl, noe som i stor grad forenkler kvanti-fiseringen av frigjort antigen.
For å kunne relatere nivået av frigjort CA6-epitop med nivået som forefinnes i kliniske forsøk med trastuzumab og cantuzumabmertansin ble en fremgangsmåte for erholdelse av molare konsentrasjoner av kompliserte frigjorte epitoper, f.eks. sialoglykotoper på Mucl, utviklet. Først ble en enkel sandwich-ELISA analyse for DS6 etablert. Analysen er skissert i figur 7A. DS6 ble anvendt for innfanging av Mucl med CA6-epitop. Siden hvert Mucl-molekyl har flere CA6-epitoper, ble biotinylert DS6 også anvendt som sporantistoff. Biotinylert DS6 bundet til innfanget CA6 ble påvist med streptavidin-HRP ved anvendelse av ABTS som substrat. CA6-epitop ble innfanget fra serum fra ovariekreftpasienter eller fra standarder som kommer fra et kommersielt tilgjengelig Mucl-analsyesett (CA15-3) som anvendes for å måle frigjort Mucl hos brystkreftpasienter. DS6-enheter/ml ble tilfeldig satt lik CA15-3-standardenheter/ml.
I figur 7B vises resultatene fra DS6-"sandwich"-ELISA-analysen hvor CA15-3-standarder ble anvendt. Den fremstilte kurven ligner svært på kurven som erholdes med CA15-3-standarder i CA15-3-analysen. For å overføre DS6-enhet/ml til en molar konsentrasjon av CA6 er det nødvendig med en standardkurve for biotinylert DS6 som overfører signal til pikogram DS6. Dersom man antar en en-til-en-støkiometri mellom CA6-epitop og biotinylert DS6-antistoff og en molekylvekt på 160 000 dalton for biotinylert DS6, kan antall mol CA6 innfanget pr. volum prøve som er tilsatt beregnes.
I figurene 8A og B vises to alternative måter å fremstille en standardkurve for biotinylert DS6 på. I figur 8A anvendes polyklonalt anti-muse-IgG fra geit for innfanging av biotinylert DS6, som i sin tur påvises på en måte som tilsvarer den benyttet i sandwich-ELISA-analysen vist i figur 7. I fremgangsmåten vist i figur 8B bindes biotinylert DS6 direkte til ELISA-platen og påvises som i figur 8A. Som vist i figur 8C, stemmer standardkurvene for biotinylert DS6 fremstilt ved disse fremgangsmåtene godt med hverandre.
I tabell 5 vises analysen av serumprøver fra ovariekreftpasienter for forskjellige frigjorte antigener. CA125-ELISA anvendes generelt for å følge behandlingen av ovariekreftpasienter ved å måle frigjorte CA125-enheter/ml. CA125-statusen ble erholdt med serumprøvene. CA15-3-ELISA anvendes generelt for å følge behandlingen av brystkreftpasienter ved å måle enheter/ml av frigjort Mucl ved anvendelse av innfangings-og påvisningsantistoffer som gjenkjenner epitoper som er forskjellige fra epitopen som gjenkjennes av DS6. I tabell 5 er CA15-3 målt i serumprøver fra ovariekreftpasienter.
For CA15-3-verdiene som er gitt i tabell 5, ble et kommersielt tilgjengelig CA15-3 Enzyme Immuno Assay-sett fra CanAg Diagnostics anvendt. For DS6-enheter/ml ble en standardkurve fremstilt ved anvendelse av CA15-3-standardene (fra CA15-3 Enzyme Immuno Assay-settet fra CanAg Diagnostics) i DS6-"sandwich"-ELISA-analysen. DS6-enheter/ml ble tilfeldig satt lik CA15-3-enheter/ml. I de siste to kolonnene er den pikomolare konsentrasjon (pM) frigjort CA6 beregnet ved anvendelse av standard kurven erholdt med biotinylert DS6, vist i figur 8C.
For den kvantitative analysen av CanAg-nivået var serumnivået av CanAg nivået som var rapportert for pasienter som deltok i en klinisk utprøving av cantuzumabmertansin før behandlingen (Tolcher et al., J. Clin. Oncol., 2i(2):211-22
(2003). En ELISA-analyse som tilsvarer den beskrevet for DS6, ble anvendt for fremstilling av en Can Ag-standard kurve ved anvendelse av CanAg-standarder. C242 ble anvendt for innfanging av CanAg-standardene. Påvisning av innfanget CanAg ble oppnådd ved anven- deise av biotinylert C242 som sporingsantistoff, fulgt av utvikling med streptavidin-HRP med ABTS som substrat. En standardkurve erholdt med biotinylert C242 ble konstruert på samme måte som for biotinylert DS6, noe som tillater omregning av enheter/ml til en molar konsentrasjon av sirkulerende CanAg-epitoper. I tabell 6 gis CanAg-nivået hos pasienter som deltok i den kliniske utprøvning av cantuzumabmertansin, sammen med den på tilsvarende måte beregnede molare konsentrasjon av sirkulerende CanAg.
En sammenligning av det pikomolare nivå av frigjort CA6 hos ovariekreftpasienter og nivået beregnet for frigjort CanAg hos CanAg-positive kreftpasienter viser at nivået av frigjort CA6 generelt tilsvarer nivået av frigjort CanAg. Videre har kun 2 av 16 serumprøver fra ovariekreftpasienter muligens et CA6-nivå som er høyere enn 4,5 nm (serumprøver 5 og 9, for hvilke signalet lå utenfor standardkurvens område), nivået over hvilket en endret herceptinfarmakokinetikk ble observert i kliniske forsøk med Her2/neu-positive brystkreftpasienter. CanAg-nivåer over 4,5 nM ble kun observert hos 3 av 37 pasienter som inngikk i den kliniske utprøvingen. I denne kliniske utprøvingen var det ingen korrelasjon mellom nivået av frigjort CanAg og hurtigere uttømming av cantuzumabmertansin. Pasienten med det høyeste CanAg-nivå (31 240 U/ml) ble imidlertid bare analysert i 18 timer etter transfusjonen). Disse resultatene viser at selv om visse epitoper på Mucl, f.eks. CA6 og CanAg, frigjøres hos kreftpasienter, frigjøres de ikke i et nivå som forhindrer terapeutisk antistoffbehandling.
Eksempel 6 Kloning av variable områder fra antistoff DS6 fra mus
Monoklonale museantistoffer som DS6 har begrenset anvendbarhet i klinisk sammenheng, siden de gjenkjennes som fremmede av det humane immunsystem. Pasienter utvikler hurtig humane antimuseantistoffer (HAMA), noe som fører til hurtig uttømming av museantistoffer. Av denne grunn ble det variable området i museantistoff DS6 (muDS6) overflatemodifisert for fremstilling av humaniserte DS6-antistoffer (huDS6).
De variable områder i museantistoffet DS6 ble klonet ved RT-PCR. Total RNA ble renset fra en konfluent T175-flaske med DS6-hybridomceller ved anvendelse av minipreparasjonssettet Qiagen RNeasy. RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved UV-spektro- fotometri, og RT-reaksjonene ble utført med 4-5 ng total-RNA ved anvendelse av settet Gibco Superscript II og randomiserte heksamerprimere.
PCR-reaksjonene ble utført med degenererte primere basert på primerne beskrevet av Wang, Z. et al., J. Immunol. Methods., 13. januar, 233(1-2): 167-77 (2000). RT-reaksjonsblandingen ble anvendt direkte for degenerert PCR-reaksjoner. 3'-lettkjedeprimeren, HindKL,
og 3'-tungkjedeprimeren, BamlgGl, ble anvendt, og for 5'-enden var PCR-primerne SaclMK for lettkjeden og en blanding av like mengder av EcoRIMHl og EcoRIMH2
for tungkjeden (blandede baser: H=A + T+C, S = G + C, Y=C + T, K = G + T, M = A +
C, R = A + G, W = A + T, V = A + C + G, N=A + T+ G + C).
PCR-reaksjonene var standard reaksjonsblandinger, bortsett fra at de var tilsatt 10 % DMSO (reaksjonsblandinger på 50 ul inneholdt sluttkonsentrasjoner av 1 x reaksjonsbuffer (ROCHE), 2 mM av hvert dNTP, 1 mM av hver primer, 2 ul RT-reaksjon, 5 ul DMSO og 0,5 ul Taq (ROCHE)). PCR-reaksjonene ble utført i en MJ research programmerbar varmeblokk ved anvendelse av et program tilpasset fra Wang, Z. et al. (J. Immunol. Methods, 13. januar, 233(1-2): 167-77 (2000)): 1) 94 °C i 3 minutter; 2) 94 °C i 15 sekunder; 3) 45 °C i 1 minutt; 4) 72 °C i 2 minutter; 5) tilbake til trinn nr. 2 29 ganger; 6) avslutning med et endelig forlengelsestrinn ved 72 °C i 10 minutter. PCR-produktene ble klonet i pBluescript II SK+ (Stratagene) ved anvendelse av restriksjonsenzymene hvis seter ble innført ved PCR-primerne. Seqwright-sekvenseringsservice sekvenserte tungkjede- og lettkjedeklonene.
For å bekrefte cDNA-sekvensene i 5'-enden ble ytterligere PCR og kloning utført. Lettkjede- og tungkjede-cDNA-sekvensen fra DS6, bestemt fra de genererte PCR-klonene, ble klippet ut og limt inn i webstedet til NCBI for Blast-søk, og museantistoffsekvenser med tilhørende signalsekvenser ble lagret. PCR-primere ble utformet fra disse signalpeptidene ved anvendelse av konserverte strekk blant de beslektede DNA-sekvensene. EcoRI-restriksjonsseter ble innført i ledersekvensprimerne (tabell 7), og disse ble anvendt i RT-PCR-reaksjoner, som beskrevet ovenfor.
Flere separate lettkjede- og tungkjedekloner ble sekvensert for påvisning og unngåelse av mulige polymeraseinnførte sekvensfeil. En enkeltsekvens ble erholdt for både lettkjedens og tungkjedens RT-PCR-kloner. Disse sekvensene var tilstrekkelige for utforming av primere som kunne amplifisere lettkjede- og tungkjedesekvensene i muse-DS6 inn i signalsekvensen. De påfølgende klonene fra disse oppfølgings-PCR-reaksjonene bekreftet 5'-endesekvensene i det variable området som var blitt endret av de opprinnelige degenererte primerne. De samlede resultater fra de forskjellige cDNA-klonene ga de endelige sekvensene for lettkjede og tungkjede fra muse-DS6, som er vist i figur 9. Ved anvendelse av Kabat- og AbM-definisjoner ble de tre CDR i lettkjeden og tungkjeden påvist (figurene 9 og 10). Et søk i NCBI-IgBlast-databasen viser at det variable lettkjedeområdet i antistoff muDS6 sannsynligvis er avledet fra musekjønnscellegenet IgV?ap4, mens det variable tungkjedeområdet sannsynligvis er avledet fra musekjønnscellegenet IgVhJ558.41 (figur 11).
Eksempel 7 Bestemmelse av overflateaminosyrerester i det variable området i antistoff DS6
Teknikkene for overflatemodifisering av antistoffer som beskrives av Pedersen et al. (1994) og Roguska et al. (1996), begynner med å prediktere overflateaminosyrerester i museantistoffets variable sekvenser. En overflateaminosyrerest er definert som en aminosyre hvor minst 30 % av det totale overflateareal er tilgjengelig for et vannmolekyl. I fravær av en løst struktur for identifisering av overflateaminosyrerestene i muDS6 sammenstilte vi de ti antistoffene med de mest homologe sekvensene i settet av 127 antistoffstrukturfiler (figur 12). Gjennomsnittet av løsningsmiddeltilgjengeligheten for hver Kabat-posisjon ble beregnet for disse sammenstilte sekvensene (figurene 13A og B).
Overflate pos i sjoner med en gjennomsnittlig tilgjengelighet på mellom 25 % og 35 % fikk gjennomgå en andre analyserunde ved å sammenligne en undergruppe av antistoffer som inneholder to identiske flankerende aminosyrerester på hver side (figurene 13A og B). Etter den andre analyserunden ble antall predikterte overflateaminosyrerester for muDS6-tungkjeden forhøyet fra 21 til 23 ved at Tyr3 og Lys23 ble addert til listen over aminosyrerester med en prediktert overflatetilgjengelighet på mer enn 30 %. I de fleste av våre overflatemodifiserte antistoffer benyttes Kabat-definisjonen av tungkjedens CDR1, men for DS6 ble AbM-definisjonen utilsiktet anvendt i beregningene, slik at tungkjedens aminosyrerest T28 ikke ble definert som en overflateaminosyrerest i rammeverksområdet, som den ellers ville ha blitt. Antall overflateposisjoner i lettkjeden ble redusert fra 16 til 15, siden den predikterte overflatetilgjengelighet av Ala80 ble redusert fra 30,5 % til 27,8 % i den andre analyserunden. Samlet har de variable sekvensene i tungkjeden og lettkjeden i muDS6 38 predikterte overflatetilgjengelige rammeverksaminosyrerester.
Eksempel 8 Seleksjon av humant antistoff
Overflateposisjonene i det variable området i muse-DS6 ble sammenlignet med de tilsvarende posisjoner i humane antistoffsekvenser i Kabat-databasen (Johnson, G., Wu, T.T., Nucleic Acids Res., 1. januar, 29(l):205-6 (2001)). Antistoffdatabasens styringsprogramvare SR (Searle, 1998) ble anvendt for ekstraksjon og sammenstilling av overflateaminosyrerester fra naturlige tungkjede- og lettkjedepar fra humane antistoffer. Den overflate fra et humant antistoffs variable område som hadde de fleste identiske overflateaminosyrerestene, idet det ble tatt spesielt hensyn til posisjoner som ligger innenfor 5 Å fra et CDR, ble utvalgt til å erstatte overflateaminosyrerester i det variable området i museantistoff DS6.
Eksempel 9 Ekspresjonsvektor for kimære og humaniserte antistoffer
Sekvensene for lettkjede- og tungkjedeparet ble klonet inn i en enkelt pattedyrekspresjonsvektor. PCR-primerne for de humane variable sekvensene innførte restriksjonsseter som tillot at den humane signalsekvens kunne adderes inn i pBluescript II-kloningsvektoren. De variable sekvensene kunne da klones inn i pattedyrekspresjonsplasmidet med EcoRI og BsiWI for lettkjeden og Hindlll og Apal for tungkjeden (figur 14). Lettkjedens variable sekvenser ble klonet med opprettholdt leseramme i det konstante området i humant Ig-kappa, og tungkjedens variable sekvenser ble klonet inn i sekvensen til det konstante området i humant Ig-gammal. I de endelige ekspresjonsplasmidene styrer humane CMV-promotere ekspresjonen av både lettkjedens og tungkjedens cDNA-sekvens.
Eksempel 10 Påvisning av aminosyrerester som på negativ måte kan påvirke DS6- aktivitet
I de fleste humaniseringer som til nå er blitt utført, er det blitt bygget en molekylmodell av det angjeldende antistoff for påvisning av aminosyrerester som ligger nær et CDR som mulige problemaminosyrerester. Med et stadig økende antall overflatemodifiserte antistoffer å ta utgangspunkt i, er historisk erfaring minst like effektiv når det gjelder å forutsi problemer som det å bygge en modell, så det ble ikke bygget en molekylmodell av DS6. I stedet ble overflateaminosyrerestene i muse-DS6 sammenlignet med overflateaminosyrerestene i tidligere overflatemodifiserte antistoffer, og aminosyrerester med lav til høy risiko for å påvirke antistoffets bindingsaktivitet ble identifisert.
Lignende sett av aminosyrerester er gjentatte ganger blitt påvist å ligge innenfor 5 Å fra et CDR, både i de tilgjengelige løste antistoffstrukturene og i molekylmodeller fra tidligere humaniseringer. Ved anvendelse av disse resultatene gir tabell 1 de muse-DS6-aminosyrerestene som sannsynligvis ligger nær et CDR, muligens innen 5 Å. Mange av disse posisjonene er også blitt endret i tidligere humaniseringer, men kun tungkjedeposisjon 74 har noensinne ført til tap av bindingsaktivitet. Museaminosyreresten ble bibeholdt i denne posisjonen i både huC242 og huB4 for å bevare museantistoffets bindingsaktivitet. Derimot ble denne posisjonen endret til den tilsvarende humane aminosyrerest i humanisert 6.2G5C6 uten tap av aktivitet (6.2G5C6 er det anti-IGFl-R-antistoff som ofte for enkelhets skyld betegnes anti-C6). Selv om alle aminosyrerestene i tabell 1 kan tenkes å utgjøre et problem i det humaniserte antistoff, må det tas spesielt hensyn til tungkjedeaminosyrerest P73 grunnet tidligere erfaringer når det gjelder denne posisjonen.
Eksempel 11 Utvelgelse av den mest homologe humane overflate
Kandidater til humane antistoffoverflater som kan anvendes for overflatemodifisering av muDS6, ble hentet ut fra Kabat-antistoffsekvensdatabasen ved anvendelse av programvaren SR. Denne programvaren gir et grensesnitt hvor kun angitte aminosyre-restposisjoner benyttes for søk i antistoffdatabasen. For å bevare de naturlige parene ble overflateaminosyrerestene i lettkjeden og tungkjeden sammenlignet sammen. De mest homologe humane overflatene fra Kabat-databasen ble sammenstilt for å kunne rangeres ut fra sekvensidentitet. De øverste tre overflatene, sammenstilt ved hjelp av programvaren SR i Kabat-databasen, gis i tabell 2. Overflatene ble så sammenlignet for å identifisere de humane overflatene som krever færrest endringer av aminosyrerestene som er vist i tabell 1. Anti-Rh(D)-antistoffet 28E4 (Boucher et al., 1997) krever det laveste antall endringer av overflateaminosyrerester (i alt 11), og kun tre av disse aminosyrerestene inngår i listen over mulige problemaminosyrerester. Siden antistoff 28E4 gir den mest homologe humane overflate, er dette den beste kandidat for overflatemodifisering av muDS6.
Eksempel 12 Konstruksjon av DNA- sekvenser for humaniserte DS6- antistoffer
De 11 endringene av overflateaminosyrerester i DS6 ble innført ved anvendelse av PCR-mutagenese. PCR-mutagenese ble utført på cDNA-klonene for det variable området i muse-DS6 for oppbygging av det overflatemodifiserte humane DS6-gen. Humaniseringsprimersett ble utformet for innføring av aminosyreendringene som var nødvendige for overflatemodifisering av DS6, vist nedenfor i tabell 8.
PCR-reaksjonene var standard reaksjonsblandinger, bortsett fra at de var tilsatt 10 % DMSO (50 ul reaksjonsblandinger inneholdt sluttkonsentrasjoner av 1 x reaksjonsbuffer (ROCHE), 2 mM av hvert dNTP, 1 mM av hver primer, 100 ng templat, 5 ul DMSO og 0,5 ul Taq (ROCHE)). Reaksjonene ble utført i en MJ research programmerbar varmeblokk med følgende program: 1) 94 °C i 1 minutt; 2) 94 °C i 15 sekunder; 3) 55 °C i 1 minutt; 4) 72 °C i 1 minutt; 5) tilbake til trinn nr. 2 29 ganger; 6) avslutning med et endelig forlengelsestrinn ved 72 °C i 4 minutter. PCR-produktene ble kuttet med de tilhørende restriksjonsenzymer og klonet inn i pBluescript-kloningsvektorene. Klonene ble sekvensert for bekreftelse av aminosyreendringene.
Siden det å endre tungkjedeaminosyrerest P73 tidligere har ført til problemer, ble det laget to versjoner av tungkjeden, én med den humane 28E4T773 og én hvor P73 fra mus ble beholdt. De andre 10 overflateaminosyrerestene ble endret fra aminosyreresten i musesekvensen til aminosyreresten i humant 28E4 i begge versjoner av det humaniserte DS6 (tabell 2). I henhold til den vanlige fremgangsmåten for å gi navn er den mest humane sekvens versjon 1.0, siden denne har alle de 11 overflateaminosyrerestene. Tungkjedeversjonen hvor P73 fra mus er beholdt, betegnes versjon 1.2 i tilfelle det er nødvendig med ytterligere versjoner, slik at versjon 1.1 er reservert for en versjon som inneholder det maksimale antall museaminosyrerester. Aminosyresekvensene til de to humaniserte versjonene er vist sammenstilt med aminosyresekvensen til muse-DS6 i figurene 15A og B. Begge de humaniserte DS6-antistoffgenene ble klonet inn i antistoffekspresjonsplasmidet (figur 14) for midlertidige og stabile transfeksjoner. cDNA- og aminosyresekvensene i lettkjedens variable områder i de humaniserte versjonene vl.O og vi.2 er like og er vist i figur 16. cDNA- og aminosyresekvensene for tungkjeden i de humaniserte versjonene vl.O og vi.2 er vist i figurene 17A og B.
Eksempel 13 Ekspresjon og rensing av huDS6 i CHO- celler og affinitetsmålinqer
For å fastslå hvorvidt de humaniserte DS6-versjonene har bibeholdt bindingsaffiniteten til muDS6 var det nødvendig å uttrykke og rense antistoffene. CHO-celler ble transfektert med de angjeldende antistoffekspresjonsplasmidene. Siden det forbigående ekspresjonsnivå av huDS6 var svært lavt, ble det valgt å fremstille stabile cellelinjer.
CHODG44-celler (4,32 x IO<6>celler/skål) ble utsådd i 15 cm skåler i ikke-selektivt medium (alfa-MEM + nukleotider (Gibco), tilsatt 4 mM L-glutamin, 50 U/ml penicillin, 50ng/ml streptomycin og 10 % (vol/vol) FBS) og plassert i en fuktgjort inkubator ved 37 °C og 5 % C02. Neste dag ble cellene transfektert med ekspresjonsplasmidene huDS6 vl.O og vi.2 ved anvendelse av en modifisert utgave av Qiagens anbefalte fremgangsmåte for Polyfect-transfeksjon. Det ikke-selektive medium ble avsugd fra cellene. Skålene ble vasket med 7 ml forvarmet (37 °C) PBS og tilsatt 20 ml ikke-selektivt medium. Plasmid-DNA (11 ng) ble fortynnet med 800 ni Hybridoma SFM (Gibco). Så ble 70 ni Polyfect (Qiagen) tilsatt til DNA/SFM-blandingen. Polyfect-blandingen ble så forsiktig vorteksbehandlet i flere sekunder og inkubert i 10 minutter ved romtemperatur. Ikke-selektivt medium (2,7 ml) ble tilsatt til blandingen. Denne ferdige blandingen ble inkubert med de utsådde cellene i 24 timer.
Transfeksjonsblandingen/mediet ble fjernet fra skålene, og cellene ble så trypsinbehandlet og talt. Cellene ble så utsådd i selektivt medium (alfa-MEM minus nukleotider, tilsatt 4 mM L-glutamin, 50 U/ml penicillin, 50 \ ig/ m\ streptomycin, 10 %
(vol/vol) FBS, 1,25 mg/ml G418) i 96-brønners plater (250nl/brønn) i forskjellige tettheter (1800, 600, 200 og 67 celler/brønn). Cellene ble inkubert i 2-3 uker med tilførsel av medium etter behov. Brønnene ble analysert for nivået av antistoffdanneise ved anvendelse av en kvantitativ ELISA. En Immulon 2HB 96-brønners plate ble belagt med antihumant IgG-F(ab)2-antistoff fra geit (Jackson Immunoresearch, 1 ng/brønn i 100 ni 50 mM natriumkarbonatbuffer, pH 9,6) og inkubert i 1,5 timer ved romtemperatur under vipping. Alle påfølgende trinn ble utført ved romtemperatur. Brønnene ble vasket to ganger med T-TBS (0,1 % Tween-20, TBS) og blokkert med 200 n' blokkeringsbuffer (1 % BSA, T-TBS) i 1 time. Brønnene ble vasket to ganger med T-TBS. I en separat plate ble antistoffstandarden, EM164 (100 ng/ml), og dyrkningssupernatanter seriefortynnet (1:2 eller 1:3) i blokkeringsbuffer. Disse fortynningene (100 ni) ble overført til ELISA-platen og inkubert i 1 time. Brønnene ble vasket tre ganger med T-TBS og inkubert med 100 ni antihumant IgG-
Fc-AP fra geit (Jackson Immunoresearch) fortynnet 1:3000 i blokkeringsbuffer i 45
minutter. Etter fem gangers vask med T-TBS ble brønnene fremkalt ved anvendelse av 100 ni PNPP-fremkallingsreagens (10 mg/ml PNPP (p-nitrofenylfosfat, dinatriumsalt, Pierce), 0,1 M dietanolaminbuffer, pH 10,3) i 25 minutter. Absorbansen ved 405 nm ble målt i en ELISA-plateleser. Absorbansmålinger (for dyrkningssupernatanten) i det lineære området av standardkurven ble anvendt for bestemmelse av antistoffnivået.
Klonene med den høyeste produksjon, påvist ved ELISA, ble så ekspandert, og lagre av nedfrosne celler ble fremstilt. For dannelse av tilstrekkelige mengder av antistoff til at det kunne renses ble cellene ekspandert i 15 cm skåler (~1 x IO<6>celler/skål) med 30 ml seleksjonsmedium og inkubert i 1 time. Dyrkningssupernatant ble oppsamlet i 250 ml koniske rør, sentrifugert i en bordsentrifuge (2000 rpm, 5 minutter, 4 °C) og så sterilfiltrert gjennom et 0,2 nm filterapparat.
For rensing av DS6 ble NaOH-kuler tilsatt til de filtrerte
dyrkningssupernatantene til en endelig pH på 8,0. En HiTrap-rprotein A-kolonne (Amersham) ble ekvilibrert med 20-50 kolonnevolumer bindingsbuffer. Supernatanten ble påsatt kolonnen ved anvendelse av en peristaltisk pumpe. Kolonnen ble så vasket med 50 kolonnevolumer bindingsbuffer. Bundet antistoff ble eluert fra kolonnen ved anvendelse av elueringsbuffer (100 mM eddiksyre, 50 mM NaCI, pH 3) i rør som var plassert i en fraksjons-samler. Eluert antistoff ble så nøytralisert ved anvendelse av nøytraliseringsbuffer (2 M K2HP04, pH 10,0) og dialysert over natten mot PBS. Det dialyserte antistoff ble filtrert gjennom et 0,2 nm sprøytefilter. Absorbansen ved 280 nm ble målt for bestemmelse av den endelige proteinkonsentrasjon.
Affiniteten av renset huIgG ble sammenlignet med muDS6 ved flowcytometri.
I det første settet av eksperimenter ble direkte binding til en CA6-utrykkende cellelinje, WISH, målt. Som vist i figur 18A, viste kimært DS6, huDS6 vl.O og huDS6 vi.2 svært like affiniteter, med tilsynelatende Kdpå 3,15 nM, 3,71 nM henholdsvis 4,2 nM, noe som tyder på at overflatemodifiseringen ikke har forstyrret CDR-områdene. Disse affinitetene er bare noe lavere enn for muDS6 (Kd= 1,93 nm), vist i figur 18B.
For å bekrefte at huDS6-versjonene har bibeholdt affiniteten til muDS6 ble konkurransebindingseksperimenter utført. Fordelen med dette formatet er at det samme påvisningssystem anvendes for både museantistoff og humant antistoff, det vil si biotin-muDS6/streptavidin-DTAF. I noen tilfeller kan den eksperimentelt målte tilsynelatende Kdvariere, ganske enkelt grunnet sekundærreagenser som anvendes for indirekte påvisning av binding. Dette kan illustreres ved å sammenligne den tilsynelatende Kdfor biotin-DS6 med Kd-verdien dersom anti-muse-FITC fra geit anvendes (Kd= 2,80 nM, figur 18B) eller dersom streptavidin-DTAF anvendes (Kd= 6,76 nm, figur 19A). Resultatene fra konkurranse-bindingsanalysen, hvor evnen til muDS6, huDS6 vl.O og huDS6 vi.2 til å konkurrere med biotin-DS6 sammenlignes, er vist i figur 19B. Den tilsynelatende EC50er 12,18 nM, 37,07 nM og 22,64 nm for muDS6, huDS6 vl.O henholdsvis huDS6 vi.2. Disse resultatene viser at overflatemodifisering av muDS6 for fremstilling av et humanisert DS6 gir liten reduksjon av bindingsaffiniteten.
Eksempel 14 Fremstilling av det cytotoksiske konjugat DS6- DM1
DS6-antistoffet (8 mg/ml) ble modifisert ved anvendelse av 8 gangers molart overskudd av N-suksinimidyl-4-(2-pyridylditio)pentanoat (SPP) for innføring av ditiopyridylgrupper. Reaksjonen ble utført i 95 % (vol/vol) buffer A (50 mM KP|, 50 mM NaCI, 2 mM EDTA, pH 6,5) og 5 % (vol/vol) DMA i 2 timer ved romtemperatur. Den noe turbide reaksjonsblanding ble gelfiltrert gjennom en NAP-kolonne eller Sephadex G25-kolonne (ekvilibrert i buffer A). Graden av modifisering ble bestemt ved å måle antistoffets absorbans ved 280 nm og absorbansen av DTT-frigjort 2-merkaptopyridin (Spy) ved 280 og 343 nm. Modifisert DS6 ble så konjugert ved en konsentrasjon på 2,5 mg Ab/ml ved anvendelse av et 1,7 gangers molart overskudd av N2 -deacetyl-N2-(3-merkapto-l-oksopropyl)maytansin-(L-DMI) over SPy. Reaksjonen ble utført i buffer A (97 %, vol/vol) med DMA (3 %, vol/vol). Reaksjonsblandingen ble inkubert ved romtemperatur over natten i ca. 20 timer. Den opake reaksjonsblanding ble sentrifugert (1162 x g, 10 minutter), og supernatanten ble så gelfiltrert gjennom en kolonne av NAP-25 eller S300 (Tandem 3, 3 x 26/10 avsaltingskolonner, G25-medium) ekvilibrert i buffer B (1 x PBS, pH 6,5). Nedsentrifugert materiale ble kastet. Konjugatet ble sterilfiltret ved anvendelse av et 0,22 nm Millex-GV-filter og så dialysert mot buffer B i en Slide-A-Lyzer. Antall DMl-molekyler koblet til hvert DS6-molekyl ble bestemt ved å måle absorbansen av det filtrerte materialet ved både 252 nm og 280 nm. Forholdet mellom DM1 og Ab ble funnet å være 4,36, og utbyttet i dette trinnet av konjugert DS6 var 55 %. Konsentrasjonen av konjugert antistoff var 1,32 mg/ml. Det rensede konjugat ble biokjemiskkarakterisert vedstørrelses-eksklusjonskromatografi (SEC) og funnet å være 92 % monomert. Analyse av DM1 i det rensede konjugat viste at 99 % var kovalent bundet til antistoff. I figur 20 viser flowcytometrisk binding av DS6-DMl-konjugat og ikke-modifisert DS6 til Caov-3-celler at konjugering av DS6 kun fører til et lite affinitetstap.
Eksempel 15 In wfro- cvtotoksisitet av DS6- DM1
Som nakent antistoff har DS6 ikke vist proliferativ eller vekstinhiberende aktivitet i cellekulturer (figur 21). Når DS6 inkuberes med celler i nærvær av DM1 konjugert til anti-muse-IgG-tungkjede og -lettkjede fra geit, vil DS6 svært effektivt målstyre og levere dette konjugatet til cellen, noe som fører til indirekte cytotoksisitet (figur 21). For videre å analysere den iboende aktivitet i nakent DS6 ble det utført en komplementavhengig cytotoksisitets(CDC)analyse ved anvendelse av muse-DS6 og humanisert DS6. HPAC og ZR-75-1-celler (25 000 celler/brønn) ble utsådd i 96-brønners plater i nærvær av 5 % humant serum eller kaninserum og forskjellige fortynninger av muse-DS6 eller humanisert DS6 i 200 ni RHBP-medium (RPMI-1640, 0,1 % BSA, 20 mM HEPES (pH 7,2-7,4), 100 U/ml penicillin og 100 ng/ml streptomycin). Cellene ble inkubert i 2 timer ved 37 °C. Så ble Alamar Blue-reagens (Biosource) tilsatt til supernatanten (10 % av den endelige konsentrasjon). Cellene ble inkubert i 5-24 timer før måling av fluorescensen. Verken muse-DS6 eller humanisert DS6 hadde noen virkning i en komplementavhengig cytotoksisitets-(CDC)analyse (figur 22). Dette tyder på at terapeutisk anvendelse av DS6 vil kreve konjugasjon til et toksisk effektormolekyl.
Cytotoksisiteten av maytansinoidkonjugert DS6-antistoff ble undersøkt ved å anvende to forskjellige analyseformater i forskjellige DS6-positive cellelinjer. Klonogenanalyser ble utført, hvor celler (1000-2500 celler/brønn) ble utsådd i 6-brønners plater i 2 ml konjugat fortynnet i dyrkningsmedium. Cellene ble kontinuerlig eksponert overfor konjugatet i flere konsentrasjoner, generelt mellom 3 x 10 11 M til 3 x IO"<9>M, og ble inkubert i et fuktgjort kammer ved 37 °C og 6 % C02i 5-9 dager. Brønnene ble vasket med PBS, og koloniene ble farget med 1 % (vekt/vol) krystallfiolett/10 % (vol/vol) formaldehyd/PBS-løsning. Ubundet fargestoff ble så vasket ut av brønnene med destillert vann, og platene fikk tørke. Koloniene ble talt ved anvendelse av et Leica StereoZoom 4 disse ksjonsmikroskop.
Utsåingseffektiviteten (PE) ble beregnet som antall kolonier/antall utsådde celler. Den overlevende fraksjon ble beregnet som PE for behandlede celler/PE for ubehandlede celler. IC50-konsentrasjonen ble bestemt ved grafisk fremstilling av den overlevende fraksjon av celler mot molar konsentrasjon av konjugatet. I en klonogenanalyse (figur 23) drepte DS6-DM1 effektivt Caov-3-celler med en beregnet IC50på 800 pM. Antigennegative celler, A375, ble kun svakt påvirket av konjugatet i en konsentrasjon på 3 x IO"<9>M, den høyeste konsentrasjon av DS6-DM1 som ble analysert, noe som viser at konjugatets celledrepende aktivitet er rettet spesifikt mot antigenuttrykkende celler. Trass i tilsynelatende følsomhet overfor maytansin var imidlertid mange av de andre DS6-positive cellelinjene ikke spesielt følsomme overfor immunkonjugatet. Alle cervixcellelinjer (HeLa, KB og WISH) var følsomme overfor konjugatet, mens kun et utvalgt antall av ovarie-og brystcellelinjene viste cytotoksisk virkning. Ingen av bukspyttkjertelcellelinjene så ut til å påvirkes.
I MTT-analysen ble celler utsådd i 96-brønners plater ved en tetthet på 1000-5000 celler/brønn. Cellene ble utsådd med seriefortynninger av enten nakent DS6 eller DS6-DMl-immunkonjugat i 200 ni dyrkningsmedium. Prøvene ble satt opp i triplikat. Cellene og antistoff-/konjugatblandingene ble så inkubert i 2-7 dager, hvoretter cellenes levedyktighet ble anslått ved en MTT([3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium-bromid)]analyse. MTT (50 ng/brønn) ble tilsatt til dyrkningssupernatanten, og blandingen ble inkubert i 3-4 timer ved 37 °C. Mediet ble fjernet, og MTT-formazan ble solubilisert i DMSO (175 nl/brønn). Absorbansen ved 540-545 nm ble målt). I en MTT-cellelevedyktig-hetsanalyse (figur 24C) var immunkonjugatet i stand til effektivt å drepe Caov-3-celler med en beregnet IC50på 1,61 nM. Brønnene med den høyeste konsentrasjon av konjugat inneholdt ingen levedyktige celler, i motsetning til nakent antistoff som ikke hadde noen virkning (figurene 21 og 24).
Resultatene fra MTT-analysene av de andre cellelinjene var noe forskjellige (figurene 24A, B og D-I). I mange tilfeller var konjugatet ute av stand til fullstendig å drepe hele cellepopulasjonen (bortsett fra for WISH-celler), selv om en viss cytotoksisitet ble observert. BT-20-celler, OVCAR5-celler og HPAC-celler var spesielt resistente: i brønnene med den høyeste konsentrasjon av konjugat (32 nM) var over 50 % av cellene fortsatt levedyktige.
Eksempel 16 Antitumoraktivitet av konjugat in vivo
For å vise in wVo-aktiviteten av DS6-DMl-konjugatet ble humane tumorxenotransplantater etablert i SCID-mus. En subkutan modell av den humane cervixkarsinomcellelinjen KB ble utviklet. KB-celler ble dyrket in vitro og oppsamlet, og 5 x IO<6>celler i 100^1 serumfritt medium ble injisert under høyre skulder på hver mus og fikk vokse i 6 dager til et gjennomsnittlig tumorvolum på 144 + 125 mm<3>, hvoretter medikamentbehandlingen ble innledet. Musene ble gitt enten PBS, konjugat ved 150 ng/kg DM1 eller konjugat ved 225 ng/kg DM1 (to mus pr. gruppe) intravenøst hver dag i 5 dager. Toksiske responser ble fulgt daglig under behandlingen. Tumorvolumet (figur 25A) og den tilsvarende kroppsvekt (figur 25B) ble fulgt gjennom undersøkelsen.
KB-tumorene som ble behandlet med PBS-kontroll, vokste hurtig, med en doblingstid på ca. 4 dager. I motsetning til dette viste begge gruppene av mus som ble behandlet med konjugat fullstendig tumorregresjon 14 dager og 18 dager etter innledet behandling for gruppen tilført 225 ng/kg henholdsvis gruppen tilført 150 ng/kg. Ved dosen på 150ng/kg var tumorforsinkelsen ca. 70 dager. Behandling med 225ng/kg førte til kurering, siden det ikke forelå tegn på at tumoren vendte tilbake da undersøkelsen ble avsluttet på dag 120. Som vist i figur 25, viste musene i gruppen tilført 150ng/kg intet vekttap, noe som viser at dosen ble godt tolerert. Ved den høyeste dosen gjennomgikk musene kun en temporær reduksjon av kroppsvekten på 3 %. I løpet av de 5 dagene med behandling viste musene ingen synlige tegn på toksisitet. Sett under ett viser denne undersøkelsen at DS6-DMl-behandling kan kurere mus for KB-xenotransplantattumorer i en ikke-toksisk dose.
Aktiviteten til DS6-DM1 ble videre analysert på et sett av subkutane xenotransplantatmodeller (se figur 26). Tumorcellelinjene som ble anvendt for fremstilling av xenotransplantater, viste et bredt spekter av følsomhet overfor maytansin in vitro og tetthet av CA6-epitopen (tabell 9 nedenfor). OVCAR5-celler og TOV-21G-celler er ovarietumorcellelinjer, HPAC er en bukspyttkjerteltumorcellelinje, og HeLa er en cervixtumorcellelinje. OVCAR5-celler og TOV-21G-celler har lav overflateekspresjon av CA6, HeLa-celler har et middels overflateekspresjonsnivå av CA6, mens HPAC-celler har en høy overflateekspresjonstetthet av CA6. T0V-21G-celler og HPAC-celler er maytansinsensitive, mens 0VCAR5-celler og HeLa-celler er 2-7 ganger mindre maytansinsensitive.
De fire cellelinjene ble dyrket in vitro og oppsamlet, og 1 x IO<7>celler i 100 ni serumfritt medium ble injisert under høyre skulder på hver mus (6 mus pr. modell) og fikk vokse i 6 dager til et gjennomsnittlig tumorvolum på 57,6 + 6,7 og 90,2 + 13,4 mm<3>for analysegruppen henholdsvis kontrollgruppen for OVCAR5, 147,1 + 29,6 og 176,2 + 18,9 mm<3>for analysegruppen henholdsvis kontrollgruppen for HPAC, 194,3 + 37,2 og 201,7 + 71,7 mm<3>for analysegruppen henholdsvis kontrollgruppen for HeLa, og 96,6 + 22,8 og 155,6 ± 13,4 for analysegruppen henholdsvis kontrollgruppen for TOV-21G, hvoretter medikamentbehandlingen ble innledet. For hver modell ble tre kontrollmus behandlet intra-venøst med to ukentlige doser av PBS, mens tre analysemus ble behandlet med to ukentlige doser av konjugat (600 ng/kg DM1). Toksiske responser ble fulgt daglig under behandlingen, og tumorvolum og kroppsvekt ble fulgt gjennom hele undersøkelsen. Virkningen av konjugat for de forskjellige modellene er vist grafisk i figurene 26A, C, E og G, og de tilsvarende kroppsvekter er fremstilt i figurene 26B, D, F og H. Cellelinjene OVCAR5, TOV-21G og HPAC gir aggressive tumorer, noe som kan observeres i PBS-kontrollene for hver modell. HeLa-modellen hadde ca. 3 ukers forsinkelse før den eksponentielle vekst begynte. I alle modellene førte behandling med DS6-DMl-konjugat til fullstendig tumorregresjon i alle mus. For TOV-21G-, HPAC- og HeLa-modellen var musene fortsatt tumorfrie på dag 61. I OVCAR5-modellen vendte tumorene tilbake ca. 45 dager etter inokulasjon av tumoren. Således førte DS6-DMl-behandling i denne modellen til en forsinkelse av tumorveksten på ca. 34 dager. Vekstforsinkelsen er signifikant, siden OVCAR5-celler er lite maytansinsensitive og har lav ekspresjon av CA6-epitopen. I modeller hvor enten CA6-epitoptettheten er høyere eller modellen har høyere sensitivitet overfor maytansin, er tumorregresjonen mer robust. Det er viktig å merke seg at kun to doser ble tilført. Doseringsskjemaet som ble anvendt i denne undersøkelsen, var åpenbart ikke toksisk for musene, siden intet vekttap ble observert. Sannsynligvis ville kurering kunne oppnås med ytterligere konjugatdoser eller høyere doser.
Human ovariekreft er hovedsakelig en bukhinnesykdom. OVCAR5-celler vokser aggressivt som en intraperitoneal (IP) modell i SCID-mus og danner tumorknuter og ascites på tilsvarende måte som ved sykdom hos mennesker. For å vise aktivitet i en IP-modell ble DS6-DM1 anvendt for behandling av mus som bar OVCAR5-IP-tumorer (figur 27). OVCAR5-celler ble dyrket in vitro og høstet, og 1 x IO<7>celler i 100 ni serumfritt medium ble injisert intraperitonealt. Tumorene fikk vokse i 6 dager, hvoretter behandlingen ble innledet. Musene ble behandlet ukentlig i 2 uker med enten PBS eller DS6-DMl-konjugat i en dose på 600 ng/kg DM1 og analysert for vekttap grunnet bukhinnesykdom. På dag 28 hadde PBS-musegruppen mistet mer enn 20 % av kroppsvekten og ble avlivet. Den behandlede gruppen ble avlivet på dag 45, etter et tap av kroppsvekt på mer enn 20 %. Denne under-søkelsen viser at DS6-DM1 kan forsinke tumorveksten i den aggressive OVCAR5-IP-modellen, trass i det faktum at OVCAR5-celler er lite følsomme overfor maytansin og har få CA6-epitoper pr. celle. Siden det benyttede doseringsskjema ikke utløste synlige tegn på toksisitet, er det trolig at flere og høyere doser kan anvendes for å oppnå ytterligere forsinkelse av tumorveksten eller kurering.
Eksempel 17 Syntese og karakterisering av cytotoksisk DS6- SPP- MMl- 202- taxoidkoniuqat
DS6 ble modifisert med N-sulfosuksinimidyl-4-nitro-2-pyridylpentanoat-(SSNPP)linkeren. 50 mg DS6 Ab i 90 % buffer A, 10 % DMA ble tilsatt 10 ekvivalenter SSNPP i DMA. Sluttkonsentrasjonen av antistoff var 8 mg/ml. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 4 timer ved romtemperatur og så renset ved G25-kromatografi. Omfanget av antistoff modifisering ble målt spektrofotometrisk ved anvendelse av absorbansen ved 280 nm (antistoff) og 325 (linker) og ble vist å tilsvare 3,82 linkere/antistoff. Gjenvinningen av antistoff var 43,3 mg, noe som gir et utbytte på 87 %. DS6-nitro-SSP ble konjugert med taxoid MM1-202 (1812P.16). Konjugeringen ble utført i en skala på 42 mg i 90 % buffer A, 10 % DM1. Taxoidet ble tilsatt i fire porsjoner, hver med 0,43 ekv./linker, over et tidsrom på ca. 20 timer. På dette tidspunkt hadde reaksjonsblandingen blitt klart blakket. Etter G25-rensing hadde det resulterende konjugat, gjenvunnet i et utbytte på ca. 64 %, ca. 4,3 taxoidmolekyler/Ab og ca. 1 ekvivalent ikke-reagert linker. For blokkering av ikke-reagert linker ble 1 ekvivalent cyste in/ ikke-reagert linker tilsatt til konjugatet under omrøring over natten. Et åpenbart gulskjær kunne merkes etter tilsetning av cystein, noe som viser fri-gjøring av tiopyridin. Reaksjonsløsningen ble så dialysert mot buffer B/0,01 % Tween 20, fulgt av videre dialyse mot buffer B alene over et tidsrom på flere dager. Det endelige konjugat hadde 2,86 medikamentmolekyler/antistoffmolekyl. Gjenvinningen av antistoff var 14,7 mg, noe som gir et totalutbytte på 35 %. Konjugatet ble videre biokjemiskkarakterisert vedSEC og funnet å ha 89 % monomer, 10,5 % dimer og 0,5 % aggregater med høyere molekylvekt.
Resultatene fra en flowcytometrisk analyse hvor binding av DS6-SPP-MM1-202-taxoid til HeLa-celler ble sammenlignet med binding av DS6-antistoff, er vist i figur 28. Resultatene viser at DS6 bibeholder bindingsaktiviteten etter konjugasjon til et taxan.

Claims (85)

1. Humansiert antistoff eller epitopbindende fragment derav,karakterisert vedat det omfatter minst én tung kjede variabel region eller et fragment derav, og minst én lett kjede variabel region eller et fragment derav, hvor den minst ene tung kjede variable regionen eller fragmentet derav omfatter tre på hverandre følgende komplementaritetsbestemmende regioner med aminosyresekvenser som er representert henholdsvis ved:
og hvor den minst ene lett kjede variable regionen eller fragmentet derav omfatter tre på hverandre følgende komplementaritetsbestemmende regioner med aminosyresekvenser som er representert henholdsvis ved:
hvor antistoffet eller det antigen-bindende fragmentet derav binder til CA6 glykotopen.
2. Humanisert antistoff eller epitop-bindende fragment derav ifølge krav 1, hvor i det minste én tung kjede variabel region eller et fragment derav består av tre sekvensielle komplementaritetsbestemmende regioner som henholdsvis har aminosyresekvensene av aminosyrer 31-35, 50-66 og 99-106 i SEKV ID NR: 11, og hvor nevnte minst en lett kjede variabel region eller et fragment derav består av tre sekvensielle komplementaritets-bestemmende regioner som henholdsvis har aminosyresekvensene av aminosyrer 24-33, 49-55 og 88-96 ifølge SEQ ID NO: 8.
3. Antistoff eller epitopbindende fragment derav ifølge krav 2, hvor den lette kjedens variable region eller fragmentet derav har minst 90 % sekvensidentitet med en aminosyresekvens representert ved SEQ ID NO: 8:
4. Antistoff eller epitopbindende fragment derav ifølge krav 3, hvor den lette kjedens variable region eller fragmentet derav har minst 95 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 8.
5. Antistoff eller epitopbindende fragment derav ifølge krav 3, hvor den lette kjedens variable region eller fragmentet derav har aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 8.
6. Antistoff eller epitopbindende fragment derav ifølge krav 2, hvor den tunge kjedens variable region eller fragmentet derav har minst 90 % sekvensidentitet med SEQ ID NO: 10 eller SEQ ID NO: 11:
7. Antistoff eller epitopbindende fragment derav ifølge krav 6, hvor den tunge kjedens variable region eller fragmentet derav har minst 95 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 10 eller SEQ ID NO: 11.
8. Antistoff eller epitopbindende fragment derav ifølge krav 6, hvor den tunge kjedens variable region eller fragmentet derav har en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 10 eller SEQ ID NO: 11.
9. Antistoff eller epitopbindende fragment derav ifølge krav 1, hvor den lette kjedens variable region omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 8 og den tunge kjedens variable region omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 10 eller SEQ ID NO: 11.
10. Polynukleotid, karakterisert vedat det koder for et antistoff eller et epitopbindende fragment derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1-9.
11. Polynukleotid, karakterisert vedat det koder for en lett kjede variabel region eller en tung kjede variabel region i et antistoff eller et epitopbindende fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 1-9.
12. Vektor, karakterisert vedat den omfatter polynukleotidet ifølge krav 10 eller krav 11.
13. Vektor ifølge krav 12, hvor den er en ekspresjonsvektor som uttrykker antistoffet eller det epitopbindende fragmentet.
14. Antistoff eller epitopbindende fragment derav ifølge krav 1, hvor antistoffet eller det epitopbindende fragment derav er et epitopbindende fragment.
15. Antistoff eller epitopbindende fragment derav ifølge krav 14, hvor det epitopbindende fragment er utvalgt fra gruppen bestående av et Fab-fragment, et Fab'-fragment, et F(ab')2-fragment, et enkelt-kjede Fv(scFv)-fragment, et enkelt-kjede antistoff, og et disulfidbundet Fv(sdFv)-fragment.
16. Cytotoksisk konjugat karakterisert vedat det omfatter antistoffet eller det epitopbindende fragmentet derav ifølge et hvilket som helst av kravene 1-9, 14 eller 15 og et cytotoksisk middel.
17. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 16, hvor antistoffet eller det epitopbindende fragmentet derav og det cytotoksiske midlet er kovalent sammenbundet via en PEG-linkergruppe.
18. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 16, hvor antistoffet eller det epitopbindende fragmentet derav og det cytotoksiske midlet er kovalent sammenbundet via en tiol- eller disulfidgruppe i det cytotoksiske midlet.
19. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 16, hvor det epitopbindende fragmentet er valgt fra gruppen bestående av et Fab-fragment, et Fab'-fragment, et F(ab')2-fragment, et enkelt-kjede Fv(scFv)-fragment, et enkelt-kjede antistoff og et disulfidbundet Fv(sdFv)-fragment.
20. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 16, hvor det cytotoksiske midlet er utvalgt fra gruppen bestående av en maytansinoidforbindelse, en taxoidforbindelse, en CC-1065-forbindelse, en dolastatinforbindelse, en daunorubicinforbindelse og en doksorubicin-forbindelse.
21. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 20, hvor det cytotoksiske midlet er maytansinoid DM1 med formel (I):
22. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 20, hvor det cytotoksiske midlet er maytansinoid DM4 med formel (II):
23. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 20, hvor det cytotoksiske midlet er et maytansinoid med formel (III):
hvor: Y' står for hvor: Ri og R2uavhengig av hverandre er CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor R2i tillegg kan være H; A, B og D er sykloalkyl eller sykloalkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal; R3, R4, R5, R6, R7, Ra, R9,Rio/Rn og Ri2er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal; I, m, n, o, p, q, r, s, t og u er uavhengig av hverandre 0 eller et helt tall på 1-5, forutsatt at minst to av I, m, n, o, p, q, r, s, t og u ikke er 0 samtidig; og Z er H, SR eller -COR, hvor R er uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal.
24. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 23, hvor Ri er metyl, R2er H, og Z er H.
25. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 23, hvor Ri og R2er metyl, og Z er H.
26. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 23, hvor Ri er metyl, R2er H, og Z er -SCH3.
27. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 23, hvor Ri og R2er metyl, og Z er -SCH3.
28. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 20, hvor det cytotoksiske midlet er et maytansinoid med formel (IV-L), (IV-D) eller (IV-D,L):
hvor: Y står for (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ, hvor: Ri og R2uavhengig av hverandre er CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor R2i tillegg kan være H; 1*3/ 1*4/ 1*5/ 1*6/ 1*7 og R8er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal; I, m og n er uavhengig av hverandre et helt tall på 1-5, og hvor n i tillegg kan være 0; Z er H, SR eller -COR, hvor R er uforgrenet eller forgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal; og May står for et maytansinoid som bærer sidekjeden i posisjon C-3, C14-hydroksymetyl, C-15-hydroksy eller C-20-desmetyl.
29. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 28, hvor Ri er metyl; R2er H; R5, R6, R7 og R8er alle H; I og m er begge 1; n er 0; og Z er H.
30. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 28, hvor Ri og R2er metyl; R5, R6, R7og R8er alle H; I og m er 1; n er 0; og Z er H.
31. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 28, hvor Ri er metyl; R2er H; R5, R6, R7 og R8er alle H; I og m er begge 1; n er 0; og Z er -SCH3.
32. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 28, hvor Ri og R2er metyl; R5, R6, R7og R8er alle H; I og m er 1; n er 0; og Z er -SCH3.
33. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 28, hvor det cytotoksiske midlet er representert ved formel (IV-L).
34. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 20, hvor det cytotoksiske midlet er et maytansinoid med formel (V):
hvor: Y står for (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ, hvor: Ri og R2uavhengig av hverandre er CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor R2i tillegg kan være H; R3, R4, R5, R6, R7og R8er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal; I, m og n er uavhengig av hverandre et helt tall på 1-5, og hvor n i tillegg kan være 0; og Z er H, SR eller -COR, hvor R er uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal.
35. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 34, hvor Ri er metyl; R2er H; R5, R6, R7 og R8er alle H; I og m er begge 1; n er 0; og Z er H.
36. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 34, hvor Ri og R2er metyl; R5, R6, R7og R8er alle H; I og m er 1; n er 0; og Z is H.
37. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 34, hvor Ri er metyl; R2er H; R5, R6, R7 og R8er alle H; I og m er begge 1; n er 0; og Z er -SCH3.
38. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 34, hvor Ri og R2er metyl; R5, R6, R7og R8er alle H; I og m er 1; n er 0; og Z er -SCH3.
39. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 20, hvor det cytotoksiske midlet er et maytansinoid valgt fra gruppen bestående av formel (VI-L), (VI-D) eller (VI-D,L):
hvor: Y2står for (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ2, hvor: Ri og R2uavhengig av hverandre er CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor R2i tillegg kan være H; R3, R», R5, R6, R7og R8er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet, syklisk alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal; I, m og n er uavhengig av hverandre et helt tall på 1-5, og hvor n i tillegg kan være 0; Z2er SR eller COR, hvor R er uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal; og May er et maytansinoid.
40. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 20, hvor det cytotoksiske midlet er et maytansinoid med formel (VII):
hvor: Y2' står for
hvor: Ri og R2uavhengig av hverandre er CH3, C2H5, uforgrenet eller forgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor R2i tillegg kan være H; A, B og D er uavhengig av hverandre sykloalkyl eller sykloalkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal; R3, R4, R5, R6, R7, Ra, R9, Rio/ Rn og Ri2er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal; I, m, n, o, p, q, r, s, t og u er uavhengig av hverandre 0 eller et helt tall på 1-5, forutsatt at minst to av I, m, n, o, p, q, r, s, t og u ikke er 0 samtidig; og Z2er SR eller -COR, hvor R er uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal.
41. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 40, hvor Ri er metyl, og R2er H.
42. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 20, hvor det cytotoksiske midlet er et maytansinoid med formel (VIII):
hvor: Yi' står for
hvor: A, B og D uavhengig av hverandre er sykloalkyl eller sykloalkenyl med 3-10 karbonatomer, ikke-substituert eller substituert aryl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal; R3/ R4/ R5/1*6/ 1*7/ 1*8/1*9/1*10/1*11 og 1*12 er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal; og I, m, n, o, p, q, r, s, t og u er uavhengig av hverandre 0 eller et helt tall på 1-5, forutsatt at minst to av I, m, n, o, p, q, r, s, t og u ikke er 0 samtidig.
43. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 42, hvor Ri er metyl, og R2er H.
44. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 42, hvor Ri og R2er metyl.
45. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 22, hvor det cytotoksiske midlet er et maytansinoid med formel (IX-L), (IX-D) eller (IX-D,L):
hvor: Yi står for (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2S-, hvor: Ri og R2uavhengig av hverandre er CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor R2i tillegg kan være H; R3/1*4/ 1*5/ 1*6/1*7 og R8er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal; I, m og n er uavhengig av hverandre et helt tall på 1-5, og hvor n i tillegg kan være 0; og May står for en maytansinol som bærer sidekjeden i posisjon C-3, C-14-hydroksymetyl, C-15-hydroksy eller C-20-desmetyl.
46. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 45, hvor Ri er metyl; og R2er H; eller Ri og R2er metyl.
47. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 45, hvor Ri er metyl; R2er H; R5, R6, R7 og R8er alle H; I og m er 1; og n er 0.
48. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 45, hvor Ri og R2er metyl; R5, R6, R7og R8er alle H; I og m er 1; og n er 0.
49. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 46, hvor maytansinoidet er representert ved formel (IX-L).
50. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 47, hvor maytansinoidet er representert ved formel (IX-L).
51. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 48, hvor maytansinoidet er representert ved formel (IX-L). ■^9 rvtntnkcick knniiinat- ifctlne kra\/9f1 h\/nr Het rvtntnkcicke miHlet er et maytansinoid med formel (X):
hvor: Yi står for (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2S-, hvor: Ri og R2uavhengig av hverandre er CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal, og hvor R2i tillegg kan være H; R3, R4, R5, R6, R7og R8er uavhengig av hverandre H, CH3, C2H5, uforgrenet alkyl eller alkenyl med 1-10 karbonatomer, forgrenet eller syklisk alkyl eller alkenyl med 3-10 karbonatomer, fenyl, substituert fenyl eller et heterosyklisk aromatisk- eller heterosyklisk-radikal; I, m og n er uavhengig av hverandre et helt tall på 1-5, og hvor n i tillegg kan være 0; og May står for en maytansinol som bærer sidekjeden i posisjon C-3, C-14-hydroksymetyl, C-15-hydroksy eller C-20-desmetyl.
53. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 52, hvor Ri er metyl; R2er H; R5, R6, R7 og R8er alle H; I og m er 1; og n er 0.
54. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 52, hvor Ri og R2er metyl; R5, R6, R7og R8er alle H; I og m er 1; og n er 0.
55. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 20, hvor maytansinoidet er DM1 eller DM4.
56. Cytotoksiske konjugat ifølge krav 55, hvor antistoffet eller det epitop-bindende fragmentet derav, og nevnte DM1 eller DM4 er kovalent bundet via en N-succinimidyl-4-(2-pyridylditio)-butanoat(SPDB)-linker.
57. Cytotoksiske konjugat ifølge krav 16, hvor antistoffet eller det epitop-bindende fragmentet derav omfatter en lett kjede variabel region omfattende aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 8 og en tung kjede variabel regionen omfatter aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 10 eller SEQ ID NO: 11, og hvor nevnte cytotoksiske middel er et maytansinoid.
58. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 57, hvor maytansinoidet er DM1 eller DM4.
59. Cytotoksiske konjugat ifølge krav 58, hvor antistoffet eller det epitop-bindende fragmentet derav, og nevnte maytansinoid er kovalent bundet via en N-succinimidyl-4-(2-pyridylditio)-butanoat(SPDB)-linker.
60. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 55, hvor 1-10 maytansinoid DM4-molekylene er bundet til antistoffet eller det epitop-bindende fragmentet derav.
61. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 56, 58 eller 59, hvor 1-10 maytansinoid DM-molekylene er bundet til antistoffet eller det epitop-bindende fragmentet derav.
62. Cytotoksisk konjugat ifølge krav 20, hvor det cytotoksiske midlet er taxanet med formel (XI):
63. In vitro fremgangsmåte for inhibering av veksten av en celle som uttrykker CA6-glykotopen, hvor den omfatter å sette en celle som uttrykker CA6-glykotopen i forbindelse med det cytotoksiske konjugat ifølge krav 16.
64. In vitro fremgangsmåte for inhibering av veksten av en celle som uttrykker CA6-glykotopen ifølge krav 63, hvor det cytotoksiske midlet er DM1 eller DM4.
65. In vitro fremgangsmåte for inhibering av veksten av en celle som uttrykker CA6-glykotopen ifølge krav 63, hvor det cytotoksiske midlet er et taxan.
66. Terapeutisk sammensetning, karakterisert vedat det omfatter et cytotoksisk konjugat ifølge krav 16 og et farmasøytisk akseptabelt bærestoff eller en eksipiens.
67. Terapeutisk sammensetning ifølge krav 66, hvor det cytotoksiske midlet er DM1 eller DM4.
68. Terapeutisk sammensetning ifølge krav 66, hvor det cytotoksiske midlet et taxan.
69. Anvendelse av et cytotoksisk konjugat ifølge krav 16 i fremstillingen av et medikament for behandling av CA6-uttrykken de kreft.
70. Anvendelse ifølge krav 69, hvor det cytotoksiske midlet er DM1 eller DM4.
71. Anvendelse ifølge krav 69, hvor det cytotoksiske midlet et taxan.
72. Anvendelse ifølge krav 69, hvor kreftformen er valgt fra gruppen bestående av serøst ovariekarsinom, endometrioid ovariekarsinom, neoplasmer i cervix uteri, neoplasmer i endometriet, neoplasmer i vulva, brystkarsinom, bukspyttkjerteltumor og tumor i urotelet.
73. Sett, karakterisert vedat det omfatter et cytotoksisk konjugat ifølge krav 16, og videre omfatter: a) en avdeling som inneholder det cytotoksiske konjugat; og b) instruksjoner for anvendelse av settet.
74. Sett ifølge krav 73, hvor det cytotoksiske midlet er DM1 eller DM4.
75. Sett ifølge krav 73, hvor det cytotoksiske midlet et taxan.
76. Sett ifølge krav 73 hvor instruksjonene omfatter instruksjoner for behandling av et individ med CA6-uttrykkende kreft.
77. Sett ifølge krav 73, hvor kreftformen er valgt fra gruppen bestående av serøst ovariekarsinom, endometrioid ovariekarsinom, neoplasmer i cervix uteri, neoplasmer i endometriet, neoplasmer i vulva, brystkarsinom, bukspyttkjerteltumor og tumor i urotelet.
78. Sett, karakterisert vedat det omfatter et terapeutisk sammensetning ifølge krav 66 og videre omfatter: a) en avdeling som inneholder den terapeutiske sammensetnngen; og b) instruksjoner for anvendelse av settet.
79. Sett ifølge krav 78, hvor det cytotoksiske midlet er DM1 eller DM4.
80. Sett ifølge krav 78, hvor det cytotoksiske midlet er et taxan.
81. Sett ifølge krav 78, hvor instruksjonene omfatter instruksjoner for behandling av et individ med CA6-uttrykkende kreft.
82. Sett ifølge krav 78, hvor kreftformen er valgt fra gruppen bestående av serøst ovariekarsinom, endometrioid ovariekarsinom, neoplasmer i cervix uteri, neoplasmer i endometriet, neoplasmer i vulva, brystkarsinom, bukspyttkjerteltumor og tumor i urotelet.
83. En fremgangsmåte for å detektere CA6 glycotop omfattende: (a) kontakte en in vitro eller ex vivo prøve med antistoffet eller det epitop-bindende fragmentet derav ifølge ethvert av kravene 1-9; og (b) påvise bindingen av antistoffet eller det epitopen-bindende fragment et derav til CA6 glycotop i nevnte prøve.
84. Fremgangsmåte ifølge krav 83, hvor nevnte binding indikerer nærvær av kreft i prøven.
85. Fremgangsmåte ifølge krav 83, hvor nevnte metode er anvendt for å diagnostisere en CA6-uttrykkende kreft
NO20060812A 2003-07-21 2006-02-20 Humansiert antistoff eller epitopbindende fragment derav som binder CA6 glykotopen; polynucleotid og ekspresjons vektor som koder for antistoffet eller fragmentene; cytotoksisk konjugat derav; anvendelse av konjugatet til fremstillingen av et medikament; sett derav; en in vitro fremgangsmåte for inhibering av veksten av en celle som uttrykker CA6-glykotopen og en fremgangsmåte for å detektere CA6 glykotopen. NO339324B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48844703P 2003-07-21 2003-07-21
PCT/US2004/023340 WO2005009369A2 (en) 2003-07-21 2004-07-21 A ca6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20060812L NO20060812L (no) 2006-04-20
NO339324B1 true NO339324B1 (no) 2016-11-28

Family

ID=34102763

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20060812A NO339324B1 (no) 2003-07-21 2006-02-20 Humansiert antistoff eller epitopbindende fragment derav som binder CA6 glykotopen; polynucleotid og ekspresjons vektor som koder for antistoffet eller fragmentene; cytotoksisk konjugat derav; anvendelse av konjugatet til fremstillingen av et medikament; sett derav; en in vitro fremgangsmåte for inhibering av veksten av en celle som uttrykker CA6-glykotopen og en fremgangsmåte for å detektere CA6 glykotopen.

Country Status (27)

Country Link
US (1) US20050123549A1 (no)
EP (1) EP1660513B9 (no)
JP (5) JP2007503202A (no)
KR (5) KR101263950B1 (no)
CN (3) CN103554261B (no)
AT (1) ATE496944T1 (no)
AU (1) AU2004258955C1 (no)
BR (1) BRPI0412879A8 (no)
CA (1) CA2532430C (no)
CR (1) CR8207A (no)
CY (1) CY1111938T1 (no)
DE (1) DE602004031239D1 (no)
DK (1) DK1660513T5 (no)
EA (1) EA014640B1 (no)
EC (1) ECSP066294A (no)
ES (1) ES2360403T3 (no)
HK (2) HK1185891A1 (no)
HR (1) HRP20110302T1 (no)
IL (2) IL172982A (no)
MX (2) MXPA06000830A (no)
NO (1) NO339324B1 (no)
NZ (3) NZ598504A (no)
PL (1) PL1660513T3 (no)
PT (1) PT1660513E (no)
SI (1) SI1660513T1 (no)
WO (1) WO2005009369A2 (no)
ZA (1) ZA200600375B (no)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
US9539348B2 (en) 2000-08-18 2017-01-10 East Carolina University Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof
US6596503B1 (en) 2000-08-18 2003-07-22 East Carolina University Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
DK1651162T3 (en) * 2003-05-20 2016-02-01 Immunogen Inc IMPROVED CYTOTOXIC AGENTS WITH NEW MAYTANSINOIDS
US7834155B2 (en) 2003-07-21 2010-11-16 Immunogen Inc. CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same
CA2486285C (en) * 2004-08-30 2017-03-07 Viktor S. Goldmakher Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
EA020130B9 (ru) * 2005-08-22 2014-10-30 Иммьюноджен, Инк. Специфичное к антигену са6 антитело, содержащий его цитотоксический конъюгат и способы применения конъюгата
CN104804094A (zh) * 2005-08-22 2015-07-29 伊缪诺金公司 Ca6抗原特异性细胞毒性偶联物及其应用方法
PL2019104T3 (pl) 2007-07-19 2014-03-31 Sanofi Sa Środki cytotoksyczne obejmujące nowe pochodne tomaymycyny i ich zastosowanie terapeutyczne
PT2242772E (pt) * 2007-12-26 2015-02-09 Biotest Ag Imunoconjugados dirigidos contra cd138 e as suas utilizações
EP2238169A1 (en) * 2007-12-26 2010-10-13 Biotest AG Method of decreasing cytotoxic side-effects and improving efficacy of immunoconjugates
MX2010007101A (es) * 2007-12-26 2011-07-01 Biotest Ag Metodos y agentes para mejorar el reconocimiento de celulas de tumor que expresan cd138.
DK2238168T3 (da) * 2007-12-26 2014-08-25 Biotest Ag Midler, der er målrettet mod cd138 og anvendelser deraf
LT2281006T (lt) * 2008-04-30 2017-11-27 Immunogen, Inc. Skersinių jungčių linkeriai ir jų panaudojimas
RU2561041C2 (ru) * 2009-05-06 2015-08-20 Биотест Аг Применения иммуноконъюгатов, мишенью которых является cd138
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
FR2949469A1 (fr) 2009-08-25 2011-03-04 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application en therapeutique
TW201117814A (en) 2009-10-02 2011-06-01 Sanofi Aventis New maytansinoids and the use of said maytansinoids to prepare conjugates with an antibody
WO2011100403A1 (en) 2010-02-10 2011-08-18 Immunogen, Inc Cd20 antibodies and uses thereof
FR2963007B1 (fr) 2010-07-26 2013-04-05 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application therapeutique
AU2012205301B2 (en) * 2011-01-14 2017-01-05 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged immunoglobulin polypeptides and method of use thereof
WO2012143499A2 (de) 2011-04-21 2012-10-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Neue binder-wirkstoff konjugate (adcs) und ihre verwendung
US9201074B2 (en) * 2011-09-20 2015-12-01 Eli Lilly And Company Anti-c-Met antibodies
ES2684950T3 (es) 2011-12-08 2018-10-05 Biotest Ag Usos de inmunoconjugados dirigidos a CD138
JP2012161321A (ja) * 2012-03-30 2012-08-30 Immunogen Inc Ｃａ６抗原特異的細胞傷害性コンジュゲート、および該コンジュゲートを用いる方法
US9353150B2 (en) 2012-12-04 2016-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment
WO2014122529A1 (en) 2013-02-05 2014-08-14 Sanofi Immuno imaging agent for use with antibody-drug conjugate therapy
JP2016515093A (ja) * 2013-02-05 2016-05-26 サノフイ 抗体−薬物コンジュゲート療法とともに使用するための免疫イメージング剤
US9989524B2 (en) 2013-02-05 2018-06-05 Sanofi Immuno imaging agent for use with antibody-drug conjugate therapy
CN111537426A (zh) 2013-03-15 2020-08-14 贝克曼考尔特公司 用于设计流式细胞术中的面板的系统和方法
EP3027218A1 (en) * 2013-08-02 2016-06-08 Sanofi Use of anti-muc1 maytansinoid immunoconjugate antibody for the treatment of solid tumors
WO2015096982A1 (de) 2013-12-23 2015-07-02 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-konjugate (adcs) mit ksp-inhibitoren
WO2015138615A2 (en) * 2014-03-12 2015-09-17 Irm Llc Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
CA2958882A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Immunogen, Inc. Methods for formulating antibody drug conjugate compositions
EP3189057A1 (en) 2014-09-03 2017-07-12 ImmunoGen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
CA2959630A1 (en) 2014-09-03 2016-03-10 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
CN108025084B (zh) 2015-06-22 2024-08-09 拜耳医药股份有限公司 具有酶可裂解基团的抗体药物缀合物（adc）和抗体前药缀合物（apdc）
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
EP4335851A3 (en) 2015-11-25 2024-06-05 ImmunoGen, Inc. Pharmaceutical formulations and methods of use thereof
MX2018011627A (es) 2016-03-24 2019-01-10 Bayer Pharma AG Profarmacos de farmacos citotoxicos que tienen grupos enzimaticamente escindibles.
WO2017197045A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Movassaghi Mohammad Convergent and enantioselective total synthesis of communesin analogs
EP3471776B1 (en) 2016-06-15 2022-05-04 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
CA3047522A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors
WO2018114798A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs von cytotoxischen wirkstoffen mit enzymatisch spaltbaren gruppen
EP3558388A1 (de) 2016-12-21 2019-10-30 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
RU2765098C2 (ru) 2017-02-28 2022-01-25 Иммуноджен, Инк. Производные майтанзиноида с саморасщепляющимися пептидными линкерами и их конъюгаты
WO2018195243A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives and conjugates thereof
WO2018209239A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
TWI827575B (zh) 2017-12-28 2024-01-01 美商伊繆諾金公司 苯二氮平衍生物
MX2021011320A (es) 2019-03-19 2021-12-10 Fundacio Privada Inst Dinvestigacio Oncològica De Vall Hebron Terapia de combinacion con omomyc y un anticuerpo que se une a pd-1 o a ctla-4 para el tratamiento del cancer.
US11535634B2 (en) 2019-06-05 2022-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
US12030888B2 (en) 2021-02-24 2024-07-09 Massachusetts Institute Of Technology Himastatin derivatives, and processes of preparation thereof, and uses thereof
WO2023150677A2 (en) * 2022-02-03 2023-08-10 Igm Biosciences, Inc. Anti-cd38 binding molecules and uses thereof
WO2024089013A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Peptomyc, S.L. Combination therapy for the treatment of cancer

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5776456A (en) * 1992-11-13 1998-07-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
WO2002016401A2 (en) * 2000-08-18 2002-02-28 East Carolina University Monoclonal antibody ds6, tumor-associated antigen ca6, and methods of use thereof

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5208020A (en) * 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) * 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DE69229477T2 (de) * 1991-09-23 1999-12-09 Cambridge Antibody Technology Ltd., Melbourn Methoden zur Herstellung humanisierter Antikörper
US5639641A (en) * 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US20030143233A1 (en) * 1999-06-07 2003-07-31 Neorx Corporation Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof
WO2001038318A1 (en) * 1999-11-24 2001-05-31 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
US6333410B1 (en) * 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
EP1258255A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
US6441163B1 (en) * 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
DE60232742D1 (de) * 2001-10-04 2009-08-06 Immunex Corp Ul16-bindungsprotein 4
AU2002363939A1 (en) * 2001-11-20 2003-06-10 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
US6716821B2 (en) * 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
CA2471431A1 (en) * 2002-01-02 2003-07-17 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
CN1816356A (zh) 2003-05-14 2006-08-09 免疫原公司 药物缀合物组合物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5776456A (en) * 1992-11-13 1998-07-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
WO2002016401A2 (en) * 2000-08-18 2002-02-28 East Carolina University Monoclonal antibody ds6, tumor-associated antigen ca6, and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
PT1660513E (pt) 2011-05-03
CR8207A (es) 2008-11-12
NZ580855A (en) 2012-03-30
ZA200600375B (en) 2006-12-27
KR20140047739A (ko) 2014-04-22
CN1922199B (zh) 2013-10-30
AU2004258955B2 (en) 2011-12-01
WO2005009369A2 (en) 2005-02-03
ECSP066294A (es) 2006-07-28
IL242336A (en) 2017-08-31
HK1185891A1 (zh) 2014-02-28
PL1660513T3 (pl) 2011-08-31
KR101263950B1 (ko) 2013-05-31
IL172982A (en) 2015-11-30
JP6144749B2 (ja) 2017-06-07
EP1660513A4 (en) 2007-07-04
NO20060812L (no) 2006-04-20
JP5643619B2 (ja) 2014-12-17
JP5997727B2 (ja) 2016-09-28
NZ612796A (en) 2015-02-27
MX336469B (es) 2016-01-18
JP2016128405A (ja) 2016-07-14
KR101565721B1 (ko) 2015-11-03
JP2011092194A (ja) 2011-05-12
WO2005009369A3 (en) 2005-06-30
JP2017123857A (ja) 2017-07-20
NZ598504A (en) 2013-08-30
BRPI0412879A (pt) 2006-10-03
KR20120059657A (ko) 2012-06-08
DE602004031239D1 (de) 2011-03-10
CA2532430A1 (en) 2005-02-03
ATE496944T1 (de) 2011-02-15
AU2004258955A1 (en) 2005-02-03
ES2360403T3 (es) 2011-06-03
CY1111938T1 (el) 2015-11-04
EA014640B1 (ru) 2010-12-30
DK1660513T5 (da) 2011-07-18
CN1922199A (zh) 2007-02-28
HRP20110302T1 (hr) 2011-06-30
DK1660513T3 (da) 2011-05-16
MXPA06000830A (es) 2006-04-18
CN103145844B (zh) 2016-08-03
IL172982A0 (en) 2006-06-11
EA200600275A1 (ru) 2006-08-25
CN103145844A (zh) 2013-06-12
BRPI0412879A8 (pt) 2015-12-15
JP2007503202A (ja) 2007-02-22
CN103554261B (zh) 2017-03-01
KR20150126732A (ko) 2015-11-12
SI1660513T1 (sl) 2011-06-30
CA2532430C (en) 2016-12-13
JP2015012861A (ja) 2015-01-22
CN103554261A (zh) 2014-02-05
KR101672664B1 (ko) 2016-11-04
EP1660513B9 (en) 2012-04-04
KR20060054331A (ko) 2006-05-22
EP1660513A2 (en) 2006-05-31
US20050123549A1 (en) 2005-06-09
AU2004258955C1 (en) 2012-07-26
EP1660513B1 (en) 2011-01-26
KR20120113811A (ko) 2012-10-15
HK1098160A1 (en) 2007-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6144749B2 (ja) Ｃａ６抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法
US9822183B2 (en) CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same
WO2007024222A1 (en) A ca6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same
AU2012201260B2 (en) A CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same
PAYNE et al. Patent 2615761 Summary
KR20080039917A (ko) Ｃａ6 항원-특이적인 세포독성 컨쥬게이트 및 이를사용하는 방법
JP2012161321A (ja) Ｃａ６抗原特異的細胞傷害性コンジュゲート、および該コンジュゲートを用いる方法

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: IMMUNOGEN, US

CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: IMMUNOGEN, US

MM1K Lapsed by not paying the annual fees