JP2015518736A - 組換え微生物およびその使用 - Google Patents

Abstract

カルボキシド栄養性（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）酢酸産生性微生物は、ＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生しない。それらは、これらの産物を作製する生合成経路を欠く。加えて、それらは、中間体（Ｒ，Ｒ）−２，３−ブタンジオールを産生するが、ＭＥＫおよび２−ブタノールの産生には、中間体（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールの産生が必要とされる。それにもかかわらず、ＭＥＫおよび／または２−ブタノールの産生は、ＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において重要な酵素を発現または過剰発現するように適合された組換え微生物を用いて達成することができる。そのような微生物、例えば、カルボキシド栄養性酢酸産生菌クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）は、ＣＯを含む基質を発酵させることができる。全体のスキームは、（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールからの２−ブタノールの産生、および（Ｒ）−アセトインの（Ｓ）−２，３−ブタンジオールへの変換を伴う。これらのステップは、ＭＥＫと２−ブタノールの両方の産生に関与する。そのような発酵方法は、さもなければ大気中に放出され、環境を汚染するであろう工業プロセスからの一酸化炭素を使用する手段を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、組換え微生物、およびＣＯを含む基質の微生物発酵によりＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生するための方法に関する。

２−ブタノールは、主に工業用溶剤であるメチルエチルケトン（ＭＥＫまたはブタノン）の前駆体として大規模に生産される有機化合物である。典型的には、硫酸触媒を使用して、水和により石油化学品（ブテン）から生産される。

ＭＥＫは、ペンキおよびインクの重要な成分であり、２０億米ドルの世界市場を有し、これは毎年１．９％の割合で増加している。その合成における中間体として、２−ブタノールの需要はブタノンの需要と密接に関連している。重要なことに、２−ブタノールは、合成ゴム、樹脂、および接着剤に使用される１，３−ブタジエンにも変換することができる。１，３−ブタジエンの世界市場は１９億米ドルを超え、毎年２．７％の割合で増加している。エタノールよりもエネルギー密度が高い２−ブタノールは、燃料ならびにブタジエン生産の前駆体としての用途の可能性も有する。

組換え微生物、および既知の方法に対して１つ以上の利点を提供する、または少なくとも有用な選択肢を公共に提供することができる、微生物発酵によりＭＥＫおよび／または２−ブタノールを生産するための方法を提供することが本発明の目的である。

本発明は、概して、とりわけ、ＣＯおよび／またはＣＯ_２を含む基質の微生物発酵によりＭＥＫおよび／または２−ブタノールを生産するための方法、およびそのような方法において使用する組換え微生物を提供する。

第１の態様では、本発明は、ＣＯを含む基質の発酵により、ＭＥＫおよび／または２−ブタノール、ならびに任意に１つ以上の他の産物を産生することができるカルボキシド栄養性酢酸産生性組換え微生物を提供する。

特定の一実施形態では、微生物は、組換え微生物が由来する親微生物に存在しないＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において１つ以上の酵素（または１つ以上のそのサブユニット）を発現するように適合される。

別の実施形態では、微生物は、組換え微生物が由来する親微生物に存在するＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において、１つ以上の酵素（または１つ以上のそのサブユニット）を過剰発現するように適合される。

一実施形態では、微生物は、親微生物に存在しないＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において１つ以上の酵素（または１つ以上のそのサブユニット）を発現し、かつ親微生物に存在するＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において１つ以上の酵素（または１つ以上のそのサブユニット）を過剰発現するように適合される。

一実施形態では、微生物は、次の：
（Ｒ）−アセトインの（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素、
（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換を触媒する酵素、
ＭＥＫの２−ブタノールへの変換を触媒する酵素、のうちの１つ以上を発現するように適合される。

一実施形態では、微生物は、親微生物に存在する１つ以上の酵素の活性を減少または実質的に排除するように適合される。一実施形態では、１つ以上の酵素は、ＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路の一部である。

一実施形態では、微生物は、ＣＯを含む基質の発酵により２−ブタノールを産生することができ、２−ブタノール生合成経路において、
（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、
ジオール／グリセロールデヒドラターゼ、
アルコールデヒドロゲナーゼ、および
それらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体から選択される１つ以上の酵素を発現または過剰発現することができるように適合される。

一実施形態では、親微生物は、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼおよびジオール／グリセロールデヒドラターゼ、またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体を欠き、組換え微生物は、これらの酵素の両方を発現するように適合される。

一実施形態では、親微生物は、（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼまたはその機能的に等価な変異体を含み、組換え微生物は、この酵素の活性を減少または実質的に排除するように適合される。

一実施形態では、微生物は、ＣＯを含む基質の発酵によりＭＥＫの産生を可能にし、ＭＥＫ生合成経路において、
（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、
ジオール／グリセロールデヒドラターゼ、および
それらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体から選択される１つ以上の酵素を発現または過剰発現するように適合される。

一実施形態では、親微生物は、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼおよびジオール／グリセロールデヒドラターゼ、またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体を欠き、組換え微生物は、これらの酵素両方を発現するように適合される。

一実施形態では、親微生物は、アルコールデヒドロゲナーゼまたはその機能的に等価な変異体を含み、組換え微生物は、この酵素の活性を減少または実質的に排除するように適合される。

一実施形態では、親微生物は、（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼまたはその機能的に等価な変異体を含み、組換え微生物は、この酵素の活性を減少または実質的に排除するように適合される。

一実施形態では、微生物は、親微生物に存在する１つ以上の核酸の発現を増加するように適合された１つ以上の外因性核酸を含み、１つ以上の核酸は、本明細書で前に言及した酵素のうちの１つ以上（またはその１つ以上のサブユニット）をコードする。一実施形態では、発現を増加するように適合された１つ以上の外因性核酸は、調節要素である。一実施形態では、調節要素は、プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、構成プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスターまたはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを含む群から選択される。

一実施形態では、微生物は、親微生物に存在しない、本明細書で前に言及した酵素のうちの１つ以上（またはその１つ以上のサブユニット）を発現するように適合される。一実施形態では、微生物は、酵素のうちの少なくとも２つまたは３つ（またはその１つ以上のサブユニット）をコードし、それらを発現するように適合された１つ以上の外因性核酸を含む。

一実施形態では、１つ以上の外因性核酸は、核酸構築物またはベクターであり、特定の一実施形態では、任意の組み合わせで、本明細書で前に言及した酵素のうちの１つ以上をコードするプラスミドである。一実施形態では、外因性核酸は、発現プラスミドである。

一実施形態では、微生物は、親微生物に存在する１つ以上の核酸の発現を増加するように適合された１つ以上の外因性核酸、および親微生物に存在しない１つ以上の酵素を発現するように適合された１つ以上の外因性核酸を含む。別の実施形態では、微生物は、親微生物に存在する酵素の活性を減少または実質的に排除するように適合される１つ以上の核酸を含む。

特定の一実施形態では、親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ）、クロストリジウム・カルボキシディボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・ドラケイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ）、クロストリジウム・スカトロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・アセティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・フォルミコアセチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・マグナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、アセトバクテリウム・ウッディ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ）、アルカリバクラム・バッチィ（Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ）、ユーバクテリウム・リモサム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ）、モーレラ・サーモアセティカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、ムーレラ・サーマウトトロフィカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、スポロミューサー・オヴァタ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ）、スポロミューサー・シルバセティカ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ）、スポロミューサー・スファエロイデス（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、オキソバクター・フェニギイ（Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ）、およびサーモアナエロバクター・キウヴィ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉ）を含むカルボキシド栄養性酢酸産生性細菌の群から選択される。

一実施形態では、親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・リュングダリイである。特定の一実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３である。別の特定の実施形態では、微生物は、クロストリジウム・リュングダリイＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。

一実施形態では、親微生物は、次の：
（Ｒ）−アセトインの（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素、
（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換を触媒する酵素、および
ＭＥＫの２−ブタノールへの変換を触媒する酵素のうちの１つ以上の活性を欠く。

一実施形態では、親微生物は、次の：
（Ｒ）−アセトインの（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素、
（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換を触媒する酵素、
ＭＥＫの２−ブタノールへの変換を触媒する酵素のうちの１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子を欠く。

一実施形態では、親微生物は、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ、ならびに／またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体をコードする１つ以上の遺伝子を欠く。

一実施形態では、親微生物は、（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および／またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体をコードする１つ以上の遺伝子を含む。

一実施形態では、親微生物は、（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体をコードするコードする１つ以上の遺伝子を含み、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ、および／またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体をコードする１つ以上の遺伝子を欠く。

第２の態様では、本発明は、微生物において発現される場合、ＣＯを含む基質の発酵により、微生物にＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生させる１つ以上の酵素（またはその１つ以上のサブユニット）をコードする核酸を提供する。

一実施形態では、核酸は、微生物において発現される場合、ＣＯを含む基質の発酵により、微生物にＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生させる２つ以上の酵素（またはそれらの１つ以上のサブユニット）をコードする。

一実施形態では、核酸は、
（Ｒ）−アセトインの（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素、
（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換を触媒する酵素、および
ＭＥＫの２−ブタノールへの変換を触媒する酵素からなる群から選択される１つ以上の酵素をコードする。

一実施形態では、酵素は、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および／またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体から選択される。

一実施形態では、核酸は、任意の順序で、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ、および／またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体をコードする核酸配列を含む。

一実施形態では、本発明の核酸は、プロモーターをさらに含む。一実施形態では、プロモーターは、その制御下の遺伝子の構成的発現を可能にする。特定の実施形態では、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌクラスタープロモーターが使用される。別の特定の実施形態では、ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターが使用される。特定の一実施形態では、プロモーターは、Ｃ・オートエタノゲナムからである。

別の態様では、本発明は、親微生物において、（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および／またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体の発現を減少するか、または排除するように適合された核酸を提供する。

別の態様では、本発明は、親微生物において存在する場合、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および／またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体のうちの１つ以上の発現を増加するように適合された核酸を提供する。

第３の態様では、本発明は、第２の態様の１つ以上の核酸を含む核酸構築物またはベクターを提供する。

特定の一実施形態では、核酸構築物またはベクターは、発現構築物またはベクターである。特定の一実施形態では、発現構築物またはベクターは、プラスミドである。

第４の態様では、本発明は、第２の態様の核酸、または第３の態様のベクターもしくは構築物のうちの任意の１つ以上を含む宿主生物を提供する。

第５の態様では、本発明は、本発明の第３の態様に言及される発現構築物もしくはベクター、およびメチル化構築物もしくはベクターを含む組成物を提供する。

好ましくは、組成物は、本発明の第１の態様による組換え微生物を産生することができる。

特定の一実施形態では、発現構築物／ベクターおよび／またはメチル化構築物／ベクターは、プラスミドである。

第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の組換え微生物を使用して、ＣＯを含む基質を発酵させることを含む微生物発酵により、ＭＥＫおよび／または２−ブタノール、ならびに任意に１つ以上の他の産物を産生するための方法を提供する。

一実施形態では、本方法は、
（ａ）本発明の第１の態様の１つ以上の微生物の培養物を収容するバイオリアクターに、ＣＯを含む基質を提供するステップと、
（ｂ）バイオリアクター内の培養物を嫌気的に発酵させて、少なくともＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生するステップと、を含む。

一実施形態では、本方法は、
ａ．ガスが大気中に放出される前に、産業プロセスの結果として産生されたＣＯ含有ガスを捕捉するステップと、
ｂ．本発明の第１の態様の１つ以上の微生物を含有する培養物によって、ＣＯ含有ガスを嫌気的に発酵させて、少なくともＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生するステップと、を含む。

本方法の態様の特定の実施形態では、微生物は、水性培養培地中に維持される。

本方法の態様の特定の実施形態では、基質の発酵は、バイオリアクターで行われる。

好ましくは、ＣＯを含む基質は、ＣＯを含むガス状基質である。一実施形態では、基質は工業廃棄ガスを含む。ある特定の実施形態では、ガスは、製鋼所の廃棄ガスまたは合成ガスである。

一実施形態では、基質は、典型的には、大部分のＣＯ、例えば、少なくとも約２０容量％〜約１００容量％ＣＯ、２０容量％〜７０容量％ＣＯ、３０容量％〜６０容量％ＣＯ、４０容量％〜５５容量％のＣＯを含有する。特定の実施形態では、基質は、約２５容量％、または約３０容量％、または約３５容量％、または約４０容量％、または約４５容量％、または約５０容量％のＣＯ、または約５５容量％のＣＯ、または約６０容量％のＣＯを含む。

ある特定の実施形態では、本方法は、ＭＥＫおよび／または２−ブタノール、ならびに任意に発酵ブロスからの１つ以上の他の産物を回収するステップをさらに含む。

第７の態様では、本発明は、第６の態様の方法により産生される場合、ＭＥＫおよび／または２−ブタノールを提供する。

別の態様では、本発明は、微生物がＣＯを含む基質の発酵によりＭＥＫおよび／または２−ブタノール、ならびに任意に１つ以上の他の産物を産生することができるように、親微生物を１つ以上の外因性核酸で形質転換することを含む本発明の第１の態様の微生物を産生するための方法を提供し、親微生物は、ＣＯを含む基質の発酵によりＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生することができない。

特定の一実施形態では、親微生物は、親微生物に存在しないＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において１つ以上の酵素を発現するように適合された１つ以上の外因性核酸で形質転換される。別の実施形態では、親微生物は、親微生物に存在するＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において１つ以上の酵素を過剰発現するように適合された１つ以上の核酸で形質転換される。別の実施形態では、親微生物は、親微生物に存在しないＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において１つ以上の酵素を発現し、かつ親微生物に天然に存在するＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において１つ以上の酵素を過剰発現するように適合された１つ以上の外因性核酸で形質転換される。別の実施形態では、親微生物は、２−ブタノンを、２−ブタノールおよび／または（Ｒ）−アセトインを（Ｒ，Ｒ）−２，３−ブタンジオールに変換することができる１つ以上の酵素に変換することができる１つ以上の酵素の活性を減少または実質的に排除するように形質転換される。一実施形態では、親微生物は、１つ以上の酵素を発現または過剰発現し、かつ１つ以上の他の酵素の活性を減少または実質的に排除するように形質転換される。

ある特定の実施形態では、１つ以上の酵素は、本明細書において前述される通りである。

ある特定の実施形態では、親微生物は、本明細書において前述される通りである。

メソ−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする外因性核酸と、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ酵素をコードする外因性核酸とを含む、単離された遺伝子操作されたカルボキシド栄養性酢酸産生性細菌が提供される。細菌は、これらの核酸から酵素を発現する。２つの酵素は、同じ細菌において発現されるか、またはそれらは、異なる細菌において別個に存在し得る。一般的に、細菌細菌は、本来酵素を発現しない。場合によっては、細菌は、Ｄ−（−）２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子におけるノックアウト変異を有する。他の場合では、細菌は、ジオール／グリセロールデヒドラターゼの再活性化タンパク質をコードする外因性核酸をさらに含み得る。これらは、その基質および／または産物と長期間接触した後に活性を失う場合があるデヒドラターゼの活発な生涯を延長する。典型的には、細菌は、嫌気性条件下で酵素を発現することができる。

細菌は、いくつかの実施形態では、そのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子におけるノックアウト変異を含み得る。これは、コードされたアルコールデヒドロゲナーゼ酵素の発現を少なくする、または防止することができる。そのような変異は、２−ブタノールの形成を減少または防止し、ＭＥＫの蓄積をもたらす。ＭＥＫは、発酵の産生に望ましい場合があり、そのため、この変異は非常に望ましい可能性がある。細菌は、いくつかの実施形態では、そのＤ−（−）２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼにおけるノックアウト変異をさらに含み得る。これは、ＭＥＫまたは２−ブタノールの産生に望ましくないブタンジオールの異性体の形成を減少または防止する。任意に、細菌は、ジオール／グリセロールデヒドラターゼの再活性化タンパク質をコードする外因性核酸をさらに含み得る。これは、ＭＥＫが所望のレベルでメソ−２，３−ブタンジオールから産生されるのを防ぐのに役立つ。

本明細書に記載される発酵および変換に有用なカルボキシド栄養性酢酸産生性細菌を形質転換するために使用することができるプラスミドも提供される。プラスミドは、カルボキシド栄養性酢酸産生性細菌において複製することができる、即ち、それは複製の好適な発生源を有する。場合によっては、プラスミドは、メソ−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする核酸と、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ酵素をコードする核酸とを含むが、いずれもプラスミドにおいて別個に存在することができる。プラスミドが細菌に形質転換される場合、望ましくは、細菌は酵素を発現する。代替えとして、それらは、誘導性プロモーターが発現に使用される場合、誘導されるときにのみ発現され得る。

そのような細菌およびプラスミドは、ＣＯおよび／またはＣＯ２を２−ブタノールに変換するためのプロセスを実践するのに有用である。ガス状のＣＯ含有および／またはＣＯ２含有基質は、上述のカルボキシド栄養性酢酸産生性細菌の培養物を含有するバイオリアクターに通される。細菌がＣＯおよび／またはＣＯ２を２−ブタノールに変換するような条件下で、細菌を培養培地中で成長させる。ブタノールは、連続または一過性様式のいずれかで、バイオリアクターから回収され得る。

上述の細菌のいくつかは、ＣＯおよび／またはＣＯ２をメチルエチルケトン（ＭＥＫ）に変換するためのプロセスに使用するのに十分適している。上述のように、細菌は、望ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼの活性または産生を減少する、または少なくする変異を有する。プロセスにおいて、ガス状のＣＯ含有および／またはＣＯ２含有基質は、適切なカルボキシド栄養性酢酸産生性細菌の培養物を含有するバイオリアクターに通される。細菌がＣＯおよび／またはＣＯ２をＭＥＫに変換するような条件下で、細菌を培養培地中で成長させる。ＭＥＫは、連続的または飛躍的であろうと、任意の既知のプロセスを用いてバイオリアクターから回収することができる。場合によっては、使用される細菌は、副産物の産生を少なくするために、Ｄ−（−）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子におけるノックアウト変異を有する。他の場合では、細菌は、ジオール／グリセロールデヒドラターゼの再活性化タンパク質をコードする外因性核酸をさらに含み得る。これは、メソ−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換のステップを着実に保つ。場合によっては、細菌は、Ｄ−（−）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子におけるノックアウト変異、およびジオール／グリセロールデヒドラターゼの再活性化タンパク質をコードする外因性核酸の両方を有する。

最適な細菌において形質転換および発現のために使用され得る核酸も提供される。有用な核酸の１つは、クロストリジウム・オートエタノゲナムのために最適化されたメソ−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼコドンをコードする。別の有用な核酸は、クロストリジウム・オートエタノゲナムのために最適化されたジオール／グリセロールデヒドラターゼコドンをコードする。特定の一例では、メソ−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、クレブシエラ・ニューモニエメソ−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼである。別の特定の例では、核酸は、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）ジオール／グリセロールデヒドラターゼをコードする。別の特定の例では、核酸は、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）ジオール／グリセロールデヒドラターゼをコードする。これらの様々なコード配列は、１つ以上のプラスミドなど、単一または複数の分子上に存在し得る。複数のプラスミドが使用される場合、それらの複製の発生源は、望ましくは、互換性がある。核酸は、適切なバクテリオファージ上に保持され得る。

本発明は、個別にまたは集合的に、本願の明細書に言及または示される部品、要素、および特徴のうちの２つ以上のいずれかまたは全ての組み合わせで、前記部品、要素、および特徴に広く存するとも言うことができ、本発明が関連する技術分野において等価物であることが知られている特定の成分が本明細書において記載される場合、そのような既知の等価物は、個別に記載されているかのように、本明細書に組み込まれるものとする。

全体でその新規態様と考えられるべきである本発明のこれらおよび他の態様は、添付の図面を参照して、単に例として挙げられる以下の説明から明らかとなるであろう。

２−ブタノールピークを示すクロマトグラムのサンプルである。上のクロマトグラムは、メソ−２，３−ブタンジオールが培地に添加された、ｐｄｄＡＢＣを含有するプラスミドを有するＣ．オートエタノゲナムからのサンプルのものである。下のクロマトグラムは、メソ−２，３−ブタンジオールが培地に添加された、野生型Ｃ．オートエタノゲナムからのサンプルのものである。 形質転換された大腸菌ＪＷ１３７５におけるブタンジオール産生を強調したＨＰＬＣプロファイルである。注記：Ｙ軸は、グラフ間で等しく縮尺されていない。目に見える４つのピークは、１４．３分の酢酸、１６．２分のメソ−２，３−ブタンジオール、１７．０分の（Ｄ，Ｌ）−２，３−ブタンジオール、および１８．９分のエタノールである。Ａ．ｐＭＴＬ８５１４５−ＡＬＳ−ＡＬＤＣ−ｓｅｃＡｄｈ５９３を有するメソ−２，３−ブタンジオールは検出されないが、ある程度の（Ｄ）−２，３−ブタンジオールが検出された、ＪＷ１３７５のプロファイルを示す。Ｂ．ｐＭＴＬ８５１４５−ＡＬＳ−ＡＬＤＣ−_ｋｐｂｕｄＣを有するメソ−２，３−ブタンジオールがある程度の（Ｄ）−２，３−ブタンジオールと共に産生された、ＪＷ１３７５のプロファイルを示す。 ４つのクローンにおける２，３ｂｄｈ遺伝子破壊の増幅の確認。プライマーＯｇ４２ｆ／Ｏｆ４３ｒによる３７５ｂｐのＰＣＲ産物は、未修飾の野生型２，３−ｂｄｈ遺伝子（Ｗ）を示す。同じプライマー一式を使用した約２ｋｂのＣＲ産物の増幅は、標的遺伝子におけるＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロンの挿入を示す。２，３−ｂｄｈ遺伝子を標的とした４つ全てのクローンは、約２ｋｂのＰＣＲ産物（１−４）の増幅に見られるように、遺伝子破壊に対して陽性である。 ＨＰＬＣによる１２−ウェルプレートにおけるメソ−２，３−ブタンジオール産生の確認。クロマトグラムは、メソ−２，３−ブタンジオールおよびＤ−（−）−２，３−ブタンジオールのピークを示す。５．４：１の比率が測定された。 プラスミドｐＭＴＬ８３１５５−ＫｐＢＤＨを有するＣ．オートエタノゲナムの反応器実験の代謝物プロファイル。選択した時点で、メソ−２，３−ブタンジオールが測定され、良好に検出された。 ＨＰＬＣによる連続培養からの３つのサンプルにおけるメソ−２，３−ブタンジオール産生の確認。 Ｃ．オートエタノゲナムにおけるメソ−２，３ブタンジオールデヒドロゲナーゼの発現を確認する増幅チャートである。 ＣＯからのメソ−２，３−ＢＤＯ、ＭＥＫ、および２−ブタノールの産生経路。 メソ−２，３−ＢＤＯ、ＭＥＫ、および２−ブタノールの産生経路。

以下は、本発明の説明であり、一般的な用語で示されるその好ましい実施形態を含む。本発明は、本明細書において、以下に「実施例」という見出しのもと示される開示によりさらに説明され、これは、本発明を支持する実験データ、本発明の様々な態様の特定の例、および本発明を実施する手段を提供する。

発明者は、ＣＯを含む基質の発酵により、ＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において重要な酵素を発現または過剰発現するように適合された組換え微生物を使用する、（Ｒ）−アセトインからのＭＥＫおよび／または２−ブタノールの産生を想定する。それらは、カルボキシド栄養性酢酸産生菌であるクロストリジウム・オートエタノゲナムにおいて、（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールから２−ブタノールを産生し、（Ｒ）−アセトインを（Ｓ）−２，３−ブタンジオールに変換することを示し、これはＭＥＫおよび２−ブタノール両方の産生において中間ステップである。これは、ＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生するための現在の方法に対して利益を有し得るＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生するための代替え手段を提示する。加えて、それは、さもなければ大気中に放出され、環境を汚染するであろう産業プロセスからの一酸化炭素を使用する手段を提示する。

カルボキシド栄養性酢酸産生性微生物がＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生することは知られていない。それらは、これらの産物を作製する生合成経路を欠く。加えて、それらは、中間体（Ｒ，Ｒ）−２，３−ブタンジオールを産生するが、ＭＥＫおよび２−ブタノールの産生には、中間体（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールの産生が必要とされる。

発明者は、クロストリジウム・オートエタノゲナムにおける発明の有効性を示したが、それらは、上述および本明細書にさらに論じられるように、本発明が広範なカルボキシド栄養性酢酸産生性微生物群およびＣＯを含む基質の発酵に適用可能であることを想定する。

本明細書に言及されるように、「発酵ブロス」は、少なくとも栄養培地および細菌細胞を含む培養培地である。

本明細書に言及されるように、「シャトル微生物」は、メチルトランスフェラーゼ酵素が発現され、目的の微生物とは異なる微生物である。

本明細書に言及されるように、「目的の微生物」は、発現構築物／ベクター上に含まれる遺伝子が発現され、シャトル微生物とは異なる微生物である。

用語「主発酵産物」は、高濃度および／または収率で産生される１つの発酵産物を意味することが意図される。

用語「効率の増加」、「増加した効率」などは、発酵プロセスに関して使用される場合、発酵を触媒する微生物の成長速度、高産物濃度での成長速度および／または産物産生速度、消費された基質の容量当たり産生される所望の産物の容量、所望の産物の産生速度または産生レベル、ならびに発酵の他の副産物と比較した産生された所望の産物の相対比率のうちの１つ以上を増加することを含むが、これらに限定されない。

句「一酸化炭素を含む基質」および同様の用語は、一酸化炭素が、例えば、成長および／または発酵のために細菌の１つ以上の株に利用可能である任意の基質を含むように理解されるべきである。

句「一酸化炭素を含むガス状基質」ならびに同様の句および用語は、ある程度の一酸化炭素を含有する任意のガスを含む。ある特定の実施形態では、基質は、少なくとも約２０容量％〜約１００容量％のＣＯ、２０容量％〜７０容量％のＣＯ、３０容量％〜６０容量％のＣＯ、および４０容量％〜５５容量％のＣＯを含有する。特定の実施形態では、気質は、約２５容量％、または約３０容量％、または約３５容量％、または約４０容量％、または約４５容量％、または約５０容量％のＣＯ、または約５５容量％のＣＯ、または約６０容量％のＣＯを含む。

ＣＯを含む基質が任意の水素を含有する必要はないが、Ｈ_２の存在は、本発明の方法による産物形成にとって有害であるべきではない。特定の実施形態では、水素の存在は、アルコール産生の全体的効率の改善をもたらす。例えば、特定の実施形態では、基質は、約２：１、または１：１、または１：２の割合のＨ_２：ＣＯを含み得る。一実施形態では、基質は、約３０容量％以下のＨ_２、２０容量％以下のＨ_２、約１５容量％以下のＨ_２、または約１０容量％以下のＨ_２を含有する。他の実施形態では、基質流は、低濃度のＨ_２、例えば、５％未満、または４％未満、または３％未満、または２％未満、または１％未満を含むか、または実質的に水素を含まない。基質は、ある程度のＣＯ_２、例えば、約１容量％〜約８０容量％のＣＯ_２、または１容量％〜約３０容量％のＣＯ_２も含有し得る。一実施形態では、基質は、約２０容量％以下のＣＯ_２を含む。特定の実施形態では、基質は、約１５容量％以下のＣＯ_２、約１０容量％以下のＣＯ_２、約５容量％以下のＣＯ_２を含むか、または実質的にＣＯ_２を含まない。

以下の説明において、本発明の実施形態は、「ＣＯを含有するガス状基質」の送達および発酵に関して説明される。しかしながら、ガス状基質は、代替え形態で提供され得ることを理解するべきである。例えば、液体に溶解されたＣＯを含有するガス状基質が提供され得る。本質的に、液体は、ガスを含有する一酸化炭素で飽和され、その後、その液体がバイオリアクターに添加される。これは、標準的な方法を用いて達成することができる。例として、微小気泡分散発生装置（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ ｅｔ．ａｌ．Ｓｃａｌｅ−ｕｐ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ ｆｏｒ ａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １０１，Ｎｕｍｂｅｒ ３／Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００２）を使用することができる。さらなる例として、ＣＯを含有するガス状基質は、固体支持体上に吸着され得る。そのような代替え方法は、用語「ＣＯを含有する基質」などの使用により包含される。

本発明の特定の実施形態では、ＣＯ含有ガス状基質は、産業廃棄（ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｏｆｆ）または廃ガスである。「産業廃棄物または排気ガス」は、産業プロセスによって産生されたＣＯを含む任意のガスを含み、鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、バイオマスのガス化、電力生産、カーボンブラック生産、およびコークス製造の結果として産生されるガスを含むように広く解釈されるべきである。さらなる例は、本明細書の別の箇所で提供され得る。

文脈上必要な場合以外は、本明細書で使用される、句「発酵」、「発酵プロセス」、または「発酵反応」などは、プロセスの成長期および産物生合成期の両方を包含することが意図される。本明細書にさらに記載されるように、いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、第１の成長反応器と、第２の発酵反応器とを備え得る。したがって、金属または組成物の発酵反応物への添加は、これらの反応器のいずれかまたはそれらの両方への添加を含むように理解されるべきである。

用語「バイオリアクター」は、１つ以上の槽および／または塔もしくは配管からなる発酵デバイスを含み、これは、連続攪拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、散水ろ床反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、またはガス−液体接触に適した他の槽もしくは他のデバイスを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、第１の成長反応器と、第２の発酵反応器とを備え得る。したがって、基質のバイオリアクターまたは発酵反応物への添加を指す場合、適切な場合、これらの反応器のいずれかまたはそれらの両方への添加を含むように理解されるべきである。

「外因性核酸」は、それらが導入される微生物の外部に由来する核酸である。外因性核酸は、それらが導入される微生物、それらが導入される生物とは異なる微生物の株もしくは種を含むがこれらに限定されない任意の適切な供給源に由来するか、またはそれらは、人工的もしくは組換えにより作製され得る。一実施形態では、外因性核酸は、それらが導入される微生物内に既に（単に例として、天然に）存在する核酸配列を表し、それらは、特定の遺伝子の発現を増加する、またはそれを過剰発現するように導入される（例えば、配列（例えば遺伝子）のコピー数を増加する、または発現を増加するために強いもしくは構成プロモーターを導入することにより）。別の実施形態では、外因性核酸は、それらが導入される微生物内に通常（単に例として、天然に）存在しない核酸配列を表し、微生物内に存在しない産物の発現、または微生物に既に存在する遺伝子（単に例として、未変性遺伝子）の発現の増加（例えば、プロモーターなどの調節要素の導入の場合）を可能にする。外因性核酸は、導入される微生物のゲノム内に組み込まれるか、または染色体外状態に維持されるように適合され得る。

本発明は、配列が本明細書に具体的に例示される配列と異なる核酸を用いて実践することができるが、但し、それらが実質的に同じ機能を行うものとすることを理解するべきである。タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列に関して、これは、コードされるタンパク質またはペプチドが実質的に同じ機能を有することを意味する。プロモーター配列を表す核酸配列に関して、変異体配列は、１つ以上の遺伝子の発現を促進する能力を有する。そのような核酸は、本明細書において、「機能的に等価な変異体」と称され得る。例として、核酸の機能的に等価な変異体は、対立遺伝子変異体、遺伝子の断片、変異を含む遺伝子（欠失、挿入、ヌクレオチド置換など）および／または多型などを含む。他の微生物からの相同遺伝子も、本明細書で具体的に例示される配列の機能的に等価な変異体の例として考慮され得る。これらは、クロストリジウム種、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ブチリクム、クロストリジウム・ジオリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｏｌｉｓ）、ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、クレブシエラ・オキシトカ、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、シトロバクター・コセリ（Ｃｉｔｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ、および大腸菌などの種における相同遺伝子を含み、その詳細は、ＧｅｎｂａｎｋまたはＮＣＢＩなどのウェブサイト上で公共的に利用可能である。句「機能的に等価な変異体」は、配列が特定の生物のためのコドン最適化の結果として変動する核酸を含むようにも解釈されるべきである。本明細書において、核酸の「機能的に等価な変異体」は、好ましくは、特定される核酸と少なくとも約７０％、好ましくは約８０％、より好ましくは約８５％、好ましくは約９０％、好ましくは約９５％以上の核酸配列同一性を有する。

本発明は、配列が本明細書に具体的に例示されるアミノ酸配列と異なるポリペプチドを用いて実践され得ることも理解するべきである。それらの変異体は、本明細書において、「機能的に等価な変異体」と称され得る。タンパク質またはペプチドの機能的に等価な変異体は、特定されるタンパク質またはペプチドと少なくとも４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％以上のアミノ酸同一性を共有するこれらのタンパク質またはペプチドを含み、関心のペプチドまたはタンパク質と実質的に同じ機能を有する。そのような変異体は、それらの範囲内のタンパク質またはペプチドの断片を含み、断片は、欠失が１〜５、〜１０、〜１５、〜２０、〜２５個のアミノ酸であり、ポリペプチドのいずれの終端で残基１から２５まで伸長し得、かつ欠失が領域内の任意の長さであるか、または内部位置にあり得るポリペプチドの切り詰められた形態を含む。本明細書において、特定のポリペプチドの機能的に等価な変異体は、例えば、前の段落に例示されるように、細菌の他の種において相同遺伝子によって発現されるポリペプチドを含むようにも解釈されるべきである。

本明細書で使用されるように、「実質的に同じ機能」は、核酸またはポリペプチドが、それが変異体である核酸またはポリペプチドの機能を行うことができることを意味するように意図される。例えば、本発明の酵素の変異体は、その酵素と同じ反応を触媒することができる。しかしながら、変異体が、それが変異体であるポリペプチドまたは核酸と同じ活性レベルを有することを意味するように解釈されるべきではない。

任意の数の既知の方法を用いて、機能的に等価な変異体が、それが変異体である核酸またはポリペプチドと実質的に同じ機能を有するかを評価することができる。しかしながら、例として、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９７６，６９：４７５−８０、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９８６：２４５：１４４−５２、またはＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９３，１７５：５０７９−５１０５に概説される方法が、それぞれ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、および（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼの活性を測定するために使用され得る。

「過剰発現する」、「過剰発現」、ならびに同等の用語および句は、本発明に関して使用される場合、同じ条件下で、親微生物のタンパク質（１つ以上の核酸を含む）の発現レベルと比較して、１つ以上のタンパク質（１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む）の発現における任意の増加を含むように広く解釈されるべきである。それは、タンパク質（１つ以上の核酸を含む）が任意の特定のレベルで発現されることを意味するように解釈されるべきではない。

「親微生物」は、本発明の組換え微生物を生成するために使用される微生物である。親微生物は、自然界に生じるもの（即ち、野生型微生物）であるか、または前に修飾されたが、本発明の主題である酵素のうちの１つ以上を発現または過剰発現しないものであり得る。したがって、本発明の組換え微生物は、親微生物において発現または過剰発現されない１つ以上の酵素を発現または過剰発現するように修飾された。

用語「核酸」および「構築物」または「ベクター」、ならびに同様の用語は、遺伝物質を細胞内に移動するためにビヒクルとして使用するのに適した任意の核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）を含むように広く解釈されるべきである。本用語は、プラスミド、ウイルス（バクテリオファージを含む）、コスミド、および人工染色体を含むように解釈されるべきである。構築物またはベクターは、１つ以上の調節要素、複製の発生源、マルチクローニング部位、および／または選択マーカーを含み得る。特定の一実施形態では、構築物またはベクターは、構築物またはベクターによりコードされる１つ以上の遺伝子の発現を可能にするように適合される。核酸構築物またはベクターは、裸核酸ならびに細胞への送達を容易にするための１つ以上の薬物で製剤化された核酸（例えば、リポソーム抱合型核酸、核酸が含まれる生物）を含む。

「メソ−２，３−ブタンジオール生合成経路」は、（Ｒ）−アセトインのメソ−２，３−ブタンジオールへの変換を可能にする酵素的経路である。例として、経路は、（Ｒ）−アセトインの（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールへの変換のステップを含み得る。例として、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、（Ｒ）−アセトインの（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールへの変換を触媒し、ジオール／グリセロールデヒドラターゼは、（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換を触媒し得る（図８および９）。

「ＭＥＫ生合成経路」は、（Ｒ）−アセトインのＭＥＫへの変換を可能にする酵素的経路である。例として、経路は、（Ｒ）−アセトインの（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオール、および（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換のステップを含み得る。例として、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、（Ｒ）−アセトインの（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールへの変換を触媒し、ジオール／グリセロールデヒドラターゼは、（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換を触媒し得る（図８および９）。

「２−ブタノール生合成経路」は、（Ｒ）−アセトインの２−ブタノールへの変換を可能にする酵素的経路である。例として、経路は、（Ｒ）−アセトインの（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールへの変換、（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換、ＭＥＫの２−ブタノールへの変換のステップを含み得る。例として、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、アセトインの（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールへの変換を触媒し、ジオール／グリセロールデヒドラターゼは、（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換を触媒し、アルコールデヒドロゲナーゼは、ＭＥＫの２−ブタノールへ触媒する（図８および９）。

文脈上明確に必要な場合以外は、ＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路における酵素への言及は、酵素の任意の１つ以上のサブユニットへの言及を含むように解釈されるべきである。単に例として、プロパンジオール／グリセロールデヒドラターゼは、３つのサブユニットを含み得る。

「ジオール／グリセロールデヒドラターゼ」への言及は、ジオールデヒドラターゼ、および別個にグリセロールデヒドラターゼへの言及を含むように解釈されるべきである。単一の酵素が両方の活性を有することを示すように解釈されるべきではない。特定の一実施形態では、ジオール／グリセロールデヒドラターゼは、プロパンジオール／グリセロールデヒドラターゼである。

ある特定の実施形態では、本発明は、ある特定の酵素の活性を減少または実質的に排除することを伴う。例えば、カルボキシド栄養性酢酸産生菌は、（Ｒ）−アセトインを（Ｒ，Ｒ）−２，３−ブタンジオール（酵素（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼを用いて）に天然に変換することができるが、ＭＥＫおよび２−ブタノールの産生に関しては、（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールの産生が必要とされる。（Ｒ，Ｒ）−２，３−ブタンジオールの産生を減少することは、ＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生するための発酵の効率を増加するのに役立ち得る。同様に、カルボキシド栄養性酢酸産生菌は、ＭＥＫを２−ブタノールに天然に変換する（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼを用いて）ことができる。これは、２−ブタノールの産生において役立つが、回収され得るＭＥＫの量を減少する可能性がある。アルコールデヒドロゲナーゼの活性を減少させることは、発酵から回収され得るＭＥＫの量を増加するのに役立ち得る。

酵素の活性を「減少または実質的に排除する」は、酵素の活性レベルにおける任意の減少を含むように広く解釈されるべきである。それは、酵素の発現および／または活性を破壊するための遺伝的修飾を含み得る。一実施形態では、１つ以上の遺伝的修飾は、酵素をコードする遺伝子のうちの１つ以上を破壊またはノックアウトする。一実施形態では、１つ以上の遺伝的修飾は、酵素の発現または活性に必要な化合物の活性を破壊する。一実施形態では、１つ以上の遺伝的修飾は、酵素の発現または活性を阻害する１つ以上の化合物の発現または活性を増加する。

本発明による酵素の遺伝子、発現、または活性を「破壊する遺伝的修飾」（および同様の用語）は、酵素が触媒する産物の生合成を少なくとも減少する任意の遺伝的修飾を含むように広く解釈されるべきである。本句は、例えば、酵素をコードする遺伝子への修飾（遺伝子の発現に関与する遺伝的調節要素への修飾を含む）、酵素の活性を減少もしくは阻害するか、または酵素の発現を減少もしくは阻害するタンパク質を産生する核酸の導入、遺伝子（例えば、ａｓＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート））の発現を遮断するように適合された核酸を発現する核酸の導入、タンパク質をコードする遺伝子への修飾を導入することにより、酵素の発現もしくは活性に必要なタンパク質の減少もしくは阻害を含むように解釈されるべきである。酵素の発現または活性に必要なタンパク質は、遺伝子もしくは１つ以上の酵素に直接作用するか、または別の化合物を介して間接的に作用し得ることを理解するべきである。同様に、酵素の活性または発現を減少または阻害するタンパク質は、酵素の遺伝子に直接作用するか、または別の化合物を介して間接的に作用し得る。

「遺伝的修飾」は、例えば、１つ以上の外因性核酸の微生物への導入、変異の遺伝的部位への導入、ゲノムへの１つ以上のヌクレオチドの付加、またはゲノムから１つ以上のヌクレオチドの除去、１つ以上のヌクレオチドの異なるヌクレオチドでの置換、遺伝子の置換、遺伝子の除去、遺伝子の付加などを含むように広く解釈されるべきであり、そのように意図される。

メソ−２，３−ブタンジオールは、（Ｒ，Ｓ）−および（Ｓ，Ｒ）−２，３−ブタンジオールを含む。（Ｒ，Ｒ）−２，３−ブタンジオールは、Ｄ−（−）−２，３−ブタンジオールである。（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールは、Ｌ−（＋）−２，３−ブタンジオールである。（Ｒ）−アセトインは、Ｄ−アセトインである。（Ｓ）−アセトインは、Ｌ−アセトインである。

微生物

本明細書に前述されるように、本発明は、ＣＯを含む基質の発酵により、ＭＥＫおよび／または２−ブタノール、ならびに任意に１つ以上の他の産物を産生することができる組換え微生物を提供する。

特定の一実施形態では、微生物は、それが由来する親微生物に存在しないＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において１つ以上の酵素（またはその１つ以上のサブユニット）を発現するように適合される。別の実施形態では、微生物は、親微生物に存在するＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において１つ以上の酵素（またはその１つ以上のサブユニット）を過剰発現するように適合される。一実施形態では、微生物は、親微生物に存在しないＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において１つ以上の酵素（またはその１つ以上のサブユニット）を発現し、親微生物に存在するＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において１つ以上の酵素（またはその１つ以上のサブユニット）を過剰発現するように適合される。一実施形態では、微生物は、親微生物に存在する１つ以上の酵素の活性を減少または実質的に排除するように適合される。一実施形態では、１つ以上の酵素は、ＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路の一部である。１つ以上の酵素の活性の破壊、１つ以上の酵素の過剰発現、および１つ以上の酵素の導入の組み合わせが本明細書において使用され得ることを理解するべきである。

一実施形態では、微生物は、次の：
（Ｒ）−アセトインの（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素、
（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換を触媒する酵素、および
ＭＥＫの２−ブタノールへの変換を触媒する酵素、のうちの１つ以上を発現または過剰発現するように適合される。

一実施形態では、（Ｒ）−アセトインの（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素は、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．Ｂ２０またはＥＣ１．１．１．７６）、またはその機能的に等価な変異体である。一実施形態では、（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換を触媒する酵素は、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．２８／４．２．１．３０）、またはその機能的に等価な変異体である。一実施形態では、ＭＥＫの２−ブタノールへの変換を触媒する酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）、またはその機能的に等価な変異体である。

一実施形態では、微生物は、ＣＯを含む基質の発酵により２−ブタノールを産生することができ、２−ブタノール生合成経路において、
（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．Ｂ２０またはＥＣ１．１．１．７６）、
ジオール／グリセロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．２８／４．２．１．３０）、
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）、および
それらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体から選択される１つ以上の酵素を発現または過剰発現するように適合される。

一実施形態では、親微生物は、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．Ｂ２０またはＥＣ１．１．１．７６）、およびジオール／グリセロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．２８／４．２．１．３０）、またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体に欠き、組換え微生物は、これらの酵素両方を発現するように適合される。

一実施形態では、親微生物は、（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４）、またはその機能的に等価な変異体を含み、組換え微生物は、この酵素の活性を減少または実質的に排除するように適合される。

一実施形態では、微生物は、ＣＯを含む基質の発酵によりＭＥＫの産生を可能にし、ＭＥＫ生合成経路において、
（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．Ｂ２０またはＥＣ１．１．１．７６）、
ジオール／グリセロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．２８／４．２．１．３０）、および
それらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体から選択される１つ以上の酵素を発現または過剰発現するように適合される。

一実施形態では、親微生物は、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．Ｂ２０またはＥＣ１．１．１．７６）、およびジオール／グリセロールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．２８／４．２．１．３０）、またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体に欠き、組換え微生物は、これらの酵素両方を発現するように適合される。

一実施形態では、親微生物は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）、またはその機能的に等価な変異体を含み、組換え微生物は、この酵素の活性を減少または実質的に排除するように適合される。

一実施形態では、親微生物は、（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４）、またはその機能的に等価な変異体を含み、組換え微生物は、この酵素の活性を減少または実質的に排除するように適合される。

微生物は、例えば、微生物内の未変性遺伝子の発現の増加（例えば、遺伝子の発現を駆動するためのより強い、または構成プロモーターの導入により）、酵素をコードし、それを発現するように適合された外因性核酸の導入により特定の酵素をコードする遺伝子のコピー数の増加、親微生物内に存在しない酵素をコードし、それを発現するように適合された外因性核酸の導入を含む、任意の数の組換え法により、１つ以上の酵素（またはその１つ以上のサブユニット）を発現または過剰発現するように適合され得る。

ある特定の実施形態では、親微生物は、親微生物に天然の１つ以上の遺伝子（天然に存在する、または存在するように前に形質転換されたものを含む）の増加または過剰発現と、親微生物に天然ではない１つ以上の遺伝子の導入の組み合わせを提供するように形質転換され得る。例えば、ＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において１つ以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子は、親微生物に天然であってもよいが、経路において１つ以上の他の酵素をコードする１つ以上の他の遺伝子を含まない場合がある。微生物は、例えば、天然のアルコールデヒドロゲナーゼを過剰発現し、（Ｒ）−アセトインを（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオール、および（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールをＭＥＫに変換するための１つまたは両方の酵素をコードする１つ以上の核酸を導入するように操作され得る。当業者は、本発明において使用する様々な他の組み合わせを理解する。

さらなる実施形態では、本発明の微生物は、アルコールデヒドロゲナーゼおよび（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼのうちの１つまたは両方の活性を減少または実質的に排除する遺伝的（ｇｅｎｅｆｉｔ）修飾を導入することにより、その親微生物からさらに修飾され得る。ＭＥＫの産生が好ましい場合、両方の酵素活性の減少が好ましい。２−ブタノールの産生が好ましい場合、（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性のみが減少される。（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼの活性の減少または実質的な排除は、必須ではないが、一実施形態では、それが好ましい。

単に例として、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼの例示的なアミノ酸および核酸配列情報は、クレブシエラ・ニューモニエからＨ６ＶＲＦ２およびＡＦＢ８２６８１．１の形態で提供される。

単に例として、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ（ｄｅｈｄｒａｔａｓｅ）の例示的なアミノ酸および核酸配列情報は、下の表１および２に提供される。ある特定の場合では、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ（ｄｅｈｄｒａｔａｓｅ）は、ビタミンＢ１２依存であり、他の場合では、それは、Ｂ１２非依存である。いくつかのジオール／グリセロールデヒドラターゼは、反応を触媒した後に不活性化され、補助因子を補充することにより酵素を再活性化することができる活性化因子タンパク質を必要とする場合がある。ある特定の実施形態では、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ（ｄｅｈｄｒａｔａｓｅ）は、３つのサブユニット（α、β、およびγ）を含む。

単に例として、アルコールデヒドロゲナーゼの例示的なアミノ酸および核酸配列情報は、Ｐ２５９８４．２、ならびにＰ１４９４１およびＡＦ１５７３０７．２、ならびにＸ６４８４の形態で提供される。さらなる例として、第ＰＣＴ／ＮＺ２０１２／００００２２号に記載されるアルコールデヒドロゲナーゼを使用することができる。

様々な酵素についての配列情報に対する上記の参照は、ＧｅｎＢａｎｋおよび／またはＮＣＢＩデータベースの参照である。配列情報は、これらの参照番号を使用してオンラインで容易にアクセスすることができる。

本発明の微生物において使用される酵素（およびそれらをコードする任意の対応する遺伝子）は、異なる細菌の属および種を含む任意の適切な供給源、または他の生物に由来し得る。しかしながら、一実施形態では、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、クレブシエラ肺炎、エロバクター−エロゲネス、またはパエニバチルス・ポリミキサに由来するものである。一実施形態では、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、上に例示されるアミノ酸配列を有するか、またはそれは、その機能的に等価な変異体である。一実施形態では、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ（ｄｅｈｄｒａｔａｓｅ）は、クレブシエラ・オキシトカからのジオールデヒドラターゼである。一実施形態では、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ（ｄｅｈｄｒａｔａｓｅ）は、本明細書において前に例示したアミノ酸配列を有するか、またはそれは、その機能的に等価な変異体である。一実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼは、クロストリジウム・オートエタノゲナムからである。一実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼは、本明細書において前に例示したアミノ酸配列を有するか、またはそれは、その機能的に等価な変異体である。

本発明において、（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼの活性は、任意に減少または実質的に排除される。この点で、遺伝子および酵素は、親微生物に含有されるものである。この酵素の例示的な配列情報は、Ｃ．オートエタノゲナムからのＡＥＩ９０７１５およびＨＱ８７６００９、Ｃ．リュングダリイからのＹＰ＿００３７８０４８２．１およびＧＩ：３００８５５４９８、Ｃ．ラグスダレイからのＡＥＩ９０７１６およびＨＱ８７６０１０を含む。

一実施形態では、微生物は、親微生物に存在する１つ以上の核酸、および本明細書で前に言及した酵素のうちの１つ以上（またはその１つ以上のサブユニット）をコードする１つ以上の核酸の発現を増加するように適合された１つ以上の外因性核酸を含む。一実施形態では、発現を増加するように適合された１つ以上の外因性核酸は、調節要素である。一実施形態では、調節要素は、プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、好ましくは適切な発酵条件下で高度に活性である構成プロモーターである。誘導性プロモーターも使用することができる。好ましい実施形態では、プロモーターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスターまたはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを含む群から選択される。発現、好ましくは適切な発酵条件下で高レベルの発現を指向することができる他のプロモーターが例示される実施形態の代替えとして有効であろうことは、当業者に理解されるだろう。

一実施形態では、微生物は、親微生物に存在しない、本明細書で前に言及した酵素のうちの１つ以上（またはその１つ以上のサブユニット）をコードし、発現するように適合された１つ以上の外因性核酸を含む。一実施形態では、微生物は、酵素のうちの少なくとも２つまたは３つ（またはその１つ以上のサブユニット）をコードし、それらを発現するように適合された１つ以上の外因性核酸を含む。

特定の一実施形態では、微生物は、２−ブタノールを産生することができ、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼおよびジオール／グリセロールデヒドラターゼのうちの１つ、このましくはそれらの両方、またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体をコードする１つ以上の外因性核酸を含む。ジオール／グリセロールデヒドラターゼは、３つのサブユニットから構成され得、各サブユニットは、異なる遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子は、全酵素を一緒にコードする単一核酸または２つ以上の核酸に組み合わされ得る。加えて、特定の親微生物は、これらのサブユニットのうちの１つ、２つ、または３つの遺伝子を含有し得る。したがって、本発明は、サブユニットのうちの１つまたは２つのみを発現するために、１つ以上の外因性核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）を用いて微生物を操作することを包含する。一実施形態では、微生物は、親微生物に存在するアルコールデヒドロゲナーゼの発現を増加するように適合された１つ以上の核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）も含む。

特定の一実施形態では、微生物は、ＭＥＫを産生することができ、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼおよびジオール／グリセロールデヒドラターゼのうちの１つ、好ましくはそれらの両方、またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体をコードする１つ以上の外因性核酸を含む。ジオール／グリセロールデヒドラターゼは、３つのサブユニットから構成され得、各サブユニットは、異なる遺伝子によってコードされる。これらの遺伝子は、全酵素を一緒にコードする単一核酸または２つ以上の核酸に組み合わされ得る。加えて、特定の親微生物は、これらのサブユニットのうちの１つ、２つ、または３つの遺伝子を含有し得る。したがって、本発明は、サブユニットのうちの１つまたは２つのみを発現するために、１つ以上の外因性核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）を用いて微生物を操作することを包含する。一実施形態では、微生物は、親微生物においてＭＥＫの２−ブタノールへの変換を減少または実質的に排除するように適合された１つ以上の核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）または遺伝的修飾も含む。一実施形態では、微生物は、親微生物に存在するアルコールデヒドロゲナーゼの活性を減少または実質的に排除するように適合された１つ以上の核酸または遺伝的修飾を含む。

一実施形態では、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、本明細書において前に例示される配列またはその機能的に等価な変異体を含む核酸によりコードされる。一実施形態では、ジオール／グリセロールデヒドラターゼは、本明細書において前に例示される、またはその任意の１つ以上の機能的に等価な変異体を含む１つ以上の核酸によってコードされる。一実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼは、本明細書において前に例示される、またはその任意の１つ以上の機能的に等価な変異体を含む１つ以上の核酸によってコードされる。代替えとして、酵素は、公共に利用可能であるデータベースに記載される、例えば、本明細書において前に列挙される核酸配列によってコードされ得る。

一実施形態では、微生物がＭＥＫおよび２−ブタノールのいずれか、またはそれらの両方を産生することができる場合、任意に、親微生物において、（Ｒ）−アセトインの（Ｒ，Ｒ）−２，３−ブタンジオールへの変換を減少または実質的に排除するように適合される。一実施形態では、微生物は、親微生物における（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼの活性を減少または実質的に排除するように適合された１つ以上の核酸または遺伝的修飾を含む。

微生物は、１つ以上の外因性核酸を含み得る。親微生物を２つ以上の遺伝的要素（遺伝子または調節要素（例えばプロモーター）など）で形質転換することが望ましい場合、それらは、１つ以上の外因性核酸上に含有され得る。

一実施形態では、１つ以上の外因性核酸は、核酸構築物またはベクターであり、特定の一実施形態では、任意の組み合わせで、本明細書で前に言及した酵素のうちの１つ以上をコードするプラスミドである。

外因性核酸は、親微生物の形質転換により染色体外を維持するか、または親微生物のゲノム内に組み込まれ得る。したがって、それらは、組み込み（例えば、相同組換え、および宿主ゲノム内への標的組み込みを可能にする領域）、または染色体外構築物の発現および複製（例えば、複製の発生源、プロモーター、および他の調節要素または配列）を補助するように適合されたさらなるヌクレオチド配列を含み得る。

一般的な例として、遺伝的修飾を遺伝子内に導入する、ないしは別の方法で遺伝子もしくはタンパク質を破壊またはノックアウトする場合において、遺伝子を破壊するために、適切な核酸構築物またはベクターが親微生物のゲノム内に組み込まれるように設計され得る。そのような構築物は、典型的には、破壊される遺伝子内またはそれに隣接する領域に相同である核酸配列（アーム）を含み、これは、相同組換えが生じる、および変異の導入、遺伝子からの核酸領域の切除、または構築物上で核酸による遺伝子領域の置換が生じるのを可能にする。構築物上のアームが、それらが標的とするゲノムの領域に１００％相補性であることが好ましいが、これは、必ずしも必要ではないが、但し、配列が関心の遺伝的領域との標的組換えを可能にするように十分に相補性であるものとする。典型的には、アームは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に定義されるように、厳密な条件下で標的領域に対してハイブリダイゼーションを可能にするであろう相同性のレベルを有する。

当業者は、本明細書に言及される酵素、特に、アルコールデヒドロゲナーゼおよび（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼの利用可能な配列情報を考慮して、標的とされる相同組換え、および親微生物のゲノムへの外因性核酸の組み込みを可能にするのに十分な核酸配列を理解するだろう。

一実施形態では、本明細書に前述される１つ以上の酵素（またはその１つ以上のサブユニット）をコードする外因性核酸は、外因性核酸によってコードされた１つ以上の酵素の発現を促進するように適合されたプロモーターをさらに含む。一実施形態では、プロモーターは、好ましくは適切な発酵条件下で高度に活性である構成プロモーターである。誘導性プロモーターも使用することができる。好ましい実施形態では、プロモーターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスターおよびホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーターを含む群から選択される。発現、好ましくは適切な発酵条件下で高レベルの発現を指向することができる他のプロモーターが例示される実施形態の代替えとして有効であろうことは、当業者に理解されるだろう。

一実施形態では、外因性核酸は、発現プラスミドである。

一実施形態では、親微生物は、カルボキシド栄養性酢酸産生性細菌の群から選択される。ある特定の実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシディボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセティカム、クロストリジウム・フォルミコアセチカム、クロストリジウム・マグナム、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム、アセトバクテリウム・ウッディ、アルカリバクラム・バッチィ、ブラウティア・プロダクタ、ユーバクテリウム・リモサム、モーレラ・サーモアセティカ、ムーレラ・サーマウトトロフィカ、スポロミューサー・オヴァタ、スポロミューサー・シルバセティカ、スポロミューサー・スファエロイデス、オキソバクター・フェニギイ、およびサーモアナエロバクター・キウヴィを含む群から選択される。

特定の一実施形態では、親微生物は、種Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ、およびＣ．ラグスダレイ、ならびに関連する分離菌を含むエタノール産生性、酢酸産生性クロストリジウムのクラスターから選択される。これらは、株Ｃ．オートエタノゲナムＪＡＩ−１^Ｔ（ＤＳＭ １００６１）［Ａｂｒｉｎｉ Ｊ，Ｎａｖｅａｕ Ｈ，Ｎｙｎｓ Ｅ−Ｊ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ．Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４， ４： ３４５−３５１］、Ｃ．オートエタノゲナム ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）［Ｓｉｍｐｓｏｎ ＳＤ，Ｆｏｒｓｔｅｒ ＲＬ，Ｔｒａｎ ＰＴ，Ｒｏｗｅ ＭＪ，Ｗａｒｎｅｒ ＩＬ：Ｎｏｖｅｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｈｅｒｅｏｆ．国際特許２００９、第ＷＯ／２００９／０６４２００号］、Ｃ．オートエタノゲナムＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、Ｃ．リュングダリイＰＥＴＣ^Ｔ（ＤＳＭ１３５２８＝ＡＴＣＣ ５５３８３）［Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ，Ｍｉｌｌｅｒ ＬＭ，Ｙａｎｇ Ｄ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｒＲＮＡ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｉ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９３，４３：２３２−２３６］、Ｃ．リュングダリイＥＲＩ−２ （ＡＴＣＣ ５５３８０）［Ｇａｄｄｙ ＪＬ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔａｉｎ ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｗａｓｔｅ ｇａｓｅｓ．米国特許１９９７、第５，５９３，８８６号］、Ｃ．リュングダリイＣ−０１（ＡＴＣＣ ５５９８８）［Ｇａｄｄｙ ＪＬ，Ｃｌａｕｓｅｎ ＥＣ，Ｋｏ Ｃ−Ｗ：Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｏｒ ｉｔｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ．米国特許２００２、第６，３６８，８１９号］、Ｃ．リュングダリイＯ−５２（ＡＴＣＣ ５５９８９）［Ｇａｄｄｙ ＪＬ，Ｃｌａｕｓｅｎ ＥＣ，Ｋｏ Ｃ−Ｗ：Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｏｒ ｉｔｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ．米国特許２００２、第６，３６８，８１９号］、Ｃ．ラグスダレイＰ１１^Ｔ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−６２２）［Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ，Ｌｅｗｉｓ ＲＳ，Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ．国際特許２００８、第ＷＯ２００８／０２８０５５号］、関連する分離菌、例えば「Ｃ．コスカティ（Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ）」［Ｚａｈｎ ｅｔ ａｌ−Ｎｏｖｅｌ ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ（米国特許出願第ＵＳ２０１１０２２９９４７号）］および「クロストリジウム種」（Ｔｙｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒｅｓ．４：１−１２）、または突然変異した株、例えば、Ｃ．リュングダリイＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ Ｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇａｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ．ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）を含むが、これらに限定されない。これらの株は、クロストリジウムｒＲＮＡクラスターＩ内にサブクラスターを形成し、それらの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、約３０％の類似する低ＧＣ含量と９９％超同一である。しかしながら、ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合およびＤＮＡ指紋実験は、これらの株が異なる種に属することを示した［Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ，Ｌｅｗｉｓ ＲＳ，Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ．国際特許２００８、第ＷＯ ２００８／０２８０５５号］。

このクラスターの全ての種は、類似する形態および大きさを有し（対数成長細胞は、０．５〜０．７×３〜５μｍの間である）、中温性（最適な成長温度は３０〜３７℃の間である）であり、厳密に嫌気性菌である［Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ，Ｍｉｌｌｅｒ ＬＭ，Ｙａｎｇ Ｄ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｒＲＮＡ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｉ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９３，４３：２３２−２３６、Ａｂｒｉｎｉ Ｊ，Ｎａｖｅａｕ Ｈ，Ｎｙｎｓ Ｅ−Ｊ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ．Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４，４：３４５−３５１、Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ，Ｌｅｗｉｓ ＲＳ，Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ．国際特許２００８、第ＷＯ ２００８／０２８０５５号］。さらに、それらは全て、同じｐＨ範囲（ｐＨ４〜７．５、最適な初期ｐＨは５．５〜６）、類似する成長速度を有するＣＯ含有ガスに対する強い独立栄養成長、ならびに主な発酵最終産物がエタノールおよび酢酸である類似する代謝プロファイル、ならびに少量の２，３−ブタンジオールおよび乳酸がある特定の条件下で形成されるなどの、同じ主要な系統発生形質を共有する［Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ，Ｍｉｌｌｅｒ ＬＭ，Ｙａｎｇ Ｄ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｒＲＮＡ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｉ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９３，４３：２３２−２３６、Ａｂｒｉｎｉ Ｊ，Ｎａｖｅａｕ Ｈ，Ｎｙｎｓ Ｅ−Ｊ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ．Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４，４：３４５−３５１、Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ，Ｌｅｗｉｓ ＲＳ，Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ．国際特許２００８、第ＷＯ ２００８／０２８０５５号］。インドール産生も３つ全ての種で観察された。しかしながら、種は、様々な糖類（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸、クエン酸）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、または他の基質（例えば、ベタイン、ブタノール）の基質利用において違いがある。さらに、種のいくつかは、ある特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に栄養要求体である一方、他はそうではないことが分かった。

一実施形態では、親株は、その唯一の炭素およびエネルギー源としてＣＯを使用する。

一実施形態では、親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・リュングダリイである。特定の一実施形態では、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３である。別の特定の実施形態では、微生物は、クロストリジウム・リュングダリイＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。

一実施形態では、親微生物は、次の：
（Ｒ）−アセトインの（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素、
（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換を触媒する酵素、および
ＭＥＫの２−ブタノールへの変換を触媒する酵素のうちの１つ以上の活性を欠く。

一実施形態では、親微生物は、次の：
（Ｒ）−アセトインの（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素、
（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換を触媒する酵素、および
ＭＥＫの２−ブタノールへの変換を触媒する酵素のうちの１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子を欠く。

一実施形態では、親微生物は、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ、および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ、ならびにそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体をコードする１つ以上の遺伝子を欠く。

一実施形態では、親微生物は、（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および／またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体をコードする１つ以上の遺伝子を含む。

一実施形態では、親微生物は、（Ｒ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および／またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体をコードするコードする１つ以上の遺伝子を含み、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、ジオール／グリセロールデヒドラターゼおよび／またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体をコードする１つ以上の遺伝子を欠く。

核酸

本発明は、本発明の組換え微生物の生成に使用する核酸および核酸構築物も提供する。

一実施形態では、核酸は、微生物において発現される場合、ＣＯを含む基質の発酵により微生物にＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生させるＭＥＫおよび／または２−ブタノール生合成経路において、酵素（またはその１つ以上のサブユニット）のうちの１つ以上をコードする１つ以上の配列を含む。特定の一実施形態では、本発明は、微生物において発現される場合、ＣＯを含む基質の発酵により微生物にＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生させる２つ以上の酵素（またはそれらの１つ以上のサブユニット）をコードする核酸を提供する。別の実施形態では、本発明は、前記酵素の３つをコードする核酸を提供する。

特定の一実施形態では、酵素は、本明細書において前述されるそれらの酵素から選択される。

一実施形態では、本発明の核酸は、任意の順序で、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼおよびジオール／グリセロールデヒドラターゼおよび／またはそれらの任意の１つ以上の機能的に等価な変異体をコードする１つ以上の核酸配列を含む。一実施形態では、核酸は、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする１つ以上の核酸配列をさらに含む。

上記酵素のそれぞれをコードする例示的なアミノ酸配列および核酸配列は、本明細書に提供されるか、または本明細書に前述するＧｅｎＢａｎｋから得ることができる。しかしながら、当業者は、本明細書に含まれる情報、ＧｅｎＢａｎｋおよび他のデータベース、ならびに遺伝子コードを考慮して、酵素またはその機能的に等価な変異体をコードする代替えの核酸を容易に理解するだろう。

一実施形態では、（Ｓ）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼをコードする核酸は、本明細書に前述される配列を有するか、またはその機能的に等価な変異体である。

一実施形態では、ジオール／グリセロールデヒドラターゼをコードする核酸配列は、本明細書に前述される配列を有するか、またはその機能的に等価な変異体である。

一実施形態では、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列は、本明細書に前述される配列を有するか、またはその機能的に等価な変異体である。

一実施形態では、本発明の核酸は、プロモーターをさらに含む。一実施形態では、プロモーターは、その制御下の遺伝子の構成的発現を可能にする。しかしながら、誘導性プロモーターも採用され得る。当業者は、本発明において使用する適切なプロモーターを容易に理解するだろう。好ましくは、プロモーターは、適切な発酵条件下で高レベルの発現を指向することができる。特定の実施形態では、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌクラスタープロモーターが使用される。別の実施形態では、ホスホトランスアセチラーゼ／アセテートキナーゼプロモーターが使用される。別の実施形態では、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーター、Ｒｎｆ複合オペロンプロモーター、またはＡＴＰシンターゼオペロンプロモーター。特定の一実施形態では、プロモーターは、Ｃ・オートエタノゲナムからである。

本発明の核酸は、親微生物の形質転換時に染色体外を維持するか、または微生物のゲノム内への組み込みに適合され得る。したがって、本発明の核酸は、染色体外構築物（例えば、複製の発生源、プロモーター、および他の調節配列）の組み込み（例えば、相同組み換えおよび宿主ゲノムへの標的組み込みを可能にする領域）、またはその安定した発現および複製を補助するように適合されたさらなるヌクレオチド配列を含み得る。

一実施形態では、核酸は、核酸構築物またはベクターである。特定の一実施形態では、核酸構築物またはベクターは、発現構築物またはベクターであるが、クローン化に使用されるものなどの他の構築物およびベクターが本発明により包含される。特定の一実施形態では、発現構築物またはベクターは、プラスミドである。

本発明の発現構築物／ベクターは、プロモーターに加えて、任意の数の調節要素、ならびに所望する場合、さらなるタンパク質の発現に適したさらなる遺伝子を含有し得ることを理解する。一実施形態では、発現構築物／ベクターは、１つのプロモーターを含む。別の実施形態では、発現構築物／ベクターは、２つ以上のプロモーターを含む。特定の一実施形態では、発現構築物／ベクターは、発現される各遺伝子に１つのプロモーターを含む。一実施形態では、発現構築物／ベクターは、リボソーム結合部位、好ましくは発現される各遺伝子にリボソーム結合部位を含む。

本明細書に記載される核酸配列および構築物／ベクター配列は、リボソーム結合部位および／または制限部位に必要なものなど、標準的なリンカーヌクレオチドを含有し得ることは、当業者に理解されるだろう。そのようなリンカー配列は、必要であると解釈されるべきではなく、定義される配列に制限を与えない。

本発明の発現構築物／ベクターを含む核酸および核酸構築物は、当該技術分野において標準的な任意の数の技法を用いて構築することができる。例えば、化学合成または組換え技法を使用することができる。そのような技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に記載される。さらなる例示的な技法は、本明細書の後の実施例のセクションに記載される。本質的に、個々の遺伝子および調節要素は、遺伝子が所望のタンパク質を形成するように発現され得るように、相互に動作可能に連結される。本発明において使用するのに好適なベクターは、当業者により理解されるだろう。しかしながら、例として、次のベクターが好適であり得る：ｐＭＴＬ８００００ベクター、ｐＩＭＰ１、ｐＪＩＲ７５０、および本明細書の後の実施例のセクションに例示されるプラスミド。

本発明の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡを含む、任意の適切な形態であってよいことを理解するべきである。

本発明は、宿主生物、特に、微生物も提供し、本明細書に記載される核酸のうちの任意の１つ以上を含むウイルス、細菌、および酵母を含む。

１つ以上の外因性核酸は、裸核酸として親微生物に送達されるか、または形質転換プロセスを容易にするために１つ以上の薬剤と共に（例えば、リポソーム抱合型核酸および核酸が含有される生物）製剤化され得る。１つ以上の核酸は、適切に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせであり得る。ある特定の実施形態では、制限阻害剤が使用され得、例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６４，４１２．）を参照。

本発明の微生物は、組換え微生物の産生に関して当該技術分野において既知の任意の数の技法を使用して、親微生物および１つ以上の外因性核酸から調製され得る。単に例として、形質転換（形質導入または遺伝子導入）は、電気穿孔、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、プロトプラスト形質転換、化学もしくは天然の形質転換受容性、プロファージ誘導、または抱合により達成され得る。好適な形質転換技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｒｏｔａｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，１９８９に記載されている。

電気穿孔は、Ｃ．リュングダリイ（Ｋｏｐｋｅ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｐｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７：１３０８７−９２、ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３、ＷＯ２０１２／０５３９０５）、Ｃ．オートエタノゲナム（ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３、ＷＯ２０１２／０５３９０５）、またはアセトバクテリウム・ウッディ（Ｓｔｒａｅｔｚ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１０３３−３７）のようないくつかのカルボキシド栄養性酢酸産生菌に関して記載されており、Ｃ．アセトブチリクム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１９０−１９５）、Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）（Ｊｅｎｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４６：３０７１−３０８０）、またはＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）（Ｔｙｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ，２００４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：８８３−８９０）などの多くのクロストリジウムにおいて使用される標準的な方法である。プロファージ誘導は、Ｃ．スカトロゲネス（Ｐｒａｓａｎｎａ Ｔａｍａｒａｐｕ Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ，２０１０，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７７５ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｔａｎｔｓ，Ｍａｓｔｅｒｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の場合において、カルボキシド栄養性酢酸産生菌に関しても示されたが、抱合は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｈｅｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，２００３，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２９：１０３−１１０）またはＣ．アセトブチリクム（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ，１９９０，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：８１９−８２６）を含む多くのクロストリジウムの好適な方法として説明され、カルボキシド栄養性酢酸産生菌に関して類似する様式で使用することができる。プラスミドＲ７０２を有する大腸菌などの大腸菌ドナー菌株が使用され得る（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ，１９９０，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：８１９−８２６）。

ある特定の実施形態では、形質転換される微生物において活性である制限系により、微生物に導入される核酸をメチル化することが必要である。これは、以下に記載されるものを含む、様々な技法を用いて行うことができる。

例として、一実施形態では、本発明の組換え微生物は、次の：
（ｉ）本明細書に記載される発現構築物／ベクターを、および（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むメチル化構築物／ベクターをシャトル微生物に導入するステップと、
メチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するステップと、
シャトル微生物から１つ以上の構築物／ベクターを単離するステップと、
１つ以上の構築物／ベクターを目的の微生物に導入するステップと、を含む方法により産生される。

一実施形態では、ステップＢのメチルトランスフェラーゼは、構成的に発現される。別の実施形態では、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現が誘導される。

シャトル微生物は、微生物、好ましくは発現構築物／ベクターを構成する核酸配列のメチル化を容易にする制限陰性微生物である。特定の実施形態では、シャトル微生物は、制限陰性大腸菌、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）、またはラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）である。

メチル化構築物／ベクターは、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む。

発現構築物／ベクターおよびメチル化構築物／ベクターがシャトル微生物に導入されると、メチル化構築物／ベクター上に存在するメチルトランスフェラーゼ遺伝子が誘導される。誘導は、本発明の特定の一実施形態では、任意の好適なプロモーター系によるものであってよいが、メチル化構築物／ベクターは、誘導性ｌａｃプロモーターを含み、ラクトースまたはその類似体、より好ましくはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導される。他の好適なプロモーターは、ｔｅｔ、またはＴ７系を含む。本発明のさらに実施形態では、メチル化構築物／ベクタープロモーターは、構成プロモーターである。

特定の実施形態では、メチル化構築物／ベクターは、メチル化構築物／ベクター上に存在する任意の遺伝子がシャトル微生物において発現されるように、シャトル微生物の同一性に特異的な複製の発生源を有する。好ましくは、発現構築物／ベクターは、発現構築物／ベクター上に存在する任意の遺伝子が目的の微生物において発現されるように、目的の微生物の同一性に特異的な複製の発生源を有する。

メチルトランスフェラーゼ酵素の発現は、発現構築物／ベクター上に存在する遺伝子のメチル化をもたらす。発現構築物／ベクターは、次に、いくつかの既知の方法のうちの任意の１つに従い、シャトル微生物から単離され得る。

特定の一実施形態では、構築物／ベクターの両方が同時に単離される。

発現構築物／ベクターは、任意の数の既知の方法を用いて、目的の微生物に導入され得る。しかしながら、例として、本明細書に後の実施例のセクションに記載される方法が使用され得る。発現構築物／ベクターはメチル化されるため、発現構築物／ベクター上に存在する核酸配列は、目的の微生物内に組み込まれ、良好に発現され得る。

メチルトランスフェラーゼ遺伝子がシャトル微生物に導入され、過剰発現され得ることが想定される。よって、一実施形態では、得られたメチルトランスフェラーゼ酵素は、既知の方法を用いて回収され、発現プラスミドをメチル化するためにインビトロで使用され得る。次に、発現構築物／ベクターは、発現のために目的の微生物に導入され得る。別の実施形態では、メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、シャトル微生物のゲノムに導入され、その後、発現構築物／ベクターをシャトル微生物に導入し、シャトル微生物から１つ以上の構築物／ベクターを単離し、次いで、発現構築物／ベクターを目的の微生物内に導入する。

問題の組成物を得るために、上記に定義される発現構築物／ベクターおよびメチル化構築物／ベクターが組み合わされ得ることが想定される。そのような組成物は、本発明の組換え微生物を産生するために、制限バリア機構を回避するのに特定の有用性を有する。

特定の一実施形態では、発現構築物／ベクターおよび／またはメチル化構築物／ベクターは、プラスミドである。

当業者は、本発明の微生物の産生に使用するのに好適なメチルトランスフェラーゼの数を理解するだろう。しかしながら、例として、本明細書の後の実施例のセクションに記載されるバチルス・ズブチルスファージΦΤ１のメチルトランスフェラーゼおよびメチルトランスフェラーゼが使用され得る。一実施形態では、メチルトランスフェラーゼは、第ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３号（ＷＯ２０１２／０５３９０５）に記載されるメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を有するか、またはその機能的に等価な変異体である。好適なメチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、所望のメチルトランスフェラーゼおよび遺伝子コードの配列を考慮して、容易に理解されるだろう。一実施形態では、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、第ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３号（ＷＯ２０１２／０５３９０５）に記載されるメチルトランスフェラーゼの配列を含むか、またはその機能的に等価な変異体である。

メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を可能にするように適合された任意の数の構築物／ベクターが、メチル化構築物／ベクターを生成するために使用され得る。

産生方法

本発明は、本発明の組換え微生物を使用して、ＣＯを含む基質を発酵させることを含む微生物発酵により、ＭＥＫおよび／または２−ブタノール、ならびに任意に１つ以上の他の産物を産生するための方法を提供する。好ましくは、ＭＥＫおよび／または２−ブタノールが主な発酵産物である。本発明の方法は、産業プロセスからの総合的な大気中への炭素放出を減少するために使用され得る。

好ましくは、発酵は、本発明の組換え微生物を使用して、バイオリアクター内の基質を嫌気的に発酵させて、少なくともＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生するステップを含む。

一実施形態では、本方法は、
（ａ）本発明の１つ以上の微生物の培養物を収容するバイオリアクターに、ＣＯを含む基質を提供するステップと、
（ｂ）バイオリアクター内の培養物を嫌気的に発酵させて、少なくともＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生するステップと、を含む。

一実施形態では、本方法は、
（ａ）ガスが大気中に放出される前に、産業プロセスの結果として産生されたＣＯ含有ガスを捕捉するステップと、
（ｂ）本発明の１つ以上の微生物を含有する培養物によって、ＣＯ含有ガスを嫌気的に発酵させて、少なくともＭＥＫおよび／または２−ブタノールを産生するステップと、を含む。

本発明の特定の一実施形態では、微生物によって発酵されたガス状基質は、ＣＯを含有するガス状基質である。ガス状基質は、産業プロセスの副産物として得られたＣＯ含有廃棄ガス、または自動車の排気ガスなどのいくつかの他の供給源からであり得る。ある特定の実施形態では、産業プロセスは、製鋼所などの鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、電力生産、カーボンブラック生産、アンモニア生産、金属生産、およびコーク製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、ＣＯ含有ガスは、任意の従来の方法を使用して、大気中に放出される前に、産業プロセスから捕捉され得る。ＣＯは、合成ガス（一酸化炭素および水素を含むガス）の成分であり得る。産業プロセスから産生されたＣＯは、通常、ＣＯ_２を産生するために燃焼処理され、したがって、本発明は、ＣＯ_２グリーンハウスガス放出の減少、およびバイオ燃料として使用するためのブタノールの産生に特定の有用性を有する。ガス状のＣＯ含有基質の組成により、発酵に導入する前に、塵粒子などの任意の望ましくない不純物を除去するために、基質を処理することが望ましい場合もある。例えば、ガス状基質は、既知の方法を使用して、濾過されるか、またはスクラブ洗浄され得る。

細菌の成長およびガスから少なくともＭＥＫおよび／または２−ブタノールが生じるために、ＣＯ含有基質ガスに加えて、好適な液体栄養培地がバイオリアクターに供給される必要があることを理解する。基質および培地は、連続、バッチ、またはバッチ供給様式でバイオリアクターに供給され得る。栄養培地は、使用される微生物の成長を可能にするのに十分なビタミンおよびミネラルを含有する。ＣＯを使用して１つ以上の産物を産生するための発酵に好適な嫌気性培地は、当該技術分野において既知である。例えば、好適な培地は、Ｂｉｅｂｅｌ（２００１）に記載されている。本発明の一実施形態では、培地は、本明細書の後の実施例セクションに記載される通りである。

発酵は、ガスから少なくともＭＥＫおよび／または２−ブタノール発酵が生じるための適切な条件下で望ましく行われるべきである。考慮されるべき反応条件は、圧力、温度、ガスの流速、液体の流速、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、攪拌速度（連続攪拌槽型反応器を使用する場合）、接種材料レベル、液相中のＣＯが制限されないことを確実にするための最大ガス基質濃度、および生産物阻害を回避するための最大産物濃度を含む。

加えて、基質流のＣＯ濃度（またはガス状基質におけるＣＯ分圧）を増加することが望ましい場合が多く、よって、ＣＯが基質である発酵反応の効率を増加する。ＣＯが少なくともＭＥＫおよび／または２−ブタノールの産生のための炭素源として微生物によって取り込まれる場合、増加した圧力で運転することにより、ガス相から液相へのＣＯ移行速度の大幅な増加を可能にする。これは、同時に、バイオリアクターが大気圧ではなく高圧で維持されるとき、保持時間（バイオリアクター中の液体容量を流入されるガス流速で割ることにより定義される）を減少させることができることを意味する。最適な反応条件は、一部、使用される本発明の特定の微生物に依存する。しかしながら、一般的に、発酵は大気圧より高い圧力で実施されることが好ましい。また、所与のＣＯから少なくともＭＥＫおよび／または２−ブタノールへの変換速度が、一部、基質保持時間の関数であり、同時に、望ましい保持時間の達成がバイオリアクターの必要容量を決定するため、加圧系の使用は、必要とされるバイオリアクターの容量を大幅に減少し、したがって、発酵設備の資本費用を削減することができる。米国特許第５，５９３，８８６号に記載される例によると、反応容量は、反応器運転圧力の増加に比例して線形に減少し得る、即ち、１０気圧で運転されるバイオリアクターは、１気圧で運転されるものの容量の１０分の１を必要とするのみである。

例として、高圧でガスからエタノールへの発酵を行う利点が記載された。例えば、第ＷＯ０２／０８４３８号は、それぞれ、１５０ｇ／ｌ／日および３６９ｇ／ｌ／日のエタノール生産性を得るために、３０ｐｓｉｇおよび７５ｐｓｉｇの圧力下で実施されたガスからエタノールへの発酵を説明する。しかしながら、大気圧で類似する培地および流入ガス組成物を用いて実施される例示的な発酵は、１日１リットル当たり１０〜２０倍少ないエタノールを産生することが分かった。

ＣＯ含有ガス状基質の導入速度は、液相中のＣＯの濃度が制限されないことを確実にするようなものであることも望ましい。これは、ＣＯが制限された条件の結果が１つ以上の産物が培養物によって消費される場合があるためである。

発酵反応を供給するために使用されるガス流の組成物は、反応の効率および／または費用に大きな影響を有し得る。例えば、Ｏ_２は、嫌気性発酵プロセスの効率を減少し得る。発酵前または発酵後の発酵プロセスの段階における望ましくない、または不必要なガスの処理は、そのような段階の負担を増加し得る（例えば、ガス流がバイオリアクターに入る前に圧縮され、不必要なエネルギーが発酵に必要ではないガスを圧縮するために使用され得る場合）。したがって、基質流、具体的には産業源に由来する基質流を処理し、望ましくない成分を除去し、望ましい成分の濃度を増加することが望ましい場合がある。

ある特定の実施形態では、本発明の微生物の培養物が水性培養培地に維持される。好ましくは、水性培養培地は、最小嫌気性微生物成長培地である。好適な培地は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，１７３，４２９号および第５，５９３，８８６号ならびに第ＷＯ０２／０８４３８号に記載されており、本明細書の後の実施例のセクションにおいて記載される通りである。

ＭＥＫおよび／もしくは２−ブタノール、またはＭＥＫおよび／もしくは２−ブタノールならびに／または１つ以上の他の産物を含有する混合流は、例えば液−液抽出を含む分留もしくは蒸発、浸透気化、ガスストリッピングおよび抽出発酵などの当該技術分野において既知の方法によって発酵ブロスから回収され得る。さらなる例として、ブタノールを抽出する方法は、Ｋoｐｋｅ＆Ｄuｒｒｅ，２０１１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｂｕｔａｎｏｌ，Ｉｎ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｂｉｏｆｕｅｌｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｅｄｓ．：Ｌｕｑｕｅ，Ｃａｍｐｅｌｏ＆Ｃｌａｒｋ），Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｌｔｄ，Ｃａｍｅｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ：２２１−２５７に記載されている。

本発明のある特定の好ましい実施形態では、ＭＥＫおよび／または２−ブタノールおよび１つ以上の産物は、バイオリアクターからブロスの一部分を連続して除去し、ブロスから微生物細胞を単離し（適宜濾過により）、ブロスから１つ以上の産物を回収することにより、発酵ブロスから回収される。アルコールは、例えば、蒸留により適宜回収され得る。アセトンは、例えば、蒸留により回収され得る。産生された任意の酸は、例えば、活性炭上に吸着することにより回収され得る。分離された微生物細胞は、好ましくは、発酵バイオリアクターに戻される。任意のアルコール（複数可）および酸（複数可）が除去された後の無細胞透過液も、好ましくは、発酵バイオリアクターに戻される。さらなる栄養素（ビタミンＢなど）が無細胞透過液に添加され、バイオリアクターに戻される前に栄養培地を補給することができる。

また、酢酸の活性炭への吸着を強化するためにブロスのｐＨが上述のように調節される場合、ｐＨは、バイオリアクターに戻される前に、発酵バイオリアクター中のブロスに類似するｐＨに再調節されるべきである。

実施例

本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例を参照して、より詳細に説明される。
微生物

Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１およびＤＳＭ２３６９３（ＤＳＭ１００６１の誘導体）ならびにＣ．リュングダリイＤＳＭ１３５２８は、ＤＳＭＺ（Ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａsｅ ７ Ｂ，３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。成長は、厳密な嫌気性条件および技法を用いて、３７℃で行われた（Ｈｕｎｇａｔｅ，１９６９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３Ｂ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１１７−１３２、Ｗｏｌｆｅ，１９７１，Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６：１０７−１４６）。酵母抽出物（表１１）を含まない既知組成ＰＥＴＣ培地、および唯一の炭素およびエネルギー源として、製鋼所の廃ガス（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｓｔｅｅｌ ｓｉｔｅ ｉｎ Ｇｌｅｎｂｒｏｏｋ，ＮＺから収集、組成：４４％のＣＯ、３２％のＮ２、２２％のＣＯ２、２％のＨ２）を含有する３０ｐｓｉの一酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｉｏｘｉｄｅ）が使用された。
代謝産物の分析

タンパク質および他の細胞残留物を除去するために、４００μｌのサンプルを１００μｌの２％（ｗ／ｖ）５−スルホサリチル酸と混合し、１４，０００×ｇで３分間遠心分離し、沈殿した残留物を分離した。次に、分析のために、１０μｌの上清をＨＰＬＣに注入した。２，３−ブタンジオール、２−ブタノール、および他の代謝産物のＨＰＬＣ分析は、３５℃で運転されるＲＩＤ（屈折率検出器）および３５℃に保たれたＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラム（３００×７．８ｍｍ、粒径９μｍ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣシステムを用いて行われた。移動相としてわずかに酸性化された水（０．００５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４）を使用し、流量は０．６ｍｌ／分であった。２，３−ブタンジオール立体異性体を区別するために、３５℃で運転されるＲＩＤ（屈折率検出器）および６０℃に保たれたＡｌｌｔｅｃｈ ＩＯＡ−２０００有機酸カラム（１５０×６．５ｍｍ、粒径８μｍ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣシステムを用いて、ＨＰＬＣ分析を行った。移動相としてわずかに酸性化された水（０．００５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４）を使用し、流量は０．２５ｍｌ／分であった。

アルコールデヒドロゲナーゼによるＣ．オートエタノゲナムにおけるＭＥＫの２−ブタノールへの変換

アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ；ＥＣ１．１．１．２）は、ＭＥＫを２−ブタノールに変換することができるカルボキシド栄養性Ｃ．オートエタノゲナムのゲノム（ＰＣＴ／ＮＺ２０１２／００００２２に記載される）において特定された。この酵素は、ＭＥＫを２−ブタノールに変換することが記載されるＣ．ベイジェリンキ（Ｉｓｍａｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９３，１７５：５０７９−５１０５）のアルコールデヒドロゲナーゼに対して相同性を有する。

この活性を確認するために、カルボキシド栄養性酢酸産生菌Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ、およびＣ．ラグスダレイを用いた成長実験が、ＰＥＴＣ培地（表１）および唯一の炭素およびエネルギー源として製鋼所の廃ガス（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｓｔｅｅｌ ｓｉｔｅ ｉｎ Ｇｌｅｎｂｒｏｏｋ，ＮＺから収集、組成：４４％のＣＯ、３２％のＮ２、２２％のＣＯ２、２％のＨ２）を含む５０ｍＬの血清ボトル中で行われた。対数成長中、５ｇ／ＬのＭＥＫが培養物に添加された。成長の終わりに、ＭＥＫは残っていなかったが、等量の２−ブタノールが検出された（表４）。酵素アッセイは、Ｃ．オートエタノゲナムの粗抽出物を用いて、Ｉｓｍａｉｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９３，１７５：５０７９−５１０５）に従い行われ、活性は、基質としてＭＥＫ、および補助因子としてＮＡＤＰＨを用いて良好に検出することができた。

活性のさらなる検査として、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現ベクター内にクローン化し、大腸菌において過剰産生し、ＭＥＫを２−ブタノールに変換する活性について測定した。

遺伝子をゲノムＤＮＡから増幅し、以下のレシピによりＫｐｎｌおよびＨｉｎｄＩＩＩを介してｐＢＡＤベクター内にクローン化した。増幅したＡＤＨ遺伝子を同様にＫｐｎＩ−ＨＦおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、電気穿孔により大腸菌ＭＣ１０６１細胞内に形質転換した。ＡＤＨ遺伝子の配列をＤＮＡ配列決定により確認した。ＯＤ_６００が０．８に達するまで、形質変換された細胞を、３７℃でアンピシリンを含む１００ｍＬのＬＢ中で成長させた。この時点で、１ｍＬの２０％アラビノースを添加し、残りの発現中、培養物を２８℃でインキュベートした。細胞をペレット化し、上清をデカントした。次いで、ペレットをＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳおよび０．２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、それぞれ０．２μＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ，２５単位／μＬ）およびｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（Ｍｅｒｃｋ，３０ｋＵ／μＬ）を添加した。次いで、アルコールデヒドロゲナーゼは、固定化金属親和性クロマトグラフィーを使用して、縮合Ｎ末端Ｈｉｓ_６タグを介して精製された。氷上で３０分インキュベートした後、細胞を音波処理により溶解し、不溶性細片をペレット化し、０．２ミクロンのフィルタを使用して、上清を清澄した。清澄した上清を、溶解緩衝液で十分に洗浄したＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に添加した。精製のために５００μＬの床容量を使用し、４℃で１時間、タンパク質をＴａｌｏｎ樹脂に結合させ、その後、数回溶解緩衝液で洗浄した。１５０ｍＭのイミダゾールで補足された溶解緩衝液を使用して、カラムからタンパク質を溶出し、溶離液を５００μＬの画分に収集した。精製プロセスを通した様々な段階で採取したアリコートならびに全ての溶出画分をＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで処理して、タンパク質の存在を確認し、精製の成功を判断した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４遠心式フィルタユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、タンパク質は貯蔵緩衝液中（５０ｍＭのリン酸カリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％ｖ／ｖのグリセロール、ｐＨ７．０）に交換された。大腸菌において発現される場合、タンパク質は高度に可溶性であり、容易に精製することができた。補助因子として０．２ｍＭの濃度のＮＡＤＰＨ、および基質として３ｍＭのＭＥＫを使用して、石英キュベットを備えたＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計で活性アッセイが行われた。アッセイ混合物は、１ｍＭのＤＴＴを含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を含有した。基質としてＭＥＫを用いたアルコールデヒドロゲナーゼは活性を示し、４４±２秒^−１のＫ_ｃａｔ、１．２±０．１ｍＭのＫ_Ｍを有し、得られたＫｃａｔ／Ｋ_Ｍは３．８ｘ１０^４秒^−１ｍＭ^−１であった。

クレブシエラ・オキシトカからのジオールデヒドラターゼ遺伝子（ｐｄｄＡＢＣ）を有するクロストリジウムの発現プラスミドの構築

標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローン化技法が使用された［Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｒｏｔａｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ，Ｍｏｏｒｅ ＤＤ，Ｓｅｉｄｍａｎ ＪＧ，Ｓｍｉｔｈ ＪＡ，Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ，１９８７］。

ホスホトランスアセチラーゼ−酢酸キナーゼオペロン（Ｐｐｔａ−ａｃｋ）（配列番号１）のプロモーター領域は、プライマーＰｐｔａ−ａｃｋ−ＮｏｔＩ−Ｆ（配列番号２：ＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣ）およびＰｐｔａ−ａｃｋ−ＮｄｅＩ−Ｒ（配列番号３：ＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＴＴＣＣＴＣＣ）を用いて、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１のゲノムＤＮＡから増幅され、ＮｏｔＩおよびＮｄｅＩ制限部位を用いて大腸菌−クロストリジウムシャトルベクターｐＭＴＬ８３１５１（ＦＪ７９７６４７．１；Ｎｉｇｅｌ Ｍｉｎｔｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）内にクローン化され［Ｈｅａｐ ＪＴ，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ＯＪ，Ｃａｒｔｍａｎ ＳＴ，Ｍｉｎｔｏｎ ＮＰ．Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９，７８：７９−８５］、プラスミドｐＭＴＬ８３１５５を生成した。

クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ）・オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１からのゲノムＤＮＡは、Ｂｅｒｔｒａｍ ａｎｄ Ｄuｒｒｅ（１９８９）による改善された方法を使用して単離された。１００−ｍｌの一晩培養物を採取し（６，０００×ｇ、１５分、４℃）、リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）で洗浄し、１．９ｍｌのＳＴＥ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのスクロース、ｐＨ８．０）に懸濁した。３００μｌのリゾチーム（約１００，０００Ｕ）を添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、２８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液を添加し、さらに１０分間インキュベートした。２４０μｌのＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ、ｐＨ８）、２０μｌのトリス−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ７．５）、および１０μｌのＲＮａｓｅ Ａ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を添加することにより、ＲＮＡを室温で消化した。次に、１００μｌのプロテイナーゼＫ（０．５Ｕ）を添加し、タンパク質分解は、３７℃で１〜３時間行われた。最後に、６００μｌのナトリウム過塩素酸塩（５Ｍ）を添加し、その後、フェノール−クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿を行った。ＤＮＡの量および質は、分光光度的に検査された。

クレブシエラ・オキシトカｐｄｄＡＢＣからのジオールデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．２８，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｄ４５０７１）をコードする遺伝子は、さらなるサブクローン化のためにＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位に隣接されるクロストリジウム・オートエタノゲナム（配列番号４）のために最適化されたコドンを有する単一のオペロンにおいて合成された。ｐｄｄＡＢＣオペロンは、次に、制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを使用して、ｐＵＣ５７ベクターからｐＭＴＬ８３１５５内にサブクローン化された。

ｐｄｄＡＢＣ発現プラスミドのＣ．オートエタノゲナムへの導入

プラスミドｐＭＴＬ８３１５５−ｐｄｄＡＢＣは、上述の方法を使用して、Ｃ．オートエタノゲナムを形質転換するために使用された。１５μｇ ｍＬ^−１のチアンフェニコールを含有するＹＴＦ−寒天（８ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．５ｇ／Ｌのフルクトース、および７．５ｇ／Ｌの寒天、ｐＨ５．８）で成長を行い、３０ｐｓｉの実在工場ガス中で、３７℃でインキュベートした。単一のコロニーを、１５μｇ ｍＬ^−１チアンフェニコールを含有するＰＥＴＣ−ＭＥＳ−寒天（表１、炭酸塩緩衝液の代わりにＭＥＳ、フルクトースなし）上に再画線（ｒｅｓｔｒｅａｋｅｄ）し、次いで、１５μｇ ｍＬ^−１チアンフェニコールおよび０．５％のフルクトースを含有するＰＥＴＣ−ＭＥＳ−寒天上に再画線した。複数のコロニーをフルクトースと共にプレートから拾い上げ、３０ｐｓｉの実在工場ガスを含むＢａｌｃｈ管において０．５％のフルクトースを含む３ｍＬのＰＥＴＣ−ＭＥＳ中で成長させた。プラスミドの存在はＰＣＲにより確認された。

Ｃ．オートエタノゲナムにおけるジオールデヒドラターゼのインビボ活性試験

ｐＭＴＬ８３１５５−ｐｄｄＡＢＣを有するＣ．オートエタノゲナムの株を、メソ−２，３−ブタンジオールの存在下で成長させ、対照としての野生型と比較した。成長培地が５ｇ Ｌ^−１のメソ−２，３−ブタンジオールで補足された場合、成長の９２時間後、１２ｍｇ Ｌ^−１２−ブタノールが形質転換された株の培養物中で検出されたが、野生型においては何も検出されなかった（表５）。理論に拘束されることなく、執筆者は、ジオールデヒドラターゼはメソ−２３ＢＤＯをＭＥＫに変換する一方、上述のＣ．オートエタノゲナムに存在するアルコールデヒドロゲナーゼ活性はＭＥＫを２−ブタノールに変換すると考える。


再活性化因子タンパク質ｄｄｒＡＢの同時発現によるメソ−ＢＤＯのＭＥＫへの変換の改善

２，３−ブタンジオールとのジオールデヒドラターゼＰｄｄＡＢＣ酵素複合体の反応は、産物形成をもたらすが、酵素複合体の不活性化ももたらす（Ｂａｃｈｏｖｉｎら、１９７７）。Ｋ．オキシトカのような未変性生物において、損傷した酵素複合体を再活性化することができるさらなる酵素が存在する（Ｍｏｒｉ Ｋ．ら、１９９７）。メソ−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換の効率を改善するために、適切な再活性化因子タンパク質（ＹＰ＿００５０１６２７８および）がジオールデヒドラターゼ遺伝子と同時発現される。Ｋ．オキシトカからの再活性化因子タンパク質遺伝子（遺伝子ＩＤ：１１６６０４２８および）ｄｄｒＡＢは、制限部位ＳａｃＩおよびＫｐｎＩに隣接されるＣ．オートエタノゲナム（配列番号６）のために最適化されたコドンを用いて合成される。ｄｄｒＡＢオペロンは、制限酵素ＳａｃＩおよびＫｐｎＩと共にｐＭＴＬ８３１５５−ｐｄｄＡＢＣにクローン化される。生成されたベクターｐＭＴＬ８３１５５−ｐｄｄＡＢＣ−ｄｄｒＡＢは、メソ−２，３−ブタンジオールのＭＥＫおよび２−ブタノールへの変換を改善するために上述されるＣ．オートエタノゲナムを形質転換するために使用される。

メソ−２，３−ブタンジオールを産生するための遺伝子を伴う発現プラスミドの構築および大腸菌におけるインビボ試験

Ｃ．オートエタノゲナムにおいてメソ−２，３−ブタンジオールを産生するために、発明者は、Ｃ．オートエタノゲナムにおいて中間体として存在する（Ｒ）−アセトインをメソ−２，３−ブタンジオールに変換することができるクレブシエラ・ニューモニエからｂｕｄＣ（ＥＣ １．１．１．３０３，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＹＰ＿００１３３５７１９）を特定した。この遺伝子は、（配列番号５）によりクロストリジウム・オートエタノゲナムのために最適化されたコドンを用いて合成され、さらなるサブクローン化のためにＳａｌＩおよびＸｈｏＩ制限部位に隣接されるクローン化ベクターｐＢＳＫに受容された。ピルビン酸塩からのアセトインの合成は、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）およびアセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＡＬＤＣ）の連続作用を必要とし、そのように、これら２つの遺伝子を構築するプラスミドが構築された。最初に、ホスホトランスアセチラーゼ−酢酸キナーゼオペロン（Ｐｐｔａ−ａｃｋ）（配列番号１）のプロモーター領域は、プライマーＰｐｔａ−ａｃｋ−ＮｏｔＩ−Ｆ（配列番号２：ＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣ）およびＰｐｔａ−ａｃｋ−ＮｄｅＩ−Ｒ（配列番号３：ＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＴＴＣＣＴＣＣ）を用いて、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１のゲノムＤＮＡから増幅され、ＮｏｔＩおよびＮｄｅＩ制限部位を用いて、大腸菌−クロストリジウムシャトルベクターｐＭＴＬ８５１４１（ＦＪ７９７６５１．１；Ｎｉｇｅｌ Ｍｉｎｔｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）内にクローン化され［Ｈｅａｐ ＪＴ，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ＯＪ，Ｃａｒｔｍａｎ ＳＴ，Ｍｉｎｔｏｎ ＮＰ．Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９，７８： ９−８５］、プラスミドｐＭＴＬ８５１４５を生成した。その後、Ｃ．オートエタノゲナムからの遺伝子ａｌｓを、プライマーａｌｓ−ＮｄｅＩ−Ｆ（配列番号７：ＧＧＡＡＧＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＧＡＧＡＴＡＴ）およびａｌｓ−ＥｃｏＲ１−Ｒ（配列番号８：ＧＧＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＴＧＧＴＴＴＡＡＴＡＧＡＴＡＡＴＧＣ）を用いて増幅し、得られた増幅産物を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲ１制限部位を用いてｐＭＴＬ８５１４５内にクローン化した。次いで、プライマーＡＬＤＣ−ＥｃｏＲ１−Ｆ（配列番号９：ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＴＡＧＡＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＡＴＧＧ）およびＡＬＤＣ−ＳａｃＩ−Ｒ（配列番号１０：ＧＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＴＡＴＣＴＣＡ）を用いて、増幅によりＡＬＤＣをこのプラスミド内に付加し、次に、制限部位ＥｃｏＲ１およびＳａｃＩを用いてクローン化し、プラスミドｐＭＴＬ８５１４５−ＡＬＳ−ＡＬＤＣを生成した。ｂｕｄＣ遺伝子は、ｐＭＴＬ８５１４５−ＡＬＳ−ＡＬＤＣ内にクローン化された。この構築物は、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｌｉ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ（ＧＣＳＣ）から得た大腸菌ＪＷ１３７５−１（ｌｄｈＡ７４４（ｄｅｌ）：：ｋａｎ）を形質転換するために使用された。得られた株を、２％のグルコースを含むＭ９培地中で嫌気的に成長させ、株は、対照としてｐＭＴＬ８５１４５−ＡＬＳ−ＡＬＤＣ−ｓｅｃＡｄｈ５９３を有する。対照株は、（Ｄ）−（−）−２，３−ブタンジオールを産生し、検出可能なメソ−−２，３−ブタンジオールは産生しなかった（図２）。ｂｕｄＣを含む構築物を有する株は、３１０ｍｇ Ｌ^−１のメソ−（Ｒ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールおよび少量の（Ｄ）−（Ｒ，Ｒ）−２，３−ブタンジオールを産生した（図２）。

一酸化炭素からのメソ−ＢＤＯの産生
Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３のＤ−（−）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼの不活性化：

Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３においてＤ−（−）−２，３−ＢＤＯ産生に関与する２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（２，３−ｂｄｈ）遺伝子は、ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン媒介遺伝子破壊ツールを用いて不活性化された（Ｈｅａｐら、２０１０）。合成され、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５ベクターに送達された２，３−ｂｄｈ遺伝子のセンス鎖上の塩基４６８と４６９との間のグループＩＩイントロン標的部位を特定するために、ＣｌｏｓＴｒｏｎ．ｃｏｍに設けられたＰｅｒｕｔｋａアルゴリズムが使用された。最終ベクターｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−２，３ｂｄｈ−４６８！４６９ｓ（配列番号１１）は、標的部位内への挿入時に抗生物質クラリスロマイシンへの耐性を付与するレトロ転位活性化ｅｒｍＢマーカー（ＲＡＭ）を含有した。

ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−２，３ｂｄｈ−４６８！４６９ｓプラスミドは、上述のように、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３内に導入された。単一コロニーの画線は、最初に１５μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含有するＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地、続いて、５μｇ／ｍｌのクラリスロマイシンを含有するＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地を有する寒天プレート上で順次行われた。２，３−ｂｄｈ遺伝子のグループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーＯｇ４２ｆ（配列番号１２）およびＯｇ４３ｒ（配列番号１３）を用いて、グループＩＩイントロン挿入に関して、ＰＣＲによりプラスミド当たり４つのコロニーをランダムにスクリーニングした。Ｍａｘｉｍｅ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘキットをＰＣＲに使用した。１６ｓ ｒＤＮＡも、プライマーｆＤ１（配列番号１４）およびｒＰ２（配列番号１５）ならびにＭａｘｉｍｅ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘキットを使用してＰＣＲ増幅された。

２，３ｂｄｈ遺伝子破壊の確認

プライマーＯｇ４２ｆ／Ｏｆ４３ｒによる３７５ｂｐのＰＣＲ産物の増幅は、未修飾の野生型２，３−ｂｄｈ遺伝子を示す。同じプライマー一式を使用した約２ｋｂのＰＣＲ産物の増幅は、標的遺伝子におけるＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロンの挿入を示す。２，３−ｂｄｈ遺伝子を標的とした４つ全てのクローンは、約２ｋｂのＰＣＲ産物の増幅に見られるように、遺伝子破壊に対して陽性である（図３）。これらの結果は、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３における２，３−ｂｄｈ遺伝子の破壊を裏付ける。

メソ−２，３−ブタンジオール産生デヒドロゲナーゼの発現
発現ベクターの構築：

Ｃ．オートエタノゲナムにおいてメソ−２，３−ブタンジオールを産生するために、発明者は、Ｃ．オートエタノゲナムにおいて中間体として存在する（Ｒ）−アセトインをメソ−２，３−ブタンジオールに変換することができるＫ．ニューモニエからｂｕｄＣ（ＥＣ１．１．１．３０３，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＹＰ＿００１３３５７１９）を特定した。この遺伝子は、さらなるサブクローン化のためにＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位に隣接されるクロストリジウム・オートエタノゲナム（配列番号５）のために最適化されるコドンを用いて合成された。最初に、ホスホトランスアセチラーゼ−酢酸キナーゼオペロン（Ｐｐｔａ−ａｃｋ）のプロモーター領域を、ｐＭＴＬ８５１４５ ＮｏｔＩおよびＮｄｅＩ制限部位から切断し、ＮｏｔＩおよびＮｄｅＩで切断されたｐＭＴＬ８３１５１（ＦＪ７９７６５１．１；Ｎｉｇｅｌ Ｍｉｎｔｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）内にクローン化し［Ｈｅａｐ ＪＴ，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ＯＪ，Ｃａｒｔｍａｎ ＳＴ，Ｍｉｎｔｏｎ ＮＰ．Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９，７８：７９−８５］、ｐＭＴＬ８３１５５を生成した。制限部位ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを使用して、Ｋ．ニューモニエからのｂｕｄＣ遺伝子をｐＭＴＬ８３１５５内にクローン化し、ｐＭＴＬ８３１５５−ＫｐＢＤＨを生成した。

Ｃ．オートエタノゲナムの転換

ＣＯからメソ−２，３−ブタンジオールを産生するために、発現プラスミドｐＭＴＬ８３１５５−ＫｐＢＤＨを使用して、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３を形質転換し、チアンフェニコール（１５ｍｇ Ｌ^−１）選択による上述の方法を用いて破壊された２，３−ｂｄｈ遺伝子を用いて突然変異体を生成した。

形質転換されたＣ．オートエタノゲナムにおけるメソ−２，３−ブタンジオール産生

メソ−２，３−ブタンジオールの産生を試験するために、２バール（ｇ）の２−ｍＬの培養物中で、形質転換された株を実在工場ガスで成長させた。分断された未変性２，３−ｂｄｈ遺伝子を有する突然変異体の背景において、メソ−２，３−ブタンジオールは、３７０±７０ｍｇのＬ−１（９つのサンプルの平均、±１標準偏差）を産生し（図４）、メソ−２，３−ブタンジオールに対するＤ−（−）−２，３ブタンジオールは５．４：１の割合であった。この成長実験のサンプルは、メソ−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現に関して、ｑＲＴ−ＰＣＲにより分析された（以下を参照）。

持続攪拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）中の形質転換されたＣ．オートエタノゲナムにおけるメソ−２，３−ブタンジオール産生

約１５００ｍＬの溶液Ａ（表６）を、１．５Ｌの発酵槽内に移し、窒素と共に散布した。レサズリン（１．５ｍＬの２ｇ／Ｌ溶液）およびＨ３ＰＯ４（８５％溶液、２．２５ｍＬ）を添加し、濃縮ＮＨ４ＯＨ（ａｑ）を用いて、ｐＨを５．０に調節した。１．５ｍｌの溶液Ｃの前に、ニトリロ三酢酸（０．３ｍｌの０．１５Ｍ溶液）を添加した（表６）。この次に、ＮｉＣｌ２（０．７５ｍｌの０．１Ｍ溶液）およびＮａ２ＷＯ３（１．５ｍＬの０．０１Ｍ溶液）を添加した。１５ｍｌの溶液Ｂ（表６）を添加し、５０ｍＬ／分でＣＯ含有ガス（５０％のＣＯ、２８％のＮ２、２％のＨ２、２０％のＣＯ２）に交換する前に、溶液をＮ２と共に散布した。次に、発酵槽を、プラスミドｐＭＴＬ８３１５５−ＫｐＢＤＨおよび破壊されたＤ−（−）−２，３−ビタン（ｂｙｔａｎｅ）ジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む２００ｍｌのクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物で播種した。発酵槽を３７℃に維持し、２００ｒｐｍで攪拌した。この実験中、Ｎａ２Ｓ溶液（０．２Ｍ溶液）は、約０．１ｍｌ／時間の速度で添加された。基質の供給は、微生物の培養物の必要に応じて増加された。

発酵プロファイルは、図５に示される。メソ−ＢＤＯの産生は、０．２ｇ／Ｌの濃度およびＤ−（−）−形態との１：１の割合の複数のサンプリング点にわたって連続発酵において確認された（図５＋６）。この反応器のサンプルは、メソ−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現に関して、ｑＲＴ−ＰＣＲにより分析された（以下を参照）。

サンプリングおよび分析手順

培地サンプルは、各発酵の過程にわたって間隔を置いてＣＳＴＲ反応器から採取された。培地がサンプル採取されるたびに、ガスが反応器に入る、または反応器から漏れないことを確実にするための注意が払われた。

ＨＰＬＣ：

ＨＰＬＣシステムＡｇｉｌｅｎｔ１１００ シリーズ．移動相：０．００２５Ｎの硫酸。流量および圧力：０．８００ｍＬ／分。カラム：Ａｌｌｔｅｃｈ ＩＯＡ；カタログ＃９６４８、１５０×６．５ｍｍ、粒径５μｍ。カラムの温度：６０°Ｃ。検出器：屈折率。検出器の温度：４５°Ｃ。

サンプルの調製方法：

４００μＬのサンプルと、５０μＬの０．１５Ｍ ＺｎＳＯ４と、５０μＬの０．１５Ｍ Ｂａ（ＯＨ）２をエッペンドルフチューブ内に充填する。チューブを４°Ｃで１０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離する。２００μＬの上清をＨＰＬＣバイアルに移し、５μＬをＨＰＬＣ計器に注入する。

頭部空間の分析：

測定は、２つの設置されたチャネルを備えたＶａｒｉａｎ ＣＰ−４９００マイクロＧＣで行われた。チャネル１は、７０ｏＣ、２００ｋＰａのアルゴン、および４．２秒のバックフラッシュ時間で運転される１０ｍのＭｏｌ−ｓｉｅｖｅカラムであり、一方、チャネル２は、９０ｏＣ、１５０ｋＰａのヘリウム、およびバックフラッシュなしで運転される１０ｍのＰＰＱカラムであった。両チャネルの注入器の温度は、７０ｏＣであった。運転時間は１２０秒に設定されたが、関心のピークはすべて、通常、１００秒前に溶出された。

細胞密度：

細胞密度は、発酵ブロスの定義されたアリコート中の細菌数を数えることにより決定された。代替えとして、サンプルの吸光度が６００ｎｍで測定され（分光光度計）、乾燥質量は公開されている手順に従い計算により決定された。

メソ−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼｂｕｄＣ遺伝子発現の発現：

ｑＲＴ−ＰＣＲ実験は、１２ウェルプレートおよび上述の連続発酵の成長研究において、Ｃ．オートエタノゲナムにおけるメソ−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼｂｕｄＣ遺伝子の導入の良好な発現を確認するために行われた。オリゴヌクレオチド対ＫｐＢＤＨ−ＦおよびＲを用いて、増幅は野生型株に観察されなかったが、両方の成長試験のプラスミドｐＭＴＬ８３１５５−ＫｐＢＤＨを保有する株に関して、類似するレベルでシグナルが測定され、メソ−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼｂｕｄＣ遺伝子の良好な発現を確認した（図７）。

１２ウェルプレートの成長実験の１ｍＬのサンプル（実験１）および連続反応器から４，５ｍＬのサンプル（実験２）を採取した。サンプルは収集直後抽出された。培養物を遠心分離した（５，０００×ＲＰＭ、１０分、４℃）。プロトコルに従い、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて全ＲＮＡを単離した。細胞の破壊は、１分の振盪と１分の氷を折衷する３サイクルで、ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ）を用いて実行され、溶出は５０μＬのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水中で行われた。ＴＵＲＢＯＴＭ ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用したＤＮａｓｅ Ｉ処理後、次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ 逆転写酵素キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、逆転写ステップを実行した。ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＲＮＡを調べた。非ＲＴ対照は、全オリゴヌクレオチド対に関して行われた。全てのｑＲＴ−ＰＣＲ反応は、２ｎｇ／μＬのｃＤＮＡテンプレート、６７ｎＭの各オリゴヌクレオチド（表７）、および１×ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含む合計２５μＬの反応容量において、ＭｙｉＱ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｏｌｏｕｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて３つ組で行われた。反応条件は、９５℃で１０分間、その後、９５°Ｃで１５秒、および７２°Ｃで１分間の４０サイクルであった。オリゴヌクレオチド二量体化または他の人工産物の増幅を検出するために、融解曲線分析は、ｑＰＣＲ（０．５℃／秒で４０℃〜９５℃の１１１サイクル）の完了直後に行われた。

一酸化炭素からのＭＥＫおよび２−ブタノールの産生

ＣＯから２−ブタノールを産生するために、クレブシエラ・肺炎からのメソ−２３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子ｂｕｄＣおよびクレブシエラ・オキシトカからのジオールデヒドラターゼ遺伝子ｐｄｄＡＢＣが、カルボキシド栄養性酢酸産生菌様クロストリジウム・オートエタノゲナム内に同時に導入される。２−ブタノールの代わりにＭＥＫを産生するために、アルコールデヒドロゲナーゼはノックアウトされる。

発現ベクターの構築

ＣＯからＭＥＫまたは２−ブタノールを産生するには、２，３−ブタンジオールをＭＥＫに変換することができるブタンジオールデヒドロゲナーゼおよびジオールデヒドラターゼを産生するメソ−２，３−ブタンジオールを必要とする。この目的のため、両遺伝子を発現するために発現ベクターが構築される。Ｋ．ニューモニエからのコドン最適化ｂｕｄＣ遺伝子がＳａｌＩおよびＸｈｏＩを伴うｐＢＳＫ−ＫｐＢＤＨから切断され、ｐＭＴＬ８３１５５−ｐｄｄＡＢＣのＳａｌＩ部位内にクローン化される。

Ｃ．オートエタノゲナムおよび誘導（ｄｅｖｉａｔｉｖｅ）株の形質転換

このベクターは、上述の不活性化未変性デヒドロゲナーゼを有するＣ．オートエタノゲナムおよび誘導株を形質転換するために使用される。次いで、様々な生成された株を工場ガスで成長させ、所望の代謝物の産生に関して試験した。

Ｄ−（−）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ両方のノックアウト

Ｄ−（−）−２，３−ブタンジオールの産生およびＭＥＫの２−ブタノールへの変換の両方を排除するために、未変性Ｄ−（−）−ブタンジオールデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼの両方が排除された。

これは、（ａ）相同組換え、および（ｂ）実施例１および実施例３に説明されるＣｌｏｓＴｒｏｎツールを用いた遺伝子をあまり破壊しないマーカーの２つの方法によって達成され得る。
（ａ）相同組換えによるΔ２，３ｂｄｈ ΔＳｅｃＡｄｈ二重ノックアウトＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３株：

２，３ｂｄｈ遺伝子の約１ｋｂ ５'（配列番号１６）および３'（配列番号１７）相同アームは、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅される。プライマーＯｇ１３ｆ（配列番号１８）／Ｏｇ１４ｒ（配列番号１９）およびＯｇ１５ｆ（配列番号２０）／Ｏｇ１６ｒ（配列番号２１）は、それぞれ、５'および３'相同アームを増幅するために使用される。２つのＰＣＲ産物は、ｐＭＴＬ８５１５１−２，３ｂｄｈ−ＫＯを得るために、Ｓｂｆ１／Ｎｏｔ１部位とＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位との間のｐＭＴＬ８５１５１プラスミド内にクローン化される。このプラスミドは、上記の例において記載される抱合または電気穿孔のいずれかによりＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３内に導入される。チアンフェニコールプレートの選択後、形質転換体は、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物の配列決定用の２，３ｂｄｈの相同アームに隣接するプライマーＯｇ３３ｆ（配列番号２２）およびＯｇ３４ｒ（配列番号２３）を用いて、２，３ｂｄｈノックアウトに関してスクリーニングされる。

ＳｅｃＡｄｈ遺伝子ノックアウト用のプラスミドは、同様に構築することができる。２，３ｂｄｈ遺伝子の約１ｋｂ ５'（配列番号２４）および３'（配列番号２５）相同アームは、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３ゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ増幅される。プライマーＳｅｃ５ｆ（配列番号２６）／Ｓｅｃ５ｒ（配列番号２７）およびＳｅｃ３ｆ（配列番号２８）／Ｓｅｃ３ｒ（配列番号２９）は、それぞれ、５'および３'相同アームを増幅するために使用される。２つのＰＣＲ産物は、ｐＭＴＬ８５１５１−ＳｅｃＡｄｈ−ＫＯを得るために、Ｓｂｆ１／Ｎｏｔ１部位とＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位との間のｐＭＴＬ８５１５１プラスミド内にクローン化される。チアンフェニコールプレートの選択後、形質転換体は、ＰＣＲ用のＳｅｃＡｄｈ遺伝子の相同アームに隣接するプライマーＳｅｃＯ５ｆ（配列番号３０）およびＳｅｃＯ５ｒ（配列番号３１）を用いて、ＳｅｃＡｄｈノックアウトに関してスクリーニングされる。

Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３における２，３ｂｄｈまたはＳｅｃＡｄｈ遺伝子のいずれかのノックアウトを達成したら、ｐＭＴＬ８５１５１−２，３ｂｄｈ−ＫＯまたはｐＭＴＬ８５１５１−ＳｅｃＡｄｈ−ＫＯプラスミドのいずれかを用いて、これらの単一突然変異体の第２の遺伝子が標的とされる。プラスミドは、上述の電気穿孔のいずれかにより単一遺伝子ノックアウト突然変異体内に導入される。形質転換体は、対応する遺伝子の相同アームに隣接するプラスミドを用いて、第２の遺伝子のノックアウトに関してスクリーニングされ得る。

（ｂ）ＣｌｏｓＴｒｏｎを用いたΔ２，３ｂｄｈ ΔＳｅｃＡｄｈ二重遺伝子破壊：

ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン構築物におけるＲＡＭ ｅｒｍＢカセットは、フリッパーゼ組換え部位（Ｆｒｔ）に隣接される。抱合または電気穿孔のいずれかによってフリッパーゼリコンビナーゼをΔ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体内に導入することにより、約１．３ｋｂのＲＡＭ ｅｒｍＢマーカーは、突然変異体のゲノムから除去することができ、よって、ｅｒｍＢマーカーは再利用することができる。グループＩＩイントロンの約０．８ｋｂの断片は、ゲノム上に残される。これは、（ｉ）クラリスロマイシンに対するその感受性を試験する、および（ｉｉ）プライマーＯｇ４２ｆ（配列番号１２）およびＯｇ４３ｒ（配列番号１３）を有するグループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列決定により確認することができる。ＲＡＭ ｅｒｍＢマーカー（Δ２，３ｂｄｈ−ｅｒｍＢ ＣｌｏｓＴｒｏｎ）を含まないΔ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体を得たら、突然変異体のＳｅｃＡｄｈ遺伝子は、ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン挿入による不活性化ツールを用いて、類似する方法で標的とされる。塩基３９９と４００との間のイントロン挿入部位は、ＣｌｏｓＴｒｏｎ．ｃｏｍに設けられたＰｅｒｕｔｋａアルゴリズムを用いてＳｅｃＡｄｈ遺伝子において特定され、イントロン標的カセットが設計された（配列番号２２）。イントロン標的カセットは、ＤＮＡ２．０により商業的に合成され、抱合または電気穿孔のいずれかによりΔ２，３ｂｄｈ−ｅｒｍＢ ＣｌｏｓＴｒｏｎ 突然変異体内に導入され得るｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−ＳｅｃＡｄｈ−３９９！４００ｓとしてｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２ベクターに送達される。形質転換体は、チアンフェニコールおよびクラリスロマイシン寒天プレートに連続して選択され、上記に説明されるプライマーＳｅｃＣＴｆ（配列番号３３）およびＳｅｃＣＴｒ（配列番号３４）を用いてＰＣＲによりスクリーニングされ得る。

本発明は、読者が過度の実験をすることなく本発明を実践することができるように、ある特定の好ましい実施形態を参照して本明細書に説明されてきた。しかしながら、当業者は、多くの成分およびパラメータが、本発明の範囲から逸脱することなく、ある程度の変更もしくは修正、および既知の等価物に置換され得ることを容易に認識するだろう。そのような修正および等価物は、個々に記載されるかのように本明細書に組み込まれることを理解するべきである。表題、見出しなどは、本文献の読者の理解を深めるために提供され、本発明の範囲を制限するものと読み取られるべきではない。

上記および以下に引用される全ての出願、特許、および刊行物の全開示は、もしあれば、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書におけるいずれの出願、特許、および刊行物への参照は、それらが世界のいずれの国において妥当な先行技術を構成するか、または共通する一般知識の一部を形成するという認識もしくは提案のいかなる形態でもなく、そのように解釈されるべきではない。

明細書および以下の任意の請求項を通して、文脈上必要な場合以外は、用語「含む」、「含む」などは、排他的とは反対に包括的と解釈されるべきである、つまり、「〜含むが、これに限定されない」という意味である。

Claims (20)

1. メソ−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする外因性核酸と、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ酵素をコードする外因性核酸と、を含む、単離された遺伝子操作されたカルボキシド栄養性（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）酢酸産生性細菌であって、前記酵素を発現する、細菌。
2. 前記細菌が、Ｄ−（−）２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子においてノックアウト変異を有する、請求項１に記載の単離された遺伝子操作されたカルボキシド栄養性酢酸産生性細菌。
3. 前記ジオール／グリセロールデヒドラターゼの再活性化タンパク質をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項１に記載の単離された遺伝子操作されたカルボキシド栄養性酢酸産生性細菌。
4. 前記核酸の不在下で、前記細菌が前記酵素を発現しない、請求項１に記載の細菌。
5. 嫌気性条件下で前記酵素を発現する、請求項１に記載の細菌。
6. メソ−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする核酸と、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ酵素をコードする核酸と、を含む、カルボキシド栄養性酢酸産生性細菌において複製することができるプラスミドであって、前記プラスミドが前記細菌に形質転換されると、前記細菌が前記酵素を発現する、プラスミド。
7. ＣＯおよび／またはＣＯ_２を２−ブタノールに変換するためのプロセスであって、
   請求項１に記載のカルボキシド栄養性酢酸産生性細菌が前記ＣＯおよび／またはＣＯ_２を２−ブタノールに変換するように、ガス状のＣＯ含有および／またはＣＯ_２含有基質を、培養培地中の前記細菌の培養物を含有するバイオリアクターに通すことと、
   前記バイオリアクターから前記ブタノールを回収することと、を含む、プロセス。
8. 請求項１に記載の細菌のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子においてノックアウト変異をさらに含む、請求項１に記載の細菌。
9. 請求項８に記載の細菌のＤ−（−）２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼにおいてノックアウト変異をさらに含む、請求項８に記載の細菌。
10. ジオール／グリセロールデヒドラターゼの再活性化タンパク質をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項８に記載の細菌。
11. ジオール／グリセロールデヒドラターゼの再活性化タンパク質をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項９に記載の細菌。
12. ＣＯおよび／またはＣＯ_２をメチルエチルケトン（ＭＥＫ）に変換するためのプロセスであって、
    請求項８に記載のカルボキシド栄養性酢酸産生性細菌が前記ＣＯおよび／またはＣＯ_２をＭＥＫに変換するように、ガス状のＣＯ含有および／またはＣＯ_２含有基質を、培養培地中の前記細菌の培養物を含有するバイオリアクターに通すことと、
    前記バイオリアクターから前記ＭＥＫを回収することと、を含む、プロセス。
13. 前記細菌が、Ｄ−（−）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子におけるノックアウト変異を有する、請求項７または１２に記載のプロセス。
14. 前記細菌が、前記ジオール／グリセロールデヒドラターゼの再活性化タンパク質をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項７または１２に記載のプロセス。
15. 前記細菌が、Ｄ−（−）−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子におけるノックアウト変異と、前記ジオール／グリセロールデヒドラターゼの再活性化タンパク質をコードする外因性核酸と、を有する、請求項７または１２に記載のプロセス。
16. クロストリジウム・オートエタノゲナムのためにコドン最適化されたメソ−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼをコードする、核酸。
17. クロストリジウム・オートエタノゲナムのためにコドン最適化されたジオール／グリセロールデヒドラターゼコドンをコードする、核酸。
18. 前記メソ−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼが、クレブシエラ・ニューモニエメソ−２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼである、請求項１６に記載の核酸。
19. 前記ジオール／グリセロールデヒドラターゼが、クレブシエラ・オキシトカジオール／グリセロールデヒドラターゼである、請求項１７に記載の核酸。
20. クレブシエラ・オキシトカジオール／グリセロールデヒドラターゼをさらにコードする、請求項１６に記載の核酸。