JP2015232017A - アンジオポエチン様３発現の調節 - Google Patents

アンジオポエチン様３発現の調節 Download PDF

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Abstract

【課題】脂質代謝を改善するため、動物においてアンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を低下させるための方法、化合物、及び組成物の提供。
【解決手段】ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする１０〜３０連結ヌクレオシドの長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与する、動物でのＡＮＧＰＴＬ３発現を低減させる方法。
【効果】前記修飾尾オリゴヌクレオチドの投与は、肥満、糖尿病、アテローム性動脈硬化、脂質異常症、冠動脈性心疾患、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂肪酸血症、もしくは代謝症候群等の、代謝疾患又は心臓血管疾患の処置、防止、遅延、又は改善に有用である。
【選択図】なし

Description

動物においてアンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を低下させるための方法、化合物、および組成物が提供される。また、動物においてＡＮＧＰＴＬ３に関連する疾患または状態を軽減するためのＡＮＧＰＴＬ３阻害剤を含む方法、化合物、および組成物が提供される。そのような方法、化合物、および組成物は、例えば、動物において心血管系疾患またはメタボリックシンドロームまたはその症状の任意の１つ以上の処置、防止、遅延、または改善に有用である。
糖尿病および肥満（「糖尿肥満」と総称することもある）は、肥満が糖尿病の病理を悪化させることが知られ、また
６０％を超える糖尿病患者が太りすぎであるという点で相関がある。ほとんどのヒト肥満は、インスリン抵抗性およびレプチン抵抗性に関連する。実際には、肥満は糖尿病自体よりもインスリン活性にさらに大きな影響をもち得ることが、示唆されてきた（Ｓｉｎｄｅｌｋａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｓ．、２００２、５１、８５−９１）。さらに、糖尿病の治療用に市販されるいくつかの化合物が体重増加、この疾患の治療に非常に好ましくない副作用を導くことが知られている。
心臓血管系疾患もまた、肥満および糖尿病と相関がある。心臓血管系疾患は、多種多様な病因を包含し、同等の多種多様な原因物質および相関するプレイヤーを持つ。多くの原因物質が、非ＨＤＬコレステロールを含む血漿コレステロールレベルの上昇などの症状、ならびに他の脂質関連障害の一因となる。この脂質関連障害（一般に脂質異常症と呼ばれる）は、他の兆候のなかでも、高脂血症、高コレステロール血症、および高トリグリセリド血症を含む。上昇した非ＨＤＬコレステロールは、動脈硬化、冠動脈疾患、心筋梗塞、虚血性脳卒中、および心臓疾患の他の形態などの心臓血管疾患を含むアテローム形成およびその後遺症に関連する。これらは、先進工業国での最も普及した病気として位置づけられている。実際に、米国の推定１２００万人が冠動脈疾患に罹患し、約３６００万人が上昇したコレステロールレベルの治療を必要とする。
疫学的証拠および実験的証拠が、血中トリグリセリド（ＴＧ）（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）の高いレベルが心臓血管疾患および無数の代謝障害の一因となることを示してきた（Ｖａｌｄｉｖｉｅｌｓｏ ｅｔ ａｌ．、２００９、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． ２０７（２）：５７３−８； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００８、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． １；１０２（２）：２５０−６）。外因性供給源または内因性供給源のいずれかに由来するＴＧは、腸からのカイロミクロンで、または肝臓からの超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）で取り込まれたり分泌される。一旦循環すると、ＴＧはリポタンパク質リパーゼ（ＬｐＬ）により加水分解され、結果として得られる遊離脂肪酸が次いで局所組織に取り込まれ、エネルギー供給源として使用される。ＬｐＬが血漿ＴＧおよび一般的な代謝に大きな影響を及ぼすことから、ＬｐＬ活性に影響を及ぼす化合物を発見および開発することは、大変興味深いことである。
メタボリック症候群は、ヒトの心臓血管疾患および糖尿病のリスクを増加させる内科的疾患の組み合わせである。高血圧、高トリグリセリド、低ＨＤＬ、および肥満を含む症状は、いくつかの個体において同時に見られる傾向がある。メタボリック症候群は多くの人々にひとかたまりで影響を与える。いくつかの研究は、米国での罹患率は、人口の最大２５％であると算出されている。メタボリック症候群は、（代謝）症候群Ｘ、インスリン抵抗性症候群、リーブン（Ｒｅａｖｅｎ’ｓ）症候群、またはＣＨＡＯＳなどの様々な他の
名称で知られている。心臓血管系障害および代謝障害のその高い罹患率から、これらの症状を治療する改善されたアプローチの必要性が依然存在する。
アンジオポエチンは、分泌成長因子のあるファミリーである。アンジオポエチンはそれぞれの内皮特異的受容体と共に、血管新生の重要な役割を果たす。あるファミリーメンバーであるアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴ５、ＡＮＧＰＴＬ３、またはアンジオポエチン５としても知られる）は、大部分は肝臓で発現され、脂質代謝を調節する役割を果たすと考えられている（Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、２００３、４４、１３６−１４３）。
アンジオポエチン様３に関するヒト遺伝子が、ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ＥＳＴ ｄａｔａｂａｓｅの調査の結果として同定され、クローン化された。全長ヒトｃＤＮＡは特徴的なアンジオポエチン構造特性を持つ４６０個のアミノ酸のポリペプチド：シグナルペプチド、拡張ヘリカルドメイン（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｄｏｍａｉｎ）、短いリンカーペプチド、および球形のフィブリノゲン相同ドメイン（ＦＨＤ）をコードしている。マウスアンジオポエチン様３ｃＤＮＡが、ヒトポリペプチドと７６％の同一性を持つ４５５このアミノ酸のポリペプチドをコードすることが見出された。アンジオポエチンのアライメントから、他のファミリーメンバーとは異なるアンジオポエチン様３が、カルシウム結合部位を決定する酸性残基のモチーフを含まないことが示された。ノーザンブロット法は、主に成体組織の肝臓での発現することを明らかにし、マウス胚ノーザンブロットは早ければ１５日目で転写産物の存在を示し、これはアンジオポエチン様３が肝臓発達中の初期に発現されること、および発現が成体肝臓で維持されることを示唆する。マウス遺伝子は第４染色体に位置し、またヒト遺伝子は１ｐ３１領域に位置した（Ｃｏｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９９、６２、４７７−４８２）。
ＫＫ肥満マウスは、わずかな肥満の多重遺伝子症候群とヒト遺伝性２型糖尿病に似た糖尿病の表現型を持つ。これらのマウスは、高インスリン血症、高血糖、および高脂血症の兆候を示す。ＫＫ／Ｓａｎと呼ばれるＫＫマウス株は、高インスリン血症および高血糖の兆候にもかかわらず、有意に低い血漿脂質レベルを持つ。変異表現型は劣性遺伝であり、遺伝子座名は低リポタンパク質血症（ｈｙｐｌ）であった。遺伝子座は、第４染色体の中間に位置し、遺伝子はポジショナルクローニングによりアンジオポエチン様３として同定された。変異ＫＫ／Ｓａｎマウスでの、完全長マウスまたはヒトアンジオポエチン様３ｃＤＮＡを含む組み換えアデノウイルスの注入により、血漿のトリグリセリド、総コレステロール、および非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）レベルが増加した。同様に、変異マウスへの組み換えアンジオポエチン様３タンパク質の注入がトリグリセリドおよび非エステル化脂肪酸のレベルを増加させた（Ｋｏｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、２００２、３０、１５１−１５７）。
ＫＫ／Ｓａｎマウスでのトリグリセリドの代謝経路を重点とした別の研究では、アンジオポエチン様３の過剰発現が、トリグリセリドに富む低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の顕著な増加をもたらした。肝臓ＶＬＤＬトリグリセリド分泌速度の相違は、野生型ＫＫマウスとＫＫ／Ｓａｎマウスとでは顕著ではなかった。しかしながら、標識ＶＬＤＬを用いた研究は、ＫＫ／Ｓａｎマウスでの低い血漿トリグリセリドレベルは、全粒子の取り込みの促進よりむしろ主にＶＬＤＬトリグリセリドの脂肪分解の促進のためであることを示唆した。ＫＫ／Ｓａｎマウスの血漿ａｐｏＢ１００およびａｐｏＢ４８レベルは、野生型ＫＫマウスと同じであった。ＡｐｏＣＩＩＩ−欠損マウスは、ＫＫ／Ｓａｎマウスと同様の表現型をもち、ＡｐｏＣＩＩＩはＶＬＤＬトリグリセリドのリパーゼによる加水分解の阻害によりＶＬＤＬトリグリセリド代謝を調節すると考えられる。組み換えタンパク質のインビトロ解析は、アンジオポエチン様３は直接リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）活性を阻害することを明らかにした（Ｓｈｉｍｉｚｕｇａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．、２００２、２７７、３３７４２−３３７４８）。
脂質代謝の役割と一致して、アンジオポエチン様３ｍＲＮＡが、４％コレステロールを含む正常餌を給餌したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで、および肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）アゴニストＴ０９０１３１７で処置したマウスで上方制御されることが見出された。ＬＸＲは、肝臓および周辺組織でのコレステロールホメオスタシスに影響を与える遺伝子を制御する役割を果たすリガンド活性化転写因子である。コレステロール代謝に加えて、ＬＸＲはまた、脂肪酸代謝を制御する役割も果たし得る。ＬＸＲを活性化する自然因子（ｎａｔｕｒａｌ ａｇｅｎｔ）または合成因子（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｇｅｎｔ）によるＨｅｐＧ２細胞の処置により、アンジオポエチン様３発現の増加を生じた。ヒトアンジオポエチン様３遺伝子のプロモーターが、ＬＸＲ応答配列を含むことを見出した。さらに、プロモーターが、ＨＮＦ−１、ＨＮＦ−４、およびＣ／ＥＢＰを含む他の転写因子に対するいくつかの潜在的な結合部位を含んでいた（Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、２００３、４４、１３６−１４３）。
Ｔ０９０１３１７による齧歯類の処置は、肝臓および血漿でのトリグリセリド蓄積に関連する。肝臓のトリグリセリド蓄積は、その両方がＬＸＲの標的であるステロール制御配列結合タンパク質−１ｃ（ＳＲＥＢＰ１ｃ）と脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）の発現の増加により説明されている。Ｔ０９０１３１７は、アンジオポエチン様３欠損マウスで血漿トリグリセリド濃度を増加させなかったが、一方で肝臓トリグリセリドの誘導性蓄積は、処置野生型マウスで認められた程度に認められた。Ｔ０９０１３１７により処置された野生型マウスでの血漿トリグリセリドの上昇は、肝臓でのアンジオポエチン様３ｍＲＮＡの誘導、および血漿タンパク質の濃度の増加に対応する（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２００３、２７８、２１３４４−２１３５１）。
さらなる研究は、外因性のアンジオポエチン様３により処置されたＫＫ／Ｓｎｋマウスで認められた血漿遊離脂肪酸（ＦＦＡ）レベルの増加機構に取り組んだ。蛍光標識アンジオポエチン様３タンパク質を持つヒト固定組織のプローブが、脂肪組織にのみに強い結合を示した。さらに、放射性標識タンパク質結合が３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で試験され、その結合が安定で特異的であることが見出された。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のアンジオポエチン様３によるインキュベーションの結果、培養培地中にＦＦＡおよびグリセロールの放出の増強が導かれた（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２００３、３０１、６０４−６０９）。
インスリン−欠損状態をモデル化するストレプトゾトシン−処置マウス（ＳＴＺ）およびインスリン−抵抗性糖尿病状態をモデル化するｄｂ／ｄｂマウスを用いる研究では、対照動物と比較した場合に、より多量の肝臓アンジオポエチン様３が糖尿病マウスで認められた。両方の糖尿病モデルが高トリグリセリド血症を示し、また認められた高脂血症は、アンジオポエチン様３の発現の増加により少なくとも部分的に説明された。これらの結果は、アンジオポエチン様３は糖尿病と脂質異常症間のリンクであり、上昇が高脂血症を促進することを示唆した（Ｉｎｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２００４、３１７、１０７５−１０７９）。
その後の研究が、その両方が代謝症候群のキープレイヤーであるレプチンおよびインスリンによるアンジオポエチン様３の制御を検証した。アンジオポエチン様３発現および血漿タンパク質レベルが、対照と比較してレプチン−耐性ｄｂ／ｄｂおよびレプチン−欠損ｏｂ／ｏｂマウスで増加した。ｏｂ／ｏｂマウスのレプチンによる補給により、アンジオポエチン様３レベルが減少した。発現の変化は、血漿のトリグリセリドおよび遊離脂肪酸のレベルの変化と関連していた。遺伝子発現および血漿タンパク質レベルは、インスリン−欠損ＳＴＺ−処置マウスで増加した（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２００４、３２２、１０８０−１０８５）。
アンジオポエチンファミリーに属する数と一致して、組み換えアンジオポエチン様３タンパク質がαｖβ３インテグリンと結合することが見出され、また組み換えアンジオポエチン様３タンパク質がインテグリンαｖβ３依存性の走触性（ｈａｐｔｏｔａｃｔｉｃ）の内皮細胞の粘着および移動を誘導した。組み換えアンジオポエチン様３タンパク質はまた、インテグリン活性化に特徴があるシグナル伝達経路を刺激した。ラット角膜血管新生分析で、アンジオポエチン様３は血管新生を強力に誘導した（Ｃａｍｅｎｉｓｃｈ ｅｔ
ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２００２、２７７、１７２８１−１７２９０）。
血漿のＨＤＬ、ＬＤＬ、およびトリグリセリドの濃度に関連する通常の変異体に関するゲノムを調査するゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）は、いくつかのグループが始めたものである。ＧＷＡＳ研究は、トリグリセリドとＡＮＧＰＴＬ３に近接した単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）との関連を見出した（Ｗｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００８、４０（２）：１６１−１６９）。
米国特許第７，２６７，８１９号、米国特許出願第１２／１２８，５４５号、および米国特許出願第１２／００１，０１２号が、アンジオポエチン様３アゴニストおよびアンタゴニストについて一般的に記載している。
国際公開第０２１０１０３９号（欧州特許第０２７３３３９０号）および国際公開第０１４２４９９号（米国特許出願番号第１０／１６４，０３０号）は、マウスアンジオポエチン様３に相補的な核酸配列を記述している（Ｒｙｕｔａ、２００２； Ｒｙｕｔａ、２００１）。
Ｓｉｎｄｅｌｋａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｓ．、２００２、５１、８５−９１ Ｖａｌｄｉｖｉｅｌｓｏ ｅｔ ａｌ．、２００９、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． ２０７（２）：５７３−８ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００８、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． １；１０２（２）：２５０−６ Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、２００３、４４、１３６−１４３ Ｃｏｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９９、６２、４７７−４８２ Ｋｏｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、２００２、３０、１５１−１５７ Ｓｈｉｍｉｚｕｇａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２００２、２７７、３３７４２−３３７４８ Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、２００３、４４、１３６−１４３ Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２００３、２７８、２１３４４−２１３５１ Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２００３、３０１、６０４−６０９ Ｉｎｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２００４、３１７、１０７５−１０７９ Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２００４、３２２、１０８０−１０８５ Ｃａｍｅｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２００２、２７７、１７２８１−１７２９０ Ｗｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００８、４０（２）：１６１−１６９
米国特許第７，２６７，８１９号 米国特許出願第１２／１２８，５４５号 米国特許出願第１２／００１，０１２号 国際公開第０２１０１０３９号 国際公開第０１４２４９９号
現在、心臓血管系障害および代謝障害を治療するための許容できる選択肢が不足している。したがって、この疾患および障害の治療のための化合物および方法を提供することが本明細書での目的である。
アンジオポエチン様３の脂質代謝での潜在的役割が研究のための格好な対象とする。アンチセンス技術は、ある遺伝子産物の発現を低減させる効果的な手段として浮上しており、したがってアンジオポエチン様３のための複数の治癒的、診断的、および研究用途に比類なく有用であることが判明し得る。
本発明は、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮＡｉ、ｄｓＲＮＡ酵素等のアンチセンス作用機序および標的分解または標的占有に基づくその他のアンチセンス機序を介した遺伝子発現および関連経路の調節に有用なアンチセンス化合物に関する。
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害してＡＮＧＰＴＬ３に関連する疾患、状態、またはその症状を処置、防止、遅延、または改善するための方法、化合物、および組成物に関する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３に関連する疾患または状態は心血管系疾患または代謝疾患である。
特定の実施形態では、本発明の化合物または組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３を標的をする（ＣＥＴＰへとターゲティングされた）１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。ＡＮＧＰＴＬ３標的は、配列番号１〜５のいずれか１つから選択される配列を有し得る。ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜５の同じ長さの部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）に相補的な少なくとも８個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し得る。ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号３４〜１８２のいずれかから選択される核酸塩基配列の少なくとも８個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し得る。修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号３４〜１８２のいずれか１つに記載される配列から選択される核酸塩基配列の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し得る。修飾オリゴヌクレオチドの連続核酸塩基部分は、配列番号１〜５のいずれか１つから選択されるＡＮＧＰＴＬ３領域の同じ長さの部分に相補的であり得る。ＡＮＧＰＴＬ３領域は、領域２２〜５２、１１６〜１４５、６３７〜７２０、９５３〜９８３、１３３３〜１４６９および１４６３−１４８９の１つ
以上から選択され得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＮＧＰＴＬ３を標的とする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含む、動物においてＡＮＧＰＴＬ３の発現を低下させる方法が提供される。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＮＧＰＴＬ３を標的とする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含む、動物においてＡｐｏＣ−ＩＩＩの発現、トリグリセライドのレベル、コレステロールのレベル、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）またはグルコースのレベルを低下させる方法が提供され、その方法において、修飾オリゴヌクレオチドは動物においてＡＮＧＰＴＬ３の発現を低下させる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＮＧＰＴＬ３を標的をする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含む、動物において心血管系疾患または代謝性疾患を改善する方法が提供され、その方法において、修飾オリゴヌクレオチドは動物においてＡＮＧＰＴＬ３の発現を低下させる。
特定の実施形態では、１）心血管系疾患または代謝性疾患を有する動物を同定すること、および２）２０個の連結されたヌクレオシドからなり且つ修飾オリゴヌクレオチド全体にわたる測定で配列番号１〜５に少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む治療有効量の化合物を動物に投与することにより、心血管系疾患または代謝性疾患を有する動物を処置することを含む、心血管系疾患または代謝性疾患を有する動物を処置する方法が提供される。特定の実施形態では、動物に投与される治療有効量の化合物は、動物において心血管系疾患または代謝性疾患を軽減する。
特定の実施形態では、本明細書に記載の修飾オリゴヌクレオチドを含むＡＮＧＰＴＬ３阻害剤を投与することにより、ヒトにおいてＡＮＧＰＴＬ３のレベル、ＬＤＬのレベル、ＡｐｏＣ‐ＩＩＩのレベル、トリグリセライドのレベル、コレステロールのレベル、グルコースのレベル、脂肪パッド重量、心血管系疾患および代謝疾患の１つ以上を低減させる方法を提供する。
上記の概括的な説明および以下の詳細な説明はどちらも例示的および説明的なものでしかなく、特許請求されている発明を制限するものではないと理解されるべきである。本明細書において、特に断りのない限り、単数形の使用は複数を含む。本明細書において、特に断りのない限り、「または」、「若しくは」、「あるいは」は「および／または」を意味する。更に、「含む」という用語および「含まれる」等の他の形態の使用は、限定するものではない。また、特に断りのない限り、「エレメント」または「構成要素」等の用語は１ユニットを含むエレメントおよび構成要素並びに２つ以上のサブユニットを含むエレメントおよび構成要素の両方を包含する。
本明細書中で使用される項目見出しは構成のみを目的とし、記載されている主題を限定するものと解釈されるべきではない。本出願中で引用される全ての文献、文献の一部、例えば、限定されるものではないが、特許、特許出願、論文、書籍、および条約を、本明細書中で議論されている文献部分および文献全体について明言的に参照により本明細書に組み込まれる。
定義
特別に定義しない限り、本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、並びに薬化学および製薬化学に関連して用いた命名法、並びに手順および技術は、当該技術分野で周知の
一般に用いられているものである。化学合成および化学的分析には標準技術を用いることができる。許される場合には、全ての特許、出願、公開出願、およびその他の刊行物、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）等のデータベースを介して入手可能なＧＥＮＢＡＮＫ受託番号および関連する配列情報、並びに本明細書の開示中で参照されるその他のデータを、本明細書中で議論されている文献部分および文献全体に関して参照により本明細書に組み込まれる。
特に断りのない限り、以下の用語は以下の意味である。
「２’−Ｏ−メトキシエチル」（２’−ＭＯＥおよび２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３ともいう）とは、フロシル（ｆｕｒｏｓｙｌ）環の２’位のＯ−メトキシ−エチル修飾を意味する。２’−Ｏ−メトキシエチル修飾された糖は修飾糖である。
「２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド」とは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分を含むヌクレオチドを意味する。
「３’標的部位」とは、特定のアンチセンス化合物の最も３’側のヌクレオチドに相補的な、標的核酸のヌクレオチドを意味する。
「５’標的部位」とは、特定のアンチセンス化合物の最も５’側のヌクレオチドに相補的な、標的核酸のヌクレオチドを意味する。
「５−メチルシトシン」とは、５’位に付加されたメチル基で修飾されたシトシンを意味する。５−メチルシトシンは修飾核酸塩基である。
「約」とは、ある値の±１０％以内を意味する。例えば、「マーカーは約５０％増加し得る」と記載されている場合、これはマーカーが４５％〜５５％増加し得ることを意味する。
「活性薬剤（ａｃｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）」とは、個体に投与された時に治療効果を与える医薬組成物中の物質を意味する。例えば、特定の実施形態では、ＣＥＴＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが活性薬剤である。
「活性標的領域」または「標的領域」とは、１つ以上の活性アンチセンス化合物の標的となる領域を意味する。
「活性アンチセンス化合物」とは、標的の核酸レベルまたはタンパク質レベルを低下させるアンチセンス化合物を意味する。
「脂肪生成」とは、前脂肪細胞からの脂肪細胞の発達を意味する。「脂質生成」とは、脂肪の生産または形成、脂肪変性または脂肪浸潤のいずれかを意味する。
「肥満症（Ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）または「肥満（ｏｂｅｓｉｔｙ）」とは、肥満である状態または除脂肪体重と比べて体脂肪若しくは脂肪組織が過剰量であることを意味する。体脂肪の量には、体全体における脂肪の分布並びに脂肪組織沈着物のサイズおよび質量の両方に関する問題が含まれる。体脂肪分布は、皮下脂肪測定、ウエストとヒップの外周比、または超音波、コンピュータ断層撮影法、若しくは磁気共鳴画像法等の技術により推定することができる。疾病管理予防センターによれば、肥満度指数（ＢＭＩ）が３０以上の個体が肥満と見なされる。本発明において、「肥満」という用語は、体内に脂肪組織が過剰に蓄積されることにより身体に必要な量を超えて体脂肪が増加している状態を含む。「
肥満」という用語は、限定されるものではないが、以下の状態を含む：成人発症型肥満；食事性肥満；内因性または代謝性の肥満；内分泌性肥満；家族性肥満；高インスリン肥満；過形成―肥大性肥満；機能低下性肥満；甲状腺機能低下性肥満；生涯肥満；病的肥満；および外因性肥満。
「同時に投与」とは、両方の薬理学的効果が同時に患者に現れるような任意の様式での２つの薬剤の共投与を意味する。同時投与は、単一の医薬組成物、同じ製剤、または同じ投与経路で両方の薬剤が投与されることを必要としない。両方の薬剤の効果は同時に発現しなくてもよい。効果は、ある期間重複するだけでよく、同じ期間続く必要はない。
「投与する」とは、動物に薬剤を与えることを意味し、限定されるものではないが、医療従事者による投与および自己投与を含む。
「薬剤（ａｇｅｎｔ）」とは、動物に投与された時に治療上の利点を与え得る活性物質を意味する。「第１の薬剤」とは、本発明の治療化合物を意味する。例えば、第１の薬剤は、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。「第２の薬剤」とは、本発明の第２の治療化合物（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする第２のアンチセンスオリゴヌクレオチド）および／または非ＡＮＧＰＴＬ３治療化合物を意味する。
「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」とは、関連する疾患、障害、または状態の少なくとも１つの指標、兆候、または症状の軽減を意味する。指標の重度は、当業者に公知の主観的または客観的尺度により決定することができる。
「ＡＮＧＰＴＬ３」とは、ＡＮＧＰＴＬ３の任意の核酸またはタンパク質を意味する。
「ＡＮＧＰＴＬ３の発現」とは、ＡＮＧＰＴＬ３をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベル、またはｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質のレベルを意味する。ＡＮＧＰＴＬ３の発現は、ノーザンブロットまたはウエスタンブロット等の当該技術分野において周知の方法により測定できる。
「ＡＮＧＰＴＬ３核酸」とは、ＡＮＧＰＴＬ３をコードする任意の核酸を意味する。例えば、特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸にはＡＮＧＰＴＬ３をコードするＤＮＡ配列、ＡＮＧＰＴＬ３をコードするＤＮＡ（イントロンおよびエクソンを含むゲノムＤＮＡを包含する）から転写されるＲＮＡ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡが含まれる。「ＡＮＧＰＴＬ３ｍＲＮＡ」とはＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。
「動物」とは、ヒトまたは非ヒト動物、限定されるものではないが例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、並びに非ヒト霊長類、限定されるものではないが例えばサルおよびチンパンジーを意味する。
「アンチセンス活性」とは、標的核酸へのアンチセンス化合物のハイブリダイゼーションに起因する任意の検出可能なまたは測定可能な活性を意味する。特定の実施形態では、アンチセンス活性は、標的核酸またはそのような標的核酸によりコードされるタンパク質の量または発現の低下である。
「アンチセンス化合物」とは、水素結合を介して標的核酸にハイブリダイゼーションすることができるオリゴマー化合物を意味する。
「アンチセンス阻害」とは、アンチセンス化合物非存在下における標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルと比べた、標的核酸に相補的なアンチセンス化合物存在下における標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルの低下を意味する。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、標的核酸の対応する領域またはセグメントへのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
「ＡｐｏＢ含有リポプロテイン」とは、そのタンパク質構成要素としてアポリポプロテインＢを有する任意のリポプロテインを意味し、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、およびリポプロテイン（ａ）を含むと理解され、一般的に、脂質を下げる薬剤または療法の標的となり得る。「ＡｐｏＢ−１００−含有ＬＤＬ」とは、ＡｐｏＢ−１００アイソフォームを含有するＬＤＬを意味する。
「アテローム性動脈硬化症」とは、大および中サイズの動脈に影響する動脈の硬化を意味し、脂肪沈着物の存在を特徴とする。脂肪沈着物は、「アテローム」または「プラーク」と呼ばれ、これは主にコレステロールおよびその他の脂肪、カルシウム、および瘢痕組織からなり、動脈の内張り（ｌｉｎｉｎｇ）にダメージを与える。
「二環式糖（ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｓｕｇａｒ）」とは、２個の非ジェミナル環原子の架橋により修飾されたフロシル環を意味する。二環式糖は修飾糖である。
「二環式核酸（ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」または「ＢＭＡ」とは、ヌクレオシドまたはヌクレオチドのフラノース部分がフラノース環上の２個の炭素原子を連結する架橋を含むことで二環式の環系を形成しているヌクレオシドまたはヌクレオチドを意味する。
「キャップ構造」または「末端キャップ部分」とは、アンチセンス化合物のいずれかの末端に導入された化学修飾を意味する。
「心血管系疾患」または「心血管系障害」とは、心臓、血管、または循環に関係する一群の状態を意味する。心血管系疾患または障害の例としては、限定されるものではないが、動脈瘤、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患（脳卒中）、冠動脈心疾患、高血圧、脂質異常症、高脂血症、および高コレステロール血症が含まれる。
「化学的に異なる領域（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｅｇｅｉｏｎ）」とは、同じアンチセンス化合物の別の領域と何らかの点で化学的に異なるアンチセンス化合物の領域を意味する。例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾のないヌクレオチドを有する領域とは化学的に異なる。
「キメラアンチセンス化合物」とは、少なくとも２つの化学的に異なる領域を有するアンチセンス化合物を意味する。
「共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）とは、個体への２つ以上の薬剤の投与を意味する。２つ以上の薬剤は、単一の医薬組成物であってもよく、別々の医薬組成物であってもよい。２つ以上の薬剤のそれぞれは、同じ投与経路で投与されてもよく、異なる投与経路で投与されてもよい。共投与は、並行投与または逐次投与を包含する。
「コレステロール」とは、全動物組織の細胞膜中に見られるステロール分子である。コ
レステロールは、動物の血漿中で、超低比重リポプロテイン（ＶＬＤＬ）、中間比重リポプロテイン（ＩＤＬ）、低比重リポプロテイン（ＬＤＬ）、および高比重リポプロテイン（ＨＤＬ）等のリポプロテインにより輸送される必要がある。「血漿コレステロール」とは、血漿または血清中に存在する、全てのリポプロテイン（ＶＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）でエステル化されたおよび／またはエステル化されていないコレステロールの和を意味する。
「コレステロール吸収阻害剤」とは、食事から得られる外因性コレステロールの吸収を阻害する薬剤を意味する。
「相補性」とは、第１の核酸と第２の核酸の核酸塩基間における対形成能を意味する。特定の実施形態では、第１および第２の核酸間の相補性は、２つのＤＮＡ鎖間、２つのＲＮＡ鎖間、またはＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の間のものであり得る。特定の実施形態では、一方の鎖の核酸塩基の一部が、他方の鎖の相補的水素結合塩基にマッチする。特定の実施形態では、一方の鎖上の全核酸塩基が、他方の鎖の相補的水素結合塩基にマッチする。特定の実施形態では、第１の核酸はアンチセンス化合物であり、第２の核酸は標的核酸である。特定のそのような実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが第１の核酸であり、標的核酸が第２の核酸である。
「連続核酸塩基」とは、互いにすぐ隣接している核酸塩基を意味する。
「冠動脈心疾患（ＣＨＤ）」とは、心臓に血液および酸素を供給する小血管の狭窄を意味し、これは多くの場合アテローム性動脈硬化症により生じる。
「デオキシリボヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの糖部分の２’位に水素を有するヌクレオチドを意味する。デオキシリボヌクレオチドは、種々の置換基のいずれかで修飾され得る。
「真性糖尿病」または「糖尿病」とは、不十分なインスリン濃度またはインスリン感受性の低下による代謝異常および異常に高い血糖（高血糖症）を特徴とする症候群である。特徴的な症状は、高血糖値による過剰な尿生成（多尿症）、排尿増加を補おうとする過剰な渇きおよび水分摂取の増加（多飲症）、高血糖の目への影響による視朦、原因不明の体重減少、および嗜眠である。
「糖尿病性脂質異常症」または「脂質異常症を伴う２型糖尿病」とは、２型糖尿病、ＨＤＬ−Ｃの減少、トリグリセリドの増加、および小粒子ＬＤＬ粒子の増加を特徴とする状態を意味する。
「希釈剤」とは、組成物中の、薬理学的活性を有さないが薬学的に必要であるか望ましい成分を意味する。例えば、注射される組成物中の希釈剤は液体、例えば食塩水であり得る。
「脂質異常症」とは、脂質および／またはリポプロテイン代謝の障害、例えば脂質および／またはリポプロテインの過剰生成または欠乏を意味する。脂質異常症は、コレステロールおよびトリグリセリド等の脂質並びに低比重リポプロテイン（ＬＤＬ）コレステロール等のリポプロテインの増加により顕在化し得る。
「投薬単位（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ）」とは、医薬剤が提供される形態、例えばピル、錠剤、または当該技術分野で公知その他の投薬単位を意味する。特定の実施形態では、投薬単位は、凍結乾燥されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むバイアルである。特
定の実施形態では、投薬単位は、再構成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むバイアルである。
「用量（ｄｏｓｅ）」とは、１回の投与で与えられるまたは特定の期間中に与えられる特定の量の医薬剤を意味する。特定の実施形態では、用量は、１、２、またはそれ以上のボーラス、錠剤、または注射で投与され得る。例えば、皮下投与が望ましい特定の実施形態では、所望の用量は、１回の注射に含めることが容易でない体積が必要となるため、所望の用量を達成するために２回以上の注射を用いてもよい。特定の実施形態では、医薬剤は、長期間にわたるまたは連続的な注入より投与される。用量は、時間、日、週、または月当たりの医薬剤の量として記載され得る。用量は、ｍｇ／ｋｇまたはｇ／ｋｇで表され得る。
「有効量」または「治療有効量」とは、医薬剤を必要とする個体において所望の生理学的結果を達成するのに十分な活性薬剤の量を意味する。有効量は、処置される個体の健康および体調、処置される個体の分類学的群、組成物の処方、個体の医学的状態の評価、並びにその他の関連因子に応じて個体間で変わり得る。
「完全に相補的」または「１００％相補的」とは、第１の核酸の核酸塩基配列の各核酸塩基が第２の核酸の第２の核酸塩基配列中に相補的な核酸塩基を有することを意味する。特定の実施形態では、第１の核酸はアンチセンス化合物であり、標的核酸は第２の核酸である。
「ギャップマー」とは、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を支援する複数のヌクレオシドを有する内部領域が、１つ以上のヌクレオシドを有する外部領域間に位置し、内部領域を含むヌクレオシドが、外部領域を含むヌクレオシドと化学的に異なる、キメラアンチセンス化合物を意味する。内部領域を「ギャップセグメント」、外部領域を「ウィングセグメント」と呼ぶこともある。
「ギャップ拡張（ｇａｐ−ｗｉｄｅｎｅｄ）」とは、１〜６個のヌクレオシドを有する５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントの間でこれらにすぐ隣接して位置する１２つ以上の連続する２’−デオキシリボヌクレオシドを有するギャップセグメントを有するキメラアンチセンス化合物を意味する。
「グルコース」とは、エネルギー源および代謝性中間体として細胞に使用される単糖である。「血漿グルコース」とは、血漿中に存在するグルコースを意味する。
「高比重リポプロテイン−Ｃ（ＨＤＬ−Ｃ）」とは、高比重リポプロテイン粒子に結合したコレステロールを意味する。血清（または血漿）中のＨＤＬ−Ｃの濃度は通常、ｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌで定量化される。「血清ＨＤＬ−Ｃ」および「血漿ＨＤＬ−Ｃ」とは、それぞれ血清および血漿中のＨＤＬ−Ｃを意味する。
「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤」とは、酵素ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害を介して作用する薬剤、例えばアトルバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、およびシンバスタチンを意味する。
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的核酸分子のアニーリングを意味する。特定の実施形態では、相補的核酸分子は、アンチセンス化合物および標的核酸を含む。
「高コレステロール血症」とは、Ｅｘｐｅｒｔ Ｐａｎｅｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｇ
ｒａｍ （ＮＣＥＰ） ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ （Ａｒｃｈ． Ｉｎｔ． Ｍｅｄ． （１９８８） １４８， ３６−３９参照）の指針通り、コレステロールまたは循環（血漿）コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、およびＶＬＤＬ−コレステロールの上昇を特徴とする状態を意味する。
「高脂血症」または「高脂質血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｅｍｉａ）」とは、血清脂質または循環（血漿）脂質の上昇を特徴とする状態である。この状態は、異常に高濃度の脂質を呈する。循環血液中の脂質画分はコレステロール、低比重リポプロテイン、超低比重リポプロテイン、およびトリグリセリドである。
「高トリグリセリド血症」とは、高いトリグリセリド濃度を特徴とする状態を意味する。
「代謝性または心血管系の疾患を有する対象を同定する」または選択する」とは、代謝性疾患、心血管系疾患、またはメタボリックシンドロームを診断された対象を同定または選択すること；あるいは、代謝性疾患、心血管系疾患、またはメタボリックシンドロームの何らかの症状、例えば、限定されるものではないが、高コレステロール血症、高血糖症、高脂血症、高トリグリセリド血症、高血圧、インスリン抵抗性の上昇、インスリン感受性の低下、通常より多い体重、および／または通常より高い体脂肪量、またはその任意の組合せを有する対象を同定または選択することを意味する。そのような同定は、任意の方法、例えば、限定されるものではないが、標準的な臨床検査または評価、例えば血清または循環（血漿）コレステロールの測定、血清または循環（血漿）血糖の測定、血清または循環（血漿）トリグリセリドの測定、血圧の測定、体脂肪量の測定、体重の測定等により実現され得る。
「糖尿病の対象を同定する」または「糖尿病の対象を選択する」とは、糖尿病と同定された対象を同定または選択すること、あるいは、糖尿病（１型または２型）の何らかの症状、例えば、限定されるものではないが、少なくとも１１０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖、多尿、多渇症、インスリン抵抗性の上昇、および／またはインスリン感受性の低下を有する対象を同定または選択することを意味する。
「肥満の対象を同定する」または「肥満の対象を選択する」とは、肥満と診断された対象を同定または選択すること、あるいは、３０超のＢＭＩおよび／または男性においては１０２ｃｍ超の胴周りもしくは女性においては８８ｃｍ超の胴周りを有する対象を同定または選択することを意味する。
「脂肪異常症を有する対象を同定する」または「脂肪異常症を有する対象を選択する」とは、脂質および／またはリポタンパク質の過剰生産または欠乏を含む、脂質および／またはリポタンパク質代謝の障害と診断された対象を同定または選択することを意味する。脂質異常症は、コレステロールおよびトリグリセライド等の脂質並びに低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール等のリポタンパク質の上昇が認められ得る。
「脂肪増加を有する対象を同定する」または「脂肪増加を有する対象を選択する」とは、全身に渡る脂肪の分布並びに脂肪組織沈着の大きさおよび質量の１つまたは両方に対する懸念を含む体脂肪量の増加（または肥満）を有する対象を同定または選択することを意味する。体脂肪分布は、皮下脂肪測定、ウエスト／ヒップ比、または超音波、コンピュータトモグラフィー、もしくは磁気共鳴画像法等の技術により推定され得る。疾病管理予防センターによれば、肥満度指数（ＢＭＩ）が３０以上である個人は肥満と見なされる。
「心血管転帰の向上」とは、心血管の有害事象の発生またはそのリスクの低減を意味する。心血管有害事象の例としては、限定されるものではないが、死亡、再梗塞、脳卒中、心原性ショック、肺水腫、心停止、および心房律動異常が含まれる。
「すぐ隣接した」とは、すぐ隣接したエレメント間に介在するエレメントがないことを意味する。
「個体」または「対象」または「動物」とは、処置または治療に選択されたヒトまたは非ヒト動物を意味する。
「発現または活性を阻害する」とは、発現または活性の低下または遮断を意味し、必ずしも発現または活性の完全な消失を示すものではない。
「インスリン抵抗性」とは、細胞、例えば、脂肪細胞、筋細胞、および／または肝臓細胞から正常なインスリン反応を得るのに通常の量のインスリンでは不十分である状態として定義される。脂肪細胞におけるインスリン抵抗性は、貯蔵トリグリセリドの加水分解を引き起こし、血漿中の遊離脂肪酸を増加させる。筋肉中におけるインスリン抵抗性はグルコースの取込みを減らすが、肝臓におけるインスリン抵抗性はグルコースの貯蔵を減らし、どちらの影響も血糖を上昇させる。インスリン抵抗性による高血漿濃度のインスリンおよびグルコースはメタボリックシンドロームおよび２型糖尿病を招くことが多い。
「インスリン感受性」とは、個体がグルコースをどれだけ効果的に処理するかの尺度である。インスリン感受性の高い個体はグルコースを効果的に処理するが、インスリン感受性の低い個体はグルコースを効果的に処理しない。
「ヌクレオシド間結合」とは、ヌクレオシド間の化学結合を意味する。
「静脈内投与」とは、静脈中への投与を意味する。
「連結されたヌクレオシド」とは、結合された隣接ヌクレオシドを意味する。
「脂質低下」とは、対象における１種類以上の脂質の低下を意味する。脂質低下は、ある期間にわたり１つ以上の投薬によって起こり得る。
「脂質低下剤」とは、例えば、対象において脂質の低下を達成するために対象に与えられる、ＡＮＧＰＴＬ３特異的修飾物質を意味する。例えば、特定の実施形態では、脂質低下剤は、対象においてａｐｏＢ、ａｐｏＣ３、総コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＩＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃ、トリグリセリド、小粒子ＬＤＬ粒子、およびＬｐ（ａ）の１つ以上を低減するために対象に与えられる。「脂質低下療法」とは、対象において１種類以上の脂質を低減するために対象に与えられる治療レジメンを意味する。特定の実施形態では、脂質低下療法は、対象においてａｐｏＢ、ａｐｏＣ−ＩＩＩ、総コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＩＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃ、トリグリセリド、小粒子ＬＤＬ粒子、およびＬｐ（ａ）の１つ以上を低減するために与えられる。
「リポプロテイン」、例えばＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬとは、血清、血漿、およびリンパ中に見られる一群のタンパク質を意味し、脂質輸送に重要である。各リポプロテインの化学的組成は、ＨＤＬでは脂質に対するタンパク質の比率が高いがＶＬＤＬでは脂質に対するタンパク質の比率が低い点で異なる。
「低比重リポプロテイン−コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）」とは、低比重リポプロテイ
ン粒子中で運搬されているコレステロールを意味する。血清（血漿）中のＬＤＬ−Ｃ濃度は一般的にｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌで定量化される。「血清ＬＤＬ−Ｃ」および「血漿ＬＤＬ−Ｃ」とは、それぞれ血清および血漿中のＬＤＬ−Ｃを意味する。
「主要危険因子」とは、特定の疾患または状態に対する高いリスクの一因となる因子を意味する。特定の実施形態では、冠動脈心疾患の主要危険因子として、限定されるものではないが、喫煙、高血圧、低ＨＤＬ−Ｃ、冠動脈心疾患の家族歴、年齢、および本明細書に開示されているその他の因子が含まれる。
「代謝障害」または「代謝性疾患」とは、代謝機能の変化または障害を特徴とする状態を意味する。「代謝性」および「代謝」は当該技術分野で周知の用語であり、一般的に、生きた生物内で起こる全範囲の生化学的プロセスを含む。代謝障害には、限定されるものではないが、高血糖症、糖尿病前症、糖尿病（１型および２型）、肥満、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、および２型糖尿病による脂質異常症が含まれる。
「メタボリックシンドローム」とは、代謝起源の脂質および脂質でない心血管系危険因子のクラスタリングを特徴とする状態を意味する。特定の実施形態では、メタボリックシンドロームは、以下の因子のいずれか３つの存在により同定される：腹囲が男性で１０２ｃｍ超、女性で８８ｃｍ超；血清トリグリセリドが少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ；ＨＤＬ−Ｃが男性で４０ｍｇ／ｄＬ未満、女性で５０ｍｇ／ｄＬ未満；血圧が少なくとも１３０／８５ｍｍＨｇ；および空腹時血糖が少なくとも１１０ｍｇ／ｄＬ。これらの決定因子は診療により容易に測定可能である（ＪＡＭＡ， ２００１， ２８５： ２４８６−２４９７）。
「ミスマッチ」または「非相補的核酸塩基」とは、第１の核酸の核酸塩基が第２または標的の核酸の対応する核酸塩基と対形成できない場合を意味する。
「混合型脂質異常症」とは、コレステロールの上昇およびトリグリセリドの上昇を特徴とする状態を意味する。
「修飾ヌクレオシド間結合」とは、天然のヌクレオシド間結合（すなわちホスホジエステルヌクレオシド間結合）からの置換または任意の変化を意味する。
「修飾核酸塩基」とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、またはウラシル以外の任意の核酸塩基を意味する。「非修飾核酸塩基」とは、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を意味する。
「修飾ヌクレオシド」とは、独立して、１つ以上の修飾糖部分または修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。
「修飾ヌクレオチド」とは、独立して、１つ以上の修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。「修飾ヌクレオシド」とは、独立して、１つ以上の修飾糖部分または修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。
「修飾オリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味する。
「修飾糖」とは、天然糖からの置換または変化を意味する。
「モチーフ」とは、アンチセンス化合物中の化学的に異なる領域のパターンを意味する。
「ＭＴＰ阻害剤」とは、酵素、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク質を阻害する薬剤を意味する。
「天然ヌクレオシド間結合」とは、３’→５’ホスホジエステル結合を意味する。
「天然糖部分」とは、ＤＮＡ（２’−Ｈ）またはＲＮＡ（２’−ＯＨ）中に見出される糖を意味する。
「非アルコール性脂肪性肝疾患」または「ＮＡＦＬＤ」とは、アルコールの過剰摂取（例えばアルコール消費量が２０ｇ／日を超える）によるものでない肝臓の脂肪炎症を特徴とする状態を意味する。特定の実施形態では、ＮＡＦＬＤは、インスリン抵抗性およびメタボリックシンドロームに関連する。ＮＡＦＬＤには、単純な幹細胞中へのトリグリセリド蓄積（脂肪肝）から炎症を伴う脂肪肝（脂肪性肝炎）、線維症、硬変症までにわたる疾患が含まれる。
「非アルコール性脂肪性肝炎」（ＮＡＳＨ）は、ＮＡＦＬＤがトリグリセリドの沈着から更に進行して起こる。ＮＡＳＨの発症には、壊死、炎症、繊維症を誘導できる「ｓｅｃｏｎｄ ｈｉｔ」が必要である。ｓｅｃｏｎｄ ｈｉｔの候補は、酸化ストレスの増加を起こす因子および炎症促進性サイトカインの発現を促進する因子の広いカテゴリーに分類することができる。肝臓トリグリセリドの増加により動物およびヒトの肝細胞において酸化的ストレスが引き起こされることが示されており、肝臓トリグリセリドの蓄積、酸化的ストレス、および脂肪肝のＮＡＳＨへの進行の間に因果関係が潜在することが示唆される（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ａｎｄ Ｈｏｒｔｏｎ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， ２００４， １１４， １４７−１５２）。高トリグリセリド血症および高脂肪酸血症により、末梢組織においてトリグリセリドの蓄積が引き起こされ得る（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ｅｔ
ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ２００４， ３２２， １０８０−１０８５）。
「核酸」とは、単量体ヌクレオチドで構成される分子を意味する。核酸には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸、二本鎖核酸、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。核酸は１分子中にこれらのエレメントの組合せを含んでもよい。
「核酸塩基」とは、別の核酸の塩基と対形成できるヘテロ環部分を意味する。
「核酸塩基配列」とは、如何なる糖、結合、または核酸塩基修飾とも無関係の、連続核酸塩基の順番を意味する。
「ヌクレオシド」とは、糖に連結した核酸塩基を意味する。
「ヌクレオシド模倣物（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）」には、オリゴマー化合物の１つ以上の位置で糖または糖および塩基並びに必要に応じて結合を置換するために使用される構造が含まれ、例えば、モルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、ビシクロ、またはトリシクロ糖模倣物、例えば非フラノース糖単位、を有するヌクレオシド模倣物が含まれる。
「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を有するヌクレ
オシドを意味する。
「ヌクレオチド模倣物」は、例えばペプチド核酸またはモルホリノ（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または他の非ホスホジエステル結合により連結されたモルホリノ）等の、オリゴマー化合物の１つ以上の位置でヌクレオシドおよび結合を置換するために使用される構造を含む。
「オリゴマー化合物」または「オリゴマー」とは、２種以上のサブ構造を含み且つ核酸分子の領域にハイブリダイズできる高分子構造を意味する。特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオシドである。特定の実施形態では、オリゴマー化合物はオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、オリゴマー化合物はアンチセンス化合物である。特定の実施形態では、オリゴマー化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、オリゴマー化合物はキメラオリゴヌクレオチドである。
「オリゴヌクレオチド」とは、連結されたヌクレオシドのポリマーを意味し、各ヌクレオシドは互いに独立して修飾されていてもよく、修飾されていなくてもよい。
「非経口投与」とは、消化管を介する以外の方法による投与を意味する。非経口投与は、局所投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または頭蓋内投与、例えば髄腔内投与、または脳室内投与を含む。投与は、持続投与、慢性投与、短期間投与、または間欠投与であり得る。
「ペプチド」とは、アミド結合により少なくとも２個のアミノ酸を連結することにより形成される分子を意味する。ペプチドとは、ポリペプチドおよびタンパク質を意味する。
「医薬剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）」とは、個体に投与された時に治療上の利点をもたらす物質を意味する。例えば、特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが医薬剤である。
「医薬組成物」とは、個体への投与に適した物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は、１つ以上の活性薬剤および無菌水溶液を含み得る。
「薬学的に許容されるキャリア」とは、オリゴヌクレオチドの構造または機能に干渉しない媒体または希釈剤を意味する。特定のそのようなキャリアは、例えば対象による経口摂取のための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁液、およびトローチ剤として医薬組成物を製剤化することを可能にする。特定のそのようなキャリアは、注射または注入用に医薬組成物を製剤化することを可能にする。例えば、薬学的に許容されるキャリアは無菌水溶液であり得る。
「薬学的に許容される塩」とは、アンチセンス化合物の生理学的および薬学的に許容される塩、すなわち元のオリゴヌクレオチドの所望の生物学的活性を保持しており、望ましくない毒性の影響を与えない塩を意味する。
「ホスホロチオエート結合」とは、非架橋酸素原子の１つを硫黄原子で置換することによりホスホジエステル結合が修飾されているヌクレオシド間の結合を意味する。ホスホロチオエート結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
「部分」とは、核酸の所定の数の連続（すなわち連結された）核酸塩基を意味する。特定の実施形態では、部分または一部は、標的核酸の所定の数の連続核酸塩基である。特定の実施形態では、部分または一部は、アンチセンス化合物の所定の数の連続核酸塩基であ
る。
「防止する」とは、数分から永久までの期間、疾患、障害、または状態の発症または発達を遅らせるまたは未然に防ぐことを意味する。防止するとは、疾患、障害、または状態を発達させるするリスクを低減することも意味する。
「プロドラッグ」とは、体内またはその細胞中で内因性の酵素またはその他の化学物質若しくは条件の作用によって活性型に変換される不活性型で調製される治療薬剤を意味する。
「副作用」とは、所望の効果以外の、処置に起因する生理学的反応を意味する。特定の実施形態では、副作用は、注射部位反応、肝機能検査異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常、ミオパチー、および倦怠感を含む。例えば、血清中のアミノトランスフェラーゼ濃度の上昇は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。例えば、ビリルビンの上昇は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。
「一本鎖オリゴヌクレオチド」とは、相補鎖にハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドを意味する。
「特異的にハイブリダイズできる」とは、所望の効果を誘導するのに十分な程度の相補性を標的核酸との間に有しつつ、特異的結合が望まれる条件下、すなわちインビボアッセイおよび治療処置の場合の生理学的条件下で非標的核酸に対する影響が最低限であるか影響がないアンチセンス化合物を指す。
「スタチン」とは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性を阻害する薬剤を意味する。
「皮下投与」とは、皮膚の直下での投与を意味する。
「標的とする」とは、標的核酸に特異的にハイブリダイズして所望の効果を誘導するアンチセンス化合物の設計および選択プロセスを意味する。
「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、および「標的ＲＮＡ転写産物」は全て、アンチセンス化合物の標的となり得る核酸を指す。
「標的領域」とは、少なくとも１つの同定可能な構造、機能、または特性を有する標的核酸の一部分と定義される。
「標的セグメント」とは、１つ以上のアンチセンス化合物の標的となる、標的核酸のヌクレオチドの配列を意味する。「５’標的部位」とは、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指す。「３’標的部位」とは、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。
「治療有効量」とは、個体に治療効果を与える薬剤の量を意味する。
「治療的なライフスタイル変化」とは、脂肪／脂肪組織質量および／またはコレステロールを下げることを意図した食事およびライフスタイルの変化を意味する。そのような変化は心疾患を発達させるリスクを低減することができ、食事から摂取する一日の総カロリー、総脂肪、飽和脂肪、多価不飽和脂肪、一価不飽和脂肪、炭水化物、タンパク質、コレステロール、不溶性繊維についての推奨および身体活動についての推奨を含み得る。
「トリグリセリド」とは、３個の脂肪酸分子と結合したグリセロールからなる脂質または中性脂肪を意味する。
「２型糖尿病」（「２型真性糖尿病」、「インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）」、「肥満関連糖尿病」、または「成人発症型糖尿病」としても知られる）とは、インスリン抵抗性、相対的インスリン欠乏、および高血糖症を主な特徴とする代謝障害である。
「処置する」とは、疾患、障害、または状態を変化または好転させるために医薬組成物を投与することを意味する。
「非修飾ヌクレオチド」とは、天然の核酸塩基、糖部分、およびヌクレオシド間結合から構成されるヌクレオチドを意味する。特定の実施形態では、非修飾ヌクレオチドはＲＮＡヌクレオチド（すなわちβ−Ｄ−リボヌクレオシド）またはＤＮＡヌクレオチド（すなわちβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド）である。
特定の実施形態
特定の実施形態では、本発明の化合物または組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。ＡＮＧＰＴＬ３標的は、配列番号１〜５のいずれか１つから選択される配列を有し得る。
特定の実施形態では、本発明の化合物または組成物は、配列番号１〜５の同じ長さの部分に相補的な少なくとも８個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１０〜３０ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、本発明の化合物または組成物は、配列番号３４〜１８２のいずれから選択される塩基配列の少なくとも８個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１０〜３０ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、本発明の化合物または組成物は、１０〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、且つ配列番号３４〜１８２のいずれか１つに記載の配列から選択される核酸塩基配列の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、本発明の化合物または組成物は修飾オリゴヌクレオチドの塩を含む。
特定の実施形態では、本発明の化合物または組成物は、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を更に含む。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、修飾オリゴヌクレオチドの全体を基準にした測定で配列番号１〜５のいずれか１つに少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％相補的である。
特定の実施形態では、本発明の化合物は一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の連結されたヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは２０個の連結されたヌクレオシドからなる。
特定の実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、修飾されたヌクレオシド間結合である。特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは修飾糖を含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、テトラヒドロピラン環でフラノース環が置換された少なくとも１つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、各テトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドは、

（式中、Ｂｘは、保護されていてもよいヘテロ環塩基部分である）で表される。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は二環式糖である。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は、２’−Ｏ−メトキシエチルまたは４’（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋（式中、ｎは１または２である）を含む。
特定の実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは修飾核酸塩基を含む。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は５−メチルシトシンである。
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ａ）連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；ｂ）連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；およびｃ）連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含む。ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは修飾糖を含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは２０個の連結されたヌクレオシドからなり、ギャップセグメントは１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなり、５’ウィングセグメントは５個の連結されたヌクレオシドからなり、３’ウィングセグメントは５個の連結されたヌクレオシドからなり、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
特定の実施形態では、本発明の化合物または組成物は、配列番号１〜５の同じ長さの部分に相補的な少なくとも８個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する２０個の連結されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドは、ａ）１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；ｂ）５個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；およびｃ）５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含む。ギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は５−メチルシトシンである。
特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物には、任意の配列番号３４〜１８２から選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも８の隣接ヌクレオ塩基を含むヌクレオ塩基配列を有する、２０の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。その中で、修飾オリゴヌクレオチドは、ａ）１０の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、ｂ）５つの結合ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、及びｃ）５つの結合ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含む。ギャップセグメントは、５
’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、及び各シトシン残基は５−メチルシトシンである。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害するための方法、化合物及び組成物を提供する。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物へ投与することを含む、動物においてＡＮＧＰＴＬ３発現を低下させる方法を提供する。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物へ投与することを含む、動物においてＡｐｏＣ−ＩＩＩ発現を低下させる方法を提供する。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物へ投与し、よって動物におけるトリグリセリドのレベルを低下させることを含む、動物においてトリグリセリド値を低下させる方法を提供する。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物へ投与し、よって、動物においてコレステロールのレベルを低下させることを含む、動物におけるコレステロール値を低下させる方法を提供する。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物へ投与し、よって動物において低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のレベルを低下させることを含む、動物における低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）値を低下させる方法を提供する。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物へ投与し、よって動物においてグルコースのレベルを低下させることを含む、動物におけるグルコース値を低下させる方法を提供する。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物へ投与し、よって動物において代謝性疾患又は心血管系疾患を寛解させることを含む、動物における代謝性疾患又は心血管系疾患を寛解させる方法を提供する。
特定の実施形態では、ａ）この動物をＡＮＧＰＴＬ３関連疾患又は状態と同定すること、及びｂ）ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物の治療的有効量を前記動物に投与することを含む、ＡＮＧＰＴＬ３関連疾患又は状態の動物を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、動物に投与する治療的有効量の化合物が、動物におけるＡＮＧＰＴＬ３関連疾患又は状態を低減する。
特定の実施形態では、ａ）前記動物を代謝性疾患又は心血管系疾患と同定すること、及びｂ）２０の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、及び前記修飾オリゴヌクレオチド全体を測定し、配列番号１〜５に対して少なくとも９０％相補的である
ヌクレオ塩基配列を有する治療的有効量の化合物を前記動物に投与し、よって、代謝性疾患又は心血管系疾患を有する動物を治療することを含む、代謝性疾患又は心血管系疾患を有する動物を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、動物に投与する治療的有効量の化合物は、動物において代謝性疾患又は心血管系疾患を低減する。
特定の実施形態では、２０の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、及び前記修飾オリゴヌクレオチドの全体を測定し、配列番号１〜５に対して少なくとも９０％相補的であるヌクレオ塩基配列を有するＡＮＧＰＴＬ３阻害剤を投与することで、ヒトにおいて、ＡＮＧＰＴＬ３値、ＬＤＬ値、ａｐｏＣ−ＩＩＩ値、トリグリセリド値、コレステロール値、グルコース値、脂肪パッド量、心血管系疾患及び代謝性疾患のうち１つ以上を低下させる方法を提供する。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害するための、本明細書に記載の化合物及び組成物の利用を提供する。
特定の実施形態では、動物においてＡＮＧＰＴＬ３発現を低下させるための、本明細書に記載の化合物及び組成の利用を提供する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物へ投与することを含む。
特定の実施形態では、動物においてＡｐｏＣ−ＩＩＩ発現を低下させるための、本明細書に記載の化合物及び組成物の利用を提供する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物へ投与し、よって動物においてＡｐｏＣ−ＩＩＩの発現を低下させることを含む。
特定の実施形態では、動物におけるトリグリセリド値を低下させるための、本明細書に記載の化合物及び組成物の利用を提供する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物へ投与し、よって動物においてトリグリセリド値を低下させることを含む。
特定の実施形態では、動物におけるコレステロール値を低下させるための、本明細書に記載の化合物及び組成物の利用を提供する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物へ投与し、よって動物におけるコレステロール値を低下させることを含む。
特定の実施形態では、動物において低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）値を低下させるための、本明細書に記載の化合物及び組成物の利用を提供する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物へ投与し、よって動物における低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の値を低下させることを含む。
特定の実施形態では、動物におけるグルコース値を低下させるための、本明細書に記載の化合物及び組成物の利用を提供する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物へ投与し、よって動物におけるグルコースの値を低下させることを含む。
特定の実施形態では、動物における代謝性疾患又は心血管疾患を寛解させるための、本明細書に記載の化合物及び組成物の利用を提供する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含
む化合物を動物へ投与し、よって動物における代謝性疾患又は心血管疾患を寛解させることを含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載の治療用化合物及び組成物の利用を提供する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３関連疾患又は状態の動物を治療するための、本明細書に記載の化合物及び組成物の利用を提供する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３関連疾患又は状態は、代謝性疾患又は心血管系疾患である。ある実施形態は、ａ）前記動物をＡＮＧＰＴＬ３関連疾患又は状態であると同定すること、及びｂ）ＡＮＧＰＴＬ３を標的とした、長さ１０〜３０結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む治療的有効量の化合物を前記動物に投与することを含む。特定の実施形態では、動物に投与する治療的有効量の化合物が、動物においてＡＮＧＰＴＬ３関連疾患又は状態を低減する。
特定の実施形態では、代謝性疾患又は心血管系疾患を有する動物を治療するための、本明細書に記載の化合物及び組成物の利用を提供する。ａ）前記動物を代謝性疾患又は心血管系疾患を有すると同定すること、及びｂ）２０の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体を測定し、配列番号１〜５に対して少なくとも９０％相補的であるヌクレオ塩基配列を有する治療的有効量の化合物を前記動物に投与し、よって、代謝性疾患又は心血管系疾患を有する動物を治療することを含む。特定の実施形態では、治療的有効量の化合物を動物に投与すると、この動物において代謝性疾患又は心血管系疾患を低減させる。
特定の実施形態では、２０の結合ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、及び前記修飾オリゴヌクレオチドの全体を測定し、配列番号１〜５に対して少なくとも９０％相補的であるヌクレオ塩基配列を有するＡＮＧＰＴＬ３阻害剤を投与することで、ヒトにおいて、ＡＮＧＰＴＬ３値、ＬＤＬ値、ａｐｏＣ−ＩＩＩ値、トリグリセリド値、コレステロール値、グルコース値、脂肪パッド量、心血管系疾患及び代謝性疾患のうち１つ以上を低下させるための、本明細書に記載の化合物及び組成物の利用を提供する。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３は遺伝子バンクアクセッション番号ＢＧ４００４０７．１（本明細書では配列番号１として含める）に記載の配列を有する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３は、遺伝子バンクアクセッション番号ＢＧ５６２５５５．１（本明細書では配列番号２として含める）に記載の配列を有する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３は、遺伝子バンクアクセッション番号ＢＧ５６２７９８．１（本明細書では配列番号３として含める）に記載の配列を有する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３は、遺伝子バンクアクセッション番号ＮＭ＿０１４４９５．１（本明細書では配列番号４として含める）に記載の配列を有する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３は、遺伝子バンクアクセッション番号ＮＴ＿０３２９７７．５ヌクレオチド１５５１１７０２〜１５５２１０８２（本明細書では配列番号５として含める）に記載の配列を有する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３は、遺伝子バンクアクセッション番号ＡＦ１６２２２４．１（本明細書では配列番号６として含める）に記載の配列を有する。特定の実施形態では、遺伝子バンクアクセッション番号ＡＩ１９５５２４．１（本明細書では配列番号７として含める）に記載の配列を有する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３は、遺伝子バンクアクセッション番号ＢＢ７１７５０１．１（本明細書では配列番号８として含める）に記載の配列を有する。
特定の実施形態では、動物はヒトである。
特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、第１剤として指定され、本発明の方法又は利用には、第２剤としての投与がさらに含まれる。特定の実施形態では、第１剤及び第２剤を共投与する。特定の実施形態では、第１剤及び第２剤を連続して、又は同時に共投与する。
特定の実施形態では、第２剤はグルコース降下薬である。グルコース降下薬には、治療的ライフスタイルの改善、ＰＰＡＲ抗体、ジペプチジルペプチダーゼ（ＩＶ）阻害剤、ＧＬＰ−１類似体、インスリン若しくはインスリン類似体、インスリン分泌促進物質、ＳＧＬＴ２阻害剤、ヒトのアミリン類似体、ビグアニド、α−グルコシダーゼ阻害剤、又はそれらの組み合わせが含まれるがこれに限定されない。グルコース降下薬には、メトホルミン、スルホニル尿素、ロシグリタゾン、メグリチニド、チアゾリジンジオン、α−グルコシダーゼ阻害剤、又はそれらの組み合わせが含まれるがこれに限定されない。スルホニル尿素は、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリド、又はグリクラジドであり得る。メグリチニドは、ナテグリニド又はレパグリニドであり得る。チアゾリジンジオンは、ピオグリタゾン又はロシグリタゾンであり得る。α−グルコシダーゼは、アカルボース又はミグリトールであり得る。
特定の実施形態では、第２剤は脂質降下治療である。特定の実施形態では、脂質降下治療には、治療的ライフスタイルの改善、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、ＭＴＰ阻害剤、ＡｐｏＢを標的としたアンチセンス化合物、又はそれらの組み合わせが含まれるがこれに限定されない。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、アトルバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、又はシンバスタチンであり得る。コレステロール吸収阻害剤はエゼチミベであり得る。
特定の実施形態では、投与には非経口投与が含まれる。
特定の実施形態では、代謝性疾患又は心血管系疾患には、肥満、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、冠状動脈性心臓病、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）
、高脂肪酸血症若しくはメタボリックシンドローム、又はそれらの組み合わせが含まれるがこれに限定されない。脂質異常症は、高脂血症であり得る。高脂血症は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、又は高コレステロール血症及び高トリグリセリド血症の併発であり得る。ＮＡＦＬＤは、脂肪肝又は脂肪性肝炎であり得る。糖尿病は、２型糖尿病又は脂質異常症を伴う２型糖尿病であり得る。
特定の実施形態では、本発明の化合物を投与することにより、トリグリセリド値、コレステロール値、インスリン抵抗性、グルコース値又はそれらの組み合わせを含む、脂質値が低下する。１つ以上のこの値が、非依存的に、５％、１０％、２０％、３０％、３５％又は４０％低下し得る。本発明の化合物を投与することにより、インスリン感受性又は肝臓インスリン感受性が改善し得る。本発明の化合物を投与することにより、アテローム斑、肥満、グルコース、脂質、グルコース抵抗性、コレステロール、又はインスリン感受性の改善、又はそれらの任意の組み合わせが低下し得る。
特定の実施形態では、１つ以上の代謝性疾患又は心血管系疾患の治療、寛解、遅延又は予防のための薬品の製造において、本明細書に記載の化合物の利用を提供する。
特定の実施形態では、本明細書に記載の、１つ以上の代謝性疾患又は心血管系疾患の治療、予防又は寛解のためのキットを提供する。このキットには、ａ）本明細書に記載の化合物、及び、任意選択的にｂ）本明細書に記載の追加の薬剤又は治療が含まれる。このキットにはさらに、１つ以上の代謝性疾患又は心血管系疾患の治療、予防又は寛解に使用するための利用ガイド又はラベルが含まれる。
アンチセンス化合物
オリゴマー化合物には、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣物、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びｓｉＲＮＡが含まれるがこれに限定されない。オリゴマー化合物は、標的核酸に対する「アンチセンス」であり得る。すなわち、水素結合により標的核酸とのハイブリダイゼーションを行う能力を有するという意味である。
特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、５’から３’の方向に転写する場合、それが標的とする標的核酸の標的セグメントの化合物の逆相補を含むヌクレオ塩基配列を有する。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’の方向に転写する場合、それが標的とする標的核酸の標的セグメントの逆相補を含むヌクレオ塩基配列を有する。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さ１０〜３０のヌクレオチドである。すなわち、アンチセンス化合物は、１０〜３０の結合ヌクレオ塩基である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、８〜８０、１０〜８０、１２〜５０、１５〜３０、１８〜２４、１９〜２２、又は２０の結合ヌクレオ塩基からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。そのような実施形態のうち特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、長さ８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、又は８０結合ヌクレオ塩基長、又は上記の任意の２つの値により定められる範囲の結合ヌクレオ塩基長からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、短縮又は切断された修飾オリゴヌクレオチドを含む。短縮又は切断された修飾オリゴヌクレオチドは、５’末端（５’末端切断）、又は代替的に３’末端（３’切断）から取り除かれた単一なヌクレオシドを有することができる。短縮又は切断されたオリゴヌクレオチドは、５’末端から取り除かれた２つ以上のヌクレオシド、又は代替的に３’末端から取り除かれた２つ以上のヌクレオシドを有することができる。代わりに、取り除かれたヌクレオシドは、修飾オリゴヌクレオチド全体に、例えば、５’末端から取り除かれた１つ以上のヌクレオシド及び３’末端から取り除かれた１つ以上のヌクレオシドを有するアンチセンス化合物において分散され得る。
単一の追加ヌクレオシドが、長鎖オリゴヌクレオチドに存在する場合、追加のヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端又は中心部に位置し得る。２つ以上の追加のヌクレオシドが存在する場合、追加のヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの５’末端（５’追加）、又は代替的に３’末端（３’追加）若しくは中心部に加えられた２つのヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドにおいて、互いに隣接し得る。代わりに、追加されたヌクレオシドは、例えば、５’末端に追加された１つ以上のヌクレオシド、３’末端に追加された１つ以上のヌクレオシド、及び／又は中心部に追加された１つ以上のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドにおいて、アンチセンス化合物全体に分散し得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチド等のアンチセンス化合物の長さを伸ばす若しくは縮めること、及び／又は活性を損なうことなく不適正塩基を挿入することは可能である。例えば、Ｗｏｏｌｆら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７３０５−７３０９， １９９２）においては、１３〜２５ヌクレオ塩基長からなる一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、卵母細胞注射モデルで標的ＲＮＡの切断を誘導する能力が試験された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端付近に８又は１１の不適正塩基を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端付近に８又は１１の不適正塩基を有している２５ヌクレオ塩基長は、不適正塩基対をまったく含まないアンチセンスオリゴヌクレオチド程ではないが、標的ｍＲＮＡの特異的切断を指示することができた。同様に標的特異的切断は、１〜３の不適正塩基対を有するものを含め、１３ヌクレオ塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて達成された。
Ｇａｕｔｓｃｈｉら（Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９３：４６３−４７１，Ｍａｒｃｈ，２００１）は、ｂｃｌ−２ｍＲＮＡに対し１００％相補性を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでｂｃｌ−２とｂｃｌ−ｘＬの両発現を低下させるｂｃｌ−ｘＬｍＲＮＡに対し不適正塩基対を３つ有するオリゴヌクレオチドの能力を示した。さらに、本オリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示した。
Ｍａｈｅｒ及びＤｏｌｎｉｃｋ （Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． １６：３３４１−３３５８， １９８８）は、タンデムな一連の１４ヌクレオ塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、それぞれ２つ又は３つのタンデムなアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列で構成されている２８並びに４２ヌクレオ塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対し、ウサギの網状赤血球アッセイにおいてヒトＤＨＦＲの翻訳を停止させる能力について試験を行った。３つのうち、１４ヌクレオ塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドのみが翻訳を阻害することができた。但し、２８又は４２ヌクレオ塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも低いレベルで作用した。
アンチセンス化合物モチーフ
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的化したアンチセンス化合物は、増強した阻害活性、標的核酸に対する増加した結合親和性、またはインビボヌクレアーゼによる分解抵抗（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）などのアンチセンス
化合物特性を与えるパターンまたはモチーフに配列された、化学的に修飾されたサブユニットを持つ。
キメラアンチセンス化合物は、典型的には、ヌクレアーゼ分解への抵抗性の増加、細胞取込みの増加、標的核酸に対する結合親和性の増加、および／または阻害活性の増加を与えるように、少なくとも１つの修飾領域を含む。キメラアンチセンス化合物の第二領域は、随意に細胞エンドヌクレアーゼＲＮａｓｅ Ｈの基質の機能をもち得、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する。
ギャップマーモチーフを持つアンチセンス化合物はキメラアンチセンス化合物であると考えられる。ギャップマーでは、ＲＮａｓｅ Ｈ開裂を促進する複数のヌクレオチドを持つ内部領域は、内部領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを持つ外部領域間に位置する。ギャップマーモチーフを持つアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ギャップセグメントは一般にエンドヌクレアーゼ切断の基質としの機能をもち、いっぽうでウィングセグメントは修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、ギャップマー領域は各異なる領域を含む糖部分の種類により区別される。ギャップマー領域を区別するために使用される糖部分の種類として、いくつかの実施形態では、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド、２’−修飾ヌクレオシド（この２’−修飾ヌクレオシドは、とりわけ２’−ＭＯＥおよび２’−Ｏ−ＣＨ３を含み得る）および二環式糖修飾ヌクレオシド（この二環式糖修飾ヌクレオシドは４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋（式中ｎ＝１またはｎ＝２）を持つものを含み得る）が挙げられる。好ましくは、各異なる領域は一様な糖部分を含む。ウィング−ギャップ−ウィングモチーフは、しばしば「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記載され、「Ｘ」は５’ウィング領域の長さを表し、「Ｙ」はギャップ領域の長さを表し、「Ｚ」は３’ウィング領域を表す。本明細書に使用される場合、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記載されるギャップマーは、ギャップセグメントが各５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントに直接隣接して位置するような構造を持つ。従って、介在しないヌクレオチドが５’ウィングセグメントとギャップセグメントの間に、またはギャップセグメントと３’ウィングセグメントとの間に存在する。本明細書に記載のアンチセンス化合物のいずれかが、ギャップマーモチーフをもち得る。いくつかの実施形態では、ＸおよびＺは同一であり、他の実施形態では異なる。好ましい実施形態では、Ｙは８〜１５ヌクレオチドである。Ｘ、Ｙ、またはＺは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のヌクレオチドのいずれかであり得る。従って、ギャップマーとして、これに限定されないが、例えば５−１０−５、４−８−４、４−１２−３、４−１２−４、３−１４−３、２−１３−５、２−１６−２、１−１８−１、３−１０−３、２−１０−２、１−１０−１、２−８−２、６−８−６、５−８−５、１−８−１、２−６−２、６−８−６、５−８−５、１−８−１、２−６−２、２−１３−２、１−８−２、２−８−３、３−１０−２、１−１８−２、または２−１８−２が挙げられる。
特定の実施形態では、ウィング−ギャップまたはギャップ−ウィング構造、すなわちギャップマー構造に関する上記のＸ−ＹまたはＹ−Ｚ構造を持つ「ウィングマー」モチーフとしてのアンチセンス化合物。従って、ウィングマー構造としては、これに限定されないが、例えば５−１０、８−４、４−１２、１２−４、３−１４、１６−２、１８−１、１０−３、２−１０、１−１０、８−２、２−１３、または５−１３が挙げられる。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的化したアンチセンス化合物は５−１０−５ギャップマーモチーフを持つ。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的化したアンチセンス化合物はギャップ
拡大（ｇａｐ−ｗｉｄｅｎｅｄ）モチーフを持つ。
標的核酸、標的領域、およびヌクレオチド配列
ＡＮＧＰＴＬ３をコードするヌクレオチド配列としては、これに限定されないが、以下が挙げられる：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＧ４００４０７．１（配列番号１として本明細書中に組み込まれる）、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＧ５６２５５５．１（配列番号２として本明細書中に組み込まれる）、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＧ５６２７９８．１（配列番号３として本明細書中に組み込まれる）、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１４４９５．１（配列番号４として本明細書中に組み込まれる）、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＴ＿０３２９７７．５ヌクレオチド１５５１１７０２〜１５５２１０８２（配列番号５として本明細書中に組み込まれる）、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ１６２２２４．１（配列番号６として本明細書中に組み込まれる）、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＩ１９５５２４．１（配列番号７として本明細書中に組み込まれる）、およびＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＢ７１７５０１．１（配列番号８として本明細書中に組み込まれる）に記載のヒトの配列。本明細書に含まれる実施例の各配列番号に記載の配列は、糖部分、ヌクレオシド間連結、または核酸塩基に対するいかなる修飾も無関係であることが理解される。そうしたことから、配列番号により定義されるアンチセンス化合物は独立して糖部分、ヌクレオシド間連結、または核酸塩基に対する１つ以上の修飾を含み得る。Ｉｓｉｓ番号（Ｉｓｉｓ Ｎｏ．）により記載されるアンチセンス化合物は核酸塩基配列とモチーフの組み合わせを示す。
特定の実施形態では、標的領域は、化学構造的に定義された標的核酸領域である。例えば、標的領域は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、エクソン／イントロンジャンクション、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、または他の定義された核酸領域を包含し得る。ＡＮＧＰＴＬ３に関して化学構造的に定義された領域は、ＮＣＢＩなどの配列データベースからの受託番号により得ることができ、この情報は引用により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、標的領域は、標的領域内のある標的セグメントの５’標的部位から標的領域内の別の標的セグメントの３’標的部位の配列を包含し得る。
特定の実施形態では、「標的セグメント」は核酸内の標的領域のより小さく下位部分である。例えば、標的セグメントは１つ以上のアンチセンス化合物が標的化する標的核酸のヌクレオチド配列であり得る。「５’標的部位」は標的セグメントの最も５’のヌクレオチド（５’−ｍｏｓｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を表す。「３’標的部位」は標的セグメントの最も３’のヌクレオチド（３’−ｍｏｓｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を表す。
標的化は、アンチセンス化合物とハイブリダイズを形成する少なくとも１つの標的セグメントを決定して、所望の効果を生じることを含む。特定の実施形態では、所望の効果はｍＲＮＡ標的核酸濃度が減少することである。特定の実施形態では、所望の効果は、標的核酸によりコードされるタンパク質濃度が減少すること、または標的核酸に関連する表現型が変わることである。
標的領域は、１つ以上の標的セグメントを含有し得る。標的領域内の多重標的セグメント（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｇｍｅｎｔ）は重複であり得る。あるいは、多重標的セグメントは非重複であり得る。特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは約３００以下のヌクレオチドで分離されている。特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上で２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチドで、およそその数で、それ以下で、およそそれ以下での数のヌクレオチドにより分離されているか、または上記値のい
ずれか２つで定義される範囲である。特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは標的核酸上で５以下のヌクレオチドで、または約５以下のヌクレオチドで分離されている。特定の実施形態では、標的セグメントは隣接している。本明細書に列挙された５’標的部位または３’標的部位のいずれかである開始核酸を持つ範囲で定義される標的領域が考えられる。
好適な標的セグメントは、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、イントロン、エクソン、またはエクソン／イントロンジャンクション内に見出され得る。開始コドンまたは終止コドンを含む標的セグメントもまた好適な標的セグメントである。好適な標的セグメントは具体的には開始コドンまたは終止コドンなどのある化学構造的に定義された領域を除外し得る。
好適な標的セグメントの決定は、標的核酸の配列とゲノム全体の他の配列とを比較することを含み得る。例えば、アルゴリズムは、様々な核酸の中で類似する領域を特定するために使用し得る。この比較は、選択された標的核酸以外の配列（すなわち非標的または標的外配列）と特異的な方法でハイブリダイズを形成し得るようなアンチセンス化合物配列の選択を阻止し得る。
標的活性領域内ではアンチセンス化合物の活性（例えば標的核酸濃度の低下パーセントに記載されるような）のばらつきが存在し得る。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ濃度の減少はＡＮＧＰＴＬ３タンパク質発現の阻害を示す。ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質濃度の減少はまた、標的ｍＲＮＡ発現の阻害を示す。さらに、表現型、例えば、表現型の変化、コレステロール、ＬＤＬ、トリグリセリド、またはグルコースの濃度の減少などはＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現の阻害を示し得る。
ハイブリダイゼーション
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは本明細書に記載のアンチセンス化合物とＡＮＧＰＴＬ３核酸の間で生じる。最も一般的なハイブリダイゼーション機構は核酸分子相補的核酸塩基間に水素結合（例えばＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合）を伴う。
ハイブリダイゼーションは様々な条件下で生じ得る。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、ハイブリダイズを形成する核酸分子の特質と組み合わせにより決定される。
配列が標的核酸と具体的にハイブリダイズを形成するか否かを決定する方法は当技術分野で公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄ．、２００１）。特定の実施形態では、本明細書で提供するアンチセンス化合物は具体的にはＡＮＧＰＴＬ３核酸でハイブリダイズを形成可能である。
相補性
アンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が対応する標的核酸の核酸塩基と水素結合して所望の効果が生じる場合（例えばＡＮＧＰＴＬ３核酸などの標的核酸のアンチセンス阻害）、アンチセンス化合物および標的核酸は互いに相補的である。
アンチセンス化合物はＡＮＧＰＴＬ３核酸の１つ以上のセグメントにわたりハイブリダイズを形成し得、介在セグメントまたは隣接セグメントはハイブリダイゼーション事象（例えばループ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造）に関連しない。
特定の実施形態では、本明細書で提供するアンチセンス化合物、またはその特定部分は
ＡＮＧＰＴＬ３核酸、標的領域、標的セグメント、またはその特定部分に７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％相補的または少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％相補的である。特定の実施形態では、本明細書で提供するアンチセンス化合物、またはその特定部分は、１つ以上の配列番号１〜５の配列に７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％相補的、または少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％相補的である。アンチセンス化合物の標的核酸とのパーセント相補性は、常法を用いて決定し得る。
例えば、アンチセンス化合物の２０核酸塩基のうち１８核酸塩基が標的領域に相補的であって具体的にハイブリダイズを形成するアンチセンス化合物は９０パーセントの相補性を表す。この例では、残存する非相補的核酸塩基はクラスタ化または相補的核酸塩基が散在化し得、必ずしも互いに隣接するまたは相補的核酸塩基に隣接していない。そのため、４（４つの）非相補的核酸塩基を有する長さの１８核酸塩基であるアンチセンス化合物（標的核酸に完全に相補的である２領域を配置する）は標的核酸と７７．８％の全相補性を有し、従って本発明の請求範囲内に入り得る。アンチセンス化合物の標的核酸領域とのパーセント相補性は、通常、当技術分野に公知のＢＬＡＳＴプログラム（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定され得る（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９９０、２１５、４０３ ４１０； Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９９７、７、６４９ ６５６）。パーセント相同性、配列同一性、または相補性は、デフォルト設定（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを用いる）を用いて、例えば、ギャッププログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ 配列 解析 Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）により決定され得る（Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．、１９８１、２、４８２ ４８９）。
特定の実施形態では、本明細書で提供するアンチセンス化合物またはその特定部分は標的核酸またはその特定部分と完全に相補的である（すなわち１００％相補性）。例えば、アンチセンス化合物はＡＮＧＰＴＬ３核酸、または標的領域、または標的セグメントまたはその標的配列に完全に相補的であり得る。本明細書中に使用される場合、「完全に相補的」はアンチセンス化合物の各核酸塩基が標的核酸の対応する核酸塩基と完全に塩基対合できることを意味する。例えば、アンチセンス化合物に完全に相補的である標的核酸の対応する２０核酸塩基部分が存在するかぎりは、２０核酸塩基アンチセンス化合物は４００核酸塩基長の標的配列に完全に相補的である。完全な相補性はまた、第一および／または第二核酸の特定部分に関して使用され得る。例えば、３０核酸塩基アンチセンス化合物の核酸塩基部分は４００核酸塩基長である標的配列と「完全に相補的」であり得る。標的配列が対応する２０核酸塩基部分を持つ場合（各核酸塩基がアンチセンス化合物の２０核酸塩基部分に相補的である）、３０核酸塩基オリゴヌクレオチドの２０核酸塩基部分は標的配列に完全に相補的である。同時に、全３０核酸塩基アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の残存する１０核酸塩基もまた標的配列に相補的であるかに依り、標的配列に完全に相補的であり得る。
非相補的核酸塩基の位置は、アンチセンス化合物の５’末端または３’末端であり得る
。あるいは、非相補的核酸塩基はアンチセンス化合物の内部部分にあり得る。２つ以上の非相補的核酸塩基が存在する場合、それらは隣接（すなわち連結）または非隣接のいずれかであり得る。一実施形態では、非相補的核酸塩基はギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウィングセグメントに位置する。
特定の実施形態では、その長さが１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０核酸塩基である、または最大１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０核酸塩基のアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３核酸などの標的核酸またはその特定部分に対して４つ以下、３つ以下、２つ以下、または１つ以下の非相補的核酸塩基を含む。
特定の実施形態では、その長さが１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０核酸塩基である、または最大１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０核酸塩基のアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３核酸などの標的核酸またはその特定部分に対して６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、または１つ以下の非相補的核酸塩基を含む。
本明細書で提供するアンチセンス化合物はまた、標的核酸の一部分に相補的であるものを含む。本明細書中に使用される場合、「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」は標的核酸の領域またはセグメント内の隣接する（すなわち連結する）核酸塩基の規定数を表す。「部分」はまた、アンチセンス化合物の隣接核酸塩基の規定数を表し得る。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は標的セグメントの少なくとも８核酸塩基部分に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は標的セグメントの少なくとも１０核酸塩基部分に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は標的セグメントの少なくとも１５核酸塩基部分に相補的である。標的セグメントの少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはそれ以上の核酸塩基部分に、またはこれらの値のうちいずれか２つにより規定される範囲の核酸塩基部分に相補的なアンチセンス化合物もまた考えられる。
同一性
本明細書で提供するアンチセンス化合物はまた、特定のヌクレオチド配列、配列番号、または固有のＩｓｉｓ番号もしくはその一部分により表される化合物の配列に対する所定のパーセント同一性をもち得る。本明細書中に使用される際、アンチセンス化合物が同じ核酸塩基対形成能を持つ場合に、化合物は本明細書に記載の配列と同一性である。例えば、記載のＤＮＡ配列でチミジンの代わりにウラシルを含むＲＮＡは、ウラシルとチミジンの両方がアデニンと対を形成するので、そのＤＮＡ配列と同一であると考えられる。本明細書に記載のアンチセンス化合物の短縮または延長した型が、本明細書で提供するアンチセンス化合物に対し同一でない塩基を持つ化合物と同様に考えられる。同一でない塩基は、互いに隣接してもよく、またはアンチセンス化合物全体にわたり分散してもよい。アンチセンス化合物のパーセント同一性は、それと比較する配列に対し同一の塩基対合を持つ塩基数により算出される。
特定の実施形態では、アンチセンス化合物またはその一部分は、本明細書に記載のアンチセンス化合物もしくは配列番号、またはそれらの一部分のうち１つ以上と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性である。
修飾
ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基（塩基としても知られる）部は、本来はヘテロ環式塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分と共有結合で連結したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含む前記ヌクレオシドに関して、リン酸基は糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分と連結し得る。オリゴヌクレオチドは隣接ヌクレオシドが互いに共有結合して高分子の直鎖状オリゴヌクレオチドを形成することにより形成される。オリゴヌクレオチド構造内では、リン酸基は通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結を形成しているとみなされる。
アンチセンス化合物の修飾は、ヌクレオシド間連結、糖部分、または核酸塩基に対する置換または変更を包含する。修飾アンチセンス化合物は、例えば細胞取込みの増強、核酸標的に対する親和性の増強、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増大、または阻害活性の増大などの所望の特性のため、しばしば野生型を超えることが好ましい。
化学的修飾ヌクレオシドはまた、標的核酸のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する短縮または切断されたものの結合親和性を増大させるために使用され得る。結果として、同様の結果が、この化学的修飾ヌクレオシドを持つより短いアンチセンス化合物によりしばしば認められ得る。
修飾ヌクレオシド間連結
ＲＮＡおよびＤＮＡの天然のヌクレオシド間連結は３’から５’のホスホジエステル結合である。１つ以上の修飾された、すなわち非天然のヌクレオシド間連結を持つアンチセンス化合物が、例えば細胞取込みの増強、核酸標的に対する親和性の増強、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増大、または阻害活性の増大などの所望の特性のため、天然のヌクレオシド間連結を持つアンチセンス化合物にわたり、しばしば選択される。
修飾ヌクレオシド間連結を持つオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持するヌクレオシド間連結ならびにリン原子をもっていないヌクレオシド間連結を含む。典型的なリン含有ヌクレオシド間連結は、これに限定されないが、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、リン酸メチル、アミド亜リン酸エステル、およびホスホロチオエートが挙げられる。リン含有およびリン非含有連結の調製方法は周知である。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的化したアンチセンス化合物は、１つ以上の修飾ヌクレオシド間連結を含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。
修飾糖部分
アンチセンス化合物は、１つ以上のヌクレオシドを随意に含み得、その糖部分が修飾されている。この糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の増強、結合親和性の増大、またはいくつかの他の有利な生物学的性質をアンチセンス化合物に与え得る。特定の実施形態では、ヌクレオシドは化学的修飾リボフラノース環部分を含む。化学的修飾リボフラノース環の例としては、これに限定されないが、置換基の付加（５’および２’置換基を含む）、二環式核酸（ＢＮＡ）を形成するための非ジェミナル環原子の架橋、Ｓ、Ｎ（Ｒ）、またはＣ（Ｒ１）（Ｒ）２（ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、または保護基）でのリボシル環酸素原子の置き換え、およびそれらの組み合わせが挙げられる。化学的修飾糖の例としては、２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（その他記載の５’，２’−ビス置換ヌクレオシドに関し、２００８年８月２１日公開の国際公開第２００８／１０１１５７号参照のこと）、またはそのリボシル環酸素原子のＳでの置き換え、さらには２’位での置換（２００５年６月１６日に公開された米国特許出願第ＵＳ２００５−０１３０９２
３号を参照のこと）、あるいはＢＮＡの５’置換（２００７年１１月２２日に公開された国際公開第２００７／１３４１８１号を参照のこと、ここでＬＮＡは例えば５’−メチルまたは５’−ビニル基での置換）が挙げられる。
修飾糖部分を持つヌクレオシドの例としては、これに限定されないが、５’−ビニル、５’−メチル（ＲまたはＳ）、４’−Ｓ、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、および２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基を含むヌクレオシドが挙げられる。２’位での置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、およびＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択される（各ＲｍおよびＲｎは独立してＨまたは置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである）。
二環式核酸（ＢＮＡ）の例としては、これに限定されないが、４’および２’のリボシル環の原子間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で提供するアンチセンス化合物は、１つ以上のＢＮＡヌクレオシドを含み、架橋は次の式のうち１つを含む：４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−Ｃ（ＣＨ３）２−Ｏ−２’（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２参照）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’および４’−Ｃ−Ｈ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’（米国特許第７，３９９，８４５号、２００８年７月１５日発行）；４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１参照）；４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（２００４年９月２日公開の米国特許出願第２００４−０１７１５７０号参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（米国特許第７，４２７，６７２号、２００８年９月２３日発行）；４’−ＣＨ２−ＣＨ（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ、２００９、７４、１１８−１３４参照）（ＣＨ３）−２’および４’−ＣＨ２−Ｃ−（＝ＣＨ２）−２’（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４参照）；またＲは独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、または保護基である。上記ＢＮＡのそれぞれが、例えばα−Ｌ−リボフラノースおよびβ−Ｄ−リボフラノースなどの様々な立体化学的糖構造を含む（国際出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３参照、国際公開第９９／１４２２６号として１９９９年３月２５日公開）。従来、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡはまた、アンチセンス活性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチドに取り込まれている（Ｆｒｉｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３、２１、６３６５−６３７２）。
二環式ヌクレオシドに関するさらなる報告が、公開された文献に見出され得る（例えば以下を参照：Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、２００７、１２９、８３６２−８３７９；米国特許第７，０５３，２０７号；同第６，２６８，４９０号；同第６，７７０，７４８号；同第６，７９４，４９９号；同第７，０３４，１３３号；および同第６，５２５，１９１号；Ｅｌａｙａｄｉ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｎｓ． Ｄｒｕｇｓ、２００１、２、５５８−５６１； Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．、２００１、８、１−７；およびＯｒｕｍ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、２００１、３、２３９−２４３；および米国特許第６，６７０，４６１号；国際公開第２００４／１０６３５号；国際公開第９４／１４２２６号；国際公開第２００５／０２１５７０号；米国特許公開第ＵＳ２００４−０１７１５７０号；同第２００７−０２８７８３１号；同第２００８−００３９６１８号；米国特許第７，３９９，８４５号；米国特許出願第１２／１２９，１５４号；同第６０／９８９，５７４号；同第６１／０２６，９９５号；同第６１／０２６，９９８号；同第６１／０５６，５６４号；同第６１／０８６，２３１号；同第６１／０９７，７８７号；同第６１／０９９，８４４号；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４；ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ２００８／０６８９２２；および国際公開第２００７／１３４１８１号）。
特定の実施形態では、ＢＮＡヌクレオシドの二環式糖部分としては、これに限定されないが、ペントフラノシル糖部分の４’位と２’位との間に少なくとも１つの架橋を持つ化合物が挙げられ、この架橋は独立して−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲａ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−、およびＮ（Ｒａ）−から独立して選択される１この基または２〜４この連結基を有する；
（式中、ｘは０、１、または２；
ｎは１、２、３、または４；
各ＲａおよびＲｂは独立してＨ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、複素環基、置換複素環基、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５−Ｃ７脂環式基、置換Ｃ５−Ｃ７脂環式基、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）、またはスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり；および
各Ｊ１およびＪ２は独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環基、置換複素環基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、または保護基である）。
特定の実施形態では、二環式糖部分の架橋は、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−、またはＣ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−である。特定の実施形態では、架橋は４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’、および４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’−（式中、各Ｒ は独立してＨ、保護基、またはＣ１−Ｃ１２アルキルである）である。
特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドとしては、これに限定されないが、以下に示すような（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、および（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｇ）メチレン−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン−アミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環（４’−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−２’）ＢＮＡ、および（Ｊ）プロピレン炭素環（４’−（ＣＨ２）３−２’）ＢＮＡが挙げられる。

（式中、Ｂｘは塩基部分でありＲは独立してＨ、保護基、またはＣ１−Ｃ１２アルキルである）。
特定の実施形態では、式Ｉ：

（式中：
Ｂｘはヘテロ環式塩基部分であり；
−Ｑａ−Ｑｂ−Ｑｃ−は−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−、またはＮ（Ｒｃ）−Ｏ−ＣＨ２であり；
ＲｃはＣ１−Ｃ１２アルキルまたはアミノ保護基であり；および
ＴａおよびＴｂはそれぞれ独立してＨ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分、または支持体との共役結合である）を持つ二環式ヌクレオシド。
特定の実施形態では、式ＩＩ：

（式中：
Ｂｘはヘテロ環式塩基部分であり；
ＴａおよびＴｂはそれぞれ独立してＨ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分、または支持体との共役結合であり；
ＺａはＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオール、または置換チオ）を持つ二環式ヌクレオシド。
一実施形態では、各置換基は独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪｃ、ＮＪｃＪｄ、ＳＪｃ、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊｃ、およびＮＪｅＣ（＝Ｘ）ＮＪｃＪｄ（式中、各Ｊｃ、Ｊｄ、およびＪｅは独立してＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、または置換Ｃ１−Ｃ６アルキルでありＸはＯまたはＮＪｃである）から独立して選択される置換基で一置換または多置換される。
特定の実施形態では、式ＩＩＩ：

（式中：
Ｂｘはヘテロ環式塩基部分であり；
ＴａおよびＴｂはそれぞれ独立してＨ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分、または支持体との共役結合であり；
ＺｂはＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、または置換アシル（Ｃ（＝Ｏ）−）である）を持つ二環式ヌクレオシド。
特定の実施形態では、式ＩＶ：

（式中：
Ｂｘはヘテロ環式塩基部分であり；
ＴａおよびＴｂはそれぞれ独立してＨ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分、または支持体との共役結合であり；
ＲｄはＣ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、または置換Ｃ２−Ｃ６アルキニルであり；
各ｑａ、ｑｂ、ｑｃ、およびｑｄは独立してＨ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、置換Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、または置換Ｃ１−Ｃ６アミノアルキルである）を持つ二環式ヌクレオシド。
特定の実施形態では、式Ｖ：

（式中：
Ｂｘはヘテロ環式塩基部分であり；
ＴａおよびＴｂはそれぞれ独立してＨ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分、または支持体との共役結合であり；
ｑａ、ｑｂ、ｑｅおよびｑｆはそれぞれ独立して水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）-
ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）-ＮＪｊＪｋ 、ま
たはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであり；
またはｑｅおよびｑｆは共に＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり；
ｑｇおよびｑｈはそれぞれ独立してＨ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、または置換Ｃ１−Ｃ１２アルキルである）を持つ二環式ヌクレオシド。
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ単量体、アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン、およびウラシルの合成および調製は、それらのオリゴマー形成、および核酸認識特性と共に記載されている（Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８、５４、３６０７−３６３０）。ＢＮＡおよびその調製はまた、国際公開第９８／３９３５２号および国際公開第９９／１４２２６号に記
載されている。
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡおよび２’−チオ−ＢＮＡの類似体もまた調製されてきた（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．、１９９８、８、２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼに対する基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二本鎖を持つロックドヌクレオシド（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）類似体の調製もまた記載されている（Ｗｅｎｇｅｌ ｅｔ
ａｌ．、国際公開第９９／１４２２６号）。さらに２’−アミノ−ＢＮＡ、新規の立体配座固定された高親和性のオリゴヌクレオチド類似体の合成が当技術分野で記載されている（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、１９９８、６３、１００３５−１００３９）。加えて、２’−アミノ−および２’−メチルアミノ−ＢＮＡが調製されて、そのＲＮＡおよびＤＮＡ鎖を持つ二本鎖の安定性について既に報告されている。
特定の実施形態では、式ＶＩ：

（式中：
Ｂｘはヘテロ環式塩基部分であり；
ＴａおよびＴｂはそれぞれ独立してＨ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分、または支持体との共役結合であり；
各ｑｉ、ｑｊ、ｑｋ、およびｑｌは独立してＨ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシル、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）-ＮＪ
ｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであり；および
ｑｉおよびｑｊまたはｑｌおよびｑｋは共に＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）（式中ｑｇおよびｑｈはそれぞれ独立してＨ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、または置換Ｃ１−Ｃ１２アルキルである））を持つ二環式ヌクレオシド。
１つの炭素環式の４’−（ＣＨ２）３−２’架橋を持つ二環式ヌクレオシドおよびそのアルケニル類似体架橋４’−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−２’が記載されている（Ｆｒｅｉｅｒ
ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７、２５（２２）、４４２９−４４４３およびＡｌｂａｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、２００６、７１、７７３１−７７４０）。炭素環式の二環式ヌクレオシドの合成および調製もまた、それらのオリゴマー形成および生化学的研究と共に記載されている（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、２００７、１２９（２６）、８３６２−８３７９）。
特定の実施形態では、ヌクレオシドは糖代替物（ｓｕｇａｒ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）によるリボシル環の置換により修飾される。この修飾は、限定されないが、式のうち１つを有する環系などのモルホリノ環、シクロヘキセニル環、シクロヘキシル環、またはテトラ
ヒドロピラニル環などの代替環系（しばしばＤＮＡ類似体と称す）によるリボシル環の置換が含まれる：
。
多くの他のビシクロおよびトリシクロ糖代替物環系がまた当技術分野に公知であり、アンチセンス化合物を組み込むために使用しヌクレオシドを修飾してもよい（例えば総説：Ｌｅｕｍａｎｎ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｊ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２、１０、８４１−８５４を参照のこと）。この環系は様々な付加的置換を受けて活性を増強し得る。例えば式ＶＩＩを持つ化合物を参照のこと：
ＶＩＩ
（但し、式ＶＩＩの前記少なくとも１つのテトラヒドロピランヌクレオシド類似体の各々に対し、独立して：
Ｂｘはヘテロ環式塩基部分であり；
ＴａおよびＴｂはそれぞれ独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体とアンチセンス化合物を結ぶヌクレオシド間連結基であり、ＴａおよびＴｂのうち１つはテトラヒドロピランヌクレオシド類似体とアンチセンス化合物を結ぶヌクレオシド間連結基であり、またＴａ のＴｂ の他の基はＨ、ヒドロキシル保護基、連結共役基、または５’もしくは３’−末端基であり；
ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、およびｑ７はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、または置換Ｃ２−Ｃ６アルキニルであり；および各Ｒ１およびＲ２は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、置換もしくは非置換アルコキシ、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、およびＣＮ（式中、ＸはＯ、Ｓ、またはＮＪ１であり、各Ｊ１、Ｊ２、およびＪ３は独立してＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである）から選択される）。
特定の実施形態では、式ＶＩＩの修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供され、ただしｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６およびｑ７はそれぞれＨ（Ｍ）である。特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、およびｑ７のうち少なくとも１つがＨ以外である。特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、およびｑ７のうち少なくとも１つがメチルである。特定の実施形態では、式ＶＩＩのＴＨＰヌクレオシドが提供され、ただしＲ１およびＲ２のうち１つがフッ素（Ｋ）である。特定の実施形態では、式ＶＩＩのＴＨＰヌクレオシドが提供され、ただしＲ１およびＲ２のうち１つがメトキシエトキシである。特定の実施形態では、Ｒ１はフッ素でありＲ２はＨであり；Ｒ１はＨであ
りＲ２はフッ素であり；Ｒ１はメトキシでありＲ２はＨであり；およびＲ１はＨでありＲ２はメトキシエトキシである。修飾糖の調製方法は当業者に公知である。
修飾糖部分を持つヌクレオチドでは、核酸塩基部分（天然に存在する、修飾された、またはその組み合わせ）は適切な核酸標的によるハイブリダイゼーションのために維持される。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的化したアンチセンス化合物は、修飾糖部分を持つ１つ以上のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾糖部分は２’−ＭＯＥである。特定の実施形態では、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドはギャップマーモチーフに配置される。特定の実施形態では、修飾糖部分は（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）架橋基を持つ二環式ヌクレオシドである。特定の実施形態では、（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）修飾ヌクレオチドはギャップマーモチーフのウィング全体にわたり配置される。
修飾糖の調製方法は当業者において公知である。
修飾糖部分を持つヌクレオチドでは、核酸塩基部分（天然に存在する、修飾された、またはその組み合わせ）は適切な核酸標的によるハイブリダイゼーションのために維持される。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的化したアンチセンス化合物は、修飾糖部分を持つ１つ以上のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾糖部分は２’−ＭＯＥである。特定の実施形態では、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドはギャップマーモチーフに配置される。
修飾核酸塩基
核酸塩基（または塩基）修飾または置換は、化学構造的に天然由来のまたは合成の非修飾核酸塩基と区別できるが、機能的に代替可能である。天然および修飾核酸塩基の両方が水素結合に関与することができる。この核酸塩基修飾物は、アンチセンス化合物にヌクレアーゼ安定性、結合親和性、または他の何らかの有益な生物学的性質を与える。修飾核酸塩基は、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）などの合成のおよび天然の核酸塩基を含む。ある核酸塩基置換物（例えば５−メチルシトシン置換物を含む）は、特に標的核酸に対するアンチセンス化合物の結合親和性の増加に有用である。例えば５−メチルシトシン置換物は、０．６〜１．２℃で核酸二本鎖安定性を増すことが示されている（Ｓａｎｇｈｖｉ、Ｙ．Ｓ．、Ｃｒｏｏｋｅ、Ｓ．Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ、Ｂ．、ｅｄｓ．、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９３、ｐｐ． ２７６−２７８）。
さらなる修飾核酸塩基として、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンとグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンとグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、ピリミジン塩基の５−プロピニル（−ＣoＣ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンおよび他のアルキニ
ル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３
−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。
複素環塩基部分はまた、プリンまたはピリミジン塩基を他の複素環、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンで置き換えたものを含み得る。アンチセンス化合物結合親和性を増加させるのに特に有用な核酸塩基としては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン類、Ｎ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（２アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピニルウラシル、ならびに５−プロピニルシトシンが挙げられる。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的化したアンチセンス化合物は１つ以上の修飾核酸塩基を含む。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的化した短縮型またはギャップ拡大型アンチセンスオリゴヌクレオチドは１つ以上の修飾核酸塩基を含む。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は５−メチルシトシンである。特定の実施形態では、各シトシンは５−メチルシトシンである。
組成物および医薬組成物の製剤方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物または製剤の調製のために、医薬的に許容可能な活性または不活性物質と混合し得る。組成物および医薬組成物の調製方法は、これに限定されないが投与経路、疾患の程度、または投与される用量などのいくつかの基準に依る。
ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的化したアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物を好適な医薬的に許容可能な希釈剤または担体と組み合わせることにより医薬組成物に利用し得る。医薬的に許容可能な希釈剤としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。ＰＢＳは非経口で送達される組成物の使用に好適な希釈剤である。従って一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的化したアンチセンス化合物および医薬的に許容可能な希釈剤を含む医薬組成物が、本明細書に記載の方法において使用される。特定の実施形態では、医薬的に許容可能な希釈剤はＰＢＳである。特定の実施形態では、アンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンス化合物を含む医薬組成物は、あらゆる医薬的に許容可能な塩、エステル、もしくはエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与した場合に生物学的に活性な代謝産物またはその残留物を（直接的または間接的に）与えることができるあらゆる他のオリゴヌクレオチドを包含する。従って、例えば本開示はまた、アンチセンス化合物の医薬的に許容可能な塩、プロドラッグ、プロドラッグの医薬的に許容可能な塩、および他の生物学的同等物に関する。好適な医薬的に許容可能な塩としては、これに限定されないが、ナトリウムまたはカリウム塩である。
プロドラッグは、体内で内因性ヌクレアーゼにより開裂するアンチセンス化合物の一端または両端にさらにヌクレオシドを組み込んだものを含み、活性アンチセンス化合物を形成し得る。
共役アンチセンス化合物
アンチセンス化合物は、得られるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取込みを増強する１つ以上の部分もしくはコンジュゲートと共有結合で連結し得る。典型的な共役基としては、コレステロール部分および脂質部分が挙げれる。さらなる共役基としては、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料が挙げられる。
アンチセンス化合物はまた、修飾されて１つ以上の安定化基をもち、通常、アンチセンス化合物の一端または両端に結合して例えばヌクレアーゼ安定性などの特性を増強する。安定化基としてキャップ構造が含まれる。これらの末端修飾は、末端核酸を持つアンチセンス化合物をエクソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内の送達および／または局在化に役立ち得る。キャップは５’末端（５’−ｃａｐ）または３’末端（３’−ｃａｐ）に存在し得、または両端に存在し得る。キャップ構造は当技術分野に公知であり、例えばデオキシ脱塩基キャップ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙ ａｂａｓｉｃ ｃａｐ）が挙げられる。アンチセンス化合物の一端または両端を覆うために使用しヌクレアーゼ安定性を与え得る、さらなる３’および５’−安定化基は、国際公開第０３／００４６０２号（２００３年１月１６日公開）に記載される。
細胞培養およびアンチセンス化合物処理
アンチセンス化合物のＡＮＧＰＴＬ３核酸のレベル、活性、または発現の効果は、様々な細胞タイプでインビトロで試験し得る。この分析用に使用される細胞タイプは商業販売業者（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓｕｓ、ＶＡ； Ｚｅｎ−Ｂｉｏ、Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、ＮＣ； Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手可能であり、細胞は製造供給元の取扱説明書に従い市販の試薬（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて培養し得る。具体的な細胞タイプとしては、これに限定されないが、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ７（肝細胞癌）細胞、初期肝細胞、Ａ５４９細胞、ＧＭ０４２８１線維芽細胞、およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ試験
本明細書中に、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する方法を記載するが、この方法は、他のアンチセンス化合物を用いた処理のために適宜変更してもよい。
一般に、細胞が培養物中でおよそ６０〜８０％の集密状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達した時に、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する。
培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを投入するために通常使用する１つの試薬としては、陽イオン性脂質トランスフェクション試薬ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中でＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）と混合し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の最終濃度と、典型的にはアンチセンスオリゴヌクレオチド１００ｎＭあたり２〜１２ｕｇ／ｍＬの範囲のＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）の濃度を達成する。
培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを投入するために使用する別の試薬としては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１血清使用量低減培地（ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（登録商標）と混合し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の濃度と、典型的にはアンチセンスオリゴヌクレオチド１００ｎＭあたり２〜１２ｕｇ／ｍＬの範囲のＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）の濃度を達成する。
培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを投入するために使用する別の試薬としては、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１
血清使用量低減培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中でＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）と混合し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の濃度と、典型的にはアンチセンスオリゴヌクレオチド１００ｎＭあたり２〜１２ｕｇ／ｍＬの範囲のＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）の濃度を達成する。
培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを投入するために使用する別の試薬としては、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）−１血清使用量低減培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中でＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）と混合し、およそ０．２〜０．８μＬ／１００ｎＭのオリゴヌクレオチド比率のＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）を含む、オリゴヌクレオチドの所望の濃度を達成する。
培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを投入するために使用する別の試薬としては、Ｆｕ遺伝子６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）が挙げられる。アンチセンスオリゴマー化合物を血清−遊離ＲＰＭＩ
１ｍｌ中にＦｕ遺伝子６と混合して、Ｆｕ遺伝子６を含むオリゴヌクレオチドの所望濃度をオリゴマー化合物比率が１〜４μＬのＦｕ遺伝子６／１００ｎＭに達成した。
培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを投入するために使用する別の技術として、電気穿孔法（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄ．、２００１）が挙げられる。
細胞を常法によりアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する。細胞を、典型的にはアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後１６〜２４時間で採取し、その時点で標的核酸のＲＮＡ濃度またはタンパク質濃度を当技術分野で公知の方法または本明細書に記載の方法により測定する。一般に、処理を複数回反復して行う場合、データを反復処理の平均で提示する。
使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は細胞系により様々である。ある特定の細胞系に関するアンチセンスオリゴヌクレオチド最適濃度を決定する方法は当技術分野で公知である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（登録商標）、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎまたはＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎでトランスフェクトする場合、典型的には１ｎＭ〜３００ｎＭの範囲の濃度で使用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、電気穿孔法を用いてトランスフェクトする場合、６２５〜２０，０００ｎＭの範囲のより高い濃度で使用する。
ＲＮＡ単離
ＲＮＡ解析を総細胞ＲＮＡまたはｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡに関して実施し得る。ＲＮＡ単離方法は当技術分野で公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄ．、２００１）。ＲＮＡは、当技術分野で公知の方法を使用して調製し、例えばＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて製造業者の推奨手順に従い調製する。
標的のレベルまたは発現の阻害解析
ＡＮＧＰＴＬ３核酸のレベルまたは発現の阻害は、当技術分野で公知の様々な方法で分析し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄ．、２００１）。例えば、標的核酸レベルは、例えばノーザンブロット法、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または定量リアルタイムＰＣＲにより定量し得る。ＲＮＡ解析は、総細胞ＲＮＡまたはｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡに実施し得る。ＲＮＡ単離方法は、当技術分野で公知である。ノーザンブロット法はまた、当技術分野で常法である。定量リアルタイムＰＣＲは、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手でき製造業者の取扱説明書に従い使用される市販のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７６００、７７００、または７９００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて好都合に行われる。
標的ＲＮＡレベルの定量リアルタイムＰＣＲ解析
標的ＲＮＡレベの定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７６００、７７００、または７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて、製造業者の取扱説明書に従い、定量リアルタイムＰＣＲにより行ってもよい。定量リアルタイムＰＣＲの方法は、当技術分野で公知である。
リアルタイムＰＣＲの前に、単離ＲＮＡを逆転写酵素（ＲＴ）反応に付し、その後にリアルタイムＰＣＲ増幅のために基質として使用される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する。ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ反応を同じ試料ウェルにて順次実施する。ＲＴ試薬およびリアルタイムＰＣＲ試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により入手してもよい。ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ反応は、当業者に公知の方法により実施される。
リアルタイムＰＣＲにより得られる遺伝子（またはＲＮＡ）標的量を、発現が一定である遺伝子、例えばシクロフィリンＡのいずれの発現レベルを用いて、またはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用した総ＲＮＡの定量化によりノーマライズしてもよい。発現は、リアルタイムＰＣＲにより、標的と同時に、多重化して、または別々に実施することにより定量化する。総ＲＮＡは ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて定量する。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によるＲＮＡ定量方法はＪｏｎｅｓ， Ｌ．Ｊ．、ｅｔ ａｌ、（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８、２６５、３６８−３７４）に教示される。ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ（登録商標）４０００装置（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）蛍光の測定に使用する。
プローブおよびプライマーを設計し、ＡＮＧＰＴＬ３核酸とハイブリッドを形成する。リアルタイムＰＣＲ用プローブおよびプライマーを設計する方法は当技術分野で公知であり、プライマーＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）などのソフトウェアの使用が挙げられ得る。
ＲＴ、リアルタイムＰＣＲにより得られる遺伝子標的量を、ＧＡＰＤＨ（すなわち発現が一定である遺伝子）のいずれの発現レベルを用いて、またはＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ． Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用した総ＲＮＡの定量化によりノーマライズしてもよい。ＧＡＰＤＨ発現は、ＲＴ、リアルタイムＰＣＲにより、標的と同時に、多重化して、または別々に実施することにより定量化した。総ＲＮＡをＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ． Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を用いて定量化した。
本明細書に記載の細胞タイプでのＧＡＰＤＨ発現の測定に使用されるプライマーおよびプローブが表２に示される。ＧＡＰＤＨのＰＣＲプローブは５’末端に共有結合で連結したＪＯＥと３’末端に共有結合で連結したＴＡＭＲＡまたはＭＧＢをもち、ＪＯＥはレポーター蛍光色素であり、ＴＡＭＲＡまたはＭＧＢはクエンチャー色素である。いくつかの細胞タイプでは、ＧＡＰＤＨ発現を測定するために、それとは別の種由来のＧＡＰＤＨ配列について設計されたプライマーおよびプローブを使用する。例えば、ヒトＧＡＰＤＨプライマーおよびプローブセットが、サル由来細胞および細胞系でのＧＡＰＤＨ発現の測定に使用される。
リアルタイムＰＣＲの使用のためのプローブおよびプライマーを設計し、標的特異的配列とハイブリッドを形成した。プライマーおよびプローブとそれらとハイブリッドを形成
する標的核酸配列を表３に示す。標的特異的ＰＣＲプローブは、５’末端と共有結合で連結するＦＡＭおよび３’末端と共有結合で連結するＴＡＭＲＡまたはＭＧＢをもち、ＦＡＭは蛍光性染料であり、ＴＡＭＲＡまたはＭＧＢはクエンチャー色素である。
タンパク質レベルの解析
ＡＮＧＰＴＬ３核酸のアンチセンス阻害は、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを測定することにより評価され得る。ＡＮＧＰＴＬ３のタンパク質レベルを、当技術分野で公知の様々な手法、例えば免疫沈降法、ウエスタンブロット法（免疫ブロット法）、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、定量的タンパク質分析、タンパク質活性分析（例えばカスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織学、免疫細胞化学、または蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄ．、２００１）などで評定または定量化してもよい。標的に関する抗体は、抗体のＭＳＲＳカタログ（Ａｅｒｉｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＭＩ）などの様々な供給源から単離および回収してもよく、あるいは当技術分野で公知の従来型モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体生成方法により調製してもよい。
アンチセンス化合物のインビボ試験
アンチセンス化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害し表現型の変化を生じる機能を評価する動物にて試験する。試験は、正常動物で、または実験用疾患モデルで実施し得る。動物への投与に関し、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、リン酸緩衝生理食塩水などの医薬的に許容可能な希釈剤にて製剤する。投与としては、非経口経路の投与が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置期間後、ＲＮＡを細胞から単離してＡＮＧＰＴＬ３核酸発現の変化を測定する。ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの変化もまた測定する。
ある指標
特定の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の医薬組成物を投与することを含む、個体を処置する方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、個体は代謝疾患および／または心臓血管疾患を患う。特定の実施形態では、個体はアテローム性動脈硬化、肝脂肪症、または高脂血症を患う。
従って、代謝疾患または心臓血管疾患に関連する症状を改善する方法が、本明細書中に提供される。また、アテローム性動脈硬化、肝脂肪症、または高脂血症に関連する症状の改善を必要とする対象でのその改善方法も、本明細書中に提供される。特定の実施形態では、代謝疾患または心臓血管疾患に関連する症状の発病率を低減させる方法が提供される。特定の実施形態では、アテローム性動脈硬化、肝脂肪症、または高脂血症に関連する症状の発病率を低減させる方法が提供される。特定の実施形態では、代謝疾患または心臓血管疾患に関連する症状の重症度を低減させる方法が提供される。特定の実施形態では、アテローム性動脈硬化、肝脂肪症、または高脂血症に関連する症状の重症度を低減させる方法が提供される。この実施形態では、前記方法は、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的化した化合物の治療有効量を投与を必要とする個体に投与することを含む。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的化したアンチセンス化合物の投与は、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％、またはこれらの値のいずれか２つの値で規定される範囲のＡＮＧＰＴＬ３発現の低下をもたらす。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的化したアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、代謝疾患または心臓血管疾患を患う、または成り易い患者を治療するための薬剤の調製に使用される。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的化したアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、アテローム性動脈硬化、肝脂肪症、または高脂血症を患う、または成り易い患者を治療するための薬剤の調製に使用される。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、配列番号３４−１８２に記載の配列の、本明細書に記載の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０隣接核酸塩基位を持つ修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む。
投与
特定の実施形態では、本明細書に記載の化合物および組成物は、非経口で投与される。
特定の実施形態では、非経口投与は点滴による。点滴は、長期もしくは持続的または短期もしくは断続的である。特定の実施形態では、注入される医薬品をポンプで送達する。
特定の実施形態では、非経口投与は注射による。注射は注射器またはポンプにより送達され得る。特定の実施形態では、注射はボーラス注射である。特定の実施形態では、注射は、組織または臓器に直接投与する。
特定の併用療法
特定の実施形態では、本発明の修飾オリゴヌクレオチを含む第１剤は、１つ以上の第２の薬剤と同時投与される。特定の実施形態では、この第２剤を設計して、本明細書に記載の第１剤と同じ疾患、障害、または症状を治療する。特定の実施形態では、この第２剤を設計して、本明細書に記載の第１剤と同じ疾患、障害、または症状を治療する。特定の実施形態では、この第２剤を設計して本明細書に記載の１つ以上の医薬組成物の望ましくない副作用を治療する。特定の実施形態では、第２剤を第１剤と同時投与して、第１剤の望ましくない効果を治療する。特定の実施形態では、第２剤を第１剤と同時投与し、併用効果を生じる。特定の実施形態では、第２剤を第１剤と同時投与し、相乗効果を生じる。
特定の実施形態では、第１剤および１つ以上の第２剤を同時に投与する。特定の実施形態では、第１剤および１つ以上の第２剤を異なる時間に投与する。特定の実施形態では、
第１剤および１つ以上の第２剤を単一の医薬製剤で一緒に調製する。特定の実施形態では、第１剤および１つ以上の第２剤を別々に調製する。
特定の実施形態では、第２剤としては、これに限定されないが、アスコルビン酸が挙げられる。
非限定的記載および引用による組み込み
本明細書に記載のある化合物、組成物、および方法が、ある実施形態にしたがい具体的に記載されてきたが、いっぽうで、以下の実施例は本明細書に記載の化合物を例示するためのみ役に立ち、これを限定することを意図しない。本出願に記載の各参考文献は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
実施例１：オリゴマー化合物によるヒトアンジオポエチン様３のアンチセンス阻害
一連のオリゴマー化合物を設計してヒトアンジオポエチン様３の様々な領域を標的化し、表１に示す公表された配列を使用した。化合物を表４に示す。表４の全ての化合物は、１０この２’−デオキシヌクレオチドからなる中心「ギャップ」領域からなり、両端（５’および３’）に５ヌクレオチドの「ウィング」が配置された２０ヌクレオチドの長さのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドからなり、また２’−ＭＯＥヌクレオチドとして知られている。ヌクレオシド間（主鎖）結合はオリゴヌクレオチドの全体にわたりホスホロチオエートである。全てのシトシン残基は５−メチルシトシン類である。表４のオリゴマー化合物は具体的にはアンジオポエチン様３をコードする標的核酸分子とハイブリッドを形成し、結合親和性を増大させる領域からなり、これらの領域はオリゴマー化合物の「ウィング」である。オリゴマー化合物はそれぞれＲＮａｓｅ Ｈ活性を導く領域を含み、この領域は「ギャップ」領域である。
化合物を、本明細書の他の実施例に記載の定量リアルタイムＰＣＲにより、表３に示す標的特異的プライマーおよびプローブ（配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０）を用いて、遺伝子標的ｍＲＮＡレベルの化合物の効果を解析した。データは、Ｈｕｈ７細胞を１５０ｎＭの開示のオリゴマー化合物でＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）を用いて処理する実験からの平均値である。表４に、オリゴマー化合物を標的化する配列の配列番号を示す。
表４では、発現の減少を阻害パーセントで表す。存在するならば、「Ｎ．Ｄ．」は「未検出」を示す。これらのオリゴマー化合物が阻害性を示す標的領域を、本明細書では「有効標的セグメント」と称する。
実施例２：オリゴマー化合物によるマウスアンジオポエチン様３のアンチセンス阻害
一連のオリゴマー化合物を設計してマウスアンジオポエチン様３の様々な領域を標的化し、表１に示す公表された配列を使用した。化合物を表５に示す。表５の全ての化合物は、１０この２’−デオキシヌクレオチドからなる中心「ギャップ」領域からなり、両端（５’および３’）に５ヌクレオチドの「ウィング」が配置された２０ヌクレオチドの長さのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドからなり、また２’−ＭＯＥヌクレオチドとして知られている。ヌクレオシド間（主鎖）結合はオリゴヌクレオチドの全体にわたりホスホロチオエートである。全てのシトシン残基は５−メチルシトシン類である。表５のオリゴマー化合物は具体的にはアンジオポエチン様３をコードする標的核酸分子とハイブリッドを形成し、結合親和性を増大させる領域からなり、これらの領域はオリゴマー化合物の「ウィング」である。オリゴマー化合物はそれぞれＲＮａｓｅ Ｈ活性を導く領域を含み、この領域は「ギャップ」領域である。
化合物を、本明細書の他の実施例に記載の定量リアルタイムＰＣＲにより、表３に示す標的特異的プライマーおよびプローブ（配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３）を用いて、遺伝子標的ｍＲＮＡレベルの化合物の効果を解析した。データは、マウス初期肝細胞を１５０ｎＭの開示のオリゴマー化合物でＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）を用いて処理する実験からの平均値である。使用する対照オリゴマー化合物は配列番号９および１０であった。表５に、オリゴマー化合物を標的化する配列の配列番号を示す。
表４では、発現の減少を阻害パーセントで表す。存在するならば、「Ｎ．Ｄ．」は「未検出」を示す。これらのオリゴマー化合物が阻害性を示す標的領域を、本明細書では「有効標的セグメント」と称する。表５のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＭ＿０１４４９５．１、配列番号４として本明細書に組み込まれる）と交差反応してもよく、核酸塩基の数に依りマウスオリゴヌクレオチドがヒトＡＮＧＰＴＬ３配列を持つ。「ヒト標的開始部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを標的化するヒトｍＲＮＡで最も５’のヌクレオチドを示す。「ヒト標的終結部位」はアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的化するヒトｍＲＮＡで最も３’のヌクレオチドを示す。「ミスマッチ」は、マウスオリゴヌクレオチドがヒト遺伝子配列と不適正となる核酸塩基の数を示す。記号「ｎ／ａ」は、マウスオリゴヌクレオチドおよびヒト遺伝子配列間で３超のミスマッチが存在したことを示す。マウス オリゴヌクレオチドおよびヒト遺伝子配列間の相補性が高いほど、マウスオリゴヌクレオチドがヒト遺伝子配列とより交差反応しやすい。
実施例３：アンジオポエチン様３を標的化する二本鎖オリゴマー化合物の設計と選定
本発明に従って、本発明のオリゴマー化合物を含む一連の二本鎖（ｄｓＲＮＡおよびその模倣）およびそれらの相補体を設計してアンジオポエチン様３を標的化し得る。その二本鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、本明細書に記載のアンジオポエチン様３を標的化したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を含む。前記鎖の末端を１つ以上の天然または修飾核酸塩基の付加により修飾してオーバーハングを形成してもよい。核酸二本鎖のセンス鎖は、次いで、アンチセンス鎖の相補体として設計および合成され、核酸二本鎖のセンス鎖はまた、いずれの末端に修飾または付加を含んでいてもよい。二本鎖のアンチセンスおよびセンス鎖は約１７〜２５このヌクレオチド、または約１９〜２３このヌクレオチドを含む。あるいは、アンチセンスおよびセンス鎖は２０、２１、または２２このヌクレオチドを含む。
例えば、一実施形態では、ｄｓＲＮＡ二本鎖のうち両鎖が中心核酸塩基にわたり相補性であり、それぞれが一方または両方の末端にオーバーハングを持つ。
例えば、配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列番号１８３として本明細書に組み込まれる）およびデオキシチミジン（ｄＴ）の２−核酸塩基オーバーハングを持つアンチセンス鎖を含む二本鎖は、以下の構造をもち得る：
オーバーハングは約２〜６この核酸塩基であり得、これらの核酸塩基は標的核酸に相補的であっても、そうでなくてもよい。別の実施形態では、二本鎖は１末端にのみオーバー
ハングをもち得る。
別の実施形態では、同じ配列を持つアンチセンス鎖を含む二本鎖、例えばＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列番号１８３）は、次に示す平滑末端（一本鎖でないオーバーハング）で調製され得る：
ＲＮＡ二本鎖は単分子または二分子であり得る；すなわち二本鎖が単一分子の一部であり得、または別々の分子でもよい。
前記二本鎖のＲＮＡ鎖は、当業者で常用される方法により合成し得、またはＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）により購入し得る。合成するとすぐに相補性二本鎖をアニールする。一本鎖を一定量に分けて（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）５０μＭの濃度まで希釈する。希釈するとすぐに、３０μＬの各鎖をアニーリング緩衝液の５希釈溶液１５μＬと混合する。前記緩衝液の最終濃度は１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４、および２ｍＭ酢酸マグネシウムである。最終容積は７５μＬである。この溶液を９０℃で１分間インキュベートし、次いで１５秒間で遠心分離する。チューブを３７℃で１時間静置して、この際、ｄｓＲＮＡ二本鎖を実験用に用いる。ｄｓＲＮＡ二本鎖の最終濃度は２０μＭである。
調製するとすぐに、二本鎖の化合物を、アンジオポエチン様３を調節する機能について評定する。細胞が８０％の集密状態に達すると、細胞を本発明の二本鎖の化合物で処理する。９６−ウェルプレートでの細胞増殖に関し、ウェルを２００μＬ ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１（商標）低減血清培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で１回洗浄し、次いで１２μｇ／ｍＬ
ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および最終濃度２００ｎＭの所望の二本鎖アンチセンス化合物を含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１（商標）（１００ｎＭ二本鎖アンチセンス化合物あたり６μｇ／ｍＬ ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）の比率）で処理する。処理の５時間後、培地を新鮮な培地と置き換える。処理後１６時間後に細胞を採取し、その際、ＲＮＡを単離し、標的の減少をＲＴ−ＰＣＲにより測定する。
実施例４：オリゴマー化合物によるマウスアンジオポエチン様３のアンチセンス阻害：用量反応試験
本発明のさらなる実施形態では、３つのオリゴヌクレオチドをさらなる用量反応試験のために選定した。マウス初期肝細胞を６．２５、２５、１００、または４００ｎＭのＩＳＩＳ２３３６９３（配列番号１３１）、ＩＳＩＳ２３３６９８（配列番号１３６）、もしくはＩＳＩＳ２３３７２５（配列番号１５９）、またはそのスクランブル対照（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ）オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１１３５２９（５−１０−５ギャップマー、ＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＡ、配列番号１１として本明細書に組み込まれる）で処理し、ｍＲＮＡレベルを本明細書の他の実施例に記載のように測定した。未処理細胞が、データをノーマライズする対照としての役割を果たした。
これらの試験の結果を表６に示す。データは３つの実験からの平均値であり、未処理の対照に対する阻害パーセントで表される。
表６に示すように、ＩＳＩＳ２３３６９３、２３３６９８、および２３３７２５は用量に依存してアンジオポエチン様３ｍＲＮＡレベルを低減させた。
実施例５：アンジオポエチン様３のアンチセンス阻害効果：Ｃ５７ＢＬ／６マウスでのインビボ試験
本発明に従い、マウスアンジオポエチン様３を標的化する２つのオリゴヌクレオチドをインビボ試験用に選択した。正常餌を給餌したＣ５７ＢＬ／６雄マウスに週に２回ＩＳＩＳ２３３６９３（配列番号１３１）またはＩＳＩＳ２３３６９８（配列番号１３６）のいずれかの５０ｍｇ／ｋｇ用量を２週間注射した。各処置群は５動物からなっていた。ある動物群は生理食塩水を週に２回で２週間注射を受けた。この生理食塩水注射群は、オリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群としての役割を果たした。
２週間の処置期間後、マウスを犠牲にしてアンジオポエチン様３ｍＲＮＡレベルを肝臓にて評定した。ｍＲＮＡ発現レベルを、本明細書の他の実施例に記載のリアルタイムＰＣＲにより定量化した。生理食塩水処置マウスと比較して、ＩＳＩＳ２３３６９３は４４％のアンジオポエチン様３ｍＲＮＡレベルの減少を生じた。ＩＳＩＳ２３３６９８は４１％のアンジオポエチン様３ｍＲＮＡレベルの減少を生じた。データは、アンジオポエチン様３アンチセンスオリゴヌクレオチド処置は肝臓にて標的ｍＲＮＡ発現を効果的に抑制し得ることことを実証する。
脾臓重量、体重、および肝重量を、試験の終了時に測定した。処置期間の終了時に（グラム単位で）測定された平均組織重量および平均体重を表７に示す。表７に示すように、体重、肝重量、および脾臓重量はオリゴヌクレオチド処置の影響を受けていなかった。
試験終了時、動物を、血清 コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ、トリグリセリド、およびグルコース値に関して、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いた通常の解析により評定した。肝毒性を示し得る血清アミノ基転移酵素、ＡＬＴおよびＡＳＴの上昇率もまた測定した。肝臓毒性に関連するＡＳＴまたはＡＬＴレベルは認められなかった。測定した血清グルコース（ＧＬＵＣ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）、ＬＤＬ、ＨＤＬ、およびトリグリセリド（ＴＲＩＧ）のレベルを、各処置群から得られる平均値としてｍｇ／ｄＬ単位で、表８に示す。
表８に示すように、ＩＳＩＳ２３３６９３およびＩＳＩＳ２３３６９８による処置は血清トリグリセリドを減少させた。ＩＳＩＳ２３３６９３による処置は総コレステロールを減少させた。
実施例６：アンジオポエチン様３のアンチセンス阻害効果：高脂肪給餌マウスでのインビボ用量反応試験
Ｃ５７ＢＬ／６マウス株は、高脂血症−誘導性アテローム斑形成の影響を受け易いことが報告されている。従って、これらのマウスに高脂肪餌を給餌して、アンジオポエチン様３アンチセンスオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡ発現に対する影響を評定するその後の試験に使用した。
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスを、脂質から得られる６０％のカロリーを含む高脂肪給餌（例
えば、 Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）上に置いた。高脂質餌を受けるマウスを処理群に分類した。３つの群が、ＩＳＩＳ２３３６９３（配列番号１３１）の注射を６週間受けた。さらに３つの群が週に２回、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇ用量のＩＳＩＳ２３３６９８（配列番号１３６）の注射を６週間受けた。
高脂肪餌動物の１群は、週に２回、生理食塩水の注射を６週間受けた。この生理食塩水注射群は、オリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群としての役割を果たした。
６週間の処置期間後、マウスを犠牲にして肝臓でのアンジオポエチン様３ｍＲＮＡレベルを評定した。ｍＲＮＡ発現レベルを、本明細書の他の実施例に記載のリアルタイムＰＣＲにより定量化した。結果を、生理食塩水処置対照と比較した平均パーセント阻害として、表９に示す。
これらのデータは、アンジオポエチン様３ｍＲＮＡを標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドが、用量に依存して肝臓での標的ｍＲＮＡ発現を効果的に減少させることを示す。
体重を試験中に監視した。脾臓重量、脂肪パッド重量、および肝重量を試験の終了時に測定した。処置期間終了時に測定した平均組織重量および平均体重を表１０に示す。
これらのデータは、体重、脾臓重量、および肝重量が影響を受けなかったことを実証する。脂肪体重量は、ＩＳＩＳ２３３６９８の処置により用量に依存して減少した。ＩＳＩＳ２３３６９８の処置により、脂肪パッド重量も減少した。
試験終了時、動物を血清コレステロール、トリグリセリド、およびグルコース値に関して、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いる通常の解析により評定した。肝毒性を示し得る血清アミノ基転移酵素ＡＬＴおよびＡＳＴの上昇率もまたＯｌｙｍｐｕｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いて測定した。測定した血清コレステロール（ＣＨＯＬ）およびトリグリセリド（ＴＲＩＧ）のレベルを、各処置群から得られる平均値としてｍｇ／ｄＬの単位で、表１１に示す。ＨＤＬおよびＬＤＬの平均レベルも平均グルコース値（ＧＬＵＣ）と同様に示す。ＡＬＴおよびＡＳＴ（これらもまた表１１に示す）もまた、各処理群から得られた平均値として国際単位／Ｌ（ＩＵ／Ｌ）で同様に示す。
表１１に示すように、生理食塩水処置と比較した場合、ＩＳＩＳ２３３６９３またはＩＳＩＳ２３３６９８による処置はコレステロールレベルの減少および血清トリグリセリドの用量依存的減少をもたらした。ＩＳＩＳ２３３６９３およびＩＳＩＳ２３３６９８はまた、脂質低下薬を試験した場合に、マウス、すなわちヒトではない他の種がＨＤＬ粒子として血清コレステロールを９０％保持しているということにより、マウスで通常認められるＨＤＬの若干の減少をもたらした。さらに、ＩＳＩＳ２３３６９３による処置はＬＤＬを低減させた。
実施例７：インビボでのアンジオポエチン様３レベルのアンチセンス阻害効果：肝臓トリグリセリ
肝脂肪症は脂質の肝臓への蓄積、しばしばアルコール摂取、糖尿病、および高脂血症により引き起こされる「脂肪肝（ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ）」、を意味し、末期の肝臓障害に進行し得る。脂肪肝症状のその有害な影響を考慮すると、肝脂肪症を予防または改善する化合物を特定することは有用である。肝脂肪症は、組織トリグリセリド量の測定、および肝臓組織の組織学的検査の両方により評定してもよい。
さらなる実施形態では、肝臓組織トリグリセリド量を実施例６に記載の動物で評価した。肝臓組織トリグリセリド量を、トリグリセリドＧＰＯ分析（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて測定した。各処置群の結果を生理食塩水処置対照にノーマライズし、これらを表１２に示す。
表１２に示すように、アンジオポエチン様３を標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、肝臓トリグリセリドの用量依存的減少をもたらす。
実施例８：アンジオポエチン様３のアンチセンス阻害効果：高脂肪給餌マウスでのＩＳＩＳ２３３６９３によるインビボ試験
実施例６に記載の試験と同じ試験で、Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスを、脂質から得られる６０％のカロリーを含む高脂肪給餌（例えば、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）の環境に置いた。高脂質餌を受けるマウスを処理群に分類した。１つの群がＩＳＩＳ２３３６９３（配列番号１３１）の注射を週に２回、５０ｍｇ／ｋｇ用量で６週間受けた。
オリゴヌクレオチドを注射のために生理食塩水に溶解させた。高脂質給餌動物のある群が、週に２回、生理食塩水の注射を６週間受けた。この生理食塩水注射群は、オリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群としての役割を果たした。
６週間の処置期間後、マウスを犠牲にして肝臓でのアンジオポエチン様３ｍＲＮＡレベルを評定した。ｍＲＮＡ発現レベルを、本明細書の他の実施例に記載のリアルタイムＰＣＲにより定量化した。ＩＳＩＳ２３３６９３により、標的ｍＲＮＡレベルの８８％の減少を生じた。
体重を試験中に監視した。脾臓重量、脂肪パッド重量、および肝重量を試験の終了時に測定した。生理食塩水単独で処置した動物の平均体重、肝重量、脾臓重量、および脂肪パッド重量は、それぞれ３３ｇ、１．２ｇ、０．１ｇ、０．７ｇであった。ＩＳＩＳ２３３６９３により処置した動物の平均体重、肝重量、脾臓重量、および脂肪パッド重量は、それぞれ３１ｇ、１．６ｇ、０．２ｇ、および０．２ｇであった。ＩＳＩＳ２３３６９３による処置により、脂肪パッド重量が７１％減少した。
試験終了時、動物を、血清コレステロール、トリグリセリド、およびグルコース値に関して、通常の臨床解析（例えばＢＴＳなどの臨床試験装置（ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ
Ｌａｂ Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にて）により評定した。肝毒性を示し得る血清アミノ基転移酵素ＡＬＴおよびＡＳＴの上昇率、および腎毒性を示し得るビリルビンレベルの上昇率もまた測定した。異常な腎臓または肝臓機能の指標としての毒性上昇はＩＳＩＳ２３３６９３処置によって認められなかった。ＩＳＩＳ２３３６９３により、血清トリグリセリドおよびグルコース値は減少したが、血清コレステロール、ＬＤＬ、またはＨＤＬレベルは変わらなかった。
肝脂肪症は脂質の肝臓への蓄積、しばしばアルコール摂取、糖尿病、および高脂血症により引き起こされる「脂肪肝」を意味し、末期の肝臓障害に進行し得る。脂肪肝症状のその有害な影響を考慮すると、肝脂肪症を予防または改善する化合物を特定することは有用である。肝脂肪症は、組織トリグリセリド量の測定、および肝臓組織の組織学的検査の両方により評定してもよい。
肝臓組織トリグリセリド量を、トリグリセリドＧＰＯ分析（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて測定した。ＩＳＩＳ２３３６９３処置群の平均結果を生理食塩水処置対照にノーマライズした。ＩＳＩＳ２３３６９３による処置により、肝臓トリグリセリドレベルが７５％減少した。
組織学的分析を通常の手順により行った。簡潔にいうと、肝臓試料を入手して、１０％中性緩衝ホルマリン固定液で固定し、そしてＨＥ染色および肝臓形態の評定用に処理した。あるいは、肝臓組織を入手し、凍結し、分割し、続いてオイルレッドＯ染色で染色して脂質沈着物を視覚化し、そしてエオシンで対比染色して細胞質を標識した。調製した試料を光学顕微鏡検査により評定した。
オイルレッドＯ染色および組織学的分析により評価したように、ＩＳＩＳ２３３６９３により処置された動物由来の肝臓は、生理食塩水処置対照肝臓と比較して、脂肪含量の減少を示した。
従って、アンジオポエチン様３を標的化したオリゴマー化合物は、組織トリグリセリド量の測定および肝臓組織の組織学的検査の両方により評定したように、肝脂肪症を改善する。
まとめると、本明細書に示すインビボ試験は、アンジオポエチン様３のアンチセンスオリゴヌクレオチドの減少が肝臓標的ｍＲＮＡの用量依存的減少、ならびに血清および肝臓トリグリセリドレベルの減少をもたらすことを示す。さらに、アンジオポエチン様３を標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドにより、痩せたマウスおよび高脂肪給餌マウスの両方で血清コレステロールレベルが低減する。さらに、脂肪パッド重量の減少が、体重または臓器重量の同様な減少を起こすことなく認められ、これは脂肪含量が標的特異的に減少することを示す。従って、本発明の別の態様は、高脂血症などの症状に関し、血清コレステロール、血清トリグリセリド、肝臓トリグリセリド、または脂肪パッド重量を減少させる方法である。
実施例９：アテローム性動脈硬化に対するアンジオポエチン様３のアンチセンス阻害効果：ＬＤＬｒ−／−マウスでのＩＳＩＳ２３３６９３による処置
ＩＳＩＳ２３３６９３の抗アテローム性動脈硬化剤としての効果を、高コレステロール餌を給餌したＬＤＬ受容体ノックアウトマウス；アテローム性動脈硬化の試験用モデルで評定した。（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １９９４ Ｍａｙ； ９３：１８８５−９３）。
処置
ＬＤＬ受容体遺伝子ノックアウトマウスＣ５７Ｂｌ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、＃２２０７）にＨａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｎｄ餌、ＴＤ９４０５９（３７％ｋＣａｌ脂肪（ココアバターの半分）、１．２５％コレステロール）を給餌した。給餌開始後４週間で、マウスを処置用に各６〜８匹のマウスからなる２群に分けた。第一の群は、ＩＳＩＳ２３３６９３（配列番号１３１）の皮下注射を２５ｍｇ／ｋｇ用量で週に２回、１６週間受けた。第二の群は対照ミスマッチオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ１４１９２３（ＣＣＴＴ
ＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣ、配列番号１８７として本明細書に組み込まれる）の皮下注射を２５ｍｇ／ｋｇ用量で週に２回、１６週間受けた。
オリゴヌクレオチドを注射用に生理食塩水に溶解した。高脂肪給餌動物のうち１群が生理食塩水の注射を週に２回、１６週間受けた。この生理食塩水注射群は、オリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群としての役割を果たした。
血液試料を４週間ごとに採取した。処置期間の終了時、マウスを安楽死させて、肝臓および大動脈をさらなる解析のために回収した。
ＲＮＡ解析
ＲＮＡを、ＡＮＧＰＴＬ３のリアルタイムＰＣＲ解析のため、ＡＮＧＰＴＬ３ プライマープローブセット（フォワード配列ＣＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＴＣＡＣＧＡＡＡ、配列番号１８８として本明細書に指定する；リバース配列ＧＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＡＴＡＴ、配列番号１８９として本明細書に指定する；プローブ配列ＣＡＣＧＣＴＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＴＣＧＴＧＧ、配列番号１９０として本明細書に指定する）を用いて肝臓組織から抽出した。結果をＰＢＳ対照と比較してマウスＡＮＧＰＴＬ３の阻害パーセントとして示す。表１３に示すように、ＩＳＩＳ２３３６９３の処置は、ＰＢＳ対照と比較するとＡＮＧＰＴＬ３ｍＲＮＡの有意な減少をもたらした。対照オリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ１４１９２３による処置は、予想通り、ＡＮＧＰＴＬ３の有意な減少をもたらさなかった。
コレステロールおよび脂質レベル
血漿および肝臓のトリグリセリド、ならびにコレステロールをＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法（Ｂｌｉｇｈ、Ｅ ａｎｄ Ｄｙｅｒ、Ｗ、Ｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ、３７、９１１−９１７、１９５９）により抽出し、市販のトリグリセリドキット（ＤＣＬトリグリセリド試薬；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．）を用いて測定した。結果を表１４〜１７に示す。表１４は、ＩＳＩＳ２３３６９３による処置が、１６週間でのコレステロールレベルにＰＢＳ対照と比較して５８％もの有意な減少をもたらしたことを実証している。総コレステロールレベルの減少は、表１５に示すように、対照と比較して５８％ものＬＤＬコレステロールレベルの有意な減少の結果である。表１６は、上記に詳述したように、マウスモデル依存的のようなＨＤＬの減少を示す。同様に、表１７は、ＩＳＩＳ２３３６９３の処置によりＰＢＳ対照と比較して１６週間で７５％トリグリセリドレベルが減少したことを実証している。
アテローム性動脈硬化症評価
ＰＢＳ、その後のホルマリンＰＢＳ溶液（５％ホルマリンのＰＢＳ）によるかん流後に、アテローム性動脈硬化症の重症度をマウスから採取した大動脈で評価した。マウス大動脈全体を解剖用顕微鏡を用いて近位上行大動脈から腸骨動脈の分岐部まで切開した。外膜脂肪を取り除き、大動脈を長手方向に開き、、解剖用の黒色ワックス上にピンで平らに留めて、スーダンＩＶで染色し、固定倍率で写真を撮影した。写真をデジタル化し、総大動脈弁領域および病変部位をＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０およびＮＩＨ Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅ／Ｄｅｆａｕｌｔ．ｈｔｍｌ）を用いて算出した。表１８に示す結果を、病変を含む総大動脈弁領域のパーセントとして報告する。示されるように、ＩＳＩＳ２３３６９３による処置が大動脈病変の顕著な減少とアテローム性動脈硬化の改善をもたらした。
肝機能
肝機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評定するため、血漿アミノ基転移酵素濃度を臨床化学自動分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いて測定した。血漿のＡＬＴ（アラニンアミノ基転移酵素）およびＡＳＴ（アスパラギン酸アミノ基転移酵素）濃度を測定し、その結果をＩＵ／Ｌ単位で示す表１９および２０に示す。測定を４週間ごとに行った。０週は、処置開始時であり、高脂肪餌給餌開始後４週間である。
実施例１０：ヒトａｐｏＢ１００トランスジェニックＬＤＬｒ−／−マウスに対するアンジオポエチン様３のアンチセンス阻害効果
脂質異常症治療薬としてのＩＳＩＳ２３３６９３の効果を、高コレステロール餌を給餌したヒトａｐｏＢ−１００トランスジェニックＬＤＬ受容体ノックアウトマウスで、評定した。これらの試験に使用したマウスは、先行論文（Ｓａｎａｎ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９５： ４５４４-４５４９）に記
載されている。簡潔には、このマウス株は、ＬＤＬｒ-／- マウス（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ
ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９２： ８８３-８９３）により
本来記載され、１２９ｓｖおよびＣ５７ＢＬ／６株のハイブリッドである）とヒトａｐｏＢ−１００トランスジェニックマウス（Ｌｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９２： ３０２９-３０３７、ＳＪＬおよびＣ５７ＢＬ／６Ｂ株のハイ
ブリッドである）のハイブリッドである。交配によりＬＤＬｒ-／-およびａｐｏＢの過剰発現特性が同型であることが示され、マウスはａｐｏＢ−１００−含有ＬＤＬの大幅な増加を示した。
処置
マウスをＨａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｎｄ社製餌ＴＤ８８１３７または「Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｄｉｅｔ」（２１％無水乳脂肪（乳脂肪）、３４％スクロース、および０．２％総コレステロール）で給餌した。給餌開始後１週間で、マウスを処置のため各５匹からなる群に分けた。第一コホートが、ＩＳＩＳ２３３６９３（配列番号１３１）の皮下注射を、週に２回、１２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇの用量で４週間受けた。第二のコホートが、対照オリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ１４１９２３（配列番号１８７）の皮下注射を、週に２回、１２．５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇの用量で４週間受けた。
オリゴヌクレオチドを注射のために生理食塩水に溶解した。高脂肪餌動物の１群が生理食塩水の注射を週に２回、４週間受けた。この生理食塩水注射群は、オリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群としての役割を果たした。
マウスを週に１回計量した。処置期間終了時に、マウスを安楽死させ、血液試料、肝臓、腎臓、脾臓、および脂肪体を、さらなる解析のために回収した。
ＲＮＡ解析
ＲＮＡを、ＡＮＧＰＴＬ３のリアルタイムＰＣＲ解析のため、ＡＮＧＰＴＬ３プライマープローブセット（フォワード配列ＣＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＴＣＡＣＧＡＡＡ、配列番号１８７として本明細書に指定する；リバース配列ＧＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＡＴＡＴ、配列番号１８８として本明細書に指定する；プローブ配列ＣＡＣＧＣＴＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＴＣＧＴＧＧ、配列番号１８９として本明細書に指定する）を用いて、
およびＡｐｏＣＩＩＩｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ解析のため、ＡｐｏＣＩＩＩプライマープローブセット（フォワード：ＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡ、本明細書に配列番号１２として組み込まれる；リバース：ＣＧＧＡＣＴＣＣＴＧＣＡＣＧＣＴＡＣＴＴ、本明細書に配列番号１３として組み込まれる；プローブ：ＣＴＣＣＡＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＣＧＣ、本明細書に配列番号１４として組み込まれる）を用いて肝臓組織から抽出した。結果を、ＰＢＳ対照と比較したマウスＡＮＧＰＴＬ３およびマウス
ＡｐｏＣＩＩＩの阻害パーセントで示す。表２１に示すように、ＩＳＩＳ２３３６９３およびＩＳＩＳ２３３７２５による処置は、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３ｍＲＮＡの有意な用量依存的減少をもたらした。ＩＳＩＳ２３３６９３による処置はまた、５０ｍｇ／ｋｇ／週でＡｐｏＣＩＩＩｍＲＮＡの阻害をもたらした。
肝臓型脂肪酸結合蛋白（ｌｉｖｅｒ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＬＦＡＢＰ）のＲＮＡレベルもまた、リアルタイムＰＣＲにより測定した。結果を表２１に示し、またＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによるＡＮＧＰＴＬ３の阻害がＬＦＡＢＰを阻害することにより肝臓での脂肪酸の輸送にも影響を及ぼすことを実証する。対照オリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ１４１９２３による処置は、予想通り、ＡＮＧＰＴＬ３、ＬＦＡＢＰまたはａｐｏＣＩＩＩに有意な減少をもたらさなかった。
コレステロールおよび脂質レベル
血漿および肝臓のトリグリセリド、ならびにコレステロールを、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法（Ｂｌｉｇｈ、Ｅ ａｎｄ Ｄｙｅｒ、Ｗ、Ｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ、３７、９１１−９１７、１９５９）により抽出し、市販のトリグリセリドキット（ＤＣＬトリグリセリド試薬；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．）を用いて測定した。結果を表２２に示す。試験は、ＩＳＩＳ２３３６９３およびＩＳＩＳ２３３７２５による処置がＰＢＳ対照と比較して２５ｍｇ／ｋｇ／週でそれぞれコレステロールレベルを６３％および３７％減少させたことを実証する。総コレステロールレベルの減少は主に、上述のように対照と比較して６３％および３４％のそれぞれのＬＤＬコレステロールレベルの有意な減少の結果であった。ＨＤＬの若干の減少は、脂質低下薬をマウスで試験した場合にＨＤＬ低下が通常マウスで認められるように、上記詳述のマウスモデル依存性であり得る。試験は、ＩＳＩＳ２３３６９３およびＩＳＩＳ２３３７２５による処置がＰＢＳ対照と比較して２５ｍｇ／ｋｇ／週でそれぞれ８２％および７０％トリグリセリドレベルを減少させたことを実証する。
従って、ＡＮＧＰＴＬ３を標的化するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによる処置により、このマウスモデルでの血漿脂質プロファイルを有意に改善する。
グルコース
グルコース生成に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評定するために、血漿グルコース値をＢｅｃｋｍａｎグルコースアナライザＩＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてグルコースオキシダーゼ法により測定した。結果を表２３に示し、また結果は、ＩＳＩＳ２３３６９３およびＩＳＩＳ２３３７２５による処置が、ＰＢＳ対照と比較して５０ｍｇ／ｋｇ／週でともに４０％の血漿グルコース値の減少をもたらしたことを実証する。
肝機能
肝機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評定するために、血漿アミノ基転移酵素濃度を臨床化学自動分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いて測定した。血漿のＡＬＴ（アラニンアミノ基転移酵素）およびＡＳＴ（アスパラギン酸アミノ基転移酵素）濃度を測定し、その結果をＩＵ／Ｌ単位で示す表２４に示す。
本試験により実証されるように、ＩＳＩＳ２３３６９３による処置によりいかなるアミノ基転移酵素レベルの有意な増加をも生じず、従って肝機能に対するいかなる弊害をももたらさなかった。ＲＮＡ解析と同様にこの分析は、ＩＳＩＳ２３３６９３がＡＮＧＰＴＬ３を標的化する強力で耐容性のアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを立証する。
体重および臓器重量
臓器重量に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評定するために、試験終了後に臓器を採取して計量した。結果を表２５に示し、またこの結果は、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによる処置が肝臓、脾臓、または腎臓重量に対し影響を与えないことを実証する。ＩＳＩＳ２３３６９３による処置により、ＰＢＳ対照と比較して、５０ｍｇ／ｋｇ／週で、まさに７７％のマウスの脂肪パッド重量が減少した。
実施例１１：Ｃ５７ＢＬ／６マウスでのフェノフィブラート阻害と比較したＡＮＧＰＴＬ３のアンチセンス阻害効果
マウスＡＮＧＰＴＬ３を標的化するＩＳＩＳ２３３６９３を、フェノフィブラートと比較してナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスで評定した。フェノフィブラートは、対象での高コレステロール血症および高トリグリセリド血症の商業的に可能な療法であり、コレステロール、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、および
トリグリセリドレベルの減少させること、ならびに高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルを上昇させることが知られている。
正常餌を給餌した５匹のＣ５７ＢＬ／６雄マウスの１群に５０ｍｇ／ｋｇ用量のＩＳＩＳ２３３６９３（配列番号１３１）を週に２回、６週間注射した。マウスの第二群を５０ｍｇ／ｋｇ／週の日常飼養育（ｄａｉｌｙ ｇａｖａｇｅ）として投与するフェノフィブラートで処置した。動物の１群は、ＰＢＳの注射を週に２回、６週間受けた。このＰＢＳ注射群は、オリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群としての役割を果たした。
６週間の処置期間後、マウスを犠牲にし、ＡＮＧＰＴＬ３ｍＲＮＡレベルを肝臓で評定した。ｍＲＮＡ発現レベルを、本明細書の他の実施例に記載のリアルタイムＰＣＲにより定量化した。ＰＢＳ処置マウスに比べると、ＩＳＩＳ２３３６９３は８５％のＡＮＧＰＴＬ３ｍＲＮＡレベルの減少を生じた。データは、ＡＮＧＰＴＬ３アンチセンスオリゴヌクレオチド処置は、肝臓での標的ｍＲＮＡ発現を効果的に阻害し得ることを実証する。
コレステロールおよび脂質レベル
血漿および肝臓のトリグリセリドならびにコレステロールを、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法（Ｂｌｉｇｈ、Ｅ ａｎｄ Ｄｙｅｒ、Ｗ、Ｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ、３７、９１１−９１７、１９５９）により抽出し、市販のトリグリセリドキット（ＤＣＬトリグリセリド試薬；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．）を用いて測定した。結果を表２６に示す。試験は、ＩＳＩＳ２３３６９３による処置がＰＢＳ対照と比較して５０ｍｇ／ｋｇ／週でコレステロールレベルを２３％減少させたことを実証する。試験は、ＩＳＩＳ２３３６９３による処置がＰＢＳ対照と比較して５０ｍｇ／ｋｇ／週で３８％トリグリセリドレベルを減少させたことを実証する。フェノフィブラートによる処置は、コレステロールまたはトリグリセリドレベルに対する効果を持っていなかった。
従って、ＡＮＧＰＴＬ３を標的化するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによる処理により、このマウスモデルでの血漿脂質プロファイルの有意な改善が生じた。
グルコース
グルコース生成に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評定するために、血漿グルコース値をＢｅｃｋｍａｎグルコースアナライザＩＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてグルコースオキシダーゼ法により測定した。結果を表２７に示し、また結果は、ＩＳＩＳ２３３６９３による処置が、ＰＢＳ対照と比較して５０ｍｇ／ｋｇ／週でともに１９％の血漿グルコース値の減少をもたらしたことを実証する。フェノフィブラートによる処置は、グルコース値に対する効果を持っていなかった。
肝機能
肝機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評定するため、血漿アミノ基転移酵素濃度を臨床化学自動分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いて測定した。血漿のＡＬＴ（アラニンアミノ基転移酵素）およびＡＳＴ（アスパラギン酸アミノ基転移酵素）濃度を測定し、その結果をＩＵ／Ｌ単位で示す表２８に示す。
この試験で実証されたように、ＩＳＩＳ２３３６３９３またはフェノフィブラートによる処置により、アミノ基転移酵素レベルのいかなる有意な増加も生じず、従って、肝機能へのいかなる弊害ももたらさなかった。
血漿ＮＥＦＡおよび３ＨＢレベルに対する効果
ＮＥＦＡおよび３−ＨＢレベルをマウス群で分析し、表２９に示した。脂肪酸化の指標としてのＮＥＦＡおよび３−ＨＢレベルは、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによる処理により有意な悪影響を受けなかった。フェノフィブラートによる処置は、ＮＥＦＡおよび３ＨＢの両方のレベルの増加に示されるように、脂肪酸化を増加させた。
臓器重量
臓器重量に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評定するために、試験終了後に臓器を採取して計量した。結果を表３０に示し、またこの結果は、ＩＳＩＳ２３３６９３による処置が肝臓、脾臓、または腎臓重量に対し影響を与えないことを実証する。ＩＳＩＳ２３３６９３による処置は、ＰＢＳ対照と比較して、５０ｍｇ／ｋｇ／週で、まさに４５％のマウスの白色脂肪組織重量が減少した。
実施例１２：Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットでのＡＮＧＰＴＬ３のアンチセンス阻害の効果
ＩＳＩＳ３６０３６３（ＧＴＧＡＣＡＴＡＴＴＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴ；配列番号１９１）およびＩＳＩＳ３６０３８２（ＴＴＴＡＡＧＴＧＡＣＧＴＴＡＣＣＴＣＴＧ；配列番号１９２）（両５−１０−５ＭＯＥギャップマーがラットｍＲＮＡ配列、配列番号１９３（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＭ＿２３３２１８．１）とそれぞれ開始位置３３３および４７６を標的化している）を、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットで評定した。
正常餌を給餌したＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの２群を５０ｍｇ／ｋｇ用量のＩＳＩＳ３６０３６３またはＩＳＩＳ３６０３８２で週に１回６週間注射した。動物の１群は、ＰＢＳの注射を週に２回６週間受けた。このＰＢＳ注射群は、オリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群としての役割を果たした。
ＲＮＡ解析
ＲＮＡを、ＡＮＧＰＴＬ３のリアルタイムＰＣＲ解析のため肝臓組織から抽出した。結果をＰＢＳ対照と比較したラットＡＮＧＰＴＬ３の阻害パーセントで示す。表３１に示す
ように、ＩＳＩＳ３６０３６３およびＩＳＩＳ３６０３８２による処置は、ＰＢＳ対照との比較で、ＡＮＧＰＴＬ３ｍＲＮＡの有意な減少をもたらした。
コレステロールおよび脂質レベル
血漿トリグリセリドおよびコレステロールを、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法（Ｂｌｉｇｈ、Ｅ ａｎｄ Ｄｙｅｒ、Ｗ、Ｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ、３７、９１１−９１７、１９５９）により抽出し、市販のトリグリセリドキット（ＤＣＬトリグリセリド試薬；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．）を用いて測定した。結果を表２６に示す。試験は、ＩＳＩＳ３６０３６３および３６０３８２による処置がＰＢＳ対照と比較してそれぞれトリグリセリドレベルを６７％および８１％減少させたことを実証する。従って、ＡＮＧＰＴＬ３を標的化するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによる処置により、このラットモデルでの血漿トリグリセリドの有意な改善が生じる。このモデルでのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによる処置は、総コレステロールまたはＬＤＬレベルに対する効果を持っていなかった。
配列表
本出願は、電子様式の配列表と共に提出されている。配列表は、２０１１年１月７日に作成されたサイズが５６ＫｂのＢＩＯＬ０１２０ＷＯＳＥＱ．ｔｘｔという名称のファイルとして提供されている。電子様式の配列表に含まれる情報の全体を参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (71)

  1. 動物にＡＮＧＰＴＬ３を標的とする１０〜３０連結ヌクレオシドの長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む、動物でのＡＮＧＰＴＬ３発現を低減させる方法であって、ＡＮＧＰＴＬ３の発現が動物で低減する、方法。
  2. 動物にＡＮＧＰＴＬ３を標的とする１０〜３０連結ヌクレオシドの長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む、動物でのａｐｏＣ−ＩＩＩ発現を低減させる方法であって、ａｐｏＣ−ＩＩＩの発現が動物で低減する、方法。
  3. 動物にＡＮＧＰＴＬ３を標的とする１０〜３０連結ヌクレオシドの長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む、動物でのトリグリセリドレベルを減少させる方法であって、トリグリセリドレベルが動物で減少する、方法。
  4. 動物にＡＮＧＰＴＬ３を標的とする１０〜３０連結ヌクレオシドの長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む、動物でのコレステロールレベルを減少させる方法であって、コレステロールレベルが動物で減少する、方法。
  5. 動物にＡＮＧＰＴＬ３を標的とする１０〜３０連結ヌクレオシドの長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む、動物での低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルを減少させる方法であって、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルが動物で減少する、方法。
  6. 動物にＡＮＧＰＴＬ３を標的とする１０〜３０連結ヌクレオシドの長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む、動物でのグルコースレベルを減少させる方法であって、グルコースレベルが動物で減少する、方法。
  7. 動物にＡＮＧＰＴＬ３を標的とする１０〜３０連結ヌクレオシドの長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを含む、動物での代謝疾患または心臓血管疾患を改善する方法であって、代謝疾患または心臓血管疾患が動物で改善される、方法。
  8. 前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体にわたり測定した配列番号１〜５に少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記修飾オリゴヌクレオチドが配列番号３４〜１８２のいずれか１つに記載の配列の少なくとも８つの隣接核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
  10. 前記動物がヒトである、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
  11. 前記化合物が第１剤であり、さらに第２剤を投与することを含む、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
  12. 前記第１剤および前記第２剤が同時投与される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記第２剤が血糖降下薬である、請求項１１のいずれかに記載の方法。
  14. 前記血糖降下薬が治療的生活習慣改善、ＰＰＡＲアゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼ（ＩＶ）阻害剤、ＧＬＰ−１類似体、インスリンもしくはインスリン類似体、インスリ
    ン分泌促進剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、ヒトアミリン類似体、ビグアニド、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記血糖降下薬がメトホルミン、スルホニル尿素、ロシグリタゾン、またはそれらの組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記血糖降下薬がアセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリド、またはグリクラジドから選択されるスルホニル尿素である、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記血糖降下薬がビグアニドメトホルミンである、請求項１３に記載の方法。
  18. 前記血糖降下薬がナテグリニドまたはレパグリニドから選択されるメグリチニドである、請求項１３に記載の方法。
  19. 前記血糖降下薬がピオグリタゾンまたはロシグリタゾンから選択されるチアゾリジンジオンである、請求項１３に記載の方法。
  20. 前記血糖降下薬がアカルボースまたはミグリトールから選択されるアルファ−グルコシダーゼ阻害剤である、請求項１３に記載の方法。
  21. 前記第２剤が脂質低下療法である、請求項１１に記載の方法。
  22. 前記脂質低下療法が治療的生活習慣改善、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、ＭＴＰ阻害剤、ＡｐｏＢを標的化したアンチセンス化合物、またはそれらのあらゆる組み合わせである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記脂質低下療法がアトルバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、またはシンバスタチンから選択されるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤である、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記脂質低下療法がコレステロール吸収阻害剤、エゼチミブである、請求項２１に記載の方法。
  25. 投与が非経口投与を含む、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
  26. 化合物が一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
  27. 前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は修飾オリゴヌクレオチド全体にわたり測定した配列番号１〜５のいずれか１つに少なくとも９５％相補的である、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
  28. 前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は修飾オリゴヌクレオチドの全体にわたり測定した配列番号１〜５のいずれか１つに１００％相補的である、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
  29. 前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間連結が修飾ヌクレオシド間連結である、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
  30. 各ヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
  32. 少なくとも１つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドを含み、テトラヒドロピラン環でフラノース環が置換される請求項３１に記載の方法。
  33. 各少なくとも１つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドが化学構造：

    （式中、Ｂｘは随意に保護されたヘテロ環式塩基部分である）を有する、請求項３２に記載の方法。
  34. 少なくとも１つの修飾糖が二環式糖である、請求項３１に記載の方法。
  35. 少なくとも１つの修飾糖が２’−Ｏ−メトキシエチルまたは４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋（式中、ｎは１または２である）を含む、請求項３１に記載の方法。
  36. 前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
  37. 前記修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記修飾オリゴヌクレオチドは２０連結ヌクレオシドからなる、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
  39. 前記修飾オリゴヌクレオチドは：
    ａ．連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
    ｂ．連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
    ｃ．連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント；を有し、
    前記ギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
  40. 前記修飾オリゴヌクレオチドは２０連結ヌクレオシドからなり、配列番号３４〜１８２のいずれかから選択される核酸塩基配列の少なくとも８つの隣接核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し、および：
    ａ．連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
    ｂ．５つの連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
    ｃ．５つの連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント；を有し、
    前記ギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間連結がホスホロチオエート結合であり、および、各シトシン５’−メチルシトシンである、請求項１〜７に記載の方法。
  41. 代謝疾患または心臓血管疾患の動物を処置する方法であって、
    ａ．代謝疾患または心臓血管疾患の動物を特定すること、
    ｂ．前記動物に、２０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み修飾オリゴヌクレオチドの全体にわたり測定した配列番号１〜５に少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する化合物の治療有効量を投与すること、を含み、
    前記代謝疾患または心臓血管疾患の動物が処置される、方法。
  42. 前記動物に投与された化合物の治療有効量が動物での代謝疾患または心臓血管疾患を減少させる、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記代謝疾患または心臓血管疾患は肥満、糖尿病、アテローム性動脈硬化、脂質異常症、冠動脈性心疾患、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂肪酸血症、もしくは代謝症候群、またはそれらの組み合わせである、請求項７または４１に記載の方法。
  44. 前記脂質異常症は高脂血症である、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記高脂血症は高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、または高コレステロール血症と高トリグリセリド血症の両方である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記ＮＡＦＬＤが肝脂肪症または脂肪性肝炎である、請求項４３に記載の方法。
  47. 糖尿病が２型糖尿病または脂質異常症合併２型糖尿病である、請求項４３に記載の方法。
  48. 投与が、トリグリセリドレベル、コレステロールレベル、インスリン抵抗性、グルコース値、またはそれらの組み合わせを含む、脂質レベルの減少をもたらす、請求項１に記載の方法。
  49. 前記レベルが独立して５％、１０％、２０％、３０％、３５％、または４０％減少する、請求項４８に記載の方法。
  50. 投与が改善したインスリン感受性をもたらす、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  51. 投与が改善した肝臓インスリン感受性をもたらす、請求項５０に記載の方法。
  52. ２０連結ヌクレオシドからなり修飾オリゴヌクレオチドの全体にわたり測定した配列番号１〜５に少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むＡＮＧＰＴＬ３阻害剤を投与することによって、ヒトでの、ＡＮＧＰＴＬ３レベル、ＬＤＬレベル、ａｐｏＣ−ＩＩＩレベル、トリグリセリドレベル、コレステロールレベル、グルコース値、脂肪パッド重量、心臓血管疾患および代謝疾患のうち１つ以上を低下させる方法。
  53. 投与がアテローム斑、肥満、グルコース、脂質、グルコース抵抗性、コレステロールの減少、もしくはインスリン感受性の改善、またはそれらの組み合わせをもたらす、請求項１〜５２に記載の方法。
  54. １０〜３０連結ヌクレオシドからなり配列番号３４〜１８２のいずれかから選択される核酸塩基配列の少なくとも８つの隣接核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌ
    クレオチドを含む化合物。
  55. 修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１〜５に少なくとも９５％相補的である、請求項５４に記載の化合物。
  56. 修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列配列番号１〜５に少なくとも１００％相補的である、請求項５４に記載の化合物。
  57. 修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項５４に記載の化合物。
  58. 少なくとも１つのヌクレオシド間連結が修飾ヌクレオシド間連結である、請求項５４に記載の化合物。
  59. 各ヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、請求項５８に記載の化合物。
  60. 少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項５４に記載の化合物。
  61. 少なくとも１つの修飾糖が二環式糖である、請求項６０に記載の化合物。
  62. 少なくとも１つの修飾糖が２’−Ｏ−メトキシエチルまたは４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋（式中、ｎは１または２である）を含む、請求項６０に記載の化合物。
  63. 少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、請求項５４に記載の化合物。
  64. 修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項６３に記載の化合物。
  65. 前記修飾オリゴヌクレオチドは：
    連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
    連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
    連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント；を有し、
    前記ギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項５４に記載の化合物。
  66. 前記修飾オリゴヌクレオチドは２０連結ヌクレオシドからなり、また：
    連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
    ５つの連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
    ５つの連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント；を有し、
    前記ギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間連結がホスホロチオエート結合である、請求項５４に記載の化合物。
  67. 修飾オリゴヌクレオチドが２０連結ヌクレオシドからなる、請求項５４に記載の化合物。
  68. １０〜３０連結ヌクレオシドからなり配列番号３４〜１８２のいずれかに記載の配列から選択される核酸塩基配列の少なくとも８つの隣接核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドまたはその塩と医薬的に許容可能な担体もしくは希釈剤を含む化
    合物。
  69. 修飾オリゴヌクレオチドは一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項６８に記載の化合物。
  70. 修飾オリゴヌクレオチドが２０連結ヌクレオシドからなる、請求項６８に記載の化合物。
  71. ２０連結ヌクレオシドからなり、配列番号３４〜１８２のいずれかから選択される核酸塩基配列の少なくとも８つの隣接核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが：
    連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
    ５つの連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
    ５つの連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント；を有し、
    前記ギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間連結がホスホロチオエート結合であり、および、各シトシン５’−メチルシトシンである、化合物。
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