JP2015194493A - 発色試薬溶液のバックグラウンド上昇抑制方法、発色試薬溶液、試薬キット、および測定装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】その方法は、試料中の成分の測定に使用され、酸化発色試薬が溶解されている発色試薬溶液を保管する際に生じる前記発色試薬溶液のバックグラウンド上昇を抑制するための方法であって、前記発色試薬溶液の水素イオン指数(pH)を強酸性に調整する調整工程、を有している。好ましくは、前記調整工程において、前記発色試薬溶液の水素イオン指数は、2.9以下または2.1以下に調整される。好ましくは、前記発色試薬溶液は、酸化ストレス度を測定するのに使用される。好ましくは、前記酸化発色試薬は、フェニレンジアミン誘導体である。
【選択図】図8
Description
図1は、本発明が適用された発色試薬溶液、その発色試薬溶液を含むカートリッジ、およびそのカートリッジを用いて生体中の酸化ストレス度を測定するための測定装置を具備する測定システムの一例を示している。測定システムAは、カートリッジ1および測定装置2を具備している。カートリッジ1は、例えば、診療所や、病院の病棟に設置されている小型の測定装置2にセットして、試料Sに含まれる成分の量を測定するのに使用される。試料S中の成分としては、具体的には、例えば、ヒドロペルオキシド(R−OOH)が挙げられる。このヒドロペルオキシドは、生体内の脂質、蛋白質、アミノ酸、核酸などが、活性酸素・フリーラジカルにより酸化を受けて生じたものである。測定によって得られたヒドロペルオキシド濃度は、生体内の酸化ストレス度を総合的に評価するのに用いられる。試料Sとしては、具体的には、例えば、全血、血漿、血清、尿、唾、間質液などの生体試料が挙げられる。これらの試料Sは、そのまま適用してもよいし、希釈液RS4で希釈して適用してもよい。
図1および図2に示すように、カートリッジ1は、複数の槽、測光セル、チップ装填箇所などが一体化されたものである。カートリッジ1は、本発明でいう試薬キットの一例に相当するものである。カートリッジ1は、例えば、ポリスチレンを材料として、射出成型により製造される。カートリッジ1は、測光セル12において、可視光線または紫外線を透過させる。これより、カートリッジ1の材料として、ポリスチレンの他に、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリカーボネートなどが使用される。カートリッジ1は、ヒドロペルオキシド濃度を測定するのに必要な試薬を全て含んでいる。このカートリッジ1は、製造後、冷蔵して輸送・保管される。冷蔵条件として、例えば、4℃以下が挙げられる。
発色試薬溶液槽11に充填された発色試薬溶液RS1は、酸化発色試薬が溶媒に溶解された液状試薬である。溶媒としては、例えば、水が使用される。発色試薬溶液RS1において、酸化発色試薬の濃度は、測定液RS2中で最終的に、0.2〜8mMまたは0.4〜6.4mMになるように調整される。酸化発色試薬は、酸化されると分子内に発色団を生じることにより呈色する。そのため、酸化発色試薬の濃度は、発色試薬溶液RS1において、例えば、0.24mM〜9.6mMまたは0.48mM〜7.68mMに調整される。酸化発色試薬は、酸化されることによりセミキノン色素やキノン色素となって発色する。酸化発色試薬として、フェニレンジアミン誘導体が使用される。特に、p−フェニレンジアミン誘導体が、好ましく使用される。p−フェニレンジアミン誘導体は、特に、下記一般式(I)で表される化合物またはその塩である。
希釈液RS4は、試料Sを希釈するためのものである。また、希釈液RS4は、発色試薬溶液RS1を希釈するためのものである。試料Sが希釈液RS4によって希釈されると、希釈試料RS3が生成する。希釈試料RS3は発色試薬溶液RS1と混合され、測定液RS2が生成する。よって、結果的に、希釈液RS4は、発色試薬溶液RS1を希釈することになる。
チップ17は、図1および図2に示すように、酸化ストレス度を測定するための準備の際に、測定装置2のノズル21(後述)の先端に装着され、チップ装填箇所16から取り外される。チップ17は、測定装置2のサンプリングポンプユニット21aの動作により、試料Sや発色試薬溶液RS1などを吸引し、排出する機能を有している。これにより、チップ17は、カートリッジ1内における各液の移し替えや吸引・排出による撹拌に用いられる。チップ17は、ポリプロピレンやポリエチレンなどの合成樹脂を用いて製造される。
測定装置2は、カートリッジ1を用いて生体内の酸化ストレス度を測定するためのものである。図1および図2に示すように、測定装置2は、制御部20、ノズル21、測光ユニット22、および温調ブロック23を具備している。
ここで、図4に示すフロー図により、カートリッジ1および測定装置2を使用して、酸化ストレス度の測定を行なう手順の一例を説明する。測定装置2の動作は、制御部20によって制御される。酸化ストレス度を測定するd−ROMsテスト(Reactive Oxygen Metabolites)においては、生体の活性酸素・フリーラジカルが直接計測されるのではない。それらにより生じたヒドロペルオキシド(R−OOH)濃度が呈色反応を用いて測定され、生体内の酸化ストレス度が総合的に評価される。なぜなら、ヒドロペルオキシド(R−OOH)は、活性酸素・フリーラジカルによって酸化反応を受けた脂質、蛋白質、アミノ酸、核酸などの総称であり、酸化ストレス度のマーカーとなるからである。
図5に示す処方に従い、比較発色試薬溶液(1)、(2)、発色試薬溶液(1)、(2)を調製した。発色試薬溶液(1)、(2)は、硫酸を添加することにより強酸性としたものである。酸化発色試薬として、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−1,4−フェニレンジアミン硫酸塩またはN−エチル−N−(2−ヒドロキシエチル)−1,4−フェニレンジアミン硫酸塩を使用した。発色試薬溶液(1)、(2)における硫酸濃度は、0.1Mとした。なお、比較発色試薬溶液(1)、(2)は、硫酸を添加しないことを除き、発色試薬溶液(1)、(2)と同一の組成とした。
各試薬溶液の調整直後の着色を確認した後、40℃、14日間保管し、バックグラウンド着色の程度を目視にて比較した。着色が強いほど、バックグラウンド上昇が大きいことを示す。
図7に示す処方に従い、比較発色試薬溶液(3)および発色試薬溶液(3)〜(8)を調整した。酸化発色試薬として、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−1,4−フェニレンジアミン硫酸塩を使用した。酸化発色試薬の濃度は、3.2mMとした。強酸としては、硫酸、塩酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸、p−トルエンスルホン酸を使用した。それぞれの強酸を添加することにより、各発色試薬溶液の水素イオン指数を図7に示すように調整した。各発色試薬溶液を40℃の条件で保管し、調整直後、3日目、7日目に、バックグラウンドの着色を測定した。測定は、発色試薬溶液(3)〜(8)を、個別に、カートリッジ1の測光セル12に分注し、測定装置2を510nmの吸光度を表示できるように設定して行った。なお、比較発色試薬溶液(3)の測定は、強酸を添加しないことを除き、発色試薬溶液(3)〜(8)と同一条件で行った。
図14に示す処方に従い、比較発色試薬溶液(4)および発色試薬溶液(9)を調整した。酸化発色試薬として、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−1,4−フェニレンジアミン硫酸塩を使用した。発色試薬溶液(9)において、酸化発色試薬の濃度は、3.2mMとした。強酸としては、p−トルエンスルホン酸を使用した。発色試薬溶液(9)におけるp−トルエンスルホン酸の濃度は、0.1Mになるように調整した。なお、比較発色試薬溶液(4)は、強酸を添加しないことを除き、発色試薬溶液(9)と同一条件とした。
希釈液RS4は、最終的な測定液RS2において、酢酸緩衝液(pH5.0)の濃度が300mM、FeSO4の濃度が0.03mMとなるように調整した。そのため、酢酸緩衝液(pH5.0)の濃度を、2000mMに調整した。また、FeSO4の濃度を、前記酢酸緩衝液(pH5.0)において0.2mMになるように調整した。
すなわち、カートリッジ1の発色試薬溶液槽11、希釈液槽14に、それぞれ規定量の発色試薬溶液(9)および前記酢酸緩衝液を充填した。また、試料槽10に前記t−ブチルペルオキシド溶液50μLを分注した。次に、カートリッジ1を測定装置2にセットし、測定をスタートさせた。測定装置2のノズル21は、チップ17を先端に装着し、希釈液槽14の前記酢酸緩衝液126μLを希釈槽13に分注した。次に、ノズル21は、試料槽10の前記t−ブチルペルオキシド溶液を吸引し、その14μLを希釈槽13へ分注した。
比較発色試薬溶液(4)についても、同様に測定を行った。
1 カートリッジ
2 測定装置
S 試料
10 試料槽
11 発色試薬溶液槽
12 測光セル
13 希釈槽
14 希釈液槽
15 洗浄液槽
16 チップ装填箇所
17 チップ
21 ノズル
22 測光ユニット
23 温調ブロック
RS1 発色試薬溶液
RS2 測定液
RS3 希釈試料
RS4 希釈液
RS5 洗浄液
Claims (15)
- 試料中の成分の測定に使用され、酸化発色試薬が溶解されている発色試薬溶液を保管する際に生じる前記発色試薬溶液のバックグラウンド上昇を抑制するための方法であって、
前記発色試薬溶液の水素イオン指数を強酸性に調整する調整工程、を有している、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記調整工程において、前記発色試薬溶液の水素イオン指数は、2.9以下または2.1以下に調整される、方法。 - 請求項1または2に記載の方法であって、
前記発色試薬溶液は、酸化ストレス度を測定するのに使用される、方法。 - 請求項1〜3のいずれかに記載の方法であって、
前記酸化発色試薬は、フェニレンジアミン誘導体である、方法。 - 請求項4に記載の方法であって、
前記フェニレンジアミン誘導体は、p−フェニレンジアミン誘導体である、方法。 - 試料中の成分の測定に使用され、酸化発色試薬が溶解されている発色試薬溶液であって、
水素イオン指数が強酸性に調整されている、発色試薬溶液。 - 請求項7に記載の発色試薬溶液であって、
水素イオン指数が、2.9以下または2.1以下に調整されている、発色試薬溶液。 - 請求項7または8に記載の発色試薬溶液であって、
酸化ストレス度を測定するのに使用される、発色試薬溶液。 - 請求項7〜9のいずれかに記載の発色試薬溶液であって、
前記酸化発色試薬は、フェニレンジアミン誘導体である、発色試薬溶液。 - 請求項10に記載の発色試薬溶液であって、
前記フェニレンジアミン誘導体は、p−フェニレンジアミン誘導体である、発色試薬溶液。 - 試料中の成分の測定に使用される試薬キットであって、
請求項7〜12のいずれかに記載の発色試薬溶液を含む、試薬キット。 - 請求項13に記載の試薬キットであって、
前記発色試薬溶液を希釈するための希釈液を更に含んでおり、
前記希釈液は、緩衝剤により呈色反応に適した所定の水素イオン指数に調整されており、前記発色試薬溶液の水素イオン指数は、前記希釈液によって希釈されることにより、前記希釈液の前記所定の水素イオン指数に変化するように構成されている、試薬キット。 - 試料中の成分の測定に使用される測定装置であって、
請求項13または14に記載の試薬キットを使用して測定を行う、測定装置。
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