CN103897426B - 氧化应激度测定用试剂及氧化应激度的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及氧化应激度测定用试剂及氧化应激度的测定方法。本发明的课题在于提供与以往相比能够以高灵敏度或在宽范围的波长区域内测定氧化应激度的氧化应激度测定用试剂以及使用该氧化应激度测定用试剂的氧化应激度的测定方法。一种氧化应激度测定用试剂，其含有由下述通式(I)表示的化合物或其盐；以及一种氧化应激度的测定方法，其使用该氧化应激度测定用试剂。通式(I)中，R1、R2、R3及R4各自独立地表示氢原子、乙基、异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基。其中，R1、R2、R3及R4中的至少1个表示异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基。
Description
技术领域
本发明涉及氧化应激度测定用试剂及氧化应激度的测定方法。
背景技术
已知生物体内的氧化应激与各种疾病和老化相关，为了掌握生物体内的氧化应激的状态，已提出各种方法。例如，提出了将血液等生物样品中的游离自由基用作氧化应激的标记物。
专利文献1中公开了通过测定受试者的氧化应激度来分析从受试者采集的血液中的游离自由基的状态的分析装置。在该分析装置中，作为氧化应激度的测定方法之一，应用了将生物体内生成的血中的氢过氧化物(ROOH)用作氧化应激的标记物并通过显色反应来测量其浓度的d-ROM测试(Reactive Oxygen Metabolites，反应性氧代谢物)。专利文献1中，作为进行该d-ROM测试时使用的显色试剂，公开了N,N-对乙基苯二胺。
另外，专利文献2中公开了将N,N-对乙基苯二胺和具有-CH3、-CH2CH3、-H或卤素原子作为其4个部位的配位官能团的化合物用作显色试剂、以及使用该显色试剂的游离自由基的测定方法。
专利文献1：日本特开2009-257909号公报
专利文献2：欧洲专利第0783692B1号说明书
发明内容
然而，对于专利文献1及2中公开的N,N-对乙基苯二胺等而言，从灵敏度或测定波长区域的任一观点考虑，吸收特性都不充分。本发明是鉴于上述事实而完成的，其课题在于提供与以往相比能够以高灵敏度或在宽范围的波长区域内测定氧化应激度的氧化应激度测定用试剂以及使用该氧化应激度测定用试剂的氧化应激度的测定方法。
本发明如下所述。
＜1＞一种氧化应激度测定用试剂，其含有由下述通式(I)表示的化合物或其盐。
通式(I)中，R1、R2、R3及R4各自独立地表示氢原子、乙基、异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基。其中，R1、R2、R3及R4中的至少1个表示异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基。
＜2＞根据＜1＞所述的氧化应激度测定用试剂，其中，所述R1、R2、R3及R4中的至少1个为碳原子数1～4的羟基烷基。
＜3＞根据＜1＞所述的氧化应激度测定用试剂，其中，所述R1、R2、R3及R4中的至少1个为2-羟乙基。
＜4＞根据＜1＞所述的氧化应激度测定用试剂，其中，所述R1、R2、R3及R4中的至少1个为苯基。
＜5＞一种氧化应激度的测定方法，其包括：使用＜1＞至＜4＞中任一项所述的氧化应激度测定用试剂测定生物样品的氧化应激度。
＜6＞一种由上述通式(I)表示的化合物或其盐，用于制造＜1＞至＜4＞中任一项所述的氧化应激度测定用试剂。
＜7＞一种＜1＞至＜4＞中任一项所述的氧化应激度测定用试剂的制造方法，其包括：将由上述通式(I)表示的化合物或其盐与缓冲液混合。
＜8＞由上述通式(I)表示的化合物或其盐在制造＜1＞至＜4＞中任一项所述的氧化应激度测定用试剂中的应用。
＜9＞＜1＞至＜4＞中任一项所述的氧化应激度测定用试剂在氧化应激度的测定方法中的应用。
发明效果
根据本发明，能够提供与以往相比能够以高灵敏度或在宽范围的波长区域内测定氧化应激度的氧化应激度测定用试剂、以及使用该氧化应激度测定用试剂的氧化应激度的测定方法。
附图说明
图1是示出实施例1中测定的吸收光谱的图。
图2是示出实施例2中进行的试验A的结果的图。
图3是示出实施例2中进行的试验B的结果的图。
具体实施方式
以下对本发明进行说明。
在本发明中用“～”表示的数值范围表示含有“～”的前后记载的数值分别作为最小值和最大值的范围。
本说明书中，在提到组合物中的各成分的量时，在组合物中存在多种与各成分相当的物质时，如果没有特别说明，则是指组合物中存在的该多种物质的合计量。
＜氧化应激度测定用试剂＞
本发明的氧化应激度测定用试剂含有由下述通式(I)表示的化合物或其盐。该由通式(I)表示的化合物或其盐作为发色色素发挥作用。由下述通式(I)表示的化合物或其盐可以在氧化应激度测定用试剂的制造中使用。需要说明的是，在以下说明中，有时将由通式(I)表示的化合物或其盐适当统称为“特定发色色素”。
本发明的氧化应激度测定用试剂包括如下两种：由下述通式(I)表示的化合物或其盐本身；以及至少含有由下述通式(I)表示的化合物或其盐和缓冲液的组合物。
本发明的氧化应激度测定用试剂也可以通过包括将由下述通式(I)表示的化合物或其盐与缓冲液混合的制造方法来制造。
本发明的氧化应激度测定用试剂可以在氧化应激度的测定方法中使用。关于可应用本发明的氧化应激度测定用试剂的氧化应激度的测定方法的详细情况如后所述。
通式(I)中，R1、R2、R3及R4各自独立地表示氢原子、乙基、异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基(例如，可以列举羟甲基、羟乙基、羟丙基，优选2-羟乙基)或苯基。
通式(I)中，也可以R1、R2、R3及R4中的至少1个表示异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基，R1、R2、R3及R4中的2个以上各自独立地表示异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基。
另外，在R1、R2、R3及R4中的2个以上各自独立地表示异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基时，可以是2个以上相同的基团，也可以是2个以上各自不同的基团。
在特定发色色素的一个优选方式中包含R1、R2、R3及R4中的至少1个为碳原子数1～4的羟基烷基的方式(以下，有时将该方式的特定发色色素称为“特定发色色素A”)。R1、R2、R3及R4中的至少1个为碳原子数1～4的羟基烷基的特定发色色素A与作为氧化应激度测定用试剂使用的现有公知的化合物相比，以更高的灵敏度显示出尖锐的吸收。因此，通过选择特定发色色素A，能够以更高的精度进行氧化应激度测定。
特定发色色素的另一个优选方式包含R1、R2、R3及R4中的至少1个为苯基的方式(以下，有时将该方式的特定发色色素称为“特定发色色素B”)。在R1、R2、R3及R4中的至少1个是苯基时，显色后的特定发色色素B因其分子结构而存在不同，但在420nm～800nm的宽范围的波长区域内具有吸收波长。
因此，例如，在使用血液作为氧化应激度测定的生物样品时，通过选择即使在不受因蛋白质等血清成分的存在而产生的干涉的影响的长波长侧的波长区域(例如，600nm以上的区域)内也具有吸收波长的特定发色色素B，能够以更高的精度测定氧化应激度。
另外，测定灵敏度有时根据测定装置的种类等发生变动，但由于特定发色色素B在宽范围的波长区域内具有吸收波长，因此具有不易受因测定装置引起的灵敏度变动的影响的优点。特别是，在使用LED(light emitting diode，发光二极管)作为测定光源时，有时因LED 的批间差异而引起测定灵敏度发生变动，但即使在这种情况下，通过使用特定发色色素B也能够以更高的精度测定氧化应激。
另外，也可以是特定发色色素具备特定发色色素A及B两者的特征的方式、即R1、R2、R3及R4中的至少1个为苯基且R1、R2、R3及R4中的至少1个为碳原子数1～4的羟基烷基的方式。此时，在由通式(I)表示的化合物中，苯基所键合的氮原子和碳原子数1～4的羟基烷基所键合的氮原子可以相同也可以不同。
在特定发色色素是在R1、R2、R3或R4具有作为通式(I)中的R1、R2、R3或R4而说明的取代基中除苯基以外的取代基的化合物时，也可以是该由通式(I)表示的化合物的盐。
特定发色色素是由通式(I)表示的化合物的盐时，作为该盐的例子，可以列举盐酸盐、硫酸盐、草酸盐等。
作为本发明中的特定发色色素，从制备样品液时在溶剂中的溶解性的观点考虑，更优选为由通式(I)表示的化合物的盐。
作为通式(I)中的R1、R2、R3及R4，包含R1为氢原子、R2为氢原子或异丙基、R3为氢原子、乙基或碳原子数1～4的羟基烷基、R4为碳原子数1～4的羟基烷基或苯基的方式，但本发明中的特定发色色素不限于此。
另外，作为特定发色色素的其他例子，包含通式(I)中R1为氢原子、R2为氢原子、R3为乙基或碳原子数1～4的羟基烷基、R4为碳原子数1～4的羟基烷基的化合物的盐酸盐、硫酸盐或草酸盐，但本发明中的特定发色色素不限于此。
特定发色色素的具体例如下所示，但本发明中的特定发色色素不限于此。
＜氧化应激度的测定方法＞
本发明的氧化应激度的测定方法(以下，适当称为“本发明的测定方法”)是使用含有已经叙述的由通式(I)表示的化合物或其盐(特定发色色素)的氧化应激度测定用试剂测定生物样品中的氧化应激度的方法。本发明的测定方法是通过显色反应测量生物样品中的氢过氧化物(R-OOH)浓度并综合地评价生物体内的氧化应激度的方法。
在本发明的测定方法中，作为测量对象的氢过氧化物(R-OOH)是指因活性氧、游离自由基而发生氧化反应的脂质、蛋白质、氨基酸、核酸等的统称，是氧化应激度的标记物。本发明的测定方法中使用的生物样品包含血液、血浆等血液来源物、尿等。
本发明的测定方法优选使用分光光度计测定通过下述第一反应及第二反应进行发色后的样品液的吸光度、并由得到的测定值算出氢过氧化物(R-OOH)浓度的方法。
第一反应：
该反应包含如下步骤：使过渡金属盐及特定发色色素溶解，且在调节为预定的pH的缓冲液中混合生物样品而得到样品液；在得到的样品液中将来源于该过渡金属盐的过渡金属离子作为催化剂来分解生物样品中含有的氢过氧化物(R-OOH)，生成包含烷氧基自由基(R-O)及氢过氧化自由基(R-OO)的游离自由基。
第二反应：
该反应中，利用第一反应中在样品液中生成的包含烷氧基自由基(R-O)及氢过氧化自由基(R-OO)的游离自由基使样品液中含有的特定发色色素发色。
作为上述缓冲液，例如可以列举：醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-马来酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、2-(N-吗啉基)乙烷磺酸(MES)缓冲液、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)缓冲液及Bis-Tris缓冲液等，优选醋酸缓冲液、MES缓冲液或Tris-马来酸缓冲液，更优选醋酸缓冲液。
作为上述缓冲液的pH，优选3.6～5.6，更优选4.6～5.4。作为上述缓冲液的浓度，优选100mM～400mM，更优选200mM～400mM。
作为上述过渡金属盐，例如可以列举：硫酸铁(II)、硫酸铜(I)等，优选硫酸铁(II)。作为上述缓冲液中过渡金属盐的浓度，优选0.06mM～0.0005mM，更优选0.03mM～0.001mM。
作为上述缓冲液中的特定发色色素的浓度，优选0.4mM～8mM，更优选0.8mM～6.4mM。
测定通常优选在20℃～40℃的温度范围内进行。
作为可在本发明的测定方法中应用的测定装置，只要是可实施本发明的测定方法的装置，则没有特别限定。作为这样的测定装置，例如可以使用日本特开2009-257909号公报中记载的测定装置。另外，作为测定装置，可以使用能够实施本发明的测定方法的市售品。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明。但是，本发明不受这些实施例的任何限制。
[实施例1]
将表1所示的各化合物作为发色色素，对每个发色色素制备下述配方A的样品液。使发色色素和过氧化氢在制备的各样品液中反应，使发色色素发色。
与发色后的各样品液另行地分别制造从下述配方的样品液中仅除去过氧化氢的样品液，并将它们作为发色前的样品液。
针对发色后及发色前的各样品液，使用光度计(产品名：分光光度计V-550，日本分光公司制)测定吸收光谱，求出它们的差光谱，并示于图1。需要说明的是，在图1中，白色三角表示使用发色色素(1)时的结果，白色圆表示使用发色色素(2)时的结果，粗线表示使用发色色素(3)时的结果，细线表示使用发色色素(4)时的结果以及“×”表示使用比较发色色素时的结果。
-配方A-
醋酸缓冲液(pH5.0) 300mM
FeSO4 0.03mM
发色色素(表1中示出的各发色色素) 3.2mM
过氧化氢 0.003质量%
表1
在表1中，实施例1中使用的发色色素(1)～(4)是本发明的氧化应激度测定用试剂涉及的特定发色色素，发色色素(1)及(2)包含在特定发色色素A中，发色色素(3)及(4)包含在特定发色色素B中。比较发色色素是现有公知的发色色素。需要说明的是，发色色素(1)及(2)以硫酸盐的形式使用。
由图1所示的结果可知如下内容。
对于具有2-羟乙基作为取代基的发色色素(1)及(2)而言，在与比较发色色素的对比中可知，虽然吸收波长几乎相同，但更尖锐且灵敏度明显高。
对于具有苯基作为取代基的发色色素(3)及(4)而言，在与比较发色色素的对比中可知，在更宽范围的区域内具有吸收波长，与以往相比能够在长波长侧进行测定。
由以上可知，通过使用本发明的含有特定发色色素的氧化应激度测定用试剂，能够以更高的精度测定氧化应激度。
[实施例2]
将表1所示的各化合物作为发色色素，对每个发色色素制备下述配方B的样品液。在制备的各样品液中使发色色素和叔丁基过氧化物(t-BuOOH)发生反应，使发色色素发色。
针对发色后的各样品液，进行下述比较试验A或B，比较各发色色素的反应性。
-比较试验A-
针对含有发色色素(1)、发色色素(2)或比较发色色素的发色后的各样品液，使用光度计(产品名：分光光度计V-550，日本分光制)，测定波长510nm下的吸光度，比较各发色色素的反应性。发色试验A的结果示于图2。图2中，“×”表示使用发色色素(1)时的结果，“白色圆”表示使用发色色素(2)时的结果，“白色方块”表示使用比较发色色素时的结果。
-比较试验B-
针对含有发色色素(3)、发色色素(4)或比较发色色素的发色后的各样品液，使用光度计(产品名：分光光度计V-550，日本分光公司制)，测定波长660nm下的吸光度，并比较各发色色素的反应性。发色试验B的结果示于图3。图3中，“×”表示使用发色色素(3)时的结果，“白色圆”表示使用发色色素(4)时的结果，“白色方块”表示使用比较发色色素时的结果。
-配方B-
醋酸缓冲液(pH5.0) 300mM
FeSO4 0.03mM
发色色素(表1中示出的各发色色素) 3.2mM
t-BuOOH调节至图2或图3中所示的各测定浓度(质量%)
由图2及图3所示的结果可知如下内容。
由图2可知，对于具有2-羟乙基作为取代基的发色色素(1)及(2)而言，在以峰波长(510nm)进行比较时，在任意一种t-BuOOH浓度下，与比较发色色素相比，反应性均高。
由图3可知，对于具有苯基作为取代基的发色色素(3)及(4)而言，即使在波长660nm下与比较发色色素相比，反应性也明显高，即使在以往难以测定的长波长侧的波长区域内，也能够测定氧化应激度。
综上所述可知，根据本发明，能够提供与以往相比能够以高灵敏度或在宽范围的波长区域内测定氧化应激度的氧化应激度测定用试剂、以及使用该氧化应激度测定用试剂的氧化应激度的测定方法。
Claims (5)
1.一种氧化应激度测定用试剂，其含有由下述通式(I)表示的化合物或其盐，
通式(I)中，R1、R2、R3及R4各自独立地表示乙基、异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基，其中，R1、R2、R3及R4中的至少1个表示异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基，或者，
R1为氢原子，R2为乙基、异丙基或苯基，R3为异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基，R4为乙基、异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基，或者，
R1为氢原子，R2为碳原子数1～4的羟基烷基，R3为碳原子数1～4的羟基烷基，R4为乙基、异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基，或者，
R1为氢原子，R2为氢原子，R3为乙基、异丙基或苯基，R4为异丙基或苯基，或者，
R1为氢原子，R2为氢原子，R3为碳原子数1～4的羟基烷基，R4为异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基，或者，
R1为氢原子，R2为氢原子，R3为氢原子，R4为异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基。
2.根据权利要求1所述的氧化应激度测定用试剂，其中，所述R1、R2、R3及R4中的至少1个为碳原子数1～4的羟基烷基。
3.根据权利要求1所述的氧化应激度测定用试剂，其中，所述R1、R2、R3及R4中的至少1个为2-羟乙基。
4.根据权利要求1所述的氧化应激度测定用试剂，其中，所述R1、R2、R3及R4中的至少1个为苯基。
5.一种氧化应激度的测定方法，其包括：使用含有由下述通式(I)表示的化合物或其盐的氧化应激度测定用试剂测定生物样品的氧化应激度，
通式(I)中，R1、R2、R3及R4各自独立地表示氢原子、乙基、异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基，其中，R1、R2、R3及R4中的至少1个表示异丙基、碳原子数1～4的羟基烷基或苯基。
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