JP2015177809A - 前立腺癌における再発性の遺伝子融合物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】前立腺癌におけるアンドロゲン調節遺伝子またはハウスキーピング遺伝子とETSファミリーメンバー遺伝子との再発性の遺伝子融合物が記載される。前立腺癌の診断、研究および療法で有用性を有する組成物および方法も提供される。一局面において、本発明は、患者で前立腺癌を同定するための方法を提供し、この方法は、患者からの試料を提供するステップ、および試料中でSLC45A3遺伝子の転写調節領域からの5’部分およびERG遺伝子からの3’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップを含み、試料中での遺伝子融合物の存在を検出することによって、患者で前立腺癌を同定する。
【選択図】なし
Description
この出願は、出願第11/825,552号(7/6/07出願)の一部継続であり、出願第11/825,552号は、出願第11/519,397号(9/12/06出願)の一部継続であり、出願第11/519,397号は、仮特許出願第60/716,436号(9/12/05出願)、同第60/779,041号(3/3/06出願)、同第60/730,358号(10/27/05出願)および同第60/795,590号(4/28/06出願)への優先権を主張する。上記の各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
本発明は、National Institutes of Healthによって付与されたCA069568、CA102872およびCA111275の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、それに限定されないが、癌マーカーを含む、癌の診断、研究および療法のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、前立腺癌のための診断マーカーおよび臨床標的としての再発性の遺伝子融合物に関する。
癌研究の中心の目的は、発癌の因果関係に関与する変化した遺伝子を同定することである。塩基の置換、挿入、欠失、転位ならびに染色体の増加および減少を含む、数種の体細胞性突然変異が同定されているが、そのすべては癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の活性変化をもたらす。1900年代前半に最初に仮定されていたが、今では、癌における染色体再配列の起因的役割についての動かぬ証拠がある(非特許文献1)。再発性の染色体異常は、主に白血病、リンパ腫および肉腫の特徴であると考えられた。ずっとより一般的であり、ヒト癌に関連する罹患率および死亡率の比較的大きな割合に寄与する上皮性腫瘍(癌腫)は、公知の、疾患特異的染色体再配列の1%未満を構成する(非特許文献2)。血液悪性疾患は、平衡した、疾患特異的染色体再配列をしばしば特徴とするが、ほとんどの固形腫瘍は過剰の非特異的染色体異常を有する。固形腫瘍の核型複雑性は、癌の進展または進行を通して得られる二次的変化によると思われる。
したがって、本発明は以下の項目を提供する:
(項目1)
患者で前立腺癌を同定するための方法であって、
(a)上記患者からの試料を提供するステップ、ならびに
(b)上記試料中でSLC45A3遺伝子の転写調節領域からの5’部分およびERG遺伝子からの3’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップ
を含み、上記試料中での上記遺伝子融合物の存在を検出することによって、上記患者で前立腺癌を同定する、方法。
(項目2)
上記SLC45A3遺伝子の上記転写調節領域が上記SLC45A3遺伝子のプロモーター領域を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
ステップ(b)が、上記SLC45A3遺伝子の上記転写調節領域からの5’DNA部分および上記ERG遺伝子からの3’DNA部分を有するゲノムDNAの染色体再配列を検出することを含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
ステップ(b)が、上記SLC45A3遺伝子の上記転写調節領域から転写される5’RNA部分および上記ERG遺伝子から転写される3’RNA部分を有するキメラmRNA転写物を検出することを含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
上記試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物および前立腺細胞からなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目6)
患者で前立腺癌を同定するための方法であって、
(a)上記患者からの試料を提供するステップ、ならびに
(b)上記試料中でFLJ35294遺伝子の転写調節領域からの5’部分およびETSファミリーメンバー遺伝子からの3’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップ
を含み、上記試料中での上記遺伝子融合物の存在を検出することによって、上記患者で前立腺癌を同定する、方法。
(項目7)
上記FLJ35294遺伝子の上記転写調節領域が上記FLJ35294遺伝子のプロモーター領域を含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
上記ETSファミリーメンバー遺伝子がETV1である、項目6に記載の方法。
(項目9)
ステップ(b)が、上記FLJ35294遺伝子の上記転写調節領域からの5’DNA部分および上記ETSファミリーメンバー遺伝子からの3’DNA部分を有するゲノムDNAの染色体再配列を検出することを含む、項目6に記載の方法。
(項目10)
ステップ(b)が、上記FLJ35294遺伝子の上記転写調節領域から転写される5’RNA部分および上記ETSファミリーメンバー遺伝子から転写される3’RNA部分を有するキメラmRNA転写物を検出することを含む、項目6に記載の方法。
(項目11)
上記試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物および前立腺細胞からなる群から選択される、項目6に記載の方法。
(項目12)
患者で前立腺癌を同定するための方法であって、
(a)上記患者からの試料を提供するステップ、ならびに
(b)上記試料中でDDX5遺伝子からの5’部分およびETSファミリーメンバー遺伝子からの3’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップ
を含み、上記試料中での上記遺伝子融合物の存在を検出することによって、上記患者で前立腺癌を同定する、方法。
(項目13)
上記ETSファミリーメンバー遺伝子がETV4である、項目12に記載の方法。
(項目14)
ステップ(b)が、上記DDX5遺伝子からの5’DNA部分および上記ETSファミリーメンバー遺伝子からの3’DNA部分を有するゲノムDNAの染色体再配列を検出することを含む、項目12に記載の方法。
(項目15)
ステップ(b)が、上記DDX5遺伝子から転写される5’RNA部分および上記ETSファミリーメンバー遺伝子から転写される3’RNA部分を有するキメラmRNA転写物を検出することを含む、項目12に記載の方法。
(項目16)
ステップ(b)が、上記DDX5遺伝子によってコードされるアミノ末端部分および上記ETSファミリーメンバー遺伝子によってコードされるカルボキシ末端部分を有するキメラタンパク質を検出することを含む、項目12に記載の方法。
(項目17)
上記試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物および前立腺細胞からなる群から選択される、項目12に記載の方法。
(項目18)
組成物であって、以下:
(a)キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、上記キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの5’部分がSLC45A3遺伝子の転写調節領域に由来し、上記キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの3’部分がERG遺伝子に由来する、オリゴヌクレオチドプローブ、
(b)SLC45A3遺伝子の転写調節領域に由来するキメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの5’部分とハイブリダイズする配列を含む第一のオリゴヌクレオチドプローブ、およびERG遺伝子に由来する上記キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの3’部分とハイブリダイズする配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプローブ、
(c)SLC45A3遺伝子の転写調節領域に由来するキメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの5’部分とハイブリダイズする配列を含む第一の増幅オリゴヌクレオチド、およびERG遺伝子に由来する上記キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの3’部分とハイブリダイズする配列を含む第二の増幅オリゴヌクレオチド、
(d)キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、上記キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの5’部分がFLJ35294遺伝子の転写調節領域に由来し、上記キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの3’部分がETV1遺伝子に由来する、オリゴヌクレオチドプローブ、
(e)FLJ35294遺伝子の転写調節領域に由来するキメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの5’部分とハイブリダイズする配列を含む第一のオリゴヌクレオチドプローブ、およびETV1遺伝子に由来する上記キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの3’部分とハイブリダイズする配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプローブ、
(f)FLJ35294遺伝子の転写調節領域に由来するキメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの5’部分とハイブリダイズする配列を含む第一の増幅オリゴヌクレオチド、およびETV1遺伝子に由来する上記キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの3’部分とハイブリダイズする配列を含む第二の増幅オリゴヌクレオチド、
(g)キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、上記キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの5’部分がDDX5遺伝子に由来し、上記キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの3’部分がETV4遺伝子に由来する、オリゴヌクレオチドプローブ、
(h)DDX5遺伝子に由来するキメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの5’部分とハイブリダイズする配列を含む第一のオリゴヌクレオチドプローブ、およびETV4遺伝子に由来する上記キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの3’部分とハイブリダイズする配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプローブ、
(i)DDX5遺伝子に由来するキメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの5’部分とハイブリダイズする配列を含む第一の増幅オリゴヌクレオチド、およびETV4遺伝子に由来する上記キメラゲノムDNAまたはキメラmRNAの3’部分とハイブリダイズする配列を含む第二の増幅オリゴヌクレオチド、
(j)上記DDX5遺伝子によってコードされるアミノ末端部分および上記ETV4遺伝子によってコードされるカルボキシ末端部分を有するキメラタンパク質に対する抗体
のうちの少なくとも1つを含む、組成物。
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語および句を下で定義する。
本発明は、前立腺癌での再発性遺伝子融合物の発見に基づく。本発明は、遺伝子融合物を直接的または間接的に検出するかまたは標的にする、診断、研究および治療の方法を提供する。本発明は、診断、研究および治療の目的のための組成物も提供する。
本発明は、前立腺癌を示す再発性の遺伝子融合物を同定する。遺伝子融合物は、アンドロゲン調節遺伝子(ARG)またはハウスキーピング遺伝子(HG)およびETSファミリーメンバー遺伝子の染色体再配列の結果である。それらの再発にもかかわらず、ARGまたはHGがETSファミリーメンバー遺伝子に融合する接合部は変動する。遺伝子融合物は、ARGまたはHGの転写調節領域からの5’部分、およびETSファミリーメンバー遺伝子からの3’部分を一般的に含む。再発性遺伝子融合物は、前立腺癌のための診断マーカーおよび臨床標的としての用途を有する。
男性ホルモンによって調節される遺伝子は、ヒト前立腺の正常な生理機能のためにきわめて重要である。それらは、前立腺癌の発達および進行にも寄与する。確認されているARGには、それらに限定されないが以下のものが含まれる。TMPRSS2;SLC45A3;HERV−K_22q11.23;C15ORF21;FLJ35294;CANT1;PSA;PSMA;KLK2;SNRK;Seladin−1;およびFKBP51(Paoloni−Giacobinoら、Genomics 44巻:309頁(1997年);Velascoら、Endocrinology 145巻(8号):3913頁(2004年))。
ハウスキーピング遺伝子は構成的に発現され、すべての組織で一般に遍在的に発現される。これらの遺伝子は、すべての細胞が生存するために必要な、基本的な、必須機能を提供するタンパク質をコードする。ハウスキーピング遺伝子は、すべての細胞および組織で同じレベルで通常発現されるが、特に細胞増殖および生物体の発達の間、多少の変動がある。ヒト細胞がどれくらい多くのハウスキーピング遺伝子を有するかは正確には分かっていないが、ほとんどの推定値は300〜500の範囲にある。
ETSファミリーの転写因子は、遺伝子発現を制御する細胞内シグナル伝達経路を調節する。下流エフェクターとして、それらは特定の標的遺伝子を活性化または抑制する。上流エフェクターとして、それらは多数の増殖因子受容体の空間的および時間的な発現を担う。このファミリーのほぼ30メンバーが同定され、広範囲の生理的および病理学的過程と関連付けられている。それらに限定されないが、これらには以下のものが含まれる。ERG;ETV1(ER81);FLI1;ETS1;ETS2;ELK1;ETV6(TEL1);ETV7(TEL2);GABPα;ELF1;ETV4(E1AF;PEA3);ETV5(ERM);ERF;PEA3/E1AF;PU.1;ESE1/ESX;SAP1(ELK4);ETV3(METS);EWS/FLI1;ESE1;ESE2(ELF5);ESE3;PDEF;NET(ELK3;SAP2);NERF(ELF2);およびFEV。例示的なETSファミリーメンバー配列を、図9に示す。
TMPRSS2:ETS遺伝子融合物の最初の同定を含み、前立腺癌で5つのクラスのETS再配列が同定されている(図43)。本発明は、特定の機構に限定されない。実際、機構の理解は、本発明を実施するために必要でない。それにもかかわらず、ARGまたはHGとの融合、または癌で増加した発現を有する遺伝子座への挿入を経たETSファミリーメンバーの上方制御された発現は、前立腺癌の機構を提供することが想定される。特定の個体に存在する再配列のクラスについての知識は、カスタマイズされた癌療法を可能にする。
TMPRSS2:ETS遺伝子融合物(クラスI)は、前立腺癌でのETS再配列の優勢なクラスを表す。他の前立腺特異的アンドロゲン誘導遺伝子(クラスIIa)および内因性レトロウイルスエレメント(クラスIIb)からの非翻訳領域との融合を含む再配列、例えばそれぞれSLC45A3およびHERV−K_22q11.23は、ETS再配列でのTMRPSS2と同様に機能する。クラスIおよびII再配列での5’パートナーに類似して、C15ORF21は前立腺癌で著しく過剰発現される。しかし、クラスIおよびII再配列での融合パートナーとは異なり、C15ORF21はアンドロゲンによって抑制され、前立腺特異的アンドロゲン抑制5’融合パートナーを含む新規クラスのETS再配列(クラスIII)を表している。対照的に、HNRPA2B1は、前立腺特異的発現またはアンドロゲン応答性を示さなかった。したがって、HNRPA2B1:ETV1は、非組織特異的プロモーターエレメントを含む融合物がETS発現を誘起する、新規クラスのETS再配列(クラスIV)を表す。クラスV再配列では、ETS遺伝子全体が前立腺特異的領域に再配列される。
上に述べたように、本発明は、ARGとETSファミリーメンバー遺伝子との融合物を提供する。例示的な遺伝子融合物配列を、図36、51および52に示す。TMPRSS2、ERG、ETV1およびETV4については、GenBank参照配列番号が提供され、エクソンは、UCSCヒトゲノムの2004年5月のアセンブリーを用いて整列されている。同定されたすべての融合物については、図36は、TMPRSS2遺伝子の開始から融合およびETSファミリーメンバー遺伝子の終止コドンまでの、完全な配列を提供する。公開されている各変異体の寄託GenBank配列も提供される。一部のTMPRSS2:ERGおよびTMPRSS2:ETV1融合物は、TMPRSS2およびETSファミリーメンバー遺伝子の中断点エクソンによって記載される。例えば、TMPRSS2のエクソン1をERGのエクソン4〜11に融合するTMPRSS2:ERGaは、TMPRSS2:ERG(1,4)として識別される。
上に述べたように、ERGを含む遺伝子融合物は、前立腺癌で最も一般的な遺伝子融合物であることが見出された。本発明の開発中に行った実験は、第21染色体q22.2〜3上のTMPRSS2とERGとの間に位置するかなりのゲノム欠失を同定した。欠失は、TMPRSS2:ERG融合物陽性PCA試料で見られた。欠失はコンセンサス領域に現れるが、この領域中で変動を示す。Parisら(Hum. Mol. Genet.13巻:1303〜13頁(2004年))による既刊の研究では、CGH分析は、TMPRSS2から6kb動原体寄りであるCTD−2103O7 BACに欠失を検出した。これらの欠失は、臨床的に限局性のPCA試料の12.5%(9/72)で、および転移性PCA試料の33%(5/15)で観察された。これらの結果は、本研究からのSNP配列データを裏付け、PCA欠失が進行に伴いより一般的になるか、またはより速やかに進行する傾向があるPCAで欠失がより頻繁に特定されることを示す。TMPRSS2:ERG再配列の特筆すべき腫瘍内均一性を考慮すると、これらの分子サブタイプが異なる疾患進行特性に関連する可能性がより高い。
本発明の一部の実施形態の開発中に行ったさらなる研究は、ETV1の異常発現の頻度とTMPRSS2:ETV1陽性前立腺癌との間の不一致を調査した。結果は、TMPRSS2:ERG遺伝子融合物を、前立腺癌でERG過剰発現を誘起する優勢な機構として同定した前の試験を確認した。しかし、ETV1を過剰発現する3つの前立腺癌では、新規の5’融合パートナーが同定された。本発明は、特定の機構に限定されない。実際、機構の理解は、本発明を実施するために必要でない。それにもかかわらず、ERGおよびETV1を含む融合物の5’パートナーでのこの矛盾の理由は不明であるが、TMPRSS2およびERGは第21染色体上に約〜3MB離れて位置しているので、それらの近接性がERGの5’パートナーとしてTMPRSS2を有利にしている可能性がある。
Oncomineデータベースからの前立腺癌プロファイリング試験で監視したすべてのETSファミリーメンバーの発現を調べるために、実験を行った(Rhodesら、上記)。ETSファミリーメンバーETV4の顕著な過剰発現が、2つの研究の各々からの単一の前立腺癌症例で特定された−1つは、肉眼的に切開した組織をプロファイリングし(Lapointeら、上記)(図7A)、他は、レーザー捕捉マイクロ切開(LCM)組織1をプロファイリングした(図7B)。ETV4は、癌組織でTMPRSS2に融合されることが見出された。
さらなる実験は、TMPRSS2:ETV5およびSLC45A3:ETV5遺伝子融合物を同定した(実施例20)。ETV5は、前立腺癌試料で異常発現を有することが見出され、その後遺伝子融合物に存在することが見出された。
さらなる実験は、前立腺癌でHNRPA2B1:ETV1遺伝子融合物を同定した。HNRPA2B1は、前立腺特異的発現およびアンドロゲン調節を示さず、その代わりにすべての腫瘍型にわたって強く発現される。HNRPA2B1は遍在的に発現される異核リボ核タンパク質のメンバーをコードし、そのプロモーターは、他のハウスキーピング遺伝子と構造類似性を共有する(Antoniouら、Genomics 82巻、269〜79頁(2003年))。さらに、HNRPA2B1プロモーターはメチル化されていないことが示されており、導入遺伝子のCMVプロモーターの転写サイレンシングを阻止する(Williamsら、BMC Biotechnol 5巻、17頁(2005年))。したがって、HNRPA2B1:ETV1は、非組織特異的プロモーターエレメントが癌遺伝子の発現を誘起する、一般的な上皮癌の新規クラスの遺伝子融合物を表す。TMPRSS2:ETS融合物はB細胞悪性疾患でのIGH−MYC再配列に機能的に類似しているが、HNRPA2B1:ETV1は、構成的に発現されるRPN1遺伝子のエンハンサーエレメントの支配下へのEVIの配置をもたらすと考えられている、急性骨髄性白血病でのinv(3)(q21q26)およびt(3;3)(q21;q26)により類似している(Suzukawaら、Blood 84巻、2681〜8頁(1994年)、Wieserら、Leuk Lymphoma 43巻、59〜65頁(2002年))。
その断片、誘導体および類似体を含む本発明の遺伝子融合タンパク質は、下記の診断、研究および治療の方法で用いることができる抗体を生成するための免疫原として用いることができる。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、キメラ、ヒト化、単鎖またはFab断片であることができる。そのような抗体および断片の生成および標識化のために、当分野の技術者に公知である様々な手順を用いることができる。例えば、Burns編、Immunochemical Protocols、第3版、Humana Press(2005年)、HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988年)、Kozborら、Immunology Today 4巻:72頁(1983年)、KohlerおよびMilstein、Nature 256巻:495頁(1975年)を参照。トランケーションされたETSファミリーメンバータンパク質またはキメラタンパク質とそれらのそれぞれの本来のタンパク質との間の差を活用する抗体または断片が、特に好ましい。
ARGまたはHGとETSファミリーメンバー遺伝子との融合物は、DNA、RNAまたはタンパク質として検出可能である。当初、遺伝子融合物は、ARGまたはHGの転写調節領域からの5’部分、およびETSファミリーメンバー遺伝子からの3’部分を有するゲノムDNAの染色体再配列として検出可能である。転写されると、遺伝子融合物は、ARGまたはHGの転写調節領域からの5’部分、およびETSファミリーメンバー遺伝子からの3’部分を有するキメラmRNAとして検出可能である。翻訳されると、遺伝子融合物は、ARGまたはHGの転写調節領域とETSファミリーメンバー遺伝子との融合物から生じる、アミノ末端がトランケーションされたETSファミリーメンバータンパク質として;ARGまたはHGの転写調節領域からのアミノ末端部分およびETSファミリーメンバー遺伝子からのカルボキシ末端部分を有するキメラタンパク質として;または、上方制御されているが、さもなければ区別できない本来のETSファミリーメンバータンパク質として検出可能である。トランケーションされたETSファミリーメンバータンパク質およびキメラタンパク質は、アミノ酸配列、翻訳後プロセシングおよび/または二次、三次もしくは四次構造において、それらのそれぞれの本来のタンパク質と異なることができる。存在する場合、そのような差を用いて遺伝子融合物の存在を特定することができる。具体的な検出方法を、下でさらに詳細に記載する。
遺伝子融合物を含むことが疑われるいかなる患者試料も、本発明の方法によって検査することができる。非限定例として、試料は、組織(例えば、前立腺生検試料もしくは前立腺切除によって得た組織試料)、血液、尿、精液、前立腺分泌物またはそれらの分画(例えば、血漿、血清、尿上清、尿細胞ペレットもしくは前立腺細胞)であることができる。好ましくは、尿試料は、前立腺からの前立腺細胞を尿路に排出させる、注意深い直腸指診(DRE)の直後に収集される。
本発明の遺伝子融合物は、それらに限定されないが、核酸配列決定、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅を含む、当分野の技術者に公知である様々な核酸技術を用いて、ゲノムDNAまたはキメラmRNAの染色体再配列として検出することができる。
核酸配列決定技術の例示的な非限定例には、連鎖停止剤(Sanger)配列決定および染色停止剤配列決定が含まれるが、これらに限定されない。RNAは細胞中でより不安定であり、ヌクレアーゼ攻撃により感受性であるので、当分野の技術者は、実験的RNAが配列決定の前にDNAに通常逆転写されることを認識する。
核酸ハイブリダイゼーション技術の例示的な非限定例には、in situハイブリダイゼーション(ISH)、マイクロアレイおよびサザンブロットまたはノーザンブロットが含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、融合物配列は、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を用いて検出される。本発明のための好ましいFISHアッセイは、細菌人工染色体(BAC)を利用する。これらは、ヒトゲノム配列決定プロジェクト(Nature 409巻:953〜958頁(2001年)を参照)で広範に用いられ、特異的BACを含むクローンは、多くの提供元、例えばNCBIを通して捜すことができる販売業者を通して入手可能である。ヒトゲノムからの各BACクローンは、それを明白に特定する参照名称が与えられている。これらの名称は、対応するGenBank配列を捜し出し、販売業者からクローンのコピーを注文するために用いることができる。
・ETV1−TMPRSS2融合物について試験するために、ETV1にわたる1つのプローブ、およびTMPRSS2遺伝子座にわたる1つを用いることができる:
ETV1のためのBAC:RP11−692L4
TMPRSS2のためのBAC:RP11−121A5、(RP11−120C17、PR11−814F13、RR11−535H11)
・c−ERG:t−ERG分断のためのプローブのセットによるERG転位の試験:
c−ERGのためのBAC:RP11−24A11
t−ERGのためのBAC:RP11−372O17、RP11−137J13
・プローブのセット、ETV1遺伝子座にわたる1つのプローブ、および第7染色体上の1つの参照プローブによるETV1欠失/増幅の試験:
ETV1のためのBAC:RP11−692L4
・プローブのセット、ERG遺伝子座にわたる1つのプローブ、および第21染色体上の1つの参照プローブによるERG欠失/増幅の試験:
ERGのためのBAC:RP11−476D17
第21染色体上の参照プローブのためのBAC:*
・プローブのセット、TMPRSS2遺伝子座にわたる1つのプローブ、および第21染色体上の1つの参照プローブによるTMPRSS2欠失/増幅の試験:
TMPRSS2のためのBAC:RP11−121A5、(RP11−120C17、PR11−814F13、RR11−535H11)
第21染色体上の参照プローブのためのBAC:PR11−32L6、RP11−752M23、RP11−1107H21、RP11−639A7、(RP11−1077M21)。
本発明の方法で有用なさらなるFISHプローブを、表16(図46)に示す。
それらに限定されないが、DNAマイクロアレイ(例えば、cDNAマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ)、タンパク質マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、トランスフェクションまたは細胞マイクロアレイ、化合物マイクロアレイ、ならびに抗体マイクロアレイを含む、異なる種類のバイオアッセイがマイクロアレイと呼ばれる。遺伝子チップ、DNAチップまたはバイオチップとして一般に公知のDNAマイクロアレイは、数千の遺伝子の同時の発現プロファイリングまたは発現レベルの監視のための、アレイを形成する、固体表面(例えば、ガラス、プラスチックまたはシリコンチップ)に結合する顕微鏡的DNAスポットの集合である。付着したDNA断片はプローブとして公知であり、それの数千を単一のDNAマイクロアレイで用いることができる。マイクロアレイは、病気の細胞および正常な細胞で遺伝子発現を比較することによって疾患遺伝子を同定するために用いることができる。マイクロアレイは、それらに限定されないが、ガラススライド上への先の鋭いピンによるプリント、予め作られたマスクを用いる写真平版、ダイナミックマイクロミラー装置を用いる写真平版、インクジェット式プリント、または微小電極アレイ上の電気化学法を含む、様々な技術を用いて作製することができる。
ゲノムDNAおよびキメラmRNAの染色体再配列は、検出の前かまたは同時に増幅することができる。核酸増幅技術の例示的な非限定例には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、転写媒介増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)および核酸配列ベースの増幅(NASBA)が含まれるが、これらに限定されない。当分野の技術者は、特定の増幅技術(例えば、PCR)は、RNAが増幅の前にDNAに逆転写されることを必要とする(例えば、RT−PCR)が、他の増幅技術はRNAを直接に増幅する(例えば、TMAおよびNASBA)ことを認識する。
増幅されていないかまたは増幅された遺伝子融合核酸は、従来の任意の手段によって検出することができる。例えば、遺伝子融合物は、検出可能に標識されたプローブとのハイブリダイゼーションおよび生じたハイブリッドの測定によって検出することができる。検出方法の例示的な非限定例を、下に記載する。
本発明の遺伝子融合物は、それらに限定されないが、タンパク質配列決定およびイムノアッセイを含む、当分野の技術者に公知である様々なタンパク質技術を用いて、トランケーションされたETSファミリーメンバータンパク質またはキメラタンパク質として検出することができる。
タンパク質配列決定技術の例示的な非限定例には、質量分析およびエドマン分解が含まれるが、これらに限定されない。
イムノアッセイの例示的な非限定例には、それらに限定されないが、以下のものが含まれる。免疫沈降、ウェスタンブロット、ELISA、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリーおよびイムノPCR。当分野の技術者に公知である様々な技術(例えば、比色、蛍光、化学発光または放射)を用いて検出可能に標識されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が、イムノアッセイで使用するために適する。
一部の実施形態では、検出アッセイによって生成される生データ(例えば、所与の遺伝子融合物または他のマーカーの存在、非存在または量)を、臨床医にとって予測的価値のあるデータに翻訳するために、コンピュータベースの分析プログラムが用いられる。臨床医は、任意の適する手段を用いて予測的データにアクセスすることができる。したがって、一部の好ましい実施形態では、本発明は、遺伝学および分子生物学の訓練をおそらく受けていない臨床医が生データを理解する必要がないという、さらなる利点を提供する。データは、その最も有用な形で臨床医に直接に示される。そこで臨床医は、被験体のケアを最適化するためにその情報を直ちに利用することができる。
本発明の遺伝子融合物は、それらに限定されないが、以下を含むin vivo画像化技術を用いて検出することもできる。放射性核種画像化、陽電子放射断層撮影(PET)、コンピュータ体軸断層撮影、X線または磁気共鳴画像化法、蛍光検出および化学発光検出。一部の実施形態では、in vivo画像化技術が、動物(例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物)で癌マーカーの存在または発現を可視化するために用いられる。例えば、一部の実施形態では、癌マーカーmRNAまたはタンパク質は、癌マーカーに特異的な標識抗体を用いて標識される。特異的に結合している、標識された抗体は、それらに限定されないが、放射性核種画像化、陽電子放射断層撮影、コンピュータ体軸断層撮影、X線または磁気共鳴画像方法、蛍光検出および化学発光検出を含む、in vivo画像化方法を用いて個体で検出することができる。本発明の癌マーカーに対する抗体を生成する方法を、下に記載する。
本発明の診断方法に用いられる組成物は、プローブ、増幅オリゴヌクレオチドおよび抗体を含むが、これらに限定されない。特に好ましい組成物は、ARGまたはHGがETSファミリーメンバー遺伝子と融合する場合だけ、生成物を検出する。これらの組成物は、以下を含む。ARGまたはHGの転写調節領域からの5’部分がETSファミリーメンバー遺伝子からの3’部分と融合する接合部とハイブリダイズする(すなわち、遺伝子融合物接合部にわたる)配列を含む単一の標識プローブ、第一の増幅オリゴヌクレオチドがARGまたはHGの転写調節領域とハイブリダイズする配列を含み、第二の増幅オリゴヌクレオチドがETSファミリーメンバー遺伝子とハイブリダイズする配列を含む、増幅オリゴヌクレオチドの対、ARGまたはHGの転写調節領域とETSファミリーメンバー遺伝子との融合物から生じる、アミノ末端がトランケーションされたETSファミリーメンバータンパク質に対する抗体、あるいは、ARGまたはHGの転写調節領域からのアミノ末端部分およびETSファミリーメンバー遺伝子からのカルボキシ末端部分を有するキメラタンパク質に対する抗体。しかし、他の有用な組成物は以下を含む。第一の標識プローブがARGまたはHGの転写調節領域とハイブリダイズする配列を含み、第二の標識プローブがETSファミリーメンバー遺伝子とハイブリダイズする配列を含む、標識プローブの対。
本発明の開発の過程で行われた実験により、本発明の遺伝子融合物と前立腺癌を抱えた患者の予後間の密接な相関関係が実証された(例えば、下の実施例5参照)。特に、融合物がTMPRSS2とERG間に位置するゲノムDNAの欠失から生じる場合には、癌細胞はより高悪性度の表現型を呈することが見出されている。したがって、いくつかの実施形態では、介在性DNAの欠失があったTMPRSS2とERG間の遺伝子融合物を検出することができるアッセイを使用して予後を提供し医者が適切な治療戦略を決定する一助とする。例えば、いくつかの実施形態では、このような特定の再配列を有する腫瘍を抱えた患者は、その予後が再配列を欠く患者よりも有意に悪いために、より集中的に治療される。
いくつかの実施形態では、本発明は薬物スクリーニングアッセイ(例えば、抗癌薬を求めてスクリーニングすること)を提供する。本発明のスクリーニング法は、本発明の方法(例えば、本発明の遺伝子融合物を含むがこれに限定されない)を使用して同定される癌マーカーを利用する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子融合物の発現を変化させる(例えば、減少させる)化合物を求めてスクリーニングする方法を提供する。化合物または作用薬は、例えば、プロモーター領域と相互作用することにより転写を妨げ得る。化合物または作用薬は、融合物から産生されるmRNAを妨げ得る(例えば、RNA干渉、アンチセンス技術、等により)。化合物または作用薬は、融合物の生物活性の上流または下流である経路を妨げ得る。いくつかの実施形態では、候補化合物は、癌マーカーに対して向けられるアンチセンスまたは干渉RNA剤(例えば、オリゴヌクレオチド)である。他の実施形態では、候補化合物は、本発明の癌マーカー調節因子または発現産物に特異的に結合しその生物学的機能を阻害する抗体または小分子である。
いくつかの実施形態では、本発明は、癌(例えば、前立腺癌)の治療法を提供する。いくつかの実施形態では、治療法は、直接的にまたは間接的に、本発明の遺伝子融合物を標的にする。
いくつかの実施形態では、本発明は遺伝子融合物の発現を標的にする。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の癌マーカーをコードする核酸分子の機能を調節し、最終的には発現される癌マーカーの量を調節するのに使用するための、オリゴマーアンチセンスまたはRNAi化合物、特にオリゴヌクレオチド(例えば、上記の薬物スクリーニング法において同定されるオリゴヌクレオチド)を含む組成物を用いる。
いくつかの実施形態では、RNAiを利用して融合タンパク質機能を阻害する。RNAiは、ヒトを含む大半の真核生物において外来遺伝子の発現を制御するための進化的に保存された細胞防御を表す。RNAiは典型的には、二本鎖RNA(dsRNA)により誘発され、dsRNAに応答して相同な一本鎖標的RNAの配列特異的mRNA分解を引き起こす。mRNA分解の媒介物は低分子干渉RNA二重鎖(siRNA)であり、これは通常、細胞内での酵素的切断により長いdsRNAから産生される。siRNAは一般に、ほぼ21ヌクレオチド長(例えば、21〜23ヌクレオチド長)であり、2つのヌクレオチド3’−オーバーハングにより特徴付けられる塩基対構造を有する。低分子RNAまたはRNAiの細胞内への導入に続いて、その配列はRISC(RNA誘導サイレンシング複合体)と呼ばれる酵素複合体へ送達されると考えられている。RISCは標的を認識し、その標的をエンドヌクレアーゼを用いて切断する。比較的大きなRNA配列が細胞に送達される場合は、リボヌクレアーゼIII酵素(ダイサー)が比較的長いdsRNAを21〜23nt ds siRNA断片に変換する。いくつかの実施形態では、RNAiオリゴヌクレオチドは、融合タンパク質の接合部領域を標的にするように設計される。
他の実施形態では、融合タンパク質発現は、本発明の癌マーカーをコードする1つまたは複数の核酸に特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を使用して調節される。オリゴマー化合物がその標的核酸に特異的にハイブリダイズすれば、核酸の正常機能が干渉を受ける。核酸に特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこのような調節は、一般に「アンチセンス」と呼ばれている。干渉を受けるDNAの機能には、複製および転写が挙げられる。干渉を受けるRNAの機能には、例えば、RNAのタンパク質翻訳部位への転位、RNAからのタンパク質の翻訳、1つまたは複数のmRNA種を生じるRNAのスプライシング、およびRNAに関与し得るまたはRNAにより促進され得る触媒活性などのきわめて重要な機能すべてが挙げられる。標的核酸機能へのそのような干渉の全体的効果は、本発明の癌マーカーの発現の調節である。本発明の文脈では、「調節」は、遺伝子の発現の増加(刺激)または減少(阻害)のどちらかを意味する。例えば、発現が阻害されれば、腫瘍増殖を潜在的に予防し得る。
本発明は、本発明の遺伝子融合物の発現を調節するのに使用するためのどんな遺伝子操作の使用でも企図している。遺伝子操作の例には、遺伝子ノックアウト(例えば組換えを使用して染色体から融合遺伝子を取り出すこと)、誘導性プロモーターおよび同類のものを用いたまたは用いないアンチセンス構築物の発現が挙げられるが、これらに限定されない。in vitroまたはin vivoでの細胞への核酸構築物の送達は、適切などんな方法を使用しても行い得る。適切な方法は、望ましい事象(例えば、アンチセンス構築物の発現)が起きるように、核酸構築物を細胞内に導入する方法である。遺伝子治療を使用して、siRNAまたはin vivoで発現される他の干渉分子を送達してもよい(例えば、誘導性プロモーター(例えば、アンドロゲン応答プロモーター)による刺激により)。
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の遺伝子融合物を発現する前立腺腫瘍を標的にする抗体を提供する。適切などんな抗体でも(例えば、モノクローナル、ポリクローナル、または合成の)、本明細書において開示される治療法において利用し得る。好ましい実施形態では、癌治療のために使用される抗体はヒト化抗体である。抗体をヒト化するための方法は当技術分野では周知である(例えば、米国特許第6,180,370号、米国特許第5,585,089号、米国特許第6,054,297号、および米国特許第5,565,332号参照。これらの特許文献はそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている)。
本発明は、(例えば、本発明の遺伝子融合物の発現または活性を調節する医薬品を含む)医薬組成物をさらに提供する。本発明の医薬組成物は、局所的が望ましいのかまたは全身的治療が望ましいのかどうか、および治療される領域に応じていくつかの方法で投与され得る。投与は、局所的(眼部を含むおよび膣および直腸送達を含む粘膜への)、肺(例えば、ネブライザーによりを含む粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくはガス注入により;気管内、鼻腔内、上皮および経皮)、経口または非経口でよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは点滴;または頭蓋内、例えば、くも膜下腔内もしくは脳室内投与が含まれる。
本発明は、本発明の外来性癌マーカー遺伝子(例えば、遺伝子融合物)またはその変異体およびバリアント(例えば、トランケーションまたは一塩基多型)を含むトランスジェニック動物の作製を企図している。好ましい実施形態では、トランスジェニック動物は、野生型動物と比べて変化した表現型(例えば、マーカーの存在の増加または減少)を示す。そのような表現型の存在または不在を解析するための方法は、本明細書に開示される方法を含むが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、トランスジェニック動物は腫瘍の増殖または癌の証拠の増加または減少をさらに示す。
以下の実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態および局面を実証し、さらに概説するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。
ERGとETV1との遺伝子融合物
A.材料および方法
癌のアウトライアープロファイル分析(COPA)
COPA分析を10,486のマイクロアレイ実験を含むOncomine 3.0の132の遺伝子発現データセット上で行った。さらに、99個の増幅された、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで採取された前立腺組織試料からのデータをCOPA分析に含めた。COPAは3つのステップを有する。第1に、遺伝子発現値はメジアンを中心にし、各遺伝子のメジアン発現をゼロに設定する。第2に、メジアン絶対偏差(MAD)を計算し、各遺伝子発現値をそのMADで割ることで1に縮尺調整する。メジアンおよびMADを、平均および標準偏差とは対照的に、例外発現値が分布推定値に対して過度に影響を与えず、したがって標準化後もこれらが保たれるように、変換に用いた。第3に、変換された発現値の75、90、および95パーセンタイルを各遺伝子について一覧にまとめて、遺伝子をこれらのパーセンタイル値スコアでランク付けし、アウトライアープロファイルについて優先順位付けされた一覧を得る。
使用した組織は、共にミシガン大学の前立腺癌専門優良研究プログラム(Specialized Program of Research Excellence:S.P.O.R.E.)組織コアの一部である、ミシガン大学の根治的前立腺切除系列由来および迅速剖検プログラム由来(Shahら、Cancer Res 64巻、9209頁(2004年12月15日))のものである。
定量的PCR(QPCR)を、本質的には(Chinnaiyanら、Cancer Res 65巻、3328頁(2005年);Rubinら、Cancer Res 64巻、3814頁(2004年))に記載されているように、SYBRグリーン色素を用いて、Applied Biosystemsの7300リアルタイムPCRシステム上で行った。要約すると、1〜5μgの総RNAを、ランダムプライマーまたはランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーの存在下で、スーパースクリプト(Sper Script)III(Invitrogen)を用いて、cDNAに逆転写した。すべての反応は、SYBRグリーンマスターミックス(Applied Biosystems)および25ngのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの両者を製造業者の推奨する熱サイクル条件を用いて実施した。すべての反応を融解曲線分析に供し、選択した実験から得た生産物を1.5%アガロースゲル上で電気泳動させることで分離した。各実験について、閾値を、配列検出ソフト、バージョン1.2.2(Applied Biosystems)を用いて、QPCR反応の指数期において設定した。各試料について、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)と比較した各標的遺伝子の量を、cDNA試料を図説の各実験について検量用試料として用いて、比較閾値サイクル(Ct)法(Applied Biosystemsユーザーマニュアル(User Bulletin)#2)により決定した。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、Integrated DNA Technologiesにより合成されたものであった。
cDNA末端のRNAリガーゼ介在性迅速増幅をジーンレーサー(GeneRacer)RLM−RACEキット(Invitrogen)を製造業者の使用説明書に従って用いて実施した。最初に、試料をERGまたはETV1の発現に基づき、QPCRにより選択した。総RNAの5μgを仔ウシ腸由来ホスファターゼで処理し、切断されたmRNAおよび非mRNAから5’ホスフェートを除去し、タバコ酸性フィロホスファターゼでキャップ構造を除去する。ジーンレーサーRNAオリゴを全長転写産物に連結し、スーパースクリプトIIIを用いて逆転写した。5’末端を得るため、第1鎖のcDNAをETV1に対してジーンレーサー5’プライマーおよびETV1エクソン4−5_r、あるいはERGに対してジーンレーサー5’プライマーおよびERGエクソン4a_rまたはERGエクソン4b rを用いて、プラチナTaqハイフィデリティ(Platinum Taq High Fidelity)(Invitrogen)で増幅した。プライマー配列を示す(表S2)。生産物を1.5%アガロースゲル上で電気泳動により分離し、バンドを切除、精製し、TOPO TAをpCR4−TOPOにクローニングした。少なくとも4つの結腸からの精製プラスミドDNAをミシガン大学DNA配列決定コアのABIモデル3730自動配列決定装置で、M13リバースおよびM13フォワード(−20)プライマーまたはT3およびT7プライマーを双方向で用いて配列決定した。RLM−RACEd cDNAは、その他のアッセイに使用しなかった。
上述のようにQPCRを用いてTMPRSS2:ERG陽性症例を同定後、同一のcDNA試料をプラチナTaqハイフィデリティおよびTPRSS2:ERGプライマーを用いてPCR増幅した。生産物を電気泳動で分離し、pCR4−TOPOにクローニングし、上述のように配列決定した。
ヒトアンドロゲン受容体で安定的にトランスフェクトしたRWPE、LNCaP、VCaP DuCaP、PC3およびPC3細胞(PC3+AR)(3)を1%エタノール対照または1nMの合成アンドロゲンR1881で24時間処理した。総RNAを単離し、ERGエクソン5−6_fおよび_rプライマーを用いて、上述したように逆転写とQPCRを行った。各試料についてERG/GAPDHの相対量をRWPE対照試料に対して較正した。
正常な末梢リンパ球由来のホルマリン固定したパラフィン包理(FFPE)組織切片と転移性前立腺癌試料MET−26およびMET−28を間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)分析に用いた。さらに、間期FISHを、13の臨床的に局在化した前立腺癌と16の転移性前立腺癌試料のFFPE切片由来のコアを含む組織マイクロアレイ上で実施した。2色、2シグナルアプローチをTMPRSS2とETV1の融合を評価するために用い、プローブはそれぞれの遺伝子座のほとんどにまたがっていた。ビオチン−14−dCTP BACクローンRP11−124L22をETV1遺伝子座に対して用い、ジゴキシン−dUTP標識したBACクローンRPP11−35CDをTMPRSS2遺伝子座に対して用いた。ERGを含む遺伝子再配列を分析するために、2つのプローブがERG遺伝子座(ビオチン−14−dCTP標識したBACクローンRP11−476D17およびジゴキシン−dUTP標識したBACクローンRP11−95I21)にまたがる、分断シグナルプローブストラテジーを利用した。すべてのBACクローンは、オークランド研究所小児科病院(CHORI)より入手したものである。組織分析の前に、すべてのプローブの完全性と純度を正常な末梢リンパ球の中期スプレッドのハイブリダイゼーションにより確認した。組織ハイブリダイゼーション、洗浄および色検出を(Rubinら、Cancer Res 64巻、3814頁(2004年);Garrawayら、Nature 436巻、117頁(2005年))に記載のように実施した。
癌のアウトライアープロファイル分析
近年、DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイリングは、癌トランスクリプトームを研究するための通常的な方法となってきている。マイクロアレイ研究は、癌の分子多様性に対する膨大な知見を与えており、多くの場合、腫瘍組織学、患者予後、および治療応答に対応する疾患の新規分子サブタイプを同定してきた(Valkら、N Engl J Med 350巻、1617頁(2004年))。しかしながら、一般に、癌トランスクリプトーム分析は、新規の癌の原因となる遺伝子の発見には至らなかった。癌遺伝子の顕著な過剰発現を生じる再配列および高レベルの複製数変化は、癌トランスクリプトームデータで顕著だが、必ずしも従来の分析アプローチで顕著であるわけではなかったと仮定された。
次に、新規COPA予測を調べた。いくつかの独立したデータセットにおいて、COPAは、ユーイング肉腫および骨髄性白血病における発癌転位に関与していることが公知である2つのETSファミリー転写因子、ERGとETV1、について前立腺癌における強いアウトライアープロファイルを同定した(Lapointeら、Proc Natl Acad Sci USA 101巻、811頁(2004年);Tianら、N Engl J Med 349巻、2483頁(2003年))。Dhanasekaranら(Keatsら、Blood 105巻、4060頁(2005年))、Welshら(Dhanasekaranら、Faseb J 19巻、243頁(2005年))、およびLapointeら(Wangら、Lancet 365巻、671頁(2005年))の前立腺癌遺伝子発現データセットにおいては、ERGは、75パーセンタイルで最高スコアのアウトライアープロファイルを示し(表1)、Lapointeら、およびTomlinsら(Welshら、Cancer Res 61巻、5974頁(2001年))データセットでは、ETV1が90パーセンタイルで最高スコアのアウトライアープロファイルを示した(表1)。総合すると、COPAは、7つの独立した前立腺癌プロファイリング研究において、ERGまたはETV1を例外遺伝子の上位10番以内に9回ランク付けした。ERGとETV1の両者は、ユーイング肉腫における発癌転位に関与している。EWS遺伝子の5’活性化領域のERG(t(21;22)(q22;q12))またはETV1(t(7;22)(p21;q12))などのETSファミリーメンバーの高保存3’DNA結合領域への融合は、ユーイング肉腫の特徴である(Lapointら、上述;Zhanら、Blood 99巻、1745頁(2002年);Fonsecaら、Cancer Res 64巻、1546頁(2004年))。ETSファミリーメンバーの関与する転位は発癌形質転換において機能的に重複するので、転移の1種のみがユーイング肉腫の各症例において通常観察される。
次に、個々の前立腺癌試料におけるERGとETV1過剰発現のメカニズムを決定した。ERGまたはETV1を過剰発現した前立腺癌細胞株および臨床標本を定量的PCR(QPCR)を行って同定した(図2A)。LNCaP前立腺癌細胞株およびホルモン抵抗性転移性前立腺癌で死亡した患者から入手した2つの標本(前立腺における残存原発癌腫であるMET−26RP、およびリンパ節転移であるMET−26LN)は、QPCRにより、ETV1を顕著に過剰発現した(図2A)。異なる解剖学的位置由来の5つの独立した転移性病巣、ならびにこの患者の前立腺における残存癌腫もDNAマイクロアレイ分析でETV1を過剰発現し(上記既出のWelshらの文献を参照)、ETV1活性化が広範な転移の前に原発性腫瘍で起こったことを示唆している。リンパ節転移はホルモン抵抗性転移性前立腺癌(MET−28LN)で死亡した第2の患者、およびERGを過剰発現したVCaPおよびDuCaPの2つの前立腺癌細胞株からも同定された(図2A)。これらの細胞株は、椎骨転移(VCaP)、およびホルモン抵抗性前立腺癌を有する第3の患者由来の硬膜転移(DuCaP)から独立に単離された(Golubら、Science 286巻、531頁(1999年);Rosenwaldら、Cancer Cell 3巻、185頁(2003年))。繰り返すと、これらの2つの細胞株におけるERGの通常の過剰発現は、ERG活性化が広範な転移の前に起こったことを示唆する。総合すると、これらの結果は、特定の遺伝事象が、前立腺腫瘍形成中に個々の試料においてERGまたはETV1を活性化している可能性があることを示唆している。
これらの結果に基づき、QPCRプライマー対は、TMPRSS2においてはフォワードプライマーで、ERGとETV1のエクソン4においてはリバースプライマーで設計された。SYBRグリーンQPCRを、両プライマー対を臨床的に局在化した前立腺癌および転移性前立腺癌の42症例より得た一連の試料にわたって用いて行い、代表的な結果を記載した(図2、DおよびE)。これらの結果は、高レベルのETV1またはERGを有する試料のみがTMPRSS2を有するそれぞれの融合産物を発現することを実証している。QPCRがいくつかの陰性試料において35サイクル後に測定可能な生産物を生じたにもかかわらず、融解曲線分析は陽性および陰性試料中に異なる生産物を明らかにし、40サイクルのQPCR分析後の生産物のゲル電気泳動は陰性融合試料のプライマーダイマーのみを明らかにした(図2、DおよびE)。プライマーダイマーの形成は、高いGC含有量(80.3%)に起因するTMPRSS2のエクソン1の全体でプライマーを設計する困難さで部分的に説明できる。しかしながら、TMPRSS2:ERGa、TMPRSS2:ETV1a、およびTMPRSS2:ETV1b融合物の特異的発現をタックマン(Taqman)QPCRでそれぞれの融合物に及ぶフォワードプライマーを用いて確認し、各症例において、生産物はSYBRグリーンQPCRと同じ症例においてのみ検出された(Sotiriouら、上述)。SYBRグリーンQPCRとアンプリコンに対して用いたプライマーの特異性をさらに確認するため、標準的な逆転写PCRをTMPRSS2:ERGaを発現した一連の試料でSYBRグリーンQPCRと同じプライマーで行った。同様の大きさの生産物が得られ、クローニング生産物の配列決定はTMPRSS2:ERGaの存在を確認した。高レベルのETV1またはERGをそれぞれ発現したが、QPCRによる転位の証拠を示さなかったPCA16およびPCA17の2症例を同定した(図2、DおよびE)。PCA16においてETV1プライマーで生産された生産物の配列決定が融合転写産物の証拠を示さず、PCA17においてはERGプライマーで生産物は得られなかったので、RLM−RACEはこれらの結果を裏付けた。同様の結果はLNCaP細胞についても得られ、RLMRACEまたはQPCRによる融合の証拠はなく、上記のエクソンウォーキングQPCRと一致していた。
RLM−RACE生産物の配列決定、RT−PCR生産物のQPCRおよび配列決定を含む、TMPRSS2:ERGおよびTMPRSS2:ETV1融合転写産物についての3つの異なるアッセイから得られた結果を表2にまとめる。すべての試料において行ったTMPRSS2融合物に対するQPCRに加え、これらの融合物の存在を、選択した試料についていくつかの手法を用いて確認した。例えば、PCA1(前立腺癌試料1)において、TMPRSS2:ERGaをRLMRACE生産物の配列決定、RT−PCR生産物のQPCRおよび配列決定により同定した。QPCR生産物のQPCR融解曲線分析およびゲル電気泳動により、PCA4は予想より大きなアンプリコンを生産した。続くRLM−RACE分析で、TMPRSS2の完全エクソン1の、ERGのエクソン2の最初との融合(TMPRSS2:ERGb)を確認した(図6)。TMPRSS2:ERGb接合部に及ぶフォワードプライマーを用いたタックマンQPCRはTMPRSS2:ERGbがPCA4のみに存在することを確認し、TMPRSS2:ERGa接合部に及ぶフォワードプライマーを用いたタックマンQPCRは、この試料中で生産物を生産しなかった(27)。TMPRSS2:ERGおよびTMPRSS2:ETV1融合物の証拠は、過剰発現したERGまたはETV1をそれぞれ発現した症例のみにQPCRまたはDNAマイクロアレイにより見られた。これらの結果は、例外分析で観察された排他的な発現と一致している。
TMPRSS2:ETV1およびTMPRSS2:ERG融合転写産物の存在確認後、染色体レベルでのこれらの再配列の証拠を、間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)をホルマリン固定したパラフィン包理(FFPE)標本を用いて得た。2つの異なるプローブストラテジーを用いた:TMPRSS2:ETV1転位を検出するのに2色、融合−シグナルアプローチ、およびERG遺伝子座の再配列を検出するのに2色、分断シグナルアプローチを用いた。これらのプローブストラテジーは、RLM−RACE、MET26およびMET28に当初使用した2症例で検証した(図3)。TMPRSS2とETV1に対するプローブを用いて、正常な末梢リンパ球(NPL)は1対の赤と1対の緑のシグナルを示した(図3A)。MET26は、プローブの重複の指標である一対のシグナルの融合を示し(図3B、黄色矢印)、この試料中におけるTMPRSS2:ETV1転写産物の発現と一致していた。さらに、ETV1に対する残りの2つのシグナルにより示されるように(図3B、赤矢印)、ETV1遺伝子座の一貫した低レベル増幅を確認した。同様に、ERG遺伝子座の5’および3’領域に及ぶプローブを用いて、NPLにおける一対の黄色のシグナルを観察した(図3C)。MET28においては、一対のプローブは緑と赤の別々のシグナルに分かれ、ERG遺伝子座での再配列を示している(図3D、緑および赤の矢印)。この結果は、この症例におけるTMPRSS2:ERG転写産物の発現と一致している。これらの結果に基づき、上述の個々のFISH分析を、局在化した前立腺癌の13症例および転移性前立腺癌の16症例(図3E)由来のコアを含む連続組織マイクロアレイで行った。マトリックスで示すように、29症例中の23症例(79.3%)が、TMPRSS2:ETV1融合物(7症例)またはERG再配列(16症例)の証拠を示した。さらに、29症例中の12症例(41.4%)でETV1遺伝子座での低レベル増幅の証拠を示した。従来の報告では、ETV1、7pのゲノム位置を、局在化したおよび転移性前立腺癌において最もよく増幅された領域の1つとして同定した(Slamonら、Science 235巻、177頁(1987年))。しかしながら、ETV1増幅がERG再配列を有する6症例で起こり、本発明者らの転写産物データが、高いERG発現およびTMPRSS2:ERG融合物を有する試料のうち高いETV1発現も有するものは19試料のうち0試料であることを実証しているので、7p増幅はETV1発現を誘発していないようである。さらに、ETV1増幅およびTMPRSS2:ETV1融合物の両者がFISHにより存在した場合、融合シグナルではなく、個々のETV1シグナルのみが増幅された。それにもかかわらず、このFISH分析結果は、上述の転写産物データと一致したゲノムレベルでのTMPRSS2:ETV1およびERG再配列の存在を実証している。
表2は、前立腺癌試料および細胞株におけるETSファミリーメンバー状態に対するTMPRSS2融合物の概要を示す。すべてのアッセイについて、陽性結果を「+」で示し、陰性結果を「−」で示している。空欄になっている細胞は、所定のアッセイがその試料について行われなかったことを示す。定量的PCR(QPCR)によるERGまたはETV1の過剰発現が示されており、アステリスクで記された試料は、その試料がcDNAマイクロアレイでも評価され、過剰発現が確認されたことを示す。TMPRSS2:ERGまたはTMPRSS2:ETV1遺伝子融合物を検出するために、選択された試料について過剰発現したETSファミリーメンバーについてのRLM−RACEを行い、配列決定後にTMPRSS2融合物を有する試料を示す。すべての試料について、QPCRによるTMPRSS2:ETV1およびTMPRSS2:ERG発現を分析した。選択された症例はまた、QPCRで用いたものと同じTMPRSS2融合物プライマーを用いて標準的な逆転写PCR(RT−PCR)により増幅し、アンプリコンを配列決定した。TMPRSS2:ETV1またはTMPRSS2:ERG融合物の証拠を示す試料を最終列に示す。
表3.癌のアウトライアープロファイル分析(COPA)。Oncomineでの検討で上位10位に入るアウトライアープロファイルを有する癌における原因となる突然変異が起こることが公知である遺伝子を示す。「X」は、後天性病原ゲノム転位に関する文献証拠を示す。「XX」は、転位について特徴付けられた具体的な研究における試料と、具体的な転位についての文献証拠を示す。「Y」は、公知の増幅との一致を示す。「**」は、前立腺癌におけるERGとETV1のアウトライアープロファイルを示す。
表4.本研究で用いたオリゴヌクレオチドプライマー。すべてのプライマーについて、遺伝子、塩基およびエクソン(UCSCゲノムブラウザーを用いた、2004年5月のヒトゲノムのアセンブリーと本明細書中に記載された参照配列のアラインメントに従う)を列挙する。フォワードプライマーを「f」、およびリバースプライマーを「r」で示す。
(実施例2)
ETV4遺伝子融合
A.材料および方法
プロファイリング研究におけるETSファミリーの発現
前立腺癌におけるETSファミリーメンバーの発現を調べるために、Oncomineデータベース(Rhodesら、Neoplasia 2004年;6巻:1〜6頁)にある、2つの前立腺癌プロファイリング研究を利用した(Lapointeら、Proc Natl Acad Sci USA 2004年;101巻:811〜6頁およびTomlinsら、Science 2005年;310巻:644〜8頁)。ETS領域を有する遺伝子をInterproフィルター「Ets」(Interpro ID:IPR000418)により同定した。ヒートマップ表示を「遺伝子毎にメジアンを中心」のオプションを用いてOncomine中に作製し、その色の対比を、ERGとETV1の発現差異を強調するように設定した。
前立腺癌組織(PCA1−5)は、ミシガン大学前立腺癌専門優良研究プログラム(S.P.O.R.E.)組織コアの一部である、ミシガン大学の根治的前立腺切除術系列から得た。すべての試料は、患者のインフォームドコンセントおよび事前の研究所審査委員の承認を得て収集した。総RNAをトリゾール(Invitrogen、Carlsbad、CA)を製造業者の使用説明に従って用いて単離した。良性前立腺組織総RNAの市販のプール(CPP、Clontech、Mountain View、CA)も用いた。
QPCRを既述のように(Tomlinsら、上述)、SYBRグリーン色素をApplied Biosystems7300リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems、Foster City、CA)上で用いて実施した。各試料についてのハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)に対する各標的遺伝子の量を報告した。これらの標的遺伝子の相対量を良性前立腺組織(CPP)のプール由来の量に対する値に対して較正した。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA)により合成されたものである。GAPDHプライマーについては、文献(Vandesompeleら、Genome Biol 2002年;3巻:RESEARCH0034)に記載の通りであった。ETV4のエクソンに対するプライマーは以下の通りであった(5’から3’に列挙):
ETV4_エクソン2−f:CCGGATGGAGCGGAGGATGA(配列番号21)、
ETV4_エクソン2−r:CGGGCGATTTGCTGCTGAAG(配列番号22)、
ETV4_エクソン3−f:GCCGCCCCTCGACTCTGAA(配列番号23)、
ETV4_エクソン4−r:GAGCCACGTCTCCTGGAAGTGACT(配列番号24)、
ETV4_エクソン11−f:CTGGCCGGTTCTTCTGGATGC(配列番号25)、
ETV4_エクソン12−r:CGGGCCGGGGAATGGAGT(配列番号26)、
ETV4_3’UTR−f:CCTGGAGGGTACCGGTTTGTCA(配列番号27)、
ETV4_3’UTR−r:CCGCCTGCCTCTGGGAACAC(配列番号28)。エクソンを、UCSCゲノムブラウザーを用いて2004年5月凍結のヒトゲノムで、ETV4(NM_001986.1)に関するRefSeqのアラインメントにより番号付けした。TMPRSS2:ETV4融合転写産物のQPCR確認のため、TMPRSS2:ETV4aおよびTMPRSS2;ETV4b転写産物の両者を検出するTMPRSS2:ETV4a−f(AAATAAGTTTGTAAGAGGAGCCTCAGCATC(配列番号29))およびTMPRSS2:ETV4b−f(ATCGTAAAGAGCTTTTCTCCCCGC(配列番号30))を、ETV4_エクソン4−rと共に用いた。
RLM−RACEを、ジーンレーサーRLM−RACEキット(Invitrogen)を用いて、記載のように製造業者の使用説明書に従い(Tomlinsら、上述)実施した。ETV4の5’末端を得るために、PCA5由来の第1鎖のcDNAを、ジーンレーサー5’プライマーおよびETV4 エクソン4−rまたはETV4_エクソン7−r(GAAAGGGCTGTAGGGGCGACTGT(配列番号31))を用いて増幅した。生産物をクローニングし、記載のように配列決定した(Tomlinsら、上述)。TMPRSS2:ETV4転写産物の等価物5’末端を両プライマー対から得た。
ホルマリン固定したパラフィン包理(FFPE)組織切片を間期FISHに用いた。パラフィン除去した組織を0.2MのHClで10分間、2×SSCで10分間、80℃で処理し、プロテアーゼK(Invitrogen)で10分間消化した。この組織とBACプローブを5分間94℃で共に変性し、一晩37℃でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、洗浄を0.1%Tween−20を含む2×SSCで5分間行い、蛍光検出をフルオレセインにコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)、およびアレクサフルオア(Alexa Fluor)594にコンジュゲートしたストレプトアビジン(Invitrogen)を用いて実施した。スライドを対比染色し、DAPI含有のProLong Gold退色防止試薬(Invitrogen)においた。スライドをLeicaのDMRA蛍光顕微鏡(Leica、Deerfield、IL)を用いて観察し、サイトビジョンソフトウェアシステム(Applied Imaging、Santa Clara、CA)を用いてCCDカメラで撮像した。
最初のCOPAスクリーニングは、ERGまたはETV1とのTMPRSS2融合物の特徴付けに至った(実施例1)。これらの遺伝子融合物に対して陰性な前立腺癌は、その他のETSファミリーメンバーを含む再配列を有しているとさらに考えられる。Oncomineデータベース(Rhodesら、上述)からの前立腺癌プロファイリング研究においてモニターされたすべてのETSファミリーメンバーの発現を調べることで、ETSファミリーメンバーETV4の著しい過剰発現を、1つは全体解剖組織のプロファイリング(Lapointeら、上述)(図7A)であり、もう1つがレーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)組織のプロファイリング(図7B)である、2つの研究の各々から単一の前立腺癌の症例で同定した。これらの症例はERGまたはETV1を過剰発現せず、いずれの良性前立腺組織も過剰発現を示さなかったので、TMPRSS2との融合物がこれらの症例におけるETV4の過剰発現に関与したと考えられた。ELF3が前立腺癌の症例のうちのわずかでも過剰発現されたにもかかわらず、これらの両研究で、正常な前立腺組織試料も顕著なELF3過剰発現を示しており、良性および癌性組織の両者での発現を引き起こす遺伝子融合の可能性が低いことを示している。したがって、このETV4過剰発現の症例(PCA5として表す)をさらに分析した。
遺伝子融合物RNAの検出
本実施例では、APTIMA製剤試薬を使用した、4つの異なる定性的アッセイにおける4つの遺伝子融合配列:TMPRSS2:ETV1a、TMPRSS2:ETV1b、TMPRSS2:ERGa、およびTMPRSS2:ERGb、を含むRNA(IVT)を標的とした捕捉、増幅および定性的検出、ならびに各々を適当な標的特異的なオリゴヌクレオチド、プライマー、およびプローブを加えたHPA検出について説明する。表5は、アッセイに用いたオリゴヌクレオチドの配列を示す。
A.材料および方法
RNA標的捕捉
溶解緩衝液は、15mMのリン酸ナトリウム一塩基性一水和塩、15mMのリン酸ナトリウム二塩基性無水物、1.0mMのEDTA二ナトリウム二水和物、1.0mMのEGTA遊離酸、および110mMのラウリル硫酸リチウムpH6.7を含有した。標的捕捉試薬は、250mMのヘペス(HEPES)、310mMの水酸化リチウム、1.88Mの塩化リチウム、100mMのEDTA遊離酸(pH6.4)、および250μg/mLの1ミクロンの、共有結合したオリゴマー(dT)14を有するカルボキシレート改変磁性粒子であるSERA−MAG MG−CM(Seradyn Inc.、Indianapolis、Indiana)を含んだ。洗浄液は、10mMのヘペス、6.5mMの水酸化ナトリウム、1mMのEDTA、0.3%(v/v)エタノール、0.02%(w/v)メチルパラベン、0.01%(w/v)プロピルパラベン、150mMの塩化ナトリウム、0.1%(w/v)ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)をpH7.5で含有する。
増幅試薬は、26.7mMのrATP、5.0mMのrCTP、33.3mMのrGTPおよび5.0mMのrUTP、125mMのヘペス、8%(w/v)トレハロース二水和物、1.33mMのdATP、1.33mMのdCTP、1.33mMのdGTP、および1.33mMのdTTPを、pH7.5で含有する3.6mLの溶液の凍結乾燥させた形態である。この増幅試薬は、9.7mLの増幅試薬再構成溶液(下記参照)中で再構成した。使用前に、各15pmolのプライマーオリゴマーを加えた。増幅試薬再構成溶液は、0.4%(v/v)エタノール、0.10%(w/v)メチルパラベン、0.02%(w/v)プロピルパラベン、33mMのKCl、30.6mMのMgCl2、0.003%フェノールレッドを含んでいた。酵素試薬は、20mMのヘペス、125mMのN−アセチル−L−システイン、0.1mMのEDTA二ナトリウム二水和物、0.2%(v/v)トリトン(TRITON)7X−100洗浄液、0.2Mのトレハロース二水和物、0.90RTU/mLのモロニー(Moloney)マウス白血病ウイルス(MMLV)逆転写酵素、および0.20U/mLのT7 RNAポリメラーゼをpH7.0で含有する1.45mLの溶液の凍結乾燥された形態のものである。1単位(RTU)の活性を5.75fmolのcDNAの37℃15分間におけるMMLV逆転写酵素およびT7 RNAポリメラーゼに対する合成および遊離と定義し、1単位(U)の活性を37℃20分間での5.0fmolのRNA転写産物の産生と定義する。酵素試薬を3.6mLの酵素試薬再構成溶液(下記参照)中で再構成した。酵素試薬再構成溶液は、50mMのヘペス、1mMのEDTA、10%(v/v)トリトン7X−100、120mMの塩化カリウム、20%(v/v)無水グリセリンをpH7.0で含有する。ハイブリダイゼーション試薬は、100mMのコハク酸遊離酸、2%(w/v)ラウリル硫酸リチウム、100mMの水酸化リチウム、15mMのアルドリチオール−2、1.2Mの塩化リチウム、20mMのEDTA遊離酸、3.0%(v/v)エタノールをpH4.7で含有した。選択試薬は、600mMのホウ酸、182.5mMの水酸化ナトリウム、1%(v/v)トリトン7X−100をpH8.5で含有した。この検出試薬は、1mMの硝酸および32mMの過酸化水素を含有する検出試薬Iと1.5Mの水酸化ナトリウムを含有する検出試薬IIとを含んだ。
標的捕捉
1.反応管1本につき400μLの試料に対して示される複製レベルでIVTストック溶液をSTMに希釈することで試料を調製する。
2.連続分注器を用いて、TCOを有するTCR100μLを適切な反応管に添加する。3.マイクロピペットを用いて各試料400μLを加えて、適切に標識する。
4.反応管をシーリングカードでカバーして、ラックを緩やかに手で振とうする。ボルテックスしない。ラックを62±1℃の水浴中で30±5分間インキュベートする。
5.水浴からラックを取り出し、反応管の底を吸収性材料で拭いて乾かす。
6.シーリングカードがしっかりと固定されていることを確認する。必要に応じて、シーリングカードを新しいものと取替え、しっかりと密封する。
7.シーリングカードを取り外さずに、ラックを室温で30±5分間インキュベートする。
8.ラックを5〜10分間TCSマグネチックベース上に置く。
9.APTIMA洗浄液を分注マニフォールドを通してポンプでくみあげて、分注装置のポンプラインを準備する。ライン中の気泡がなくすべての10個のノズルが安定な流れの液体を送液するように、ポンプで十分に液体をシステム内に通す。
10.真空ポンプを始動し、吸引マニフォールドとトラップ瓶の間の第一のコネクターで吸引マニフォールドの接続を切る。真空計の読みが、25in.Hgを超えないようにする。真空計の読みには15秒かかる可能性がある。マニフォールドを再び接続して、および真空計の読みが7〜12in.Hgの範囲になるようにする。すべての標的捕捉ステップが完了するまで真空ポンプを運転させておく。
11.吸引マニフォールドを第1セットの先端部にしっかりと取り付ける。先端部が軽く反応管の底に接触するまで、先端部を第1のTTUに下げて、すべての液体を吸引する。先端部を反応管の底に触れたままにしない。
12.吸引終了後、先端部をもとの先端カセットに外し入れる。各試料専用の先端部を用いて、吸引ステップを残りのTTUについて繰り返す。
13.分注マニフォールドを各TTUに配置し、分注装置ポンプを用いて、1.0mLのAPTIMA洗浄液をTTUの各反応管に送液する。
14.反応管をシーリングカードで封をし、ラックをTCSから取り除く。マルチチューブボルテックスミキサーで1度ボルテックスする。
15.ラックをTCSマグネチックベース上に5〜10分間置く。
16.すべての液体をステップ13および14のように吸引する。
17.最終吸引の後、ラックをTCSベースから取り出し、目視で反応管を検査してすべての液体が吸引されたかを確認する。液体がまだ見られる場合、ラックをTCSベースに2分間戻して、各検体について先に用いたものと同じ先端部を用いてTTUに対して吸引を繰り返す。
1.連続分注器を用いて、分析物特異性プライマーを含有する再構成増幅試薬75μLを各反応管に加える。この時点でラック中のすべての反応混合物は赤色となるはずである。2.連続分注器を用いて、200μLの油試薬を加える。
3.シーリングカードで反応管に封をし、マルチチューブボルテックスミキサー上でボルテックスする。
4.ラックを水浴中62±1℃で10±5分間インキュベートする。
5.ラックを水浴に移し、42±1℃で5±2分間放置する。
6.ラックを水浴につけたまま、シーリングカードを注意深く取り外し、連続分注器を用いて、25μLの再構成酵素試薬を反応混合物の各々に添加する。この段階で、すべての反応は、オレンジ色となっているはずである。
7.直ちに新しいシーリングカードで反応管に封をして水浴から取り出し、ラックを手で緩やかに振とうさせて反応物を混合する。
8.ラックを42±1℃で60±15分間インキュベートする。
1.増幅前に水浴からラックを取り出し、増幅後領域に移す。分析物特異性プローブを有する再構成したプローブ試薬100μLを、連続分注器を用いて加える。すべての反応混合物はこの時点で黄色となっているはずである。
2.反応管をシーリングカードで封をし、マルチチューブボルテックスミキサー上で10秒間ボルテックスする。
2.ラックを62±1℃の水浴中で20±5分間インキュベートする。
3.ラックを水浴から取り出し、室温で5±1分間インキュベートする。
1.連続分注器を用いて、250μLの選択試薬を各反応管に加える。すべての反応は、この段階で赤色を呈するはずである。
2.反応管をシーリングカードで封をして10秒間あるいは色が均一になるまでボルテックスし、ラックを62±1℃の水浴中で10±1分間インキュベートする。
3.ラックを水浴から取り出す。ラックを室温で15±3分間インキュベートする。
1.試験完了に十分な量の自動検出試薬IおよびIIがあることを確認する。
2.カセット位置番号1に空のTTUを1つ入れてLEADERルミノメーターを準備し、WASHプロトコールを行う。
3.TTUをルミノメーターにロードし、HC+RevBプロトコールを実行する。
TMPRSS2:ERGおよびTMPRSS2:ETV1遺伝子融合物IVTの各々をTCRに添加した4つのアッセイに対する結果を表6〜9に示す。
(実施例4)
遺伝子融合物に関するFISH分析
本実施例では、前立腺癌試料29試料中23試料がERGまたはETV1に再配列を保持することを実証するための蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)の使用について説明する。細胞株実験は、TMPRSS2のアンドロゲン応答性プロモーターエレメントが前立腺癌においてETSファミリーメンバーの過剰発現を介在していることを示唆する。これらの結果は、癌腫の発症および前立腺癌の分子的診断および治療に意味をもつ。
・1つがETV1に及び、1つがTMPRSS2遺伝子座に及ぶプローブを用いたETV1−TMPRSS2融合物試験
ETV1に対するBAC:RP11−692L4
TMPRSS2に対するBAC:RP11−121A5、(RP11−120C17、PR11−814F13、RR11−535H11)
・c−ERG:t−ERG分断に関する1組のプローブを用いたERG転位試験:
c−ERGに対するBAC:RP11−24A11
t−ERGに対するBAC:RP11−372O17、RP11−137J13
・1つがETV1遺伝子座に及び、1つの基準プローブが第7染色体上にある1組のプローブを用いたETV1欠失/増幅試験:
ETV1に対するBAC:RP11−692L4
第7染色体上の標準プローブに対するBAC:chrのセントロメア上の市販プローブ・1つがERG遺伝子座に及び、1つの基準プローブが第21染色体上にある1組のプローブを用いたERG欠失/増幅試験:
ERGに対するBAC:RP11−476D17
第21染色体上の標準プローブに対するBAC:*
・1つがTMPRSS2遺伝子座に及び、1つの基準プローブが第21染色体上にある1組のプローブを用いたTMPRSS2欠失/増幅試験:
TMPRSS2に対するBAC:RP11−121A5、(RP11−120C17、PR11−814F13、RR11−535H11)
第21染色体上の基準プローブに対するBAC:*
*第21染色体上の基準プローブに対するBAC:PR11−32L6、RP11−752M23、RP11−1107H21、RP11−639A7、(RP11−1077M21)
(実施例5)
欠失を伴うTMPRSS2:ERG融合物
本実施例では、TMPRSS2:ERG融合物に伴う、第21染色体q22.2〜3上のERGとTMPRSS2との間に位置する共通の欠失の存在について説明する。疾患進行と臨床成績との関連を、広い範囲にわたるヒトPCA試料、6つの細胞株、および13の異種移植を用いて調べた。
臨床試料
この研究で用いた前立腺試料は、IRB認定プロトコールのもとで収集されたものである。すべての臨床的に局在化したPCA試料を1人の病理学者により特徴付けし、病理報告の際の観察者間の差異を排除するため、グリーソンスコアをつけた。臨床的に局在化したPCA試料をウルム大学での現在進行中の研究プロトコールの一部として収集した。これらのホルモン抵抗性試料はミシガン大学の迅速剖検プログラムから採取されたものである。
アンドロゲン非依存性(PC−3、DU−145、HPV10、および22Rv1)、およびアンドロゲン感受性(LNCaP)PCA細胞株は、American Type Culture Collection(Manassas、VA)から購入したものであり、限定培地中で維持した。HPV10は、HPV18DNA(18)によるトランスフェクションで形質転換した、高悪性度PCA(グリーソンスコア:4+4=8)由来の細胞に由来した。22Rv1は、性腺摘除誘発性退縮および親のアンドロゲン依存性CWR22異種移植の再発後にマウスにおいて連続的に増殖させた、異種移植に由来するヒトPCA上皮細胞株である。VCAP細胞株は、ミシガン大学での迅速剖検プログラムの一部として、椎骨転移性病変から得られたものである。
TMPRSS2:ERGの転位に関するFISH分析は、本明細書中や過去にも記載がある(Tomlinsら、Science 310巻:644〜8頁(2005年))。この分離アッセイを図11および14に示す。第21染色体q22.2上におけるERG再配列を分析するために、それぞれがERG遺伝子座の隣接するセントロメアおよびテロメア領域に広がる、ビオチン−14−dCTP標識BACクローンRP11−24A11(最終的にコンジュゲートして赤のシグナルを生成)、およびジゴキシゲニン−dUTP標識BACクローンRP11−137J13(最終的にコンジュゲートして緑のシグナルを生成)からなる分離プローブシステムを応用した。すべてのBACクローンは、BACPACリソースセンター、オークランド研究所小児科病院(CHORI)、Oakland、CAより入手したものである。
SNPアレイは対立遺伝子の遺伝子型分析を対象としているにもかかわらず、このSNPアレイデータは、異型接合性の損失(Lieberfarbら、Cancer Res 63巻:4781〜5頁(2003年);Linら、Bioinformatics 20巻:1233〜40頁(2004年))および複製数変化の検出(Zhaoら、Cancer Cell 3巻:483〜95頁(2003年))に関する情報を提供できる。SNPアレイ分析を利用すると、黒色腫(MITF)等の様々な癌における増幅遺伝子を確認および検証することが可能である(Garrawayら、Nature 436巻:117〜22頁(2005年))、およびPCA(TPD52)(Rubinら、Cancer Res. 64巻:3814〜22頁(2004年))。
を用いた。
臨床的および病理学的変数を再配列状態および欠失の存在との関連について調べた。χ(カイ)2乗検定およびフィッシャーの正確確率検定を適切に用いた。カプラン−マイヤー分析を、病態についての前立腺特異的な抗原無再発生存曲線とゲノム変化パラメーターを作製するのに用いた。対数順位検定を関連性の統計学的有意性を評価するのに用いた。ネオアジュバントホルモンアブレーション療法の前歴のある患者は排除した。すべての統計をウィンドウズ(登録商標)用SPSS13.0(SPSS社、Chicago、IL)を用いて有意水準0.05で行った。
TMPRSS2:ERG遺伝子再配列と関連した第21染色体上の欠失の検出
PCAにおけるTMPRSS2:ERG再配列の頻度の特徴付けるために、Tomlinsらにより記載されたアッセイ(Science 310巻:644〜8頁(2005年))を改変したFISH分析を用いた。当初のFISH分析は、セントロメア3’およびテロメア5’末端のERG上に位置する2つのプローブを用いた。この新しいアッセイは、5’プローブをテロメア方向に移動した(図14)。PCAスクリーニング組織マイクロアレイ(TMA)を用いて、TMPRSS2:ERG再配列(図11Aおよび11B)を実証するおよそ70%のPCAが、テロメア5’ERGプローブ(図11Cおよび11D)に対応する緑のシグナルの消失も示すことが観察され、この染色体領域が消失したことを示唆している。100KオリゴヌクレオチドSNPアレイをこれらの欠失の範囲を特徴付けるために用いた。細胞株、異種移植およびホルモン未処理およびホルモン抵抗性転移性PCA試料を含む30のPCA試料を調べることにより、第21染色体q23上のERGとTMPRSS2との間のゲノム消失が確認された(図12A〜C)。
これらの観察についての頻度および潜在的臨床意義を特徴付けるため、118の臨床的に局在化したPCAの症例をFISHにより調べた。これらの臨床的および病理学的デモグラフィックスを表10に示す。患者のコホートは、高腫瘍悪性度(グリーソン評価)、病態の段階、および予備治療PSAレベルにより実証される疾患再発のリスクが高い。PCAの大きな領域が微視的に調べることのできる、このコホート由来の標準的な組織切片を用いると、TMPRSS2:ERG再配列は所与の腫瘍について均一に観察された。TMA実験によりこれらの観察を確認した。3〜6のコアが腫瘍の異なる領域から得られたPCAの症例では、100%の一致がTMPRSS2:ERG再配列状態(すなわち、存在または非存在)について観察された。欠失を伴うTMPRSS2:ERG再配列の場合、97.9%(94/96)の症例で欠失が同じ患者由来のすべてのTMAコアで観察された。
TMPRSS2:ERG再配列を原発性PCA試料の49.2%およびホルモン未処理転移性LN試料の41.2%で確認した(図13A)。テロメアプローブの欠失(緑シグナル)(図1C〜D)を原発性PCA試料の60.3%(35/58)およびTMPRSS2:ERG再配列を有するホルモン未処理リンパ節腫瘍の42.9%(3/7)で観察した。
再配列状態と臨床的および病理学的変数との関連を観察した(図13)。欠失を有するTMPRSS2:ERG再配列は、進行した腫瘍段階(pT)(p=0.03)(図13B)および局所骨盤リンパ節への転移性疾患の存在(pN0対pN1−2)(p=0.02)を有するPCAの症例でより高い割合で観察された。欠失を伴うまたは伴わないTMPRSS2:ERG再配列と、経過観察データのある70人の患者についての前立腺特異的抗原(PSA)生化学的欠陥により決定された臨床成績との関連性も評価した。グリーソン評価、腫瘍段階、核グレード、およびリンパ節状態は、PSA生化学的欠陥値(すべてのp値<0.0005)の良好な予測因子である。FISHアッセイにより決定された欠失のないTMPRSS2:ERG再配列PCAの症例におけるPSA無再発延命効果を示唆する傾向が一変量レベルで観察された。
致死性前立腺癌に関連するTMPRSS2:ERG遺伝子融合物
以前の研究において、ERG(21q22.2)、ETV1(7p21.2)(Tomlinsら、Science 310巻:644〜8頁(2005年))、またはETV4(Tomlinsら、Cancer Res. 66巻(7号):3396〜400頁(2006年))のいずれかであるETS転写因子ファミリーメンバーとのTMPRSS2(21q22.3)の5’非翻訳領域の遺伝子融合は、大多数の前立腺癌におけるETS遺伝子の過剰発現に関する機構を与える。さらに、アンドロゲン制御遺伝子であるTMPRSS2、および癌遺伝子の融合は、疾患の進行がこれらの分子のサブタイプに基づいて変動し得る可能性を示唆している。遺伝子融合に関して最もよくある機構は、TMPRSS2とERGの間の約2.8メガベースのゲノムDNAの喪失である(図17AおよびB)。この実施例は、通常のTMPRSS2:ERG遺伝子融合物の存在に基づく転移または前立腺癌特異的な死亡のリスクについて説明する。
本治験対照母集団は、Andrenらの文献(J. Urol. 175巻(4号)1337〜40頁(2006年))に記載の症候性良性前立腺肥大に対する経尿道的前立腺切除術(TURP)または経膀胱腺腫核摘出により、1977年から1991年の間にスウェーデンのオレブロ大学病院で診断された初期の前立腺癌(T1a−b、Nx、M0)を有する男性からなる。診断でのベースライン評価として、物理的検査、胸部X線、骨スキャンおよび骨格X線検査(必要に応じて)を行った。リンパ節転移段階評価は行わなかった。この評価では遠隔転移の証拠が示されなかったので、患者は診断後最初の2年間は6カ月毎そしてその後12カ月毎に治験、臨床検査および骨スキャンを受けることとした。骨スキャンによる決定で転移のあった患者は、症状のあった場合、アンドロゲン欠乏療法で治療した。
局在化した癌を診断された男性のこの集団ベースのコホートにおいて、TMPRSS2:ERG融合の頻度は15.2%(14/92)であった(図17AおよびB)。TMPRSS2:ERG融合陽性腫瘍は、より高いグリーソンスコア(両側P=.014)を有する可能性が高い(表11)。融合状態と致死性前立腺癌の関係を評価するために、累積罹患率回帰を用いた。累積罹患率(CIR)が3.6(P=.004、95%信頼区間[CI]=1.5〜8.9)である、TMPRSS2:ERG遺伝子融合物の存在と転移または疾患特有の死亡との顕著な関連が観察された(図17C)。グリーソンスコアを調節した場合、CIRは2.4であった(P=.07および95%CI=0.9〜6.1)。本発明は特定の機構に限定されるものではない。実際、機構を理解することは、本発明を実施するのに必要ではない。にもかかわらず、所与の細胞腫瘍の細胞内でのTMPRSS2:ERG遺伝子融合物の均一性および侵襲性前立腺癌のみにおけるその存在(前立腺上皮内腫瘍と比べた場合に)に基づいて、このことは、グリーソンパターンの表現型の影にひそむ生物学に一部寄与する初期の現象であると考えられていた。
*TMPRSS2:ERG融合物を有する被験体とTMPRSS2:ERG融合物を持たない被験体の臨床用パラメーターを、連続変数およびカテゴリー変数のそれぞれについてt検定またはχ2乗検定を用いることで比較した。
前立腺癌患者の尿中のTMPRSS2:ETS融合物の検出
A.材料および方法
尿採取、RNA単離および増幅
尿試料は、針生検または根治的前立腺切除術の前に、直腸診後患者から採取した。尿は、DNA/RNA保存料を含む尿採取用のカップ(Sierra Diagnostics)への排尿により採取した。RNAの単離には、少なくとも30mLの尿を4℃で15分間400rpmで遠心分離した。RNAlater(Ambion)を尿沈渣に添加し、RNAが単離するまで、−20℃で保存した。総RNAを、キアゲン社のRNイージーマイクロキットを製造業者の使用説明書に従って使用して単離した。総RNAを、オムニプレックス全トランスクリプトーム増幅(WTA)キット(Rubicon Genomics)を製造業者の使用説明書に従って(Tomlinsら、Neoplasia 8巻:153頁[2006年])用いて増幅した。25ngの総RNAをWTAライブラリー合成に用い、cDNAライブラリーについてWTA PCR増幅を1回行った。増幅産物をキアクイック(QIAquick)PCR精製キット(キアゲン社)を用いて精製した。概念実験の細胞株証明として、記載数のVCaPまたはLNCaP細胞を1mLの滅菌尿中に添加し、これらの試料を排尿採取尿として処理した。
定量的PCR(QPCR)を、本質的に記載される(Tomlinsら、Neoplasia 8巻:153頁[2006年]、Tomlinsら、Science 310巻:644頁[2005年]、および上記実施例1)ように、WTA増幅cDNA由来のERG、ETV1およびTMPRSS2:ERG転写産物を検出するのに用いた。各QPCR反応について、10ngのWTA増幅cDNAを鋳型として用いた。ERG、ETV1、PSA、およびGAPDHの反応には、2×パワーSYBRグリーンマスターミックス(Applied Biosystems)、および25ngのフォワードおよびリバースプライマーを用いた。TMPRSS2:ERGaの反応には、2×タックマンユニバーサルPCRマスターミックスおよび最終濃度900nMのフォワードおよびリバースプライマー、および250nMのプローブを用いた。タックマンアッセイでは、38サイクルを超えるCt値を有する試料は、増幅を示さないと考えた。すべての試料について、ERGとETV1の量は、GAPDHの量に基準化した。尿中の前立腺細胞の乏しい回復を示すPSAの不適切な増幅の試料は、さらなる分析から排除した。ERG(エクソン5 6フォワード)とETV1(エクソン6_7)2、GAPDH3、およびPSA4プライマーは記載の通りである。TMPRSS2:ERGaに対して特異的なタックマンプライマーおよびプローブ(MGB標識)は、以下の通りである:
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)
整合する針生検から得た、厚さ4μmのホルマリン固定したパラフィン包理(FFPE)切片を間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)に用い、既述のように(実施例2およびTomlinsら、Cancer Res 66巻:3396頁[2006年])、処理およびハイブリダイゼーションした。ERG再配列検出用のBACプローブである、RP11−95I21(ERGに対して5’側)およびRP11−476D17(ERGに対して3’側)を既述のように調製した(Tomlinsら、Cancer Res 66巻:3396頁[2006年];Tomlinsら、Science 310巻:644頁[2005年];上記実施例1および2)。
本実施例では、直腸診後の尿に排泄された前立腺癌細胞内のTMPRSS2:ETS融合転写産物の存在により前立腺癌を検出する非侵襲性方法について記載する。結果を図33に示す。概念の証拠として、高レベルのERGおよびTMPRSS2:ERG(VCaP)または高レベルのETV1(LNCaP)を発現する前立腺癌細胞株を添加した滅菌尿を用いた。図33Aに示すように、1,600細胞でVCaP中に排他的に過剰発現したERGと16,000細胞でLNCaP中に排他的に過剰発現したETV1を定量的PCR(QPCR)により検出することができる。
前記針生検コホートから、5人の患者がERGの著しい過剰発現を有することが確認され、そのうち1人は針生検でHGPINを有すると診断され、その他の4人は前立腺癌を有すると診断された。前記根治的前立腺切除術コホートからは、前立腺癌を有する3人のうち1人の患者は、高ERG発現を有することが確認された(図33B)。ETV1過剰発現は、いずれのコホートの患者からも検出されなかった。ERGを過剰発現した試料中のTMPRSS2:ERGの発現を確認するため、TMPRSS2:ERGaを特異的に増幅するように設計されたタックマンプライマー/プローブアッセイを利用した。このアッセイは、TMPRSS2:ERGaを発現するVCaP細胞からの産物を強力に増幅する(Tomlinsら、Science 310巻:644頁[2005年])。さらにまた、ERGを過剰発現した前立腺癌を有する患者由来の尿試料の6つのうち5つがTMPRSS2:ERGa(Ct値:29.8〜38.9)も発現したのに対し、ERG過剰発現なしの患者の10試料のうち、TMPRSS2:ERGaを発現したものは無かった。1つの試料はTMPRSS2:ERGaの発現なくERGを過剰発現したので、この試料は、TMPRSS2:ERGbまたはより最近同定された融合転写産物(Sollerら、Genes Chromosomes Cancer 45巻:717頁[2006年];Yoshimotoら、Neoplasia 8巻:465頁:2006年)等の融合転写産物のその他のアイソフォームを発現しているようである。TMPRSS2:ERG融合転写産物の存在がTMPRSS2:ERG陽性癌性組織の存在を示すことを確認するため、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)を、代表的な症例より得た整合した組織切片上でERG配列を検出するように設計されたプローブを用いて実施した。整合した組織は、検出可能なTMPRSS2:ERG転写産物を尿中に有し癌と診断された3人の患者から得たものであり、1人は検出可能なTMPRSS2:ERG転写産物を尿中に含有し、高悪性度のPINと診断され、そして2人の患者は検出可能なTMPRSS2:ERG転写産物を持たず癌と診断されている。図33Bに示すように、癌と診断されたが検出可能なTMPRSS2:ERG転写産物を自身の尿に含有しない患者の両人は、FISHでは癌性組織中のERG再配列を有さなかった。癌と診断されかつ検出可能なTMPRSS2:ERG転写産物を自身の尿中に含有する3人の患者はすべて、癌性組織中のERG再配列もFISHにより示した。最後に、高悪性度PINと診断され、検出可能なTMPRSS2:ERGを自身の尿に有する患者は、高悪性度PIN組織中にERG再配列を示さなかった。このことは、この患者が前立腺のどこかに未診断の癌を有しているかもしれず、このためこれらの尿中に検出可能なTMPRSS2:ERG転写産物が存在することになったことを示している。
前立腺癌におけるTMPRSS2とETSファミリー遺伝子の融合
本検討では、臨床的に局在化した前立腺癌を手術により治療したアメリカ人男性111人からなるスクリーニングベースのコホートにおける、TMPRSS2とETSファミリー遺伝子の再配列の頻度に関する包括的な分析について記載する。
治験対象母集団、臨床的データ、および前立腺試料の収集
臨床的に局在化した前立腺癌の供給源として、癌を示す組織マイクロアレイ(TMA)含有コアおよび良性組織を、ミシガン大学で初期単独治療(すなわち、アジュバントまたはネオアジュバントの無いホルモンまたは放射線療法)として根治的前立腺切除術を受けた111人の男性から構築した。根治的前立腺切除術系列は、ミシガン大学前立腺癌専門優良研究プログラム(SPORE)組織コアの一部である。TMAを構築するため、3つのコア(直径0.6mm)を各代表組織ブロックから取り出した。TMA構築プロトコールについては、文献(Kononenら、Nat. Med. 4巻:844頁[1998年];Rubinら、Am. J. Surg. Pathol. 26巻:312頁[2002年])に記載されている。詳細な臨床的、病理学的、およびTMAデータは、既述の確実な関連データベースに保存されている(Manleyら、Am J. Pathol. 159巻:837頁[2001年])。
厚さ4μmの組織マイクロアレイ切片を、間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)に用い、既述のように処理およびハイブリダイゼーションした(Tomlinsら、Science 310巻:644頁[2005年];Tomlinsら、Cancer Res 66巻:3396頁[2006年])。スライドをAxioplanイメージングZ1顕微鏡(Carl Zeiss)を用いて観察し、メタアファー(Metafer)イメージ分析システム(Meta Systems、Altlussheim、Germany)でアイシス(ISIS)ソフトウェアシステムを利用し、CCDカメラで撮像した。形態学的に無傷のおよび非オーバーラップ核の状態で、FISHシグナルを病理学者により手作業で評価し(100x油浸)、1つ症例からの3つのコアにある少なくとも30細胞または最大数の癌細胞を記録した。30個の評価可能な細胞のない症例は、不十分なハイブリダイゼーションとして報告した。すべてのBACは、BACPAC Resource Center(Oakland、CA)から入手し、プローブ位置は、正常な末梢リンパ球の中期スプレッドとのハイブリダイゼーションにより検証した。TMPRSS2、ERG、およびETV4再配列の検出については、以下のプローブを用いた。すなわち、RP11−35C4(TMPRSS2に対して5’側)、およびRP11−120C17(TMPRSS2に対して3’側)、RP11−95I21(ERGに対して5’側)、およびRP11−476D17(ERGに対して3’側)、およびRP11−100E5(ETV4に対して5’側)、およびRP11−436J4(ETV4に対して3’側)。TMPSS2−ETV1融合物の検出については、RP11−35C4(TMPRSS2に対して5’側)をRP11−124L22(ETV1に対して3’側)と共に用いた。BAC DNAをQIAフィルターマキシプレップキット(Qiagen、Valencia、CA)を用いて単離し、プローブをジゴキシゲニン−またはビオチンニックトランスレーションミックス(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)を用いて合成した。ジゴキシゲニンおよびビオチン標識されたプローブを、フルオレセインをコンジュゲートしたジゴキシゲニン抗体(Roche Applied Science)、およびAlexa594をコンジュゲートしたストレプトアビジン(Invitrogen、Carlsbad、CA)をそれぞれ用いて検出した。
本実施例では、臨床的に局在化した前立腺癌を外科的に処置したアメリカ人男性の大きなスクリーニングベースのコホートにおけるTMPRSS2とETS転写因子遺伝子再配列のシグネチャーの概要を描く包括的な分析について説明する。TMPRSS2分断プローブFISH分析アプローチを、図34に示すように、公知のETSファミリーパートナーであるERG、ETV1、ETV4とその他の未知のパートナーを有する前立腺癌における遺伝子再配列の全体的な頻度を検出するのに用いた。3つの公知のETSパートナー(ERG、ETV1、およびETV4)に対して陰性である前立腺癌は、その他のETSファミリーメンバーに関わる再配列を有している可能性があると仮定した。これらの結果は、臨床的に局在化した前立腺癌におけるTMPRSSとETSファミリー遺伝子再配列が、複合分子シグネチャーを示した(図35AおよびB)。全体的なTMPRSS2が評価可能な症例の65%で再配列したのに対し、ERG、ETV1およびETV4が評価可能な症例の55%、2%および2%で再配列した(図35A)。TMPRSS2再配列を有する症例の40.5%において、3’プローブの損失が観察され、これは遺伝子融合の機構としてのTMPRSS2とERGとの間の染色体欠失と一致している。これらの結果は、前立腺癌における高頻度のTMPRSS2:ETS融合を確認し、TMPRSS2:ERGがきわめて共通の型であることを示す過去の研究を立証している(Tomlinsら、Science 310巻:644頁;Pernerら、Cancer Res 66巻:3396頁[2006年];Yoshimotoら、Neoplasia 8巻:4665頁[2006年];Sollerら、Genes Chromosomes Cancer 45巻:717頁[2006年];Wangら、Cancer Res 66巻:8347頁[2006年]および上述の実施例)。
PSA遺伝子融合
FISH実験を、PSAに対し5’および3’に位置するプローブについて分断シグナルを示す症例をFISHにより同定するために用いた。PSA分断を検出するのに用いた5’および3’BACはそれぞれRP11−510I16およびRP11−26P14である。PSA遺伝子融合についてのパートナーはいまだ同定されていない。これらの同じプローブは、PSAのごく近傍に位置しているため、ETSファミリーメンバーSPIB内の分断もとらえる。
FLI1過剰発現
FLI1発現を、FLI1遺伝子融合を有していない異なる細胞試料で評価した。FLI1の5’および3’エクソン発現を高FLI1発現を有する症例から測定した。結果を図18に示す。5’および3’転写産物の存在量に差異は検出されなかった。RACEでも融合転写産物を示さなかった。FLI1は、対照試料と比較して前立腺癌において過剰発現された。Fli1増幅のためのプライマーを、タックマンプローブと共に図37に示す。
組織マイクロアレイ
組織マイクロアレイを遺伝子融合物の存在についての分析に使用した。用いたTMAは、前立腺癌進行アレイ,前立腺癌予後評価アレイ、温式生検アレイ,前立腺癌スクリーニングアレイ、Erg陰性前立腺癌アレイ、および個々の前立腺癌の症例である。以下の遺伝子プローブを組織マイクロアレイ上で使用した。すなわち、TMPRSS2−ETV1融合プローブ、Erg分断プローブ、TMPRSS2分断プローブ、ETV1分断プローブ、ETV4分断プローブ、およびFL1分断プローブを使用した。
Erg発現のアンドロゲン制御
本実施例では、Erg発現のアンドロゲン制御について記載する。LNCap(TMPRSS2−ERG−)、およびVCaP(TMPRSS2−ERG+)細胞株を用いた。これらの細胞を異なる量のR1881と48時間接触させた。Erg、PSA(+(陽性)対照)、およびβ−チューブリン(−(陰性)対照)の発現を評価した。これらの結果を図19に示す。ERG発現は、VCaPにおいてはアンドロゲン依存であるが、LNCap細胞ではアンドロゲン依存ではないことが分かった。
ペプチド抗体およびアクアプローブの作製
図22〜25は、ペプチド抗体作製およびアクアプローブの作製における使用のためのERG1、ETV1、FLI−1、およびETV4の配列(下線部)を示す。プライマーは、すべてのETSファミリーメンバー用にApplied Biosystemsにより設計されたものである。発現を前立腺癌の症例においてモニターし、高発現は、可能な遺伝子融合の指標およびFISHのための指標である。
LnCaP細胞におけるETV1
本実施例では、VCaPおよびLNCaPにおけるアンドロゲンに対する転写応答の分析について記載する。PSA等の両細胞株で異なって発現された転写産物の数を検出することに加え、VCaPまたはLNCaP細胞において独自に調節不全な転写産物の数も同定した。本分析は、ETV1がLNCaP細胞内でアンドロゲンに対し排他的に応答性を示すことを立証した。LNCaP細胞におけるETV1の過剰発現と合わせて、FISHをLNCaP細胞におけるETV1遺伝子座を調べるのに用いた。
細胞株
前立腺癌細胞株LNCaP(リンパ節前立腺癌転移由来)、およびVCaP(Korenchuk, S.ら、In vivo 15巻、163〜8頁(2001年))(椎骨前立腺癌転移由来)を本検討に用いた。マイクロアレイ研究については、VCaPおよびLNCaP細胞を、0.1%エタノール、またはエタノールに溶解した1nMの合成アンドロゲンメチルトリエノロン(R1881、NEN Life Science Products、Boston、MA)を用いた48時間の処理の前に、活性炭処理済血清含有培地中で24時間増殖させた。定量的PCR(QPCR)研究に関しては、細胞の増殖を、活性炭処理済血清含有培地中で24時間、0.1%エタノール、アセトンに溶解したカソデックス(Casodex)(10μM、ビカルタミド、AstraZeneca Pharmaceuticals、Wilmington、DE)またはエタノールに溶解したフルタミド(10μM、Sigma、St.Louis、MO)と共に予備インキュベートして行った。2時間後、0.1%エタノールまたは0.5nMのR1881を添加し、細胞を48時間後に回収した。総RNAをすべての試料から製造業者の使用説明書に従ってトリゾール(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いて単離した。RNA完全性を、変性ホルムアルデヒドゲル電気泳動またはAgilentのバイオアナライザー2100(Agilent Technologies、Palo Alto、CA)により確認した。
本検討で用いたcDNAマイクロアレイは、アレイが32,448の特徴(feature)を含むこと意外は、本質的に既述のように構築した。アレイのプリントおよび後処理のためのプロトコールは、インターネット上で入手できる。cDNAマイクロアレイ分析を基本的に既述のように行った。要約すると、対照およびR1881で処理したVCaPおよびLNCaP細胞株由来の総RNAを逆転写し、cy5蛍光色素で標識した。対照VCaPまたはLNCaP試料から得たプールした総RNAを逆転写し、それぞれの細胞株由来のすべてのハイブリダイゼーションに対してcy3蛍光色素で標識した。その後、標識産物を混合し、cDNAアレイとハイブリダイゼーションした。イメージを、Genepixソフトウェアパッケージ(Axon Instruments Inc、Union City、CA)を用い、フラグ付けおよび標準化した。データをアレイ単位でメジアンを中心にし、試料の少なくとも80%に存在する発現値を有した遺伝子のみを本分析に用いた。
QPCRを文献(Tomlinsら、Cancer Res 66巻、3396〜400頁(2006年);Tomlinsら、Science 310巻、644〜8頁(2005年))に記載のように、Applied Biosystemsの7300リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems、Foster City、CA)でSYBRグリーンの色素を用いて行った。各試料のハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)に対する各標的遺伝子の量を報告した。各細胞株および/または実験における標的遺伝子の相対量は、対照に対し較正した。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA)により合成されたものである。GAPDH(Vandesompeleら、Genome Biol 3巻、RESEARCH0034(2002年))、PSA(Spechtら、Am J Pathol 158巻、419〜29頁(2001年))、ERG(エクソン5−6_fおよびエクソン5−6_r)およびETV1(エクソン6−7_fおよびエクソン6−7_r)、プライマー(Tomlinsら、Science 310巻、644〜8頁(2005年))は、記載の通りである。
中期スプレッドを、標準的な手法により、正常な末梢リンパ球(NPLs)およびLNCaP細胞から調製した。スライドを、2倍濃度のSSCで2分間、70%エタノールで2分間、そしてプローブの添加前に100%エタノールで2分間処理した。スライドをカバースリップでカバーし、75℃で2分間インキュベートし、そして一晩37℃でハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後の洗浄を2倍濃度のSSCで42℃にて5分間行い、その後PBST中で3回洗浄した。蛍光検出を、フルオレセインにコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン(ロシュアプライドサイエンス社、インディアナ州インディアナポリス)およびAlexaFluor594にコンジュゲートしたストレプトアビジン(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いて実施した。スライドを対比染色し、DAPI含有ProLong Gold退色防止試薬(Invitrogen)中においた。スライドをツァイスAxio ImagerZ1蛍光顕微鏡(Zeiss、Thornwood、NY)を用いて観察し、ISISソフトウェア(Metasystems、Altlussheim、Germany)を用いてCCDカメラで撮像した。
結果を図26〜28に示す。図26は、LNCaP前立腺癌細胞株におけるETV1の過剰発現およびアンドロゲン制御を示す。図26Aは、VCaPおよびLNCaP前立腺癌細胞株におけるアンドロゲン調節遺伝子の発現シグネチャーを示す。遺伝子のヒートマップは、媒体のみでの治療(灰色)と比較した、1nMの合成アンドロゲンR1881(緑)によるいずれかの細胞株(特徴数3,499、p<0.05および変化倍率>=1.5)における誘発または抑制を示す。各列は遺伝子、各列は試料を示す。黄色および青色の細胞は、カラースケールに従い、過剰または過小発現をそれぞれ示す。灰色の細胞は、欠測データを示す。各細胞株についての値は、対応する対照試料を中心に示している。ヒートマップ中でPSA、ERG、およびETV1の位置を示し、これらの発現を挿入図中に示している。図26Bは、定量的PCR(QPCR)による、VCaPおよびLNCaP細胞の両細胞におけるアンドロゲンによるPSA誘発を示す。LNCaP(赤色)、およびVCaP(青色)細胞株におけるPSA(GAPDHに対し標準化)の相対発現をQPCRにより決定した。細胞を、媒体または1nMのR1881で48時間、抗アンドロゲンカソデックスまたはフルタミドの存在または非存在下で記載どおりに処理した。各試料におけるPSAの相対量を、各細胞株に対する対照試料中の量に対して較正した。図26Cは、LNCaP細胞におけるアンドロゲンによるETV1誘発を示す。Bと同じ試料を用いて、ETV1の相対量をQPCRにより決定した。図26Dは、ETV1がLNCaP細胞中で顕著に過剰発現されていることを示す。PSA、ETV1およびERGの相対発現を、QPCRにより各細胞株由来の48時間対照試料で決定した。各試料における標的遺伝子の相対量を、両細胞株由来のPSAの平均量に対して較正した。LNCaPとVCaPでのERGとETV1発現における差の倍率を示す。
前立腺癌におけるETSファミリーメンバーのノックダウン
本実施例では、前立腺癌におけるETSファミリーメンバーのノックダウンについて記載する。siRNAをLNCaPおよびVCAPにおけるETV1およびERGの発現をノックダウンするのに用いた。定量的PCRをこのノックダウンの確認に用いた。結果を図29および30に示す。このノックダウンは増殖に影響を与えなかった。shRNAを発現するレンチウイルスを安定なノックダウンのために作製した。
トランスジェニックマウス
本発明の遺伝子融合物を過剰発現するトランスジェニックマウスの他に、ETSとアンドロゲン応答性遺伝子も作製した。図31は、マウス作製に用いるためのウイルス過剰発現システムである。図32は、トランスジェニックマウスにおけるゲノム挿入断片の模式図である。このようなマウスは、研究(例えば、機構試験)および薬物スクリーニング応用における用途がある。
TMPRSS2:ERGaの同定
上述のように(実施例1)、TMPRSS2のERGへの融合を観察した。TMPRSS2:ERGa遺伝子融合物からの発現タンパク質を決定するため、3xFlagタグを停止コドンのすぐ上流に挿入して、VCaP前立腺癌細胞株から、エクソン4の始まりにある融合区切り点からエクソン11内の推定の停止コドンまでのERG(NM_004449)の部分を増幅するのに、PCRを用いた。この産物をpCR8/GW/TOPO TA(Invitrogen)にTAクローン化し、双方向で配列決定した。配列決定は、本明細書においてERG1(ERGアイソフォーム1由来のエクソン6を含む
およびERG2(このエクソンを含まない)と称する2つの異なるアイソフォームの存在を明らかにした。この生産物をpLenti6/V5−DESTデスティネーションベクターにGatewayクローン化した。このプラスミドを、ERGタンパク質産生のため、直接的にPHINX細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクションアッセイ:Phinx細胞に、FuGeneトランスフェクション試薬(Roche)を製造業者の使用説明書に従って用いて、ERG2または空ベクターをトランスフェクトした。直径150mmのプレート計10個を各コンストラクトに用いた。トランスフェクション後48時間の時点でこれらの細胞を収集し、以下に記載する免疫沈降アッセイに用いた。
ゲルバンドを採取し、製造業者の使用説明書に従い銀染色キット(Invitrogen Corporation、Carlbad、CA)に含まれる脱染溶液を用いて脱染した。ゲル中で、消化をpH9の1Mの重炭酸アンモニウム中でブタ由来トリプシン(1:50、Promega Corporation、Madison、WI)を用いて行った。この消化は、37℃で16時間行った。24時間後、トリプシン活性を3%ギ酸により停止した。これらのペプチドを50%アセトニトリルを用いて抽出した。これらのペプチドを乾燥して0.1%ギ酸含有の2%アセトニトリルに懸濁し、パラダイムHPLCポンプ(Michrome Bio Resources Inc)に取り付けた0.075mm×150mmのC18カラムを用いて、逆相クロマトグラフィーにより分離した。ペプチドを、溶媒Aを0.1%ギ酸/2%アセトニトリルとし、B(0.1%ギ酸/95%アセトニトリル)を45分5〜95%の濃度勾配で用いて溶出した。フィニガン(Finnigan)LTQ質量分析計(Thermo Electron Corp.)をスペクトルを得るのに用い、装置をデータ依存モードでダイナミックエクスクルージョン(dynamic exclusion)を可動状態にして操作した。フルMSスキャンにおける3つの最大量ペプチドイオンでのMS/MSスペクトルを得た。これらのスペクトルを、混成の、非同一のNCBIヒト標準配列データベースに対してMASCOT検索ツールを用いて検索した。これらのデータベースの検索結果は、ペプチド帰属精度について、ペプチドプロヘット(PeptideProphet)プログラムを用いて確認した。これは混合モデルであり、検索結果スコアやトリプシン(typtic)末端数等の様々なペプチドの特徴に基づいた正確なペプチド同定の確率を決める期待値最大化評価である。第2のプログラムであるプロテインプロヘット(ProteinProphet)をペプチドをタンパク質によりグループ化し、これらの確率を組み合わせて正しいタンパク質帰属の確率を決めるために用いた。識別能は、これらのNSP値により、またはペプチドグループ化情報および起こり得るマルチヒットのタンパク質の状態を意味する同胞ペプチド数により、個々のペプチドの確率の2次的な再評価で増加する。
本表は、3つの異なる実験にわたって得たERG2についてのカバレージマップを示す。下線部アミノ酸配列は、VCAP細胞からクローン化されたERG1のシリコ翻訳配列に対応する。アミノ酸配列GGAAFIFPNTSVYPEATQRITTRP(配列番号196)は、ERG1に特異的でERG2では欠損しているエクソンに対応している。残りのアミノ酸配列は、3つの実験の各々で同定されたERG2配列に対応している。ERG2をすべての実験におけるバンド1〜5で同定した。これらのバンドの各々で得たERG2についてのペプチド配列を示す。非常に高いカバレージのERG2タンパク質が、3つの実験にわたり観察された。このカバレージマップは、第1の50アミノ酸残基に対応する、クローン化タンパク質のN末端領域におけるペプチドのカバレージが、質量分析カバレージマップにおいてほどんど観察されないことを示した。しかしながら、アミノ酸バリンで始まるペプチドVPQQDWLSQP(配列番号197)はきわめて大量に見られ、したがって、すべての実験において同定された。より詳しい評価は、47番目の位置にあるアミノ酸がメチオニンのフレームにあることを示唆した。複数の実験における47番目のメチオニンの上流(N終端)にあるどのようなペプチドの欠如も、それがERG2のN末端アミノ酸であることを確認している。さらにまた、50番目の位置にあるアルギニン残基の存在により、潜在的なトリプシン切断部位とした。この部位でのトリプシンによる消化は、イオン捕捉質量分析計による同定には小さすぎるより短鎖のN末端ペプチドMSPRや、すべての実験で同定された長鎖C末端ペプチドVPQQDWLSQP(配列番号198)を生じることになる。さらに、ペプチド配列MIQTVPDPAAHI(配列番号199)も単一の実験において非常に低い確率スコアで同定された。これは、NCBIにおいて報告されているように、ERGのN末端にマッピングされる。この配列は、VCAP細胞からクローン化された、異所的に過剰発現されたコンストラクトの一部ではなかった。これは、PHINX細胞において発現されたin vivoのERGより入手できたかもしれず、したがって良性細胞に関連するERGの一部を示しているのかもしれない。
第1のメチオニンは、内在性ERGの翻訳開始部位である。
図20は、内在性および融合ポリペプチドの模式図を示す。
尿試料でのFISH分析
尿から前立腺細胞を分離および調製するため、約30mLの尿を直腸診後に採取する。この後直ちに、15mLのPreservCytを加え、試料を50mLの遠心管中で10分間室温で4000rpmにて遠心分離する。上澄みを廃棄し、ペレットを15mLの0.75MのKCl中に15分間室温で再懸濁し、50mLの遠心管中で10分間室温で4000rpmにて遠心分離する。上澄みを廃棄し、ペレットを10mLの3:1比メタノール:氷酢酸中に再懸濁する。この後、4000rpmで8分間遠心する。上澄みを200μLを除き廃棄し、ペレットを再懸濁する。続いてこの再懸濁したペレットをガラススライドに滴下し、風乾する。ハイブリダイゼーションおよびプローブ調製を上記の実施例2のように、ERG5’/3’およびTMPRSS5’/3’プローブ対で行う。
さらなるETV1遺伝子融合
A.材料および方法
試料および細胞株
前立腺組織は、共にミシガン大学前立腺癌専門優良研究プログラム(S.P.O.R.E.)組織コアの一部である、ミシガン大学の根治的前立腺切除術系列および迅速剖検プログラム1から得たものである。すべての試料を、患者らのインフォームドコンセントおよび事前の研究所審査委員の承認を得て採取した。
定量的PCR(QPCR)を、パワーSYBRグリーンのマスターミックス(Applied Biosystems、Foster City、CA)をApplied Biosystemsの7300リアルタイムPCRシステム上で、文献(Tomlinsら、Cancer Res 66巻、3396〜400頁(2006年);Tomlinsら、Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in prostate cancer. Science 310巻、644〜8頁(2005年))に記載のように用いて行った。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA)により合成されたものであり、表15に列挙されている。HMBSおよびGAPDH5、およびPSA6プライマーは記載の通りである。アンドロゲン刺激反応を4回行い、その他すべての反応を2回行った。
RLM−RACEを、既述のように(Tomlinsら、2005年、上述;Tomlinsら、2006年、上述)、製造業者の使用説明書に従ってジーンレーサーRLM−RACEキット(Invitrogen)を用いて行った。ETV1の5’末端を得るため、第1の鎖のcDNAを、ジーンレーサー5’プライマーおよびETV1 エクソン4−5−rを用いて、プラチナTaqハイフィデリティ(Invitrogen)で増幅した。産物をクローン化し、文献(Tomlinsら、2005年、上述;Tomlinsら、2006年、上述)に記載のように双方向で配列決定した。RLM−RACEされたcDNAは、その他のアッセイに使用しなかった。
ホルマリン固定したパラフィン包理(FFPE)組織切片に対する間期FISHを文献(Tomlinsら、2005年、上述)に記載のように行った。1アッセイにつき少なくとも50の核を評価した。LNCaPおよびMDA−PCa2Bの中期スプレッドを、標準的な細胞遺伝学的手法により調製した。スライドを2倍濃度のSSC中で2分間、70%エタノールで2分間、そして100%エタノールで2分間前処理し、風乾した。スライドおよびプローブを同時に75℃で2分間変性し、一晩37℃でハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後、0.5倍濃度のSSC中42℃で5分間、続いてPBST中で3回洗浄した。蛍光検出を、フルオレセインについては抗ジゴキシゲニン抱合体(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)、Alexa Fluor594(Invitrogen)についてはストレプトアビジンコンジュゲートを用いて行った。スライドを対比染色し、DAPI含有ProLong Gold退色防止試薬(Invitrogen)中においた。スライドをZeissのアキシオイメージャー(Axio Imager)Z1蛍光顕微鏡(Zeiss、Thornwood、NY)で観察し、ISISソフトウェア(Metasystems、Altlussheim、Germany)を利用しCCDカメラで撮像した。BAC(表16に記載)はBACPACリソースセンター(カリフォルニア州オークランド)から入手したものであり、プローブは文献(Tomlinsら、2005年、上述)に記載のように調製した。予め標識された第7染色体セントロメアおよび7pテロメアプローブはVysis(Des Plaines、IL)から入手したものである。すべてのプローブについて、完全性および正確な局在化を正常な末梢リンパ球の中期スプレッドとのハイブリダイゼーションにより確認した。
14q13〜q21における5’融合パートナーと遺伝子の組織特異的発現を決定するため、29の異なる種類の630の腫瘍から得た発現プロファイルからなる、国際ゲノムコンソーシアムのexpOデータセットをOncomineデータベースを利用して用いた。市販のアレイプラットフォームではモニターされない、HERV−K_22q11.23の発現を調べるため、リンクスセラピューティクス社(Lynx Theraputics)の正常組織MPSS(massively parallel signature sequencing)データセット(GSE1747)に対するクエリーを文献(Staufferら、Cancer Immun 4巻、2頁(2004年))に記載のように、HERV−K_22ql1.23を明確に同定するMPSSタグ「GATCTTTGTGACCTACT」(配列番号308)を用いて行った。expOデータセットより得た腫瘍型の記述およびMPSSデータセットより得た正常な組織型を表17に示す。
LNCaP、C4−2B、RWPE−ETV1およびRWPE−GUS細胞の発現プロファイリングをアジレント社の全ヒトゲノムオリゴマイクロアレイ(Santa Clara、CA)を利用して行った。トリゾールを用いて単離した総RNAをQiagenのRNAeasyマイクロキット(Valencia、CA)を用いて精製した。1μgの総RNAをcRNAに転換し、製造業者のプロトコール(Agilent)に従って標識した。ハイブリダイゼーションを65℃で16時間行い、およびアレイをAgilentDNAマイクロアレイスキャナーでスキャンした。画像を分析し、線形およびLowess標準化を各アレイに対して実施して、データをAgilentの特性抽出ソフト9.1.3.1を利用して抽出した。LNCaPおよびC4−2Bハイブリダイゼーションについては、各細胞株に対する標準をプール良性前立腺総RNA(Clontech、Mountain View、CA)とした。各細胞株についてダイフリップも行った。特性を色素フリップの補正後の2つのC4−2Bアレイにおける平均発現で割った2つのLNCaPアレイにおける平均発現(対数比)で順位付けした。RWPE細胞については、4つのハイブリダイゼーションを行った(複製RWPE−ETV1/RWPE−GUSおよびRWPE−GUS/RWPE−ETV1ハイブリダイゼーション)。過剰および過小発現したシグネチャーを、すべての4つのハイブリダイゼーションで顕著な異なる発現差異(P値対数比<0.01)と、ダイフリップに対する補正後に2倍平均過剰または過小発現(対数比)を有する特性のみを含むようにフィルタリングして作製した。
LNCaP、VCaP、プールした正常なヒト雄DNA(Promega、Madison、WI)、および正常な胎盤DNA(Promega)由来のゲノムDNA(10μg)を、EcoRIまたはPstI New England Biologicals、Ipswich、MA)で一晩消化した。断片を0.8%アガロースゲル上40Vで一晩分離し、ハイボンドNXナイロン膜に移し、予備ハイブリダイゼーションして、プローブとハイブリダイゼーションし、標準的なプロトコールに従って洗浄した。FISHにより関連付けられたchr7の領域にまたがる一連の22プローブ(RP11−313C20とRP11−703A4との間)を、プールした正常なヒト雄ゲノムDNA(表15)上でプラチナTaqハイフィデリティを用いてPCR増幅により作製した。各プローブ25ngをdCTP−P32で標識し、ハイブリダイゼーションに用いた。
LNCaP細胞におけるETV1区切り点を同定するため、サザンブロット法により同定した再配列に基づく逆PCR法を用いた。野生型の配列由来の逆相補配列であり、プライマーB1、B2、B3と異なる、プライマーA1、A2、A3を、PstIで消化および再連結した(分子内結合を促進するため)LNCaPゲノムDNA鋳型に対する逆PCRに用いた。ネステッドPCRを、以下のプライマー組の順で実施した。すなわち、A1−B1、A2−B2、およびA3−B3。エキスパンド20kb plus PCRシステム(Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany)を、製造業者の指示に従い、融合産物の増幅に用いた。このネステッドPCRで観察された濃縮3KbバンドをpCR8/GW/TOPO(Invitrogen)にクローン化し、ミニプレップDNAを挿入断片についてスクリーニングし、陽性クローンを配列決定した(ミシガン大学DNA配列決定コア、Ann Arbor、MI)。その後、融合特異性プライマーを用いたプラチナTaqハイフィデリティにより、融合物をPCRにより確認した(表15)。
ETV1の既報の停止コドンに対するTMPRSS2:ETV1融合物(269−1521、NM_004956.3)に存在する、ETV1のcDNAをMET264からRT−PCRで増幅して、GatewayエントリーベクターpCR8/GW/TOPO(Invitrogen)にTOPOクローン化し、pCR8−ETV1を得た。アデノウイルスおよびレンチウイルスのコンストラクトを作製するため、pCR8−ETV1および対照エントリークローン(pENTR−GUS)をそれぞれpAD/CMV/V5(Invitrogen)とpLenti6/CMV/V5(Invitrogen)と、LRクロナーゼII(Invitrogen)を用いて組換えた。対照pAD/CMV/LACZクローンをInvitrogenから入手した。アデノウイルスおよびレンチウイルスは、ミシガン大学ベクターコアにより作製されたものである。この良性不死化前立腺細胞株RWPEをETV1またはGUSを発現するレンチウイルスに感染させ、安定なクローンをブラストサイジン(Invitrogen)を用いた選択により作製した。初代PrEC細胞では安定な系統を作製できないので、良性PrECをETV1またはLACZを発現するアデノウイルスに感染させた。細胞数を、細胞のトリプシン処理および記載の時点で3回コールターカウンターで分析することで概算した。侵襲アッセイについては、同数のPREC−ETV1および−LACZ(感染後48時間)または安定なRPWE−ETV1および−GUS細胞を、化学誘引物質として下側チャンバーにはウシ胎児血清を加えた、24ウェル培養プレートのインサート内にある基底膜マトリックス(EC matrix、Chemicon、Temecula、CA)上に播種した。48時間後、非侵襲性細胞およびECマトリックスを綿棒で除去した。感染細胞をクリスタルバイオレットで染色し、写真撮像した。これらのインサートを10%酢酸で処理し、吸収を560nmで測定した。
LNCaP細胞におけるETV1のsiRNAノックダウンについて、ダーマコン社のETV1用SMARTpool(MU−003801−01、Chicago、IL)を構成する個々のsiRNAを、qPCRによりETV1ノックダウンについて試験し、最も効果的な一本鎖siRNA(D−003801−05)をさらなる実験に用いた。siCONTROL非標的siRNA#1(D−001210−01)またはETV1に対するsiRNAを、オリゴフェクタミン(Invitrogen)を用いてLNCaP細胞にトランスフェクトした。24時間後、2回目の同一トランスフェクションを実行し、24時間後に以下に記載するようなRNAおよび侵襲アッセイのために細胞を回収した。LNCaP細胞におけるETV1のshRNAノックダウンについては、pMS2レトロウイルスベクター由来のETV1に対するshRNAmirコンストラクト(V2HS_61929、Open Biosystems、Huntsville、AL)を、製造業者のプロトコールに従ってpGIPZレンチウイルス空ベクター(RHS4349、Open Biosystems)にクローン化した。ETV1のshRNAmirを有するpGIPZレンチウイルスまたは非発現抑制対照(RHS4346)は、ミシガン大学ベクターコアにより作製されたものである。LNCaP細胞をレンチウイルスに感染させ、48時間後に細胞を以下に記載するように侵襲アッセイに用いた。6つの独立した実験の代表的な結果を示す。
同じ数の記載の細胞を、ウシ胎児血清を化学誘引物質として下側のチャンバーに添加した24ウェル培養プレートのインサート内にある基底膜マトリックス(ECマトリックス、Chemicon、Temecula、CA)上に播種した。48時間後、非侵襲細胞およびECマトリックスを綿棒で除去した。感染細胞をクリスタルバイオレットで染色し、写真撮像した。これらのインサートを10%酢酸で処理し、吸収を560nmで測定した。
RWPE−ETV1およびRWPE−GUS細胞を、細胞周期の特特徴付けについてFACSで評価した。細胞を2倍濃度のPBSで洗浄し、およそ2×106細胞を70%エタノール中に固定する前にPBS中に再懸濁した。沈渣の細胞を洗浄し、RNase(100μg/mL最終濃度)およびヨウ化プロピジウム(10μg/mL最終濃度)で30分間37℃で処理した。染色細胞をFACSDiviaを利用してLSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences、San Jose、CA)で分析し、および細胞周期の段階をModFit LT(Verity Software House、Topsham、ME)を用いて計算した。
正常培地の低融点アガロースの0.6%(質量/体積)の下層を、6ウェル培養プレート中で調製した。一番上に、1×104RWPE−GUS、RWPE−ETV1、またはDU145(陽性対照)細胞を含有する0.3%アガロースの層を入れた。12日後、病巣をクリスタルバイオレットで染色しカウントした。
細胞を、50mMのTris−HCl(pH7.4)、1%NP40(Sigma、St.Louis、MO)、および完全プロテアーゼ阻害剤混合物(Roche)を含むNP40溶解緩衝液中でホモジナイズした。15μgのタンパク質抽出物をSDS試料緩衝液と混合し、10%SDS−ポリアクリルアミドゲル上で還元条件下で電気泳動させた。これらの分離したタンパク質を、ニトロセルロース膜(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)上に移した。この膜を、ブロッキング用緩衝液[0.1%ツイーン(TBS−T)および5%脱脂乾燥乳を含有するトリス緩衝生理食塩水]中で1時間インキュベートした。一次抗体を、ブロッキング用緩衝液中一晩4℃で、記載の希釈率で適用した。TBS−T緩衝液で3回洗浄後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたロバ抗マウスIgG抗体(Amersham Pharmacia Biotech)で、1:5,000希釈で1時間室温にてインキュベートした。これらのシグナルを、改良型化学発光検出システム(Amersham Pharmacia Biotech)および放射線写真法で描出した。
ETV1のin vivoでの過剰発現について、C末端3XFLAG−エピトープタグをつけたコンストラクトを、停止コドンの前で3×FLAGタグをコードするリバースプライマーと、pCR8−ETV1を鋳型として用いて、PCRにより作製した。この産物をpCR8にTOPOクローン化した。前立腺特異的ETV1遺伝子導入コンストラクトを作製するため、3倍濃度のFLAG−ETV1を、改変低分子複合プロバシンプロモーター(ARR2PB)の下流およびウシ成長ホルモンpolyA部位(PA−BGH)の上流で、pBSII(Stratagene、La Jolla、CA)に挿入した。ARR2PB配列は、本来のプロバシン配列PB(−426/+28)とさらに2つのアンドロゲン応答エレメントを有する。このコンストラクトを配列決定し、FVBマウス卵への微量注入の前の一過性トランスフェクトの際にLNCaP細胞におけるアンドロゲンによるプロモーター誘導能を試験した。ARR2PB−ETV1プラスミドをPvuI/KpnI//SacIIで直線化し、受精FVBマウス卵に微量注入し、ミシガン大学遺伝子導入動物モデルコアにより、偽妊娠の雌に手術で移植した。遺伝子導入初代動物を、切り取った尾から単離したゲノムDNAを用いてPCRによりスクリーニングした。遺伝子導入ARR2PB−ETV1初代動物を、FVBマウスと交配し、導入遺伝子陽性雄マウス子孫を様々な時点で屠殺した。トランスジェニックマウス由来の前立腺をNikonの切開用顕微鏡を用いて切開し、10%緩衝ホルマリンに固定し、パラフィン中に包理した。5μmの切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、3人の病理学者により、ヒト癌コンソーシアム前立腺病理委員会のマウスモデルに関するバーハーバーミーティングのコンセンサスレポートに従って評価した(Namら、Cancer Biol Ther 6巻(2007年))。
B.結果
前立腺癌における新規5’ETS融合パートナーの同定
qPCRにより、前立腺組織試料の2つのコホートを、ETV1の例外発現を有する症例を同定するために、ERGとETV1の発現についてスクリーニングした。図38aに示すように、これら2つのコホートにわたり、54の局在化した前立腺癌試料のうち26および3試料が、それぞれERG(48%)およびETV1(5.5%)例外発現を示した。さらにまた、2つのホルモン抵抗性転移性前立腺癌試料であるMET26およびMET23は、ETV1例外発現を示した。qPCRにより、ERGの例外発現を有する、26の局在化した試料中の25試料(96%)が、TMPRSS2:ERG融合転写産物を発現した。MET26を除き、4つのETV1例外(PCa_ETV1_1〜3およびMET23)を含むいずれの試料も、TMPRSS2:ETV1融合転写産物を発現しなかった。
HERV−K_22q11.23:ETV1、SLC45A3:ETV1、およびC15ORF21:ETV1融合物は、5’パートナー由来の予測翻訳配列を含まず、HNRPA2B1:ETV1融合物におけるHNRPA2B1配列は、融合タンパク質に対して2つの残基のみが寄与する。したがって、5’パートナーのプロモーターエレメントは、おそらくこれらの症例における異常ETV1発現を誘発するので、これらの遺伝子の組織特異性およびアンドロゲン制御が特徴付けられた。SLC45A3、C15ORF21、およびHNRPA2B1の組織特異性を調べるため、29の異なる種類の630の腫瘍から得た発現プロファイルからなる国際ゲノムコンソーシアムexpOデータセットをOncomineデータベースを用いて検索した(Rhodesら、Neoplasia 9巻、166〜80頁(2007年))。TMPRSS2と同様に、SLC45A3は、その他すべての腫瘍型(メジアン=0.33、P=2.4E−7)と比較して、前立腺癌において著しい過剰発現(メジアン=2.45、1つのアレイ当たりのメジアンを超える標準偏差)を示した。C15ORF21は、前立腺癌において同様の過剰発現を示した(メジアン=2.06対−0.12、P=3.4E−6)。一方、HNRPA2B1は、前立腺およびその他の腫瘍型で高発現を示した(メジアン=2.36対2.41、P>0.05)(図38d)。HERV−K_22q11.23をexpOデータセットで用いたDNAマイクロアレイでモニターしていないにもかかわらず、Staufferら(Cancer Immun 4巻、2頁(2004年))が記載するように、MPSSにより明確に測定される。したがって、HERV−K_22q11.23の発現を、31のその他の正常な組織(メジアン=100万あたり9個の転写産物)と比較して、HERV−K_22q11.23が正常な前立腺組織において最高レベルで発現(100万あたり94個の転写産物)した、32の正常な組織型(Jongeneelら、Genome Res 15巻、1007〜14頁(2005年))からのプロファイルを含むリンクス治療法MPSSデータセット中で検索した(図38d)。
5’パートナーがコード配列をETV1転写産物に与えないので、臨床的試料および前立腺癌細胞株における異なるクラスのETV1再配列についての共通の結果は、切断されたETV1の異常過剰発現である。したがって、この現象は、前立腺癌における異常ETSファミリーメンバー発現の役割を決定するために、in vitroおよびin vivoで繰り返された。アデノウイルスおよびレンチウイルスコンストラクトは、指標のTMPRSS2:ETV1融合物が陽性の症例、MET26(ETV1のエクソン4から始まってETV1の終始コドンまで)で表されるようにETV1を過剰発現するようにデザインされている(図41a)。良性不死化前立腺上皮細胞株RWPEをETV1を発現するレンチウイルスに感染させ、安定なRWPE−ETV1細胞を選択し、ETV1を発現するアデノウイルスによる感染により、原発性良性前立腺上皮細胞株PrECにおいてETV1を一時的に過剰発現した。RWPEおよびPrEC細胞の両者において、ETV1の過剰発現は、増殖に対して検出可能な効果はなく(図44a〜b)、細胞周期分析は、S期におけるRWPE−ETV1とRWPE−GUS細胞の割合に何の差異も示さなかった(図44c)。さらにまた、軟寒天形質転換アッセイでは、ETV1過剰発現がRWPE細胞を形質転換するには十分でないことが示された(図44d)。
次に、in vivoでのETV1過剰発現の効果を、アンドロゲン制御下で前立腺において排他的に強力な導入遺伝子発現を誘発する、改変プロバシンプロモーター(ARR2Pb−ETV1)の制御下にあるFLAGタグの付いた切断されたバージョンのETV1(図41a)を発現するトランスジェニックマウスを用いて調べた(Ellwood−Yenら、Cancer Cell 4巻、223〜38頁(2003年))。この導入遺伝子は、ヒト前立腺癌において同定されたETV1のアンドロゲン誘導遺伝子融合物に機能的に類似している(すなわち、TMPRSS2:ETV1、SLC45A3:ETV1、およびHERV−K_22q11.23:ETV1)。複数のARR2Pb−ETV1初代動物を入手し、表現型分析に展開した。12〜14週齢の、ARR2Pb−ETV1トランスジェニックマウス8匹中6匹(75%)がマウス前立腺上皮内腫瘍(mPIN)を発症した(表18および図42)。mPINの定義に従い、層形成、高色素血および肥大核小体を含む核異型を示す、ARR2Pb−ETV1マウスの前立腺における正常な腺内に含まれる局所性増殖病変を観察した(図42a〜f)。mPINは、ARR2Pb−ETV1マウスのすべての3つの前立腺葉(前側、腹側、および背外側)で観察され、腹側葉で最もよく見られた(7/11、63.6%)(表18)。免疫組織化学的検査により、強度のETV1−FLAG発現が、ARR2Pb−ETV1マウスの良性腺ではなく、排他的にmPIN病巣で観察され(図48)、qPCRは、導入遺伝子発現が前立腺に限定されるものであることを確認した。
(実施例20)
ETV5遺伝子融合物
本実施例では、TMPRSS2:ETV5およびSLC45A3:ETV5遺伝子融合物の同定を記載する。SYBRグリーンQPCRによるETV5例外発現の検出には、以下のプライマー対:
ETV5_エクソン13−f:5’−CCGAAGGCTTTGCTTACTAAGTTTCTGA−3’(配列番号416)
ETV5_エクソン13−r:5’−CACTGCCCTTGTTTGCCTGAATG−3’(配列番号417)
を用いた。
ETV5_エクソン6−r:5’−AGCTCCCGTTTGATCTTGGTTGG−3’(配列番号418)
を用いた。
ETV5_エクソン11−r:5’−CATGGTAGGCTCCTGTTTGACTTTG−3’(配列番号419)
を用いた。
さらなるERG、ETV1およびETV4遺伝子融合物
ETS転写因子であるERG、ETV1、ETV4またはETV5を伴う再発性遺伝子融合物は、40〜70%の前立腺癌において同定されている。包括的な間期インサイチュハイブリダイゼーション(FITH)分断プローブストラテジーを用いて、110の臨床的に局在化された前立腺癌患者のコホートにおいて、全27のETSファミリーメンバーおよびそれらの5つの公知の5’融合パートナーを調べた。この包括的FISHスクリーニングに基づいて、4つの注目すべき観察がなされた。第1に、大部分の前立腺癌(44%)をETS遺伝子融合物に帰することができない。第2に、SLC45A3は、ERGの5’融合パートナーである;以前は、TMPRSS2が唯一の報告されたERGの5’パートナーであった。第3に、2つの前立腺特異的なアンドロゲン誘導遺伝子であるFLJ35294およびCANT1は、それぞれETV1およびETV4に対する5’パートナーである。第4に、普遍的に発現するアンドロゲン非感受性遺伝子であるDDX5をETV4とフレームを合わせて融合させ、DDX5:ETV4融合タンパク質の発現を導く。
治験対象母集団、臨床的データ、および組織マイクロアレイ(TMA)の収集
ミシガン大学病院で2004から2006年までの初期治療として根治的前立腺切除術を受けた110人の臨床的に局在化した前立腺癌の患者を示すTMAを構築した。コア(直径0.6mm)を各代表腫瘍病巣から取り出し、病理学者によって形態を確認した。詳細な臨床的、病理学的、およびTMAデータは、既述の確実な関連データベースに保存されている(参照により全体として本明細書に援用されるMehraら、Mod Pathol. 2007年;20巻(5号):538〜44頁)。表19に患者の情報を示す。この根治的前立腺切除シリーズは、ミシガン大学の前立腺癌専門優良研究プログラムの組織コアの一部であった。
間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)およびFISHに基づくスクリーニングストラテジー
従来の有効なFISHに基づく分断プローブストラテジーを利用して、前立腺癌における公知および新規な遺伝子異常を調べた(参照により全体として本明細書に援用されるTomlinsら、Nature 2007年;448巻(7153号)):595〜9頁;Tomlinsら、Cancer Res 2006年;66巻(7号):3396〜400頁;Tomlinsら、Science 2005年;310巻(5748号):644〜8頁)。細菌人工染色体(BAC)(表20に列挙)をBACPACリソースセンター(カリフォルニア州オークランド)から得て、プローブを調製した。
すべてのプローブの完全性および正確な局在化を正常な末梢リンパ球の中期スプレッドに対するハイブリダイゼーションによって検証した。スライドをイメージングZ1顕微鏡(カールツァイス社、独国オーバーコッヘン)を用いて調べた。形態学的に無傷のおよび非オーバーラップ核の状態で、FISHシグナルを病理学者により手作業で評価し(100×油浸)、各部位から最小数50個の癌細胞を記録した。非常に弱いかまたはシグナルのない癌部位は、不十分なハイブリダイゼーションとして報告した。全3つのコアにおいて腫瘍組織を含まない症例を排除した。
アンドロゲン感受性前立腺癌細胞株であるLnCaPを10%FBS含有のRPMIに維持した。アンドロゲン刺激実験について、活性炭処理された5%FCSを補足したフェノールレッド不含RPMI中に細胞を2日間置き、その後、以下の時点0、3、12、24、および48時間で、1%エタノールまたは10nMのR1881で処理した。アンドロゲンで細胞を16時間処理し、クロマチン免疫沈降(ChIP)分析のために架橋した。製造業者の使用説明書に従って、総RNAをトリゾール(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いて単離した。
Q−PCRを標準的なプロトコールに従って行った。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーをIntegrated DNA Technologies(Coralville、IA)によって合成し、表21に列挙する。
ハウスキーピング遺伝子GAPDHのmRNAレベルによって試料を標準化した。アンドロゲン刺激反応を3点測定で行い、他のすべての反応を2点測定で行った。
前立腺癌における異常ETS遺伝子の未知の5’パートナーを同定するためにRLM−RACEを行った。製造業者の使用説明書によるタッチダウンPCRプロトコールにより、遺伝子特異的リバースプライマーETV1_エクソン4−5r、ETV4_エクソン7rおよび5’遺伝子レーサープライマー(Invitrogen)を用いて、プラチナTaqハイフィデリティ酵素(Invitrogen)により第1鎖のcDNAを増幅した。PCR増幅産物をpCR4−TOPO TAベクター(Invitrogen)にクローニングし、記述したベクタープライマーを用いて双方向に配列決定した。
ホルモン枯渇細胞をR1881またはエタノール処理を施した後に、5μgの抗アンドロゲン受容体(AR)抗体(Upstate、Lake Placid、NY)を16時間用いて、ChIP実験を以前に記載される(参照により全体として本明細書に援用されるYuら、Cancer Cell 2007年;12巻(5号):419〜31頁)ように行った。インプット全細胞抽出DNAおよびChIPに富んだDNAを連結媒介性PCRによって増幅し、標的プロモーターのqPCR評価に供した。ChIPエンリッチメントをインプットDNAの割合として評価した。
5’融合パートナーの組織特異的発現を決定するために、Oncomineデータベースを用いて、国際ゲノムコンソーシアムのexpOデータセットを調べ、これは29の異なるタイプの630個の腫瘍由来の発現プロファイルからなっていた。
全長DDX5−ETV4融合cDNAを、症例85番の5’RLM−RACE生産物を用いて、コザック配列−FLAタグ−開始コドン−DDX5 N末端ヌクレオチド配列(5’−CACC−ATG−GATTACAAGGATGACGACGATAAGTCGGGTTATTCGAGTGACCGAGACCGCGGC−3’;配列番号438)を含む5’プライマーと終止コドンまでのETV4のC末端ヌクレオチドに対応する3’プライマー(CTAGTAAGAGTAGCCACCCTTGGGGCCA;配列番号439)により、ゲートウェイ(Gateway)クローニングシステムエントリーベクターpENTR−D−TOPO(Invitrogen)にクローニングした。LRクロナーゼII(Invitrogen)を用いて、pENTR−D−Topo−DDX5−ETV4をpCDNA3.2−DESTベクター(Invitrogen)に組み換えることによって発現構築物を生じさせた。FuGENE6トランスフェクション試薬(Roche)を用いて、ヒト胚腎臓(HEK)293細胞をpCDN3.2−FLAG−DDX5−ETV4発現構築物で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞由来の溶解物をSDS−PAGEで分離し、ポリ二フッ化ビニリデンメンブレン(GE Healthcare)上に転写した。このメンブレンをブロッキング緩衝液[トリス緩衝化生理食塩水、0.1%ツイーン(TBS−T)、5%脱脂粉乳]中で1時間インキュベートし、1:1000に希釈したFLAGタグに対するウサギポリクローナル抗体(Cell Signaling Technology)と共に一晩4℃でインキュベートした。TBS−Tによる洗浄後、このブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした二次抗体と共にインキュベートし、製造業者(GE Healthcare)によって説明されるように増強ケミルミネッセンスシステムによってシグナルを視覚化した。ローディングが等しいことを確認するために、ブロットをGAPDH(Abeam)を用いてブロットを再精査した。前立腺組織溶解物をETV4ポリクローナル抗体(Abnova)を用いた免疫ブロットによって同様に処理した。
前立腺癌における全27のETSファミリー遺伝子、および全5つの公知の5’融合パートナーの再配列状態の包括的プロファイルを、臨床的に局在化された前立腺癌の110症例から構成されたTMAに関するFISH分断プローブハイブリダイゼーションを用いて作製した(図54)。
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- 明細書に記載の発明。
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