JP2015093867A

JP2015093867A - 新規な静菌または抗菌剤

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Publication number: JP2015093867A
Application number: JP2013236176A
Authority: JP
Inventors: 寛司上西; Kanji Uenishi; 洋副島; Hiroshi Soejima; 祐子真木; Yuko Maki; 民二杉山; Tamiji Sugiyama
Original assignee: Snow Brand Seed Co Ltd; Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Seed Co Ltd; Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2015-05-18
Anticipated expiration: 2033-11-14
Also published as: JP6162579B2

Abstract

【課題】病原性菌に対して効果のある食品由来の静菌または抗菌性物質、ならびにそれを有効成分とする植物病原菌抑制剤、ヒトや家畜等の感染症予防剤を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明は、シクロヘキサンカルボン酸にアミノ酸がアミド結合した化合物およびその塩を有効成分とする新規な静菌または抗菌剤であり、前記化合物は、式（１）で表される化合物である。
【化１】

ここで、Rは中性または酸性のアミノ酸側鎖を示す。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規な静菌または抗菌剤に関する。また、当該静菌または抗菌剤を含有することを特徴とする植物病原菌防除剤、飲食品、栄養組成物または、飼料等に関する。

野菜などの植物に発生する病気には多様な病原性細菌が関与していることが知られており、病原菌としてシュードモナス属、キサントモナス属、エルビニア属、アグロバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ストレプトマイセス属、スピロプラスマ属のほかマイコプラスマ様細菌などが報告されている。特に、わが国で問題となるイネの細菌病には褐条病菌(Pseudomonas.syringae)、籾枯病菌(Pseudomonas.glumae)、葉鞘褐変病菌(Pseudomonas.marginalis)及び白葉枯病菌(Xanthomonas campestris pv.orizae)が関与しているといわれている。これらを防除するための農薬はあるが、たとえば収穫直前のブロッコリーの花蕾のように化学合成農薬を散布すると残留が問題となる場合などについては依然として防除する手立てが無い。よって、これらの病原菌を抑制する食品由来の静菌または抗菌性物質があれば、散布後もそのまま摂食することが可能であり、残留による健康への影響も無いため、有機農業にも活用することができると考えられる。そのため、植物病原性菌に対して効果のある食品由来の静菌または抗菌性物質の出現が望まれている。

一方、畜産分野において、家畜の感染症予防・治療に用いられる抗生物質量はヒトへの使用量の２倍以上と言われており、多薬耐性菌の出現などの問題が深刻化している。そのため、抗生物質を可能な限り使用せずに飼育することが強く望まれており、病原性菌に対して効果のある食品由来の静菌または抗菌性物質があれば、飼料に加えて投与することにより感染症を予防し、安心、安全かつ経済的な家畜の飼育が可能となる。

乳中には多数のタンパク性抗菌物質が含まれていることが知られており、例えば、乳性ホエータンパク質と水溶性銀化合物を混和した繊維の抗菌加工方法（特許文献１）、病原菌に対する抗体を含む乳を用いた感染症予防食品添加用組成物（特許文献２）、動物の血液及び乳汁中のグロブリン含有物を抗菌剤として利用した豚用飼料（特許文献３）等が開示されている。また、ニューロキノン系抗菌剤と乳由来ラクトフェリン類の加水分解物またはラクトフェリン類の加水分解物由来の抗菌性ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤（特許文献４）、水不溶性銀含有乳清蛋白質加水分解物の製造法（特許文献５）等も開示されている。更に、乳タンパク質以外の抗菌成分として、ホエー由来の遊離脂肪酸、主に酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸及びラウリン酸の一つ又は複数から選ばれる遊離脂肪酸で構成される抗菌性組成物（特許文献６）も開示されている。

特開２００７−４６２０８号公報特開２００８−２２７０４号公報特開昭６１−１３２１４３号公報特開平１１−９２３７５号公報特開２００５−２６９９２５号公報特表２０１１−５０５４１５号公報

上述したように、乳タンパク質、脂肪酸の抗菌性については報告があるものの、特許文献１〜６については、用いる原料や製造工程が煩雑であることや、十分な効果が得られないこと等の様々な問題が認められる。
また、特許文献４に記載されるラクトフェリン等の乳中の抗菌性タンパク質は、分子量が２０，０００Ｄａ以上と大きいので、本発明の静菌または抗菌性成分とは異なる物質である。
また、特許文献５では、乳タンパク質の加水分解物を抗菌剤として用いているが、乳成分単独の効果ではなく、さらに乳成分を加水分解する工程を有するため製造工程が煩雑である等の問題が認められる。
さらに、特許文献６の遊離脂肪酸の抗菌剤は、乳化剤として乳タンパク等が必要なこと、遊離脂肪酸の乳化組成物はそれらの合同融点未満の温度ではほとんどまたは全く抗菌効力を持たないことが開示されており、これらの点から実用化においては問題点が多い。
一方で、乳タンパク質、脂肪酸以外の低分子物質の静菌または抗菌性については全く報告がされていない。また、乳やホエーの限外ろ過パーミエイトについて静菌または抗菌性の効果を有する報告はなされていない。

よって、本発明は、乳またはホエーに含まれる低分子画分の有効利用を目的とし、乳またはホエーよりの低分子画分を探索することにより静菌または抗菌効果のある物質を取得することを課題とする。また、それを有効成分とする植物病原菌抑制剤、ヒトや家畜等の感染症予防剤を提供することを課題とする。

前記課題を解決すべく、鋭意検討した所、本発明者らは、ホエーの限外ろ過パーミエイトを更に分画した分画物に、土壌細菌に対する高い静菌または抗菌活性があることを見出した。さらに、当該分画物より、植物病原性細菌や食中毒細菌などに対して静菌または抗菌活性がある化合物を分離・同定することに成功した。
即ち本発明は下記の通りである。
[１]シクロヘキサンカルボン酸とアミノ酸がアミド結合した化合物および／またはその塩を有効成分とする静菌または抗菌剤。
[２]シクロヘキサンカルボン酸とアミノ酸のアミド結合した化合物が、下記式（１）で表される化合物である前記[１]に記載の静菌または抗菌剤。

ここで、Rは中性または酸性のアミノ酸側鎖を示す。
[３]アミノ酸が、グリシン、アラニン、セリンのいずれかである前記[２]に記載の静菌または抗菌剤。
[４]乳抽出物からなる前記[１]〜[３]のいずれかに記載の静菌または抗菌剤。
[５]ホエー抽出物からなる前記[１]〜[３]のいずれかに記載の静菌または抗菌剤。
[６]前記静菌または抗菌の対象とする微生物が、Escherichia属、シュードモナス属のいずれかである前記[１]〜[４]のいずれかに記載の静菌または抗菌剤。
[７]前記静菌または抗菌の対象とする微生物が大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナスアエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナスフルオレッセンス（Pseudomonas fluoressence）のいずれかであることを特徴とする前記[５]に記載の静菌または抗菌剤。
[８]前記[１]〜[５]のいずれかに記載の静菌または抗菌剤を含有することを特徴とする植物病原菌防除剤。
[９]前記[１]〜[５]のいずれかに記載の静菌または抗菌剤を含有することを特徴とする飲食品、栄養組成物または飼料。

本発明により得られる化合物は、静菌剤または抗菌剤として有用である。また、本発明の化合物を含む、乳またはホエー由来成分を有効成分とする静菌または抗菌剤を提供することができる。これらの静菌または抗菌剤は食品由来の天然物であり、ブロッコリーの花蕾等の農薬を散布できない野菜に対して用いることができるほか、土壌散布によっても植物病原菌を抑制することが可能である。さらには、ヒトや家畜動物等で問題となる病原性大腸菌等に対して効果が期待できるため、安全な腸内病原菌の抑制剤としても利用できる。

実施例１で得られた化合物の高速液体クロマトグラフィーによるクロマトグラムを示した図である（実施例２）。実施例１で得られた化合物の吸収スペクトルを示した図である（実施例２）。実施例１で得られた化合物のＥＳＩ−ＦＴ−ＭＳスペクトルを示した図である（実施例２）。

以下、本発明の化合物及びその製造方法について説明する。
本発明の静菌又は抗菌剤は、例えば、工業的にホエーやホエーの限外ろ過パーミエイト等から分画することが可能であり、乳副産物の付加価値を向上し、有効に活用することが可能となる。このような処理により得られた本発明の静菌又は抗菌性物質は、食品由来の天然物であり、ブロッコリーの花蕾などの農薬を散布できない野菜に対しても使用できるほか、土壌散布によっても植物病原菌を抑制することが可能である。更には、ヒトや家畜動物などで問題となる病原性大腸菌などに対して抑制効果が期待できるため、安全な腸内病原菌の抑制剤としても利用できる。さらに、本発明の静菌又は抗菌性物質をアミノ酸とシクロヘキサンカルボン酸から合成した場合においても、同様に用いることができる。

本発明において使用する原料としては、生乳や脱脂乳等の乳又は、ホエーなど用いることができる。例えば乳であれば、入手が容易である牛乳が適当であるが、多量に入手が可能であれば人乳、ヤギ乳、羊乳などの乳であってもかまわないし、液状でもよいし、粉末化したものを還元して用いてもかまわない。ホエーであれば、酸や乳酸菌で分離した酸ホエーでも良いし、レンネットを用いたチーズ製造時に二次的に生成するホエーであっても良く、液状でもよいし、粉末化したものを還元して用いてもかまわない。脱脂乳からミルクタンパク質コンセントレート（ＭＰＣ）を製造する際に副産物として生成する限外ろ過パーミエイトを用いても良い。副産物の有効利用という観点から、ホエーやその限外ろ過パーミエイトなどを使用することが望ましい。

乳またはホエーより脂肪を除く場合には、例えばクリームセパレーターなど用いて遠心分離により除去することができる。
乳またはホエーよりタンパク質成分を除く場合には、限外ろ過フィルターを用いることもできるし、溶液中の塩濃度を高めて析出させる（塩析）こともできる。限外ろ過フィルターとしては、乳またはホエー中のタンパク質成分を除去できればどのようなものでもかまわないが、乳タンパク質のサイズや除去効率を考慮すると、３，０００から２０，０００Ｄａの範囲内の分画分子量を有する限外濾過膜が適当である。

本発明の静菌又は抗菌剤の分離・精製には、有機溶媒による抽出や、合成吸着樹脂やシリカゲルなどを用いたカラムクロマトグラフィーを併用して用いることができる。例えば、タンパク質・脂質を除去したホエーの限外ろ過パーミエイトを合成樹脂であるＤＩＡＩＯＮ(登録商標) ＨＰ２０（三菱化学製）に供し、蒸留水で洗浄後、５０％のエタノール溶液で溶出する。エバポレーターで乾固した後、蒸留水に再溶解し、水酸化ナトリウム（和光純薬製）にてpＨ８．０に調整後、酢酸エチル（和光純薬製）で溶媒抽出を行う。水相を回収し、塩酸（和光純薬製）にてｐＨ２．５に調整した後、酢酸エチルで溶媒抽出を行う。酢酸エチル相を回収してエバポレーターで乾固後、蒸留水に再溶解し、本発明の静菌又は抗菌性物質を含む粗画分（ＡＥ画分）を得ることができる。

更に上記静菌又は抗菌性物質を精製するため、高速液体クロマトグラフィーなどを用いて上記静菌又は抗菌性物質の分画を行うことができる。例えば、逆相カラムを用い、移動相には酢酸やトリフルオロ酢酸、ギ酸などで酸性化した含水メタノールや含水アセトニトリルなどを使用し、それらを組み合わせて分画することで本発明の静菌又は抗菌性物質のみを精製することが可能である。本発明の静菌又は抗菌性物質を含む画分を選択するためには、高速液体クロマトグラフィーで分取した画分を乾固し、５０％エタノールに溶解後、病原菌に対する抗菌試験を実施して抗菌性を示した画分を選択する。例えば滅菌したペーパーディスク（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）に分画物を５０μl吸収させ、病原菌を塗布した標準寒天培地（パールコア標準寒天培地、栄研化学製）上に等間隔に並べる。病原菌の至適条件で培養後、ペーパーディクス周辺で菌の生育を阻害している範囲（阻止円）の大きさでその抗菌性の有無を判断することができる。

上記方法などにより得られた本発明の静菌又は抗菌剤の本体は、シクロヘキサンカルボン酸とアミノ酸がアミド結合した化合物であり、具体的には、例えば以下の式（１）で表される化合物である。

ここで、上記式（１）のＲは、中性または酸性のアミノ酸側鎖を示し、酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸、中性アミノ酸としてはグリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン、セリン・トレオニン、システイン・メチオニン、アスパラギン・グルタミン、プロリン、フェニルアラニン・チロシン・トリプトファンなどを挙げることができるが特に限定されるものではなく、このうちでも好ましくはグリシン、アラニン、セリンが挙げられる。アミノ酸がグリシン、アラニン、セリンの場合の上記式（１）のＲは、順に、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＯＨとなる。精製された本発明の静菌又は抗菌性物質は液状のまま使用しても良いし、噴霧乾燥や凍結乾燥などにより粉末化してから使用しても良い。
なお、本発明は、上記のシクロヘキサンカルボン酸とアミノ酸がアミド結合した化合物の塩についても同様の効果を有する。例えば、金属塩、無機塩、アミン塩、アミノ酸塩等が挙げられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、銀塩、銅塩等が挙げられ、無機塩としては、例えば、炭酸ナトリウム塩、炭酸水素ナトリウム塩、炭酸カリウム塩、炭酸水素カリウム塩等が挙げられ、アミン塩としては、例えば、トリエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられ、アミノ酸塩としては、例えば、アルギニン塩、リジン塩等が挙げられる。

本発明の静菌又は抗菌剤は、各種のアミノ酸とシクロヘキサンカルボン酸をアミド縮合させて調製することもできる。たとえば、グリシンおよびシクロヘキサンカルボン酸から、アラニンとシクロヘキサンカルボン酸から、またはセリンとシクロヘキサンカルボン酸から調製することもできる。

本発明の静菌又は抗菌剤を植物病原菌防除剤として用いる場合には、例えば液状の物質に溶解して単独で散布しても良いし、他の農薬等の散布時に薬剤と混和して同時に散布することもできる。例えば、粉末化した該剤を水や他の液剤に約０．１~１０%溶解して散布することにより、植物病原菌防除剤としての効果が期待できる。植物体表面への付着性を高めるため、農業上通常用いられる展着剤、界面活性剤を補助剤として添加することも可能である。例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、オキシエチレンポリマー、オキシプロピレンポリマー、ポリオキシエチレンアルキルリン酸エステル、脂肪酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルリン酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル、第四級アンモニウム塩、オキシアルキルアミン、レシチン、サポニン等が挙げられる。また、必要に応じてゼラチン、カゼイン、デンプン、寒天、ポリビニルアルコール、アルギン酸ソーダなどを補助剤として用いることができる。
また、土壌中の病原菌防除の目的では、粉末状で直接散布することもできるが、ゼオライト等の土壌改良資材に混和あるいは吸着させた後、土壌にすき込んで使用することも可能であるし、肥料に混和して用いることも可能である。
植物体への散布部位は、病原菌の発症、繁殖可能部位であればどこにでも用いることができ、花、茎、葉、根および種子などが挙げられる。

本発明の静菌又は抗菌剤は、ヒト又は家畜・ペットなどの感染症予防を目的として用いることができる。ヒトの感染症予防を目的とした場合は、本発明の静菌又は抗菌剤を錠剤やドリンク剤に添加することもできるし、飲食品に添加して使用することもできる。家畜・ペットなどの動物用途であれば、固形飼料・餌に混和することもできるし、飲料水に溶解して摂取させることもできる。また、粉末を飼料・餌に直接振りかけて与えることもできる。
例えば、粉末化した本剤を１〜９９%含む錠剤をヒトが飲用することで、感染症予防効果が期待できる。また、粉末化した本剤を豚または鶏用の固形飼料に０．１〜５%程度混和して給与することで、感染症予防効果が期待できる。

本発明の静菌又は抗菌剤は、ヒト用の食品や、家畜飼料・ペット用餌などの腐敗防止剤として使用することも出来る。この場合、用途や形態に合わせて液体または粉末の静菌または抗菌剤を適当量混和することができる。

当該静菌または抗菌性物質を、たとえばブロッコリーの花蕾等、そのまま食するため農薬を散布できない野菜に対しても使用することができる。その結果、これらの野菜類の病害を抑え、安定的に農業生産を行うことができる。更に、本発明の静菌または抗菌性物質を土壌散布することで、植物病原菌の繁殖、感染などの抑制効果も期待できる。また、種子を本発明の静菌または抗菌性物質に浸漬しておいたり、発症前の植物体に散布しておくことで、植物病原菌の発症を予防することも期待できる。また、ヒトや家畜動物などで問題となる病原性大腸菌等に対しても効果が期待できるため、食品や家畜飼料として摂食することにより、安全に腸内病原菌を防除することもできる。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例
に限定されるものではない。

（ホエーからの本発明の静菌又は抗菌性物質を含む粗画分の調製）
ゴーダタイプチーズの製造工程で排出されたチーズホエー４０Ｌを８，０００ｇ×３０分、４℃で遠心分離後、その上清を分画分子量が１０，０００Ｄａの限外ろ過膜（3838 HFK-131、Koch Membrane Systems Inc.）に供し、通過した画分をホエー限外ろ過パーミエイトとした。
合成樹脂であるＤＩＡＩＯＮＨＰ２０（三菱化学製）をエタノール（和光純薬製）で膨潤後、蒸留水で洗浄し、オープンカラム（内径45mm×長さ550mm）に充填した。ホエー限外ろ過パーミエイトをこの樹脂に供し、３Ｌの蒸留水にて洗浄を行った後、３Ｌの５０％のエタノール溶液で溶出した。溶出液をエバポレーターで乾固した後、５００ｍｌの蒸留水に再溶解した。これに水酸化ナトリウム（和光純薬製）を加えてｐＨ８．０に調整し、酢酸エチル（和光純薬製）５００ｍｌで３回の溶媒抽出を行った。水相を回収し、塩酸（和光純薬製）にてｐＨを２．５に調製した後、酢酸エチル５００ｍｌで３回の溶媒抽出を行った。回収した酢酸エチル相をエバポレーターで乾固後、５０％エタノール１０ｍｌに溶解し、粗画分（ＡＥ画分）とした。

試験例１

（ＡＥ画分のシュードモナス及び大腸菌の抑制効果）
北海道別海町の土壌を滅菌水に懸濁後、ＰＤＢ培地（パールコア標準寒天培地、栄研化学製）に塗布し、２７℃で1日培養した。生育したコロニーの一つを釣菌し、その16S rRNAの遺伝子配列を解読したところ、当株がPseudomonas sp.であることが確認された。この分離株を以降の抗菌性試験に用いた。
前記土壌より分離したシュードモナス属細菌（Pseudomonas sp）と子牛の糞便より分離した大腸菌（Escherichia coli）を、標準寒天培地（パールコア標準寒天培地、栄研化学製）に塗布し、シュードモナス属細菌は３０℃で、大腸菌は３７℃で1日培養した。生育した菌体を生理食塩水に懸濁し、その１００μｌを標準寒天培地に塗布した。滅菌した直径１０ｍｍのペーパーディスク（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）にホエー抽出画分を各々５０μl吸収させ、寒天培地上に等間隔に並べた。培地をシュードモナス属細菌は３０℃で、大腸菌は３７℃で1日間培養した後、ペーパーディクス周辺で菌の生育を阻害している範囲（阻止円）の大きさを測定した。その結果、シュードモナス属細菌、大腸菌共にＡＥ画分で強い阻止円を形成していた（表１）。なお、蒸留水を滅菌したペーパーディスクに１００μｌ吸収させたものを寒天培地上に置いて同様に培養したが（対照区）、阻止部分は形成されなかった（阻止円の大きさは１０ｍｍ）。
以上の結果から、ＡＥ画分には植物病原性菌であるシュードモナス属細菌や、動物の感染症原因菌である大腸菌に対しても高い静菌または抗菌効果があることが判明した。また、データは示さなかったが、ヒトの糞便より分離した大腸菌（Escherichia coli）でも同様の静菌または抗菌効果が認められた。

（１）ＡＥ画分から本発明の静菌又は抗菌性化合物の分離・同定
実施例１で分画したＡＥ画分について、活性成分を分離するためシリカゲルカラム（ワコーゲルC-100，和光純薬製，直径20ｍｍ×250ｍｍ）に供し、精製を行った。ＡＥ画分をこのカラムに供し、５００ｍＬの１％酢酸含有ヘキサン（和光純薬製）にて洗浄を行った後、１Ｌのｎ−ヘキサン：酢酸エチル：酢酸＝３９：６０：１溶液にて溶出した。エバポレーターで乾固した後、１Ｎ酢酸に溶解し、あらかじめメタノールで膨潤・洗浄後、１Ｎ酢酸で順化したＳｅｐＰａｋｔＣ18カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に添加し、さらに20ｍｌの1Ｎ酢酸で溶出させた。
次に、高速液体クロマトグラフィーを用いて抗菌成分の分画を行った。まず、カラムにＹＭＣＯＤＳ−Ａ（１０ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ：ＹＭＣ）を用い、溶媒は１％酢酸ｉｎ５０％メタノールを３ｍｌ／分で流し、カラム温度を４０℃とし、ピークは２３５ｎｍから３５０ｎｍのスペクトルで検出した。上記の溶出液を高速液体クロマトグラフィーに供し、３分間隔で分取したものを乾固した。５０％エタノールに溶解後、試験例１と同様にして大腸菌に対する抗菌性試験を行い、９〜１２分の分画物で抗菌活性があることを見出した。更に精製するため、この分画物をＹＭＣＰｈｅ（１０ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ：ＹＭＣ）カラムに供し、１％酢酸ｉｎ５０％メタノール・３ｍｌ／分で分画した。このうち７〜９分の分画物が抗菌活性を示したため、更にＹＭＣＯＤＳ−Ａ（１０ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ：ＹＭＣ）カラムに供し、１％酢酸ｉｎ２０％メタノール・３ｍｌ／分で分画した。このうち１７〜１９分の分画物が抗菌活性を示したため、更にＸｔｒｒａＰｒｅｐＲＰ１８（１０ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ：Ｗａｔｅｒｓ）カラムに供し、１％酢酸ｉｎ４０％アセトニトリル（和光純薬製）・３ｍｌ／分で分画した。このうち９〜１０分の位置（図１破線部分）に単一ピークが検出され（図１）、この分画物が抗菌活性を示した。このピークのスペクトルを調べると、特異的な紫外部吸収極大は認められなかった（図２）。
この化合物をＥＳＩ−ＦＴ−ＭＳで分析した結果、シクロヘキサンカルボン酸とアミノ酸のアミド結合物であり、分子式Ｃ₉Ｈ₁₅Ｎ₁Ｏ₃で表される分子量１８５．１の化合物であることが判明した（図３）。また、^１Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−d）及び^１３Ｃ−ＮＭＲ（アセトン−d）による解析の結果、^１Ｈについてはσppm：３．８６（２Ｈ,ｓ）、２．２３（１Ｈ，ｔｔ）、１．８−１．７（５Ｈ，ｍ）、１．５−１．２（５Ｈ,ｍ）であり、^１３Ｃについては、σ：２６．８（ＣＨ_２）、２６．９（ＣＨ_２）、３０．６（ＣＨ_２）、４１．７（ＣＨ_２）、４６．１（ＣＨ）、１７３．２（ＣＯ）、１７９．６（ＣＯ）のシグナルが検出された。
以上の分析結果から、当該化合物がシクロヘキサンカルボン酸にグリシンがアミド結合した化合物であると同定した。
（２）抗菌活性の測定
得られた化合物４．８ｍｇを５０％エタノールに溶解し、滅菌した８ｍｍのペーパーディスク吸収させた。このディクスを用いて、試験例１と同様にして大腸菌に対する抗菌試験を行った結果、明確な阻止円を形成した（表２）。なお、蒸留水を滅菌したペーパーディスクに５０μｌ吸収させたものを寒天培地上に置いて同様に培養したが（対照区）、阻止部分は形成されなかった（阻止円の大きさは８ｍｍ）。
以上の結果から、ホエーより分画した抗菌活性画分よりさらに分離・精製して得られた前記化合物は抗菌性を示すことが確認された。

（植物病原菌の防除剤）
上記実施例２で得られた本発明の化合物１ｇをポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルリン酸アンモニウム１９０ｇ、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル６０ｇ、リン酸トリエチル２８０ｇ、リン酸トリブチル４７０ｇと均一に混和し、乳剤を調製し、植物病原菌防除剤を製造した。

（家畜用感染症予防飼料）
上記実施例１で得られた静菌又は抗菌活性を有する粗画分２００ｇを９９．８ｋｇの脱イオン水に溶解し、５０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（MARK II 160型；特殊機化工業社製）にて、３、６００ｒｐｍで４０分間撹拌混合した。この混合溶液に大豆粕１２ｋｇ、脱脂粉乳１４ｋｇ、大豆油４ｋｇ、コーン油２ｋｇ、パーム油２３．２ｋｇ、トウモロコシ澱粉１４ｋｇ、小麦粉９ｋｇ、ふすま２ｋｇ、ビタミン混合物５ｋｇ、セルロース２．８ｋｇ、ミネラル混合物２ｋｇを配合し、１２０℃、４分間殺菌して、本発明の家畜用感染症予防飼料１００ｋｇを製造した。

（ヒト用感染症予防剤）
上記実施例２で得られた本発明の化合物１ｇ、ラクトース１４０ｇ、シュガーエステル８ｇ、セルロース２ｇを混合し、圧縮錠剤機により圧縮して、本発明品のヒト用感染症予防剤を製造した。

（１）グリシンおよびシクロヘキサンカルボン酸からの本発明化合物の調製
グリシン−シクロヘキサンカルボン酸縮合物の合成は、グリシンメチルエステルとシクロヘキサンカルボンとのアミド結合、エステル部分の加水分解の2ステップで行なった。まず、Glycine methyl ester hydrochloride 5gおよびCyclohexanecarboxylic acid 5.13gを氷冷したジクロロメタン100ｍｌに溶解した後、トリメチルアミン5.6mlを添加した。この母液に、ジクロロメタン70mLに溶解した1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide塩酸塩 7.67g、1-hydroxybenzotriazole 0.54g、トリエチルアミン5.6mlを氷冷しながら1時間かけて添加し、室温に戻しながら一晩攪拌した。反応液は蒸留水、5% NaHCO₃、1N HCl、蒸留水の順に溶媒抽出を行うことにより精製し、得られたジクロロメタン相を硫酸マグネシウムにより脱水、ろ過後乾固した。アセトンに溶解し、4℃下で再結晶させて固液分離した後、結晶を五酸化ニリン共存下で減圧乾燥させた。
次に、この結晶2gを50%EtOH 50mlに溶解し、６３℃で加温しながら１N NaOH 10mlを徐々に滴下した。反応液をHClによりpH８に調整後、蒸留水で100mLとし、酢酸エチルにより抽出して水相を得た。これをHClによりpH2.5に調整後、酢酸エチル抽出を3回行って酢酸エチル相を得た。これを無水硫酸マグネシウムにより脱水し、ろ過後乾固した。アセトンに溶解し、4℃下で再結晶させて固液分離した後、結晶を五酸化ニリン共存下で減圧乾燥させた。
この化合物をＥＳＩ−ＦＴ−ＭＳで分析した結果、実施例２で同定された化合物と同様の分子量とフラグメントパターンを示したことから、合成した化合物が実施例２で得られたホエーより分画した化合物と同一であると判断した。
（２）合成した本発明化合物の抗菌活性の測定
合成したグリシン−シクロヘキサンカルボン酸の縮合物について、30μmoleを５０％エタノールに溶解し、滅菌した８ｍｍのペーパーディスク吸収させた。このディクスを用いて、試験例１と同様にして大腸菌に対する抗菌試験を行った結果、明確な阻止円を形成した（表３）。なお、蒸留水を滅菌したペーパーディスクに５０μｌ吸収させたものを寒天培地上に置いて同様に培養したが（対照区）、阻止部分は形成されなかった（阻止円の大きさは８ｍｍ）。
以上の結果から、グリシンとシクロヘキサンカルボン酸より合成した本発明の化合物が抗菌性を示すことが確認された。

（１）アラニンまたはセリンとシクロヘキサンカルボン酸からの本発明化合物の調製
実施例６と同様の方法を用いて、アラニンまたはセリンとシクロヘキサンカルボン酸縮合物の合成を行なった。Glycine methyl ester hydrochlorideの代わりにAlanine methyl ester hydrochlorideおよびSerine methyl ester hydrochlorideを出発原料とし、最終的に得られた結晶をGC−ＭＳで分析した結果、アラニンまたはセリンとシクロヘキサンカルボン酸の縮合物であることを確認した。
（２）合成した本発明化合物の抗菌活性の測定
合成したアラニンまたはセリンーシクロヘキサンカルボン酸の縮合物について、30μmoleを５０％エタノールに溶解し、滅菌した１０ｍｍのペーパーディスク吸収させた。このディクスを用いて、試験例１と同様にして大腸菌およびシュードモナスに対する抗菌試験を行った結果、明確な阻止円を形成した（表４）。なお、蒸留水を滅菌したペーパーディスクに１００μｌ吸収させたものを寒天培地上に置いて同様に培養したが（対照区）、阻止部分は形成されなかった（阻止円の大きさは１０ｍｍ）。
以上の結果から、アラニンまたはセリンとシクロヘキサンカルボン酸より合成した本発明の化合物が抗菌性を示すことが確認された。

本発明により新規な静菌または抗菌剤を提供することができる。この物質は、植物病原菌や大腸菌などに対して静菌または抗菌活性を有し、食品由来の抗菌剤として植物病原菌の防除剤、腸内菌叢改善剤などに活用することができる。本発明は、食品分野、医薬分野のみならず、酪農畜産分野、農業分野への利用が可能である。特に、農薬を使用できない野菜の病原菌防除や、抗生物質の使用を控えたい家畜の感染症予防、合成保存料を使用できない食品の保存性向上に大きく貢献することが期待できる。

Claims

シクロヘキサンカルボン酸とアミノ酸がアミド結合した化合物および／またはその塩を有効成分とする静菌または抗菌剤。
シクロヘキサンカルボン酸とアミノ酸のアミド結合した化合物が、下記式（１）で表される化合物である請求項１に記載の静菌または抗菌剤。

ここで、Rは中性または酸性のアミノ酸側鎖を示す。
アミノ酸が、グリシン、アラニン、セリンのいずれかである請求項２に記載の静菌または抗菌剤。
乳抽出物からなる請求項１〜３のいずれかに記載の静菌または抗菌剤。
ホエー抽出物からなる請求項１〜３のいずれかに記載の静菌または抗菌剤。
前記静菌または抗菌の対象とする微生物が、Escherichia属、シュードモナス属のいずれかである請求項１〜４のいずれかに記載の静菌または抗菌剤。
前記静菌または抗菌の対象とする微生物が大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナスアエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナスフルオレッセンス（Pseudomonas fluoressence）のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載の静菌または抗菌剤。
請求項１〜５のいずれかに記載の静菌または抗菌剤を含有することを特徴とする植物病原菌防除剤。
請求項１〜５のいずれかに記載の静菌または抗菌剤を含有することを特徴とする飲食品、栄養組成物または飼料。