JP2014527806A5 - 改変抗体およびその作製方法 - Google Patents

Description

抗体は、広範囲に開発され、人間の治療的利用で用いられているタンパク質の一ファミリーである。治療的利用で抗体が好まれるのは、実質的に任意の所望の標的分子を特異的に標的とし得るというそれらの万能性に拠る。タンパク質系治療用製品の大半はモノクローナル抗体である。しかしながら、モノクローナル抗体系療法の使用に付随するある重大な欠点は、対象動物に投与したとき該治療用モノクローナル抗体に対して中和抗体が産生されることである。これらの中和抗体は、投与されたモノクローナル抗体に存在する外来性アミノ酸配列を認識する該対象動物の免疫系から生じる。結果として、投与された治療用抗体に対して免疫応答が惹起される。該対象動物による中和抗体の産生は、該治療用モノクローナル抗体による該対象動物の治療継続能力を大きく障害し得る。典型的には、対象動物でいったん中和抗体が産生されてしまうと、治療用抗体の使用を増加させねばならない。なぜならば、中和抗体は、投与されたモノクローナル抗体の治療効果を効果的に低下させるか又は無効にするからである。このことは、治療用抗体の使用を初期治療に制限し、治療用抗体の反復投与又は長期投与は選択肢とならないという結果をもたらし得る。要約すれば、治療用抗体に対する中和抗体の産生は当該抗体の治療的使用を大きく制限し、このことは順次、慢性又は再発性疾患の治療において該抗体の使用を大きく制限するか又は完全に妨げ得る。

一般的に用いられるヒト化技術の一つはCDR移植技術であり、前記技術によれば、ドナー抗体（例えばネズミ由来抗体）由来の相補性決定領域（CDR）がヒト起源の抗体由来のフレームワーク領域と合体されて重鎖及び軽鎖可変ドメインを形成し、前記は続いてヒト抗体由来重鎖及び軽鎖定常ドメインと合体される。したがって生成抗体は限られた数の非ヒト由来アミノ酸を含むだけであり、このことはヒト免疫系によって外来性とみなされるエピトープの存在を制限するために役立つ。
ヒト化に付随する重要なある欠点は、ヒト化はしばしば、非ヒト化ドナー抗体によって示される結合親和性よりも生成ヒト化抗体の結合親和性に大きな低下を生じるということである。治療用抗体に対して中和抗体が産生される事例のように、このことは、当該抗体の治療的使用を顕著に損なうことになり得る。特に、結合親和性の低下はより大用量の治療用抗体の投与を必要とし、それはさらにまた投薬頻度の増加も要求し得る。これらの要因はともに治療コストの増大及び患者の不便の増加をもたらす。さらにまた対象動物へのより大量の抗体の投与は、治療用抗体に対して中和抗体が生成されるリスクの増大をもたらす。

本発明はある標的種で使用するためにドナー抗体を改変する方法を開示し、前記改変は、生成抗体が、該フレームワーク領域内のいずれの位置においても当該種の当該位置において外来性であるようなアミノ酸を一切含まないように実施される。したがって、該改変抗体はドナー抗体の特異性及び親和性を維持するが、同時に潜在的に外来性であるエピトープが作出されないように改変されるであろう。該改変抗体はしたがって標的種で外来性とみなされず、それゆえに、その有効性の中和を特に長期投与後にもたらし得る免疫応答を誘発しないであろう。前記を達成することができる本方法は、以前の方法に固有であった全ての欠点を克服し、しかも際立った単純性及び洗練性を特徴とする。
甚だしい努力の後で、本発明者らは驚くべきことに、標的種に投与したとき完全に又は有意に非免疫原性であるように、ドナー抗体又は前記由来の抗原結合フラグメントを改変する方法を開発した。前記標的種はドナー抗体が由来した種とは異なる種である。典型的には、対象動物に投与した後で該生成抗体に対して中和抗体は生じない。さらにまた、抗体を非免疫原性にする抗体の改変は、目的の標的に対する結合特異性又は親和性の低下をもたらさないであろう。

ある種の実施態様では、フレームワーク領域のアミノ酸残基が、当該抗体が投与される種の対応する位置のアミノ酸残基プールに存在するか否かの同定は、当該配列とプール残基のアラインメントの実施によって達成される。本質的には、置換される残基は生成された改変抗体の結合活性を低下させない。すなわち、置換されるアミノ酸は、当該抗体の結合特性に有意な影響を及ぼすことなく異なるアミノ酸のために置換できる。前記は、主として当該アミノ酸を相同アミノ酸（すなわち類似又は関連する特徴（例えば標的部位における分子のサイズ、極性／荷電若しくは疎水性、又は側鎖の大きさ）を有するアミノ酸）で置換することによって達成される。或いは、残基は、標的種の対応する位置に存在するコンセンサス残基で置換できる。
置換される（又は置換可能な）アミノ酸残基は、変種寛容位置として知られ得る位置に存在する。すなわち、別の残基のための当該残基の置換は、フレームワーク領域間に介在する相補性決定領域の結合特異性を変化させない。そのような置換は、1つの種のフレームワーク領域の特定の位置に存在するある残基は第二の種のフレームワーク領域配列の対応する位置には存在しないことがあるという事実のために必要であると考えられる。したがって、該アミノ酸は、当該アミノ酸残基がフレームワーク領域配列の当該位置に通常は存在しない種の免疫系によって外来性とみなされるエピトープを形成するために、免疫誘導応答を前記に対して引き起こし得る。相同残基又は標的種に存在するコンセンサス残基で当該外部残基を置換する本方法論を用いることによって、潜在的に外来性であるエピトープを変化させ、外来性と認識されないエピトープを形成することができる。したがって、抗体のフレームワーク領域からそのようなエピトープを全て除去することによって、該抗体が最初に得られた種とは異なる種である対象動物に投与したとき、該抗体の当該部分に対して液性応答が生じるのを防ぐことができる。

これまで当業界で抗体を脱免疫するためにもっとも一般的に用いられたアプローチは、レシピエント種の生殖系列配列から適合するフレームワークを選別し、このフレームワークにCDR領域を移植するものであった。このアプローチの問題は、選別したフレームワークは該CDRに対して稀にしか完全なマッチングを示さず、結果として目的の標的エピトープに対する結合親和性は低下する。その後アフィニティ成熟が必要とされるが、前記はアミノ酸の導入に帰結しこれらアミノ酸はそれらが導入される位置においてときに外来性である。前記を解決するのが本発明の方法であり、本方法では、ドナーフレームワークの改変は、あるアミノ酸が固有の位置でレシピエントにとって外来性である場所でのみ行われる。この入れ替えは、本発明の部分としてまとめた選択肢リストから選択される。結果として（それは本発明の核心である）、ドナーフレームワークの構造的な改善は本質的に存在せず、したがってCDRの立体構造のゆがみも本質的に存在しないが、同時に該フレームワーク内に“非自己”のアミノ酸も存在せず、生成された免疫グロブリンは該標的種で外来性であるフレームワークエピトープを欠く。本方法論を用いて、任意の所望の種に投与するために免疫グロブリンを改変することができる。

本発明者らが用いた本発明の抗体のための重鎖及び軽鎖可変ドメインを作出するプロセスは、標的（例えばイヌ）にとって当該位置で外来性であることが判明している特定のドナーアミノ酸残基を、（本発明者らの分析を基にして）CDR領域の立体構造を維持ししたがって結合特異性及びアビジチーを維持するが、免疫原性エピトープ（前記エピトープは、もし未改変形で該標的に投与されると該抗体に対して中和抗体の生成をもたらし得る）の存在を低下させる標的（例えばイヌ）残基で入れ替える工程を生じる。具体的には、本発明の抗体を調製する方法（ペチセーションとして知られている）は、ドナー抗体のフレームワーク領域の配列を標的（例えばイヌ）由来の1つの抗体又は抗体プールと比較することによって、標的（例えばイヌ）への投与に対する適切性についてドナー（例えばヒト）抗体のフレームワーク領域の配列を判定する工程を含む。該比較はドナー配列と該標的配列のただ1つのメンバーとの間で実施できるが、標的配列のプールとの比較が好ましいことは明白であろう。なぜならば、そのような比較は標的種のそれぞれのKabat位置における天然に存在する選択肢の数を増やすからである。これは、ドナーと標的との間の“マッチング”の機会を増やすだけでなく、マッチングが存在しない場合に入れ替えの選択肢もまた増やすであろう。結果として、ドナーと可能な限り近い特徴を有する入れ替えを選択することができる。ドナー配列とイヌ配列がいずれかのKabat番号又は対応する位置で相違する場合、ドナー配列は、標的（例えばイヌ）の当該位置に天然に存在することが判明しているアミノ酸残基で問題のアミノ酸が置換されるように改変される。

ドナー免疫グロブリンフレームワーク領域に存在するアミノ酸残基の置換が必要な場合、典型的には、前記置換は保存的置換の原則を用いて実施され、ここでアミノ酸は、標的（例えばイヌ）の当該Kabat位置に天然に存在し、かつドナー配列の置換されるアミノ酸に対してサイズ、電荷及び疎水性が可能な限り近縁であるアミノ酸残基で入れ替えられる。その意図は、ドナー抗体の三次元構造の混乱若しくは破壊を全く引き起こさないか又は少なくとも最小限にする入れ替えを選択することである。ある種の状況では、明白な選択は存在せず、それぞれの選択が長所及び短所を有するであろう。最終的な決定には、三次元モデリング又は多様な代替配列の発現すら要求されるかもしれない。しかしながら、おおむね明らかな優先性が利用可能であろう。この方法の結果として、ドナー配列の変更は、当該残基が標的で外来性であるときにのみ実施され、入れ替えアミノ酸は入れ替えられるものと可能な限り近縁である。したがって、外来性であるエピトープの創出は回避されるが、全体的な三次元構造は保存され、結果として親和性及び特異性もまた保存される。本発明のこの特徴の例示的な例には以下が含まれる：
−軽鎖配列：配列番号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、25、27及び71；
−重鎖配列：配列番号：2、4、6、8、10、12、14、16、18、19、20、21、24、26、68、69及び70。

イヌTNFに対し結合特異性を有するイヌ抗体の製造
更なる例示として、ヒト抗体D2E7（腫瘍壊死因子と結合する）をそのイヌ変種作製の出発点として用い、本特許のPET化方法を実施した。
下記に示す表9−16は、ヒトモノクローナル抗体D2E7の軽鎖及び重鎖可変ドメインのフレームワーク領域とイヌ免疫グロブリンフレームワーク配列の各位置について明らかにしたアミノ酸残基のプール（表1−8に示されている）とのアラインメントを例示する。以前にKabatの配列位置で外来性と考えられたある種の残基（表9で*印）は今ではイヌにとって自然であると考えられ、したがって*印の位置で示された変更はもはや実施されないか、又は別のより保存的な残基が選択され得る（表10の**印）。この追加情報を基に、Ser9、Ala13及びGly16（表9で*印）を含む、3つの軽鎖の位置が変更されないであろう。軽鎖のHis42は当該位置の残基のまた別の選択であろう（表10の**印）。これらの位置におけるイヌ化D2E7フレームワーク残基の改変及びそのような改変を含む抗体は本発明の範囲内と考える。そのような抗体は、配列番号：15に示す配列を有する軽鎖可変ドメインを含むであろうが、ただし除外例として、セリン残基は9位に提供され、アラニン残基は13位に提供され、グリシン残基は16位に提供され、配列番号：15の上記の位置に示される残基の位置を占める。場合によって、配列番号：15のグルタミンの位置の42位にヒスチジン残基を提供することができる。これらの変更を示す改変配列は配列番号：71として提供される。本発明は、配列番号：71を含む軽鎖可変ドメインを含む抗体及び前記抗体に由来する抗原結合フラグメントに及ぶ。

Claims (12)

1. 以下の工程を含む、標的種に投与するためにドナー免疫グロブリンを改変する方法であって、前記改変された免疫グロブリンが、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域内のいずれの位置においても、その位置において前記標的種由来の１以上の免疫グロブリンにとって外来性であるいずれのアミノ酸も含まない、前記方法：
   −標的種以外の種からドナー免疫グロブリンを同定する工程であって、該ドナー免疫グロブリンは標的種に存在する標的エピトープに対し結合特異性を有する、前記工程
   −該ドナー免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域のアミノ酸配列を決定する工程、
   −該ドナー免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域のアミノ酸配列の各アミノ酸残基を、該標的種由来の1つ以上の免疫グロブリンのフレームワーク領域のアミノ酸配列の対応する位置に存在するアミノ酸残基と比較して、該標的種由来の1つ以上の免疫グロブリンの少なくとも１つのフレームワーク領域のアミノ酸配列の対応する位置に存在しない、該ドナー免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域のアミノ酸配列内の1つ以上のアミノ酸残基を同定する工程；及び
   −該ドナー免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインフレームワーク領域のアミノ酸配列に存在するが、該標的種由来の前記1つ以上の免疫グロブリンの少なくとも１つのフレームワーク領域のアミノ酸配列の対応する位置には存在しない該1つ以上の同定アミノ酸残基を、該標的種由来の1つ以上の免疫グロブリンの少なくとも１つのフレームワーク領域のアミノ酸配列の対応する位置に存在するアミノ酸残基で置換する工程。
2. ドナー免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域のアミノ酸配列に存在するアミノ酸残基の置換が、保存的置換の原則を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
3. ドナー免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖の少なくとも1つの定常ドメインを、標的種由来の免疫グロブリンに由来する重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメインで入れ替える工程をさらに含む、請求項1または２に記載の方法。
4. 標的種が哺乳動物標的種である、請求項1から３のいずれかに記載の方法。
5. 哺乳動物種が、イヌ、ネコ及びウマから成る群から選択されるコンパニオンアニマルである、請求項４に記載の方法。
6. 哺乳動物種がヒトである、請求項４に記載の方法。
7. ヒト神経成長因子（NGF）と特異的に結合することができる中和抗体又はその抗原結合フラグメントであって、該抗体又は抗原結合フラグメントが、配列番号：13のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び／又は配列番号：14のアミノ酸配列又は前記と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、重鎖および軽鎖可変ドメインのいずれの位置においても、その位置においてヒト由来の１以上の免疫グロブリンにとって外来性であるいずれのアミノ酸も含まない、前記中和抗体又はその抗原結合フラグメント。
8. 軽鎖が配列番号：25のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
9. 重鎖が配列番号：24のアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７又は８に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
10. 請求項７から９のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
11. ヒトの痛みの治療又は予防用の、請求項１０記載の医薬組成物。
12. ヒトの関節炎に付随する痛みの治療用の、請求項１０記載の医薬組成物。