JP2014519853A - 芳香族分子の組換え生成系 - Google Patents

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Abstract

本発明は、大腸菌、酵母、糸状菌、藻類、微細藻類、他の植物細胞等の原核生物および真核生物宿主における芳香族分子の生成に関する。
【選択図】 図１−１

Description

関連出願
本願は、２０１１年６月２３日出願の米国仮出願第６１／５００，５１８号および２０１２年１月５日出願の第６１／５８３，３２５号の利益を主張するものであり、これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、大腸菌、酵母、糸状菌、藻類、微細藻類、他の植物細胞等の原核生物および真核生物宿主における芳香族分子の生成に関する。
現在、再生可能な資源からの多くの特殊化学物質および液体燃料生成の満たされていない必要性が存在している。環境、地球の海洋、および大気への多大な悪影響にもかかわらず、化学化合物および自動車燃料の大半が、依然として、原油、石炭タール、シェール油等の化石燃料から得られている。特に注目すべきは、クレゾール等の単純なフェノール化合物が、環境にそのような悪影響を及ぼすプロセスで石炭タールから主として抽出されるため、クレゾール生成を専門とする米国の工場がここ数年で閉鎖している。しかしながら、この問題が単に別の地理的場所に移され得るだけにすぎず、これは地球的解決策にはならない。合成生物学は、これら等のある特殊化学物質の製造業者に解決策の可能性を提示する。
ポリケチドは、概して、脂肪酸合成に類似する様式で、２炭素単位を縮合することにより合成される。概して、合成は、スターター単位およびエクステンダー単位を含み、これらの「２炭素」単位は、例えば、アシルチオエステル、典型的には、アセチル、プロピオニル、マロニル、またはメチルマロニル補酵素−Ａチオエステルに由来する。「様式」が異なる４つのクラスのポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）が存在し、そこで触媒部位が使用される（Ｗａｔａｎａｂｅ ａｎｄ Ｅｂｉｚｕｋａ，２００４）。Ｉ型モジュラーＰＫＳは、線形「アセンブリライン」様式で１回だけ使用される触媒部位を含む複数の「モジュール」を有する単一タンパク質である。Ｉ型反復ＰＫＳは、最終ポリケチド生成物に達するために繰り返し使用される部位を有する単一タンパク質である。本発明は、そのクラスのそれぞれからコード配列を採用することができるが、好ましい実施形態では、採用されるＰＫＳは、主にこのクラスのＰＫＳ、例えば芳香族６−メチルサリチル酸シンターゼ、もしくはオルセリン酸シンターゼ、またはこれらの酵素の改変型に由来する。Ｉ型ＰＫＳのポリペプチド成分をコードする遺伝子は、酵母および大腸菌等の異種微生物において、ポリケチドの微生物生成のために使用されている。例えば、米国特許第６，０３３，８８３号、同第６，２５８，５６６号、および同第７，０７８，２３３号を参照されたい。
ＩＩ型ＰＫＳは複数のタンパク質を含み、それぞれ単一の単官能性活性部位を有する。この活性部位は、１回のみ使用され得るか、または繰り返し使用され得る。最後に、ＩＩＩ型ＰＫＳは、複数のモジュールを有する単一タンパク質であり、ここで、活性部位が繰り返し使用される。
ＰＫＳは、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）に類似する方法で機能する。脂肪酸は、概して、疎水性成分から構成され、バイオ燃料等のエネルギー源としても使用することができる。多くの真核生物は、共通または類似の代謝経路を用いて脂肪酸を合成する。種子では、トリグリセリドの一部としての脂肪酸は、さらなる発芽のためにエネルギー源として貯蔵される。ＦＡＳ経路は、色素体に位置する。アセチル−ＡＣＰ（アシルキャリアタンパク質）は、縮合酵素、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ）ＩＩＩによって形成される。アセチル−ＡＣＰのより長い鎖の脂肪酸への伸長は、より長いβ−ケトアシル−ＡＣＰを形成するためのマロニル−ＡＣＰ由来の２炭素単位の縮合（β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ）、ケト機能のアルコールへの還元（β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ）、エノイル−ＡＣＰを形成するための脱水（β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ）、および最後に伸長された飽和アシル−ＡＣＰを形成するためのエノイル−ＡＣＰの還元（エノイル−ＡＣＰレダクターゼ）の周期性活動を伴う。β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ（ＫＡＳ Ｉ）は、主に、最大パルミトイル−ＡＣＰ（Ｃ１６：０）の伸長に関与し、一方、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＫＡＳ ＩＩ）は、主に、ステアロイルＡＣＰ（Ｃ１８：０）への最終的な伸長に関与する。
同様に、反復芳香族ＰＫＳは、図１および２に示される生合成経路を介して、マロニル−ＡＣＰ由来の２−炭素単位の縮合を利用して、６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡ）（２−ヒドロキシ−６−メチル安息香酸（ＨＭＢＡ）として知られる）およびオルセリン酸（ＯＳＡ）等の生成物を形成する。これらの経路の柔軟性は、細菌性６−ＭＳＡＳがケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインの触媒活性を単純に「ノックアウト」することによってＯＳＡを合成するように操作することができるという事実により強調される（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ１７，４９５−５０３，２０１０）。
本発明は、殺菌性、薬学的、および再生可能な液体燃料領域において複数の用途を有する分子および前駆体分子の生成のための系を提供する。いくつかの実施形態では、アシルキャリアタンパク質のパンテテイニル化のための機構の追加（すなわち、ＰＰＴａｓｅとして知られるホロＡＣＰシンターゼの使用）は、そのような分子を必ずしも自然に生成し得ない広範囲の宿主における前記分子の生成を可能にする。
クレゾール、オルシノール、ヒドロキシメチル安息香酸、ならびにそれらの同族のエーテル、エステル、およびラクトン等の微生物宿主からそのように直接的または間接的に得られる芳香族分子は、殺菌剤、医薬品、ビタミン、風味剤、または再生可能なエネルギー源、例えば、燃料、燃料添加剤（酸素化物、燃料付加物、すなわち、高オクタンガソリン配合剤など）として好適に使用される化合物をもたらすために処理されるか、またはさらに処理され得る化合物の同種もしくは異種調製物をもたらす。
６−ＭＳＡの生合成経路を示す（Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ１９２：４８７−４９８（１９９０））。 ６−ＭＳＡの生合成経路を示す（Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ１９２：４８７−４９８（１９９０））。 ６−ＭＳＡおよびＯＳＡの生合成経路を示す（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ１７：４９５−５０３（２０１０））。 ６−ＭＳＡおよびＯＳＡの生合成経路を示す（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ１７：４９５−５０３（２０１０））。 ６−ＭＳＡおよびＯＳＡの生合成経路を示す（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ１７：４９５−５０３（２０１０））。
本発明は、大腸菌、酵母、糸状菌、藻類、微細藻類、他の植物細胞等の原核生物および真核生物宿主における芳香族分子の生成に関する。一態様では、分子は、官能性芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）を用いて得られ、結果として得られた様々な分子は、生体内で形質転換されて、殺菌または薬学的用途のために特殊化学物質を作製する。加えて、本発明は、殺菌または薬学的用途のための化合物の前駆体の生成を企図する。一態様では、前駆体は、さらなる特殊化学物質およびポリマーの前駆体であり得る高オクタン芳香族またはシクロヘキサンおよびシクロヘキサノール様の分子を得るためにさらに処理される。処理された前駆体は、石油系およびジェット燃料に適合し得、したがって、再生可能なエネルギー源として使用され得る。
本発明は、様々な宿主におけるポリケチドの生成および誘導体化のための組換え材料ならびに結果として得られるポリケチドおよびその誘導体に関する。当該技術分野において既知であるように、単一または複数のベクターを使用して、化合物を生成するための宿主を構築することができる。単一ベクターは、宿主細胞の最小限の処理を可能にし、複数のベクターはさらなる生体内形質転換の能力を促進し、様々な新規の合成経路の設計の際に柔軟性を可能にする。
一実施形態では、本発明は、ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系を含む、フェノール化合物を生成するための改変された組換え宿主細胞を提供する。別の実施形態では、宿主細胞は、ｉｉ）ホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系をさらに含み、ＡＣＰシンターゼは前記ＰＫＳをパンテテイニル化する。さらなる実施形態では、宿主細胞は、ｉｉｉ）デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の発現系をさらに含む。他の一実施形態では、前記細胞から単離される生成物は、フェノール化合物である。別の実施形態では、芳香族ＰＫＳは、原核生物由来の６−メチルサリチル酸のシンターゼである。他の一実施形態では、核生物由来の６−ＭＳＡＳの発現系は、同一のベクター上、または別個のベクター上に存在する官能性デカルボキシラーゼを含む。他の一実施形態では、芳香族ＰＫＳは、野生型形態のストレプトマイセス・アンチビオチクス（Ｓ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）由来のＣｈｌＢ１遺伝子によってコードされる。さらなる一実施形態では、細胞によって生成されることが可能であり、細胞から単離することが可能であるフェノール化合物は、メタクレゾールである。
一実施形態では、芳香族ＰＫＳは、不活性化ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを含む。別の実施形態では、芳香族ＰＫＳは、真菌由来の６−メチルサリチル酸のシンターゼである。さらなる実施形態では、芳香族ＰＫＳは、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のＡｖｉＭ遺伝子によってコードされるオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）である。別の実施形態では、細胞によって生成されることが可能であり、細胞から単離することが可能であるフェノール化合物は、オルシノールである。
別の実施形態では、デカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列は、プリムネシウム・パツルム（Ｐ．ｐａｔｕｌｕｍ）由来の６−ＭＳＡデカルボキシラーゼ遺伝子、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）由来のＰａｔＧ遺伝子、グリオクラジウム・ロゼウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）由来のＯＳＡ デカルボキシラーゼ遺伝子、アスペルギルス種由来の２，３−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子、およびスフィンゴモナス・パウシモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）ＳＹＫ−６由来の５−カルボキシバニリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子からなる群から選択される。
別の実施形態では、前記ＰＫＳの発現系および前記ホロＡＣＰシンターゼの発現系は、同一のベクター上に存在する。他の実施形態では、前記ＰＫＳの発現系および前記ホロＡＣＰシンターゼの発現系は、別個のベクター上に存在する。他の一実施形態では、ＰＫＳおよび前記ホロＡＣＰシンターゼは、２シストロン性メッセンジャーＲＮＡから発現される。
他の一実施形態では、改変された細胞は、前記最小ＰＫＳの発現系もしくは前記ホロＡＣＰシンターゼの前記発現系のいずれかとして同一のベクター上、または別個のベクター上に存在する官能性デカルボキシラーゼの発現系を含む。別の実施形態では、前記最小ＰＫＳの発現系および前記ホロＡＣＰシンターゼの前記発現系および官能性デカルボキシラーゼの前記発現系は、同一のベクター上に存在する。一実施形態では、前記発現系のうちの１つ、２つ、または３つすべては、宿主細胞の染色体に組み込まれるか、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）から発現される。他の実施形態では、発現されたＰＫＳ、ホロＡＣＰシンターゼ、およびデカルボキシラーゼのうちの少なくとも２つは、多シストロン性メッセンジャーＲＮＡに由来する。別の実施形態では、宿主生物は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびアスペルギルス種からなる群から選択される。一実施形態では、宿主生物は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）である。別の実施形態では、アスペルギルス・ニガーは、ホロＡＣＰシンターゼの異種発現系を含まない。
別の態様では、本発明は、フェノール化合物を生成する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ａ）ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系と、ｉｉｉ）デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の発現系とを含む、改変された組換え宿主細胞を提供するステップを含む。別の実施形態では、本方法は、ｂ）組換え宿主細胞においてフェノール化合物中間体を生成することをさらに含む。他の一実施形態では、本方法は、ｃ）フェノール化合物中間体からフェノール化合物を合成することをさらに含み、組換えデカルボキシラーゼは、フェノール化合物中間体の脱カルボキシル化を触媒して、フェノール化合物を形成する。一実施形態では、フェノール化合物中間体は６−ＭＳＡである。別の実施形態では、フェノール化合物はメタクレゾールである。
一実施形態では、芳香族ＰＫＳは、不活性化ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを含む。別の実施形態では、芳香族ＰＫＳは、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のＡｖｉＭ遺伝子によってコードされるオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）である。いくつかの実施形態では、フェノール化合物中間体は、オルセリン酸（ＯＳＡ）である。他の実施形態では、フェノール化合物はオルシノールである。
別の態様では、本発明は、フェノール化合物を生成する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ａ）ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系とを含む、改変された組換え宿主細胞を提供することを含む。一実施形態では、本方法は、ｂ）組換え宿主細胞において生成されたフェノール化合物中間体を単離することをさらに含む。一実施形態では、本方法は、ｃ）金属触媒（または他の種類の触媒）と共に加熱し、続いて蒸留することにより、ステップｂ）のフェノール化合物中間体を脱カルボキシル化して、フェノール化合物を形成することをさらに含む。さらなる実施形態では、フェノール化合物中間体は６−ＭＳＡである。他の実施形態では、フェノール化合物はメタクレゾールである。一実施形態では、金属触媒は、粉末形態である。別の実施形態では、金属触媒は亜鉛触媒である。
他の一態様では、本発明は、アルキル化フェノール化合物を生成するための改変された組換え宿主細胞を提供する。一実施形態では、細胞は、ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系と、ｉｉｉ）デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の発現系と、（ｉｖ）Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＯＭＴ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第４の発現系とを含む。一実施形態では、細胞によって生成されることが可能であり、前記細胞から単離することが可能である生成物は、アルキル化フェノール化合物である。一実施形態では、アルキル化フェノール化合物は、３−メチルアニソールである。
一実施形態では、芳香族ＰＫＳは、不活性化ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを含む。別の実施形態では、芳香族ＰＫＳは、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のＡｖｉＭ遺伝子によってコードされるオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）である。さらなる一実施形態では、アルキル化フェノール化合物は、３，５−ジメトキシトルエンである。
さらなる実施形態では、ＯＯＭＴは、ＯＯＭＴ１、ＯＯＭＴ２、ＯＯＭＴ３、ＯＯＭＴ４、ＣＯＭＴ１からなる群から選択されるロサ・キネンシス（Ｒｏｓａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）遺伝子によってコードされる。
別の態様では、本発明は、アルキル化フェノール化合物を生成する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ａ）ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系と、ｉｉｉ）デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の発現系とを含む、改変された組換え宿主細胞を提供することを含む。別の実施形態では、本方法は、ｂ）組換え宿主細胞において生成されたフェノール化合物中間体を単離することをさらに含む。一実施形態では、本方法は、ｃ）アルキル化剤で処理することにより、ステップｂ）のフェノール化合物中間体をアルキル化して、アルキル化フェノール化合物を形成することをさらに含む。別の実施形態では、アルキル化剤はメタノールである。
一実施形態では、アルキル化フェノール化合物中間体はｍ−クレゾールである。別の実施形態では、アルキル化フェノール化合物は、３−メチルアニソールである。
別の実施形態では、芳香族ＰＫＳは、不活性化ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを含む。一実施形態では、芳香族ＰＫＳは、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のＡｖｉＭ遺伝子によってコードされるオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）である。一実施形態では、アルキル化フェノール化合物中間体はオルシノールである。他の一実施形態では、アルキル化フェノール化合物は、３，５−ジメトキシトルエンである。
別の態様では、本発明は、フタル酸無水化合物を生成する方法を提供し、本方法は、ａ）ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系と、を含む改変された組換え宿主細胞を提供することを含む。別の実施形態では、本方法は、ｂ）組換え宿主細胞において生成されたフタル酸無水中間体化合物を単離することをさらに含む。他の一実施形態では、本方法は、ｃ）酸化剤で処理することにより、ステップｂ）のフタル酸無水中間体化合物を酸化することをさらに含む。一実施形態では、フタル酸無水中間体化合物は６−ＭＳＡである。別の実施形態では、フタル酸無水物は、３−ヒドロキシフタル酸無水物である。
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術、表記、および他の科学的用語はすべて、本発明が属する当該技術分野において一般に理解される意味を有するよう意図される。ある場合には、一般に理解される意味の用語は、明確化および／または即時参照のために本明細書において定義されており、本明細書におけるそのような定義の包含は、当該技術分野において一般的に理解されるものに対する実質的な相違を表すものと必ずしも解釈されないものとする。本明細書において記載または参照される技法および手順は、概して、当業者に十分に理解されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ． ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載される広く利用されている分子クローン化方法等の従来の方法を用いて採用される。適切な場合、市販のキットおよび試薬の使用を伴う手順は、別途記載のない限り、概して、製造者が定義したプロトコルおよび／またはパラメータに従って実行される。したがって、本方法、キット、および使用が説明される前に、本発明は、記載される特定の方法、プロトコル、細胞系、動物の種または属、構築物、および試薬に限定されず、言うまでもなく、それ自体が変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態の説明目的のためであって、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限するようには意図されないことも理解されたい。
本明細書および付属の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別途文脈に明確に記載されない限り、複数形の参照を含むことにも留意されたい。
本明細書および特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、記載される整数または整数の群を含むことが示唆されるが、任意の他の整数または整数の群を排除しないことを理解する。
「ＰＫＳ」とは、ポリケチドシンターゼ（例えば６−ＭＳＡＳまたはＯＳＡＳ）を指す。
「ＡＣＰ」とは、アシルキャリアタンパク質を指す。
「ＡＣＰＳ」とは、アシルキャリアタンパク質シンターゼ（例えばホロＡＣＰシンターゼ）を指す。
「ＤＣ」とは、デカルボキシラーゼを指す。
「ＰＫＳ＊」とは、改変されたポリケチドシンターゼまたはＰＫＳ変異型（例えば不活性ケトレダクターゼドメインを有するＰＫＳ）を指す。
「６−ＭＳＡＳ」とは、６−メチルサリチル酸シンターゼを指す。
「ＯＳＡＳ」とは、オルセリン酸シンターゼを指す。
「ＯＯＭＴ」とは、オルシノールＯ−メチルトランスフェラーゼを指す。
「６−ＭＳＡ」とは、６−メチルサリチル酸を指す。
「ＯＳＡ」とは、オルセリン酸を指す。
「ＨＭＢＡ」とは、２−ヒドロキシ−６−メチル安息香酸を指す。
本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、および参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、迅速かつ安価で効率的な様式で、対象とする有機化合物を生成するための方法および材料を提供する。したがって、本発明は、いくつかの商業的および工業的必要性を満たす。用語「有機分子」とは、例えば、芳香族化合物等の炭素および水素から主に構成される任意の分子を指す。対象とする有機化合物は、６−ＭＳＡ／ＨＭＢＡ、ＯＳＡ、メタクレゾール、オルシノール等のフェノールまたはフェノール化合物、３−メチルアニソール、３，５−ジメトキシトルエン、およびフタル酸無水物（例えば３−ヒドロキシフタル酸無水物）等のフタル酸を含むが、これらに限定されない。
具体的には、再生可能資源からの対象とする化合物（例えば、メタクレゾール、オルシノール、メチルアニソール）およびそれらの誘導体の微生物生成は、本発明により想定される。芳香族は官能性芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）を用いて得られ、得られる様々な分子は、殺菌性もしくは薬学的用途のための特殊化学物質を作製するために、または殺菌性もしくは薬学的用途のための化合物の前駆体を作製するために、生体内で形質転換されるか、あるいはさらなる特殊化学物質およびポリマーのための前駆体であり得る高オクタン芳香族もしくはシクロヘキサンおよびシクロヘキサノール様分子を得るためにさらに処理されるか、または石油系およびジェット燃料に対応し、したがって再生可能なエネルギー源として使用することができる。
一態様では、本発明は、フェノール、フェノール化合物、およびフェノール化合物中間体の合成に関する。本明細書に使用される、フェノールまたはフェノール化合物は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）に結合するフェニル基（−Ｃ６Ｈ５）を含む有機化合物を指す。
Figure 2014519853
好ましい実施形態では、フェノールまたはフェノール化合物は、ｍ−クレゾール（３−メチルフェノールとしても知られる）またはオルシノール（５−メチルベンゼン−１，３−ジオールとしても知られる）である。
Figure 2014519853
本発明は、フェノール化合物中間体の合成にも関する。一実施形態では、フェノール化合物中間体は、本明細書に記載される代謝経路のステップのうちの１つにおいて生成される化合物である（例えば図１および図２）。用語「代謝経路」は、１つの酵素反応の生成物が次に酵素反応の基材となる一連の２つ以上の酵素反応を指す。代謝経路の各ステップで、中間体化合物が形成され、後続のステップの基材として利用される。一実施形態では、代謝経路の各ステップは、本明細書に記載される改変された組換え細胞において生じる。別の実施形態では、代謝経路の少なくとも１ステップは、本明細書に記載される改変された組換え細胞において生じ、代謝経路のうちの少なくとも１ステップは、改変された組換え細胞の外で生じる。代謝経路の各ステップで生成された化合物は、「中間体」、または「中間体化合物」、または「化合物中間体」と呼ばれ得る。
一実施形態では、代謝経路は、以下のうちの１つによって触媒される酵素反応を含む：６−ＭＳＡＳ、ＯＳＡＳ、ホロＡＣＰシンターゼ、デカルボキシラーゼ、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、およびそれらの任意の組み合わせ。そのような代謝経路は、本明細書に記載される対象とする化合物ならびに中間体化合物を生成することができる。
別の実施形態では、代謝経路は、ｉ）６−ＭＳＡＳまたはＯＳＡＳ、およびｉｉ）ホロＡＣＰシンターゼによって触媒される酵素反応を含む。一実施形態では、代謝経路は、ホロＡＣＰシンターゼによる６−ＭＳＡＳのパンテテイニル化を含む。他の一実施形態では、代謝経路から生成された化合物は、６−ＭＳＡまたはＯＳＡである。一実施形態では、６−ＭＳＡまたはＯＳＡは、フェノール化合物中間体である。別の実施形態では、６−ＭＳＡは、フタル酸無水物中間体化合物である。
一実施形態では、フェノール化合物中間体は、６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡ）（２−ヒドロキシ−６−メチル安息香酸（ＨＭＢＡ）としても知られる）およびオルセリン酸（ＯＳＡ）からなる群から選択される。別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞および方法は、フェノール化合物中間体から対象とするフェノール化合物を合成するために提供される。他の一実施形態では、ｍ−クレゾールは６−ＭＳＡ中間体から合成されるか、またはオルシノールはＯＳＡ中間体から合成される。
別の実施形態では、６−ＭＳＡは、フタル酸無水物中間体化合物である。他の一実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞および方法は、フェノール化合物中間体からフタル酸無水化合物を合成するために提供される。
別の実施形態では、代謝経路は、ｉ）ＰＫＳ（例えば、６−ＭＳＡＳ、改変された６−ＭＳＡＳまたはＯＳＡＳ）、ｉｉ）ホロＡＣＰシンターゼ、およびｉｉｉ）デカルボキシラーゼによって触媒される酵素反応を含む。他の一実施形態では、代謝経路から生成された化合物は、ｍ−クレゾールまたはオルシノールである。
別の実施形態では、代謝経路は、ｉ）ＰＫＳ（例えば、６−ＭＳＡＳ、改変された６−ＭＳＡＳまたはＯＳＡＳ）、ｉｉ）ホロＡＣＰシンターゼ、およびｉｉｉ）デカルボキシラーゼによって触媒される酵素反応を含む。他の一実施形態では、代謝経路から生成された化合物は、メチル化されたフェノール化合物中間体である。別の実施形態では、メチル化されたフェノール中間体化合物は、ｍ−クレゾールまたはオルシノールである。一実施形態では、ｍ−クレゾールは３−メチルアニソールの中間体であり、オルシノールは３，５−ジメトキシトルエンの中間体である。
別の実施形態では、代謝経路は、ｉ）ＰＫＳ（例えば、６−ＭＳＡＳ、改変された６−ＭＳＡＳまたはＯＳＡＳ）、ｉｉ）ホロＡＣＰシンターゼ、ｉｉｉ）デカルボキシラーゼ、およびｉｖ）Ｏ−メチルトランスフェラーゼによって触媒される酵素反応を含む。他の一実施形態では、代謝経路から生成された化合物は、メチル化されたフェノール化合物である。一実施形態では、反応は、６−ＭＳＡＳ、ホロＡＣＰシンターゼ、デカルボキシラーゼ、およびＯＯＭＴによって触媒され、３−メチルアニソールをもたらす。他の一実施形態では、反応は、改変された６−ＭＳＡＳ（またはＯＳＡＳ）、ホロＡＣＰシンターゼ、デカルボキシラーゼ、およびＯＯＭＴによって触媒され、３，５−ジメトキシトルエンをもたらす。
別の態様では、本発明は、微生物における対象とする有機化合物の生成に関し、微生物における炭水化物源からそのような化合物を生成するための方法を提供する。
本方法は、以下の対象とする有機化合物、特に６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡ）（２−ヒドロキシ−６−メチル安息香酸（ＨＭＢＡ）としても知られる）、ｍ−クレゾール、オルシノール、３−メチルアニソール、３，５−ジメトキシトルエン、トルエン、およびフタル酸のうちの１つを生成することができる微生物を組み込む。本発明は、操作された代謝経路、単離された核酸もしくは操作された核酸、ポリペプチドもしくは操作されたポリペプチド、宿主細胞もしくは遺伝子操作された宿主細胞、対象とする有機化合物を生成するための方法および材料を提供する。
別の態様では、本発明は、天然または非天然の基材上で活性もしくは改善された活性を有する、または広範な基材特異性を有する酵素をコードする操作されたポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本明細書において互換的に使用される用語「ポリペプチド」ならびに用語「タンパク質」および「ペプチド」とは、例えば、遺伝子生成物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前述の他の等価物、変異型、および類似体を含む、アミノ酸のポリマーを指す。用語「酵素活性を有するポリペプチド」とは、反応の完了時にそれ自体が破壊または変更されることなく、他の物質の化学反応を触媒する任意のポリペプチドを指す。典型的に、酵素活性を有するポリペプチドは、１つ以上の基材から１つ以上の生成物の形成を触媒する。いくつかの実施形態では、既存の酵素は、有機生合成で使用するために改変される。いくつかの好ましい実施形態では、対象とする有機化合物の生成に関与する酵素は、６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）、オルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）、ホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼ、デカルボキシラーゼ、およびＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＯＭＴ）を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、酵素は、不活性化ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを含む６−ＭＳＡＳである。別の実施形態では、不活性化ＫＲドメインを含む６−ＭＳＡＳは、改変された組換え細胞において、および本明細書に記載される方法によりオルセリン酸の生成を容易にする。
本発明は、様々な態様において、所望の生成物に到達するために、追加の改変酵素と結合する芳香族ＰＫＳ系、またはその改変された形態、もしくはこれらのうちの２つ以上の部分の様々な成分を採用する。
本発明に利用される反復または「芳香族」ＰＫＳ系は、生成された酵素の触媒部位の反復使用を特徴とする。したがって、これらの芳香族ＰＫＳ系において、特定の種類の活性を有する１つの酵素のみがポリケチドの合成を通して系の関連活性を触媒するように生成される。
いくつかの実施形態では、酵素の反応機構は、基材特異性を変更、拡大、または改善するために、新しい反応を触媒するように変更され得る。酵素構造（例えば結晶構造）が知られている場合、酵素の性質は、合理的な再設計（参照によりそれらの全体が組み込まれる、米国特許出願第ＵＳ２００６０１６０１３８号、同第ＵＳ２００８００６４６１０号、および同第ＵＳ２００８０２８７３２０号を参照のこと）により改変され得ることを理解されたい。酵素の性質における改変または改善は、実質的に酵素の構造−機能および／または別の分子との相互作用（例えば、基材対非天然基材）を混乱させる可能性があるポリペプチド鎖の中に改変を導入することにより生じ得る。ポリペプチドのいくつかの領域が酵素活性に重要であり得ることは当該技術分野において周知である。例えば、触媒に関与するアミノ酸の組成物および／または基材結合ドメインにおける小さな混乱は、酵素の機能に対して有意な作用を有する。いくつかのアミノ酸残基は、酵素の２次または３次構造を維持するために重要な位置にある場合があり、改変されると、酵素の性質において顕著な変化も生成する。いくつかの実施形態では、潜在的な経路成分は、前述のいずれかの変異型である。そのような変異型は、ランダム突然変異誘発により生成されるか、または例えば変更された基材特異性、増加した酵素活性、より大きい安定性等を有する酵素活性の生成のための合理的な設計によって生成され得る。したがって、いくつかの実施形態では、所望の性質を有する酵素を生成する参照親酵素に対する改変の数は、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、もしくは２０以上のアミノ酸、参照酵素を構成するアミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大２０％、アミノ酸の総数の最大３０％、アミノ酸の総数の最大４０％、またはアミノ酸の総数の最大５０％を含み得る。一実施形態では、参照または親酵素は、ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを取り除くために改変される６−ＭＳＡＳである。別の実施形態では、ＫＲドメインを欠損する改変された６−ＭＳＡＳは、細胞において、または本明細書に記載される方法によりオルセリン酸を生成することが可能である。
当業者は、本明細書に例示される操作された経路はこれに限定されないが種特異的遺伝子に関して記載され、核酸またはアミノ酸配列のホモログもしくはオルソログを包含することを理解する。ホモログおよびオルソログ配列は、当該技術分野において既知の方法を用いて整合されるとき、比較的高度の配列同一性／類似性を保有する。
本発明の態様は、新しい代謝能力または新しい代謝経路を備えるように操作された新しい微生物または「遺伝子改変された」微生物もしくは宿主細胞に関する。本明細書で使用される、用語「遺伝子改変された」微生物とは、参照種の野生型株に通常は見られない少なくとも１つの遺伝的変更を有する微生物に関する。いくつかの実施形態では、遺伝的に操作された微生物は、代謝経路の重要点で少なくとも１つの特定の酵素を発現または過剰発現する、および／または代謝障害を克服もしくは回避するために、他の酵素の合成を遮断するように操作される。
本発明の態様は、操作された代謝経路を設計し作製するための方法を提供する。本発明のいくつかの態様では、１つ以上の利用可能で持続可能な基材から対象とする生成物を作製するための代替え経路は、対象とする１つ以上の宿主細胞または微生物において作製され得る。対象とする化合物を作製するための操作された経路は、複数の酵素を伴うことができ、したがって、経路を通る流束は、対象とする生成物の生成に最適ではない可能性があることを理解されたい。したがって、本発明のいくつかの態様では、流束は、互いに対する経路酵素の活性レベルを調節することにより最適に平衡が保たれる。そのような調節の例は、本明細書全体を通して提供される。
一態様では、本発明は、遺伝子改変された宿主細胞または微生物、および対象とする有機化合物を生成するためにそれを使用する方法を提供する。本明細書で使用される、宿主細胞とは、生体内または生体外の真核細胞、原核細胞、または単細胞実体として培養された多細胞生物からの細胞（例えば細胞系）を指す。宿主細胞は、原核生物（例えば大腸菌または枯草菌等の細菌）または真核生物（例えば酵母、哺乳類または昆虫の細胞）であり得る。
例えば、宿主細胞は、細菌細胞（例えば大腸菌、枯草菌、マイコバクテリア菌種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、または他の好適な細菌細胞）、古細菌（例えばメタノコッカス・ジャナスキー（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、もしくはメタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、または他の好適な古細菌細胞）、酵母細胞（例えばサッカロマイセス・セレヴィシエ、分裂酵母（Ｓ．Ｐｏｍｂｅ）等のサッカロマイセス種、ピキア（Ｐｉｃｃｈｉａ）種、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．Ａｌｂｉｃａｎｓ）等のカンジタ種、または他の好適な酵母種）であり得る。
いくつかの組換え宿主において、抗菌活性を有するポリケチドが望ましいとき、合成後改変を通して生成されたポリケチドを活性化することが必要である場合もあることに留意されたい。これがもし特定の宿主の場合であるならば、宿主は、例えば形質転換によって、これらの改変をもたらすのに必要なそれらの酵素を含むように改変される。そのような酵素の中では、例えばグリコシル化酵素である。
したがって、例えば本発明のポリケチドを生成するための好適な宿主は、ＰＫＳに関連する活性のうちの１つ以上を有するタンパク質を生成するための発現系を含むベクター、典型的にはプラスミドを含むように改変される。様々な活性を異なる発現ベクターに配置することにより、高度な多様性を達成することができる。天然に存在する細胞、遺伝的に操作された細胞（形質転換細胞、合成細胞等）等の様々な宿主を使用することができ、複数のベクターの組み込みを確実にするために選択マーカーが考案され得る任意の好適な宿主細胞は、容易に使用することができる。好ましい宿主細胞は、酵母、大腸菌、および他の細菌（酪酸生成菌およびストレプトマイセス種等）、真菌（ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種等）、放線菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種（ｎ−ブタノールを生成するクロストリジウム・アセブチリカム（Ｃ．Ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）等）、メタノサエタ・テルモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、長鎖アルケンを生成するミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｌｕｔｅｕｓ）、ビブリオ・ファーニシイ（Ｖｉｂｒｉｏ Ｆｕｒｎｉｓｓｉｉ）（ｎ−アルカンを生成するＭ１株等）、および植物細胞を含むが、哺乳類もしくは昆虫の細胞または他の好適な組換え宿主が使用できない理論的理由はない。酵母株の中で好ましいものは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリスである。好ましい植物細胞は、単細胞の藻形態、珪藻等の藻類細胞である。しかしながら、対象とする固有のＰＫＳ酵素を有するとき、他の種類および株は有用であり得る（例えば、第ＷＯ ９８／５５６２５号を参照のこと）。したがって、米国特許第７，２５６，０２３号は、例えば、健康上の利益を有することが主張されるＤＨＡおよびＥＰＡ、オメガ−３油を作製するための多価不飽和脂肪酸ポリケチドシンターゼを教示する。そのシンターゼを保有する好ましい宿主細胞は、例えばＤＨＡおよびドコサペンタエン酸が豊富な大量のトリアシルグリセロールを蓄積するスラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）海洋微生物であるシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）である。
本発明の実践において、植物細胞、およびいくつかの実施形態では単細胞植物細胞が使用され得る。例えば、対象とするベクター系の宿主として、以下の種を使用することができる：緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）のクラスに属する微細藻類であるネオクロリス・オレオアブンダンス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ）、緑藻綱のクラスの、好ましくは一定の攪拌下で維持される単細胞藻類であるセネデスムス・ジモルフス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、珪藻であるフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、ハプト藻綱（Ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）（プリムネシウム藻綱（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｏｐｈｙｃｅａｅ））のクラスのメンバーである細胞内で石灰化する能力を有する単細胞円石藻類であるプリュウロクリシス・カルテレ（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ ｃａｒｔｅｒａｅ）、リムネシィウム・パルバム（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、海洋単細胞藻類であるテトラセルミス・チュイ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｃｈｕｉ）、テトラセルミス・スエシカ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｕｅｃｉｃａ）、微細藻類であるイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）、ナンノクロリス・オクラタ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ ｏｃｕｌａｔａ）とも呼ばれ、ナンノクロリス・アトムス・ブッチャー（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ ａｔｏｍｕｓ Ｂｕｔｃｈｅｒ）、ナンノクロリス・マクラタ・ブッチャー（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｃｕｌａｔａ Ｂｕｔｃｈｅｒ）、ナノクロロプシス・ガジタナ・ルビアン（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ Ｌｕｂｉａｎ）、およびナノクロロプシス・オクラタ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｕｌａｔａ）（Ｄｒｏｏｐ）と同一の群であるナンノクロロプシス・サリナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓａｌｉｎａ）、緑藻類であるボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、高ＣＯ２封鎖率も有する早成長株であるドナリエラ・ターティオレクタ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ）等。
言うまでもなく、宿主の選択は、発現系ならびに選択可能マーカーに関連する対照配列の選択を決定付ける。例えば、大腸菌の使用に好適なプロモーター系は、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、およびλ−由来ＰＬプロモーター、およびＮ−遺伝子リボソーム結合部位を含む。酵母に関して、好適な対照配列は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）等の糖分解酵素の合成のためにプロモーターを含む。他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ−１およびＡＤＨ−２）、イソシトクロム−Ｃ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用に関与する酵素のものを含む。コード配列の３’端でターミネーター配列が望ましいことも既知である。
発酵方法は、その炭素利用経路または発現制御のモードが異なるため、特定の酵母株に適応され得る。例えば、サッカロマイセス酵母の発酵は、単一のグルコース供給、複合窒素源（例えばカゼイン加水分解）、および複数のビタミン補給を必要とし得る。これは、グリセロール、メタノール、および微量の鉱物供給を必要とし得るが、最適な成長および発現に関して単純なアンモニウム（窒素） 塩のみを必要とするメチロトローフ酵母のピキア・パストリスと対照的である。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．（１９９０）９：９５ １０４、米国特許第５，３２４，６３９号、およびＦｉｅｓｃｈｋｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９８７）２９：１１１３ １１２１を参照されたい。
メチロトローフ酵母においていくつかのメタノール応答遺伝子があり、それぞれの発現は、メタノール応答調節領域（プロモーターとも称される）によって制御される。そのようなメタノール応答プロモーターのいずれも、本発明の実践における使用に適している。具体的な調節領域の例としては、ピキア・パストリスＡＯＸ１由来の１級アルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター、ピキア・パストリスＡＯＸ２由来の２級アルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター、ピキア・パストリス（ＤＡＳ）由来のジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子のプロモーター、プリムネシウム・パストリス由来のＰ４０遺伝子のプロモーター、プリムネシウム・パストリス由来のカタラーゼ遺伝子のプロモーター等が挙げられる。ピキアとの使用に好適な媒体は、米国特許第５，２３１，１７８号および同第５，３２４，６３９号に記載されている。
好適な宿主細胞の例示的な例としては、任意の古細菌、細菌、または真核細胞を含む。古細菌細胞の例としては、アエロパイラム（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）属、アルカエオグロブス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ）属、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノコッカス（メタノコッカス）属、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、スルフォロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、およびサーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属に属するものが挙げられるが、これらに限定されない。古細菌種の例示的な例としては、アエロパイラム・ペルニクス、アルカエオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコッカス・ジャナスキー、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、ピロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、サーモプラスマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。
細菌細胞の例としては、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾバクター（Ａｚｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フォルミジウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、セネデスムン（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｎ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｒｏｍｙｃｅｓ）属、シネコッカス（Ｓｙｎｎｅｃｏｃｃｕｓ）属、およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属に属するものが挙げられるが、これらに限定されない。
細菌種の例示的な例としては、枯草菌、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・アンモニアジェネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、バクテリウム・イマリオフィルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）、クロストリジウムベイエリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｇｅｒｉｎｃｋｉｉ）、エンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ）、エシェリキア・コライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・メバロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）、シュードモナス・プディカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｄｉｃａ）、ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドスピリラム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
嫌気性細菌は、アセトバクテリウム・キブイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋｉｖｕｉ）、アセトバクテリウム・ウッディ（Ａ．ｗｏｏｄｉｉ）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、クロストリジウム・アセティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・フォルモアセチカム（Ｃ．ｆｏｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・クルベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、クロストリジウム・サーモアセチカム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・サーモサッカロリティカム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ユーバクテリウム・リモサム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ）、ラクトバチルス・カセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ペプトストレプトコッカス・プロダクト（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）、およびクロストリジウム・ルジュングダーリイ（Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、ならびにこれらの混合物を含むが、これらに限定されない細菌の１株または酪酸を生成する細菌のうちの２つ以上を含む混合培養物であってよい。
いくつかの実施形態では、嫌気性細菌生物は、代謝的に操作される。本明細書で使用される、嫌気性生物は、成長に酸素（すなわち、嫌気条件）を必要としない任意の生物である。有利に、細菌細胞は、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｎｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラブム（Ｂ．ｆｌａｖｕｍ）、またはブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム（Ｂ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）細胞であってよく、これらの株は、現在、細菌発酵プロセスを用いてアミノ化合物を作製するために、工業的に採用されている。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムは、アミノ酸生成物（例えば、Ｌ−グルタメート、Ｌ−リジン、Ｅｇｇｌｅｇｉｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｎｉｃｕｍ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＵＳＡ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）に広く使用されてきた。
概して、細菌宿主細胞が使用される場合、非病原性株が好ましい。非病原性株を有する種の例示的な例としては、枯草菌、エシェリキア・コライ、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシラス・へルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、緑膿菌、シュードモナス・メバロニ、シュードモナス・プジダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｄｉｔａ）、ロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・カプスラタス、ロドスピリラム・ルブラム等が挙げられるが、これらに限定されない。
真核生物細胞の例としては、真菌細胞が挙げられるが、これに限定されない。真菌細胞の例としては、アスペルギルス属、カンジタ属、クリソスポリウム属、クリオトコッカス（Ｃｒｙｏｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、フザリウム属、クリベロマイセス属、ネオティホディウム（Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ）属、ノイロスポラ属、ペニシリウム属、ピキア属、サッカロマイセス属、トリコデルマ属、およびキサントフィロマイセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）属（以前のファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ））に属するものが挙げられるが、これらに限定されない。
真核生物種の例示的な例としては、アスペルギルス・ニーヅランス、アスペルギルス・ニガー、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、カンジダ・アルビカンス、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・ベエナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ピキア アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・コダマ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｄａｍａｅ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・オパンティエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・パストリス、ピキア・ピジュペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・クエルカム（Ｐｉｃｈｉａ ｑｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・スティピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・オレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・オウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ）、サッカロマイセス・バヤヌス（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・ボウラルディ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉ）、サッカロマイセス・セレヴィシエ、ストレプトマイセス・ファンギシディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオクロモジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラメウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、およびキサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）（以前のファフィア・ロドザイマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ））が挙げられるがこれらに限定されない。
概して、真核細胞が使用される場合、非病原性株が好ましい。非病原性株を有する種の例示的な例としては、フザリウム・グラミネアルム、フザリウム・ベエナツム、ピキア・パストリス、サッカロマイセス・ボウラルディ、およびサッカロマイセス・セレヴィシエが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、生物は、黄金藻類（黄色植物（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）界の微生物等）、緑色藻類、珪藻、渦鞭毛藻類（例えばクリプテコディニウム・コーニー等のクリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属のメンバーを含む渦鞭毛藻（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）目の微生物等）、酵母ならびにモルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）およびモルチエレラ属シュマッカリ亜属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｅｃｔ． ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）を含むが、これらに限定されないムコール（Ｍｕｃｏｒ）およびモルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属の真菌からなる群から選択されるものを含む。黄色植物の微生物群のメンバーは、以下の微生物の群を含む微細藻類および藻類様微生物を含む：ハマトレス（Ｈａｍａｔｏｒｅｓ）、プロテロモナズ（Ｐｒｏｔｅｒｏｍｏｎａｄｓ）、オパリネス（Ｏｐａｌｉｎｅｓ）、デベルペイエラ（Ｄｅｖｅｌｐａｙｅｌｌａ）、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）、ラビリンスリド（Ｌａｂｒｉｎｔｈｕｌｉｄｓ）、スラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）、ビオセシド（Ｂｉｏｓｅｃｉｄｓ）、オオミセテス（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ハイポチトリジオミセテス（Ｈｙｐｏｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、コマチオン（Ｃｏｍｍａｔｉｏｎ）、レチキュロスファエラ（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｐｈａｅｒａ）、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、ペラゴコッカス（Ｐｅｌａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、オリコラ（Ｏｌｌｉｃｏｌａ）、アウレオコッカス（Ａｕｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、パルマレス（Ｐａｒｍａｌｅｓ）、珪藻、キサントフィテス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔｅｓ）、ファエオフィテス（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔｅｓ）（褐藻類）、ユースチグマトフィテス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ）、ラフィドフィテス（Ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔｅｓ）、シヌリドス（Ｓｙｎｕｒｉｄｓ）、アキソディネス（Ａｘｏｄｉｎｅｓ）（リゾクロムリナアレス（Ｒｈｉｚｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａａｌｅｓ）、ペディネルラレス（Ｐｅｄｉｎｅｌｌａｌｅｓ）、ディクチオカレス（Ｄｉｃｔｙｏｃｈａｌｅｓ）を含む）、クリソメリダレス（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｒｉｄａｌｅｓ）、サルキノクリシダレス（Ｓａｒｃｉｎｏｃｈｒｙｓｉｄａｌｅｓ）、ヒドルラレス（Ｈｙｄｒｕｒａｌｅｓ）、ヒバーディアレス（Ｈｉｂｂｅｒｄｉａｌｅｓ）、およびクロムリナレス（Ｃｈｒｏｍｕｌｉｎａｌｅｓ）。スラウストキトリドは、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属（種はアグレガツム（ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）、リムナセウム（ｌｉｍｎａｃｅｕｍ）、マングロベイ（ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）、ミヌツム（ｍｉｎｕｔｕｍ）、オクトスポルム（ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｍ）を含む）、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属（種はアルジメンタレ（ａｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、アウレウム（ａｕｒｅｕｍ）、ベンチコラ（ｂｅｎｔｈｉｃｏｌａ）、グロボスム（ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、キンネイ（ｋｉｎｎｅｉ）、モチバム（ｍｏｔｉｖｕｍ）、マルチルジメンタレ（ｍｕｌｔｉｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、パキデルマム（ｐａｃｈｙｄｅｒｍｕｍ）、プロリフェルム（ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｍ）、ロゼウム（ｒｏｓｅｕｍ）、ストリアツム（ｓｔｒｉａｔｕｍ）を含む）、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属（種はアメボイデア（ａｍｏｅｂｏｉｄｅａ）、ケルゲレンシス（ｋｅｒｇｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ミヌタ（ｍｉｎｕｔａ）、プロフンダ（ｐｒｏｆｕｎｄａ）、ラジアテ（ｒａｄｉａｔｅ）、サイレンス（ｓａｉｌｅｎｓ）、サルカリアナ（ｓａｒｋａｒｉａｎａ）、シゾキトロプス（ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｏｐｓ）、ビスルゲンシス（ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ）、ヨルケンシス（ｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）を含む）、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属（種はハリオチジス（ｈａｌｉｏｔｉｄｉｓ）、ケルゲレンシス（ｋｅｒｇｕｅｌｅｎｓｉｓ）、プロフンダ（ｐｒｏｆｕｎｄａ）、ストッキノイ（ｓｔｏｃｃｈｉｎｏｉ）を含む）、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属（種はマリナム（ｍａｒｉｎｕｍ）を含む）、アルトルニア（Ａｌｔｈｏｒｎｉａ）属（種はクロウチー（ｃｒｏｕｃｈｉｉ）を含む）、およびエリナ（Ｅｌｉｎａ）属（種はマリサルバ（ｍａｒｉｓａｌｂａ）、シノリフィカ（ｓｉｎｏｒｉｆｉｃａ）を含む）を含む。ラブリンツリド（Ｌａｂｒｉｎｔｈｕｌｉｄｓ）は、ラビリンツラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属（種はアルゲレンシス（ａｌｇｅｒｉｅｎｓｉｓ）、コエノシスチス（ｃｏｅｎｏｃｙｓｔｉｓ）、チャットニー（ｃｈａｔｔｏｎｉｉ）、マクロシスチス（ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、マクロシスチス・アトランチカ（ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ）、マクロシスチス・マクロシスチス（ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、マリナ（ｍａｒｉｎａ）、ミヌタ（ｍｉｎｕｔａ）、ロスコフジエンシス（ｒｏｓｃｏｆｆｅｎｓｉｓ）、バルカノビー（ｖａｌｋａｎｏｖｉｉ）、ビテリナ（ｖｉｔｅｌｌｉｎａ）、ビテリナ・パシフィカ（ｖｉｔｅｌｌｉｎａ ｐａｃｉｆｉｃａ）、ビテリナ・ビテリナ（ｖｉｔｅｌｌｉｎａ ｖｉｔｅｌｌｉｎａ）、ゾプフィ（ｚｏｐｆｉ）を含む）、ラブリントミクサ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｏｍｙｘａ）属（種はマリナを含む）、ラビリンツロイデス（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属（種はハリオチジス（ｈａｌｉｏｔｉｄｉｓ）、ヨルケンシス（ｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）を含む）、ディプロフリス属（種はアルケリ（ａｒｃｈｅｒｉ）を含む）、ピロソルス（Ｐｙｒｒｈｏｓｏｒｕｓ）属＊（種はマリヌス（ｍａｒｉｎｕｓ）を含む）、ソロジプロフリス（Ｓｏｒｏｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）属＊（種はステルコレア（ｓｔｅｒｃｏｒｅａ）を含む）、クラミドミクサ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｙｘａ）＊属（種はラビリンツロイデス、モンタナ（ｍｏｎｔａｎａ）を含む）を含む。
好適な生物は、自然環境から収集することを含む、いくつかの利用可能な供給源から得ることができる。例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）は、現在、上記に識別される多くの公共に利用可能な微生物株を記載している。本明細書で使用される、任意の生物または生物の任意の特定の型は、野生株、突然変異体、または組換え型を含む。これらの生物を培養または成長させるための成長条件は当該技術分野において既知であり、これらの生物の少なくともいくつかの適切な成長条件は、例えば米国特許第５，１３０，２４２号、米国特許第５，４０７，９５７号、米国特許第５，３９７，５９１号、米国特許第５，４９２，９３８号、米国特許第５，７１１，９８３号、および米国特許第６，６０７，９００号に開示されており、これらすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。好ましくは、有効培地は迅速な微生物成長も促進する。微生物は、バッチ、流加、および連続を含むが、これらに限定されない従来の発酵モードいおいて培養され得る。
本発明のさらなる実施形態では、遺伝子導入植物は、穀類、大豆、菜種（アブラナ、特にキャノーラおよび冬アブラナ（ｗｉｎｔｅｒ ｏｉｌ ｓｅｅｄ ｒａｐｅ）を含む）、綿サトウキビ、およびジャガイモ、特にトウモロコシ、大豆、菜種（アブラナ、特にキャノーラおよび冬アブラナを含む）、綿、小麦、および、米を含む群から選択される。
本発明の別の実施形態では、遺伝子導入植物は裸子植物、特にエゾマス、マツ、またモミである。
好ましい一実施形態では、宿主植物は、カエデ科、ウルシ科、セリ科、キク科、アブラナ科、サボテン科、ウリ科、トウダイグサ科、マメ科、アオイ科、スイレン科、ケシ科、バラ科、ヤナギ科、ナス科、ヤシ科、パイナップル科、カヤツリグサ科、アヤメ科、ユリ科、ラン科、リンドウ科、シソ科（Ｌａｂｉａｃｅａｅ）、モクレン科、キンポウゲ科、スイカズラ科（Ｃａｒｉｆｏｌａｃｅａｅ）、アカネ科、ゴマノハグサ科、ナデシコ科、ツツジ科、タデ科、スミレ科、イグサ科、またはイネ科から選択され、好ましくは、セリ科、キク科、アブラナ科、ウリ科、マメ科、ケシ科、バラ科、ナス科、ユリ科、またはイネ科の群から選択される植物から選択される。好ましいものは作物植物、特に、上述の科および属等の宿主細胞としての上述の植物であり、例えば、好ましい種は、アナカルジウム・オシデンタレ（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、カレンデュラ・オフィシナリス（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、カルタムス・チンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、チコリウム・インチバス（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｉｎｔｙｂｕｓ）、シナラ・スコリムス（Ｃｙｎａｒａ ｓｃｏｌｙｍｕｓ）、ヘリアンタス・アヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ）、タゲテス・ルシダ（Ｔａｇｅｔｅｓ ｌｕｃｉｄａ）、タゲテス・エレクタ（Ｔａｇｅｔｅｓ ｅｒｅｃｔａ）、タゲテス・テヌイフォリア（Ｔａｇｅｔｅｓ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）；ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）；コリラス・アベラナ（Ｃｏｒｙｌｕｓ ａｖｅｌｌａｎａ）、コリラス・コラルナ（Ｃｏｒｙｌｕｓ ｃｏｌｕｒｎａ）、ボラゴ・オフィシナリス（Ｂｏｒａｇｏ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）；ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ラパ種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｓｐ．）、シナピス・アルベンシス（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｒｖｅｎｓｉｓ）、ブラシカ・ジュンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、ブラシカ・ジュンセア変種ジュンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ ｖａｒ．ｊｕｎｃｅａ）、ブラシカ・ジュンセア変種クリスピフォリア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ ｖａｒ． ｃｒｉｓｐｉｆｏｌｉａ）、ブラシカ・ジュンセア変種フォリオサ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ ｖａｒ． ｆｏｌｉｏｓａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）、ブラシカ・シナピオイデス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｉｎａｐｉｏｉｄｅｓ）、メラノシナピス・コミュニス（Ｍｅｌａｎｏｓｉｎａｐｉｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、アナナ・コモサス（Ａｎａｎａ ｃｏｍｏｓｕｓ）、アナナス・アナナス（Ａｎａｎａｓ ａｎａｎａｓ）、ブロメリア・コモサ（Ｂｒｏｍｅｌｉａ ｃｏｍｏｓａ）、カリカ・パパヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、カナビス・サチベ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖｅ）、イポメア・バタタス（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、イポメア・パンデュラタ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｐａｎｄｕｒａｔａ）、コンボルバルス・バタタス（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ ｂａｔａｔａｓ）、コンボルバルス・チリアセウス（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ ｔｉｌｉａｃｅｕｓ）、イポモア・ファスチギアタ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｆａｓｔｉｇｉａｔａ）、イポモア・チリアセア（Ｉｐｏｍｏｅａ ｔｉｌｉａｃｅａ）、イポモア・トリロバ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｔｒｉｌｏｂａ）、コンボルバルス・パンデュラタス（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ ｐａｎｄｕｒａｔｕｓ）、ベタ・バルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ベタ・バルガリス変種アルチシマ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ．ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、ベタ・バルガリス変種バルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ベタ・マリチマ（Ｂｅｔａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、ベタ・バルガリス変種ペレニス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ．ｐｅｒｅｎｎｉｓ）、ベタ・バルガリス変種コンジチバ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ．ｃｏｎｄｉｔｉｖａ）、ベタ・バルガリス変種エスクレンタ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、ククルビタ・マキシマ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）、ククルビタ・ミキシタ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｉｘｔａ）、ククルビタ・ペポ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ）、ククルビタ・モスカタ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）、オレア・エウロペア（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、マニホット・ウチリシマ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｕｔｉｌｉｓｓｉｍａ）、ジャニファ・マニホット（Ｊａｎｉｐｈａ ｍａｎｉｈｏｔ）、ジャトロファ・マニホット（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｍａｎｉｈｏｔ）、マニホット・アイピル（Ｍａｎｉｈｏｔ ａｉｐｉｌ）、マニホット・ダルシス（Ｍａｎｉｈｏｔ ｄｕｌｃｉｓ）、マニホット・マニホット（Ｍａｎｉｈｏｔ ｍａｎｉｈｏｔ）、マニホット・メラノバシス（Ｍａｎｉｈｏｔ ｍｅｌａｎｏｂａｓｉｓ）、マニホット・エスクレンタ（Ｍａｎｉｈｏｔｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、リシヌス・コミュニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ピサム・サチバム（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ピサム・アルベンセ（Ｐｉｓｕｍ ａｒｖｅｎｓｅ）、ピサム・ヒュミレ（Ｐｉｓｕｍ ｈｕｍｉｌｅ）、メジカゴ・サチバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、メジカゴ・ファルカタ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｆａｌｃａｔａ）、メジカゴ・バリア（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｖａｒｉａ）、グリシン・マックス・ドリコス・ソヤ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ｄｏｌｉｃｈｏｓ Ｓｏｊａ）、グリシン・グラシリス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、グリシン・ヒスピダ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｈｉｓｐｉｄａ）、ファセオラス・マックス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｍａｘ）、ソヤ・ヒスピダ（Ｓｏｊａ ｈｉｓｐｉｄａ）、ソヤ・マックス（Ｓｏｊａ ｍａｘ）、ココス・ヌシフェラ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、ペラルゴニウム・グロスラリオイデス（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉｏｉｄｅｓ）、オレウム・ココアス（Ｏｌｅｕｍ ｃｏｃｏａｓ）、ラウラス・ノビリス（Ｌａｕｒｕｓ ｎｏｂｉｌｉｓ）、ペルセア・アメリカーナ（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、アラキス・ヒポゲア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、リナム・ウシタチシマム（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、リナム・ヒュミレ（Ｌｉｎｕｍ ｈｕｍｉｌｅ）、リナム・オーストリアカム（Ｌｉｎｕｍ ａｕｓｔｒｉａｃｕｍ）、リナム・ビエネ（Ｌｉｎｕｍ ｂｉｅｎｎｅ）、リナム・アングスチフォリウム（Ｌｉｎｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ）、リナム・カタルチカム（Ｌｉｎｕｍ ｃａｔｈａｒｔｉｃｕｍ）、リナム・フラバム（Ｌｉｎｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、リナム・グランジフロラム（Ｌｉｎｕｍ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）、アデノリナム・グランジフロラム（Ａｄｅｎｏｌｉｎｕｍ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）、リナム・レウィシ（Ｌｉｎｕｍ ｌｅｗｉｓｉｉ）、リナム・ナルボネンセ（Ｌｉｎｕｍ ｎａｒｂｏｎｅｎｓｅ）、リナム・ペレネ（Ｌｉｎｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ）、リナム・ペレネ変種レウィシ（Ｌｉｎｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ ｖａｒ． ｌｅｗｉｓｉｉ）、リナム・プラテンセ（Ｌｉｎｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ）、リナム・トリギナム（Ｌｉｎｕｍ ｔｒｉｇｙｎｕｍ）、プニカ・グラナタム（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ゴシピウム・アルボレウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｕｍ）、ゴシピウム・バルバデンセ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、ゴシピウム・ヘルバセウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、ゴシピウム・タルベリ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｔｈｕｒｂｅｒｉ）、ムサ・ナナ（Ｍｕｓａ ｎａｎａ）、ムサ・アクミナタ（Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ）、ムサ・パラジシアカ（Ｍｕｓａ ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）、ムサ属の種（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、エラエイス・ギネンシス（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）、パパベル・オリエンタレ（Ｐａｐａｖｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）、パパベル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ ｒｈｏｅａｓ）、パパベル・デュビウム（Ｐａｐａｖｅｒ ｄｕｂｉｕｍ）、セサマム・インジカム（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）、ピペル・アダンカム（Ｐｉｐｅｒ ａｄｕｎｃｕｍ）、ピペル・アマラゴ（Ｐｉｐｅｒ ａｍａｌａｇｏ）、ピペル・アングスチフォリウム（Ｐｉｐｅｒ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ）、ピペル・アウリタム（Ｐｉｐｅｒ ａｕｒｉｔｕｍ）、ピペル・ベテル（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｅｌ）、ピペル・クベバ（Ｐｉｐｅｒ ｃｕｂｅｂａ）、ピペル・ロンガム（Ｐｉｐｅｒ ｌｏｎｇｕｍ）、ピペル・ニグラム（Ｐｉｐｅｒ ｎｉｇｒｕｍ）、ピペル・レトロフラクタム（Ｐｉｐｅｒ ｒｅｔｒｏｆｒａｃｔｕｍ）、アルタンテ・アダンカ（Ａｒｔａｎｔｈｅ ａｄｕｎｃａ）、アルタンテ・エロンガタ（Ａｒｔａｎｔｈｅ ｅｌｏｎｇａｔａ）、ペペロミア・エロンガタ（Ｐｅｐｅｒｏｍｉａ ｅｌｏｎｇａｔａ）、ピペル・エロンガタム（Ｐｉｐｅｒ ｅｌｏｎｇａｔｕｍ）、ステフェンシア・エロンガタ（Ｓｔｅｆｆｅｎｓｉａ ｅｌｏｎｇａｔａ）、ホルデウム・バルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホルデウム・ジュバタム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｊｕｂａｔｕｍ）、ホルデウム・マリナム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｍｕｒｉｎｕｍ）、ホルデウム・セカリナム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｓｅｃａｌｉｎｕｍ）、ホルデウム・ジスチコン（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｄｉｓｔｉｃｈｏｎ）、ホルデウム・エギセラス（Ｈｏｒｄｅｕｍ ａｅｇｉｃｅｒａｓ）、ホルデウム・ヘキサスチコン（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｈｅｘａｓｔｉｃｈｏｎ）、ホルデウム・ヘキサスチカム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｈｅｘａｓｔｉｃｈｕｍ）、ホルデウム・イレグラレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ホルデウム・サチバム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ホルデウム・セカリナム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｓｅｃａｌｉｎｕｍ）、アベナ・サチバ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、アベナ・ファツア（Ａｖｅｎａ ｆａｔｕａ）、アベナ・ビザンチナ（Ａｖｅｎａ ｂｙｚａｎｔｉｎａ）、アベナ・ファツア変種サチバ（Ａｖｅｎａ ｆａｔｕａ ｖａｒ．ｓａｔｉｖａ）、アベナ・ハイブリダ（Ａｖｅｎａ ｈｙｂｒｉｄａ）、モロコシ・ビコロル（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、モロコシ・ハレペンセ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｅ）、モロコシ・サッカラタム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓａｃｃｈａｒａｔｕｍ）、モロコシ・バルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、アンドロポゴン・ドルモンジ（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ）、ホルカス・ビコロル（Ｈｏｌｃｕｓ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ホルカス・モロコシ（Ｈｏｌｃｕｓ ｓｏｒｇｈｕｍ）、モロコシ・エチオピカム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ａｅｔｈｉｏｐｉｃｕｍ）、モロコシ・アルンジナセウム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍ）、モロコシ・カフロラム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｃａｆｆｒｏｒｕｍ）、モロコシ・セルナム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｃｅｒｎｕｕｍ）、モロコシ・ドシュナ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｄｏｃｈｎａ）、モロコシ・ドルモンジ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ）、モロコシ・デュラ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｄｕｒｒａ）、モロコシ・ギネンセ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｇｕｉｎｅｅｎｓｅ）、モロコシ・ランセオラタム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ）、モロコシ・ネルボサム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｎｅｒｖｏｓｕｍ）、モロコシ・サッカラタム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓａｃｃｈａｒａｔｕｍ）、モロコシ・スブグラブレセンス（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｕｂｇｌａｂｒｅｓｃｅｎｓ）、モロコシ・ベルチシリフロラム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｆｌｏｒｕｍ）、モロコシ・バルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホルカス・ハレペンシス（Ｈｏｌｃｕｓ
ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ）、モロコシ・ミリアセウム・ミレット（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ ｍｉｌｌｅｔ）、パニカム・ミリタセウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉｔａｃｅｕｍ）、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、トリチカム・エスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トリチカム・デュラム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、トリチカム・ツルギダム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ）、トリチカム・ヒベルナム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｈｙｂｅｒｎｕｍ）、トリチカム・マチャ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍａｃｈａ）、トリチカム・サチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）またはトリチカム・バルガレ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、コフィア属の種（Ｃｏｆｅａ ｓｐｐ．）、コフィア・アラビカ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）、コフィア・カネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、コフィア・リベリカ（Ｃｏｆｆｅａ ｌｉｂｅｒｉｃａ）、カプシカム・アナム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、カプシカム・アナム変種グラブリウスクラム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ ｖａｒ．ｇｌａｂｒｉｕｓｃｕｌｕｍ）、カプシカム・フルテセンス（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、カプシカム・アナム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ソラナム・メロンゲナ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、リコペルシコン・リコペルシカム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、リコペルシコン・ピリフォルメ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｙｒｉｆｏｒｍｅ）、ソラナム・インテグリフォリウム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉｕｍ）、ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、またはカメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）である。
ウルシ科、例えば、ピスタチア（Ｐｉｓｔａｃｉａ）属、マンギフェラ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ）属、アナカルジウム（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ）属、例えば、ピスタチア・ベラ（Ｐｉｓｔａｃｉａ ｖｅｒａ）種［ピスタチオ、ピスタジエ（Ｐｉｓｔａｚｉｅ）］、マンギフェル・インディカ（Ｍａｎｇｉｆｅｒ ｉｎｄｉｃａ）種［マンゴ］またはアナカルジウム・オシデンタレ（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）種［カシュー］；キク科、例えば、カレンデュラ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）属、カルタムス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）属、センタウレア（Ｃｅｎｔａｕｒｅａ）属、シコリウム（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）属、シナラ（Ｃｙｎａｒａ）属、ヘリアンタス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）属、ラクツカ（Ｌａｃｔｕｃａ）属、ロカスタ（Ｌｏｃｕｓｔａ）属、タゲテス（Ｔａｇｅｔｅｓ）属、バレリアナ（Ｖａｌｅｒｉａｎａ）属、例えば、カレンデュラ・オフィシナリス種［マリゴールド］、カルタムス・チンクトリウス種［サフラワー］、センタウレア・シアヌス（Ｃｅｎｔａｕｒｅａ ｃｙａｎｕｓ）種［コーンフラワー］、チコリウム・インチバス種［ブルーデイジー］、シナラ・スコリムス種［チョウセンアザミ］、ヘリアンタス・アヌス種［ヒマワリ］、ラクツカ・サチバ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）種、ラクツカ・クリスパ（Ｌａｃｔｕｃａ ｃｒｉｓｐａ）種、ラクツカ・エスクレンタ（Ｌａｃｔｕｃａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）種、ラクツカ・スカリオラ属種サチバ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓｃａｒｉｏｌａ Ｌ．ｓｓｐ．ｓａｔｉｖａ）、ラクツカ・スカリオラ変種インテグラタ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓｃａｒｉｏｌａ Ｌ．ｖａｒ．ｉｎｔｅｇｒａｔａ）、ラクツカ・スカリオラ変種インテグリフォリア（Ｌａｃｔｕｃａ ｓｃａｒｉｏｌａ Ｌ．ｖａｒ．ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、ラクツカ・サチバ亜種ロマナ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｒｏｍａｎａ）、ロカスタ・コミュニス（Ｌｏｃｕｓｔａ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）種、バレリアナ・ロカスタ（Ｖａｌｅｒｉａｎａ ｌｏｃｕｓｔａ）種［レタス］、タゲテス・ルシダ（Ｔａｇｅｔｅｓ ｌｕｃｉｄａ）種、タゲテス・エレクタ（Ｔａｇｅｔｅｓ ｅｒｅｃｔａ）種、またはタゲテス・テヌイフォリア（Ｔａｇｅｔｅｓ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）種［マリゴールド］；セリ科、例えば、ダウカス（Ｄａｕｃｕｓ）属、例えば、ダウクス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）種［ニンジン］；カバノキ科、例えば、コリラス（Ｃｏｒｙｌｕｓ）属、例えば、コリラス・アベラナ種またはコリラス・コラルナ種［ヘーゼルナッツ］；ムラサキ科、例えば、ボラゴ（Ｂｏｒａｇｏ）属、例えば、ボラゴ・オフィシナリス種［ルリヂサ］；アブラナ科、例えば、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属、メラノシナピス（Ｍｅｌａｎｏｓｉｎａｐｉｓ）属、シナピス（Ｓｉｎａｐｉｓ）属、アラバドプシス（Ａｒａｂａｄｏｐｓｉｓ）属、例えば、ブラシカ・ナプス種、ブラシカ・ラパ種［キャノーラ、アブラナ、カブラナ］、シナピス・アルベンシス種、ブラシカ・ジュンセア種、ブラシカ・ジュンセア変種ジュンセア種、ブラシカ・ジュンセア変種クリスピフォリア種、ブラシカ・ジュンセア変種フォリオサ種、ブラシカ・ニグラ種、ブラシカ・シナピオイデス種、メラノシナピス・コミュニス種［カラシ］、ブラシカ・オレラセア種［飼料用ビート］またはアラビドプシス・タリアナ種；パイナップル科、例えば、アナナ（Ａｎａｎａ）属、ブロメリア（Ｂｒｏｍｅｌｉａ）属、例えば、アナナ・コモサス種、アナナス・アナナス種またはブロメリア・コモサ種［パイナップル］；パパイヤ科、例えば、カリカ（Ｃａｒｉｃａ）属、例えば、カリカ・パパヤ種［パパイヤ］；アサ科、例えば、カナビス（Ｃａｎｎａｂｉｓ）属、例えば、カナビス・サチベ種［ヘンプ］、ヒルガオ科、例えば、イポメア（Ｉｐｏｍｅａ）属、コンボルバラス（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ）属、例えば、イポメア・バタタス種、イポメア・パンデュラタ種、コンボルバラス・バタタス種、コンボルバラス・チリアセウス種、イポメア・ファスチギアタ種、イポメア・チリアセア種、イポメア・トリロバ種またはコンボルバラス・パンデュラタス種［サツマイモ、マンオブザアース（Ｍａｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅａｒｔｈ）、野生のイモ］；アカザ科、例えば、ベタ（Ｂｅｔａ）属、すなわち、ベタ・バルガリス種、ベタ・バルガリス変種アルチシマ種、ベタ・バルガリス変種バルガリス種、ベタ・マリチマ種、ベタ・バルガリス変種ペレニス種、ベタ・バルガリス変種コンジチバ種またはベタ・バルガリス変種エスクレンタ種［サトウダイコン］；ウリ科、例えば、ククビタ（Ｃｕｃｕｂｉｔａ）属、例えば、ククルビタ・マキシマ種、ククルビタ・ミキシタ種、ククルビタ・ペポ種またはククルビタ・モスカタ種［カボチャ、スカッシュ］；グミ科、例えば、エラグナス（Ｅｌａｅａｇｎｕｓ）属、例えば、オレア・エウロペア種［オリーブ］；ツツジ科、例えば、カルミア（Ｋａｌｍｉａ）属、例えば、カルミア・ラチフォリア（Ｋａｌｍｉａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ）種、カルミア・アングスチフォリア種（Ｋａｌｍｉａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、カルミア・ミクロフィラ（Ｋａｌｍｉａ ｍｉｃｒｏｐｈｙｌｌａ）種、カルミア・ポリフォリア（Ｋａｌｍｉａ ｐｏｌｉｆｏｌｉａ）種、カルミア・オシデンタリス（Ｋａｌｍｉａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）種、シトラス・カマロデンドロス（Ｃｉｓｔｕｓ ｃｈａｍａｅｒｈｏｄｅｎｄｒｏｓ）種またはカルミア・ルシダ（Ｋａｌｍｉａ ｌｕｃｉｄａ）種［アメリカ月桂樹、広葉月桂樹、キャリコブッシュ、スプーンウッド、ナガバハナガサシャクナゲ、高山月桂樹、湿地月桂樹、西湿地月桂樹、低湿地月桂樹］；トウダイグサ科、例えば、マニホット（Ｍａｎｉｈｏｔ）属、ジャニファ（Ｊａｎｉｐｈａ）属、ジャトロファ（Ｊａｔｒｏｐｈａ）属、リシナス（Ｒｉｃｉｎｕｓ）属、例えば、マニホット・ウチリシマ種、ジャニファ・マニホット種、ジャトロファ・マニホット種、マニホット・アイピル種、マニホット・ダルシス（Ｍａｎｉｈｏｔ ｄｕｌｃｉｓ）種、マニホット・マニホット種、マニホット・メラノバシス種、マニホット・エスクレンタ種［マニホット、クズウコン、タピオカ、キャッサバ］またはリシナス・コミュニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）種［トウゴマ、キャストルオイルブッシュ、キャストルオイル植物、ヒマ、ワンダーツリー］；マメ科、例えば、ピサム（Ｐｉｓｕｍ）属、アルビジア（Ａｌｂｉｚｉａ）属、カトルミオン（Ｃａｔｈｏｒｍｉｏｎ）属、フェウイレア（Ｆｅｕｉｌｌｅａ）属、インガ（Ｉｎｇａ）属、ピテコロビウム（Ｐｉｔｈｅｃｏｌｏｂｉｕｍ）属、アカシア（Ａｃａｃｉａ）属、ミモザ（Ｍｉｍｏｓａ）属、メジカジョ（Ｍｅｄｉｃａｊｏ）属、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）属、ドリコス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ）属、ファセオラス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ属）、ソヤ（Ｓｏｊａ）属、例えば、ピサム・サチバム種、ピサム・アルベンセ種、ピサム・ヒュミレ種［エンドウ豆］、アルビジア・ベルテリアナ（Ａｌｂｉｚｉａ ｂｅｒｔｅｒｉａｎａ）種、アルビジア・ジュリブリシン（Ａｌｂｉｚｉａ ｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ）種、アルビジア・レベック（Ａｌｂｉｚｉａ ｌｅｂｂｅｃｋ）種、アカシア・ベルテリアナ（Ａｃａｃｉａ ｂｅｒｔｅｒｉａｎａ）種、アカシア・リトラリス（Ａｃａｃｉａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）種、アルビジア・ベルテリアナ（Ａｌｂｉｚｚｉａ ｂｅｒｔｅｒｉａｎａ）種、アルビジア・ベルテリアナ（Ａｌｂｉｚｚｉａ ｂｅｒｔｅｒｉａｎａ）種、カトルミオン・ベルテリアナ（Ｃａｔｈｏｒｍｉｏｎ ｂｅｒｔｅｒｉａｎａ）種、フェウイレア・ベルテリアナ（Ｆｅｕｉｌｌｅａ ｂｅｒｔｅｒｉａｎａ）種、インガ・フラグランス（Ｉｎｇａ ｆｒａｇｒａｎｓ）種、ピテセロビウム・ベルテリアナム（Ｐｉｔｈｅｃｅｌｌｏｂｉｕｍ ｂｅｒｔｅｒｉａｎｕｍ）種、ピテセロビウム・フラグランス（Ｐｉｔｈｅｃｅｌｌｏｂｉｕｍ ｆｒａｇｒａｎｓ）種、ピテコロビウム・ベルテリアナム（Ｐｉｔｈｅｃｏｌｏｂｉｕｍ ｂｅｒｔｅｒｉａｎｕｍ）種、シュードアルビジア・ベルテリアナ（Ｐｓｅｕｄａｌｂｉｚｚｉａ ｂｅｒｔｅｒｉａｎａ）種、アカシア・ジュリブリシン（Ａｃａｃｉａ ｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ）種、アカシア・ネム（Ａｃａｃｉａ ｎｅｍｕ）種、アルビジア・ネム（Ａｌｂｉｚｉａ ｎｅｍｕ）種、フェウイレア・ジュリブリシン（Ｆｅｕｉｌｌｅｅａ ｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ）種、ミモザ・ジュリブリシン（Ｍｉｍｏｓａ ｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ）種、ミモザ・スペシオサ（Ｍｉｍｏｓａ ｓｐｅｃｉｏｓａ）種、セリカンルダ・ジュリブリシン（Ｓｅｒｉｃａｎｒｄａ ｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ）種、アカシア・レベック（Ａｃａｃｉａ ｌｅｂｂｅｃｋ）種、アカシア・マクロフィラ（Ａｃａｃｉａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ）種、アルビジア・レベック種、フェウイレア・レベック（Ｆｅｕｉｌｌｅｅａ ｌｅｂｂｅｃｋ）種、ミモザ・レベック（Ｍｉｍｏｓａ ｌｅｂｂｅｃｋ）種、ミモザ・スペシオサ（Ｍｉｍｏｓａ ｓｐｅｃｉｏｓａ）種［ログウッド類似種、ネムノキ、西インドクルミ］、メジカゴ・サチバ種、メジカゴ・ファルカタ種、メジカゴ・バリア種［アルファルファ］、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）種、ドリコス・ソヤ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｓｏｊａ）種、グリシン・グラシリス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｇｒａｃｉｌｉｓ）種、グリシン・ヒスピダ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｈｉｓｐｉｄａ）種、ファセオラス・マックス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｍａｘ）種、ソヤ・ヒスピダ（Ｓｏｊａ ｈｉｓｐｉｄａ）種またはソヤ・マックス（Ｓｏｊａ ｍａｘ）種［大豆］；フウロソウ科、例えば、ペラルゴニウム（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ）属、ココス（Ｃｏｃｏｓ）属、オレウム（Ｏｌｅｕｍ）属、例えば、ココス・ヌシフェラ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）種、ペラルゴニウム・グロサラリオイデス（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉｏｉｄｅｓ）種またはオレウム・ココイス（Ｏｌｅｕｍ ｃｏｃｏｉｓ）種［ココナッツ］；イネ科、例えば、サッカラム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）属、例えば、サッカラム・オフィシナラム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）種；クルミ科、例えば、ジャグランス（Ｊｕｇｌａｎｓ）属、ワリア（Ｗａｌｌｉａ）属、例えば、ジャグランス・レギア（Ｊｕｇｌａｎｓ ｒｅｇｉａ）種、ジャグランス・アイランチフォリア（Ｊｕｇｌａｎｓ ａｉｌａｎｔｈｉｆｏｌｉａ）種、ジャグランス・シエボルディアナ（Ｊｕｇｌａｎｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ）種、ジャグランス・シネレア（Ｊｕｇｌａｎｓ ｃｉｎｅｒｅａ）種、ワリア・シネレア（Ｗａｌｌｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）種、ジャグランス・ビキシビ（Ｊｕｇｌａｎｓ ｂｉｘｂｙｉ）種、ジャグランス・カリフォルニカ（Ｊｕｇｌａｎｓ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）種、ジャグランス・ヒンドシ（Ｊｕｇｌａｎｓ ｈｉｎｄｓｉｉ）種、ジャグランス・インテルメディア（Ｊｕｇｌａｎｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）種、ジャグランス・ジャマイセンシス（Ｊｕｇｌａｎｓ ｊａｍａｉｃｅｎｓｉｓ）種、ジャグランス・メジャー（Ｊｕｇｌａｎｓ ｍａｊｏｒ）種、ジャグランス・ミクロカルパ（Ｊｕｇｌａｎｓ ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ）種、ジャグランス・ニグラ（Ｊｕｇｌａｎｓ ｎｉｇｒａ）種またはワリア・ニグラ（Ｗａｌｌｉａ ｎｉｇｒａ）種［クルミ、黒クルミ、一般的なクルミ、ペルシアクルミ、白クルミ、バタークルミ、黒クルミ］；クスノキ科、例えば、ペルセア（Ｐｅｒｓｅａ）属、ラウラス（Ｌａｕｒｕｓ）属、例えば、月桂樹ラウラス・ノビリス（Ｌａｕｒｕｓ ｎｏｂｉｌｉｓ）種［月桂樹、ローリエ、月桂樹ローリエ、スイート月桂樹］、ペルセア・アメリカーナ（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）種、ペルセア・アメリカーナ種、ペルセア・グラチシマ（Ｐｅｒｓｅａ ｇｒａｔｉｓｓｉｍａ）種またはペルセア・ペルセア（Ｐｅｒｓｅａ ｐｅｒｓｅａ）種［アボカド］；マメ科、例えば、アラキス（Ａｒａｃｈｉｓ）属、例えば、アラキス・ヒポゲア（
Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）種［ピーナッツ］；アマ科（Ｌｉｎａｃｅａｅ）、例えば、リナム（Ｌｉｎｕｍ）属、アデノリナム（Ａｄｅｎｏｌｉｎｕｍ）属、例えば、リナム・ウシタチシマム種、リナム・ヒュミレ種、リナム・オーストリアカム種、リナム・ビエネ種、リナム・アングスチフォリウム種、リナム・カタルチカム種、リナム・フラバム種、リナム・グランジフロラム種、アデノリナム・グランジフロラム種、リナム・レウィシ種、リナム・ナルボネンセ種、リナム・ペレネ種、リナム・ペレネ変種レウィシ種、リナム・プラテンセ種またはリナム・トリギナム［亜麻、亜麻仁］；ザクロ科（Ｌｙｔｈｒａｒｉｅａｅ）、例えば、プニカ（Ｐｕｎｉｃａ）属、例えば、プニカ・グラナタム（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）種［ザクロ］；アオイ科、例えば、ゴシピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）属、例えば、ゴシピウム・ヒルスツム種、ゴシピウム・アルボレウム種、ゴシピウム・バルバデンセ種、ゴシピウム・ヘルバセウム種またはゴシピウム・タルベリ種［綿］；バショウ科、例えば、ムサ（Ｍｕｓａ）属、例えば、ムサ・ナナ種、ムサ・アクミナタ種、ムサ・パラジシアカ種、ムサ属の種［バナナ］；アカバナ科、例えば、カミソニア（Ｃａｍｉｓｓｏｎｉａ）属、オエノテラ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ）属、例えば、オエノテラ・ビエニス（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ ｂｉｅｎｎｉｓ）種またはカミソニア・ブレビペス（Ｃａｍｉｓｓｏｎｉａ ｂｒｅｖｉｐｅｓ）種［サクラソウ、月見草］；ヤシ科、例えば、エラシス（Ｅｌａｃｉｓ）属、例えば、エラエイス・ギネンシス種［油ヤシ］；ケシ科、例えば、パパベル（Ｐａｐａｖｅｒ）属、例えば、パパベル・オリエンタレ種、パパベル・ロエアス種、パパベル・デュビウム種［ポピー、オリエンタルポピー、ヒナゲシ、フィールドポピー、シャーリーポピー、フィールドポピー、長頭ポピー、長鞘ポピー］；ゴマ科、例えば、セサマム（Ｓｅｓａｍｕｍ）属、例えば、セサマム・インジカム種［ゴマ］；コショウ科、例えば、ピペル（Ｐｉｐｅｒ）属、アルタンテ（Ａｒｔａｎｔｈｅ）属、ペペロミア（Ｐｅｐｅｒｏｍｉａ）属、ステフェンシア（Ｓｔｅｆｆｅｎｓｉａ）属、例えば、ピペル・アダンカム種、ピペル・アマラゴ種、ピペル・アングスチフォリウム種、ピペル・アウリタム種、ピペル・ベテル種、ピペル・クベバ種、ピペル・ロンガム種、ピペル・ニグラム種、ピペル・レトロフラクタム種、アルタンテ・アダンカ種、アルタンテ・エロンガタ種、ペペロミア・エロンガタ種、ピペル・エロンガタム種、ステフェンシア・エロンガタ種［カイエンヌペッパー、ワイルドペッパー］；イネ科、例えば、ホルデウム（Ｈｏｒｄｅｕｍ）属、セカレ（Ｓｅｃａｌｅ）属、アベナ（Ａｖｅｎａ）属、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）属、アドロポゴン（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）属、ホルカス（Ｈｏｌｃｕｓ）属、パニカム（Ｐａｎｉｃｕｍ）属、オリザ（Ｏｒｙｚａ）属、ゼア（Ｚｅａ）属、トリチカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属、例えば、ホルデウム・バルガレ種、ホルデウム・ジュバタム種、ホルデウム・ムリナム種、ホルデウム・セカリナム種、ホルデウム・ジスチコン種、ホルデウム・エギセラス種、ホルデウム・ヘキサスチコン種、ホルデウム・ヘキサスチカム種、ホルデウム・イレグラレ種、ホルデウム・サチバム種、ホルデウム・セカリナム種［大麦、精白玉麦、狐尾大麦、ムギクサ、牧草大麦］、セカレ・セレアレ（Ｓｅｃａｌｅ Ｃｅｒｅａｌｅ）種［ライ麦］、アベナ・サチバ種、アベナ・ファツア種、アベナ・ビザンチナ種、アベナ・ファツア変種サチバ種、アベナ・ハイブリダ種［オート麦］、モロコシ・ビコロル種、モロコシ・ハレペンセ種、モロコシ・サッカラタム種、モロコシ・バルガレ種、アンドロポゴン・ドラモンジ種、ホルカス・ビコロル種、ホルカス・モロコシ種、モロコシ・エチオピカム種、モロコシ・アランジナセウム種、モロコシ・カフロラム種、モロコシ・セルナム種、モロコシ・ドクナ種、モロコシ・ドラモンジ種、モロコシ・デュラ種、モロコシ・ギネンセ種、モロコシ・ランセオラタム種、モロコシ・ネルボサム種、モロコシ・サッカラタム種、モロコシ・サブグラブレセンス種、モロコシ・ベルチシリフロラム種、モロコシ・バルガレ種、ホルカス・ハレペンシス種、モロコシ・ミリアセウム・ミレット種、パニカム・ミリタセウム種［モロコシ、アワ］、オリザ・サチバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）種、オリザ・ラチフォリア（Ｏｒｙｚａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ）種［イネ］、ゼア・マイス［トウモロコシ、メイズ］、トリチカム・エスチバム種、トリチカム・デュラム種、トリチカム・ツルギダム種、トリチカム・ヒベルナム種、トリチカム・マチャ種、トリチカム・サチバム種またはトリチカム・バルガレ種［小麦、パン小麦、一般的な小麦］；ヤマモガシ科、例えば、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ）属、例えば、マカダミア・インテルグリフォリア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｒｇｒｉｆｏｌｉａ）種［マカダミア］；アカネ科、例えば、コフィア（Ｃｏｆｆｅａ）属、例えば、コフィア属の種（Ｃｏｆｅａ ｓｐｐ．）、コフィア・アラビカ種、コフィア・カネフォラ種またはコフィア・リベリカ種［コーヒー］；ゴマノハグサ科、例えば、ベルバスカム（Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ）属、例えば、ベルバスカム・ブラッタリア（Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ ｂｌａｔｔａｒｉａ）種、ベルバスカム・シャイキシ（Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ ｃｈａｉｘｉｉ）種、ベルバスカム・デンシフロラム（Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒｕｍ）種、ベルバスカム・ラグラス（Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ ｌａｇｕｒｕｓ）種、ベルバスカム・ロンギフォリウム（Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉｕｍ）種、ベルバスカム・リクニティス（Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ ｌｙｃｈｎｉｔｉｓ）種、ベルバスカム・ニグラム（Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）種、ベルバスカム・オリンピカム（Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ ｏｌｙｍｐｉｃｕｍ）種、ベルバスカム・フロモイデス（Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ ｐｈｌｏｍｏｉｄｅｓ）種、ベルバスカム・フェニカム（Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ ｐｈｏｅｎｉｃｕｍ）種、ベルバスカム・パルベルレンタム（Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ ｐｕｌｖｅｒｕｌｅｎｔｕｍ）種またはベルバスカム・タプサス（Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ ｔｈａｐｓｕｓ）種［モウズイカ、白モスモウズイカ、刺葉モウズイカ、デンスフラワーモウズイカ、銀モウズイカ、長葉モウズイカ、白モウズイカ、暗モウズイカ、ギリシャモウズイカ、オレンジモウズイカ、紫モウズイカ、白髪モウズイカ、グレートモウズイカ］；ナス科、例えば、カプシカム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）属、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、ソラナム（Ｓｏｌａｎｕｍ）属、リコペルシコン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）属、例えば、カプシカム・アナム種、カプシカム・アナム変種グラブリウスクラム種、カプシカム・フルテセンス種［コショウ］、カプシカム・アナム種［パプリカ］、ニコチアナ・タバカム種、ニコチアナ・アラタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ）種、ニコチアナ・アテヌアタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）種、ニコチアナ・グラウカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌａｕｃａ）種、ニコチアナ・ラングスドルフィ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ）種、ニコチアナ・オブツシフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ）種、ニコチアナ・クアドリバルビス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ）種、ニコチアナ・レパンダ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｅｐａｎｄａ）種、ニコチアナ・ラスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）種、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）種［タバコ］、ソラナム・ツベロサム種［ジャガイモ］、ソラナム・メロンゲナ種［ナス］、（リコペルシコン・エスクレンタム種、リコペルシコン・リコペルシカム種、リコペルシコン・ピリフォルメ種、ソラナム・インテグリフォリウム種またはソラナム・リコペルシカム種［トマト］；アオギリ科、例えば、テオブロマ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属、例えば、テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）種［カカオ］；ツバキ科、例えば、カメリア（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属、例えば、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）種）［茶］。
真核生物または原核生物宿主細胞は、遺伝子改変され得るか、または改変されており（「組換え宿主細胞」、「代謝操作された細胞」、または「遺伝的に操作された細胞」とも称される）、核酸、例えば１つ以上の生合成または操作された経路遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターのレシピエントとして使用される。真核生物および原核生物宿主細胞は、核酸によって遺伝的に操作された元の細胞の後代も示す。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、その代謝性質に関して選択され得る。例えば、選択またはスクリーニングが特定の代謝経路に関する場合、関連する経路を有する宿主細胞を使用することが有用であり得る。そのような宿主細胞は、それに経路の１つ以上の中間体または生成物を処理または移入もしくは排出させる、ある生理学的適応を有することができる。しかしながら、他の実施形態では、対象とする特定の経路に関連する酵素を発現しない宿主細胞は、１つ以上の欠けているステップを提供するために適切な遺伝要素一式を用い、宿主細胞に依存せずにその経路に必要な成分のすべてを識別することができるために選択され得る。
本発明の代謝的に操作された細胞は、操作された代謝経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を有する宿主細胞を形質転換することにより作製される。本明細書で使用される、用語「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」、および「遺伝的構築物」は、互換的に使用され、ＲＮＡもしくはＤＮＡのポリマー、１本鎖もしくは２本鎖、任意に合成、非天然、もしくは変更されたヌクレオチド塩基を含むことを意味する。ヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはＲＮＡの１つ以上のセグメントを含み得る。好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを変更することなく、宿主細胞の典型的なコドン使用を反映するようにコドン最適化される。ある実施形態では、用語「コドン最適化」または「コドン最適化された」とは、特定の宿主細胞における発現を強化するために、核酸によってコードされるポリペプチドの配列を改変することなく、核酸配列のコドン含量を変更することを指す。ある実施形態では、本用語は、ポリペプチドの発現レベルを制御する手段として（例えば、発現レベルを増加させるまたは減少させるのいずれか）、核酸配列のコドン含量を変更することを包含することを意味する。したがって、本発明の態様は、操作された代謝経路に関与する酵素をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、代謝的に操作された細胞は、以下に記載されるステップを行うために必要な酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドを発現することができる。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、酵母における発現についてコドン最適化される。
例えば、特定の細胞は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上の核酸配列を含み得、それぞれ１つが本明細書に記載されるフェノール化合物またはフェノール化合物中間体の生成に必要なポリペプチド（複数可）をコードする。あるいは、単一の核酸分子は、１つ、２つ以上のポリペプチドをコードすることができる。例えば、単一の核酸分子は、２つ、３つ、４つ、またはさらには５つの異なるポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。本明細書に記載される本発明に有用な核酸配列は、例えば、ｃＤＮＡ配列の増幅、ＤＮＡライブラリ、新規合成、ゲノムセグメントの切除等の様々な供給源から得ることができる。そのような供給源から得られる配列は、次に、所望の改変を有する核酸配列を生成するために、標準的な分子生物学および／または組換えＤＮＡ技術を用いて改変され得る。核酸配列の改変のための例示的な方法は、例えば、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、欠失、挿入、置換、制限酵素を用い、任意に連結と組み合わせた配列の部分交換、相同組換え、部位特異的組換え、またはそれらの様々な組み合わせを含む。他の実施形態では、核酸配列は、合成核酸配列であり得る。合成ポリヌクレオチド配列は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第１１／８０４，９９６号の同時係属出願米国特許第７，３２３，３２０号、ならびに米国特許公開第１００６／０１６０１３８号および同第２００７／０２６９８７０号に記載される様々な方法を用いて生成され得る。
細菌、植物、および動物の細胞の形質転換の方法は、当該技術分野において周知である。一般的な細菌の形質転換の方法は、電気穿孔および化学修飾を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、好適な培地で生体外培養されるとき、少なくとも約０．１ｇ／Ｌ、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約０．７５ｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも約１．５ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約２．５ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約３．５ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約４．５ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約５．５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約７ｇ／Ｌ、少なくとも約８ｇ／Ｌ、少なくとも約９ｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｇ／Ｌのレベルで、対象とする生成物または中間体を生成するように遺伝子改変される。
遺伝子改変された宿主細胞によって生成される対象とする生成物またはその代謝中間体のレベルは様々な方法で制御することができることを理解されたい。いくつかの実施形態では、発現のレベルは、操作された経路に関与する１つ以上の酵素をコードする核酸配列のコピーの数によって（例えば、高コピー発現ベクター対中程度または低コピー発現ベクター）制御される。好ましくは、核酸配列は、ベクターを用いて細胞内に導入される。低コピー発現ベクターは、概して、１細胞当たり２０ベクターより少ないコピー（例えば、１細胞当たり１〜約５、５〜約１０、１０〜約１５、１５〜約２０コピーの発現ベクター）を提供する。原核生物細胞（例えば大腸菌）の好適な低コピーの発現ベクターは、ｐＡＹＣ１８４、ｐＢｅｌｏＢａｃ１１、ｐＢＲ３３２、ｐＢＡＤ３３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳおよびその誘導体、ｐＳＣ１０１、ＳｕｐｅｒＣｏｓ（ｃｏｓｍｉｄ）、ならびにｐＷＥ１５（ｃｏｓｍｉｄ）を含むが、これらに限定されない。中程度コピー数の発現ベクターは、概して、１細胞当たり約２０〜約５０の発現ベクターコピー、または１細胞当たり約２０〜８０の発現ベクターコピーを提供する。原核生物細胞（例えば大腸菌）の好適な中程度のコピー発現ベクターは、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢＡＤ２４、ならびにＣｏｌＥ１起源の複製およびその誘導体を含むベクターを含むが、これらに限定されない。高コピー数の発現ベクターは、概して、１細胞当たり約８０〜約２００以上の発現ベクターコピーを提供する。原核生物細胞（例えば大腸菌）の好適な高コピー発現ベクターは、ｐＵＣ、ＰＣＶ１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ、およびｐＴＺベクターを含むが、これらに限定されない。
別の態様では、本発明は、操作された経路に関与するポリペプチドをコードする核酸またはその部分配列を含む発現カセットを提供する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、転写要素（例えばプロモーター）およびターミネーターに作動可能に連結される核酸を含むことができる。本明細書で使用される、用語「カセット」とは、特定の遺伝子を発現することができるヌクレオチド配列を指すが、この場合、前記遺伝子はヌクレオチド配列に存在する１つ以上の調節配列に連結されるように挿入される。したがって、例えば、発現カセットは、宿主細胞で発現されるように、所望の異種遺伝子を含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットは、既知の組換え技法によりベクター内に導入され得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素により所望の核酸配列の転写を開始および制御するヌクレオチドの配列である。いくつかの実施形態では、プロモーターは誘発性であり得る。他の実施形態では、プロモーターは構成型であり得る。原核生物宿主細胞の使用に好適なプロモーターの非限定的な例としては、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃオペロンプロモーター等が挙げられる。原核生物細胞の使用に好適な強力なプロモーターの非限定的な例としては、ｌａｃＵＶ５プロモーター、Ｔ５、Ｔ７、Ｔｒｃ、Ｔａｃ等が挙げられる。真核生物細胞の使用に好適なプロモーターの非限定的な例としては、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター等が挙げられる。終止制御領域は、好ましい宿主固有の様々な遺伝子にも由来し得る。
また本発明において、さらなる態様では、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニーヅランス、または関連する真菌種、例えばノイロスポラ・クラッサのコード領域に関連するプロモーター領域が識別され、単離され、適切に細胞の外の第２の異なるコード領域と機能的関連において接合され、次に適切なベクターを用いて宿主の糸状菌内に再導入される。次に、宿主細胞は、導入したプロモーター領域の制御下で第２のコード領域のタンパク質を発現する。第２のコード領域は、ＰＫＳ等の宿主種に外来であるものであってよく、この場合、宿主は所与の宿主によって天然に発現されないタンパク質を発現する。あるいは、第２のコード領域は、宿主に天然であるものであってよく、この場合、それは、改変されたまたは強化されたタンパク質発現および活性を得るために、所与の宿主に天然に関連するプロモーター領域と異なるプロモーター領域に関連する。
本発明は、宿主の真菌が異なるタンパク質を発現するように配列するために、外来のコード領域をプロモーターと共に真菌内に導入する能力も提供する。遺伝子と共に宿主内に導入されたプロモーター領域を介して、天然に生じる個々の遺伝子または導入された外来遺伝子の転写を調節する能力も提供する。例えば、プロモーター領域は、アルコールデヒドロゲナーゼＩと天然に関連する。アスペルギルス・ニーヅランスの（ａｌｃＡ）遺伝子およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＡ）遺伝子は、細胞外培地中のエタノール、スレオニン、または他の誘発物質の手段により調節可能である。この作用は、ａｌｃＲとして知られる遺伝子の一体性に依存する。ａｌｃＡまたはａｌｄＡプロモーター領域がアスペルギルス等の異なる構造遺伝子に関連するとき、本発明によると、エタノールまたは他の誘発物質による異なる遺伝子の発現の類似する調節が達成され得る。
さらなる例として、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子に天然に関連し、本発明の実施形態に使用されるプロモーター領域は、デンプンおよび他の糖類によって積極的に誘発される。
要約すれば、任意の好適な微生物の宿主細胞は、本発明の目的である化合物を作製するように遺伝子改変され得る。
哺乳類細胞、放線菌、植物細胞、昆虫細胞等に使用するための好適なプロモーターも、当業者に周知である。したがって、例えば、藻類等の単一細胞植物または植物細胞の培養物との関連において、いくつかの実施形態では、対象とする導入遺伝子は、構築物の安定性、構築物の複製を確実にするために、適切な調節および他の機能要素を有するベクター内に配置され得る。構築物要素は、機能を確実にするように作動可能に連結される。句「作動可能に連結される」とは、構築物の要素が導入遺伝子の発現等の機能を可能にするように連結されることを意味する。構築物は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｏｌａｎ，ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載されるもの等の、当該技術分野において既知の技法を用いて、知られように、得られる様々な成分から組み立てることができる。
当該技術分野において既知であるように、藻類細胞等の植物細胞において作用することが知られている対象とする宿主における使用において最適化される要素を含むことが有益であり得る。例えば、好適な植物プロモーターが使用され得る。多くのそのような植物プロモーターが既知であり、構成型、組織および一時的に特異的なプロモーターを含む。構成型プロモーターの例としては、オクトピンシンターゼ（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＥＭＢＯ Ｊ．６，１１−１６、ノパリンシンターゼ（Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ１９８３ ２５，１１（２）：３６９−８５）、マンノピンシンターゼ（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１９８９，８６，３２１９−３２２３）、Ｔ−ＤＮＡ ｏｆ アグロバクテリウム・ツメファシエンスに由来するもの；ＣａＭＶ３５Ｓ（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９８５，３１３（６００５）：８１０−２）、およびＣａＭＶ１９Ｓ（Ｌａｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：３１５−３２４，１９８７）；イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２：１６３−１７１，１９９０）、メイズユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ１８：６７５−６８９）、ヒマワリユビキチン（Ｂｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，７９，ｐｐ８７−９４）、および植物ヒストンプロモーター（Ｂｒｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９９３，４（３）：４４５−４５７）が挙げられるが、これらに限定されない。組織特異的プロモーターの例としては、ファゼオリンプロモーター（Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：３３２０−３３２４）、コングリシニンプロモーター（Ｂｅａｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ＥＭＢＯ Ｊ．４：３４０７−３０５３）、コンリニンプロモーター（Ｔｒｕｋｓａ ｅｔ ａｌ，２００３，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ４１：１４１−１４７）、オレオシンプロモーター（Ｐｌａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５（２）：１９３−２０５）、およびヘリアンシニン（ｈｅｌｉａｎｔｈｉｎｉｎ）プロモーター（Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：４７３−４８６）を含むタネ特異的プロモーターが挙げられるが、これに限定されない。対象とする他のプロモーターは、タネ特異的であるブラシカ・ナプスナピンプロモーター（欧州特許第０２５５２７８号）、脂肪酸エロンゲーゼ（ｅｌｏｎｇａｓｅ）プロモーター（第ＷＯ２／０５２０２４号）、植物ＡＣＰ遺伝子のプロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号）、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（１９９１）８８：２５７８−２５８２））、Ｂｃｅ−４遺伝子由来の（米国特許第５，５３０，１９４号）または植物シンターゼ構造遺伝子に関連する５’調節領域である。
植物シンターゼ構造遺伝子に即時３’下流で発見されるような転写終止領域も使用することができる。本明細書に記載される他の真核生物のように、所望の性質を促進するために、イントロン、スプライス部位、および当該技術分野において既知の他の要素を使用することができる。
対象とする遺伝子は、様々な手段で対象とする細胞内に導入され得る。例えば、導入遺伝子自体は、対象とする導入遺伝子で被覆された粒子を用いるなど、直接導入することができる。細菌クローン化ベクターを使用することができる。あるいは、アグロバクテリウムに基づく系を使用することができ、例えば、欧州特許第ＥＰ−Ｂ−０ １１６ ７１８号または第ＥＰ−Ｂ−０ １２０ ５１６号を参照されたい。また、当該技術分野において既知である、カルシウム、ポリエチレングリコール、または電気穿孔を用いたプロトプラスト形質転換、炭化ケイ素ファイバを用いた微量注入法なども使用することができる。
大腸菌および放線菌等の細菌における使用に好適な選択マーカーは、概して、抗生物質耐性を付与し、酵母において使用するためのものは、多くの場合、栄養要求量を補完する。酵母において使用するための選択マーカーは、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＥＵ２−ｄ、ＴＲＰ１、ＬＹＳ２、ＨＩＳ１、ＨＩＳ３を含むが、これらに限定されない。放線菌において使用するための選択マーカーは、チオストレプトン耐性、アプラマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性、およびエリスロマイシン耐性のものを含むが、これらに限定されない。
ベクターの構築、宿主細胞の形質転換、および良好な形質転換の選択のための方法および材料は、当該技術分野において周知である。
したがって、本明細書における本発明の一実施形態によると、単一宿主細胞は、１つまたは複数のベクターを含むように改変され、それぞれのベクターは、最終生成物の合成の一部に寄与する。芳香族化合物を生成するための複数のベクターの構築において、別個の読み枠が別個のベクター上に組み込まれるか、または適切に構築された場合、読み枠の一部が２つ以上のベクターの間で分配され得、それぞれが発現の制御をもたらすための適切な配列を有するか、あるいはそれらは、最終生成物の合成に寄与するように染色体内に組み込まれ得る。実際、ある生成物の酵素すべてをコードするすべての遺伝子（すなわちオペロン）は、工業的生物のゲノム内に組み込まれ得る。さらに、そのオペロンは、オペロンをコードするＤＮＡが工業規模での所望の生成物の最適な生成のための追加の株および生物において迅速に試験され得るように、「携帯型」であるように設計され得る。
あるいは、２および／または多シストロン性メッセージ構築物を用いて、２つ以上の酵素が１つ以上のプラスミドまたは染色体性に組み込まれたＤＮＡから発現し得る。そのような構築物において、開放読み枠は、メッセンジャーＲＮＡ上のすべての開放読み枠の効率的な翻訳を可能にする内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離され得る。酵母において、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来の有用なＩＲＥＳ配列が説明されてきたが、これらはメチロトローフの酵母であるプリムネシウム・パストリス（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）において効率的に機能することも示された。（ｈｔｔｐ：／／ｇｒａ１０３．ａｃａ．ｎｔｕ．ｅｄｕ．ｔｗ／ｇｄｏｃ／９８／Ｄ９２Ｂ４７４０３ａ．ｐｄｆ）。
他の一態様では、本発明は、少なくとも１つのＩＲＥＳを含む発現系を提供する。一実施形態では、以下のうちの２つ以上の開放読み枠は、１つ以上のＩＲＥＳによって分離される：ｉ）６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）またはオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、ｉｉ）ホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、およびｉｉｉ）デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列。
本明細書に記載される、宿主内に導入された上記の発現系のうちの１つ以上またはすべては、染色体内に組み込まれるか、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）から発現し得る。
組み込みは、例えば相同組換えを用いてもたらすことができる。相同組換えが使用される場合、組み込みは、上記に引用されるＰＣＴ出願第ＷＯ ９５／０８５４８号に記載される、染色体に通常存在する内因性ＰＫＳ活性を欠失させることもできる。これらの実施形態でも、ハイグロマイシン耐性またはチオストレプトン耐性等の選択マーカーは、組み込みをもたらすベクターに含まれる。
上記に記載される、ＰＫＳの酵素系に対する翻訳後の改変をもたらす追加の酵素は、好適な組換え発現系を通して宿主内に導入される必要があり得る。加えて、例えば、脱炭酸化、メチル化、またはグリコシル化を通してポリケチド自体を変換する酵素が必要であり得る。その基材特異性を変更するため、またはドメインを適切な特異性および触媒活性で置換するために、触媒ドメインを改変することも必要であり得る。例えば、酵母におけるマロニルＣｏＡレベルは、Ｗａｔｔａｎａｃｈａｉｓａｅｒｅｅｋｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ１０，２４６−５４，２００８に記載される、マロニルＣｏＡシンターゼまたはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼに関して過剰発現される遺伝子等の、マロニル−ＣｏＡの合成の強化に関する発現系を酵母宿主内に組み込むことにより強化され得る。
本発明の他の実施形態では、通常の細胞代謝プロセスは、クレゾール、オルシノール、もしくはクレゾール−オルシノール−エーテル生成物の生成を最大にするように強化されるか、または削除され得る。例えば、エタノールの生成から離れて所望の生成物の生成に炭素流を転用するために、経路を生成するエタノール中の１つ以上の酵素の発現は、遺伝子操作を通して活性においてノックアウトされるか、または減少され得る。具体的な一実施形態では、ピルベートデカルボキシラーゼの活性は、遺伝子の欠失または破壊により完全にノックアウトされるか、または減少され得る。別の実施形態では、ＡＤＨ１遺伝子が同様に改変され得る。
したがって、本発明は、ポリケチドを作製するための基本的な仕組みを有する宿主のポリケチド由来分子の生成を強化するだけでなく、さらに特殊化学前駆体、エネルギー源として直接使用することができるか、またはエネルギー源に改変もしくは変換することができる分子の生成を方向付ける機会を提供する。本発明は、原位置でさらにより望ましい生成物を作製するために、改変酵素の活性と共に、導入されたＰＫＳの要素を供給することにより様々な生成物を提供するためのより効率的な手段も提供する。
本発明の好ましい実施形態では、ＰＫＳ遺伝子は、フレーム内で１つ以上の改変酵素遺伝子に融合される。例えば、両方の酵素が活性である６−ＭＳＡＳまたはＫＲ欠失６−ＭＳＡＳ／デカルボキシラーゼ融合タンパク質は、糖分解経路を介して糖類をｍ−クレゾールまたはオルシノールに直接変換するために使用される。融合遺伝子コードされたＯ−メチルトランスフェラーゼも含む上記に由来する３官能性酵素複合体が発現し得、それによって、ピルベートを介して糖をメチルアニソールまたはジメトキシトルエンに直接変化させる。
ガソリン、航空ガソリン、ケロシン、ジェット燃料等の石油由来の燃料は、燃焼環境における使用に適した化合物の混合物である。概して、そのような分類は、温度範囲に基づく原油の分留によって得られる化合物に関する。したがって、ガソリンは、概して、約１５０°の範囲で得られた、長さがＣ５〜Ｃ１２の炭化水素（ＨＣ）を含み、ジェット燃料を含むケロシンは、約２００°の範囲で得られた、長さがＣ１２〜Ｃ１５のＨＣなどを含む。ディーゼル燃料は、ガソリンの約１５％超である、約０．８５ｋｇ／ｌの密度を有する。ディーゼルは、概して、直鎖状および環状の両方の約７５％のパラフィンならびに２５％の芳香族を含む。概して、分子は、１０〜１５個の炭素を有する。バイオディーゼルは、それらの多くが部分的にトリグリセリドを分解して、脂肪酸および脂肪酸エステルを得ることにより得られるため、概して、アルカンおよび芳香族炭化水素の代わりにメチルエステルを含む。本発明由来の芳香族化合物およびシクロヘキサン誘導体は、上記の燃料用に混合剤として直接使用されるか、あるいは要求される燃料特徴に関して適切な長さのアルキル基とのエステル化およびエーテル化のための開始材料であってもよい。
いくつかの実施形態では、操作された代謝経路の第１の酵素は、第１のプロモーターの制御下であってもよく、操作された経路の第２の酵素は、第２のプロモーターの制御下であってもよく、第１および第２のプロモーターは異なる強度を有する。例えば、第１のプロモーターは第２のプロモーターより強いか、または第２のプロモーターは第１のプロモーターより強くてもよい。したがって、第１の酵素のレベルは、操作された経路において、第１の酵素のコピー数を増加することにより、および／または第２の酵素が作動可能に連結されるプロモーターの強度に対して、第１の酵素が作動可能に連結されるプロモーターの強度を増加させることにより、第２の酵素のレベルに対して増加され得る。他のいくつかの実施形態では、操作された経路の複数の酵素は、同一のプロモーターの制御下であり得る。
一態様では、本発明は、改変された組換え宿主細胞、および細胞内の１つの酵素成分の発現を制御するためにプロモーターが使用されるメチル化フェノール化合物を生成するため方法を提供する。メチル化フェノール化合物を作製するプロセス中のフェノール化合物の生合成の速度は、典型的に、フェノール化合物のメチル化の速度を超える。例えば、本明細書に記載される細胞および方法からのｍ−クレゾールまたはオルシノールの生合成の速度は、Ｏ−メチルトランスフェラーゼによるｍ−クレゾールまたはオルシノールのメチル化の速度を超える。結果として、ｍ−クレゾールまたはオルシノールの過剰生成は、細胞に毒性問題をもたらす可能性がある。一実施形態では、本発明は、デカルボキシラーゼの発現系を含む改変された組換え宿主細胞を提供し、デカルボキシラーゼの発現は、デカルボキシラーゼの発現を減少させるプロモーターによって制御される。一実施形態では、プロモーターはＬｅｕ２ｄプロモーターである。Ｌｅｕ２ｄは部分的に欠失していることが知られている。別の実施形態では、減少したデカルボキシラーゼ発現のプロモーターを有する宿主細胞は、３−メチルアニソールまたは３，５ジメトキシトルエン等のメチル化フェノール化合物を生成することができる。他の一実施形態では、プロモーターにより減少した発現を有するデカルボキシラーゼは、アスペルギルス・クラバタスのＰａｔＧ遺伝子から発現した６−ＭＳＡ デカルボキシラーゼである。
他の実施形態では、リボソーム結合部位の変更は、経路において異なる酵素の相対的な翻訳および発現に影響を及ぼす。リボソーム結合部位の変更は、経路における酵素の相対的な発現を制御するために単独で使用することができるか、または遺伝子発現レベルにも影響を及ぼす前述のプロモーターの改変およびコドン最適化と合わせて使用することができる。
例示的な実施形態では、可能な経路酵素の発現は、経路酵素が反応混合物中で作用する基材の存在に依存し得る。例えば、ＡのＢへの変換を触媒する酵素の発現は、培地におけるＡの存在により誘発され得る。そのような経路酵素の発現は、誘発をもたらす化合物を添加することにより、または生合成経路のプロセス中の化合物の自然な発達による（例えば、誘発物質は、所望の生成物を得るために、生合成プロセス中に生成された中間体であってよい）いずれかにより誘発され得る。
いくつかの実施形態では、対象とする有機分子を産生するための代替え経路を産生するために、コンピュータ実装設計技法が使用され得る。いくつかの実施形態では、データベースはゲノムに対する情報を含み、そのリンクは新規代謝経路を設計するために利用され得る。データベースの例としては、ＭｅｔａＣｙｃ（代謝経路および酵素のデータベース、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａの生体触媒／生分解データベース（有機化学化合物用の微生物の触媒反応および生分解経路のデータベース）、ＬＧＡＮＤ（代謝物および他の化学化合物についての情報、代謝および他の反応を表す基材−生成物の関係、ならびに酵素分子についての情報を提供する複合データベース）である。経路成分のデータベースは、予想、推定上、または未知の機能の成分も含み得る。未定義の組成物を有する可能性がある定義された機能の偽性成分も含み得る。いくつかの実施形態では、プログラムは、公共のドメインである（例えば、特許権により網羅されない、および／またはライセンス料の対象とならない）調節および／または機能要素の組み合わせを設計することができる。自由に利用可能な遺伝的要素のデータベースは、代替え経路を生成するために組み合わされ得る核酸配列の供給源として産生される、および／または使用され得る。既知の機能および／または調節要素の異なる組み合わせ（例えば、異なる種から）を含む代替え経路が、設計、組み立て、および／または試験され得る。酵素的要素領域に変形を含むライブラリは、異なる種類の酵素または同一の酵素の異なる変異型の相対的作用を確認するために使用され得る。調節要素領域に変形を含むライブラリは、遺伝子一式間の最適な発現レベルまたは調節制御を確認するために使用され得る。
異なる経路をコードする核酸を組み立てることができる。いくつかの実施形態では、異なる操作された経路の機能的性質は、宿主細胞または生物を適切に組み立てられた核酸で形質転換し、操作された生物の性質をアッセイすることにより生体内で試験され得る。いくつかの実施形態では、異なる操作された経路の機能的性質は、組み立てられた核酸から発現された成分を単離し、生体外系で成分の適切な組み合わせを試験することにより、生体外で試験され得る。
本発明のいくつかの実施形態では、酵母の半数体酵母株が使用され得る。他の実施形態では、２倍体株が好ましい。それらは、改変された実験室株、または工業用株、または改変された工業用株であり得る。酵母成長の再生可能な原料は、トウモロコシ、小麦、サトウキビ、テンサイ等からの精製されたもしくは部分的に精製された糖類、または木材、スイッチグラス、竹、ジャトロハ等のセルロース供給源に由来し得る。それらは、二酸化炭素および太陽光から糖類を生成することができる微細藻類、ラン藻、および同様の生物にも由来し得る。
化合物の生成
下の表１に例示されるように、本明細書に記載される改変された組換え宿主細胞および方法は、多くの対象とする化合物の生成および単離を可能にする。
Figure 2014519853
 １．６−ＭＳＡまたはＯＳＡ
一態様では、本発明は、改変された組換え細胞、および６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡ）またはオルセリン酸（ＯＳＡ）の生成のための方法を提供する。一実施形態では、改変された組換え細胞は、発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）またはオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、ホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系をさらに含む。他の一実施形態では、ＡＣＰシンターゼは前記ＰＫＳをパンテテイニル化する。他の一実施形態では、宿主細胞は、６−ＭＳＡ（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ＰＫＳを発現する。一実施形態では、芳香族ＰＫＳは、真菌由来の６−ＭＳＡ（６−ＭＳＡＳ）のシンターゼである。別の実施形態では、芳香族ＰＫＳは、原核生物由来の６−ＭＳＡ（６−ＭＳＡＳ）のシンターゼである。他の一実施形態では、原核生物の６−ＭＳＡＳのシンターゼは、野生型形態のストレプトマイセス・アンチビオチクス由来のＣｈｌＢ１遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、芳香族ＰＫＳは、ＯＳＡＳのシンターゼである。一実施形態では、ＯＳＡＳは、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のＡｖｉＭ遺伝子によってコードされる。
別の実施形態では、原核生物の６−ＭＳＡＳのシンターゼは、オルセリン酸（ＯＳＡ）が細胞によって生成されるように不活性化ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを含む。好ましい実施形態では、６−ＭＳＡおよびＯＳＡは、中間体化合物、例えば本明細書に記載されるフェノールまたはフタル酸無水物の中間体化合物である。
一態様では、本発明は、細菌の反復ＰＫＳの使用を想定する。一実施形態では、細菌の反復ＰＫＳは、ストレプトマイセス・アンチビオチクス ＤＱ１１６９４１ ＣｈＬＢ１、ストレプトマイセス・パクタム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐａｃｔｕｍ）ＡＢ３０３０６３ ｐｃｔＳ、アクチノマヅラ・マヅラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｍａｄｕｒａｅ）ＡＹ２７１６６０ ６−ＭＳＡ）、フランキア種（Ｆｒａｎｋｉａ ｓｐ．）ＮＣ ００９９２１、サリニスポラ・アレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）ＮＣ ００９９５３ ａ、ミクロモノスポラ・エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ＡＦ５０５６２２ ＣａｌＯ５、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス ＡＦ３３３０３８ ＡｖｉＭ、サリニスポラ・アレニコラ ＮＣ ００９９５３ ｂ、ストレプトマイセス・カルシノスタチカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｃｉｎｏｓｔａｔｉｃｕｓ）ＡＹ１１７４３９ ＮｃｓＢ、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ＮＣ００９１４２、およびヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＮＣ ０００９６２ ｐｐｓＡからなる群から選択される。
６−ＭＳＡＳ遺伝子は、真菌、細菌もしくは植物等の任意の天然源から得ることができるか、または発現された６−ＭＳＡＳ ＰＫＳの最適な生合成特徴をもたらす合成、ハイブリッド、または改変された誘導体であり得る。一実施形態では、使用される６−ＭＳＡＳ遺伝子は、狭葉サンタ草（Ｅｒｉｏｄｙｃｔｉｏｎ ｐａｖｏｎｉｎａ）等の植物に由来し得る（Ｋｈａｄｅｎ Ｓ．ａｎｄ Ｍａｒｌｅｓ，ＲＪ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ１５；７９８５−８００５（２０１０）。酵素活性の改変および最適化は、当該技術分野において周知である。
別の変形では、ＰＫＳ系の定義された部分の１つ以上の発現系は宿主の染色体内に組み込まれ、少なくとも１つの追加の発現系は複製可能なベクター上に存在する。したがって、６−ＭＳＡＳまたはＯＳＡＳの場合、開放読み枠のうちの１つの発現系が最初に染色体内に組み込まれ得、他の開放読み枠の発現系はベクター上に存在し得る。そのような発現系の染色体内への組み込みは、既知の方法および手段のいずれかを通して生じ得る。
一実施形態では、本発明は、６−ＭＳＡＳ（またはＯＳＡＳ）の第１の発現系および／または宿主の染色体内に組み込まれるホロＡＣＰシンターゼの第２の発現系を含む改変された組換え宿主細胞を提供する。別の実施形態では、改変された宿主細胞は、宿主の染色体内に組み込まれる６−ＭＳＡＳ（またはＯＳＡＳ）の第１の発現系および複製可能なベクター上の細胞に存在するホロＡＣＰシンターゼの第２の発現系を含む。一実施形態では、改変された宿主細胞は、複製可能なベクター上の細胞に存在する６−ＭＳＡＳ（またはＯＳＡＳ）の第１の発現系および宿主の染色体内に組み込まれるホロＡＣＰシンターゼの第２の発現系を含む。
別の態様では、６−ＭＳＡおよびＯＳＡは、それぞれ、本明細書に記載される改変された組換え宿主細胞および方法によって生成され、かつ／または単離することができる。一旦細胞によって生成され、それから単離されると、６−ＭＳＡおよびＯＳＡは、対象とする化合物（例えば、ｍ−クレゾール、３−メチルアニソール、３，５−ジメトキシトルエン、フタル酸無水物等）の生成のための化合物中間体として機能する。
２．ｍ−クレゾールまたはオルシノール
別の態様では、本発明は、ｍ−クレゾールまたはオルシノールを生成するための改変された組換え細胞および方法を提供する。一実施形態では、改変された組換え宿主細胞は、上記のセクションで記載される第１および第２の発現系を含む。別の実施形態では、細胞は、デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の発現系をさらに含む。
一実施形態では、本発明は、６−ＭＳＡＳ（またはＯＳＡＳ）の第１の発現系および／または宿主の染色体内に組み込まれるホロＡＣＰシンターゼの第２の発現系を含む改変された組換え宿主細胞を提供する。別の実施形態では、改変された宿主細胞は、複製可能なベクター上の細胞に存在するデカルボキシラーゼの第３の発現系をさらに含む。他の一実施形態では、改変された宿主細胞は、宿主の染色体内に組み込まれるデカルボキシラーゼの第３の発現系をさらに含む。一実施形態では、宿主細胞は、６−ＭＳＡＳ（またはＯＳＡＳ）、ホロＡＣＰシンターゼ、および宿主の染色体内に組み込まれるデカルボキシラーゼの発現系のうちの少なくとも１つ、および複製可能なベクター上に存在する同一の発現系のうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、６−ＭＳＡＳ（またはＯＳＡＳ）、ホロＡＣＰシンターゼ、および宿主の染色体内に組み込まれるデカルボキシラーゼの発現系のすべて、または複製可能なベクター上に存在する同一の発現系のすべてを含む。
一実施形態では、デカルボキシラーゼヌクレオチド配列は、プリムネシウム・パツルム由来の６−ＭＳＡ デカルボキシラーゼ遺伝子、アスペルギルス・クラバタス由来のＰａｔＧ遺伝子、グリオクラジウム・ロゼウム由来のＯＳＡデカルボキシラーゼ遺伝子、アスペルギルス種由来の２，３−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子、およびスフィンゴモナス・パウシモビリスＳＹＫ−６由来の５−カルボキシバニリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子からなる群から選択される。別の実施形態では、宿主細胞によって生成され、それから単離することができる生成物は、ｍ−クレゾールまたはオルシノールである。
別の具体的な実施形態では、本発明は、生体内または 生体外脱炭酸化を介して、ｍ−クレゾールまたはオルシノールを生成するように改変される細胞に関する。前者の細胞系では、６−ＭＳＡ （ＨＭＢＡ）またはオルセリン酸に特異的なデカルボキシラーゼは、同一の細胞内の天然のまたは改変されたデカルボキシラーゼ遺伝子から発現される。天然のデカルボキシラーゼ遺伝子は、プリムネシウム・パツルム由来の６−ＭＳＡデカルボキシラーゼ遺伝子、アスペルギルス・クラバタス由来のＰａｔＧ遺伝子、およびグリオクラジウム・ロゼウム由来のオルセリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子含む（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５；Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．１９：２０１３-２０２１）。密接に関連する、またはさらには関連性が低い芳香族カルボン酸に対して基材特異性を有する生成物酵素をコードする他のデカルボキシラーゼ遺伝子は、有効な脱炭酸化酵素も生成するように、突然変異または品種改良により改変され得ることも理解されたい。
別の態様では、対象とする化合物を生成するように、２つの異なる種類の改変された組換え宿主細胞が採用される。一実施形態では、本発明は、第１のＰＫＳ（６−ＭＳＡＳまたはＯＳＡＳ）発現系および第２のホロＡＣＰシンターゼ発現系を含む第１の細胞と、第３のデカルボキシラーゼ発現系を含む第２の細胞とを提供する。別の実施形態では、第１のＰＫＳ発現系および／または第２のホロＡＣＰシンターゼ発現系は、第１の細胞の染色体内に組み込まれるか、または複製可能なベクター上の第１の細胞に存在する。他の一実施形態では、デカルボキシラーゼの第３の発現系は、第２の細胞の染色体内に組み込まれるか、または複製可能なベクター上の第２の細胞に存在する。
一態様では、本発明は、対象とする化合物を生成するための、改変された組換え宿主細胞の混合物を提供する。一実施形態では、混合物は、ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系、およびｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系を含む、第１の改変された組換え宿主細胞と、ｉｉｉ）デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の発現系を含む、第２の改変された組換え宿主細胞とを含む。別の実施形態では、混合物は、第１および第２の改変された組換え宿主細胞の共培養された混合物である。他の一実施形態では、第１の改変された組換え宿主細胞は酵母細胞である。別の実施形態では、酵母細胞はサッカロマイセス・セレヴィシエ細胞である。他の一実施形態では、第２の改変された組換え宿主細胞は真菌細胞である。別の実施形態では、真菌細胞はアスペルギルス・クラバタスである。さらなる実施形態では、本発明は、フェノール化合物の生成をもたらす第１の改変された組換え宿主細胞と第２の改変された組換え宿主細胞の共培養の方法を提供する。一実施形態では、フェノール化合物はｍ−クレゾールである。本方法は実施例６において例示される。
３．３−メチルアニソールおよび３，５ジメトキシトルエン
他の一態様では、本発明は、メチル化フェノール化合物を生成するための改変された組換え細胞および方法を提供する。一実施形態では、本明細書に記載される第１（例えばＰＫＳ）、第２（例えばホロＡＣＰシンターゼ）、および第３（例えばデカルボキシラーゼ）の発現系に加え、本方法および細胞は、異種Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＯＭＴ）の第４のまたは追加の発現系を含む。ＯＯＭＴの発現系を利用するそのような改変された組換え細胞および方法は、３−メチルアニソールまたは３，５−ジメトキシトルエンを生成するために提供される。
Figure 2014519853
別の実施形態では、追加の発現系は、単離される生成物が３−メチルアニソールまたは３，５−ジメトキシトルエンであるように、ベクター、染色体、またはＹＡＣＳに含まれる。他の一実施形態では、Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、ロサ・キネンシス品種のＯＯＭＴ１、ＯＯＭＴ２、ＯＯＭＴ３、ＯＯＭＴ４、ＣＯＭＴ１遺伝子およびバラのハイブリッド株から選択される。
一態様では、本発明は、メチル化フェノール化合物、例えば３−メチルアニソールまたは３，５−ジメトキシトルエンを生成するための改変された組換え細胞および方法を提供する。一実施形態では、改変された組換え細胞は、発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）またはオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、ホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系をさらに含む。他の一実施形態では、ＡＣＰシンターゼは前記ＰＫＳをパンテテイニル化する。別の実施形態では、細胞は、デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の発現系をさらに含む。
他の一態様では、宿主細胞は、６−ＭＳＡ（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ＰＫＳを発現する。一実施形態では、芳香族ＰＫＳは、真菌由来の６−ＭＳＡ（６−ＭＳＡＳ）のシンターゼである。別の実施形態では、芳香族ＰＫＳは、原核生物由来の６−ＭＳＡ（６−ＭＳＡＳ）のシンターゼである。他の一実施形態では、原核生物の６−ＭＳＡＳのシンターゼは、野生型形態のストレプトマイセス・アンチビオチクス由来のＣｈｌＢ１遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、芳香族ＰＫＳは、ＯＳＡＳのシンターゼである。一実施形態では、ＯＳＡＳは、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のＡｖｉＭ遺伝子によってコードされる。別の実施形態では、原核生物の６−ＭＳＡＳのシンターゼは、オルセリン酸（ＯＳＡ）が細胞によって生成されるように不活性化ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを含む。
好ましい実施形態では、本明細書に記載される宿主細胞および方法は、３−メチルアニソールのフェノール化合物中間体としてのｍ−クレゾール、または３，５−ジメトキシトルエンのフェノール化合物中間体としてのオルシノールの生成をもたらす。別の実施形態では、本方法は、宿主細胞からｍ−クレゾールまたはオルシノールを単離することと、メチル化剤で処理して、それぞれ、３−メチルアニソールまたは３，５−ジメトキシトルエンを形成することとを含む。
別の態様では、本発明は、宿主細胞からメチル化フェノール化合物を直接生成するための改変された組換え宿主細胞および方法を提供する。一実施形態では、本発明は、第１のＰＫＳ発現系、第２のホロＡＣＰシンターゼ発現系、およびメチルトランスフェラーゼのさらなる発現系を含む第３のデカルボキシラーゼ発現系を含む細胞を提供する。さらなる実施形態では、芳香族ポリケチド生成物のメチルエーテルの生成および単離を可能にする、前記細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結される少なくとも１つのＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むさらなる発現系が含まれる。触媒活性を強化するため、またはより厳密な基材特異性のために改変されるＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子およびその後代は、複数の供給源から得ることができる。例えば、好ましい実施形態では、バラの花弁由来のオルシノールＯ−メチルトランスフェラーゼＯＯＭＴ１が形質転換に利用される。Ｏ−メチルトランスフェラーゼＤＮＡ配列は、以下の供給源から得ることができるが、これらの供給源のみに限定されない：ロサ・キネンシス、ロサ・ルゴーサ（Ｒ．ｒｕｇｏｓａ）、Ｒ．マジャリス（Ｒ．ｍａｊａｌｉｓ）、Ｒ．ロサ・ベッゲリアナ（Ｒ．ｂｅｇｇｅｒｉａｎａ）、Ｒ．ロサ・オドラタ（Ｒ．ｏｄｏｒａｔａ）、Ｒ．カニナ（Ｒ．ｃａｎｉｎａ）、Ｒ．ガリカ（Ｒ．ｇａｌｌｉｃａ）、Ｒ．ウッドシー（Ｒ．ｗｏｏｄｓｉｉ）、Ｒ．メレッティ（Ｒ．ｍａｒｅｔｔｉｉ）、Ｒ．ロクスブルギー（Ｒ．ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ）、ヴィティス・ビニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ｄｕｌｃｉｓ）、およびアンズ（Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ）。
一実施形態では、本発明は、発現されることができる６−ＭＳＡＳまたはＯＳＡＳの第１の発現系および／または宿主の染色体内に組み込まれるホロＡＣＰシンターゼの第２の発現系を含む改変された組換え宿主細胞を提供する。別の実施形態では、改変された宿主細胞は、複製可能なベクター上の細胞に存在するデカルボキシラーゼおよび／またはＯＯＭＴの第３の発現系をさらに含む。他の一実施形態では、改変された宿主細胞は、宿主の染色体内に組み込まれるデカルボキシラーゼおよび／またはＯＯＭＴの第３の発現系をさらに含む。一実施形態では、宿主細胞は、６−ＭＳＡＳ（またはＯＳＡＳ）、ホロＡＣＰシンターゼ、デカルボキシラーゼ、および宿主の染色体内に組み込まれるＯＯＭＴの発現系のうちの少なくとも１つ、および複製可能なベクター上に存在する同一の発現系のうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、６−ＭＳＡＳ（またはＯＳＡＳ）、ホロＡＣＰシンターゼ、デカルボキシラーゼ、および宿主の染色体内に組み込まれるＯＯＭＴの発現系のすべて、または複製可能なベクター上に存在する同一の発現系のすべてを含む。
さらなる実施形態では、様々なメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）またはＭＴＨＦＲ融合タンパク質をコードする遺伝子の過剰発現は、Ｒｏｊｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７；４０５６−４０６１ （２００２）により記載される、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ反応の基材として利用可能であるＳ−アデノシルメチオニンの高供給を維持するために使用され得る。一実施形態では、改変された組換え宿主細胞およびそれを使用する方法は、Ｓ−アデノシルメチオニンが細胞で生成されるように、ＭＴＨＦＲをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第５の発現系を採用することができる。別の実施形態では、改変されたの組換え宿主細胞は、第１のＰＫＳ発現系、第２のホロＡＣＰシンターゼ発現系、第３のデカルボキシラーゼ発現系、ヒドロ葉酸レダクターゼのさらなる発現系を含む第４のＯＯＭＴ発現系を含む。
別の態様では、本発明は、宿主細胞からフェノール化合物中間体を生成し、それから単離する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系と、ｉｉｉ）デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の発現系とを含む、改変された組換え宿主細胞を提供することを含む。別の実施形態では、本方法は、組換え宿主細胞において生成されたフェノール化合物中間体を単離するステップをさらに含む。他の一実施形態では、本方法は、アルキル化剤で処理することによりアルキル化フェノール化合物を形成するために、単離ステップにおいて得られたフェノール化合物中間体をアルキル化することをさらに含む。アルキル化剤は、アルキル基を基材に付加することができる任意の薬剤を含み、水素原子をアルキル基と置換することを容易にする薬剤を含む。いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノール等からなる群から選択される。別の態様では、本方法は、細胞から単離された化合物中間体をアルキル化剤で処理して、以下のアルキル基：エチル、メチル、イソプロピル、３級ブチル等のうちの１つを化合物中間体にもたらすことを含む。
一実施形態では、フェノール化合物中間体はｍ−クレゾールであり、これは、次にアルキル化剤で処理され、アルキル化フェノール化合物を生成する。一実施形態では、アルキル化剤は、３−エチルアニソールを生成するためのエタノール、３−メチルアニソールを生成するためのメタノール、３−イソプロピルアニソールを生成するためのイソプロパノール、または３−ブチルアニソールを生成するためのｔｅｒｔ−ブタノールである。一実施形態では、アルキル化剤は、メタノール、ヨードメタン、炭酸ジメチルから選択されるメチル化剤である。別の実施形態では、メチル化はＯ−メチル化である。
一実施形態では、フェノール化合物中間体はオルシノールであり、これは、次にアルキル化剤で処理され、アルキル化フェノール化合物を生成する。一実施形態では、アルキル化剤は、３，５−ジエトキシトルエンを生成するためのエタノール、３，５−ジメトキシトルエンを生成するためのメタノール、３，５−ジイソプロポキシトルエンを生成するためのイソプロパノール、３，５−ジブトキシトルエンを生成するためのｔｅｒｔ−ブタノールである。一実施形態では、アルキル化剤は、メタノール、ヨードメタン、および炭酸ジメチルから選択されるメチル化剤である。別の実施形態では、メチル化はＯ−メチル化である。
４．フタル酸無水物
一態様では、本発明は、フタル酸無水化合物を生成するための改変された組換え細胞および方法を提供する。一実施形態では、化合物は３−ヒドロキシフタル酸無水物である。
一実施形態では、改変された組換え細胞は、発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、ホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系をさらに含む。他の一実施形態では、ＡＣＰシンターゼは前記ＰＫＳをパンテテイニル化する。ＰＫＳおよびＡＣＰの成分は本明細書に記載されるように変動してよい。
別の態様では、本発明は、フタル酸無水化合物を生成する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系とを含む、改変された組換え宿主細胞を提供することを含む。別の実施形態では、本方法は、組換え宿主細胞において生成されたフタル酸無水中間体化合物を単離するステップをさらに含む。他の一実施形態では、本方法は、酸化剤で処理することにより、単離ステップにおいて得られたフタル酸無水中間体化合物を酸化して、フタル酸無水化合物を形成することをさらに含む。酸化剤は、除去を容易にすることができる任意の薬剤を含む。いくつかの実施形態では、酸化剤は、周囲空気を含む空気である。当業者は、本発明における使用に好適である他の酸化剤を認識するだろう。一実施形態では、フタル酸無水中間体化合物は６−ＭＳＡである。
４．発現系
本明細書において、本発明は、クレゾール、アニソール、トルエン、シクロヘキサン、シクロヘキサノール、および他の６員環化合物ファミリーの特殊化学物質を生成するための芳香族ＰＫＳ系に関与する触媒活性の発現系を採用する。３−メチルアニソール（例えば、米国特許第４，４０７，６６１号を参照のこと）もしくは３−エトキシトルエン、３−イソプロポキシトルエン、またはグリセロールでエーテル化されたｍ−クレゾール、および対応するジアルキル化オルシノール誘導体等の石油系燃料適合分子がある。生成されたタンパク質は、天然のアミノ酸配列を含み得、よってこれらのタンパク質の天然形態または変更された形態の基材特異性および活性は、所望の触媒活性が維持される限り使用することができる。しかしながら、この活性の特異性および効率は、天然形態と異なる。しかしながら、天然系に存在するある活性は、ＯＳＡＳ活性を有する酵素を産生するために、６−ＭＳＡＳ遺伝子のケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを不活性化すること等により、意図的に欠失または不活性化され得る（例えば、Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １７：４９５−５０３，２０１０を参照のこと）。さらに、様々な芳香族系の成分ならびにモジュラー系の様々なモジュールの成分は、混合され、組み合わされ得る。ＰＣＴ出願第ＷＯ ９５／０８５４８号（参照により本明細書に組み込まれる）は、例えばアクチノロージンの開放読み枠が代替えの芳香族系からの開放読み枠を有する発現ベクターに含まれるハイブリッド芳香族ＰＫＳ系の構築を説明する。
ＰＫＳタンパク質のみの発現系は、組換え宿主がアシルキャリアタンパク質のパンテテイニル化をもたらすホロＡＣＰシンターゼ活性も含まない限り、ポリケチドの実際の生成に十分ではない可能性がある。この活性ステップは、ＡＣＰが完了ポリケチドをもたらす一連のクライゼン縮合においてスターター単位または成長ポリケチド鎖である２炭素単位を獲得する能力に必要である。ホロＡＣＰシンターゼとして作用するホスホパンテテイニル化酵素を欠失する宿主において、本発明は、この酵素に好適な発現系を供給することによりこの活性を付与する手段を提供する。ホロＡＣＰシンターゼの発現系は、ＰＫＳ単位を保有するものとは別のベクター上に供給されるか、または同一ベクター上に供給されるか、または宿主の染色体内に組み込まれるか、またはポリケチドシンターゼのすべてもしくは一部を有する融合タンパク質の発現系として供給され得る。概して、脂肪酸合成に関連するホロＡＣＰシンターゼは、好適ではなく、むしろポリケチド合成または非リボソームタンパク質の合成に特異的に関連するシンターゼが、この点において有用である。しかしながら、脂肪酸合成に関連するあるホロＡＣＰシンターゼ、例えばアスペルギルス・ニーヅランスのｎｐｇＡタンパク質は、酵母等の異種宿主におけるポリケチドの生合成において機能することが示された（Ｗａｔｔａｎａｃｈａｉｓａｅｒｅｅｋｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ９７：８９３−９００，２００７）。
具体的には、モジュラーＰＫＳ系は、大腸菌等のある宿主細胞に内因性であるホスホパンテテイニル化酵素によって生じるホスホパンテテイニル化によって活性されないが、バチルスに由来する酵素、具体的には、バチルス・ブレビのグラミシジンホロＡＣＰシンターゼ、枯草菌由来のサーファクチン関連ホロＡＣＰシンターゼ、およびアスペルギルス・ニーヅランス由来の脂肪酸合成関連ｎｐｇＡ ＰＰＴａｓｅタンパク質は、基材としてモジュラーＰＫＳ ＡＣＰドメインを利用することができる。同様に、ｎｐｇＡは、反復芳香族ＰＫＳ ６−ＭＳＡＳを活性化することができることも示された。適切なホロＡＣＰシンターゼの発現系を含むことは、モジュラーＰＫＳもしくは酵母または他の真核生物をコードする遺伝子の発現だけに必要ではないが、そのような発現系を含むことは、ポリケチドおよびその誘導体が発現される酵素によって生成される場合必要であり得る。
別の態様では、宿主細胞における発現系は、１つ以上のベクター上に提供され得る。一実施形態では、ＰＫＳの第１の発現系およびホロＡＣＰシンターゼの第２の発現系は、同一のベクター上に存在する、別個のベクター上に存在する、または２シストロン性メッセンジャーＲＮＡから発現される。別の実施形態では、官能性デカルボキシラーゼの第３の発現系は、ＰＫＳおよび／またはホロＡＣＰシンターゼと同一のベクター上に存在するか、または別個のベクター上に存在する。他の一実施形態では、ＰＫＳの第１の発現系およびホロＡＣＰシンターゼの第２の発現系ならびに官能性デカルボキシラーゼの第３の発現系は、同一のベクター上に存在する。いくつかの実施形態では、第１、第２、および第３の発現系のうちの１つ以上（またはすべて）は、宿主細胞染色体内に組み込まれるか、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）から発現される。他の一実施形態では、発現されたＰＫＳ、ホロＡＣＰシンターゼ、およびデカルボキシラーゼのうちの少なくとも２つ（または３つすべて）が、多シストロン性メッセンジャーＲＮＡに由来する。
したがって、一態様では、本発明は、宿主細胞が少なくとも２つのベクターを含むように改変される組換え宿主細胞に関し、第１のベクターは、第１の選択マーカーおよび第１の発現系を含み、第２のベクターは、第２の選択マーカーおよび第２の発現系を含み、任意に、追加のベクターは、追加の選択可能マーカーおよび発現系を含み、ベクター上に含まれる発現系は、少なくとも最小ＰＫＳ系をコードし、それを生成することができる。最少ＰＫＳ系が芳香族系である場合、最少系は、ケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（ＫＳ／ＡＴ）触媒領域、触媒領域、およびアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）活性を含む。一実施形態では、宿主細胞は、細菌、酵母、糸状菌、植物、藻類、または微細藻類の宿主細胞からなる群から選択される。
本発明のこの態様の具体的な一実施形態では、組換え宿主細胞は、（ａ）第１の選択可能マーカーおよび６−メチルサリチル酸シンターゼ（６−ＭＳＡＳ）遺伝子またはオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含む第１のベクター、（ｂ）第２の選択可能マーカーおよびホロＡＣＰシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含む第２のベクター、および（ｃ）第３の選択可能マーカーおよび前記細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されるデカルボキシラーゼ活性をコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含む第３のベクターを含むように改変される。あるいは、ベクターのうちの少なくとも２つは、宿主細胞が２つのベクターのみ、またはさらには１つのベクターを含むように混合することができ、２つの発現系を含むベクターは、別個の発現系としてこれらを維持することができるか、または２つもしくは３つの開放読み枠は、単一プロモーターの制御下に配置することができ、２シストロンまたは３シストロンメッセージのいずれかは、設計された酵素経路内への翻訳のために転写される。他の実施形態では、操作された酵素経路のそれぞれおよびすべての部分の発現系は、宿主細胞染色体内に組み込まれる。例えば、ホロＡＣＰシンターゼ遺伝子であるアスペルギルス・ニーヅランスのｎｐｇＡは、サッカロマイセス・セレヴィシエゲノム内に組み込まれるとき効率的に機能する（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：５８９−５９２（２００９）。
他の一態様では、改変された組換え宿主細胞は、以下のうちの１つ以上を含む少なくとも１つの発現系を含む：ｉ）６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）またはオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、ｉｉ）ホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、およびｉｉｉ）デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列。
一実施形態では、宿主細胞は、６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）またはオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、およびホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系をさらに含む。
別の態様では、本発明は、６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）またはオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）、ホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼ、およびデカルボキシラーゼの融合タンパク質を発現する宿主細胞を提供する。そのような「３重融合タンパク質」は、本明細書に記載される方法によって発現され得る。
５．宿主細胞
一態様では、本発明は、先行技術に対して利点を提供するポリケチドを生成するための改変された組換え宿主細胞を提供する。米国特許第６，０３３，８３３号は、ＰＫＳ（モジュラーまたは真菌）およびホロＡＣＰシンターゼの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を使用する改変された組換え宿主細胞を開示する。米国特許第６，２５８，５６６号は、モジュラーまたは真菌ＰＫＳを利用する改変された組換え宿主細胞を開示する。米国特許第７，０７８，２３３号は、モジュラーまたは真菌ＰＫＳ、および脂肪酸合成に関連しないＡＣＰシンターゼを利用する改変された組換え宿主細胞を開示する。一実施形態では、本発明は、ＰＫＳおよびホロＡＣＰシンターゼの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない組換え宿主細胞を提供する。別の実施形態では、ＰＫＳは、真菌ＰＫＳまたはモジュラーＰＫＳではない。他の一実施形態では、ＰＫＳは芳香族ＰＫＳである。他の一実施形態では、ＡＣＰシンターゼは、脂肪酸合成に関連する。
他の一実施形態では、宿主細胞は、細菌、酵母、糸状菌、植物、藻類、または微細藻類の宿主細胞からなる群から選択される。一態様では、本発明は、本発明によって想定される生成物を生成するように改変され得る様々な宿主細胞または生物を提供する。一実施形態では、宿主細胞または生物は、ピキア・パストリスである。
別の実施形態では、宿主細胞または生物は、アスペルギルス種およびアスペルギルス・ニガーである。当業者は、本発明における使用に好適である追加の真菌種を認識するだろう。一実施形態では、改変された宿主細胞は、ホロＡＣＰシンターゼの異種発現系を含まない。
６．生成方法
一態様では、本発明は、異種微生物においてｍ−クレゾールまたはオルシノールを生成するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、炭素流の基材の使用を含む。別の実施形態では、炭素流の基材は、精製されたもしくは部分的に精製されたグルコースまたはデキストロース、トウモロコシ糖、サトウキビ、セルロース糖類（木材、竹、スイッチグラス、またはジャトロハに由来するもの等）からなる群から選択される。当業者は、本発明との使用に適切な追加の炭素源を認識するだろう。別の実施形態では、微生物は、ピキア・パストリスである。
また別の態様では、本発明は、宿主において芳香族化合物の超生理学的レベルの合成を得るための方法を目的とする。別個のベクター上または複数のベクター系におけるベクターのうちの１つの上（もしくはＰＫＳ発現の単一ベクター上）のいずれかに適合ホロＡＣＰシンターゼの、またはＰＫＳもしくはその一部を伴う融合タンパク質としての発現系を供給することにより、大腸菌、酵母、糸状菌、藻類、および他の微生物系等の宿主は、宿主における関連遺伝子のコピー数、もしくは他の遺伝子複製手段において増加を本質的に得るように処理され得るか、あるいは、誘発性プロモーター、エンハンサー等を使用する、転写および／または翻訳等の強化を得る等の正の調節により、強化されたレベルのポリケチド、クレゾール、オルシノール、およびそのメチルエーテルは、製造の選択および規模に影響を受けやすい適当な宿主において作製され得る。
一態様では、本発明は、本明細書に記載される、対象とする化合物の中間体を含む対象とする化合物の高収率を得るための改変された組換え細胞および方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系とを含む、改変された組換え酵母細胞を提供することを含む。別の実施形態では、本方法は、組換え改変された酵母細胞においてフェノール化合物中間体を生成することをさらに含む。一実施形態では、フェノール化合物中間体は６−ＭＳＡである。
ＰＫＳ、例えば６−ＭＳＡＳを用いた微生物宿主細胞からの化合物の生成は、グルコースの変換に関して、収率の制限および効率の制限をもたらしてきた。例えば、Ｋｅａｌｅｙらは、６−ＭＳＡＳを発現する酵母宿主細胞を用いて１．７ｇ／Ｌの６−ＭＳＡの収率を報告し（ＰＮＡＳ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９５，ｐｐ．５０５−５０９，Ｊａｎｕａｒｙ１９９８）、一方、Ｘｉｅらは、６−ＭＳＡＳを発現する酵母宿主細胞において、６％のグルコース変換率を報告した（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９３，Ｎｏ．４，Ｍａｒｃｈ ５，２００６）。好ましい実施形態では、生成ステップは、ＰＫＳを発現する宿主細胞から３ｇ／Ｌを超える６−ＭＳＡの収率を提供する（実施例１を参照）。他の一実施形態では、３ｇ／Ｌを超える６−ＭＳＡの生成ステップは、細胞の成長に４０ｇ／Ｌのグルコースを使用することを含む。別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、モル基準で、グルコースから６０％を超える変換率で６−ＭＳＡの単離を提供する（実施例１を参照）。一実施形態では、６０％の変換率の生成ステップは、細胞の成長に５ｇ／Ｌのグルコースを使用することを含む。
本明細書に記載される方法によると、経路発達のための反応混合は、細胞成長および／またはインキュベーションを可能にする任意の槽において実行することができる。例えば、反応混合は、生物反応器、細胞培養フラスコもしくはプレート、多重ウェルプレート（例えば、９６、３８４、１０５６ウェルマイクロタイタープレート等）、培養フラスコ、発酵槽、または細胞成長もしくはインキュベーション用の他の槽であり得る。
スクリーニングは、いくつかの遺伝的状況において、他の細胞を死滅させるが、マーカーを発現する細胞を残存させる（またはその逆）選択可能マーカーの発現の検出により実行することができる。本明細書に記載される方法を用いた新規経路の効率的な発達を提供するためには、効率的なスクリーニング技法が必要とされる。好ましくは、酵素経路によって生成された化合物の好適なスクリーニング技法は、対象とする性質に関して迅速かつ精度の高いスクリーニングを可能にする。視覚的（熱量測定）アッセイはこの点に関して最適であり、好適な光吸収性質を有する化合物に対して容易に適用される。より複雑なスクリーニング技術は、例えば、高処理ＨＰＬＣ−ＭＳ解析、ＳＰＭＥ（固相微量抽出）、およびＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析法）（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｄ．Ｒ．Ｋｎａｐｐ；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９７９を参照のこと）を含む。ある場合には、自動注入および迅速なサンプル分析のために、スクリーニングロボットがＨＰＬＣ−ＭＳシステムに接続される。これらの技法は、実質的に任意の所望の化合物の高処理検出および定量化を可能にする。
生物学的に生成された対象とする生成物は、当該技術分野において既知の方法を使用して発酵培地または細胞抽出物から単離され得る。例えば、固体または細胞片は、遠心分離または濾過により除去され得る。対象とするバイオ生成物は、蒸留、液体−液体抽出、膜蒸発、吸着により、または当該技術分野において既知の方法を使用して単離され得る。
いくつかの実施形態では、対象とする生成物の識別は、ＨＰＬＣを使用して行うことができる。例えば、基準サンプルは、培地中の既知量の有機生成物を用いて調製される（例えば、６−ＭＳＡ、ＯＳＡ、ｍ−クレゾール、またはオルシノール）。次に、生成された化合物または化合物中間体の保持時間が真の基準と比較され得る。いくつかの実施形態では、対象とする生成物の識別は、ＧＣ−ＭＳを使用して行うことができる。次に、分離されたサンプルは、質量選択検出器によって分析され、前の質量スペクトルおよび真の基準の保持時間と比較される。
本方法の実践は、別途記載のない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学、工学、ロボット工学、光学、コンピュータソフトウェア、および組み込みの従来の技法を採用する。技法および手順は、概して、当該技術分野の知識内である、当該技術分野における従来の方法および様々な一般参照により行われる。そのような技法は文献に詳細に説明される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２．ｓｕｐ．ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，１９８４）、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）、論文Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ． Ｍ． Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）、Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９８３）、およびＬａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｔｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｌｉｆｅｔｉｍｅ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｍｅｔａｌ−ｌｉｇａｎｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｍｕｌｔｉ−ｐｈｏｔｏｎ Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ，Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｓｕｐｐｌ ＶＯＬ．１０（１９９６）ｐａｇｅｓ ２１３−２４、蛍光技法に関しては、Ｏｐｔｉｃｓ Ｇｕｉｄｅ ５ Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ．ＴＭ．Ｉｒｖｉｎｅ Ｃａｌｉｆ、一般的な光学方法に関しては、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｗａｖｅｇｕｉｄｅ Ｔｈｅｏｒｙ，Ｓｎｙｄｅｒ＆Ｌｏｖｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ、かつ光ファイバ理論および材料に関しては、Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｙ Ｐｅｔｅｒ Ｃｈｅｏ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌを参照されたい。
本明細書において例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されない任意の要素もしくは複数の要素、制限もしくは複数の制限の不在下で適切に実践することができる。したがって、例えば、本明細書におけるそれぞれの場合において、用語「含む」、「〜から本質的になる」、および「〜からなる」のいずれも、他の２つの用語のいずれかと置換することができる。したがって、本用語のうちの１つを用いた本発明の実施形態に関して、本発明は、これらの用語のうちの１つがこれらの用語の別のものと置換される別の実施形態も含む。それぞれの実施形態では、本用語は、その確立された意味を有する。したがって、例えば、一実施形態は、いくつかの成分を「含む」宿主細胞を包含することができ、別の実施形態は、同一の成分「から本質的になる」宿主細胞を包含し、第３の実施形態は、同一の成分「からなる」宿主細胞を包含するだろう。採用されてきた用語および表現は、説明の用語としてであって、制限の用語として使用されず、そのような用語および表現の使用において、示され、説明される特徴の任意の等価物またはその一部を排除する意図はなく、様々な修正が主張される本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書において開示される内容の修正および変形は、当業者によって行われ得、そのような修正および変形は、付属の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると考えられることを理解されたい。
前述の記載される説明は、当業者に本発明の実践を可能にするのに十分であると考えられる。以下の実施例は、単に例示目的のために提示されるものであり、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。実際、本明細書に示され、説明されたものに加え、本発明の様々な修正は、前述の説明から当業者には明らかとなり、付属の特許請求の範囲内に入る。
実施例
実施例１−サッカロマイセス・セレヴィシエにおける６−ＭＳＡＳおよびＯＳＡＳの発現
ポリケチド生成物のｍ−クレゾールおよびオルシノールへの変換。サッカロマイセス・セレヴィシエＡＤＨ２プロモーターが化学的に合成され、ストレプトマイセス・アンチビオチクス由来の細菌性６−ＭＳＡＳ遺伝子ＣｈｌＢ１、またはストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のＯＳＡＳ、ＡｖｉＭ遺伝子の合成遺伝子に融合される。サッカロマイセス・セレヴィシエターミネーター配列も、各それぞれのＰＫＳ遺伝子の終止コドン（複数可）直後の遺伝子配列に融合される。発現カセットは、ＵＲＡ３選択可能マーカーを含む酵母発現ベクター内にクローン化された。同様に、アスペルギルス・ニーヅランスｎｐｇＡタンパク質をコードする遺伝子は、トリプトファン欠乏培地における成長のために、選択可能マーカーを含む酵母発現ベクター内にクローン化される。
成分であるサッカロマイセス・セレヴィシエＩｎｖＳｃ１（ＭＡＴａ ｈｉｓ３Ｄ１ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１−２８９ ｕｒａ３−５２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、発現ベクターで順次形質転換され、次に最少寒天プレート（ウラシルおよびトリプトファン原栄養性に基づく選択のため、アミノ酸または硫酸アンモニアを含まない１．７ｇ／Ｌの酵母窒素塩基（ＤＩＦＣＯ）、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｇ／Ｌのグルコース、アミノ酸を含む２０ｇ／Ｌの寒天）上に設置される。形質転換体を選別し、ウラシルおよびトリプトファン欠乏最少培地で２４時間成長させた。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、同一性を確認するために、制限消化分析により分析した。
良好な形質転換体を使用して、２ｍＬのウラシル欠乏最少培地を播種し、軌道振とう器で、３０℃で一晩成長させた。 この培養物の５００μＬのアリコートを使用して、５０ｍＬのＹＥＰＤ培地（Ｗｏｂｂｅ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３４：１３．０．１−１３．１３．９（Ｗｉｌｅｙ，１９９６））（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトン、２０ｇ／Ｌのグルコース）を播種し、培養物を振とう器で、３０℃で成長させた。別の実験において、４０ｇ／Ｌのグルコースが使用されることを除き、上記と同一のものを使用し、６−ＭＳＡは、＞３グラム／リットルのレベルで単離された。他の別の実験において、５ｇ／Ｌのグルコースが使用されたことを除き、上記と同一のものを使用し、６−ＭＳＡは、モル基準で、グルコールから＞６０％の変換率で単離された。
２４、４８、および７２時間の成長後に取られた５００μＬの培養物のアリコートを遠心分離することにより細胞を収集し、５０μＬの２×ＳＤＳゲル充填緩衝液中で約２分間沸騰させるとこにより溶解した。１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に充填することにより、細胞可溶化液を分析する。予測された６−ＭＳＡＳの大きさに対応するバンドをｃａ．１９０ｋＤで、そしてＯＳＡＳ ＡｖｉＭタンパク質をｃａ．１４５ｋＤで観察する。
６−ＭＳＡおよびＯＳＡを、前述のように酵母上清から単離し（Ｋｅａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：５０５−９，１９９８）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上の既知の標準と比較することにより、およびＨＰＬＣにより識別する。
次に、精製された６−ＭＳＡおよびＯＳＡを、既知の化学方法を用いて脱炭酸化して、ｍ−クレゾールおよびオルシノールを得るか、あるいはプリムネシウム・パツルム由来の酵素等の組換えもしくは天然の６−ＭＳＡデカルボキシラーゼ、アスペルギルス・クラバタス由来の６−ＭＳＡデカルボキシラーゼＰａｔＧ、グリオクラジウム・ロゼウム由来のもの等のＯＳＡデカルボキシラーゼ、またはアスペルギルス・ニガー由来のもの等の２，３−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ、またはスフィンゴモナス・パウシモビリスＳＹＫ−６由来の５−カルボキシバニリン酸デカルボキシラーゼを用いて脱炭酸化する。ｍ−クレゾールおよびオルシノール生成物は、既知の標準を用いて、ＴＬＣおよびＨＰＬＣによって識別される。
次に、化学還元により、ｍ−クレゾールのヒドロキシル基を除去し、既知の方法を実践し、例えば加熱後、亜鉛粉末で蒸留することにより、トルエンを得る。芳香族環を飽和するために、トルエンをさらに還元し、飽和され、ジェット燃料に非常の望ましい好適なエネルギー源であるメチルシクロヘキサンを得る。あるいは、水素化および脱酸素化をもたらすために、金属触媒を用いて、特許出願第ＷＯ／２００６／０８６４５７号に記載される方法により、ｍ−クレゾールを還元し、直接メチルシクロヘキサンに脱酸素化する。ｍ−クレゾールも標準的な方法によりジェット燃料に使用することができ、またガソリンに使用することもできるメチルシクロヘキサンに還元される。
実施例２−サッカロマイセス・セレヴィシエにおけるｍ−クレゾールの直接生成
アスペルギルス・ニーヅランスｎｐｇＡ遺伝子が標準的な方法により酵母株ＢＪ２１６８（ＡＴＣＣから入手）のゲノム内に組み込まれる酵母株は、Ｒｈｏ１００−ｎｐｇＡ株を作り出すように構築される。Ｕｒａ３の選択下のＣｈＢ１遺伝子、およびＴｒｐ１による選択制御下のプリムネシウム・パツルムの６−ＭＳＡデカルボキシラーゼまたはアスペルギルス・クラバタス由来の６−ＭＳＡデカルボキシラーゼＰａｔＧの発現の発現系を含むプラスミドは、順次、Ｒｈｏ１００−ｎｐｇＡ内に形質転換される。
形質転換された酵母細胞を、２％のグルコースを含むＹＥＰＤ媒体を含む振とうフラスコ中で４８および７２時間成長させ、ｍ−クレゾールの生成に関して上清を分析する。遠心分離により細胞を除去し、さらに分析、定量化、および高純度に蒸留するために、酢酸エチルを使用して、培地からｍ−クレゾールを抽出する。
さらなる一連の実験において、２つの遺伝子は、単一プロモーターから発現される２つの遺伝子を分離するサッカロマイセス・セレヴィシエＩＲＥＳ配列を使用して、同一のベクター上に発現される。サッカロマイセス・セレヴィシエＩＲＥＳ配列は、そのそれぞれの発現系からｍ−クレゾールを生成するその能力に関して比較された。
実施例３−サッカロマイセス・セレヴィシエにおけるオルシノールの直接生成
Ｕｒａ３の選択下のストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のＯＳＡＳ ＡｖｉＭ遺伝子、およびＴｒｐ１を通した選択制御下のアスペルギルス・クラバタス由来のＰａｔＧデカルボキシラーゼの発現の発現系を含むプラスミドは、順次、Ｒｈｏ１００−ｎｐｇＡ内に形質転換される。
形質転換された酵母細胞を、２％のグルコースを含むＹＥＰＤ媒体を含む振とうフラスコ中で４８および７２時間成長させ、オルシノールの生成に関して上清を分析する。遠心分離により細胞を除去し、さらに分析、定量化、および高純度に蒸留するために、酢酸エチルを使用して、培地からオルシノールを抽出する。
さらなる一連の実験において、２つの遺伝子は、単一プロモーターから発現される２つの遺伝子を分離するサッカロマイセス・セレヴィシエＩＲＥＳ配列を使用して、同一のベクター上に発現される。ＩＲＥＳ配列は、そのそれぞれの発現系からオルシノールを生成するその能力に関して比較される。
実施例４−サッカロマイセス・セレヴィシエ発酵上清における６−ＭＳＡおよびＯＳＡのそれぞれｍ−クレゾールおよびオルシノールへの変換
実施例２および３の酵母細胞を、トウモロコシ糖、セルロース糖類、およびサトウキビ等の様々な供給材料を用いて、バッチ供給の１リットル発酵槽（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）で成長させた。培地を連続流モードで一定速度で供給および除去し、組換えデカルボキシラーゼタンパク質を含む溶液中に培地を供給する。上記のように、得られたｍ−クレゾールおよびオルシノール生成物を分析のため酢酸エチルで抽出する。
さらなる一連の実験において、ｍ−クレゾールおよびオルシノールを含む上清は、好適なマトリックス上に適切な固定化デカルボキシラーゼ酵素を含むカラム中に直接供給される。再度、上記のように、カラム溶出物からのそれぞれのｍ−クレゾールおよびオルシノール生成物を生成レベルの分析のために酢酸エチルで抽出する。
実施例５−サッカロマイセス・セレヴィシエにおける３−メチルアニソールおよび３，５−ジメトキシトルエンの生成
第３の発現系を、実施例２、３、および４の発現系内に組み込む。ロサ・キネンシスのバラの花弁（レディ・ヒリンドンおよびオールド・ブラッシュ品種）由来のＯ−メチルトランスフェラーゼの合成遺伝子（Ｓｃａｌｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５２３：１１３−１１８（２００２）を構築し、サッカロマイセス・セレヴィシエＡＤＨ−２プロモーターまたはサッカロマイセス・セレヴィシエ糖分解酵素遺伝子プロモーターの制御下に配置する。
上記のように発現系の完全補体を含む株を成長させ、収集し、３−メチルアニソール（１−メトキシ−３−メチルベンゼン）および３，５−ジメトキシトルエン（１，３−ジメトキシ−５−メチルベンゼン）の生成に関して細胞上清を分析し、続いて酢酸エチルまたはジエチルエーテルで抽出する。
実施例６−６−ＭＳＡを生成する酵母細胞およびデカルボキシラーゼ酵素を生成する細胞の共培養
上記のストレプトマイセス・アンチビオチクス由来の細菌性６−ＭＳＡＳ遺伝子ＣｈｌＢ１を発現するサッカロマイセス・セレヴィシエ細胞、、およびアスペルギルス・ニーヅランスｎｐｇＡタンパク質を上記のように４８時間成長させる。同様に４８時間成長させたアスペルギルス・クラバタス由来のデカルボキシラーゼＰａｔＧを発現するサッカロマイセス・セレヴィシエ細胞を含む等容量の培地を培養物に添加し、共培養物を３０℃で２４時間インキュベートする。遠心分離により細胞を除去し、さらに分析、定量化、および高純度に蒸留するために、酢酸エチルを使用して、培地からｍ−クレゾールを抽出する。
実施例７−粉末金属触媒と共に加熱することによる６−ＭＳＡの脱炭酸化
精製した６−ＭＳＡを触媒量の様々な金属粉末と混合し、周囲気圧で加熱する。ｍ−クレゾールを蒸発させ、収集槽内に凝集させる。得られた生成物の分析は、＞９９％のパーセンテージ純度を示す。
特定の例において、粉末６−ＭＳＡ（２０グラム）を亜鉛粉末（２．５グラム）と混合し、すべての固体が液化するまで蒸留器中で加熱した。加熱を続け、ｍ−クレゾールを蒸発させ、氷冷のフラスコ内に凝集させ、＞９９．９％純度の１１．３５グラムの無色のｍ−クレゾールを得た。

Claims (49)

  1. フェノール化合物を生成するための改変された組換え宿主細胞であって、前記細胞から単離される生成物が、フェノール化合物であるように、
    ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、
    ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系と、
    ｉｉｉ）デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の発現系と、
    を含む、改変された組換え宿主細胞。
  2. 前記フェノール化合物が、メタ−クレゾールである、請求項１に記載の宿主細胞。
  3. 前記フェノール化合物が、オルシノールである、請求項１に記載の宿主細胞。
  4. 前記芳香族ＰＫＳが、不活性化ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを含む、請求項３に記載の宿主細胞。
  5. 前記芳香族ＰＫＳが、真菌由来の６−メチルサリチル酸のシンターゼである、請求項１に記載の改変された細胞。
  6. 前記芳香族ＰＫＳが、原核生物由来の６−メチルサリチル酸のシンターゼである、請求項１に記載の改変された細胞。
  7. 前記芳香族ＰＫＳが、野生型形態のストレプトマイセス・アンチビオチクス由来のＣｈｌＢ１遺伝子によってコードされる、請求項６に記載の改変された細胞。
  8. 前記芳香族ＰＫＳが、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス由来のＡｖｉＭ遺伝子によってコードされるオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）である、請求項３に記載の改変された細胞。
  9. 前記デカルボキシラーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、プリムネシウム・パツルム（Ｐ．Ｐａｔｕｌｕｍ）由来の６−ＭＳＡデカルボキシラーゼ遺伝子、アスペルギルス・クラバタス由来のＰａｔＧ遺伝子、グリオクラジウム・ロゼウム由来のＯＳＡデカルボキシラーゼ遺伝子、アスペルギルス種由来の２，３−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子、およびスフィンゴモナス・パウシモビリスＳＹＫ−６由来の５−カルボキシバニリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
  10. 前記ＰＫＳの前記発現系および前記ホロＡＣＰシンターゼの前記発現系が、同一のベクター上に存在する、請求項１に記載の改変された細胞。
  11. 前記ＰＫＳの前記発現系および前記ホロＡＣＰシンターゼの前記発現系が、別個のベクター上に存在する、請求項１に記載の改変された細胞。
  12. 前記ＰＫＳおよび前記ホロＡＣＰシンターゼが、２シストロン性メッセンジャーＲＮＡから発現される、請求項１に記載の改変された細胞。
  13. 官能性デカルボキシラーゼの発現系が、同一のベクター上または別個のベクター上に存在する、請求項６に記載の改変された細胞。
  14. 官能性デカルボキシラーゼの発現系が、前記最小のＰＫＳの発現系もしくは前記ホロＡＣＰシンターゼの前記発現系のいずれかと同一のベクター上、または別個のベクター上に存在する、請求項７に記載の改変された細胞。
  15. 前記最小のＰＫＳの前記発現系および前記ホロＡＣＰシンターゼの前記発現系および官能性デカルボキシラーゼの前記発現系が、同一のベクター上に存在する、請求項１に記載の改変された細胞。
  16. 前記発現系のうちの１つ、２つ、または３つすべてが、前記宿主細胞の染色体に組み込まれるか、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）から発現される、請求項１に記載の改変された細胞。
  17. 前記発現されたＰＫＳ、ホロＡＣＰシンターゼ、およびデカルボキシラーゼのうちの少なくとも２つが、多シストロン性メッセンジャーＲＮＡに由来する、請求項１に記載の改変された細胞。
  18. 前記宿主生物が、ピキア・パストリスおよびアスペルギルス種からなる群から選択される、請求項１に記載の改変された細胞。
  19. 前記宿主生物が、アスペルギルス・ニガーである、請求項１に記載の改変された細胞。
  20. ホロＡＣＰシンターゼの異種発現系を含まない、請求項１９に記載の改変された細胞。
  21. フェノール化合物を生成する方法であって、
    ａ）改変された組換え宿主細胞であって、
    ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、
    ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系と、
    ｉｉｉ）デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の発現系と、を含む、改変された組換え宿主細胞を提供することと、
    ｂ）前記組換え宿主細胞においてフェノール化合物中間体を生成することと、
    ｃ）前記フェノール化合物中間体からフェノール化合物を合成することであって、組換えデカルボキシラーゼが、前記フェノール化合物中間体の脱カルボキシル化を触媒して、前記フェノール化合物を形成することと、
    を含む、方法。
  22. 前記フェノール化合物中間体が、６−ＭＳＡである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記フェノール化合物が、メタクレゾールである、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記フェノール化合物中間体が、オルセリン酸（ＯＳＡ）である、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記フェノール化合物が、オルシノールである、請求項２１に記載の方法。
  26. 前記芳香族ＰＫＳが、不活性化ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを含む、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 前記芳香族ＰＫＳが、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のＡｖｉＭ遺伝子によってコードされるオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）である、請求項２４または２５に記載の方法。
  28. フェノール化合物を生成する方法であって、
    ａ）改変された組換え宿主細胞であって、
    ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、
    ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系と、を含む、改変された組換え宿主細胞を提供することと、
    ｂ）前記組換え宿主細胞において生成されたフェノール化合物中間体を単離することと、
    ｃ）金属触媒で加熱し、続いて、蒸留することによって、ステップｂ）の前記フェノール化合物中間体を脱カルボキシル化して、前記フェノール化合物を形成することと、
    を含む、方法。
  29. 前記フェノール化合物中間体が、６−ＭＳＡである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記フェノール化合物が、メタ−クレゾールである、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記金属触媒が、粉末形態である、請求項２８に記載の方法。
  32. 前記金属触媒が、亜鉛触媒である、請求項２８または３１に記載の方法。
  33. アルキル化フェノール化合物を生成するために改変された組換え宿主細胞であって、前記細胞から単離される生成物が、アルキル化フェノール化合物であるように、
    ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、
    ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系と、
    ｉｉｉ）デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の発現系と、
    （ｉｖ）Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＯＭＴ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第４の発現系と、を含む、改変された組換え宿主細胞。
  34. 前記アルキル化フェノール化合物が、３−メチルアニソールである、請求項３３に記載の改変された細胞。
  35. 前記アルキル化フェノール化合物が、３，５−ジメトキシトルエンである、請求項３３に記載の改変された細胞。
  36. 前記芳香族ＰＫＳが、不活性化ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを含む、請求項３５に記載の改変された細胞。
  37. 前記芳香族ＰＫＳが、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のＡｖｉＭ遺伝子によってコードされるオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）である、請求項３５に記載の改変された細胞。
  38. ＯＯＭＴが、ＯＯＭＴ１、ＯＯＭＴ２、ＯＯＭＴ３、ＯＯＭＴ４、ＣＯＭＴ１からなる群から選択されるロサ・キネンシス（Ｒ．Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）遺伝子によってコードされる、請求項３３に記載の改変された細胞。
  39. アルキル化フェノール化合物を生成する方法であって、
    ａ）改変された組換え宿主細胞であって、
    ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、
    ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系と、
    ｉｉｉ）デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第３の発現系と、を含む、改変された組換え宿主細胞を提供することと、
    ｂ）前記組換え宿主細胞において生成されたフェノール化合物中間体を単離することと、
    ｃ）アルキル化剤での処理によって、ステップｂ）の前記フェノール化合物中間体をアルキル化して、前記アルキル化フェノール化合物を形成することと、を含む、方法。
  40. 前記フェノール化合物中間体が、ｍ−クレゾールである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記フェノール化合物中間体が、オルシノールである、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記芳香族ＰＫＳが、不活性化ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記芳香族ＰＫＳが、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のＡｖｉＭ遺伝子によってコードされるオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）である、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記アルキル化フェノール化合物が、３−メチルアニソールである、請求項３９または４０に記載の方法。
  45. 前記アルキル化フェノール化合物が、３，５−ジメトキシトルエンである、請求項３９または４１に記載の方法。
  46. 前記アルキル化剤が、メタノールである、請求項３９に記載の方法。
  47. フタル酸無水化合物を生成する方法であって、
    ａ）改変された組換え宿主細胞であって、
    ｉ）発現されることができる６−メチルサリチル酸（６−ＭＳＡＳ）の芳香族ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第１の発現系と、
    ｉｉ）前記ＰＫＳをパンテテイニル化するホロアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）シンターゼをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む第２の発現系と、を含む、改変された組換え宿主細胞を提供することと、
    ｂ）前記組換え宿主細胞において生成されたフタル酸無水中間体化合物を単離することと、
    ｃ）酸化剤での処理によって、ステップｂ）の前記フタル酸無水中間体化合物を酸化して、前記フタル酸無水化合物を形成することと、を含む、方法。
  48. 前記フタル酸無水中間体化合物が、６−ＭＳＡである、請求項４０に記載の方法。
  49. 前記フタル酸無水物が、３−ヒドロキシフタル酸無水物である、請求項４０に記載の方法。
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