CN103764819A

CN103764819A - 芳族分子的重组生产系统

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Publication number: CN103764819A
Application number: CN201280040918.8A
Authority: CN
Inventors: P.J.巴尔
Original assignee: Rho Renewable Ltd By Share Ltd
Current assignee: Rho Renewable Ltd By Share Ltd
Priority date: 2011-06-23
Filing date: 2012-06-22
Publication date: 2014-04-30
Also published as: JP2014519853A; NZ619984A; CN108570420A; CA2839570C; AU2012272644A1; US10125381B2; MX349840B; BR112013033021A2; AU2012272644B2; CA2839570A1; ZA201400226B; RU2014101985A; KR20140046439A; KR101895651B1; JP6297489B2; AU2012272644A8; WO2012178110A2; MX2013015091A; US9637763B2; EP2723857B1

Abstract

本发明涉及在原核和真核宿主，如大肠杆菌(E.coli)、酵母、丝状真菌、藻类、微藻、其它植物细胞中生产芳族分子。

Description

芳族分子的重组生产系统

相关申请

本申请要求2011年6月23日提交的美国临时申请第61/500,518号和2012年1月5日提交的第61/583,325号的权益，该临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。

发明领域

发明背景

目前存在从可再生资源中生产许多特种化学品和液体燃料的未实现的需要。尽管对地球的海洋和大气环境有很大的负面影响，大部分化学化合物和机动车燃料仍来源于化石燃料如原油、煤焦油、页岩油等。特别注意，简单酚类化合物如甲酚在过程中主要提取自煤焦油，该过程对环境有如此的负面影响以致专门生产甲酚的美国工厂近年来已关闭。然而，这不是全球性的方案，因为该问题可以简单地被转移到另一地理位置。合成生物学提供了制造某些特种化学品如这些的可能方案。

一般以类似于脂肪酸合成的方式通过缩合二碳单元来合成聚酮化合物。通常，合成包括启动单元和扩展单元；这些“二碳”单元来源于例如酰基硫酯，通常为乙酰基、丙酰基、丙二酰基或甲基丙二酰基辅酶-A硫酯。有四类聚酮化合物合酶(PKS)，其不同之处在于使用催化位点的“方式”(Watanabe andEbizuka，2004)。I型模块化PKS是有多个“模块”的单个蛋白，其含有以线性“装配线”类型仅使用一次的催化位点。I型迭代PKS是具有重复使用以得到最终聚酮化合物产物的位点的单个蛋白。本发明可从每个类型中采用编码序列，但在优选实施方案中，采用的PKS将主要来源于例如芳族6-甲基水杨酸合酶，或苔色酸合酶，或这些酶的修饰形式的这类PKS。在异源微生物如酵母和大肠杆菌中，编码I型PKS多肽组分的基因已经被用于聚酮化合物的微生物生产。参见例如美国专利No.6,033,883、No.6,258,566和No.7,078,233。

II型PKS包含多个蛋白，其中每个蛋白具有单个单官能活性位点。活性位点可以只用一次或重复使用。最后，III型PKS是具有多个模块的单个蛋白，其中活性位点被重复使用。

PKS以与脂肪酸合酶(FAS)类似的方式工作。脂肪酸通常由疏水性组分组成，且可用作能源如在生物燃料中。许多真核生物使用共同的或相似的代谢途径合成脂肪酸。在种子中，储存作为甘油三酯一部分的脂肪酸作为能量来源用于进一步的发芽。FAS途径位于质体中。通过冷凝酶β-酮酰-ACP合酶(KAS)III形成乙酰-ACP(酰基载体蛋白)。延长乙酰-ACP至长链脂肪酸包括丙二酰-ACP的2-碳单元的循环缩合作用以形成更长的β-酮酰-ACP(β-酮酰-ACP合酶)、酮基官能团到醇的还原(β-酮酰-ACP还原酶)、形成烯酰-ACP的脱水(β-羟酰-ACP脱水酶)，以及最后还原烯酰-ACP以形成细长饱和的酰基-ACP(烯酰-ACP还原酶)。β-酮酰-ACP合酶I(KAS I)主要负责延伸至棕榈酰-ACP(C16:0)，而β-酮酰-ACP合酶II(KAS II)主要负责最终延伸至硬脂酰ACP(C18:0)。

类似地，通过示于图1和2的生物合成途径，迭代芳族PKS利用从丙二酰-ACP的2-碳单元的缩合以形成产物如6-甲基水杨酸(6-MSA)，也称为2-羟基-6-甲基苯甲酸(HMBA)和苔色酸(OSA)。通过简单地“敲除”酮还原酶(KR)结构域的催化活性可工程化细菌6-MSAS以合成OSA这一事实，这些途径的灵活性得以强调(Ding等，Chemistry&Biology17,495-503,2010)。

本发明提供在杀微生物、药物和可再生的液体燃料领域有多用途的分子和前体分子的生产系统。在一些实施方案中，添加用于酰基运载蛋白泛酸巯基乙胺基化(pantetheinylation)(即，用完整的ACP合酶，也称为PPT酶)的机器可在非必须天然生产此类分子的宽范围的宿主中生产所述分子。

由此从微生物宿主直接或间接获得的芳族分子，如甲酚、苔黑素、羟甲基苯甲酸及其同源的醚、酯和内酯，生成均相或非均相的化合物制剂，其或可进一步处理以生成适合用作杀微生物剂、药物、维生素、调味剂或可再生能源(如燃料、燃料添加剂例如含氧化合物、燃料辅助剂即高辛烷值汽油掺合剂等)的化合物。

附图简述

图1描述了6-MSA的生物合成途径(Beck等，Eur J Biochem192:487-498(1990))。

图2描述了6-MSA和OSA的生物合成途径(Ding等，Chemistry andBiology17:495-503(2010))。

发明概述

本发明涉及原核和真核宿主，如大肠杆菌、酵母、丝状真菌、藻类、微藻、其它植物细胞等中芳族分子的生产。一方面，用官能化的芳族聚酮化合物合酶(PKS)获得分子，并且所得的各种分子在体内转化来制造具有杀微生物或药物用途的特种化学品。此外，本发明涉及具有杀微生物或药物用途的化合物前体的生产。一方面，进一步处理前体以生成可以是其它特种化学品和聚合物前体的高辛烷值的芳族或环己烷和环己醇样分子。处理过的前体可与基于石油的和喷射燃料相容，并因此可用作可再生能源。

本发明涉及在多种宿主中产生和衍生聚酮化合物的重组材料以及所产生的聚酮化合物及其衍生物。如本领域所知，单个或多个载体可用于构建产生化合物的宿主。单个载体允许宿主细胞最小的处理能力，多个载体促进体内进一步转化的能力，并且可以更灵活地设计各种新的合成途径。

在一个实施方案中，本发明提供修饰的重组宿主细胞以产生酚类化合物，其包含i)第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列。在另一个实施方案中，宿主细胞还包含ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化(pantetheinylates)。在另外的实施方案中，宿主细胞还包含iii)第三表达系统，该系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列。在一个其它实施方案中，从所述细胞分离的产物是酚类化合物。在另一个实施方案中，芳族PKS是原核生物的6-甲基水杨酸合酶。在一个其它实施方案中，原核生物6-MSAS的表达系统包含存在于相同载体上或独立载体上的官能化脱羧酶。在一个其它实施方案中，芳族PKS由野生型形式的抗生链霉菌(S.antibioticus)的ChlB1基因编码。在一个另外的实施方案中，能被细胞产生并且能从细胞分离的酚类化合物是间甲酚。

在一个实施方案中，芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。在另一个实施方案中，芳族PKS是真菌的6-甲基水杨酸合酶。在另外的实施方案中，芳族PKS是由绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。在另一个实施方案中，能被细胞产生并且能从细胞分离的酚类化合物是苔黑酚。

在另一个实施方案中，编码脱羧酶的核苷酸序列选自由展青霉(P.patulum)的6-MSA脱羧酶基因、棒曲霉(Aspergillus clavatus)的PatG基因、粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)的OSA脱羧酶基因、曲霉属(Aspergillus)种的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶基因和少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)SYK-6的5-羧基香草醛脱羧酶基因组成的组。

在另一个实施方案中，所述PKS的表达系统和所述完整的ACP合酶的表达系统存在于相同的载体上。在其它实施方案中，所述PKS的表达系统和所述完整的ACP合酶的所述表达系统存在于独立载体上。在一个其它实施方案中，PKS和所述完整的ACP合酶由双顺反子信使RNA表达。

在一个其它实施方案中，包含官能化脱羧酶表达系统的修饰的细胞存在于与所述最小PKS的表达系统或所述完整的ACP合酶的所述表达系统的相同载体上，或独立载体上。在另一个实施方案中，所述最小PKS的表达系统和所述完整的ACP合酶的所述表达系统以及官能化脱羧酶的所述表达系统存在于相同的载体上。在一个实施方案中，一个、两个或所有三个所述表达系统整合到宿主细胞染色体或由酵母人工染色体(YAC)表达。在其它实施方案中，表达的PKS、完整的ACP合酶和脱羧酶的至少两种来源于多顺反子信使RNA。在另一个实施方案中，宿主生物体选自由毕赤酵母(Pichiapastoris)和曲霉属种组成的组。在一个实施方案中，宿主生物体是黑曲霉(Aspergillus niger)。在另一个实施方案中，黑曲霉不含完整的ACP合酶的异源表达系统。

另一方面，本发明提供生产酚类化合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：a)提供修饰的重组宿主细胞，其包含i)第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中所述ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化；和iii)第三表达系统，该系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述方法还包括b)在重组宿主细胞中生产酚类化合物中间体。在一个其它实施方案中，该方法还包括c)从酚类化合物中间体合成酚类化合物，其中重组脱羧酶催化酚类化合物中间体脱羧以形成酚类化合物。在一个实施方案中，酚类化合物中间体是6-MSA。在另一个实施方案中，酚类化合物是间甲酚。

在一个实施方案中，芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。在另一个实施方案中，芳族PKS是由绿色产色链霉菌的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。在一些实施方案中，酚类化合物中间体是苔色酸(OSA)。在其它实施方案中，酚类化合物是苔黑酚。

另一方面，本发明提供生产酚类化合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括a)提供修饰的重组宿主细胞，其包含i)第一表达系统，第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；和ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化。在一个实施方案中，该方法还包括b)分离产生于重组宿主细胞的酚类化合物中间体。在一个实施方案中，所述方法还包括c)通过用金属催化剂(或其它类型的催化剂)加热然后蒸馏，使步骤b)的酚类化合物中间体脱羧以形成酚类化合物。在另外的实施方案中，酚类化合物中间体是6-MSA。在其它实施方案中，酚类化合物是间甲酚。在一个实施方案中，金属催化剂是粉末形式。在另一个实施方案中，金属催化剂为锌催化剂。

在一个其它方面，本发明提供修饰的重组宿主细胞以生产烷基化的酚类化合物。在一个实施方案中，所述细胞包含i)第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；和ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中所述ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化；iii)第三表达系统，该系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列，和(iv)第四表达系统，该系统包含至少一个编码O-甲基转移酶(OOMT)的核苷酸序列。在一个实施方案中，能被细胞产生并且能从所述细胞分离的产物是烷基化的酚类化合物。在一个实施方案中，烷基化酚类化合物是3-甲基苯甲醚。

在一个实施方案中，芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。在另一个实施方案中，芳族PKS是由绿色产色链霉菌的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。在一个另外的实施方案中，烷基化的酚类化合物是3,5-二甲氧基甲苯。

在另外的实施方案中，OOMT由选自由OOMT1、OOMT2、OOMT3、OOMT4、COMT1组成的组的月季(Rosa chinensis)基因编码。

另一方面，本发明提供生产烷基化酚类化合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括a)提供修饰的重组宿主细胞，其包含i)第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化；和iii)第三表达系统，该系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列。在另一个实施方案中，该方法还包括b)分离产生于重组宿主细胞的酚类化合物中间体。在一个实施方案中，所述方法还包括c)通过用烷基化试剂进行处理，使步骤b)的酚类化合物中间体烷基化以形成烷基化的酚类化合物。在另一个实施方案中，烷基化试剂是甲醇。

在一个实施方案中，烷基化的酚类化合物中间体是间甲酚。在另一个实施方案中，烷基化的酚类化合物是3-甲基苯甲醚。

在另一个实施方案中，芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。在一个实施方案中，芳族PKS是由绿色产色链霉菌的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。在一个实施方案中，烷基化的酚类化合物中间体是苔黑酚。在一个其它实施方案中，烷基化的酚类化合物是3,5-二甲氧基甲苯。

另一方面，本发明提供生产邻苯二甲酸酐化合物的方法，该方法包括a)提供修饰的重组宿主细胞，其包含i)第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化。在另一个实施方案中，所述方法还包括b)分离产生于重组宿主细胞的邻苯二甲酸酐中间体化合物。在一个其它实施方案中，该方法还包括c)通过用氧化剂进行处理，使步骤b)的邻苯二甲酸酐中间体化合物氧化以形成邻苯二甲酸酐化合物。在一个实施方案中，邻苯二甲酸酐中间体化合物是6-MSA。在另一个实施方案中，邻苯二甲酸酐是3-羟基邻苯二甲酸酐。

发明描述

除非另有定义，否则本文所用的所有领域术语、表示法和其它科学术语旨在具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。在一些情况下，为清楚和/或便于参考起见，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文此类定义的包括不必被解释为与本领域通常所理解的相比表示出显著不同。本文所描述或引用的技术和程序通常被很好地理解，且通过使用常规方法被本领域技术人员通常采用，诸如，例如，广泛使用的分子克隆技术描述于Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual第2版(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.。视情况，涉及使用可商购的试剂盒和试剂的程序一般根据制造商规定的协议和/或参数来实施，除非另外说明。在本方法之前，描述了试剂盒和其使用，应当理解本发明不限于所述的具体方法、方案、细胞系、动物种或属、构建体和试剂，这些当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并非旨在限定本发明的范围，本发明的范围只受所附权利要求限定。

必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“和”以及“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确指出。

本说明书和权利要求中，词语“包含(comprise)”或变体如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解成意指包括所述的整数或整数的组，但不排除任何其它整数或整数的组。

"PKS"是指聚酮化合物合酶(例如，6-MSAS或OSAS)。

"ACP"是指酰基载体蛋白。

"ACPS"是指酰基载体蛋白合酶(例如完整的ACP合酶)。

"DC"是指脱羧酶。

"PKS*"是指修饰的聚酮化合物合酶或PKS变体(例如，具有失活的酮还原酶结构域的PKS)。

"6-MSAS"是指6-甲基水杨酸合酶。

"OSAS"是指苔色酸合酶。

"OOMT"是指苔黑酚O-甲基转移酶。

"6-MSA"是指6-甲基水杨酸。

"OSA"是指苔色酸。

"HMBA"是指2-羟基-6-甲基苯甲酸。

本说明书中引用的所有专利、专利申请和文献参考资料在此通过引用整体并入本文。

本发明提供以快速、廉价和有效的方式生产所关注的有机化合物的方法和材料。因此，本发明满足了许多商业和工业需要。术语“有机分子”是指例如主要由碳和氢原子组成的任何分子，诸如，例如，芳香族化合物。所关注的有机化合物包括但不限于酚类或酚类化合物，如6-MSA/HMBA、OSA、间甲酚、苔黑酚、3-甲基苯甲醚、3,5-二甲氧基甲苯，和邻苯二甲酸酯如邻苯二甲酸酐(例如，3-羟基邻苯二甲酸酐)。

特别地，本发明涵盖从可再生资源中微生物生产所关注的化合物(例如，间甲酚，苔黑酚、甲基苯甲醚)及其衍生物。使用官能化芳族聚酮化合物合酶(PKS)获得芳族化合物，且将得到的各种分子在体内转化来制备特种化学品用于杀微生物或药物使用，或者制备化合物前体用于杀微生物或药物使用，或者进一步处理以得到能作为其它特种化学品和聚合物前体的高辛烷值的芳族或环己烷和环己醇样分子，或与基于石油和喷射的燃料相容，并因此能用作可再生能源。

一方面，本发明涉及酚类、酚类化合物和酚类化合物中间体的合成。如本文所用，酚类或酚类化合物是指有机化合物，其包括键合到羟基基团(-OH)的苯基基团(-C₆H₅)。

苯酚

在一个优选实施方案中，酚类或酚类化合物是间甲酚(也称为3-甲基苯酚)或苔黑酚(也称为5-甲基苯-1,3-二醇)。

间甲酚苔黑酚

本发明还涉及酚类化合物中间体的合成。在一个实施方案中，酚类化合物中间体是产生于本文描述的代谢途径的一个步骤的化合物(例如，图1和图2)。术语“代谢途径”是指一组两个或多个酶促反应，其中一个酶促反应的产物变成下一个酶促反应的底物。在代谢途径的每个步骤，中间体化合物形成并用作后续步骤的底物。在一个实施方案中，代谢途径的每个步骤发生在本文描述的修饰的重组细胞。在另一个实施方案中，代谢途径的至少一个步骤发生在本文描述的修饰的重组细胞，且代谢途径的至少一个步骤发生在修饰的重组细胞之外。代谢途径每个步骤产生的化合物可以被称为“中间体”或“中间体化合物”或“化合物中间体”。

在一个实施方案中，代谢途径包含由下列6-MSAS、OSAS、完整的ACP合酶、脱羧酶、O-甲基转移酶及其任意组合的一或多种催化的酶促反应。此类代谢途径能产生本文描述的所关注的化合物以及中间体化合物。

在另一个实施方案中，代谢途径包含由i)6-MSAS或OSAS；和ii)完整的ACP合酶催化的酶促反应。在一个实施方案中，代谢途径包括通过完整的ACP合酶的6-MSAS的泛酸巯基乙胺基化。在一个其它实施方案中，从代谢途径产生的化合物是6-MSA或OSA。在一个实施方案中，6-MSA或OSA是酚类化合物中间体。在另一个实施方案中，6-MSA是邻苯二甲酸酐中间体化合物。

在一个实施方案中，酚类化合物中间体选自由6-甲基水杨酸(6-MSA)(也称为2-羟基-6-甲基苯甲酸(HMBA))和苔色酸(OSA)组成的组。在另一个实施方案中，本文描述的重组细胞和方法提供从酚类化合物中间体合成所关注的酚类化合物。在一个其它实施方案中，由6-MSA中间体合成间甲酚或由OSA中间体合成苔黑酚。

在另一个实施方案中，6-MSA是邻苯二甲酸酐中间体化合物。在一个其它实施方案中，本文描述的重组细胞和方法提供从酚类化合物中间体合成邻苯二甲酸酐化合物。

在另一个实施方案中，代谢途径包括由i)PKS(例如，6-MSAS，修饰的6-MSAS或OSAS)；ii)完整的ACP合酶；和iii)脱羧酶催化的酶促反应。在一个其它实施方案中，由代谢途径产生的化合物是间甲酚或苔黑酚。

在另一个实施方案中，代谢途径包括由i)PKS(例如，6-MSAS，修饰的6-MSAS或OSAS)；ii)完整的ACP合酶；和iii)脱羧酶催化的酶促反应。在一个其它实施方案中，由代谢途径产生的化合物是甲基化的酚类化合物中间体。在另一个实施方案中，甲基化的酚类中间体化合物是间甲酚或苔黑酚。在一个实施方案中，间甲酚是3-甲基苯甲醚的中间体并且苔黑酚是3,5-二甲氧基甲苯的中间体。

在另一个实施方案中，代谢途径包括由i)PKS(例如，6-MSAS，修饰的6-MSAS或OSAS)；ii)完整的ACP合酶；iii)脱羧酶；和iv)O-甲基转移酶催化的酶促反应。在一个其它实施方案中，由代谢途径产生的化合物是甲基化的酚类化合物。在一个实施方案中，反应由6-MSAS、完整的ACP合酶、脱羧酶和OOMT催化以生成3-甲基苯甲醚。在一个其它实施方案中，反应由修饰的6-MSAS(或OSAS)、完整的ACP合酶、脱羧酶和OOMT催化以生成3,5-二甲氧基甲苯。

另一方面，本发明涉及所关注的有机化合物在微生物中的生产，并且提供在微生物中从碳源生产此类化合物的方法。

所述方法包含能生产以下所关注的有机化合物之一的微生物，特别是6-甲基水杨酸(6-MSA)(也称为2-羟基-6-甲基苯甲酸(HMBA))、间-甲酚、苔黑酚、3-甲基苯甲醚、3,5-二甲氧基甲苯、甲苯和邻苯二甲酸酯。本发明提供工程化的代谢途径、分离的核酸或工程化的核酸、多肽或工程化的多肽、宿主细胞或基因工程化的宿主细胞、方法和材料来生产所关注的有机化合物。

另一方面，本发明涉及工程化的多肽和多核苷酸，其编码对天然或非天然底物有活性或改进的活性或具有广泛的底物特异性的酶。本文可互换使用的术语“多肽”以及术语“蛋白”和肽”是指氨基酸聚合物，包括，例如，基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段，和其它等同物、变体和前面的类似物。术语“具有酶活性的多肽”是指催化其它物质的化学反应直至反应完成而本身不被破坏或改变的任何多肽。通常，具有酶活性的多肽催化一个或多个底物形成一个或多个产物。在一些实施方案中，现有的酶经修改用于有机生物合成。在一些优选的实施方案中，涉及生产所关注的有机化合物的酶包括但不限于6-甲基水杨酸(6-MSAS)；苔色酸合酶(OSAS)；完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶、脱羧酶和O-甲基转移酶(OOMT)。在一个实施方案中，所述酶是包含失活的酮还原酶(KR)结构域的6-MSAS。在另一个实施方案中，包含失活的KR结构域的6-MSAS促进在修饰的重组细胞中产生苔色酸且通过本文描述的方法。

本发明的不同方面采用芳族PKS系统的不同组分，或其修饰的形式或一份以上的这些，与其它修饰的酶连用以得到所需产物。

本发明使用的迭代或“芳族”PKS系统的特征在于迭代使用产生的酶的催化位点。因此，在这些芳族PKS系统中，在聚酮化合物的整个合成中产生只有一种具有特定活性类型的酶以催化系统的相关活性。

在一些实施方案中，可改变所述酶的反应机制以催化新的反应，以改变、扩展或改进底物特异性。应当理解，如果已知所述酶结构(例如，晶体结构)，酶的性质可以通过合理的重新设计来修饰(参见美国专利申请US20060160138、US20080064610和US20080287320，其以引用的方式整体并入本文)。酶性质的修饰或改进可能由于对多肽链引入修饰，事实上，其可干扰该酶的结构-功能和/或与另一分子的相互作用(例如底物及非天然底物)。本领域熟知的是，多肽的某些区域对酶活性可以是至关重要的。例如，涉及催化和/或底物结合结构域的氨基酸组成中的小干扰将对酶功能产生显著影响。某些氨基酸残基可以在重要位置以保持该酶的二级或三级结构，从而被修饰时酶的性质也产生显著变化。在一些实施方案中，可能的途径组分是任何前述的变体。此类变体可通过随机突变而产生或通过合理设计具有例如改变的底物特异性、增加的酶活性、更大的稳定性等的酶活性的生产而产生。因此，在一些实施方案中，产生具有期望性质的酶的参考亲本酶的修饰数量可包含一个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸，或20个或更多个氨基酸，多达氨基酸总数量的10%、多达氨基酸总数量的20%、多达氨基酸总数量的30%、多达组成参考酶的氨基酸总数量的40%或多达组成参考酶的氨基酸总数量的50%。在一个实施方案中，参考或亲本酶是6-MSAS，其被修饰以除去酮还原酶(KR)结构域。在另一个实施方案中，缺乏KR结构域的修饰的6-MSAS能在细胞中产生苔色酸或通过本文所述方法。

本领域技术人员将理解，本文所举例说明的工程化的途径被描述与物种特异性基因有关，但不限于物种特异性基因，并涵盖核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物。当使用本领域已知方法比对时，同源物和直系同源物序列具有高程度的序列同一性/相似性。

本发明的方面涉及已经被工程化为具有新代谢能力或新代谢途径的新的微生物或“基因修饰的”微生物或宿主细胞。本文使用的术语“基因修饰的”微生物是指具有至少一个基因改变的微生物，其通常在参考物种的野生型菌株中未被发现。在一些实施方案中，基因工程化的微生物被工程化以在代谢途径的关键点表达或过表达至少一种特定的酶，和/或阻止其它酶的合成，以克服或避免代谢瓶颈。

本发明的各方面提供了设计和制备工程化代谢途径的方法。在本发明的一些方面，由一个或多个可用的和可维持的底物制备所关注的产物的可选的途径可以在一种或多种宿主细胞或所关注的微生物中制备。应该理解，制备所关注化合物的工程化的途径可包括多个酶，并因此途径的通量对生产所关注的产物可能不是最佳的。因此，在本发明的某些方面，通过调节途径酶相对彼此的活性水平使通量达到最佳的平衡。此类调节的实例在整个申请中提供。

一方面，本发明提供了基因修饰的宿主细胞或微生物和使用相同的以生产所关注的有机化合物的方法。本文所用的宿主细胞是指在体内或体外真核细胞、原核细胞或细胞来自多细胞生物体(例如细胞系)作为单细胞实体培养的。宿主细胞可以是原核(例如，细菌如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(B.subtilis))或真核(例如，酵母、哺乳动物或昆虫细胞)。

例如，宿主细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、分枝杆菌(Mycobacterium spp.)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，或其它合适的细菌细胞)、古菌(例如，詹氏甲烷球菌(Methanococcus Jannaschii)或海沼甲烷球菌(Methanococcus Maripaludis)或其它合适的古菌细胞)、酵母细胞(例如，酵母(Saccharomyces)属如酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母(Picchia species)，念珠菌属如白色念珠菌(C.albicans)，或其它合适的酵母种)。

应当注意，在一些重组宿主中当需要具有抗菌活性的聚酮化合物时，可能还需要激活产生于合成后修饰的聚酮化合物。对于特定的宿主如果情况是这样，那么宿主将被修饰例如通过转化，以含有那些需要影响这些修饰的酶。在此类酶中例如有糖基化酶。

因此，为了产生例如本发明的聚酮化合物，修饰合适的宿主以含有载体和典型的质粒，其含有表达系统用于生产与PKS有关的一种或多种活性的蛋白。通过将各种活性置于不同的表达载体上可获得高度的变化。可以使用各种宿主，如天然存在的细胞、基因工程化的细胞如转基因细胞、合成细胞等。选择标记可被设计以确保并入多个载体的任何合适的宿主细胞可以容易地被使用。优选的宿主细胞包括酵母、大肠杆菌，和其他细菌如产醋酸菌(acetogens)和链霉菌属(Streptomyces)、真菌如脉孢菌属(Neurospora)和曲霉属、放线菌(actinomycetes)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)如产生正丁醇的丙酮丁醇梭状芽孢杆菌(C.acetobutylicum)、嗜热鬃毛甲烷菌(Methanosaetathermophila)、产生长链烯烃的藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)如产生正烷烃的M1菌株，和植物细胞，虽然没有理论原因为何哺乳动物或昆虫细胞或其它合适的重组宿主不能使用。酵母菌株中优选的是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母。优选的植物细胞是藻类细胞，如单细胞藻类形式、硅藻等。但是，可使用具有固有的所关注的PKS酶的其它类型和菌株，参见，例如，WO98/55625。因此，美国专利No.7,256,023公开了用多不饱和脂肪酸聚酮化合物合酶制备例如DHA和EPA、ω-3油，其被宣称具有健康益处。携带合酶的优选的宿主细胞是例如裂殖壶菌(Schizochytrium)，其为积累大量富含三酰甘油的DHA和二十二碳五烯酸的破囊壶菌(Thraustochytrid)海洋微生物。

植物细胞，在一些实施方案中单个细胞植物细胞，可用于实施本发明。例如，以下物种可用作所关注的载体系统的宿主：富油新绿藻(Neochlorisoleoabundans)，属于绿藻纲类(Chlorophyceae)的微藻；二形栅藻(Scenedesmusdimorphus)，绿藻纲类的单细胞藻类，优选地保持在恒定搅拌下；眼虫藻(Euglena gracilis)；三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)，硅藻；颗石藻(Pleurochrysis carterae)，能将亚细胞钙化的单细胞球石藻类，定鞭藻(Haptophyta)类普林藻纲的成员(Prymnesiophyceae)；小定鞭金藻(Prymnesiumparvum)；周氏扁藻(Tetraselmis chui)，一种海洋单细胞藻类；亚心形扁藻(Tetraselmis suecica)；球等鞭金藻(Isochrysis galbana)，微藻类；微拟球藻(Nannochloropsis salina)，也称微绿球藻(Nannochloris oculata)，与Nannochloris atomus Butcher、Nannochloris maculata Butcher、Nannochloropsisgaditana Lubian和Nannochloropsis oculata(Droop)属于同一组；布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)，绿藻；杜氏盐藻(Dunaliella tertiolecta)，一种具有高CO₂隔离率的快速生长的菌株等。

当然，宿主的选择指示了与表达系统以及选择标记有关的控制序列的选择。合适的启动子系统，例如用于大肠杆菌，包括色氨酸(trp)启动子、乳糖(lac)启动子、T7启动子和λ-衍生的P_L启动子和N-基因核糖体结合位点。对酵母而言，合适的控制序列包括合成糖酵解酶的启动子，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)。其它启动子包括那些用于醇脱氢酶(ADH-1和ADH-2)、异细胞色素-C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。还已知，编码序列的3’末端需要终止子序列。

发酵方法可用于在其碳利用途径或表达控制模式有差异的特定酵母菌株。例如，酵母属酵母的发酵可能需要单一葡萄糖进料、复合氮源(例如，酪蛋白水解物)和多种维生素补充。这与甲基营养型酵母毕赤酵母相反，其可能需要甘油、甲醇和痕量矿物进料，但仅简单的铵(氮)盐用于最佳生长和表达。参见，例如，Elliott等J.Protein Chem.(1990)9:95104，美国专利No.5,324,639和Fieschko等，Biotechnol.Bioeng.(1987)29:11131121。

在甲基营养酵母中有很多甲醇反应基因，每个基因表达由甲醇反应调节区域(也称为启动子)控制。任何此类甲醇反应启动子适合用于本发明的实施。特定的调节区域的实例包括巴斯德毕赤酵母AOX1一级醇氧化酶基因的启动子、巴斯德毕赤酵母AOX2二级醇氧化酶基因的启动子、巴斯德毕赤酵母(DAS)二羟丙酮合酶基因的启动子、巴斯德毕赤酵母P40基因的启动子、巴斯德毕赤酵母过氧化氢酶基因的启动子等。用于毕赤酵母的合适的培养基描述于美国专利No.5,231,178和No.5,324,639。

合适的宿主细胞的说明性实例包括任何古细菌、细菌，或真核细胞。古细菌细胞的实例包括但不限于属于属：气热菌属(Aeropyrum)、超嗜热古菌属(Archaeglobus)、盐杆菌属(Halobacterium)、产甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷细菌属(Methanobacterium)、火球菌属(Pyrococcus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)，和热原体属(Thermoplasma)的那些。古菌种的说明性实例包括但不限于：敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)、闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)、詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烧杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、深海热球菌(Pyrococcus abyssi)、超嗜热火球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、火山热原体(Thermoplasma volcanium)。

细菌细胞的实例包括但不限于属于下列属的那些：土壤杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)、鱼腥藻属(Anabaena)、组囊藻属(Anacystis)、节细菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、着色菌属(Chromatium)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、席藻属(Phormidium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红杆菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、栅藻属(Scenedesmun)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphlococcus)、链霉菌属(Strepromyces)、Synnecoccus和发酵单胞菌属(Zymomonas)。

细菌种的说明性实例包括但不限于：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacines)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、嗜氨短杆菌(Brevibacterium immariophilum)、拜氏梭菌(Clostridium beigerinckii)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、迈氏假单胞菌(Pseudomonas mevalonii)、Pseudomonas pudica、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。

厌氧菌可以是一种细菌菌株或含有两种或以上的产醋酸细菌的混合培养物，包括但不限于Acetobacterium kivui、伍氏醋酸杆菌(A.woodii)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、C.formoaceticum、克氏梭菌(C.kluyveri)、热醋酸梭菌(C.thermoaceticum)、热纤梭菌(C.thermocellum)、热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)、热解糖梭菌(C.thermosaccharolyticum)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus)和杨氏梭菌(C.ljungdahlii)及其混合物。

在一些实施方案中，厌氧细菌生物体被代谢工程化。如本文所用，厌氧生物体是生长不需要氧气(即厌氧条件下)的任何生物体。有利的是，所述细菌细胞可以是大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌(C.glutanicum)、黄色短杆菌(B.flavum)或乳酸发酵短杆菌(B.lactofermentum)细胞；这些菌株或目前被用在工业上使用细菌发酵工艺以制备氨基化合物。例如，谷氨酸棒杆菌已经广泛用于生产氨基酸(例如L-谷氨酸、L-赖氨酸，参见Eggleging L等，2005,Handbookfor Corynebacterium glutanicum.Boca Raton,USA:CRC Press)。

一般而言，如果使用细菌宿主细胞，非病原性菌株是优选的。非病原性菌株种的说明性实例包括但不限于：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌(Lactibacillus acidophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、迈氏假单胞菌(Pseudomonas mevalonii)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudita)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、荚膜红细菌(Rodobacter capsulatus)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)等。

真核细胞的实例包括但不限于真菌细胞。真菌细胞的实例包括但不限于属于属：曲霉属、念珠菌属(Candida)、金孢子菌属(Chrysosporium)、隐球酵母属(Cryotococcus)、镰刀菌属(Fusarium)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、内生真菌(Neotyphodium)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、木霉属(Trichoderma)和法夫酵母(Xanthophyllomyces)(原名Phaffia)的那些。

真核生物物种的说明性实例包括但不限于：构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、白色念珠菌(Candida albicans)、Chrysosporium lucknowense、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、镶片镰孢霉(Fusarium venenatum)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、库德毕赤酵母(Pichia kodamae)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、有抱毕赤酵母(Pichia opuntiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、栋毕赤酵母(Pichia quercuum)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)、金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、金色链霉菌(Streptomyces aureus)、贝酵母(Saccaromyces bayanus)、果酒酵母(Saccaromyces boulardi)、酿酒酵母、杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、橄榄灰链霉菌(Streptomyces olivogriseus)、枝链霉菌(Streptomyces rameus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、酒红链霉菌(Streptomyces vinaceus)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)(原名Phaffia rhodozyma)。

一般而言，如果使用真核细胞，非病原性菌株是优选的。非病原性菌株的说明性实例包括但不限于：禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、巴斯德毕赤酵母、果酒酵母(Saccaromyces boulardi)和酿酒酵母。

在一些实施方案中，生物体包括那些选自由金色藻类(如不等鞭毛类(Stramenopiles)领域的微生物)、绿藻、硅藻、甲藻(如甲藻目(order Dinophyceae)的微生物，包括隐甲藻属(genus Crypthecodinium)成员，诸如，例如，寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii))、酵母、毛霉(Mucor)属和被孢霉(Mortierella)属，包括但不限于和高山被孢霉(Mortierella alpina)和舒克里被孢霉(Mortierella sect.schmuckeri)组成的组。微生物群不等鞭毛类的成员包括微藻类和类藻微生物，包括下组的微生物：汉姆门(Hamatores)、普罗特蒙门(Proteromonads)、欧帕门(Opalines)、德维尔派门(Develpayella)、戴普罗弗门(Diplophrys)、拉普利门(Labrinthulids)、破囊壶菌门(Thraustochytrids)、拜尔瑟门(Biosecids)、水霉门(Oomycetes)、海植戴尔门(Hypochytridiomycetes)、康曼门(Commation)、瑞可罗门(Reticulosphaera)、普莱格门(Pelagomonas)、普莱格可门(Pelagococcus)、欧里可拉门(Ollicola)、奥瑞可门(Aureococcus)、小壳藻门(Parmales)、娃藻门(Diatoms)、黄藻门(Xanthophytes)、褐藻门(Phaeophytes)(褐藻)、黄绿藻门(Eustigmatophytes)、绿鞭藻门(Raphidophytes)、新纽门(Synurids)、爱科斯汀门(Axodines)(包括瑞佐克姆纲(Rhizochromulinaales)、金须藻纲(Pedinellales)、娃鞭藻纲(Dictyochales))、克里索达纲(Chrysomeridales)、萨西诺达纲(Sarcinochrysidales)、水树藻目(Hydrurales)、塾居金藻目(Hibberdiales)和色金藻目(Chromulinales)。破囊壶菌门(Thraustochytrids)包括裂殖壶菌属(Schizochytrium)(种包括黃金石斛(aggregatum)、黎姆萘瑟(Iimnaceum)、芒格(mangrovei)、迷你藻(minutum)、欧托(octosporum))、破囊壶菌属(Thraustochytrium)(种包括阿迪门多(arudimentale)、奥雷姆(aureum)、碧席考拉(benthicola)、格罗波(gobosum)、凯尼(kinnei)、摩迪(motivum)、茂迪待(multirudimentale)、派凯(pachydermum)、普罗弗(proliferum)、罗素(roseum)、斯托特(striatum))、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)(种包括埃摩拜迪(amoeboidea)、科格尼斯(kerguelensis)、米钮塔(minuta)、普罗弗达(profunda)、雷迪安(radiate)、塞仑(sailens)、赛卡瑞那(sarkariana)、斯佐凯(schizochytrops)、维格斯(visurgensis)、优克尼斯(yorkensis))、破囊壶菌属(Aplanochytrium)(种包括海罗迪(haliotidis)、科格仑斯(kerguelensisi)、普罗弗达(profunda)、斯托凯(stocchinoi))、日本壶菌属(Japonochytrium)(种包括麦尼(marinum))、阿尔托尼氏壶菌属(Althornia)(种包括克劳迪(crouchii))和埃氏壶菌属(Elina)(种包括玛瑞萨(marisalba)、欣诺瑞弗卡(sinorifica))。拉普利门(Labrinthulids)包括拉普利属(Labyrinthula)(种包括埃格瑞尼(algeriensis)、考诺赛斯(coenocystis)、查托尼(chattonii)、玛克赛斯(macrocystis)、大西洋玛克赛斯(macrocystis atlantica)、双重玛克赛斯(macrocystis macrocystis)、玛瑞那(marina)、迈纽塔(minuta)、罗斯科弗尼(roscoffensis)、凡卡诺维(valkanovii)，维丽那(vitellina)、太平洋维丽那(vitellinapacifica)、双重维那(vitellina vitellina)、佐普菲(zopfi))、拉普利索属(Labyrinthomyxa)(种包括玛瑞那(marina))、拉普利诺属(Labyrinthuloides)(种包括海罗迪(haliotidis)、优克尼斯(yorkensis))、戴普罗弗属(Diplophrys)(种包括阿凯瑞(archeri))、皮霍索属(Pyrrhosorus*)(种包括玛瑞纽斯(marinus))、索罗迪普罗属(Sorodiplophrys*)(种包括斯特考瑞(stercorea))、克莱米多属(Chlamydomyxa*)(种包括拉普利诺(Iabyrinthuloides)、蒙塔那(montana))。

合适的生物体可从许多来源获得，包括通过从自然环境收集。例如，美国典型培养物保藏中心目前列举了许多可公开获得的上述鉴定的微生物菌株。如本文所用，任何生物体，或任何特定类型的生物体，包括野生菌株、突变体或重组体类型。培养或生长这些生物体的生长条件是本领域已知的，并且这些生物体中至少一些的适当生长条件被公开在例如美国专利No.5,130,242、美国专利No.5,407,957、美国专利No.5,397,591、美国专利No.5,492,938、美国专利No.5,711,983和美国专利No.6,607,900中，所有这些专利通过引用整体并入本文。优选地，有效的培养基也能促进微生物快速生长。可将微生物培养在常规的发酵模式，其包括但不限于分批、补料分批和连续的。

在本发明进一步的实施方案中，转基因植物选自由谷类、大豆、油菜籽(包括油料种子，特别是卡诺拉(canola)油菜和冬油料种子油菜)、棉花、甘蔗和马铃薯，特别是玉米、大豆、油菜籽(包括油料种子，特别是卡诺拉油菜和冬油料种子油菜)、棉花、小麦和水稻组成的组。

在本发明的另一个实施方案中，转基因植物是裸子植物，特别是云杉、松树、冷杉。

在一个优选的实施方案中，宿主植物选自以下科的家族：槭树科(Aceraceae)、漆树科(Anacadiaceae)、伞形科(Apiaceae)、菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、掠桐科(Arecaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、莎草科(Cyperaceae)、莺尾科(Iridaceae)、百合科(Liliaceae)、兰科(Orchidaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、唇形科(Labiaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、毛直科(Ranunculaceae)、Carifolaceae、菌草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、寥科(Polygonaceae)、堇菜科(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或禾本科(Poaceae)，并优选选自以下科：槭树科、漆树科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科的植物。优选作物植物并且特别是本文中以上提到的植物作为宿主植物，如以上提到的科和属，例如优选的物种是腰果(Anacardium occidentale)、金盏花(Calendula officinalis)、红花(Carthamus tinctorius)、菊芋(Cichorium intybus)、洋蓟(Cynara scolymus)、向日葵(Helianthus annus)、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)、细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)；胡萝卜(Daucus carota)；欧洲榛(Corylusavellana)、土耳其榛(Corylus colurna)、琉璃苣(Borago officinalis)；欧洲油菜(Brassica napus)、芜青(Brassica rapa ssp.)、野欧白芥(Sinapis arvensis)、芥菜型油菜(Brassica juncea)、芥菜型油菜芥菜变种(Brassica juncea var.juncea)、芥菜型油菜皱叶变种(Brassica juncea var.crispifolia)、芥菜型油菜大叶变种(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥(Brassica nigra)、Brassica sinapioides、芥菜(Melanosinapis communis)、甘蓝(Brassica oleracea)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、凤梨(Anana comosus)、菠萝(Ananas ananas)、菠萝(Bromeliacomosa)、番木瓜(Carica papaya)、大麻(Cannabis sative)、甘薯(Ipomoeabatatus)、提琴叶牵牛花(Ipomoea pandurata)、旋花属(Convolvulus batatas)、空心菜黄槿(Convolvulus tiliaceus)、长鞭五爪属(Ipomoea fastigiata)、五爪椴树属(Ipomoea tiliacea)、三裂叶薯(Ipomoea triloba)、Convolvulus panduratus、甜菜(Beta vulgaris)、甜萝卜(Beta vulgaris var.altissima)、甜菜原变种(Betavulgaris var.vulgaris)、沿海甜菜(Beta maritima)、甜菜宿根变种(Beta vulgarisvar.perennis)、红甜菜(Beta vulgaris var.conditiva)、Beta vulgaris var.escnlenta、笋瓜(Cucurbita maxima)、灰籽南瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)、南瓜(Cucurbita moschata)、油橄榄(Olea europaea)、木薯(Manihot utilissima)、Janipha Manihot、麻疯树蜀葵(Jatropha manihot)、Manihot aipil、甜木薯(Manihot dulcis)、Manihot manihot、Manihot melanobasis、木薯(Manihotesculenta)、蓖麻(Ricinus communis)、豌豆(Pisum sativum)、饲料豌豆(Pisumarvense)、早生矮豌豆(Pisum humile)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜猜(Medicago varia)、大豆(Glycine max)、黄豆(Dolichos soja)、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、大显(Glycine hispida)、大菜豆(Phaseolus max)、大豆(Soja hispida)、大豆(Soja max)、椰子(Cocos nucifera)、荼麓子天竺葵(Pelargonium grossularioides)、Oleum cocoas、月桂(Laurusnobilis)、鱼辱梨(Persea americana)、花生(Arachis hypogaea)、亚麻(linumusitatissimum)、linum humile、奥地利亚麻(linum austriacum)、linum bienne、窄叶亚麻(linum angustifolium)、湾亚麻(linum catharticum)、金黄亚麻(linumflavum)、大花亚麻(linum grandiflorum)、Adenolinum grandiflorum、刘易斯亚麻(linum lewisii)、那旁亚麻(linum narbonense)、宿根亚麻(linum perenne)、刘易斯宿根亚麻(linum perenne var.lewisii)、linum pratense、linum trigynum、石榴(Punica granatum)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、树棉(Gossypiumarboreum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)、瑟伯氏棉(Gossypium thurberi)、香蕉(Musa nana)、小果野蕉(Musa acuminata)、大蕉(Musa paradisiaca)、色蕉(Musa spp·)、油棕(Elaeis guineensis)、东方罂粟(Papaver orientale)、虞美人(Papaver rhoeas)、长荚罂粟(Papaver dubium)、胡麻(Sesamum indicum)、树胡椒(Piper aduncum)、Piper amalago、狭叶胡椒(Piper angustifolium)、大胡椒(Piper auritum)、萎叶(Piper betel)、荜澄茄(Pipercubeba)、荜菝(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、假荜拔(Piper retrofractum)、Artanthe adunca、Artanthe elongata、长胡椒(Peperomia elongata)、Piperelongatum、Steffensia elongata、大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeumjubatum)、鼠大麦(Hordeum murinum)、漂麦状大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、三叉大麦(Hordeum aegiceras)、栽培六棱大麦(Hordeum hexastichon)、Hordeumhexasti chum、Hordeum irregulare、大麦(Hordeum sativum)、漂麦状大麦草(Hordeum secalinum)、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦原变种(Avena fatuavar.sativa)、杂种野燕麦(Avena hybrida)、双色高梁(Sorghum bicolor)、石茅高梁(Sorghum halepense)、甜高梁(Sorghum saccharatum)、高梁(Sorghumvulgare)、Andropogon drummondii、两色域毛草(Holcus bicolor)、蜀黍(Holcussorghum)、Sorghum aethiopicum、高粱茅(Sorghum arundinaceum)、卡佛尔高梁(Sorghum caffrorum)、垂穗高梁草(Sorghum cernuum)、甜高梁(Sorghumdochna)、Sorghum drummondii、硬高梁草(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、多脉高粱(Sorghum nervosum)、甜高粱(Sorghumsaccharatum)、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高梁(Sorghumvulgare)、石茅高梁(HoIcus halepensis)、黍(Sorghum miliaceum millet)、稷(Panicum militaceum)、玉米(Zea mays)、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticumvulgare)、咖啡(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffeacanephora)、大果咖啡(Coffea liberica)、辣椒(Capsicum annuum)、朝天椒(Capsicum annuum var.glabriusculum)、观赏辣椒(Capsicum frutescens)、甜椒(Capsicum annuum)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、茄子(Solanum melongena)、番茄(Lycopersicon esculentum)、番茄(Lycopersiconlycopersicum)、梨形番前(Lycopersicon pyriforme)、红前(Solanumintegrifolium)、番前(Solanum lycopersicum)、可可树(Theobroma cacao)或茶树(Camellia sinensis)。

漆树科诸如黄连木属(Pistacia)、杧果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)如阿月浑子(阿月浑子[阿月浑子，Pistazie])、杧果(Mangifer indica)[芒果]或鸡腰果(Anacardium occidentale)[腰果]的属和种；菊科诸如金盏花属(Calendula)、红花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、Locusta、万寿菊属(Tagetes)、缬草属(Valeriana)如金盏花(Calendula officinalis)[金盏花]、红花(Carthamus tinctorius)[红花]、矢车菊(Centaurea cyanus)[矢车菊]、菊苣(Cichorium intybus)[蓝雏菊]、洋蓟(Cynara scolymus)[朝鲜蓟]、Helianthusannus[向日葵]、莴苣(Lactuca sativa)、皱叶莴苣(Lactuca crispa)、芋(Lactucaesculenta)、Lactuca scariola L.ssp.Sativa、Lactuca scariola L.var.integrata、Lactuca scariola L.var.integrifolia、Lactuca sativa subsp.Romana、Locustacommunis、莴苣缬草(Valeriana locusta)[莴苣]、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)或细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)[金盏花]的属和种；伞形科(Apiaceae)诸如胡萝卜属(Daucus)如野胡萝卜(Daucus carota)[野胡萝卜]的属和种；桦木科(Betulaceae)诸如榛属(Corylus)如欧洲榛(Corylus avellana)或土耳其榛(Corylus colurna)[榛子]的属和种；紫草科(Boraginaceae)诸如琉璃苣属(Borago)如琉璃苣(Borago officinalis)[琉璃苣]；十字花科(Brassicaceae)诸如芸苔属(Brassica)、Melanosinapis、芥属(Sinapis)、拟南芥属(Arabadopsis)如芸苔(Brassica napus)、芜青属的某些种(Brassica rapa ssp.)[芸苔，油料种子芸苔(oilseed rape)、芜菁芸苔(turnip rape)]、野生欧白芥(Sinapis arvensis)、芥菜(Brassica juncea)、芥菜原变种(Brassica juncea var.juncea)、皱叶芥菜(Brassica juncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥(Brassica nigra)、Brassica sinapioides、Melanosinapis communis[芥末]、甘蓝(Brassica oleracea)[饲用甜菜]或拟南芥(Arabidopsis thaliana)的属和种；凤梨科(Bromeliaceae)诸如凤梨属(Anana)、菠萝属(Bromelia)如凤梨(Ananacomosus)、Ananas ananas或Bromelia comosa[菠萝]的属和种；番木瓜科(Caricaceae)诸如番木瓜属(Carica)如番木瓜(Carica papaya)[番木瓜]的属和种；大麻科(Cannabaceae)诸如大麻属(Cannabis)如大麻(Cannabis sative)[大麻]的属和种，旋花科(Convolvulaceae)诸如番薯属(Ipomea)、旋花属(Convolvulus)如番薯(Ipomoea batatus)、提琴叶牵牛花(Ipomoea pandurata)、番薯(Convolvulus batatas)、Convolvulus tiliaceus、Ipomoea fastigiata、Ipomoeatiliacea、三裂叶薯(Ipomoea triloba)或Convolvulus panduratus[红薯，Man of theEarth，野生马铃薯]的属和种，藜科(Chenopodiaceae)诸如甜菜属(Beta)即甜菜(Beta vulgaris)、Beta vulgaris var.altissima、甜菜原变种(Beta vulgaris var.Vulgaris)、沿海舌甘菜(Beta maritima)、甜菜宿根变种(Beta vulgaris var.perennis)、Beta vulgaris var.conditiva或Beta vulgaris var.esculenta[甜菜]的属和种；葫芦科(Cucurbitaceae)诸如南瓜属(Cucurbita)如笋瓜(Cucurbitamaxima)、灰子南瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)或南瓜(Cucurbita moschata)[南瓜，南瓜]的属和种；胡颓子科(Elaeagnaceae)诸如胡颓子属(Elaeagnus)如木犀榄(Olea europaea)[橄榄]的属和种；杜鹃花科(Ericaceae)诸如山月桂属(Kalmia)如阔叶山月桂(Kalmia latifolia)、狭叶山月桂(Kalmia angustifolia)、小叶山月桂(Kalmia microphylla)、沼泽山月桂(Kalmiapolifolia)、西洋山月桂(Kalmia occidentalis)、Cistus chamaerhodendros或山月桂(Kalmia lucida)[美国月桂、阔叶月桂、美国山桂(calico bush)、勺木、山月桂(sheep laurel)、高山月桂(alpine laurel)、沼泽月桂(bog laurel)、西部沼泽月桂(stern bog-laurel)、沼泽月桂(swamp-laurel)]的属和种；大戟科(Euphorbiaceae)诸如木薯属(Manihot)、Janipha、麻疯树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)如木薯(Manihot utilissima)、Janipha manihot、Jatropha manihot、Manihot aipil、甜木薯(Manihot dulcis)、Manihot manihot、Manihot melanobasis、木薯(Manihot esculenta)[木薯、葛、木薯淀粉、木薯(cassaya)]或蓖麻(Ricinuscommunis)[蓖麻子、蓖麻油灌木(Castor Oil Bush)、蓖麻油植物(Castor OilPlant)、蓖麻子(Palma Christi)、好奇树(Wonder Tree)]的属和种；豆科诸如豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、Inga、Pithecolobium、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、Medicajo、大豆属(Glycine)、镰扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、Soja如豌豆(Pisum sativum)、饲料豌豆(Pisum arvense)、Pisum humile[豌豆]、Albizia berteriana、合欢(Albiziajulibrissin)、阔荚合欢(Albizia lebbeck)、Acacia berteriana、Acacia littoralis、Albizia berteriana、Albizzia berteriana、Cathormion berteriana、Feuilleaberteriana、Inga fragrans、Pithecellobium berterianum、Pithecellobium fragrans、Pithecolobium berterianum、Pseudalbizzia berteriana、Acacia julibrissin、Acacianemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、Mimosa julibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrda julibrissin、阔荚合欢(Albizia lebbeck)、Acacia macrophylla、大叶合欢(Albizia lebbek)、Feuilleea lebbeck、大叶含羞草(Mimosa lebbeck)、Mimosaspeciosa[不纯洋苏木(bastard logwood)、合欢(silk tree)、东印度核桃]、紫苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(Medicago varia)[紫花苜蓿]、大豆(Glycine max)、镰扁豆(Dolichos soja)、宽叶蔓豆(Glycinegracilis)、大豆(Glycinehispida)、大菜豆(Phaseolus max)、Soja hispida或Sojamax[大豆]的属和种；牻牛儿苗科(Geraniaceae)诸如天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum如椰子(Cocos nucifera)、茶麋子天竺葵(Pelargoniumgrossularioides)或椰子油(Oleum cocois)[椰子]的属和种；禾本科(Gramineae)，例如甘蔗(Saccharum)属如甘蔗(Saccharum officinarum)的种属；胡桃科(Juglandaceae)例如核桃属(Juglans)、胡桃属(Wallia)例如核桃(Juglans regia)、日本核桃(Juglans ailanthifolia)、山核桃(Juglans sieboldiana)、灰胡桃(Juglanscinerea)、Wallia cinerea、Juglans bixbyi、加州黑核桃(Juglans californica)、印度黑核桃(Juglans hindsii)、Juglans intermedia、Juglans jamaicensis、大核桃(Juglans major)、小果核桃(Juglans microcarpa)、黑核桃(Juglans nigra)或黑胡桃(Wallia nigra)[胡桃(walnut)、黑胡桃(black walnut)、胡桃(common walnut)、波斯胡桃(persian walnut)、白胡桃(white walnut)、灰胡桃(butternut)、黑胡桃(black walnut)]的种属；樟科(Lauraceae)例如鳄梨(Persea)、月桂(Laurus)的种属，例如月桂属(species laurel)、月桂(Laurus nobilis)[月桂(bay)、月桂(laurel)、月桂(bay laurel)、甜月桂(sweet bay)]、鳄梨(Persea americana)、鳄梨(Perseaamericana)、鳄梨(Persea gratissima)或Persea persea[鳄梨]；豆科(Leguminosae)例如花生属(Arachis)例如落花生(Arachis hypogaea)[花生]的种属；亚麻科(Linaceae)例如亚麻属，Adenolinum例如亚麻(Linum usitatissimum)、Linum humile、奥地利亚麻(Linum austriacum)、Linum bienne、窄叶亚麻(Linumangustifolium)、泻亚麻(Linum catharticum)、金黄亚麻(Linum flavum)、大花亚麻(Linum grandiflorum)、Adenolinum grandiflorum、刘易斯亚麻(Linumlewisii)、那旁亚麻(Linum narbonense)、宿根亚麻(Linum perenne)、宿根亚麻刘易斯变种(Linum perenne var.lewisii)、Linum pratense或亚麻子(Linumtrigynum)[[亚麻(flax)、亚麻子(linseed)]的种属；Lythrarieae，例如石榴属(genera Punica)，如石榴(Punica grmatum)[石榴(pomegranate)]的种属；锦葵科(Malvaceae)，例如棉属(genera Gossypium)，如陆地棉(Gossypium hirsutum)、丰对棉(Gossypium arboreum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)或瑟伯棉(Gossypium thurberi)[棉]的种属；芭蕉科(Musaceae)，例如芭蕉属(Musa)，如香蕉(Musa nana)、小果野蕉(Musaacuminata)、大蕉(Musa paradisiaca)、芭蕉属(Musa spp.)的种属[香蕉]；柳叶菜科(Onagraceae)，例如Camissonia属、月见草属(Oenothera)，如月见草(Oenothera biennis)或夜来香(Camissonia brevipes)[樱草花(primrose)、月见草(evening primrose)]的种属；棕榈科(Palmae)，例如油棕属(Elacis)，如油棕(Elaeis guineensis)[油棕]的种属；罂粟科(Papaveraceae)，例如罂粟属(Papaver)，如东方罂粟(Papaver orientale)、虞美人(Papaver rhoeas)、长荚罂粟(Papaver dubium)[罂粟(poppy)、东方罂粟(oriental poppy)、玉米罂粟(cornpoppy)、野罂粟(field poppy)、雪莉罂粟(shirley poppies)、野罂粟(field poppy)、长荚罂粟(long-headed poppy)、长荚罂粟(long-pod poppy)]的种属；胡麻科(Pedaliaceae)，例如胡麻属(Sesamum)，如胡麻(Sesamum indicum)[胡麻]的种属；胡椒科(Piperaceae)，例如胡椒属(Piper)、Artanthe属、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia属，如树胡椒(Piper aduncum)、Piper amalago、狭叶胡椒(Piper angustifolium)、大胡椒(Piper auritum)、萎叶胡椒(Piper betel)、荜澄茄(Piper cubeba)、荜拔(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、假荜拔(Piperretrofractum)、Artanthe adunca、长胡椒(Artanthe elongata)、Peperomiaelongata、Piper elongatum、Steffensia elongata[辣椒(cayenne pepper)、花椒(wildpepper)]的种属；禾本科，例如大麦属(Hordeum)、黑麦属(kcale)、燕麦属(Avena)、高良属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍属(Pmicum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)，如大麦(Hordeumvulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、鼠大麦草(Hordeum murinum)、短芒大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、Hordeumaegiceras、六列大麦(Hordeum hexastichon)、六梭大麦(Hordeum hexastichum)、不规则大麦(Hordeum irregulare)、大麦(Hordeum sativum)、短芒大麦草(Hordeum secalinum)[大麦(barley)、珍珠麦(pearl barley)、狐尾大麦(foxtailbarley)、鼠大麦(wall barley)、草地大麦(meadow barley)])、黑麦(Secalecereale[黑麦])、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、地中海红燕麦(Avenabyzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida[燕麦])、二色高粱(Sorghum bicolor)、石茅高粱(Sorghum halepense)、甜高梁(Sorghumsaccharatum)、高梁(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、二色绒毛草(HoIcus bicolor)、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghumarundinaceum、卡佛尔高梁(Sorghum caffrorum)、垂穗高梁草(Sorghumcernuum)、工艺高梁(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高梁草(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、多脉高梁草(Sorghum nervosum)、甜高梁(Sorghum saccharatum)、Sorghum subglabrescens、垂叶高梁草(Sorghum verticilliflorum)、高粱(Sorghum vulgare)、石茅高梁(HoIcus halepensis)、Sorghum miliaceum、黍栗(Panicum militaceum[高粱(Sorghum)、黍(millet)])、稻(Oryza sativa)、阔叶稻(Oryza latifolia)[稻]、玉米(Zea mays[玉米(corn)、玉米(maize)])、小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或Triticum vulgare[小麦(wheat)、面包小麦(bread wheat)、普通小麦(common wheat)]的种属；山龙眼科(Proteaceae)，例如澳洲坚果属(Macadamia)，如全缘叶澳洲坚果(Macadamiaintergrifolia[夏威夷果(macadamia)])的种属；菌草科(Rubiaceae)，例如咖啡属(genera Coffea)，如咖啡属的某些种(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea canephora)或大果咖啡(Coffea liberica)[咖啡]的种属；玄参科(Scrophulariaceae)，例如毛蕊花属(Verbascum)，如毛瓣毛蕊花(Verbascumblattaria)、东方毛蕊花(Verbascum chaixii)、密叶毛蕊花(Verbascumdensiflorum)、Verbascum lagurus、长叶毛蕊花(Verbascum longifolium)、Verbascum lychnitis、Verbascum nigrum、奥林匹克毛蕊花(Verbascumolympicum)、Verbascum phlomoides、紫毛蕊花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum或毛蕊花(Verbascum thapsus)[毛蕊花(mullein)、white moth mullein、nettle-leaved mullein、密花毛蕊花(dense-flowered mullein)、silver mullein、长叶毛蕊花(long-leaved mullein)、白色毛蕊花(white mullein)、dark mullein、希腊毛蕊花(greek mullein)、橙色毛蕊花(orange mullein)、紫花毛蕊花(purple mullein)、hoary mullein、great mullein]的种属；茄科(Solanaceae)，例如辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)，如辣椒属(Capsicum annuum)、彩椒(Capsicum annuumvar.glabriusculum)、五色椒(Capsicum frutescens)[胡椒]、红椒(Capsicumannuum)[红辣椒(paprika]、烟草(Nicotiana tabacum)、花烟草(Nicotiana alata)、长头烟草(Nicotiana attenuata)、光烟草(Nicotiana glauca)、郎氏烟草(Nicotianalangsdorffii)、Nicotiana obtusifolia、Nicotiana quadrivalvis、Nicotiana repanda、黄花烟草(Nicotiana rustica)、林烟草(Nicotiana sylvestris)[烟草]、马铃薯(Solanum tuberosum)[土豆]、茄(Solanum melongena)[茄子]、普通番茄(Lycopersicon esculentum)、樱桃番茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanumlycopersicum)[西红柿]；梧桐科(Sterculiaceae)，例如可可树属(Theobroma)，如可可树(Theobroma cacao)[可可]的种属，或者山茶科(Theaceae)，例如山茶属(Camellia)，如大叶茶(Camellia sinensis)[茶]的种属。

真核或原核宿主细胞可以是或已被基因修饰的(也称为“重组宿主细胞”，“代谢工程化细胞”或“基因工程化细胞”)并作为核酸例如表达载体的受体，该载体包含编码一种或多种生物合成或工程化途径的基因产物的核苷酸序列。真核和原核宿主细胞也代表原始细胞的后代，该原始细胞已经被核酸基因工程化。在一些实施方案中，宿主细胞可被选择其代谢性质。例如，如果选择或筛选与特定代谢途径有关，使用具有相关途径的宿主细胞是有益的。此类宿主细胞可具有某些生理适应性，使得宿主细胞处理或导入或导出途径的一种或多种中间体或产物。然而，在其它实施方案中，可选择不表达与所关注的特殊途径有关的酶的宿主细胞以便能够鉴定那个途径所需的所有组分，使用合适的基因元件而不依赖于宿主细胞以提供一个或多个丢失的步骤。

通过用至少一个编码涉及工程化代谢途径的酶的核苷酸序列转化宿主细胞来制备本发明的代谢工程化细胞。如本文所用，术语“核苷酸序列”、“核酸序列”和“基因构建体”可互换使用，并意指RNA或DNA的聚合物，单链或双链，任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸序列可包含cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA的一个或多个片段。在一个优选的实施方案中，核苷酸序列进行密码子优化以反映宿主细胞典型的密码子使用而不改变由核苷酸序列编码的多肽。在某些实施方案中，术语“密码子优化”或“经密码子优化”是指修饰核酸序列的密码子含量而不改变由核酸编码的多肽序列以增强特定宿主细胞中的表达。在某些实施方案中，术语意欲涵盖修饰核酸序列的密码子含量作为平均值以控制多肽的表达水平(例如，增加或降低表达水平)。因此，本发明的各方面包括编码涉及工程化代谢途径的酶的核酸序列。在一些实施方案中，代谢工程化细胞可表达一种或多种具有执行下述步骤需要的酶活性的多肽。在一个实施方案中，核苷酸序列进行密码子优化以在酵母中表达。

例如，特定的细胞可包含一个、两个、三个、四个、五个或五个以上的核酸序列，每个核酸序列编码生产本文所述酚类化合物或酚类化合物中间体需要的多肽。可选地，单个核酸分子能编码一个或多于一个的多肽。例如，单个核酸分子可包含编码二、三、四或甚至五个不同的多肽的核酸序列。用于本文所述发明的核酸序列可获自多种来源，诸如，例如，cDNA序列扩增、DNA文库、从头合成、基因组部分的切除。获自此类来源的序列然后可用标准分子生物学和/或重组DNA技术来修饰以产生具有期望修饰的核酸序列。修饰核酸序列的示例性方法包括，例如，定点诱变、PCR诱变、缺失、插入、取代、用限制性内切酶替换部分序列，任选地与连接、同源重组、位点特异性重组或其各种组合结合。在其它实施方案中，核酸序列可以是合成的核酸序列。合成的多核苷酸序列可以用各种方法来产生，方法描述于美国专利No.7,323,320、待批的申请具有序列No.11/804,996，和美国专利公开No.1006/0160138和No.2007/0269870，其通过引用整体并入本文。

细菌、植物和动物细胞的转化方法是本领域熟知的。常见的细菌转化方法包括电穿孔和化学修饰。

在一些实施方案中，基因修饰的宿主细胞被基因修饰使得当体外培养在合适的培养基上时其产生至少约0.1g/L、至少约0.5g/L、至少约0.75g/L、至少1g/L、至少约1.5g/L、至少约2g/L、至少约2.5g/L、至少约3g/L、至少约3.5g/L、至少约4g/L、至少约4.5g/L、至少约5g/L、至少约5.5g/L、至少约6g/L、至少约7g/L、至少约8g/L、至少约9g/L或至少10g/L水平的所关注的产物或中间体。

应该理解，基因修饰的宿主细胞产生的所关注的产物或其代谢中间体的水平可以以各种方式控制。在一些实施方案中，通过编码一种或多种涉及工程化途径的酶的核酸序列的拷贝数量来控制表达水平(例如，高拷贝表达载体对中等或低拷贝表达载体)。优选地，核酸序列用载体导入细胞。低拷贝表达载体通常提供每个细胞少于20个载体的拷贝(例如，每细胞从1至约5，从5至约10，从10至约15，从15至约20个拷贝表达载体。原核细胞合适的低拷贝表达载体(例如大肠杆菌)，包括但不限于pAYC184、pBeloBac11、pBR332、pBAD33、pBBR1MCS及其衍生物、pSC101、SuperCos(粘粒)和pWE15(粘粒)。中等拷贝数量表达载体通常提供每个细胞从约20至约50个表达载体拷贝或每个细胞从约20至80个表达载体拷贝)。原核细胞合适的中等拷贝表达载体(例如大肠杆菌)，包括但不限于pTrc99A、pBAD24和含有ColE1复制起点的载体及其衍生物。高拷贝数量表达载体通常提供每个细胞从约80至约200或更多个表达载体拷贝。原核细胞合适的高拷贝表达载体(例如大肠杆菌)，包括但不限于pUC、PCV1、pBluescript、pGEM和pTZ载体。

另一方面，本发明提供包含编码涉及工程化途径多肽的核酸或其亚序列的表达盒。在一些实施方案中，表达盒可包含可操作地连接到转录元件(例如启动子)和终止子上的核酸。如本文所用，术语“盒”是指能表达特定基因的核苷酸序列，如果插入所述基因以便可操作地连接到存在于核苷酸序列的一个或多个调控序列。因此，例如，表达盒可包含期望的异源基因在宿主细胞中表达。在一些实施方案中，通过已知的重组技术一个或多个表达盒可引入载体。启动子是核苷酸序列，其通过RNA聚合酶启动并控制期望的核酸序列的转录。在一些实施方案中，启动子可以是诱导型的。在其它实施方案中，启动子可以是组成型的。用于原核宿主细胞的合适的启动子的非限制性实例包括细菌噬菌体T7RNA聚合酶启动子、trp启动子、lac操纵子的启动子等。用于原核细胞的合适的强启动子的非限制性实例包括lacUV5启动子、T5、T7、Trc、Tac等。用于真核细胞的合适的启动子的非限制性实例包括CMV立即早期启动子、SV40早期或晚期启动子、HSV胸苷激酶启动子等。终止控制区还可以来自优选宿主的天然的多种基因。

同时在本发明的另一方面，与丝状真菌，如黑曲霉，构巢曲霉(A.nidulans)或相关的真菌，如粗糙脉孢菌(N.crassa)有关的启动子区被鉴定和分离，在细胞外适当地以功能化关系与第二个不同的编码区结合，然后用适当的载体再引入宿主丝状真菌中。然后该宿主细胞在对导入的启动子区的控制下表达第二编码区蛋白。第二编码区对宿主物种可以是外源的，如PKS，在此情况下宿主将表达给定宿主不能天然表达的蛋白。可选地，第二编码区可以是对宿主天然的一个，在该情况下它与启动子区结合，该启动子区不同于与给定宿主天然相关的启动子区，以得到修饰的或提高的蛋白表达和活性。

本发明还提供将异源编码区与启动子一起引入到真菌以安排宿主真菌表达不同蛋白质的能力。本发明还提供调节天然存在其中的单个基因或引入其中的外源基因转录的能力，该引入通过与基因一起导入宿主启动子区。例如，与乙醇脱氢酶I.(alcA)基因和构巢曲霉醛脱氢酶(aldA)基因天然有关的启动子区通过乙醇、苏氨酸、或其它细胞外培养基的诱导物质进行调节。该作用依赖于称为alcR基因的完整性。当alcA或aldA启动子区与曲霉属等的不同结构基因有关时，根据本发明，可实现对通过乙醇或其它诱导剂的类似的不同基因表达的调节。

作为另一个实例，用淀粉和其它糖正诱导与黑曲霉葡糖淀粉酶基因天然相关的并用于本发明实施方案的启动子区。

总之，任何合适的微生物宿主细胞可被基因修饰以制备本发明主题的化合物。

用于哺乳动物细胞、放线菌、植物细胞、昆虫细胞等的合适的启动子也为本领域技术人员所熟知。因此，例如在单细胞植物环境中如藻类或培养的植物细胞，在一些实施方案中所关注的转基因可置于载体，该载体具有合适的调节和其它功能元件以确保构建体的稳定性和构建体的复制。该构建体元件可操作地连接以确保功能。短语“可操作地连接”意指连接构建体元件以确保功能，如转基因表达。使用本领域已知的如那些在Sambrook等中所述技术(1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Nolan，编，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)，可由已知获得的各种组分装配构建体。

如本领域已知的，可能有益的是包括被优化用于所关注的宿主的元件，如已知在植物细胞如在藻类细胞中操作。例如，可使用合适的植物启动子。许多此类植物启动子是已知的并包括组成型的、组织和时间特异性启动子。组成型启动子的实例包括但不限于章鱼碱合酶(Ellis等，1987，EMBO J.6,11-16)、胭脂氨酸合酶(Bevan等，NAR198325,11(2)：369-85)、甘露氨酸合酶(Langridge等，PNAS，1989,86,3219-3223)、来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的那些；CaMV35S(Odell等，Nature.1985,313(6005)：810-2)和CaMV19S(Lawton等，Plant Mol.Biol.9:315-324,1987)；水稻肌动蛋白(McElroy等，Plant Cell，2:163-171,1990)、玉米泛素(Christensen等，1992，Plant Mol Biol18:675-689)、向日葵泛素(Binet等，1991，Plant Science79，第87-94页)和植物组蛋白启动子(Brignon等，Plant J.1993,4(3)：445-457)。组织特异性启动子的实例包括种子特异性启动子，包括但不限于菜豆蛋白(phaseolin)启动子(Sengupta-Gopalan等，1985，Proc Natl Acad Sci USA85:3320-3324)、伴大豆球蛋白(conglycinin)启动子(Beachy等，1985,EMBO J.4:3407-3053)、conlinin启动子(Truksa等，2003，Plant Phys and Biochem41:141-147)、油质蛋白(oleosin)启动子(Plant等，1994，Plant Mol Biol25(2)：193-205)和向日葵蛋白(helianthinin)启动子(Nunberg等，1984，Plant Cell6:473-486)。所关注的其它启动子是种子特异性的欧洲油菜napin启动子(欧洲专利No.0255278)、脂肪酸延伸酶启动子(WO2/052024)、植物ACP基因启动子(美国专利No.5,420,034)、去饱和酶基因启动子(Thompson等，(Proc.Nat.Acad.Sci.(1991)88:2578-2582))、来自与植物合酶结构基因有关的Bce-4基因(美国专利No.5,530,194)或5’调节区。

也可使用如立即发现植物合酶结构基因的3’下游的转录终止区。与本文所述的其它真核生物体一样，本领域已知的内含子、剪接位点和其它元件可用于促进期望的性能。

所关注的基因可以各种方法引入到所关注的细胞。例如，转基因本身可以直接引入，如用涂覆有所关注的转基因的颗粒。可用细菌克隆载体。可选地，可用基于农杆菌的系统，参见，例如EP-B-0116718或EP-B-0120516。同样，如本领域已知，可使用钙、聚乙二醇或电穿孔、显微注射、用碳化硅纤维等的原生质体转化。

适用于细菌如大肠杆菌和放线菌的选择标记通常赋予抗生素抗性；那些用于酵母的通常补充营养需要。用于酵母的选择标记包括但不限于URA3、LEU2、LEU2-d、TRP1、LYS2、HIS1、HIS3。用于放线菌的选择标记包括但不限于对硫链丝菌肽、安普霉素、潮霉素和红霉素抗性的那些。

用于构建载体、转化宿主细胞和筛选成功的转化体的方法和材料为本领域所熟知。

因此，根据本发明的一个实施方案，单一宿主细胞将被修饰以包含一个或多个载体，每个载体部分促进最终产物的合成。在构建多个载体用于芳族化合物的生产中，该独立读码框可并到不同载体或，如果适当地被构建，部分阅读框可以分布在多个载体，每个具有适当的影响表达控制的序列，或可选地，它们可整合到染色体以促进最终产物的合成。事实上，编码某产物的酶的所有基因(即操纵子)可整合到工业生物体的基因组。另外，该操纵子可设计成“便携式”，使得在其它菌株和生物体中编码操纵子的DNA可被快速检测以用于期望产物工业规模的最佳生产。

可选地，使用二-和/或多顺反子信息构建体，两种或多种酶可由一个或多个质粒或染色体整合的DNA表达。在此类构建体中，开放阅读框可被内部核糖体进入位点(IRES)所隔离，使得信使RNA上的所有开放阅读框有效翻译。在酵母中，已描述酿酒酵母中有用的IRES序列，且这也被证实在甲基营养酵母毕赤酵母中可以有效地起作用。

(http://gra103.aca.ntu.edu.tw/gdoc/98/D92B47403a.pdf)。

在一个其它方面，本发明提供包含至少一个IRES的表达系统。在一个实施方案中，两个或多个下列的开放阅读框被一个或多个IRES隔开：i)至少一个编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)或苔色酸合酶(OSAS)的核苷酸序列；ii)至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列；和iii)至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列。

如本文所述，一个或多个或所有上述引入宿主的表达系统可整合到染色体或由酵母人工染色体(YAC)表达。

例如使用同源重组能实现整合。如上引用的PCT申请WO95/08548所述，如果使用同源重组，整合也可删除通常定位于染色体上的内源PKS活性。在这些实施方案中同样，潮霉素或硫链丝菌肽抗性的选择标记将包括在例如影响整合的载体中。

如上所述，影响PKS酶系统翻译后修饰的其它的酶可能需要通过合适的重组表达系统以引入到宿主。另外，可能需要例如通过脱羧、甲基化或糖基化转变聚酮化合物本身的酶。还必须修饰催化结构域以改变其底物特异性或用适当的特异性和催化活性取代结构域。例如，酵母中丙二酰CoA的水平可通过将表达系统合并到酵母宿主而增强，用于提高丙二酰-CoA的合成，如丙二酰CoA合酶或乙酰CoA羧化酶的基因过表达，如Wattanachaisaereekul等，Metab Eng10,246-54,2008所述。

在本发明的其它实施方案中，正常细胞代谢过程可被增强或删除以最大限度地生产甲酚、苔黑酚或甲酚-苔黑酚-醚产物。例如，为使碳通量远离乙醇生产并朝向期望的产物生产，通过基因操作可敲除在乙醇生产途径中一种或多种酶的表达或使活性降低。在一个具体的实施方案中，丙酮酸脱羧酶的活性可被完全敲除或通过基因缺失或破坏而降低。在另一个实施方案中，ADH1基因可被类似地修饰。

因此，本发明提供了增强宿主中来源于聚酮化合物的分子的产生机会，该宿主具有生产聚酮化合物的基本机器，但进一步指导分子的生产，该分子可直接用作特种化学前体、能源、或可被修改或转换为能源。通过提供引入的PKS元件以及修饰酶的活性，本发明还提供了更有效的方法来提供多种产物，以原位制备甚至更期望的产物。

在本发明的一个优选的实施方案中，PKS基因融合于一种或多种修饰酶基因的框内。例如，6-MSAS或缺失KR的6-MSAS/脱羧酶融合蛋白，其中两种酶是有活性的，通过糖酵解途径用于将糖直接转变成间甲酚或苔黑酚。可表达源自上述的三官能化酶复合物，其也含有融合基因编码的O-甲基转移酶，因此可采用糖通过丙酮酸直接到甲基苯甲醚或二甲氧基甲苯。

来源于石油的燃料，如汽油、航空汽油、煤油、喷气燃料等，是适用于燃烧设置的化合物的混合物。通常，此类类别涉及基于温度范围的原油分馏获得的化合物。因此，汽油通常含有在约150°的范围内获得的长度从C₅至C₁₂的碳氢化合物(HC)，煤油其包括喷气燃料，含有在约200℃范围内获得的长度从C₁₂至C₁₅的HC等。柴油燃料的密度为约0.85kg/l，比汽油的高约15%以上。柴油通常包含约75%的链和环状的链烷烃和25%的芳族化合物。通常，分子具有10到15个碳原子。生物柴油通常包含甲酯而不是烷烃和芳烃，因为很多是通过部分降解甘油三酯以生成脂肪酸和脂肪酸酯而得到。本发明的芳族化合物和环己烷衍生物可直接用作上述燃料的混合试剂，或可选地，可以是酯化反应和醚化反应中具有燃料特性需要的适当长度的烷基的起始原料。

在一些实施方案中，工程化代谢途径的第一种酶可以在第一启动子的控制下并且工程化途径的第二种酶可以在第二启动子的控制下，其中第一和第二启动子具有不同的强度。例如，第一启动子可强于第二启动子或第二启动子可强于第一启动子。因此，通过增加第一种酶的拷贝数和/或通过增加第一种酶可操作连接到的启动子强度相对于第二种酶可操作连接到的启动子强度，可增加工程化途径中第一种酶的水平相对于第二种酶的水平。在一些其它实施方案中，工程化途径的多个酶可在相同启动子的控制之下。

一方面，本发明提供了修饰的重组宿主细胞和生产甲基化的酚类化合物的方法，其中启动子用于控制细胞内一种酶促组分的表达。在制备甲基化的酚类化合物的过程中，酚类化合物的生物合成速率通常超过酚类化合物的甲基化速率。例如，本文所述的细胞和方法中间甲酚或苔黑酚的生物合成速率超过通过O-甲基转移酶的间甲酚或苔黑酚的甲基化速率。因此，过量的间甲酚或苔黑酚可引起细胞的毒性问题。在一个实施方案中，本发明提供了包含脱羧酶表达系统的修饰的重组宿主细胞，其中的脱羧酶的表达受到减少脱羧酶表达的启动子的控制。在一个实施方案中，启动子是Leu2d启动子。已知Leu2d是部分缺陷的。在另一个实施方案中，具有减少脱羧酶表达的启动子的宿主细胞能产生甲基化的酚类化合物，如3-甲基苯甲醚或3,5二甲氧基甲苯。在一个其它实施方案中，由于启动子使表达降低的脱羧酶是由棒曲霉的PatG基因表达的6-MSA脱羧酶。

在其它实施方案中，改变所述核糖体结合位点影响了途径中不同酶的相对翻译和表达。改变所述核糖体结合位点可单独用于控制途径中酶的相对表达，或者可与上述启动子修饰和密码子优化同时使用也影响基因表达水平。

在一个示例性的实施方案中，可能途径的酶表达可取决于反应混合物中途径酶将与其作用的底物的存在。例如，催化将A转化成B的酶的表达可诱导于培养基存在的A中。此类途径酶的表达可以通过添加引起诱导的化合物或在生物合成途径过程中天然累积的化合物进行诱导(例如，诱导剂可以是在生物合成过程中所产生的中间体以生成期望的产物)。

在一些实施方案中，计算机实现的设计技术可用于产生可供选择的途径以产生所关注的有机分子。在一些实施方案中，数据库包含基因组信息且其链接可用于设计新的代谢途径。数据库的实例是MetaCyc(代谢途径和酶数据库，University of Minnesota，生物催化/生物降解数据库(用于有机化学化合物的微生物催化反应和生物降解途径的数据库)、LGAND(复合数据库，该数据库提供关于代谢物和其它化学化合物的信息、表示代谢和其它反应的底物-产物关系和酶分子信息)。途径组分的数据库也可包含预测、假定或未知功能的组分。它还可以包含定义功能的伪组分，其可具有未定义的组合物。在一些实施方案中，程序可设计公共领域中调节和/或功能元件的组合(例如，未被专利权利所涵盖和/或不承受许可费)。可自由获取基因元件的数据库可产生和/或用作核酸序列的来源，其可组合以产生可供选择的途径。包含已知功能和/或调控元件不同组合的可供选择的途径(例如，来自不同物种)可被设计、装配和/或检测。包括酶促元件区变化的文库可用于确定不同类型酶的相对作用或相同酶的不同变体。包括调节元件区变化的文库可用于确定最优表达水平或一组基因的调节控制。

可装配编码不同途径的核酸。在一些实施方案中，不同工程化途径的功能化性质可通过用适当装配的核酸来转化宿主细胞或生物体以及分析工程化生物体的性质进行体内测试。在一些实施方案中，不同工程化途径的功能化性质可通过分离由装配的核酸的组分以及测试体外系统中组分表达的适当组合进行体外测试。

在本发明的一些实施方案中，可用酵母的单倍体酵母菌株。在其他实施方案中，二倍体菌株是优选的。它们可能是修饰的实验室菌株，或工业菌株，或修饰的工业菌株。酵母生长的可再生原料可来源于纯化的或部分纯化的糖，所述糖来自玉米、小麦、甘蔗、甜菜等，或来源于纤维素源，如木材、柳枝稷、竹子、麻风树等。它们也可来源于微藻、蓝细菌和能由二氧化碳和阳光产生糖的类似生物体。

化合物的生产

如下表1所例证，修饰的重组宿主细胞和本文描述的方法允许生产和分离的多个所关注的化合物。

表1

PKS-6-MSA(6-MSAS)的PKS

PKS*-6-MSA(6-MSAS)的具有失活KR结构域的修饰的PKS

1.6-MSA或OSA

一方面，本发明提供了修饰的重组细胞和生产6-甲基水杨酸(6-MSA)或苔色酸(OSA)的方法。在一个实施方案中，修饰的重组细胞包含第一表达系统至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)或苔色酸合酶(OSAS)的核苷酸序列。在另一个实施方案中，宿主细胞还包含第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列。在一个其它实施方案中，ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化(pantetheinylates)。在一个其它方面，宿主细胞表达6-MSA(6-MSAS)的芳族PKS。在一个实施方案中，芳族PKS是真菌的6-MSA(6-MSAS)合酶。在另一个实施方案中，芳族PKS是原核生物的6-MSA(6-MSAS)合酶。在一个其它实施方案中，原核生物6-MSAS的合酶由野生型形式的抗生链霉菌(S.antibioticus)的ChlB1基因编码。在一些实施方案中，芳香族PKS是OSAS的合酶。在一个实施方案中，OSAS由来自绿色产色链霉菌的AviM基因编码。

在另一个实施方案中，原核生物6-MSAS的合酶包含灭活的酮还原酶(KR)结构域，使得苔色酸(OSA)由该细胞产生。在优选的实施方案中，如本文所述6-MSA和OSA是中间体化合物，例如，酚或邻苯二甲酸酐中间体化合物。

一方面，本发明涵盖细菌迭代PKS的使用。在一个实施方案中，细菌迭代PKS选自由以下组成的组：抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)DQ116941ChLB1；密旋链霉菌(Streptomyces pactum)AB303063pctS；马杜拉放线菌(Actinomadura madurae)AY2716606-MSA；弗兰克氏菌(Frankiasp.)NC009921；砂嗜盐产孢菌(Salinispora arenicola)NC009953a；棘孢小单胞菌(Micromonospora echinospora)AF505622CalO5；绿色产色链霉菌AF333038AviM；砂嗜盐产孢菌NC009953b；制癌链霉菌(Streptomycescarcinostaticus)AY117439NcsB；红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)NC009142；和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)NC000962ppsA。

6-MSAS基因可获自任何天然来源，如真菌、细菌或植物，或可以是合成的、杂交的或修饰的衍生物，其可导致所表达的6-MSAS PKS的优化的生物合成特性。在一个实施方案中，所用的6-MSAS基因可来源于植物如窄叶细辛(yerba-santa)(Eriodyction pavonina)，Khaden S.和Marles,RJ.Molecules15;7985-8005(2010)。酶促活性的修饰和优化为本领域技术人员所熟知。

在另一个变体中，PKS系统指定部分的一个或多个表达系统整合到宿主染色体且至少一种其它的表达系统定位于可复制的载体。因此，在6-MSAS或OSAS的情况下，一个开放阅读框的表达系统可首先整合到染色体且其它开放阅读框的表达系统可以定位于载体。此类表达系统到染色体的整合可通过已知方法和装置发生。

在一个实施方案中，本发明提供修饰的重组宿主细胞，其包含6-MSAS(或OSAS)的第一表达系统和/或整合到宿主染色体的完整的ACP合酶的第二表达系统。在另一个实施方案中，修饰的宿主细胞包含整合到宿主染色体的6-MSAS(或OSAS)的第一表达系统和存在于细胞中可复制的载体上的完整的ACP合酶的第二表达系统。在一个实施方案中，修饰的宿主细胞包含存在于细胞中可复制的载体上的6-MSAS(或OSAS)的第一表达系统和整合到宿主染色体的完整的ACP合酶的第二表达系统。

另一方面，通过本文所述的修饰的重组宿主细胞和方法，6-MSA和OSA每个都能被生产和/或分离。一旦从所述细胞生产和分离，6-MSA和OSA可作为化合物中间体用于生产所关注的化合物(例如，间甲酚；3-甲基苯甲醚；3,5-二甲氧基甲苯；邻苯二甲酸酐等)。

2.间甲酚或苔黑酚

另一方面，本发明提供了修饰的重组细胞和用于生产间甲酚或苔黑酚的方法。在一个实施方案中，如在上面部分所述，修饰的重组宿主细胞包含第一和第二表达系统。在另一个实施方案中，细胞还包含第三表达系统，该系统包括至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供修饰的重组宿主细胞，其包含6-MSAS(或OSAS)的第一表达系统和/或整合到宿主染色体的完整的ACP合酶的第二表达系统。在另一个实施方案中，修饰的宿主细胞还包含用于脱羧酶的第三表达系统，其存在于细胞中可复制的载体上。在一个其它实施方案中，修饰的宿主细胞还包含用于脱羧酶的第三表达系统，其整合到宿主染色体中。在一个实施方案中，宿主细胞包含整合到宿主染色体的6-MSAS(或OSAS)、完整的ACP合酶和脱羧酶的至少一个表达系统以及至少一个存在于可复制的载体上的相同表达系统。在另一个实施方案中，宿主细胞包含整合到宿主染色体的6-MSAS(或OSAS)、完整的ACP合酶和脱羧酶的所有表达系统或所有存在于可复制的载体上的相同表达系统。

在一个实施方案中，脱羧酶核苷酸序列选自由以下组成的组：展青霉的6-MSA脱羧酶基因、棒曲霉的PatG基因或粉红粘帚霉的OSA脱羧酶基因、曲霉属物种的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶基因，和少动鞘氨醇单胞菌SYK-6的5-羧基香草醛脱羧酶基因。在另一个实施方案中，能产生并分离自宿主细胞的产品是间甲酚或苔黑酚。

在另一个具体的实施方案中，本发明涉及通过体内或离体脱羧反应修饰以产生间甲酚或苔黑酚的细胞。在前面的细胞系，6-MSA(HMBA)或苔色酸特异性的脱羧酶由相同细胞内的天然或修饰的脱羧酶基因表达。天然脱羧酶基因包括展青霉的6-MSA脱羧酶基因、棒曲霉的PatG基因，和粉红粘帚霉的苔色酸脱羧酶基因(Pettersson等，1965;Acta Chem.Scand.19:2013–2021)。还应当理解，编码与芳族羧酸紧密相关或甚至不太相关的具有底物特异性的产物酶的其它脱羧酶基因可以通过突变或选择育种进行修饰，以同样产生有效的脱羧基的酶。

另一方面，采用两种不同类型的修饰的重组宿主细胞以生产所关注的化合物。在一个实施方案中，本发明提供包含第一个PKS(6-MSAS或OSAS)表达系统和第二个完整的ACP合酶表达系统的第一细胞和包括第三脱羧酶表达系统的第二细胞。在另一个实施方案中，第一个PKS表达系统和/或第二个完整的ACP合酶表达系统被整合到第一细胞的染色体，或存在于第一细胞的可复制的载体上。在一个其它实施方案中，脱羧酶的第三表达系统被整合到第二细胞的染色体，或存在于第二细胞的可复制的载体上。

一方面，本发明提供了修饰的重组宿主细胞混合物以生产所关注的化合物。在一个实施方案中，混合物包含第一修饰的重组宿主细胞，其包含i)第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；和ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化；和第二修饰的重组宿主细胞，其包含iii)第三表达系统，该系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列。在另一个实施方案中，混合物是第一和第二修饰的重组宿主细胞共培养的混合物。在一个其它实施方案中，第一修饰的重组宿主细胞是酵母细胞。在另一个实施方案中，酵母细胞是酿酒酵母细胞。在一个其它实施方案中，第二修饰的重组宿主细胞是真菌细胞。在另一个实施方案中，真菌细胞是棒曲霉。在另外的实施方案中，本发明提供一种导致产生酚类化合物的共培养第一修饰的重组宿主细胞和第二修饰的重组宿主细胞的方法。在一个实施方案中，酚类化合物是间甲酚。此方法示例于实施例6。

3.3-甲基苯甲醚和3,5二甲氧基甲苯

一个其它方面，本发明提供了修饰的重组细胞和用于生产甲基化的酚类化合物的方法。在一个实施方案中，除了本文所述的第一(例如，PKS)、第二(例如，完整的ACP合酶)和第三(例如，脱羧酶)表达系统，所述方法和细胞包含第四或其它的异源O-甲基转移酶(OOMT)表达系统。使用OOMT表达系统的此类修饰的重组细胞和方法提供了3-甲基苯甲醚或3,5-二甲氧基甲苯的生产。

3-甲基苯甲醚 3,5-二甲氧基甲苯

在另一个实施方案中，其它的表达系统包含于载体、染色体或YACS，使得分离的产物是3-甲基苯甲醚或3,5-二甲氧基甲苯。在一个其它实施方案中，O-甲基转移酶选自月季品种和玫瑰杂交株的OOMT1、OOMT2、OOMT3、OOMT4、COMT1基因。

一方面，本发明提供了修饰的重组细胞和用于生产甲基化的酚类化合物，例如，3-甲基苯甲醚或3,5-二甲氧基甲苯的方法。在一个实施方案中，修饰的重组细胞包含第一表达系统至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)或苔色酸合酶(OSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列。在另一个实施方案中，宿主细胞还包含第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列。在一个其它实施方案中，ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化(pantetheinylates)。在另一个实施方案中，细胞还包含第三表达系统，该系统包括至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列。

在一个其它方面，宿主细胞表达6-MSA(6-MSAS)的芳族PKS。在一个实施方案中，芳族PKS是真菌的6-MSA(6-MSAS)合酶。在另一个实施方案中，芳族PKS是原核生物的6-MSA(6-MSAS)合酶。在一个其它实施方案中，原核生物6-MSAS的合酶由野生型形式的抗生链霉菌(S.antibioticus)的ChlB1基因编码。在一些实施方案中，芳香族PKS是OSAS的合酶。在一个实施方案中，OSAS由绿色产色链霉菌的AviM基因编码。在另一个实施方案中，原核生物6-MSAS的合酶包含灭活的酮还原酶(KR)结构域，使得苔色酸(OSA)由该细胞产生。

在优选的实施方案中，本文描述的宿主细胞和方法导致产生间甲酚作为3-甲基苯甲醚的酚类化合物中间体，或苔黑酚作为3,5-二甲氧基甲苯的酚类化合物中间体。在另一个实施方案中，该方法包括从宿主细胞中分离间甲酚或苔黑酚以及用甲基化试剂处理以形成3-甲基苯甲醚或3,5-二甲氧基甲苯。

另一方面，本发明提供了直接从宿主细胞中生产甲基化酚类化合物的修饰的重组宿主细胞和方法。在一个实施方案中，本发明提供了包含第一PKS表达系统、第二完整的ACP合酶表达系统和第三脱羧酶表达系统的细胞，其进一步包含甲基转移酶表达系统。在进一步的实施方案中，包括进一步的表达系统，该系统包含编码至少一个O-甲基转移酶基因的核苷酸序列，该基因可操作地连接到所述细胞中可操作的启动子上，允许芳族聚酮化合物产物甲基醚的产生和分离。修饰以增强催化活性或更严格的底物特异性的O-甲基转移酶基因及其后代可以获自多个来源。例如，在一个优选的实施方案中，玫瑰花瓣的苔黑酚O-甲基转移酶OOMT1被用于转化。O-甲基转移酶DNA序列可获自以下来源，但并非只限于这些来源：月季、玫瑰(R.rugosa)、R.majalis、R.beggeriana、香水月季(R.odorata)、狗牙蔷薇(R.canina)、洋蔷薇(R.gallica)、r.woodsii、R.marettii、十六夜蔷薇(R.roxburghii)、葡萄(Vitisvinifera)、啤酒花(Humulus lupulus)、杏仁(Prunus dulcis)和山杏(Prunusarmeniaca)。

在一个实施方案中，本发明提供修饰的重组宿主细胞，其包含能被表达的6-MSAS或OSAS的第一表达系统，和/或整合到宿主染色体的完整的ACP合酶的第二表达系统。在另一个实施方案中，修饰的宿主细胞还包含脱羧酶的第三表达系统，和/或存在于细胞内的可复制载体上的OOMT。在一个其它实施方案中，修饰的宿主细胞还包含脱羧酶的第三表达系统，和/或整合到宿主染色体的OOMT。在一个实施方案中，宿主细胞包含整合到宿主染色体的6-MSAS(或OSAS)、完整的ACP合酶、脱羧酶和OOMT的至少一个表达系统以及至少一个存在于可复制载体上的相同表达系统。在另一个实施方案中，宿主细胞包含整合到宿主染色体的6-MSAS(或OSAS)、完整的ACP合酶、脱羧酶和OOMT的所有表达系统或所有存在于可复制载体上的相同表达系统。

在进一步的实施方案中，在O-甲基转移酶反应中，编码各种亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)或MTHFR融合蛋白的基因的过表达可被用于保持可用的底物S-腺苷甲硫氨酸的高供应，如Roje等，J.Biol.Chem277;4056-4061(2002)所述。在一个实施方案中，修饰的重组宿主细胞及其使用方法可采用包含至少一个编码MTHFR的核苷酸序列的第五表达系统，使得S-腺苷甲硫氨酸在细胞中产生。在另一个实施方案中，修饰的重组宿主细胞包含第一PKS表达系统、第二完整的ACP合酶表达系统、第三脱羧酶表达系统、第四OOMT表达系统，其还包括一个亚甲基四氢叶酸还原酶的表达系统。

另一方面，本发明提供从宿主细胞中生产和分离酚类化合物中间体的方法。在一个实施方案中，所述方法包含提供修饰的重组宿主细胞，其包含i)第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化；和iii)第三表达系统，该系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述方法还包括分离重组宿主细胞中产生的酚类化合物中间体的步骤。在一个其它实施方案中，该方法进一步包括通过用烷基化试剂进行处理，使分离步骤中获得的酚类化合物中间体烷基化以形成烷基化的酚化合物。烷基化试剂包括任何能将底物添加烷基基团的试剂，包括促进氢原子被烷基基团取代的试剂。在一些实施方案中，烷基化试剂选自由乙醇、甲醇、异丙醇、丁醇等组成的组。另一方面，本方法包括用烷基化试剂处理分离自细胞的化合物中间体以给化合物中间体提供下列烷基之一：乙基、甲基、异丙基、叔丁基等。

在一个实施方案中，酚类化合物中间体是间甲酚，其然后用烷基化试剂处理以产生烷基化的酚类化合物。在一个实施方案中，烷基化剂是乙醇以产生3-乙基苯甲醚；甲醇以产生3-甲基苯甲醚；异丙醇以产生3-异丙基苯甲醚；或叔丁醇以产生3-丁基苯甲醚。在一个实施方案中，烷基化试剂是选自甲醇、甲基碘、碳酸二甲酯的甲基化试剂。在另一个实施方案中，甲基化是O-甲基化。

在一个实施方案中，酚类化合物中间体是苔黑酚，其然后用烷基化试剂处理以产生烷基化的酚类化合物。在一个实施方案中，烷基化试剂是乙醇以产生3,5-二乙氧基甲苯；甲醇以产生3,5-二甲氧基甲苯；异丙醇以产生3,5-二异丙氧基甲苯；或叔丁醇以产生3,5-丁氧基甲苯。在一个实施方案中，烷基化试剂是选自甲醇和碳酸二甲酯的甲基化试剂。在另一个实施方案中，甲基化是O-甲基化。

4.邻苯二甲酸酐

一方面，本发明提供了修饰的重组细胞和生产邻苯二甲酸酐化合物的方法。在一个实施方案中，化合物是3-羟基邻苯二甲酸酐。

在一个实施方案中，修饰的重组细胞包含第一表达系统的至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列。在另一个实施方案中，宿主细胞还包含第二表达系统的至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列。在一个其它实施方案中，ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化(pantetheinylates)。如本文所述，PKS和ACP组分可发生变化。

另一方面，本发明提供生产邻苯二甲酸酐化合物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括提供修饰的重组宿主细胞，其包含i)第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；和ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化。在另一个实施方案中，该方法进一步包括分离产生于重组宿主细胞的邻苯二甲酸酐中间体化合物的步骤。在一个其它实施方案中，该方法进一步包括通过用氧化剂处理，使获自分离步骤的邻苯二甲酸酐中间体化合物氧化以形成邻苯二甲酸酐化合物。氧化剂包括任何能促进去除的试剂。在一些实施方案中，氧化剂是空气，包括环境空气。本领域的普通技术人员能理解适用于本发明的其它氧化剂。在一个实施方案中，邻苯二甲酸酐中间体化合物是6-MSA。

4.表达系统

本发明采用的表达系统用于涉及芳族PKS系统的催化活性，以生产特种化学品甲酚、苯甲醚、甲苯、环己烷、环己醇和其它六元环化合物家族。这些是基于石油的燃料相容性分子，如3-甲基苯甲醚(参见，例如美国专利号4,407,661)或3-乙氧基甲苯、3-异丙氧基甲苯或用甘油醚化的间甲酚，和相应的二烷基化的苔黑酚衍生物。产生的蛋白质可包含天然氨基酸序列，因此只要期望的催化活性保持不变，可使用这些蛋白质的天然形式或改变形式的底物特异性和活性。然而这种活性的特异性和效率可不同于天然形式。然而存在于天然系统的某些活性，可以有意地删除或灭活，如通过使6-MSAS基因的酮还原酶(KR)结构域失活以产生具有OSAS活性的酶(参见，例如Ding等，Chem Biol17:495-503,2010)。此外，各种芳族系统的组分以及模块化系统的各种模块组分可被混合和匹配。通过引用并入本文的PCT申请WO95/08548，描述了杂交的芳族PKS系统的构建，其中例如放线菌紫素的开放阅读框被包含在其它芳族系统的开放阅读框的表达载体中。

PKS蛋白质的表达系统单独不足以用于实际生产聚酮化合物，除非重组宿主也包含影响酰基载体蛋白泛酸巯基乙胺基化的完整的ACP合酶活性。这种活化步骤对ACP能“拾取”2-碳单元是必需的，所述2-碳单元在一系列的克莱森(Claisen)缩合中是起始单元或生长的聚酮化合物链以导致最终的聚酮化合物。对缺少泛酸巯基乙胺基化的酶而表现为完整的ACP合酶的宿主，本发明提供通过提供此酶适当的表达系统而赋予此活性的方法。完整的ACP合酶的表达系统可提供在从携带PKS单元分离的载体上，或可提供在相同载体上，或可整合到宿主染色体中，或可作为具有全部或部分聚酮化合物合酶的融合蛋白的表达系统而提供。一般而言，与脂肪酸合成有关的完整的ACP合酶是不适合的；而特异性地与聚酮化合物合成或与非核糖体蛋白合成有关的合酶在这方面是有用的。然而，与脂肪酸合成有关的某些完整的ACP合酶，例如构巢曲霉的npgA蛋白，已示出在异源宿主如酵母的聚酮化合物的生物合成中起作用(Wattanachaisaereekul等，Biotech Bioeng97:893-900,2007)。

具体而言，模块化PKS系统未被来源于某些宿主细胞如大肠杆菌内源性的泛酸巯基乙胺基化酶泛酸巯基乙胺基化；然而，来源于芽孢杆菌属特别是短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)的短杆菌肽的完整的ACP合酶、与枯草芽孢杆菌的表面活性肽相关的完整的ACP合酶，和与构巢曲霉脂肪酸合成相关的npgA PPT酶蛋白可利用模块化PKS ACP结构域作为底物。类似地，npgA已示出还能激活迭代芳族PKS6-MSAS。尽管包括适合的完整的ACP合酶的表达系统对编码模块化PKS或酵母或其他真核生物的基因表达是非必需的，如果聚酮化合物及其衍生物通过表达的酶来生产，则可能需要包括此类表达系统。

另一方面，宿主细胞中的表达系统可提供在一个或多个载体上。在一个实施方案中，PKS的第一表达系统和完整的ACP合酶的第二表达系统，存在于相同的载体，存在于独立的载体，或表达自双顺反子信使RNA。在另一个实施方案中，功能化脱羧酶的第三表达系统存在于与PKS和/或完整的ACP合酶相同的载体上，或存在于独立的载体上。在一个其它实施方案中，PKS的第一表达系统和完整的ACP合酶的第二表达系统和功能化脱羧酶的第三表达系统存在于相同载体上。在一些实施方案中，一个或多个(或全部)第一、第二和第三表达系统整合到宿主细胞染色体或表达自酵母人工染色体(YAC)。在一个其它实施方案中，其中至少两个(或全部)的表达的PKS、完整的ACP合酶和脱羧酶来源于多顺反子信使RNA。

因此，一方面，本发明涉及重组宿主细胞，其中宿主细胞经修饰而含有至少两个载体，包含第一选择标记和第一表达系统的第一载体以及包含第二选择标记和第二表达系统的第二载体，和任选地其它含有其它选择标记和表达系统的载体，其中包含在载体上的所述表达系统编码并能产生至少最小PKS系统。如果最小PKS系统是芳族系统，该最小系统将包含酮基合酶/酰基转移酶(KS/AT)催化区、催化区和酰基载体蛋白(ACP)活性。在一个实施方案中，宿主细胞选自由细菌、酵母、丝状真菌、植物、藻类、或微藻宿主细胞组成的组。

在本发明的这方面的一个具体实施方案中，重组宿主细胞经修饰以包含：(a)第一载体，其包含第一选择标记和包含编码6-甲基水杨酸合酶(6-MSAS)基因或苔色酸合酶(OSAS)基因的核苷酸序列的表达系统；和(b)第二载体，其包含第二选择标记和包含编码完整的ACP合酶的核苷酸序列的表达系统；和(c)第三载体，其包含第三选择标记和包含编码脱羧酶活性的核苷酸序列的表达系统，该序列可操作地连接到所述细胞中可操作的启动子上。可选地，可结合至少两个载体以使宿主细胞只包含两个载体或者甚至一个载体；包含两个表达系统的载体可将其维持为独立的表达系统，或两个或三个开放阅读框可置于单个启动子的控制下，其中二-或三顺反子信息被转录用于翻译成所设计的酶促途径。在其它实施方案中，工程化酶促途径的每个或所有部分的表达系统可被整合到宿主细胞染色体。例如，当整合到酿酒酵母基因组时，完整的ACP合酶基因、构巢曲霉的npgA有效地发挥作用(Ma等，Science326:589-592(2009)。

在一个其它方面，修饰的重组宿主细胞包含至少一个表达系统，该系统包括一个或多个下列：i)至少一个编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)或苔色酸合酶(OSAS)的核苷酸序列；ii)至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列；和iii)和至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列。

在一个实施方案中，宿主细胞包含第一种表达系统，该系统包括至少一个编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)或苔色酸合酶(OSAS)的核苷酸序列；和至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列。在另一个实施方案中，宿主细胞还包含第二表达系统，该系统包括至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供表达6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)或苔色酸合酶(OSAS)融合蛋白的宿主细胞；完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶；和脱羧酶。此类“三体融合蛋白”可用本文所述的方法来表达。

5.宿主细胞

一方面，本发明提供了修饰的重组宿主细胞以生产聚酮化合物，其提供优于现有技术的优点。美国专利No.6,033,833公开了使用编码PKS(模块化或真菌)和完整的ACP合酶融合蛋白的核苷酸序列的修饰的重组宿主细胞。美国专利No.6,258,566公开了使用模块化或真菌PKS的修饰的重组宿主细胞。美国专利No.7,078,233公开了使用模块化或真菌PKS和与脂肪酸合成无关的ACP合酶的修饰的重组宿主细胞。在一个实施方案中，本发明提供了不包括编码PKS和完整的ACP合酶融合蛋白的核苷酸序列的重组宿主细胞。在另一个实施方案中，PKS不是真菌PKS或模块化PKS。在另一个实施方案中，PKS是芳族PKS。在一个其它实施方案中，ACP合酶与脂肪酸合成有关。

在一个其它实施方案中，宿主细胞选自由细菌、酵母、丝状真菌、植物、藻类、或微藻宿主细胞组成的组。一方面，本发明提供多种宿主细胞或生物体，其可被修饰以产生本发明涵盖的产物。在一个实施方案中，宿主细胞或生物体巴斯德毕赤酵母。

在另一个实施方案中，宿主细胞或生物体是曲霉种和黑曲霉。本领域的普通技术人员将理解适用于本发明的其它真菌物种。在一个实施方案中，修饰的宿主细胞不包含完整的ACP合酶的异源表达系统。

6.生产方法

一方面，本发明提供在异源微生物中生产间甲酚或苔黑酚的方法。在一个实施方案中，该方法包括使用碳通量的底物。在另一个实施方案中，碳通量的底物选自由纯化或部分纯化的葡萄糖或右旋糖、玉米糖、甘蔗、纤维素糖，如那些来自木材、竹子、柳枝稷或麻疯树组成的组。本领域的普通技术人员将理解适用于本发明的其它碳源。在另一个实施方案中，所述微生物是巴斯德毕赤酵母。

又一方面，本发明涉及在宿主中获得超生理水平的芳族化合物合成的方法。通过在独立的载体上、在多载体系统的一个载体上(或表达PKS的单一载体)，或作为PKS或其部分的融合蛋白，提供兼容的完整的ACP合酶的表达系统，宿主如大肠杆菌、酵母、丝状真菌、藻类和其它微生物系统可被处理以得到宿主内相关基因或其它基因复制方法拷贝数的基本增加，或者通过正调节，如使用诱导型启动子、增强子等，获得转录和/或翻译等的增强，聚酮化合物、甲酚、苔黑酚和其甲基醚水平的增强可在方便的宿主中进行以适于选择和规模生产。

一方面，本发明提供了修饰的重组细胞和获得高产率的所关注的化合物包括所关注的化合物中间体的方法，如本文所述。在一个实施方案中，所述方法包括提供修饰的重组酵母细胞，其包含i)第一表达系统，该系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；和ii)第二表达系统，该系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化。在另一个实施方案中，本方法还包括在重组修饰的酵母细胞中生产苯酚化合物中间体。在一个实施方案中，酚类化合物中间体是6-MSA。

使用PKS，例如6-MSAS，在微生物宿主细胞中生产化合物已经导致了葡萄糖转化的有限产量和有限效率。例如，Kealey等报道利用酵母宿主细胞表达6-MSAS时产量为1.7g/L6-MSA(PNAS USA，第95卷，第505-509页，January1998)，而Xie等报道，在酵母宿主细胞中表达6-MSAS时葡萄糖转化率为6%(Biotechnology and Bioengineering，第93卷，第4期，2006年3月5日)。在一个优选的实施方案中，生产步骤提供了在表达PKS的宿主细胞中6-MSA的产率大于3g/L(参见实施例1)。在一个其它的实施方案中，大于3g/L6-MSA的生产步骤包括使用40g/L葡萄糖用于细胞生长。在另一个实施方案中，本文描述的方法提供了在摩尔基础上以从葡萄糖中大于60%的转化对6-MSA进行分离(参见实施例1)。在一个实施方案中，具有60%转化的生产步骤包含使用5g/L葡萄糖用于细胞生长。

根据本文所述方法，途径开发的反应混合物可在允许细胞生长和/或孵育的任何容器中进行。例如，反应混合物可以是生物反应器、细胞培养瓶或板、多孔板(例如96、384、1056孔微量滴定板等)、培养瓶、发酵罐、或用于细胞生长或孵育的其它容器。

通过检测选择标记的表达可进行筛选，其在某些基因情况下允许细胞表达标记以存活而其它细胞死亡(或反之亦然)。使用本文描述的方法，需要有效的筛选技术以提供新途径的有效开发。优选地，酶促途径产生的化合物的合适的筛选技术允许快速和灵敏的筛选所关注的性质。视觉(量热)测定在这方面是最佳的，并易于应用于具有合适的光吸收性质的化合物。更复杂的筛选技术包括，例如，高通量HPLC-MS分析、SPME(固相微萃取)和GC-MS(气相色谱-质谱)(参见Handbook of analytical derivatization reaction,D.R.Knapp;John Wiley&Sons,1979)。在一些情况下，筛选机器人被连接到HPLC-MS系统用于自动注射和快速的样品分析。这些技术允许进行高通量检测和几乎任何期望的化合物的定量。

采用本领域已知的方法，可从发酵培养基或细胞提取物中分离生物生产的所关注的产物。例如，固体或细胞碎片可以通过离心或过滤除去。所关注的生物产物可以通过蒸馏、液-液萃取、膜蒸发、吸附，或使用本领域已知的任何方法进行分离。

在一些实施方案中，用HPLC可进行所关注的产物的鉴定。例如，用已知量的培养基中的有机产物制备标准样品(如6-MSA、OSA、间甲酚或苔黑酚)。产生的化合物或化合物中间体的保留时间然后可与可信标准进行对比。在一些实施方案中，用GC-MS可进行所关注的产物的鉴定。然后通过质量选择检测器对溶解的样品进行分析，并与先前的质谱和可信标准的保留时间进行对比。

除非另有说明，本发明的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA，和免疫学、工程学、机器人学、光学装置、计算机软件和集成的常规技术。该技术和程序通常根据本领域常规方法和各种一般参考文献来进行，其在本领域的技术范围内。此类技术在文献中被充分解释。参见，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual,增刊第2版，Sambrook,Fritsch和Maniatis编(Cold Spring Harbor LaboratoryPress:1989);DNA Cloning,Volumes I and II(D.N.Glover编，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Mullis等，美国专利No.4,683,195;Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编。1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins编。1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987);ImmobilizedCells And Enzymes(IRL Press,1986);B.Perbal,A Practical Guide To MolecularCloning(1984)；论著Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.);GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，ColdSpring Harbor Laboratory);Methods In Enzymology,第154和155卷(Wu等编)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编，Academic Press,London,1987);Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986)；Manipulating the MouseEmbryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986);Lakowicz,J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy,New York:Plenum Press(1983)，和Lakowicz,J.R.Emerging Applications of Fluorescence Spectroscopyto Cellular Imaging:Lifetime Imaging,Metal-ligand Probes,Multi-photonExcitation and Light Quenching,Scanning Microsc.增刊第10卷(1996)第213-24页，对于于荧光技术，Optics Guide5Melles Griot.TM.Irvine Calif.对于一般的光学方法，Optical Waveguide Theory,Snyder&Love，Chapman&Hall出版，和Peter Cheo的Fiber Optics Devices and Systems，由Prentice-Hall出版用于光纤理论和材料。

本文说明性描述的发明可以适当地在缺少本文未明确公开的任何元件或许多元件、限定或许多限定的情况下实施。因此，例如，在本文每种情况下，任一术语“包含”，“主要由…组成”和“由…组成”可由其它两个术语进行替代。因此，对于使用一个所述术语的本发明的实施方案而言，本发明也包括另一个实施方案，其中这些术语的一个被这些术语的另一个替代。在每个实施方案中，所述术语具有其建立的含义。因此，例如，一个实施方案可涵盖“包含”许多组分的宿主细胞，另一实施方案将涵盖“主要由相同组分组成”的宿主细胞，且第三个实施方案将涵盖“由相同组分组成”的宿主细胞。已采用的术语和表达用作描述而非限制的术语，并且不旨在使用此类排除任何所示和描述的特征的等同物或其部分的术语和表达，但是可认识到，各种修饰可能在本发明要求保护的范围内。因此应当理解，尽管本发明已经通过优选的实施方案和任选的特征具体公开，但此公开的修饰和概念的变化可以由本领域技术人员所采用，并且此类修饰和变化被认为属于本发明由所附权利要求所定义的范围内。

前述书面描述被认为足以使本领域的技术人员能够实施本发明。提供下列实施例仅用于说明性目的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。因此，除了本文显示和描述的那些修饰外，本发明的各种修饰对于本领域技术人员来说是很显然的，来自前面描述并落在所附权利要求的范围内。

实施例

实施例1-6-MSAS和OSAS在酿酒酵母中的表达

聚酮化合物产物到间甲酚和苔黑酚的转化。酿酒酵母ADH2启动子被化学合成并融合到来自抗生链霉菌的细菌6-MSAS基因ChlB1或来自绿色产色链霉菌的OSAS、AviM基因的合成基因中。酿酒酵母的终止子序列也被融合到所述基因序列，之后立即到每个分别的PKS基因的终止密码子。将表达盒克隆到含有URA3选择标记的酵母表达载体。类似地，将编码构巢曲霉npgA蛋白的基因克隆到含有选择标记的酵母表达载体，以在色氨酸缺陷型的培养基中生长。

感受态酿酒酵母InvSc1(MATa his3D1leu2trp1-289ura3-52)(Invitrogen)依次用表达载体转化，然后涂铺在基本琼脂平板(1.7g/L无氨基酸或硫酸铵的酵母含氮碱基(DIFCO)、5g/L(NH₄)₂SO₄、20g/L葡萄糖、20g/L琼脂，其包含基于尿嘧啶和色氨酸原养型选择的氨基酸。挑出转化体并在尿嘧啶和色氨酸缺陷型的基本培养基上生长24小时。从转化体中分离质粒DNA并用限制性消化分析以确定同一性。

将成功的转化体接种到2mL尿嘧啶缺陷型基本培养基中并在30℃在轨道式振荡器中生长过夜。将此培养物的500μL等份用于接种50mL YEPD培养基(Wobbe在Current Protocols in Molecular Biology，增刊34:13.0.1-13.13.9(Wiley，1996))(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖)，并将培养物在30℃的振荡器中生长。在一个独立的实验中，与上述相同，除了用40g/L葡萄糖，6-MSA以>3克/升的水平被分离。在另一个与上相同的独立实验中，除了使用5g/L葡萄糖，在摩尔基础上以从葡萄糖中>60%的转化对6-MSA进行分离。

通过将取自生长24和48和72小时后的500μL等份的培养物进行离心来收集细胞，并通过煮沸约2分钟将细胞溶解在50μL2×SDS凝胶加样缓冲液中。将细胞溶解产物通过上样到12%SDS-PAGE凝胶进行分析。在大约190kD处观察到与6-MSAS预期大小对应的条带，且OSAS AviM蛋白在大约145kD处。

6-MSA和OSA分离自酵母上清，如前所述(Kealey等，Proc Natl Acad SciUSA95:505-9,1998)，并通过与薄层色谱(TLC)平板上的已知标准对比和HPLC进行鉴定。

然后使用已知的化学方法将纯化的6-MSA和OSA脱羧以得到间甲酚和苔黑酚，或可选地使用重组或天然6-MSA脱羧酶进行脱羧反应，如来自展青霉的酶、来自棒曲霉的6-MSA脱羧酶PatG、如来自粉红粘帚霉的OSA脱羧酶，或如来自黑曲霉的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶，或来自少动鞘氨醇单胞菌SYK-6的5-羧基香草醛脱羧酶。使用已知标准，通过TLC和HPLC鉴定间甲酚和苔黑酚产物。

然后，通过化学还原除去间甲酚的羟基基团，实施已知方法例如通过用锌粉末加热然后蒸馏以生成甲苯。甲苯进一步被还原使芳环饱和以生成甲基环己烷，一种饱和的并且非常期望用于喷射燃料的合适的能源。可选地，通过描述于专利申请WO/2006/086457的使用金属催化剂来影响氢化和脱氧的方法，间甲酚被直接还原并脱氧成甲基环己烷。通过标准方法，间甲酚还被还原成甲基环己醇，其能用于喷射燃料并且还能用于汽油。

实施例2-在酿酒酵母中直接生产间甲酚

构建酵母菌株，其中通过标准方法将构巢曲霉npgA基因整合到酵母菌株BJ2168的基因组(获自ATCC)以创建菌株Rho100-npgA。包含Ura3选择下的ChB1基因表达系统，并用于展青霉6-MSA脱羧酶的表达，或Trp1选择控制下的来自棒曲霉的6-MSA脱羧酶PatG的质粒依次转化到Rho100-npgA。

将转化的酵母细胞在含有2%葡萄糖的YEPD培养基的摇瓶中生长48和72小时，且分析上清液中间甲酚的产生。通过离心除去细胞，并用乙酸乙酯从培养基中萃取间甲酚进行进一步分析、定量和蒸馏到高纯度。

在另一系列的实验中，两个基因表达在相同的载体上，使用酿酒酵母IRES序列分开这两个表达自单个启动子的基因。比较酿酒酵母IRES序列从它们各自的表达系统中产生间甲酚的能力。

实施例3-从酿酒酵母中直接生成苔黑酚

包含Ura3选择下的来自绿色产色链霉菌OSAS AviM基因的表达系统，并用于Trp1选择控制下的来自棒曲霉PatG脱羧酶表达的质粒依次转化到Rho100-npgA。

将转化的酵母细胞在含有2%葡萄糖的YEPD培养基的摇瓶中生长48和72小时，且分析上清液中苔黑酚的产生。通过离心除去细胞，并用乙酸乙酯从培养基中萃取苔黑酚进行进一步分析、定量和蒸馏到高纯度。

在另一系列的实验中，两个基因表达在相同的载体上，使用酿酒酵母IRES序列分开这两个表达自单个启动子的基因。比较IRES序列从它们各自的表达系统中产生苔黑酚的能力。

实施例4-在酿酒酵母发酵上清中6-MSA和OSA分别转化为间甲酚和苔黑酚

使用各种原料如玉米糖、纤维素糖和甘蔗糖，将来自实施例2和3的酵母细胞生长于分批补料培养的1升发酵罐中(New Brunswick)。以恒定的速率以连续流动模式补料并除去培养基，并且将培养基补料到含有重组脱羧酶蛋白的溶液中。所得的间甲酚和苔黑酚产物用乙酸乙酯萃取，用于如上分析。

在另一系列的实验中，含有间甲酚和苔黑酚的上清液被直接补料到在合适基质上含有适当固定化脱羧酶的柱上。同样，分别来自柱子流出物的间甲酚和苔黑酚产物用乙酸乙酯萃取用于如上分析生产水平。

实施例5-在酿酒酵母中生产3-甲基苯甲醚和3,5-二甲氧基甲苯

第三表达系统并入到实施例2、3和4的表达菌株。来自月季(希灵登夫人(Lady Hillingdon)和粉月季(Old Blush)品种)玫瑰花瓣(Scalliet等，FEBSLetters523:113-118(2002)的O-甲基转移酶合成基因被构建并置于酿酒酵母ADH-2启动子或酿酒酵母糖酵解酶基因启动子的控制下。

如上所述，用乙酸乙酯或乙醚萃取后，含有表达系统全部补充的菌株生长并收获，并分析细胞上清液中3-甲基苯甲醚(1-甲氧基-3-甲基苯)和3,5-二甲氧基甲苯(1,3-二甲氧基-5-甲基苯)的产生。

实施例6-生产6-MSA的酵母细胞和生产脱羧酶的细胞的共培养

如上表达抗生链霉菌细菌性6-MSAS基因ChlB1的酿酒酵母细胞，和构巢曲霉npgA蛋白如上所述生长48小时。将也生长48小时的含有表达棒曲霉脱羧酶PatG的酿酒酵母细胞的等体积培养基加到培养物中，且在30℃共培养孵育24小时。通过离心除去细胞，并用乙酸乙酯从培养基中萃取间甲酚进行进一步分析、定量和蒸馏到高纯度。

实施例7-用粉末状金属催化剂通过加热使6-MSA进行脱羧反应

使纯化的6-MSA与催化量的各种金属粉末混合，并在环境压力下加热。使间甲酚蒸发并浓缩到收集容器中。分析所得产物显示纯度百分数>99％。

在具体的实施例中，使粉末状的6-MSA(20克)与锌粉(2.5克)混合并在曲颈瓶中加热直至所有固体液化。继续加热且使间甲酚蒸发并浓缩到冰-冷却的烧瓶中，得到产量为11.35克>99.9％纯的无色间甲酚。

Claims

1.一种用于生产酚类化合物的修饰的重组宿主细胞，其包含

i)第一表达系统，所述系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列，和

ii)第二表达系统，所述系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中所述ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化，和

iii)第三表达系统，所述系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列，

使得从所述细胞分离的产物是酚类化合物。

2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述的酚类化合物是间甲酚。

3.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述的酚类化合物是苔黑酚。

4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中所述的芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。

5.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述的芳族PKS是真菌的6-甲基水杨酸合酶。

6.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述的芳族PKS是原核生物的6-甲基水杨酸合酶。

7.根据权利要求6所述的修饰的细胞，其中所述的芳族PKS由野生型形式的抗生素链霉菌的ChlB1基因编码。

8.根据权利要求3所述的修饰的细胞，其中所述的芳族PKS是由绿色产色链霉菌的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的修饰的细胞，其中编码所述的脱羧酶的所述的核苷酸序列选自由展青霉的所述6-MSA脱羧酶基因、棒曲霉的所述PatG基因、粉红粘帚霉的所述OSA脱羧酶基因、曲霉属物种的所述2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶基因和少动鞘氨醇单胞菌SYK-6的所述5-羧基香草醛脱羧酶基因组成的组。

10.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述PKS的所述表达系统和所述完整的ACP合酶的所述表达系统存在于相同的载体上。

11.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述PKS的所述表达系统和所述完整的ACP合酶的所述表达系统存在于独立的载体上。

12.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述PKS和所述完整的ACP合酶表达自双顺反子信使RNA。

13.根据权利要求6所述的修饰的细胞，其中功能化脱羧酶的表达系统存在于相同的载体上，或独立的载体上。

14.根据权利要求7所述的修饰的细胞，其中功能化脱羧酶的表达系统存在于与所述最小PKS的表达系统或所述完整的ACP合酶的所述表达系统相同的载体上，或不同的载体上。

15.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述最小PKS的所述表达系统和所述完整的ACP合酶的所述表达系统和功能化脱羧酶的所述表达系统存在于相同的载体上。

16.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中一、二或全部三个所述表达系统整合到宿主细胞染色体或表达自酵母人工染色体(YAC)。

17.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中表达的PKS、完整的ACP合酶和脱羧酶中至少两个来源于多顺反子信使RNA。

18.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述的宿主生物体选自由巴斯德毕赤酵母和曲霉属物种组成的组。

19.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述的宿主生物体是黑曲霉。

20.根据权利要求19所述的修饰的细胞，其不含有完整的ACP合酶的异源表达系统。

21.一种生产酚类化合物的方法，所述方法包括

a)提供一种修饰的重组宿主细胞，其包含

i)第一表达系统，所述系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；

ii)第二表达系统，所述系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中所述ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化；和

iii)第三表达系统，所述系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列；

b)在所述的重组宿主细胞中生产酚类化合物中间体；并且

c)从所述的酚类化合物中间体合成酚类化合物，其中重组脱羧酶催化所述的酚类化合物中间体的脱羧反应以形成所述的酚类化合物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述的酚类化合物中间体是6-MSA。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述的酚类化合物是间甲酚。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述的酚类化合物中间体是苔色酸(OSA)。

25.根据权利要求21所述的方法，其中所述的酚类化合物是苔黑酚。

26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述的芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。

27.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述的芳族PKS是由绿色产色链霉菌的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。

28.一种生产酚类化合物的方法，所述方法包括

a)提供一种修饰的重组宿主细胞，其包含

i)第一表达系统，所述系统包含至少一个能被表达的编码6-甲基水杨酸(6-MSAS)的芳族聚酮化合物合酶(PKS)的核苷酸序列；和

b)分离所述重组宿主细胞中产生的酚类化合物中间体；并且

c)通过用金属催化剂加热然后蒸馏，使步骤b)中所述的酚类化合物中间体脱羧以形成所述的酚类化合物。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述的酚类化合物中间体是6-MSA。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述的酚类化合物是间甲酚。

31.根据权利要求28所述的方法，其中所述的金属催化剂是粉末形式的。

32.根据权利要求28或31所述的方法，其中所述的金属催化剂是锌催化剂。

33.一种用于生产烷基化的酚类化合物的修饰的重组宿主细胞，其包含

ii)第二表达系统，所述系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中所述ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化，

iii)第三表达系统，所述系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列，和

(iv)第四表达系统，所述系统包含至少一个编码O-甲基转移酶(OOMT)的核苷酸序列，

使得从所述细胞分离的所述产物是烷基化的酚类化合物。

34.根据权利要求33所述的修饰的细胞，其中所述的烷基化的酚类化合物是3-甲基苯甲醚。

35.根据权利要求33所述的修饰的细胞，其中所述的烷基化的酚类化合物是3,5-二甲氧基甲苯。

36.根据权利要求35所述的修饰的细胞，其中所述的芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。

37.根据权利要求35所述的修饰的细胞，其中所述的芳族PKS是由绿色产色链霉菌的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。

38.根据权利要求33所述的修饰的细胞，其中所述的OOMT由选自OOMT1、OOMT2、OOMT3、OOMT4、COMT1组成的月季基因编码。

39.一种生产烷基化的酚类化合物的方法，所述方法包括

a)提供一种修饰的重组宿主细胞，其包含

iii)第三表达系统，所述系统包含至少一个编码脱羧酶的核苷酸序列，并且

b)分离所述重组宿主细胞中产生的酚类化合物中间体；并且

c)通过用烷基化试剂进行处理，使步骤b)的所述酚类化合物中间体烷基化以形成所述的烷基化的酚类化合物。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述的酚类化合物中间体是间甲酚。

41.根据权利要求39所述的方法，其中所述的酚类化合物中间体是苔黑酚。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述的芳族PKS包含灭活的酮还原酶(KR)结构域。

43.根据权利要求41所述的方法，其中所述的芳族PKS是由绿色产色链霉菌的AviM基因编码的苔色酸合酶(OSAS)。

44.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述的烷基化的酚类化合物是3-甲基苯甲醚。

45.根据权利要求39或41所述的方法，其中所述的烷基化的酚类化合物是3,5-二甲氧基甲苯。

46.根据权利要求39所述的方法，其中烷基化试剂是甲醇。

47.一种生产邻苯二甲酸酐化合物的方法，所述的方法包括

a)提供一种修饰的重组宿主细胞，其包含

ii)第二表达系统，所述系统包含至少一个编码完整的酰基载体蛋白(ACP)合酶的核苷酸序列，其中所述ACP合酶将所述PKS泛酸巯基乙胺基化；并且

b)分离在所述的重组宿主细胞中产生的邻苯二甲酸酐中间体化合物；并且

c)通过用氧化剂进行处理，使步骤b)的所述邻苯二甲酸酐中间体化合物氧化以形成所述的邻苯二甲酸酐化合物。

48.根据权利要求40所述的方法，其中所述的邻苯二甲酸酐中间体化合物是6-MSA。

49.根据权利要求40所述的方法，其中所述的邻苯二甲酸酐是3-羟基邻苯二甲酸酐。