JP2001510993A - 細菌および酵母におけるポリケチドの産生 - Google Patents

細菌および酵母におけるポリケチドの産生

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Abstract

(57)【要約】 ハイブリッドおよび新規のポリケチドシンターゼおよびポリケチドが、多重ベクター系の使用によって産生される。別々のベクターにおけるPKS系の種々の触媒活性を置換することによって提供される組合せ確率は、PKSおよびポリケチドの改良されたライブラリーの構築を可能にする。さらに、ポリケチドは、所望のPKSのための発現系とともに、ホロACPシンターゼのための発現系を供給することによって、通常はポリケチドを産生しない宿主において産生され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌および酵母におけるポリケチドの産生 本願は、米国特許法第119条の下で、暫定出願60/033,193（1996年12月18日出 願）からの優先権を請求する。この暫定出願の内容は、本明細書中で参考として 援用される。技術分野 本発明は、酵母およびE.coliのような微生物宿主におけるポリケチドの産生、 および種々の機能的ポリケチドシンターゼ（PKS）および得られる種々のポリケ チドを含むライブラリーの調製に関する。より詳細には、種々のPKS産物を作出 するようにこれらの部分を混合しそして適合させる簡便性のために、別々のベク ターにおけるポリケチドシンターゼ系の部分を供給することに関する。これは、 単一産生系に集中した操作よりむしろ組合せアプローチを介する、ポリケチド合 成物およびポリケチドのライブラリーの産生を可能にする。背景技術 ポリケチドは、それらの一般的な生合成経路によって関連づけられる天然の産 物の特に有用な群を代表する。代表的なメンバーとしては、マクロライド抗生物 質（例えば、エリスロマイシン、スピラマイシン、およびタイロシン）、免疫抑 制剤（例えば、ラパマイシンおよびFK506）、駆虫薬（例えば、アベルメクチン （avermectin））、抗真菌剤（例えば、アンホテリシンＢおよびナイスタチン） 、抗ガン剤（例えば、ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、および抗コレス テロール剤（anticholesterolemics）（例えば、メビノリン（mevinolin））が 挙げられる。ポリケチドは、一般的に、Streptomyces、Actinomyces、Actinomad ura、Micromonospora、Saccharopolyspora、およびNocardiaを含む放線菌の二次 代謝産物である。1986年において、微生物起源の約6,000の抗生物質が特徴づけ られており、そのうちの70が、臨床的に使用されているいると見積もられた；さ ら なる1100の代謝物が、1988〜1992年に報告され、その約40％がポリケチドであっ た。 天然から入手可能なポリケチド構造の多様性にもかかわらず、目的の特定の標 的に関連づけられるポリケチドを同定するためのスクリーニングのための好都合 な基質が存在するように、利用可能なポリケチドのレパートリーを拡張し、およ びライブラリーの形態で多様なポリケチドを合成する必要性が残っている。本発 明は、このような必要性に対する解決策を提供する。 ポリケチドは、一般的に、脂肪酸合成に類似の様式において、２炭素単位の縮 合によって合成される。一般的には、この合成は、開始単位および伸長単位を包 含する；これらの「２炭素」単位は、アシルチオエステル、代表的には、アセチ ル、プロピニル、マロニル、またはメチルマロニル補酵素-Ａチオエステルに由 来する。ポリケチドシンターゼ（PKS）の２つの主要なクラスが存在し、これら は、触媒部位が使用される「様式」--いわゆる「芳香族」PKSおよびモジュール 性PKSにおいて異なる。本発明は、本明細書中でさらに説明されるような両方の これらのクラスからのコード配列を使用する。 異種機能的PKS（すなわち、ポリケチドを産生し得るPKS）の組換え産生は、St reptomycesにおいて達成されており、そして芳香族PKSのハイブリッド形態は、 同様にこれらの宿主において産生されている。例えば、Khosla,C.ら、J Bacteri ol(1993)175:2194-2204；Hopwood,D.A.ら、Nature(1985)314:642-644；Sherman ，D.H.ら、J Bacteriol(1992)174:6184-6190を参照のこと。さらに、モジュール 性PKS酵素の組換え産生は、PCT出願WO 95/08548に記載のように、Streptomyces において達成されている。これらの全ての場合において、PKS酵素は、単一のベ クターから発現されている。PKS触媒部位をコードする遺伝子を有する単一のベ クターは、Roberts.G.A.ら、Eur J Biochem(1993)214:305-311によって、E.coli に形質転換されたが、PKSは、機能的ではなかった。おそらく、アシルキャリア タンパク質のパントテン化（pantothenoylation）の欠失に起因する。 本発明は、種々の宿主におけるPKSの産生のための二重ベクターまたは多重ベ クター系、および得られるポリケチドを提供する。多重ベクターの使用は、調製 され得るPKSおよびポリケチドの組合せ形態の数を増強するためのより効率的な 手段を提供する。アシルキャリアタンパク質（すなわち、ホロACPシンターゼ） のパントテン化のための機構の付加は、広範な宿主におけるポリケチドの産生を 可能にする。発明の開示 本発明は、広範な宿主におけるポリケチドの産生およびPKS酵素のライブラリ ーの産生のための組換え材料、ならびに多重ベクター系に基づいて得られるポリ ケチドに関する。多重ベクター系の使用は、組合せライブラリーの構築を容易に し、そしてその種々のメンバーの設計において、より大きな柔軟性を可能にする 。本発明はまた、ポリケチド応答性レセプターに関する自己分泌系に起因して本 質的に自己スクリーニングされるこのようなライブラリーに関する。 従って、１つの局面において、本発明は、組換え宿主細胞およびそのライブラ リーに関し、宿主細胞が少なくとも２つのベクターを含むように改変される場合 、第１ベクターは、第１選択マーカーおよび第１発現系を含み、そして第２ベク ターは、第２選択マーカーおよび第２発現系を含み、そして必要に応じて、さら なるベクターは、さらなる選択マーカーおよび発現系を含み、ここでこれらの発 現系は、少なくとも最低限のPKS系をコードしそして産生し得るベクターに含ま れる。最低限のPKS系が芳香族系である場合、この最低限の系は、ケトシンター ゼ／アシルトランスフェラーゼ（KS/AT）触媒領域、鎖長因子（CLF）触媒領域、 およびアシルキャリアタンパク質（ACP）活性を含む。最低限のPKS系が、モジュ ール系である場合、この系は、少なくともKS触媒領域、AT触媒領域、およびACP 活性を含む。モジュール系について、これらの活性は、合成における中間体が基 質として提供された場合、十分である；新規合成経路が要求される場合、ロード するアシルトランスフェラーゼが含まれるべきであり、これは、別のATおよびAC P領域を含む。 本発明のこの局面の１つの特定の実施態様において、組換え宿主細胞は、以下 を含むように改変される：（a）第１選択マーカー、およびこの細胞において作 動可能なプロモーターに作動可能に連結された芳香族PKSのケトシンターセ／ア シルトランスフェラーゼ（KS/AT）触媒領域をコードするヌクレオチド配列を含 む発現系を含む第１ベクター；（b）第２選択マーカー、およびこの細胞におい て作動可能なプロモーターに作動可能に連結された鎖長因子（CLF）触媒ドメイ ンをコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含む第２ベクター；ならびに（ c）第３選択マーカー、およびこの細胞において作動可能なプロモーターおよび このような細胞のコロニーから構成されるライブラリーに作動可能に連結された アシルキャリアータンパク質（ACP）活性をコードするヌクレオチド配列を含む 発現系を含む第３ベクター。あるいは、ベクターの２つが、宿主細胞が２つのベ クターのみを含むように組み合わせられ得る；２つの発現系を含むベクターが、 これらを別々の発現系として維持し得るか、または２つのオープンリーディング フレームが、単一のプロモーターの制御下に配置され得る。 別の特定の実施態様において、本発明は、第１選択マーカー、およびこの細胞 において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたモジュール性ポリケチ ドシンターゼ（PKS）の少なくとも１つの最低限のモジュールのための発現系を 含む第１ベクター：ならびに第２選択マーカー、およびこの細胞において作動可 能なプロモーターに作動可能に連結されたモジュール性ポリケチドシンターゼの 少なくとも１つの最低限の第２モジュールをコードするヌクレオチド配列を含む 第２ベクター、を含むように改変された細胞、ならびにこのような細胞のコロニ ーを含むライブラリーに関する。 別の変更において、PKS系の規定された部分のための１つ以上の発現系は、宿 主染色体に組み込まれ、そして少なくとも１つのさらなる発現系は、複製可能ベ クターに存在する。従って、芳香族PKSの場合において、オープンリーディング フレームの１つのための発現系は、最初に、染色体に取り込まれ得、そしてその 他のオープンリーディングフレームのための発現系は、ベクターに存在し得る。 モジュール性PKSの場合において、１つ以上のモジュールのための発現系は、染 色体上に存在し、そして１つ以上のモジュールのためのさらなる発現系は、ベク ター上に存在する。このような発現系の染色体への組み込みは、公知のファージ 媒介性組み込みを介して、または相同組換えによってかのいずれかで生じ得る。 本発明はまた、本発明の方法によって産生される新規のポリケチド、および得 られるポリケチドライブラリーをスクリーニングする方法に関する。 なおさらなる局面において、本発明は、アシルキャリアタンパク質の活性化の ための機構を欠失する（すなわち、ホロACPシンターゼを欠失する）宿主におい て、ポリケチドの合成を得るための方法に関する。別々のベクター（多重ベクタ ー系におけるベクターの１つ（または、PKS発現のための単一ベクター））にお いて、またはPKSもしくはその部分との融合タンパク質としてのいずれかに適合 するホロACPシンターゼのための発現系を供給することにより、E.coli、酵母、 および通例ではポリケチドを合成しない他の微生物のような宿主は、簡便な宿主 へとされ得る。このことは、例えば、Streptomycesのポリケチド産生株から供給 される「清潔な」宿主の必要性を取り除く。図面の簡単な説明 図１は、いくつかの代表的な芳香族PKSの組成を示す図である。 図２は、モジュール性PKSの代表としてのエリスロマイシンPKSの構成を示す図 である。 図３は、真菌PKS系、6-メチルサリチル酸シンターゼ（6-MSAS）の構成を示す 図である。 図４は、多重ベクター化モジュール性PKS系の概念化を示す図である。 図５は、多重ベクター化芳香族PKS系の図である。 図６は、ホロACPシンターゼの発現のためのベクターおよび6-MSASをコードす る遺伝子の発現のためのベクターの構築（両方のベクターは酵母における使用の ため）を図で示す。 図７は、本発明の種々のベクターで形質転換した酵母培養物の上清について、 HPLC実行の結果を示す。 図８Ａおよび８Ｂは、酵母（図８Ａ）およびE.coli（図８Ｂ）における、抗生 物質6-メチルサリチル酸（6-MSA）の産生の速度論を示す。 図９は、予測した産物とともに、酵母に適合可能なベクターにおける使用のた めの２つのモジュール性PKSのための発現系を示す。発明を実施する態様 本発明は、種々の局面において、芳香族、PKS系、モジュール性PKS系、真菌PK S系、もしくはその改変形態の種々の成分またはこれらの１つより多い部分を使 用する。芳香族、モジュール性、および真菌PKS系の一般的な特徴を、それぞれ 、図１，２、および３に示す。 「芳香族」PKS系は、産生されたいくつかの酵素における触媒部位の反復使用に よって特徴づけられる。従って、芳香族PKSにおいて、特定の型の活性を有する １つの酵素のみが産生されて、ポリケチドの合成を通じて、系のための関連活性 を触媒する。芳香族PKSにおいて、最低限のPKSの酵素は、３つのオープンリーデ ィングフレームにおいてコードされる。図１に示すように、アクチノロジン（ac tinorhodin）PKSは、６つの別々のORFにおいてコードされる。最低限のPKSにつ いて、１つのORFは、ケトシンターゼ（KS）およびアシルトランスフェラーゼ（A T）を含む；第二のORFは、鎖長因子（CLF）であると考えられるものを含む；そ して三番目のリーディングフレームは、アシルキャリアタンパク質（ACP）をコ ードする。さらなるORFは、アロマターゼ（ARO）、シクラーゼ（CYC）、および ケトレダクターゼ（KR）をコードする。KS/AT、ACP、およびCLFの組合せは、最 低限のPKSを構成する。なぜなら、これらの要素が２炭素単位の単縮合に必要で あるからである。 対照的に、gris PKSは、５つの別々のORFを含み、ここで、KS/AT、CLF、およ びACPは、３つのORF上にあり、KRは四番目上にあり、そしてAROは５番目上にあ る。 「モジュール性」PKS系において、各触媒部位は、一回のみ使用され、そしてP KS全体は、一連の「モジュール」としてコードされる。従って、モジュール性シ ンターゼタンパク質は、複数の触媒部位を含み、これらは同じ型の触媒活性を有 する。最低限のモジュールは、少なくともKS、AT、およびACPを含む。必要に応 じて、さらなる活性は、KR、DH、エノイルレダクターゼ（ER）およびチオエステ ラーゼ（TE）活性を含む。図２は、抗生物質エリスロマイシンについての中間体 前駆体6-dEBの合成のためのモジュール性PKS系の構成を図で示す。示すように、 呼び出し（loading）領域に続いて６つのモジュールが存在する；モジュール６ 上のチオエステラーゼは、ホスホパントテニル基を介して結合するシンターゼか らの、完全な6-デオキシエリスロノリドＢ（6-dEB）の遊離をもたらす。図は、6 -deBの進行性形成を示す。これは、シンターゼのモジュール６上のホロACPから の除去の後に環化される。エリスロマイシンＡに6-deBを変換するために、２つ の糖残基は、続く反応において３位および５位でのヒドロキシル基を介して付加 される。 6-メチルサリチル酸シンターゼ（6-MSAS）をコードする「真菌」PKSは、芳香 族PKSおよびモジュール性PKSの両方にいくらか類似点を有する。それは、KS、AT 、デヒドラターゼ（DH）、KR、およびACPのための１つのリーディングフレーム のみを有する。従って、モジュール性PKSの単一モジュールに類似するようにみ える。しかし、これらの部位は、反復使用される。芳香族PKSとは異なり、図３ に示すように、それはCLFを含まない。 本発明は、本明細書において、芳香族PKS系、モジュール性PKS系、および真菌 PKS系の全てに関与する触媒活性についての発現系を使用する。産生されるタン パク質は、天然のアミノ酸配列を含み得、従って、天然形態またはこれらのタン パク質の改変形態の基質特異性および活性は、所望の触媒活性が維持される限り 、使用され得る。しかし、この活性の特異性および効率は、天然形熊のそれらと は異なり得る。しかし、天然系に存在する特定の活性は、意図的に欠失され得る 。さらに、種々の芳香族系の成分は、混合および一致され得、ならびにモジュー ル系の種々のモジュールの成分も混合および一致され得る。PCT出願WO 95/08548 （上記に参照され、そして本明細書中で参考として援用される）は、例えば、ア クチノロジンのオープンリーディングフレームが、別の芳香族系からのオープン リーディングフレームを有する発現ベクターに含まれる、ハイブリッド芳香族PK S系の構築を記載する。 PKSタンパク質単独についての発現系は、組換え宿主がまた、アシルキャリア タンパク質のパントテン化をもたらすホロACPシンターゼ活性をも含む限りは、 ポリケチドの実際の産生に十分であり得ない。この活性化工程は、開始単位であ る「２Ｃ」単位または完成したポリケチドを生じる一連のクライゼン縮合におい て成長するポリケチドを「拾い出す」ACPの能力に必要である。ホロACPシンター ゼとして挙動するホスホパントテン化酵素を欠失する宿主について、本発明は、 この酵素のための適切な発現系を供給することによって、この活性を付与するた めの手段を提供する。ホロACPシンターゼについての発現系は、PKS単位を有する ものとは別のベクターに供給され得るか、または同じベクターに供給され得るか 、または宿主の染色体に組み込まれ得るか、またはポリケチドシンターゼの全て または部分との融合タンパク質のための発現系として供給され得る。一般的には 、脂肪酸合成に関連するホロACPシンターゼは、適切ではない；むしろ、ポリケ チド合成または非リボソームタンパク質の合成に特異的に関連するシンターゼが 、この点に関して有用である。 詳細には、モジュール性および真菌PKS系は、E.coliに生来のホスホパントテ ン化酵素によって影響されるホスホパントテン化によって活性化されない；しか し、Bacillusに由来する酵素、特にBacillus brevisのグラミシジンホロACPシン ターゼおよびBacillus subtilisからのサーファクチン（surfactin）関連ホロAC Pシンターゼは、基質として、モジュール性および真菌PKS ACPドメインを利用し 得る。以下の実施例に示されるように、適切なホロACPシンターゼのための発現 系の封入は、E.coliまたは酵母において真菌またはモジュール性PKSをコードす る遺伝子の発現だけを必要としないが、このような発現系の封入は、ポリケチド が産生された酵素によって産生される場合、必要である。 いくつかの組換え宿主において、抗生物質活性を有するポリケチドが所望され る場合、合成後の改変を介して産生されるポリケチドを活性化する必要もあり得 ることに注意されるべきである。これが、特定の宿主のための場合である場合、 宿主は、例えば、形質転換によって改変されて、これらの改変に影響に影響を与 えるのに必要な酵素を含むようになる。このような酵素は、例えば、グリコシル 化酵素である。 芳香族PKS系の合成についての組合せの確率は、反復使用される部位の性質、 および最終産物のための合成機構を示すクライゼン縮合に必要な最低限のPKS系 の一部ではない随意の活性の存在または非存在に依存する。従って、芳香族PKシ ンターゼは、KS/AT、ACP、およびCLFを含まなければならないが、他の触媒活性 （すなわち、KR、ARO、およびCYC）は随意である。真菌PKシンターゼは、モジュ ール性PKS系と同様に、KS、AT、およびACP機能性のみを必要とする。種々の供給 源からのこれらの活性の種々の組合せ、および変異形態が、使用され得る。 触媒部位は、モジュール性PKS系において一回のみ使用されるので、この型の シンターゼにおける組合せ確率はより大きい。モジュール性PKSの組合せ能力は 、以下によって与えられる：ATL×（ATE×４）M、ここでATLは、ローディングア シルトランスフェラーゼの数であり、ATEは、伸長アシルトランスフェラーゼの 数であり、そしてＭは、遺伝子クラスターにおけるモジュールの数である。数４ は、これが、ケト基が以下のいずれか：１）反応なし；２）ＫＲ活性単独；３） KR＋DH活性；または４）KR＋DH＋ER活性、によって改変され得る方法の数を示す ので式中に存在する。エリスロマイシンPKSの最初の２つのモジュールのみの発 現が、予測した短縮化トリケト産物の産生を生じることが示されている。Kaoら 、J Am Chem Soc(1994)116:11612-11613を参照のこと。メチマイシンアグリコン に類似の新規な12員環マクロライドは、S.coelicolorにおいて、このPKSのモジ ュール１〜５の発現によって産生された。Kao C.ら、J Am Chem Soc(1995)117:9 105-9106を参照のこと。この研究、ならびにCortes,J.ら、Science(1995)268:14 87-1489の研究は、PKEモジュールは機能的に独立しており、その結果、ラクトン 環サイズは、存在するモジュールの数によって制御され得ることを示す。 モジュールの数の制御に加えて、モジュールは、例えば、Donadio,S.ら、Scie nce(1991)252:675-679；Donadio,S.ら、Gene(1992)115:97-103に記載されるよう に、ケトレダクターゼドメインの欠失によって遺伝子的に改変される。さらに、 エノイルレダクターゼドメインの変異は、Donadio,S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U SA(1993)90:7119-7123によって報告された。これらの改変もまた、改変PKS、従 って改変ポリケチドを生じた。 上記のように、天然に見いだされる芳香族、真菌の、またはモジュール性PKS 系に由来する触媒活性のコード配列は、それらの天然の形態において使用され得 るか、または標準的な変異誘発技術によって改変されて、活性を欠失または減少 し得るか、本来は存在しないモジュールに活性を導入し得る。例えば、KR活性は 、この機能を通常欠くモジュールに導入される。 上記に示されるように、当該分野では、単一の発現ベクターから、Streptomyc esにおいて、ハイブリッドのおよび／または別の芳香族もしくはモジュール性PK S系の構築による、いくつかの新規なポリケチドの産生に成功しているが、一般 的に広範な種々のシンターゼを産生するための宿主細胞において、多重ベクター 系を用いる利点は得られていない。「多重」とは、２つ以上を意味し；「ベクタ ー」は宿主系を形質転換するために使用され得、そして選択マーカー、および発 現系を調節するプロモーターおよび任意の他の配列の制御下でコード配列を含む 非依存性発現系の両方を含む核酸分子を意味する。代表的なこのようなベクター はプラスミドであるが、ファージミド、コスミド、ウイルスベクターなどのよう な他のベクターもまた、宿主の性質に従って使用され得る。 もちろん、１つ以上の別のベクターは、関連発現系の宿主の染色体への取り込 みを生じ得る。 一般的に、E.coliおよび酵母のような微生物宿主は、どちらも、ポリケチドを 構築するために首尾良く使用されていない。このことは、本発明の方法に従って 、これらの宿主に補充され得るホロACPシンターゼの欠失に起因すると考えられ る。 従って、本発明のポリケチドを産生するために、適切な宿主が改変されて、ベ クター（代表的には、プラスミド）を含むようになり、これは、PKSに関連する １つ以上の活性を有するタンパク質の産生のための発現系を含む。異なる発現ベ クターに対して種々の活性を配することによって、高い程度の多様性が達成され 得る。種々の宿主が使用され得る：選択マーカーが分割されて多重ベクターの取 り込みを確実にし得る任意の適切な宿主細胞は、容易に使用され得る。好ましい 宿主としては、なぜ哺乳動物細胞または昆虫細胞または他の適切な組換え宿主が 使用され得ないかの理論的な理由はないが、酵母、E.coli、放線菌、および植物 細胞が挙げられる。好ましい酵母株は、Saccharomyce ScerevisiaeおよびPichia pastorisである。好ましい糸状菌としては、Streptomycesの種々の株が挙げられ る。 もちろん、宿主の選択は、発現系に関連する制御配列ならびに選択マーカーの 選択に影響する。例えば、E.coliにおける使用のための適切なプロモーター系と しては、トリプトファン（trp）プロモーター、ラクトース（lac）プロモーター 、T7プロモーター、およびλ誘導PLプロモーター、およびN-遺伝子リボソーム結 合部位が挙げられる。酵母のための適切な制御配列としては、糖化酵素（例えば 、 3-ホスホグリセレートキナーゼ）の合成のためのプロモーターが挙げられる。他 のプロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH-1およびADH-2）、 イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および マルトースおよびグルコース利用を担う酵素のためのものが挙げられる。終結配 列は、コード配列の3'末端で所望され得るとも考えられる。 哺乳動物細胞、放線菌、植物細胞、昆虫細胞などにおける使用に適切なプロモ ーターもまた、当該分野で周知である。 E.coliのような細菌および放線菌における使用に適切な選択マーカーは、一般 的に、抗生物質耐性を与える；酵母における使用のためのものは、しばしば、栄 養性要求を補う。酵母における使用のための選択マーカーとしては、URA3、LEU2 -d、TRP1、LYS2、HIS1、HIS3が挙げられるがこれらに制限されない。放線菌にお ける使用のための選択マーカーとしては、チオストレプトン、アプラマイシン、 ハイグロマイシン、およびエリスロマイシン耐性のためのものが挙げられるがこ れらに限定されない。 ベクターの構築、宿主細胞の形質転換、および首尾良い形質転換体のための選 択のための方法および材料は、当該分野で十分理解される。 従って、本発明の１つの実施態様に従って、単一の宿主細胞が改変されて、多 重ベクターを含むようになり、各ベクターはPKS系の合成の部分に寄与する。芳 香族PKS系の産生のための多重ベクターを構築することにおいて、図１に示され るもののような別々のリーディングフレームが、別々のベクターに取り込まれ得 るか、適切に構築される場合、リーディングフレームの部分は、１つより多いベ クターの間に分布し、各々は、発現の制御に影響するための適切な配列を有し得 る。モジュール性のための、単一のモジュールまたは１つより多いモジュールは 、単一のベクターにおける発現系の一部として存在し得る；多重ベクターが、細 胞を改変して所望のPKS系全体を含むようにするために使用される。 上記のように、宿主に導入される１つ以上の発現系が、染色体に取り込まれ得 る。 従って、本発明のライブラリーを調製するために、適切な宿主細胞が、所望の 数のベクターで形質転換される；改変の一部として所望される各ベクターにおけ る異なる選択マーカーを用いることにより、全ての所望のベクターの封入によっ て改変される首尾良い形質転換体が選択され得る。PKSシンターゼの部分のため の複数の発現系を含む第１選択マーカーとの第１ベクターの混合物、およびPKS 系の種々の第２部分のための発現系との第２のベクターの混合物などを用いるこ とにより、「ハイブリッド」PKS系の組合せ提示を有する首尾良い形質転換体の コロニーが得られる。このような首尾良い形質転換体の個々のコロニーのパネル を調製することによって、PKS系のライブラリーが得られ、それによりポリケチ ドのライブラリーが得られる。ホロACPシンターゼのための発現系もまた、必要 ならば供給される。ポリケチドは、宿主の性質に依存して、グリコシル化され得 る。 このアプローチはまた、１つ以上の多重ベクターの適切な部分の、宿主細胞の 染色体への取り込みに影響することによって改変され得る。取り込みは、適切な ファージベクターを用いて、または相同組換えによって影響され得る。相同組換 えが使用される場合、取り込みはまた、上記のPCT出願WO 95/08458に記載のよう に、染色体に本来存在する内因性PKS活性を欠失し得る。これらの実施態様にお いてまた、ハイグロマイシンまたはチオストレプトン耐性のような選択マーカー は、取り込みに影響するベクターに含まれ得る。 次いで、ポリケチドライブラリーは、任意のポリケチド応答性標的に関して、 活性化するかまたは他の様式で標的に結合する特定のポリケチドメンバーを同定 するために、活性についてスクリーニングされ得る。このようなスクリーニング 方法は、当該分野で標準的である。 本発明の特定の好ましい実施態様において、ライブラリーは、ポリケチド自体 を産生する宿主細胞内または表面で提示されるポリケチド応答性レセプターを導 入することによって自己スクリーニングされ得る。この「自己分泌」系は、レセ プターを活性化するものについて自己選択するコロニーを可能にする。このよう な系は、例えば、Broach,J.R.およびThorner,J.，Nature(1996)384:Supp.7:14-1 6による文献に記載される。 自己分泌系は、レセプターに限定されないが、細胞の内部に発現されるタンパ ク質を含み得、そしてその相互作用は、産生されるポリケチドに関して、米国特 許第第5,283,173号においてFieldsによって記載される酵母２ハイブリッド系に 類似の様式において評価され得る。 従って、細胞は改変されて、「ポリケチド機能についての細胞ベースの検出系 」が作製される。ポリケチドの機能は、細胞の表面で産生されるかまたは細胞内 に産生されるいずれかのレセプターに関するアゴニストまたはアンタゴニスト活 性を含み得るか、またはポリケチドは、２つのハイブリッド相互作用スクリーニ ングのためのアゴニストまたはアンタゴニストであり得、その結果、ラパマイシ ンおよびFK506に類似のタンパク質-タンパク質相互作用インヒビターまたは架橋 因子について選択可能である。 このような細胞ベースの検出系はまた、ポリケチドのライブラリーをスクリー ニングするのに有用であり、これらは、単一のベクター系のみを含む細胞から産 生されることに注目するべきである。従って、これらの改良は、本発明の複合ベ クター組み合わせライブラリーだけでなく、単一の発現ベクターにおけるこれら の系を含む細胞を用いて産生されるポリケチドシンターゼおよびポリケチドライ ブラリーに応用可能である。 上記のように、PKSにおける酵素系に対する翻訳後修飾に影響するさらなる酵 素は、適切な組換え発現系を介して宿主に導入される必要があり得る。さらに、 例えば、グリコシル化を介してポリケチド自体を活性化する酵素が必要とされ得 る。触媒ドメインを改変して、それらの気質特異性を変更するか、またはドメイ ンを適切な特異性と置換する必要もあり得る。一般的に、例えば、酵母における マロニルCoAレベルは、メチルマロニルCoAより高いと考えられている；酵母が宿 主として選択された場合、エキステンダー（extender）単位（例えば、スピラマ シンまたはタイロシンに由来するもの）としてマロニルCoAを利用し得る触媒ド メインを含むことが所望され得る。 図４は、本発明の概念的な基準の１つの実施態様を図示し、ここで、３つの別 々のベクターが使用されて、モジュール性PKSを産生する。示されるように、各 ベクターは、２つのエキステンダーAT(一方はメチルマロニルCoAから、および他 方はマロニルCoAから)を用いて、64の異なるオープンリーディングフレームの構 築、および上記のKR、DH、およびERに関与する４つの組み合わせを可能にする。 従って、モジュールNo.１は、エキステンダー単位としてマロニルCoAを使用し得 る；モジュールNo.２は、メチルマロニルCoA；逆配列が使用され得るか、または 両方のエキステンダーがマロニルCoAを使用し得るか、または両方がメチルマロ ニルCoAを使用し得る。このことは、エキステンダーの組み合わせの４つの別の 型を生じ、その各々は、４つのKR/DH/ER改変体によって多重化される。各々別々 のプラスミドが、同じセットの可能性を提供する；プラスミドの１つはまた、ロ ーディング機能を含まねばならず、そして１つは、チオエステラーゼ機能を含ま なければならない。従って、192のプラスミドの構築によって、新規なポリケチ ドの合成の上限は、64×64×64または262,144分子であり、これは、多数の新規 なポリケチドを得るための効率的な方法を提供する。 図５は、本明細書中以下の実施例11により詳細に示される複合ベクター芳香族 PKSに対するアプローチを示す。図５において、代表的な芳香族ポリケチドシン ターゼの３つの別のリーディングフレームは、別々のベクターに配置される。従 って、各リーディングフレームは、所望される場合、異なる芳香族ポリケチドシ ンターゼに由来し得る。 使用される宿主細胞にかかわらず産生されるポリケチドを変化させるのに有用 な別の改変は、PKS（特に、モジュール性または真菌PKS）を操作して、第１モジ ュールのケトシンターゼ（KS）を不活化する。このことは、Jacobsenら、Scienc e(1997)277:367-369によって記載のように、システムが、3-ヒドロキシ-2-メチ ルパントン酸（pantonoic acid）-N-アセチルシステアミンチオエステルのよう な適切なジケチドチオエステル、またはジケチドアナログの類似のチオエステル を取り込むことを可能にする際の増強された効率を可能にする。不活化ケトシン ターゼ領域を含むPKSモジュールの構築は、同時係属中の米国特許出願第08/675 ，817号に記載され、そしてPCT出願WO 97/02358号に公開される。これらは、本 明細書中で参考として援用される。これらの改変PKSモジュールは、多重ベクタ ー法を用いてライブラリーを調製することにおいて、および／または適切なホロ ACPシンターゼをコードする遺伝子のさらなる発現を要求し得る、E.coliおよび 酵母に基づくポリケチド産生生物において、本発明の種々の実施態様において使 用され得る。 従って、本発明は、通常はポリケチドを産生しない宿主（例えば、E.coliおよ び酵母）においてポリケチドを産生する機会を提供する。本発明はまた、E.coli または酵母宿主においてであろうと、あるいは他のより伝統的に使用される宿主 においてであろうと、複数の別々のベクターに導入したPKSのエレメントを供給 することによって種々のポリケチド産物を提供する、より効率的な手段を提供す る。本発明はまた、本発明の方法を用いて調製されたポリケチドのライブラリー を含む。 ポリケチドの使用 充分に理解されるように、グリコシル化形態におけるポリケチドは、強力な抗 生物質である。さらに、多くのポリケチドは、免疫抑制剤および抗ガン剤である 。ポリケチドまたはそれらのグリコシル化形態が、特定の環境下で炎症を減少さ せ得ることもまた見いだされている。このことは、IL-8のようなサイトカインの 放出を阻害する、特定の抗生物質の能力に起因すると考えられる。例えば、Hott ,M．は、Kurume Medical Journal(1996)43:207-217において、原因不明の組織化 肺炎および関連疾患におけるエリスロマイシンの好都合な臨床効果が、IL-8産生 の局所抑制を介する末梢気道における好中球の蓄積の阻害に起因するとの結論を 下している。さらなる実験研究において、Tamaoki,J.ら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy(1996)40:1726-1728は、ロキシスロマイシンまたはエリスロ マイシンでのモルモットの前処置が、IL-8が吸引された場合の杯細胞分泌の増加 を阻害することを示した。Hamada,K.ら、Chemotherapy(1995)41:59-69は、マウ スにおけるエリスロマイシンの抗腫瘍効果は、IL-4の産生の増強に起因すること を示した。別の研究において、Keicho,N.ら、Journal of Antibiotics(Tokyo)(1 993)46:1406-1413は、エリスロマイシンが、その抗菌作用とは独立して炎症の程 度を抑制することが報告されていることを記載し、そしてエリスロマイシンが、 分裂促進因子および抗原で刺激されたヒトリンパ球の増殖応答を抑制するが、コ ンカナバリン-Ａ（concanavilin-A）誘導性のIL-2産生または住-2R-α発現にお いては効果がなかつたことを示す。Ballly,S.ら、Antimicrobial Agents and Ch emotherapy(1991)35:2016-2019は、ロキシスロマイシン、スピラマイシン、およ びエ リスロマイシンが、IL-1α、IL-1β、およびIL-6、ならびに腫瘍壊死因子αの産 生において異なる効果を有することを示した。スピラマイシンは、そしてエリス ロマイシンはより少ない程度で、IL-1α、IL-1β、またはTNFαに影響を与えず に総IL-6産生を増加させる。ロキシスロマイシンは、影響を有さなかった。 従って、抗生物質もまた、炎症機構を調節するのに重要であることを示す多数 の論文が存在する。文献は、エリスロマイシンが、IL-8の産生を減少させるが、 IL-6、IL-1、およびIL-2の産生を増強することを示すようである。スピラマイシ ンは、IL-6の産生を増強することが示されている。 これらの実施例は、本発明を例示することを意図するが本発明を限定すること は意図しない。 実施例１ 102d 、6-MSAS酵母発現ベクターの構築 酵母において有効な制御配列を得、そしてポリリンカーとともにプラスミドpB lueScript（Stratagene）に挿入した。S.cerevisiae ADH2プロモーターを、以下 のプライマーを用いてPCRによって増幅した： 順方向：GGGAGCTCGGATCCATTTAGCGGCCGCAAAACGTAGGGGC 逆方向：CCGAATTCTAGAGGTTTCATATGGTATTACGATATAGTTAATAG。 順方向プライマーは、5'ADH2配列に相補的な15塩基を含み、そしてSacI（ヌク レオチド３〜８）、BamHI（ヌクレオチド9〜14）、およびNotI（ヌクレオチド20 〜27）の制限部位を導入する。逆方向プライマーは、3'ADH2配列に相補的な15塩 基を含み、そしてNdeI（ヌクレオチド18〜23）、XbaI（ヌクレオチド7〜12）、 およびEcoRI（ヌクレオチド３〜８）の部位を導入する。 ADH2ターミネーターを、以下のプライマーを用いてPCRによって増幅した： 順方向：GGGAATTCATAGTCGACCGGACCGATGCCTTCACGATTTATAG 逆方向：TTTTCTATTATAAGATGAAAAACGAGGGGAGCTCCCATGGCC。 順方向プライマーは、EcoRI（ヌクレオチド３〜８）、SalI（ヌクレオチド12 〜17)、およびRsrII（ヌクレオチド17〜24）の制限部位を導入する。逆方向プラ イマーは、XhoI（ヌクレオチド29〜34）およびAsp718（ヌクレオチド35〜40） の制限部位を導入する。 ADH2プロモーターを含むSacI/EcoRIフラグメント、ADH2ターミネーターを含む EcoRI/Asp718フラグメント、およびpBlueScriptのSacI/Asp718フラグメントを連 結して、6MSASについてのクローニング部位(L2)およびB.subtilisからの界面活 性物質ホスホパントテイン（phosphopantothein）トランスフェラーゼについて の遺伝子（sfp遺伝子）を含む中間体ベクター43d2を産生した。図６を参照のこ と。このプラスミドは、プロモーター／ターミネーターカセットを酵母シャトル ベクターに移入するための部位（L1、L3）、ならびに中間体BlueScriptベクター からのプロモーター／遺伝子カセットを酵母シャトルベクターに移動するための 部位（L1、L2）もまた含む。 次いで、ADH2プロモーター／ターミネーターを、E.coli/酵母シャトルベクタ ーpYT（S.Hawkes博士，University of California，San Franciscoから贈与され た）に導入した。pYTからの13.2kbp BamHI/SalI制限フラグメントを、43d2から の757-bp BamHI/XhoI制限フラグメントに連結して、プラスミド101c（これは、 選択のためのLeuマーカーおよびUraマーカーを含む）を得た。 発現ベクターの構築を完了するために、Penicillium patulumからの6-メチル サリチル酸シンターゼ（6-MSAS）についての遺伝子を含む5.3-kbp NdeI/XbaI制 限フラグメントを、脱メチル化プラスミドpDB102（Bedford,D.ら、J Bacteriolo gy(1995)177:4544-4548）から得、そしてNdeI/XbaI制限43d2に連結して、中間体 プラスミド71dを得た。71dからの6.1-kbp NotI/RsrII制限フラグメントを、101c からの12.6-kbp NotI/RsrII制限フラグメントに連結して、発現ベクター102dを 産生した。 実施例２ Saccharomyces cerevisiae における6-MSASの発現 コンピテントなSaccharomyces cerevisiae InvSc1（MATa his 3DI leu2 trp1- 289 ura3-52）（Invitrogen)を、102dで形質転換し、次いで最少寒天プレート（ アミノ酸または硫酸アンモニウムを含まない1.7g/L酵母窒素源ベース（DIFCO） 、５g/L(NH4)2SO4、20g/Lグルコース、ウラシル原栄養性に基づく選択のため のアミノ酸を含む20g/L寒天）にプレートした。形質転換体を拾い、そしてウラ シル欠損最少培地で24時間増殖させた。プラスミドDNAを形質転換体から単離し 、そして制限消化分析によって分析して、同一性を確認した。 首尾良い形質転換体を使用して、２mLのウラシル欠損最少培地を接種し、そし て旋回式シェーカーで30℃にて一晩増殖させた。この培養物の100μLのアリコー トを使用して、10mLのYPD培地（Wobbe,C.R.，Current Protocols in Molecular Biology，補遺34:13.0.1-13.13.9（Wiley，1996））（10g/L酵母抽出物、20g/L ペプトン、20g/Lグルコース）に接種し、そして培養物を、シェーカーで30℃に て増殖させた。 細胞を、増殖の18および36時間後に採取した培養物の500μLアリコートの遠心 分離によって回収し、そして50μLの２×SDSゲルローディング緩衝液において２ 分間煮沸することによって溶解させた。 細胞溶解産物を、12％SDS-PAGEゲルにロードすることによって分析した。6-MS ASの予測したサイズに対応するバンドは、約l90kDで観察された。 実施例３ ホロACPシンターゼ発現ベクターの構築 Bacillus subtilis sfp遺伝子は、ホロACPシンターゼ（すなわち、ホスホパン トテノイル（phosphopantothenoyl）トランスフェラーゼ）をコードし、そして プラスミドYepFLAG-1（IBI/Kodak）に挿入される。 YepFLAG-1の5.7-kbp PacI/NotI制限フラグメントを、合成ポリリンカーに連結 して、以下の制限部位を導入した： （PacI）-BamHI-NotI-NcoI-RsrII-XhoI-SalI-（NotI）。 元来のPacIおよびNotI連結部位は、この連結物において破壊された。得られた ベクターを、BamHIおよびSalIで切断し、そしてBamHI/XhoI消化した43d2（実施 例１を参照のこと）に連結して、ADH2プロモーター／ターミネーターを導入し、 従ってプラスミド126bを得た。Bacillus subtilis sfp遺伝子を、プラスミドpUC 8-sfp（Nakano,M.ら、Mol Gen Genet(1992)232313-321）から、以下のプライマ ーを用いるPCRによって増幅した： 順方向：TAGACACATATGAAGATTTACGGAATTTATATG 逆方向：TACATTCTAGAAATTATAAAAGCTCTTCG。 順方向プライマーは、NdeI制限部位（ヌクレオチド7〜12）を導入し、そして 逆方向プライマーは、XbaI部位（ヌクレオチド6〜11）を導入する。 得られたPCRフラグメントを、43d2のNdeIおよびXbaI部位に連結して、プラス ミド109cを産生した。 109cの1.3-kbp BamHI/SalI制限フラグメントを、BamHI/SalI消化126bに連結し て、ADH配列の制御下のsfp遺伝子および選択マーカーとしてのトリプトファン原 栄養性を含む発現ベクター128aを産生した。 実施例４ 酵母における6-メチルサリチル酸の産生 コンピテントなSaccharomyces cerevisiae InvSc1細胞を、102d（6MSAS）およ び128a（sfpホロACPシンターゼ）で形質転換した。128aを、トリプトファン原栄 養性について選択する最初の形質転換に使用した：次いで、首尾良い形質転換体 を、102dでトランスフェクトし、トリプトファンおよびウラシル原栄養性につい て選択した。形質転換体は、30℃にて48〜72間後に現れた。 6MSAS/sfp形質転換体のシングルコロニーを、トリプトファンおよびウラシル 欠損最少培地において、30℃にて24〜48時間増殖させ、その後、100μlを使用し て、10mlのYPD培地を接種した。培養物を、30℃にて18時間、旋回式シェーカー において225rpmにて増殖させた。YPD培地（50ml）を、0.5mlの一晩培養物で接種 し、そして30℃にて142時間インキュベートした。１mlのアリコートを定期的に 除去し、そして細胞を遠心分離によって回収した。細胞を、SDS-PAGEローディン グ緩衝液に懸濁し、２分間煮沸し、そしてSDS-PAGEに供して、PKSタンパク質の 産生を決定した。上清を、HPLC（C1８逆相カラム、水／アセトニトリル／酢酸勾 配、ダイオードアレイUV検出）への20μLの注入によって6-メチルサリチル酸産 生について分析した。LCパラメーターは、以下のとおりである：溶媒Ａ＝水中１ ％酢酸；溶媒Ｂ＝アセトニトリル中１％酢酸；勾配=30分間で20％Ｂから80％Ｂ 、次いで２分間で100％；流速＝0.5ml/分。6-メチルサリチル酸の量を、307nm でのピーク積分によって定量した。標準曲線を、真正6-メチルサリチル酸を用い て作成した（Seidel,J.L.ら、J Chem Ecology(1990)16:1791-1816）。 代表的な実験の結果を図７に示す。コントロールプラスミド101cのみを含むか 、またはコントロールプラスミドおよびsfp発現プラスミド128aを含む酵母は、6 -MSAを産生しなかった（トレースｂ、ｄ）。6-MSAS発現ベクター102dのみを含む 酵母は、かろうじて検出可能な量の6-MSAを産生した（トレースｃ）。6-MSAS発 現ベクター102dおよびsfp発現ベクター128aの両方を含む酵母は、1.7g/lもの多 くの6-MSAを産生した（トレースａ）。 形質転換体についての酵母増殖および6-MSA産生の速度論を、図８Ａに示す。 示されるように、白四角は、OD600によって測定した増殖を示す。黒丸は、6-MSA の産生をg/Lで示す。6-MSAの産生は、グルコースが枯渇した場合、ADH2プロモー ターの抑制解除と一致して開始される。プラトーには、約60時間の増殖の後に達 し、そして150時間まで一定のままであった。 6-MSAの大規模調製のために、２つのプラスミドを保有する500mlの酵母培養物 を、120時間増殖させ、そして細胞を遠心分離によって除去した。上清ブロス（2 80ml）を、28mlの氷酢酸で酸性化し、次いで280mlの酢酸エチルで抽出した。有 機抽出物を、減圧下で乾燥するまで濃縮した。粗産物、水からの結晶化によって 精製し、そして結晶を、KOH上で減圧下で乾燥させた。6-MSAの同定を、NMRおよ び質量分析によって確認した。上記の特定の実験において、280mlの無細胞酵母 培養物は、針状結晶として240mｇの6-MSAを生じた。振盪フラスコ培養物は、代 表的には、１g/Lを越える6-メチルサリチル酸を産生した。実施例５ DEBS モジュール６KR-ACP-TE発現ベクター、プラスミド104の構築 プラスミド90（これは、T5プロモーター、２lacオペレーター、およびlacIq（ ？）を含む）を、pQE60（Qiagen）の1.1kbp XhoI/XbaIフラグメントを、pET22b( +)（Novagen）のより大きなXhoI/XbaIフラグメントに連結することによって構築 した。モジュール６KR-ACP-TEをコードするDNAを含むPstI/EcoRI制限フラグメン トを、プラスミド90に連結して、プラスミド104（このモジュールのための発 現ベクター）を得た。 実施例６ モジュール６KR-ACP-TEのホスホパントテン化 Ａ．インビボ： βアラニン栄養要求性株ESCherichia coli SJ16（E.coli Genetic Stock Cent er）を、104、および以下のいずれかについての遺伝子を含むホロACPシンターゼ 発現プラスミドで同時形質転換した： E,coli脂肪酸シンターゼホロACPS（ACPS）； E.coliエンテロバクチンシンテターゼホロACPS（EntD）、または Bacillus brevisグラミシジンシンテターゼホロACPS（GsP）。 ホロACPS発現プラスミドは、Dr.Daniel Santi，UCSFから寄贈された（Ku,J.ら 、Chemistry&Biology(1997)4:203-207）。 各同時形質転換体を、0.001％チアミン、0.01％メチオニン、および100μMβ- アラニンを補充した最小培地Ｅ（Vogel,H.J.ら、J Biol Chem(1956)218:97-106 ）において、37℃にて20時間増殖させた。細胞を遠心分離によって回収し、そし てβ-アラニンを含まない１mLの増殖培地で洗浄した。この洗浄を、４回反復し た。最後に、細胞をβ-アラニンを含まない１mLの増殖培地において、37℃にて ６時間インキュベートした。 飢餓細胞の30μLアリコートを、0.52μM[3H]-β-アラニン（１μCi、Amrican Radiolabeled Chemicals,Inc.）を補充した１mLの増殖培地に添加した。37℃に て６時間後、細胞を、１mMまでのIPTGの添加によって誘導し、37℃にてさらに３ 時間維持し、そして遠心分離した。細胞ペレットを、SDSゲルローディング緩衝 液において煮沸し、次いで10％SDS-PAGEゲルにおいて分析した。ゲルをCoomassi e Blueで染色し、写真撮影し、Amplify（Alnersham）に浸透させ、乾燥させ、そ してKodak Bio-MAXフィルムを用いて２日間オートラジオグラフした。 DEBSのモジュール6KR-ACP-TEフラグメントは、GsPおよびEntDとの同時発現に 基づいて効率的に標識され、一方、ACPとの同時発現に基づく標識は観察されな かった。ACPSがDEBSフラグメントを活性化し得ないのは、E.coliにおいて発現さ れる場合の、DEBSタンパク質のホスホパントテン化の公知の不活性および欠失に 基づくと考えられる（Robertsら、Eur J Blochem(1993)214:305-311）。 Ｂ．インビトロ：DEBSのモジュール６KR-ACP-TEフラグメントを、p104で形質 転換したE.coliから、Ni+2アフィニティーカラムを用いて、製造業者の説明書（ Invitrogen）に従って精製した。Bacillus subtilisから精製したサーファクチ ン（surfactin）シンテターゼホロACPS（sfp）は、Dr.Christopher Walsh（Harv ard Medical School）から寄贈された。標識化3H-補酵素Ａは、Dr.Daniel Santi （UCSF）から寄贈された。 全てのアッセイを、100μLの全用量中、10mMgCl2、50mM Tris-HCl（pH8.8）に おいて行い、そして40,00cpmの3H-補酵素Ａおよび0.39μM sfpを含んだ。ポジテ ィブコントロールは、グラミシジンシンテターゼ（Dr.Daniel Santi，UCSF）か らの1.8μM OheATドメインを含み、これは、通常、sfpによってパントテン化さ れる。反応を、37℃にて12時間維持し、次いでSDSゲルローディング緩衝液にお いて煮沸し、そして10％SDS-PAGEゲルにおいて分析した。ゲルを、Coomassie Bl ueで染色し、写真撮影し、Amplify（Amersham）に浸透させ、乾燥し、そしてKod ack Bio-MAXフィルムを用いて２時間オートラジオグラフした。 PheAT、およびDEBSのモジュール６KR-ACP-TEフラグメントの両方を、sfpによ って効率的に標識した。 実施例７ Escherichiacoli における6-メチルサリチル酸の産生 プラスミド90（実施例５を参照のこと）を、プラスミド90のEcoRI/HindIIIの 間にリンカーを挿入することによってp95に変換し、T5プロモーターに隣接する 制限部位NdeIおよびSpeIを導入した。6-MSAS発現ベクター109を、6-MSASオープ ンリーディングフレームを含むNdeI/XbaIフラグメント（Pfeifer,E.ら、Biochem istry(1995)347450-7459）を、ベクターのSpeIとHindIII部位との間の約1kbpの リンカーを残す95の大きなNdeI/SpeIフラグメントと連結することによって構築 した。 sfp発現ベクター108を、pUC-8sfpの1.1-kbp EcoRI/PvuII制限フラグメント （実施例３を参照のこと）を、DNAポリメラーゼIによるEcoRI部位の充填後にEco RVで切断したpACYC-184（New England Biolabs）に連結することによって作製し た。プロモーターに関するsfp遺伝子の方向を、HindIII消化によって検証した。 プラスミド108および109を、E.coli C2453に同時形質転換し、そして形質転換 体を、クロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性によって選択した。両方の プラスミドを含む単一のコロニーを、10％グリセロールを補充したATCC培地765 において、37℃にて、1.00D600の密度まで増殖させ、次いで30℃まで冷却し、そ して0.5mM IPTGの添加によって誘導した。細胞増殖を、30℃にて36時間続けた。 タンパク質発現を、10％SDS-ポリアクリルアミドゲルによってチェックした。6- メチルサリチル酸の形成後に、培養ブロスのHPLC分析を行った。 6-MSAの濃度を、実施例４に記載のように、基準サンプルを用いて、濃度対、 対応するHPLCピークの積分面積のプロットから評価した。産物の同定を、LC-質 量分析（これは、[M+H]+＝153を示す）によって、H2Oの欠失に対応するm/z＝135 で主要なフラグメントで確認した。これらの条件下で、培養物は、50mg/Lの6-メ チルサリチル酸を産生した。 E.coliにおける6-MSAの産生は、sfpタンパク質をコードするプラスミドの存在 に依存した。6-MSAS発現ベクター109のみで形質転換したE.coliは、IPTGによる 誘導に続いて、37℃にて４時間インキュベーションした場合、全タンパク質の約 ５％で約190kD 6-MSASの産生を示した。しかし、タンパク質のほとんどは不溶性 であり、そして6-MSAは、培地において検出されなかった。6-MSAS発現ベクター1 09を含むβ-アラニン栄養要求性株E.coli SJ16を、誘導の前および後に標識化β -アラニンとともにインキュベートした場合、SDS-PAGEにおける6-MSASバンドに おいて放射活性は見いだされなかった；従って、6-MSASは、内因性トランスフェ ラーゼによってホスホパントテニル補因子で改変されなかったようである。プラ スミド108および109の両方で同時形質転換したE.coli SJ16に関する同様の実験 において、検出可能な量の放射活性を、190kD 6-MSASバンドにおいて見いだした ；しかし、これらの条件下では、6-MSAは検出されなかった。しかし、インキュ ベーションの温度を低くして、適切なタンパク質の折り畳みを促進し、そしてグ リセロールを培地に添加して、細胞内マロニルCoA基質のレベルを増加させた 場合、6-MSAの産生が改良された。従って、細胞を、グリセロールの非存在下で3 0℃にて増加させるか、または10％グリセロールの存在下で37℃にて増殖させた 場合、6-MSAは産生されなかった。しかし、上記のように、10％グリセロールの 存在下で30℃にて増殖させた場合、インキュベーションの24時間後に、約75mg/L に達するまで6-MSAを産生した。産生の速度論を、図８Ｂに示す。 実施例８ Saccharomyces cerevesiae における PKS- ホロACPシンターゼ融合タンパク質を用いた6-メチルサリチル酸の産生 Penicillium patulum 6-メチルサリチル酸シンターゼ（6-MSAS）とBacillus s ubtilisサーファクチンホロACPシンターゼ（sfp）との間の融合タンパク質を、 以下のように作製した： 6-MSAS遺伝子（実施例１を参照のこと）を含む5.3-kbp NdeI/HindIIIフラグメ ントを、sfp遺伝子（実施例３を参照のこと）を含む708-bp HindIII/XbaIフラグ メント、およびNdeI/XbaI制限43d2（実施例１を参照のこと）と連結して、中間 体プラスミド69を産生した。69からの約６-kbp NotI/RsrII制限フラグメントを 、NotI/RsrII制限101c（実施例１を参照のこと）と連結して、酵母発現ベクター 26al（実施例１を参照のこと）を得た。このベクターは、ADH2プロモーター／タ ーミネーター対の間に6-MSAS/sfp融合遺伝子を含む。 得られた融合タンパク質は、（アラニン）3リンカーを用いて6-MSASのC-末端 リジンとsfpのN-末端メチオニンとの結合からなり、その結果融合の領域におけ る遺伝子のDNA配列は、以下であった： 5'-AAGCTTGCCAAA-GCCGCCGCC-ATGAAGATTTAC-3’ ここで、リジンおよびメチオニンコドンに下線を付す。 S.cerevesiae InvSc1の26a1での形質転換および実施例３に記載の培養は、別 々の遺伝子として6-MSASおよびsfpの発現から得られるものと匹敵するレベルで 、6-メチルサリチル酸の産生を生じた。従って、融合タンパク質は、6-MSASおよ びsfpの酵素活性を組合せ、自己ホスホパントテン化し、そしてポリケチド産物 を産生する。 このことは、発現ベクターに使用可能なプラスミドレプリコンの数が制限され る場合、ポリシストロン性メッセージが適切にプロセシングされない場合、また は多重ベクターでの形質転換が困難および／もしくは時間のかかる場合、宿主の 形質転換に特に有用である。 実施例９ 染色体組み込みを用いる、Streptomyces lividansにおける 混合染色体／プラスミド発現系による 6- デオキシエリスロノリドの産生 染色体とプラスミド発現系との間の３つのDEBS遺伝子を分割する実現可能性を 実証するために、２つの実験を行った。両方の実験において、組み込みベクター pSET152（Bierman,Mら、Gene(1992)116:43-49）を使用して、DEBS遺伝子クラス ターの１つの遺伝子を、アクチノロジンプロモーターの制御下で、Streptomyces 染色体に、ファージ付着部位で配置した。残りの遺伝子を、複製プラスミドpRM5 （McDanielら、Science(1993)262:1546−1550）に、アクチノロジンプロモータ ーの制御下で配置した。 Ａ．eryAIII遺伝子（モジュール５および６ならびにDEBSのチオエステラーゼ をコードする）を、アクチノロジンプロモーターの制御下で、pSETl52にクロー ン化した。得られるベクターを使用して、S.lividans K4−114（アクチノロジン 遺伝子が、標準的な方法による同種組換えによって欠失されている株）を形質転 換した（米国特許出願08/238,811、本明細書中で参考として援用する）。アプラ マイシン耐性形質転換体を選択した。 発現プラスミドを、２つの遺伝子は、アクチノロジンプロモーターの制御下で あるように、eryAIおよびeryAII遺伝子（それぞれ、モジュール１＋２および３ ＋４を含む）をpRM5のPacI/EcoRI部位にクローン化することによって構築する。 このプラスミドを使用して、組み込みeryAIII遺伝子を含むS.lividansクローン のプロトプラストを形質転換し、そしてチオストレプトンおよびアプラマイシン の両方に耐性であるコロニーを選択した。 Ｂ．あるいは、アクチノロジンプロモーターおよびeryAI遺伝子を、pSET152に クローン化して、続いてS.lividans染色体に組み込んだ。eryAIIおよびeryAIII 遺伝子を、アクチノロジンプロモーターの後ろのpRM5にクローン化し、そしてこ のプラスミドを使用して、組み込みeryAI遺伝子を含むS.lividans株を形質転換 した。 混合染色体-プラスミド発現系を含む上記の生物のランダムに選択したコロニ ーを、XAD-16樹脂上でR2YE培地において培養し、そして７日後に回収した樹脂の エタノール抽出物を、6-デオキシエリスロノリドＢの産生について、LC/質量分 析によって分析した。実験ＡおよびＢの両方からの培養物は、pCK7（アクチノロ ジンプロモーターの制御下で全ての３つのeryA遺伝子を含む複製プラスミド）を 含むS.lividansの培養物の抽出物に見いだされるものに匹敵する15〜20mg/Lのレ ベルで、6-デオキシエリスロノリドＢを産生した。 実施例10 Streptomyces lividans における 混合染色体／プラスミド発現系による 6- デオキシエリスロノリドＢの産生 多重遺伝子PKSについての混合染色体-プラスミド発現系を構築するための別の 方法はまた、ポリケチド産生のための純粋な宿主の同時作製を達成する。適切な 発現宿主（これは、通常、ポリケチド産物を産生する）は、同種組換えを介して 外来PKS遺伝子のサブセットによって置換された染色体PKS遺伝子を有する。この ことは、外来PKS遺伝子の所望の染色体組み込みを達成し、一方、天然のPKSから の妨害および競合を同時に排除する。実施例は、S.coelicolorおよびS.lividans （その両方が、ブルーポリケチドアクチノロジンを作製する）について容易に説 明される。 全体のアクチノロジン遺伝子クラスターがこれらの生物から除去され、そして 同種組換えを介して抗生物質マーカーと置換される方法が記載されている（米国 特許出願08/238,811）。この方法を、以下のように順応させる：組換えベクター は、以下のエレメントを含む一本鎖DNAを作製し得る任意のベクター（例えばpBl ueScript）からなる：１）作用クラスターの5’1-kbp末端に相同なDNA配列； ２）耐性マーカー（例えば、ハイグロマイシンまたはチオストレプトン）；３） 作用II-orfアクチベーター遺伝子；４）作用プロモーター；５）１つ以上の外来 PKS遺伝子；および６）作用クラスターの3’1-kbp末端に相同なDNA配列。S.coel icolorまたはS.lividansの組換えベクターでの形質転換、続くハイグロマイシン 耐性についての選択、および青色の欠失についてのスクリーニングは、アクチノ ロジン遺伝子クラスターを欠き、そして必要とされるアクチノロジン制御エレメ ントとともに外来PKS遺伝子の染色体コピーを含む宿主を提供する。この宿主は 、続いて、複製ベクター（例えば、SCP2*ベースのプラスミド）によって、そし て／または外来PKSの他の遺伝子を含むファージベクター（例えば、pSET152）と 形質転換されて、PKS遺伝子のセットを完全にし、そしてポリケチド産物を産生 する。 実施例11 芳香族最低限PKSの発現のための酵母ベクターの構築 KS/AT二機能性タンパク質をコードする遺伝子およびアクチノロジンPKSのCLF 遺伝子（図５に図示する）を、PCRによって増幅して改変し、そしてそれぞれGal 1およびGal10プロモーターの制御下で、酵母発現ベクターpYEUra3（Clontech） にクローン化する。ACP遺伝子を増幅し、そしてホロACPシンターゼ遺伝子ととも に、必要であれば、Ura3遺伝子のLeu2-d遺伝子との置換によって、pYEUra3に由 来するプラスミドにクローン化する。発現もまた、それぞれ、Gal1およびGal10 プロモーターによって駆動される。酵母株BJ2168を、これらのプラスミドおよび プラスミド128a（実施例３を参照のこと）で同時形質転換し、そして形質転換体 を、標準的な方法によって、ウラシルおよびロイシン欠乏プレートにおいて選択 した。発現を、製造業者の説明書に従って、２％ガラクトースにおける増殖によ って誘導する。このシンターゼ系によって産生されたポリケチドは、以下のよう に予測される： 実施例12 モジュール性シンターゼ活性の発現のための酵母ベクターの構築 ２つのベクターを構築する。１つは、ADH-2プロモーターの制御下で、エリス ロマイシンPKSのチオエステラーゼドメインと同一直線上に、スピラマイシンの 推定２モジュール系を含む。コード配列構築物を操作して、コドン開始部位でNd eI部位および終止コドンに続いてNsiI部位に隣接させる；この構築物を、合成オ リゴヌクレオチドリンカーを用いて、pYTにクローン化する。 第２ベクターにおいて、Kao,C．ら、J Am Chem Soc(1995)117:9105-9106によ って記載されるような、NdeIおよびNsiI部位に隣接するエリスロマイシンPKS系 からの類似構造を、pYTにクローン化して、ADH-2プロモーターの制御下に置く。 図９は、これらのベクターの関連発現部分および予測されるポリケチド産物を示 す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 アシュレー，ゲイリー ダブリュー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94502, アラメダ，ベルデマール ドライブ 1102 (72)発明者 ツィールマン，ライナー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94403, サン マテオ，レオナ ストリート 3908

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．非改変形態において、ポリケチドを産生しない、改変された組換え宿主細胞 であって、該細胞が、最低限のポリケチドシンターゼ（PKS）のための発現系、 およびホロACPシンターゼのための発現系を含むように改変され、 該最低限のPKSが、ケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（KS/AT）触媒 領域、鎖長因子（CLF）触媒領域、および芳香族PKSに対するアシルキャリアタン パク質（ACP）活性を含むか：あるいは 該最低限のPKSが、KS触媒領域、AT触媒領域、およびモジュール性PKSまたは真 菌PKSに対するACP活性を含む、 改変された組換え宿主細胞。 ２．E.coliまたは酵母である、請求項１に記載の改変された細胞。 ３．前記PKSが、6-メチルサリチル酸についてのシンターゼである、請求項１に 記載の改変された細胞。 ４．前記ホロACPシンターゼをコードするヌクレオチド配列および前記最低限のP KSの部分の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列が、融合タンパク質を コードするように融合される、請求項１に記載の改変された細胞。 ５．前記最低限のPKSのための発現系および前記ホロACPシンターゼのための発現 系が、別々のベクターに存在する、請求項１に記載の改変された細胞。 ６．前記発現系の少なくとも１つが、宿主細胞染色体に組み込まれる、請求項１ に記載の改変された細胞。 ７．ポリケチドを産生するための方法であって、前記発現系がコードタンパク質 を産生し、そして該ポリケチドが合成される条件下で請求項１の細胞を培養する 工程を包含する、方法。 ８．以下： a）少なくとも２つのベクターであって、該第１ベクターが、第１選択マーカ ーおよび第１発現系を含み、そして該第２ベクターが、第２選択マーカーおよび 第２発現系を含み、そして必要に応じてさらなるベクターが、さらなる選択マー カーおよび発現系を含み、該ベクターにおいて含まれる発現系が、少なくとも１ つの最低限のポリケチドシンターゼ（PKS）を産生するのに有効である、少なく とも２つのベクター；または b）少なくとも１つのベクターおよび改変された染色体であって、該１つのベ クターが、第１選択マーカーおよび第１発現系を含み、そして該改変された染色 体が、第２発現系を含み、そして必要に応じてさらなるベクターが、さらなる選 択マーカーおよび発現系を含み、該ベクターにおいて含まれる発現系が、該染色 体上の該発現系と組み合わせて、少なくとも最低限のポリケチドシンターゼ（PK S）を産生するのに有効である、少なくとも１つのベクターおよび改変された染 色体 のいずれかを含むように改変された、組換え宿主細胞であって、 該最低限のPKSは、ケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（KS/AT）触媒 領域、鎖長因子（CLF）触媒領域、および芳香族PKSについてのアシルキャリアタ ンパク質（ACP）活性を含むか：あるいは 該最低限のPKSは、KS触媒領域、AT触媒領域、およびモジュール性PKSまたは真 菌PKSについてのACP活性を含む、 組換え宿主細胞。 ９．酵母細胞、E.coli細胞、放線菌、または植物細胞である、請求項８に記載の 細胞。 １０．機能的ポリケチドについての細胞ベースの検出系のための発現系をさらに 含む、請求項８に記載の細胞。 １１．少なくとも最低限の芳香族PKSを産生する、請求項８に記載の細胞であっ て： （a）第１選択マーカー、および該細胞において作動可能なプロモーターに作 動可能に連結されたKS/AT触媒領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現系 を含む第１ベクター： （b）第２選択マーカー、および該細胞において作動可能なプロモーターに作 動可能に連結されたCLF触媒領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現系を 含む第２ベクター；ならびに （c）第３選択マーカー、および該細胞において作動可能なプロモーターに作 動可能に連結されたACP活性をコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含む 第３ベクター、 を含む細胞。 １２．少なくとも１つの最低限のモジュール性PKSを産生する、請求項８に記載 の細胞であって： （a）第１選択マーカー、および該細胞において作動可能なプロモーターに作 動可能に連結されたポリケチドシンターゼ（PKS）の少なくとも１つのモジュー ルのための発現系を含む第１ベクター；ならびに （b）第２選択マーカー、および該細胞において作動可能なプロモーターに作 動可能に連結されたポリケチドシンターゼの第２モジュールを少なくともコード するヌクレオチド配列を含む第２ベクター、 を含む、細胞。 １３．前記第１モジュールおよび第２モジュールが、異なるポリケチドシンター ゼに由来する、請求項１２に記載の細胞。 １４．前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、KR活 性をコードするヌクレオチド配列をさらに含むか；または 前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、KRおよび DH活性をコードするか；または 前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、KR活性、 DH活性、およびER活性をコードし；ならびに／または 前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、チオエス テラーゼ（TE）活性をコードする、 請求項１３に記載の細胞。 １５．ポリケチドを産生するための方法であって、該発現系がコードタンパク質 を産生しそして該ポリケチドが合成される条件下で、請求項８の細胞を培養する 工程を包含する、方法。 １６．ホロACPシンターゼのための組換え発現系を含むようにさらに改変されて いる、請求項８の細胞。 １７．ポリケチドを産生するための方法であって、該発現系がコードタンパク質 を産生しそして該ポリケチドが合成される条件下で、請求項１６の細胞を培養 する工程を包含する、方法。 １８．個々のコロニーのパネルを含むポリケチドシンターゼPKSまたは合成され たポリケチドのライブラリーであって、各コロニーが、以下： a）少なくとも２つのベクターであって、該第１ベクターは、第１選択マーカ ーおよび第１発現系を含み、そして該第２ベクターは、第２選択マーカーおよび 第２発現系を含み、そして必要に応じてさらなるベクターは、さらなる選択マー カーおよび発現系を含み、該ベクターにおいて含まれる発現系は、少なくとも最 低限のポリケチドシンターゼ（PKS）を産生するのに有効である、少なくとも２ つのベクター；あるいは b）少なくとも１つのベクターおよび改変された染色体であって、該１つのベ クターは、第１選択マーカーおよび第１発現系を含み、そして該改変された染色 体は、第２発現系を含み、そして必要に応じてさらなるベクターは、さらなる選 択マーカーおよび発現系を含み該ベクターにおいて含まれる発現系が、該染色体 上の該発現系と組み合わせて、少なくとも最低限のポリケチドシンターゼ（PKS ）を産生するのに有効である、少なくとも１つのベクターおよび改変された染色 体、 のいずれかを含み、 該最低限のPKSが、ケトシンターゼ／アシルトランスフェラーゼ（KS/AT）触媒 領域、鎖長因子（CLF）触媒領域、および芳香族PKSについてのアシルキャリアタ ンパク質（ACP）活性を含み：ならびに 該最低限のPKSが、KS触媒領域、AT触媒領域、およびモジュール性PKSまたは真 菌PKSについてのACP活性を含み、 ここで、ベクターの組合せ、またはベクターと改変された染色体との該組合せ が、各コロニーにおいて異なる、ライブラリー。 １９．前記コロニーが、酵母、E.coli、放線菌、または植物細胞のコロニーであ る、請求項１８に記載のライブラリー。 ２０．前記各コロニーが、さらに、機能的ポリケチドについての細胞ベースの検 出系のための発現系を含む、請求項１８に記載のライブラリー。 ２１．前記PKSが芳香族PKSであり、そして各コロニーが： （a）第１選択マーカー、および前記細胞において作動可能なプロモーターに 作動可能に連結するKS/AT触媒領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現系 を含む第１ベクター； （b）第２選択マーカー、および前記細胞において作動可能なプロモーターに 作動可能に連結されたCLF触媒領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現系 を含む第２ベクター； （c）第３選択マーカー、および前記細胞において作動可能なプロモーターに 作動可能に連結されたACP活性をコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含 む第３ベクター； を含み、 ここで該第１、第２、および第３ベクターの組合せが各コロニーにおいて異な る、請求項１８に記載のライブラリー。 ２２．前記PKSがモジュール性PKSであり、ここで各コロニーが、 第１選択マーカー、および前記細胞において作動可能なプロモーターに作動可 能に連結されるPKSの少なくとも１つのモジュールのための発現を含む第１ベク ター；ならびに 第２選択マーカー、および前記細胞において作動可能なプロモーターに作動可 能に連結されたポリケチドシンターゼの第２モジュールを少なくともコードする ヌクレオチド配列を含む第２ベクター、 を含み、 ここで該第１、および第２ベクターの組合せが各コロニーにおいて異なる、請 求項１８に記載のライブラリー。 ２３．前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、KR活 性をコードするヌクレオチド配列をさらに含むか；または 前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、KRおよび DH活性をコードするか；または 前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、KR、DH、 およびER活性をコードし；および／または 前記少なくとも１つのモジュールをコードするヌクレオチド配列が、チオエス テラーゼ（TE）活性をコードする、請求項２２に記載のライブラリー。 ２４．前記各コロニーが、ホロACPシンターゼのための組換え発現系をさらに含 む、請求項１８に記載のライブラリー。 ２５．ポリケチドのライブラリーを産生するための方法であって、前記発現系が コードタンパク質を産生しそして前記ポリケチドが合成される条件下で、請求項 １８に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。 ２６．ポリケチドのライブラリーを産生するための方法であって、前記発現系が コードタンパク質を産生しそして前記ポリケチドが合成される条件下で、請求項 ２４に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。 ２７．標的レセプターに結合するポリケチドを同定するための方法であって、該 レセプターへの結合が検出され得る条件下で、該レセプターを請求項１８に記載 のライブラリーの各メンバーと接触させる工程；および 各メンバーに関する該レセプターへの結合の存在または非存在を検出し、それ によりレセプターに結合するメンバーが同定される工程、 を包含する、方法。 ２８．標的レセプターに結合するポリケチドを同定するための方法であって、該 レセプターへの結合が検出され得る条件下で、該レセプターを請求項２４に記載 のライブラリーの各メンバーと接触させる工程；および 各メンバーに関する該レセプターへの結合の存在または非存在を検出し、それ によりレセプターに結合するメンバーが同定される工程、 を包含する、方法。 ２９．細胞ベースの検出系において機能的なポリケチドを同定するための方法で あって、該細胞ベースの検出系のシグナルの存在または非存在について、請求項 １８に記載のライブラリーの各メンバーを評価し、それにより機能的ポリケチド が同定される工程を包含する、方法。 ３０．酵母における発現に適応させたベクターであって、酵母において作動可能 な選択マーカー、および酵母において作動可能なプロモーターに作動可能に連結 される少なくとも１つの機能的ポリケチドシンターゼ触媒活性のコード領域を含 む発現系、を含むベクター。 ３１．請求項３０に記載のベクターを含むように改変された酵母細胞。 ３２．ホロACPシンターゼのための組換え発現系をさらに含む、請求項３１に記 載の酵母細胞。 ３３．ポリケチドシンターゼ活性を産生する方法であって、発現が支持される条 件下で、請求項３１に記載の酵母細胞を培養する工程を包含する、方法。 ３４．ポリケチドシンターゼ活性を産生する方法であって、発現が支持される条 件下で、請求項３２に記載の酵母細胞を培養する工程を包含する、方法。 ３５．E.coliにおける発現に適応させたベクターであって、E.coliにおいて作動 可能な選択マーカー、およびE.coliにおいて作動可能なプロモーターに作動可能 に連結された少なくとも１つの機能的ポリケチドシンターゼ触媒活性のコード領 域を含む発現系、を含むベクター。 ３６．請求項３５のベクターを含むように改変されたE.coli細胞。 ３７．ホロACPシンターゼのための組換え発現系をさらに含む、請求項３６に記 載のE.coli細胞。 ３８．ポリケチドシンターゼ活性を産生する方法であって、発現が支持される条 件下で、請求項３６に記載のE.coli細胞を培養する工程を包含する、方法。 ３９．ポリケチドシンターゼ活性を産生する方法であって、発現が支持される条 件下で、請求項３７に記載のE.coli細胞を培養する工程を包含する、方法。
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