JP2014513737A

JP2014513737A - 架橋ポリ−ε−リシン粒子

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Publication number: JP2014513737A
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Inventors: ウェリングス，ドナルド
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Abstract

本発明は、架橋ポリ−ε−リシンポリマーを提供する。ポリ−ε−リシンと架橋剤とはアミド結合によって連結され、架橋剤は、ポリ−ε−リシンのアルファ炭素アミンと反応することができる少なくとも２つの官能基を有する。該ポリマーは、水および他の溶媒に適切に不溶性であり、粒状の形状で提供される。本発明は、架橋ポリ−ε−リシンポリマーを含む粒状支持体を提供し、該ポリマーが、粒子自体を提供してもよいし、または粒子、例えばシリカ上にコーティングされていてもよい。該ポリマーは、広範な用途、例えば、創傷治療、粒状支持体および支持体に結合されたまたは保持される機能材料を含む医学的診断薬、ならびにペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖の固相合成、種の固定化、細胞培養、ならびにクロマトグラフ分離において有用である。

Description

本発明は、ポリマー支持体、該支持体を調製する方法、および固相プロセスにおける該支持体の使用に関する。特に、本発明は、架橋ポリ−ε−リシンを含むポリマー支持体に関する。該支持体は、広範な物理的および化学的プロセス、とりわけ基質との相互作用が必要とされるプロセス、例えば、固相合成、固相抽出、固相試薬、種の固定化、細胞培養、触媒反応、クロマトグラフィーにおいて、ならびに医学的診断薬（ｍｅｄｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）において有用である。

ポリ−ε−リシンは、天然に存在する多分散の短鎖ポリアミドであり、カルボキシル基とイプシロン（ε）アミノ基との間のアミド結合を介して連結したアミノ酸リシンから構成される。この構造は、アミド結合がリシンのカルボキシル基とεアミノ基との間で形成されるという点で普通ではなく、それに対し、従来よりポリ−リシンに採用される、ペプチド中のアミノ酸の間の普通のペプチド結合は、カルボキシル基とαアミノ基との間で形成される。天然に存在するポリ−ε−リシンの多分散性は、通常はアミノ酸２５〜３５個の間である。市販される従来のポリ−リシンでは、ペプチドはそれよりはるかに広い不十分に制御された多分散性を有し、通常はアミノ酸５〜５００個からなるものを何でも含有する。

架橋ポリ−ε−リシンは、アミド結合の間の鎖長が長いために構造的に従来のポリ−リシンより弾力性がある。構造的に、ポリ−ε−リシンは実質的にα−アミノナイロン５である。

ポリ−ε−リシンは現在、食品保存料として細菌発酵によって大規模に製造されている。それは高価ではなく、商業的量で容易に入手できる。本発明において、本発明人らは、ポリ−ε−リシンを架橋して幅広い技術にわたる用途を有する不溶性のポリマー支持体を形成することについて記述する。こうした用途には、それだけには限らないが、固相ペプチド合成、固相オリゴヌクレオチド合成、固相抽出、固相試薬、種の固定化、細胞培養、触媒反応、クロマトグラフィー、農薬の持続放出および医薬品の持続放出、創傷ケア、再生医療ならびに医学的診断薬が含まれる。

固体支持体材料が固相合成プロセスに有用であることは公知である。例として、有機分子、特にペプチドおよびオリゴヌクレオチドの合成、種の固定化、触媒の担持、イオン交換、材料からの種の抽出、診断薬およびクロマトグラフィーを含めた広範な物理的および化学的プロセスが、固体支持体材料を採用する。

通常、有機分子の多段階合成は、次のステージに進む前に、各ステージで生成される中間体を分離する数多くの単離ステップを含む。これらのプロセスは、時間や費用がかかることが多く、また収率の点で不十分なことがある。中間体は、精製されて過剰な試薬および反応副生成物を除去することが必要とされることが多く、沈殿、濾過、二相溶媒抽出、固相抽出、結晶化およびクロマトグラフィーなどの操作が採用されることがある。

固相合成には、液相合成に優る幾つかの利点がある。例えば、標的分子を固体支持体に可逆的に付着（ａｔｔａｃｈ）させることによって、液相合成に使用される単離操作をある程度回避することができる。過剰な試薬および副生成物の一部は、固体支持体の濾過および洗浄によって除去することができる。あるプロセスでは、標的分子を実質的に定量的収率で回収することができ、それは液相合成では通常特に困難である。加えて、固体支持体上で操作を行うのに必要な時間は、通常、液相合成で同等の段階を実行するのに必要な時間よりはるかに少ない。

幅広いプロセスにおける種の固定化も公知である。例えば、ポリマー支持体は、化学触媒反応および生体触媒反応を含めた従来の有機化学で使用する触媒の固定化に汎用される。固定化酵素は、有機化学反応を実行するためにまたはキラル分割のために採用することができ、例えば、第二級アルコールを分割するために固定化ペニシリンアミダーゼが使用され（Ｅ．Ｂａｌｄａｒｏら、Ｔｅｔ．Ａｓｙｍ．４、１０３１、（１９９３）、また固定化ペニシリンＧアミダーゼも、アモキシシリンの製造においてベンジルペニシリンの加水分解に使用される（Ｃａｒｌｅｙｓｍｉｔｈ、Ｓ．Ｗ．ａｎｄＬｉｌｌｙ、Ｍ．Ｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、２１、１０５７〜７３、１９７９）。

固体支持体は、医療および診断用途のために生体巨大分子を固定化するのにも使用される。これには、タンパク質、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の固定化が含まれる。細胞培養は一般に、特異的な表面特性および形態を有する固体支持体上で行われる。支持体上の固定化酵素を、シグナルを発生するセンサーとして採用することもできる。一例は、グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ結合酵素系によるグルコースの検出であり、ここでは、グルコースが存在すると過酸化水素が発生し、それはペルオキシダーゼの基質であり、ペルオキシダーゼは多種多様な基質を酸化して着色、蛍光または発光シグナルをもたらす。

その蛍光が特定のカチオンまたはアニオンに感応する様々な蛍光体を利用して、ｐＨ測定のための水素イオンなどの特定のイオンの濃度を示すことができる。

ポリマー粒子は、クロマトグラフィーで使用されることが多く、この場合、固体支持体は固定相と呼ばれる。クロマトグラフィーのある様式では、固定相の費用が制限的なことがある。他の様式では、固定相の物理的性質によって技術の有効性が低下することがある。例えば、アフィニティー、イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーにおいてよく使用される軟質ポリマーは、粒子の変形しやすい性質のために、高流量で使用することができない。他の多くの様式のクロマトグラフィーで使用される硬質のマクロポーラスポリマーは、機械的に脆弱である場合が多く、後で短寿命を来すことがある。

クロマトグラフ分離における固体支持体または固定相の用途は、例えば、製薬およびバイオテクノロジー産業で使用される複雑で技術的に高度な分離、および鉱業で使用されるより大規模なプロセスなど、極めて範囲が広い。製薬産業で最も価値が高い薬物の中には分取クロマトグラフィーによって精製されるものもあり、クロマトグラフ分離の向上は、技術的に有益であり、かつ経済的に有利であろう。鉱業および貴金属回収業では、世界の大部分のパラジウム、すなわち触媒コンバーターおよび高価値製品の製造などの広範な工業的用途およびプロセスに不可欠な成分は、固定化クラウンエーテルを使用して精錬することができる（Ｔｒａｃｚｙｋ、Ｆ．Ｐ．；Ｂｒｕｅｎｉｎｇ、Ｒ．Ｌ．；Ｉｚａｔｔ、Ｎ．Ｅ．「ＴｈｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＲＴ）ｆｏｒＲｅｍｏｖａｌａｎｄＲｅｃｏｖｅｒｙｏｆＭｅｔａｌＩｏｎｓｆｒｏｍＡｑｕｅｏｕｓＳｏｌｕｔｉｏｎｓ」；ＩｎＦｏｒｔｓｃｈｒｉｔｔｅｉｎｄｅｒＨｙｄｒｏｍｅｔａｌｌｕｒｇｉｅ；１９９８、Ｖｏｒｔｒａｇｅｂｅｉｍ３４．ＭｅｔａｌｌｕｒｇｉｓｃｈｅｎＳｅｍｉｎａｒｄｅｓＦａｃｈａｕｓｓｃｈｕｓｓｅｓｆｕｅｒＭｅｔａｌｌｕｒｇｉｓｃｈｅＡｕｓ−ｕｎｄＷｅｉｔｅｒｂｉｌｄｕｎｇｄｅｒＧＤＭＢ；１８〜２０Ｎｏｖｅｍｂｅｒ１９９８；Ｇｏｓｌａｒ）。

固相抽出および固相試薬の調製におけるポリマー粒子の使用も、化学、製薬およびバイオテクノロジー産業で公知である。

公知の固相支持体は、一般に、用途に適した特定のサイズおよび物理的性質のポリマー粒子を含む。使い勝手を良くするために、こうしたポリマー粒子は、球状で、定められた粒径分布を有することが多い。粒子の球状の性質により、ポリマーの流動性および濾過特性が向上する。固体支持体の使用には、操作上の利点があるが、固相手法にとって不利な点がある。

ペプチド合成では、伸長するペプチドを担持するポリマー支持体としてポリスチレンが広く採用され、それは、比較的安価で、広く入手可能であり、ペプチド合成において許容可能な性能を与える。ペプチドおよびオリゴヌクレオチドの固相合成に汎用される他の市販の支持体は、例えば複雑な製造プロセスのために高価なことがある。一般的に、ミクロポーラスポリマーおよびマクロポーラスポリマーが使用される。ミクロポーラスポリマーは、比較的低レベルの架橋剤を有し、それによってポリマー粒子は適切な溶媒中で溶媒和し、結果的に膨潤することが可能である。マクロポーラスポリマーは、大抵の場合、ポリマーマトリクスに高レベルの架橋剤を有し、大きな細孔を含有する。こうしたポリマー粒子は一般的に硬質であり、良好な流動性を有し、充填カラムでの使用に適している。

広範な用途における支持体としての使用に適切な、代替のまたは向上した、費用効果の高いポリマーを見出すことが依然として必要である。架橋ポリ−ε−リシンポリマーは、特性の組み合わせに優れており、適正な架橋剤を選択することによって所望の特性に従って適合させることができ、広範な用途に費用効果的に採用することができることを、本発明者らは今や見出した。

Ｅ．Ｂａｌｄａｒｏら、Ｔｅｔ．Ａｓｙｍ．４、１０３１、（１９９３）Ｃａｒｌｅｙｓｍｉｔｈ、Ｓ．Ｗ．ａｎｄＬｉｌｌｙ、Ｍ．Ｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、２１、１０５７〜７３、１９７９Ｔｒａｃｚｙｋ、Ｆ．Ｐ．；Ｂｒｕｅｎｉｎｇ、Ｒ．Ｌ．；Ｉｚａｔｔ、Ｎ．Ｅ．「ＴｈｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＲＴ）ｆｏｒＲｅｍｏｖａｌａｎｄＲｅｃｏｖｅｒｙｏｆＭｅｔａｌＩｏｎｓｆｒｏｍＡｑｕｅｏｕｓＳｏｌｕｔｉｏｎｓ」；ＩｎＦｏｒｔｓｃｈｒｉｔｔｅｉｎｄｅｒＨｙｄｒｏｍｅｔａｌｌｕｒｇｉｅ；１９９８、Ｖｏｒｔｒａｇｅｂｅｉｍ３４．ＭｅｔａｌｌｕｒｇｉｓｃｈｅｎＳｅｍｉｎａｒｄｅｓＦａｃｈａｕｓｓｃｈｕｓｓｅｓｆｕｅｒＭｅｔａｌｌｕｒｇｉｓｃｈｅＡｕｓ−ｕｎｄＷｅｉｔｅｒｂｉｌｄｕｎｇｄｅｒＧＤＭＢ；１８〜２０Ｎｏｖｅｍｂｅｒ１９９８；Ｇｏｓｌａｒ

第１の態様では、本発明は架橋ポリ−ε−リシンポリマーを提供する。

架橋ポリ−ε−リシンポリマーは、広範な用途のための支持体の提供において、とりわけ架橋が水および他の溶媒に不溶性であるポリマーをもたらす場合に、特に有用である。比較的低レベルの架橋が採用される場合、ポリマーは水溶性であることができ、これにより以下に記述する通りのある種の用途に利点がもたらされる。適切には、ポリマーは、アミド結合で連結された、ポリ−ε−リシンと架橋剤とを含む。

ポリマーは、例えば、シート、物品、繊維などの非粒子のマクロ形状を含めた任意の適切な形状であっても、または粒状の形状であってもよい。

架橋ポリ−ε−リシンのポリ−ε−リシン成分は、架橋ポリマーの主成分である。架橋剤は、ポリ−ε−リシンポリマーを互いに結び付けるように作用して、ポリ−ε−リシンポリマーが幅広い用途（それには、有機分子、例えばポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどの合成のための支持体、クロマトグラフィー、本明細書で以下に記述する通りの機能材料用の支持体としての使用が含まれる）で使用するための構造体、例えば格子などをもたらすようにする。

ポリ−ε−リシンポリマー中の遊離アルファ（α）アミノ基と反応することができる、少なくとも２つの官能基、好ましくは２つ以上のカルボン酸基を有する架橋剤と反応することによって、ポリ−ε−リシンポリマーは適切に架橋される。架橋剤は、３つ以上の官能基を有して、同数のポリ−ε−リシンポリマー鎖と連結してもよいし、またはそれより少ない鎖と連結してもよいが、１つまたは複数のかかる鎖と複数の結合を有する。架橋剤は、架橋反応に関与せず、架橋ポリマーを使用する間に他の種と反応させるために利用可能のまま残される、他の官能基を含有してもよい。

ポリマー支持体における架橋のレベルを使用して、最終的な架橋ポリ−ε−リシンの物理的形状および化学反応性を制御することができる。高レベルの架橋を導入すれば、マクロポーラスポリマー支持体の調製に適した硬質の構造体が生成され、それに対して、低レベルの架橋であれば、より軟質でよりミクロポーラスの材料が生成される。低レベルの架橋ではアミン官能性が高く、それはキャッピングの制御によって容易に適合させることができる。扱い、溶媒和および物理的特性も、導入する架橋剤のタイプによって定めることができる。

適切には、架橋剤は特定の化合物または化合物群を含む。架橋剤は反復単位を含んでもよく、また多分散系であってもよいが、多分散性は、架橋時に形成される格子構造の適正な制御が確保されるように狭くする。架橋剤は、ポリ−ε−リシンのアルファ炭素アミンと反応することができる少なくとも２つの官能基を含む。この目的に適した一般的な官能基の例には、カルボン酸が含まれる。

アミド結合は生分解性であり、本発明の架橋ポリマーおよびそれを含む支持体は、生分解性が重要な用途でとりわけ有用である。さらに、アミド結合は、生分解性であるだけでなく、例えばプロテアーゼなど酵素によって代謝することができ、医療用途で使用するのに特に有利であり、とりわけヒトまたは動物の体表または体内での医学的使用に有利である。ポリマーまたは支持体が経時的に適切に分解し、それによってその機能が完了した後で支持体を除去する操作が不要となるような医療用途に、本発明のポリマーおよび支持体は利益をもたらす。

とりわけ好ましい実施形態では、架橋剤とポリ−ε−リシンとの間の結合はアミド結合を含み、好ましくは少なくともイプシロンアミン基の１％が架橋され、より好ましくは少なくとも５０％、望ましくは少なくとも９０％、とりわけ実質的に結合のすべてがアミド結合である。

さらに好ましい実施形態では、ポリマーは軽く架橋され、イプシロンアミン基の１から５０％まで、１から２０％まで、１から１０％までが架橋される。本発明の軽く架橋されたポリマーおよび支持体は、有機種、例えばペプチドおよびヌクレオチド配列の合成、および活性な種、例えば薬学的に活性な薬剤の送達にとりわけ有用である。

したがって、好ましい実施形態では、架橋剤は、２つ以上のカルボン酸基と、２つ以上の基を連結する脂肪族鎖とを含む。架橋剤はポリ酸を含んでもよい。好ましい実施形態では、架橋剤は、式Ｘ［ＣＯ_２Ｈ］_ｎの化合物を含み、式中、ｎは２以上、好ましくは２から６、より好ましくは２から４であり、Ｘは疎水性または親水性の連結基であり、好ましくは脂肪族である。適切には、基Ｘは、連結基上の官能性置換基をすべて除いて、分子量１４から２５０、より好ましくは２８から１４０を有する。

Ｘは、ヘテロ原子、例えば酸素および窒素を、連結基の主鎖の一部として含有してもよく、また架橋ポリ−ε−リシンポリマーを使用する間に他の種と反応させるための官能基を含有してもよい。

酸基を連結する脂肪族鎖は、親水性であってもよく、好ましくはビス−カルボキシ−ポリアルキレングリコール、例えばビス−カルボキシ−ポリエチレングリコールであってもよく、または脂肪族鎖は疎水性であって、疎水性架橋剤をもたらしてもよく、例えば、セバシン酸はより親油性の支持体をもたらす。架橋剤は、前駆体材料、例えば無水物から誘導されてもよい。他の適切な架橋剤の例には、ニトリロ三酢酸、グルタル酸およびＨＯＯＣＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨが含まれる。適切には、架橋剤はその溶媒和特性に従って選択され、ポリ−ε−リシンポリマーとの反応時に、ポリマーと架橋剤とが架橋剤用溶媒を含む分散相内に含有され、ポリ−ε−リシンが不混和性の連続相内であるようにする。

好ましい実施形態では、Ｘは炭化水素基を含み、水素原子および炭素原子のみを含み、好ましくは炭素原子２から１４個、より好ましくは３から１２個、とりわけ５から８個を含む。炭化水素基は直鎖であっても分枝であってもよく、好ましくは直鎖である。炭化水素基は飽和であっても不飽和であってもよく、好ましくは飽和である。好ましい架橋剤の例には、炭素原子８から１２個を有するジカルボン酸、例えば、セバシン酸、ドデカン二酸およびアゼライン酸などが含まれる。

ポリ−ε−リシンは、架橋の前に誘導体化または修飾して、当業者によく知られる他の架橋の化学が可能であるようにしてもよい。ポリ−ε−リシンは、アミノ酸、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸を使用して架橋されてもよい。この場合、架橋ポリ−ε−リシンは、分解すると天然に存在するアミノ酸だけを生じるだけとなる。例えばシスチンと反応すれば、同様に架橋されたポリマーが生成されることとなるが、この場合、構造体はシステインジスルフィド架橋を含有し、分解するとやはり天然に存在するアミノ酸を生じることとなる。

好ましい架橋剤の例には、グルタミン酸、シスチン、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ））、アジピン酸、ドデカン二酸、合成ペプチド、とりわけ天然のコラーゲンの構造に基いたペプチド、トリペプチド配列−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−を含有する合成ペプチド、フィブリノーゲンおよび他の天然のタンパク質中の細胞結合ペプチド、複数のカルボン酸基を含有する天然に存在するポリマー、例えばゼラチン、アルギン酸、ならびに複数のカルボン酸を有するクラウンエーテル（金属キレート化およびクロマトグラフィーでの使用にとりわけ適する）が含まれる。さらなる適切な例を以下に示す。

ポリ−ε−リシンの多分散性は重大ではないが、好ましい実施形態では、ポリ−ε−リシンの多分散性は適切にはアミノ酸１０から５０個、好ましくは２５〜３５個の間である。多分散性が狭くなると、架橋ポリマー支持体の最終特性を一層正確に制御できるようになる。架橋ポリ−ε−リシンには、例えばいくつかの様式のクロマトグラフィーにおける用途など、多くの用途があると見込まれるが、鎖に沿って反復するＬ−キラル中心があるので、キラル分離に関して特に有利であり得る。ペンダントαアミノ基は容易に修飾されて、幅広いキラル選択特性を支持体に与えることとなる他のクロマトグラフ結合部位または他のキラル部分を組み込むことができる。

適切には、ポリ−ε−リシンと架橋剤との相対量は、ポリ−ε−リシンが架橋ポリ−ε−リシンポリマーの主成分であるように選択される。十分に架橋されたポリマーが必要とされる場合は、ポリ−ε−リシンポリマーと架橋剤の相対量は、ポリ−ε−リシンのアルファアミン基と架橋官能基に関して化学量論的モル当量となるように選択されるであろう。アミン官能性が所望される場合は、相当量より少ない架橋剤が採用されて、所望の割合の遊離アミン基をもたらす。適切には、架橋ポリ−ε−リシンポリマーは、そのアルファアミン基の０から９５％を遊離アミン基として有する。比較的大きい割合の、例えば５０から１００％のアミン基が反応している好ましい実施形態では、架橋ポリ−ε−リシンポリマーは、比較的硬質な特性を適切に示すこととなる。少ない割合のアミン基が、例えばアミン基の５から５０％までが反応して架橋をもたらす場合、ポリマーは適切に比較的軟質またはゲル様である。軟質またはゲル様ポリマーは、ポリペプチド、特に長いポリペプチドの合成にとりわけ有用である。

好ましい実施形態では、架橋ポリ−ε−リシンポリマーは、０．００１ｍｍｏｌ／ｇより多く２０ｍｍｏｌ／ｇまで、０．０１から１０ｍｍｏｌ／ｇの架橋ポリ−ε−リシンポリマーを含み、好ましくは０．１から８ｍｍｏｌ／ｇまで、例えば１から８ｍｍｏｌ／ｇまで（とりわけポリペプチド合成のために）を含む。

別の実施形態では、架橋ポリ−ε−リシンポリマーは、０．０１から０．３ｍｍｏｌ／ｇを含み、核酸配列の合成に特に有利である。

好ましい実施形態では、架橋剤およびポリ−ε−リシンポリマーは、例えば水などの溶媒和される溶媒中で反応し、それは不混和性の連続相、例えばジクロロメタン中で分散する。溶媒中の反応物の濃度は、溶媒を除去したときに架橋ポリマーが収縮する度合いに影響を与えることとなり、その度合いにより架橋ポリマー中により大きな細孔がもたらされる。ジメチルホルムアミドを溶媒として採用してもよい。

第２の態様では、本発明は、本発明による架橋ポリ−ε−リシンポリマーを含む粒状支持体を提供する。

ポリマー粒子は、通常は分散重合法または乳化重合法によって作製することができ、その方法では、モノマー溶液は、重合開始前に不混和性の溶媒（連続相）中に分散する。形成されたポリマー粒子は通常、次いで濾過され、洗浄され、分級されて、必要とされる粒径分布が単離される。

好ましい実施形態では、架橋ポリマーは、好ましくは中空粒子である粒子上または粒子周辺に形成される。これによりシーディング効果（ｓｅｅｄｉｎｇｅｆｆｅｃｔ）が得られ、狭い粒径分布のポリマー粒子が形成できるようになる。

さらなる好ましい実施形態では、架橋ポリマーは粒子の表面上に形成される。好ましくは粒子はシリカであるが、他の公知のポリマー、例えばポリスチレンおよびヒドロキシルアパタイトであってもよい。例えば、コーティングされたシリカ粒子が、高速液体クロマトグラフィーにおける用途に適する。

好ましい実施形態では、架橋ポリマーは、ナノ粒子上またはナノ粒子周辺で形成される。これによりシーディング効果が得られ、ナノ粒子サイズのポリマー粒子を形成できるようになる。かかる粒子は、例えばトランスフェクションなどの薬物送達においてヘルスケア用途を有すると見込まれる。

架橋ポリ−ε−リシンポリマーをさらに反応させて、所与の用途向けの特定の官能性を与えてもよい。適切には、ポリマーを、少なくとも３つの官能基（このうち２つは、２本のポリマー鎖間に架橋をもたらすためのポリマーと反応する官能基、他は所望の用途で使用する遊離官能基（ｆｒｅｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）をもたらすための官能基）を有する化合物と反応させる。

架橋ポリ−ε−リシン支持体は、例えばコハク酸を使用してカルボン酸へ変換することによって、所望の通りにさらに官能化されてもよい。例として、アミン官能性支持体は、タンパク質、例えばタンパク質Ａを固定化する活性化ポリマーの調製において、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ）塩酸塩で処理することができる。

架橋ポリマー、好ましくは粒状の架橋ポリマーは、ポリマーによって担持される機能材料も含んでもよい。適切な機能材料の例には、触媒、ペプチド合成のための開始剤種、薬学的活性物質、農薬的活性物質、巨大分子、酵素、核酸配列およびタンパク質が含まれる。

適切には、架橋ポリマーは中空粒子上に担持される。架橋ポリマーは、粒子全体または粒子の一部の周辺に格子または網を形成することができる。中空粒子は、官能基、例えば、ポリマー上の遊離アミン基と反応して架橋ポリマーと粒子との間に共有結合的な連結をもたらすことができるカルボン酸基などを適切に含む。

本発明のよる架橋ポリ−ε−リシンポリマーまたは前記ポリマーを含む粒状支持体は、貴金属触媒、例えばパラジウム触媒の担持に特に有用である。特に有利な例は、カルボン酸を形成するように官能化された架橋ポリ−ε−リシン上に担持された酢酸パラジウムである。

本発明は、さらなる態様において、粒状支持体材料を生成する方法であって、粒子、好ましくは中空粒子を提供するステップ、粒子をポリ−ε−リシンと架橋剤との溶液に接触させるステップ、該粒子の表面上にポリマーコーティングを形成するようにポリ−ε−リシンと架橋剤との重合を実施するステップを含む方法を提供する。

適切には、重合は、当業者に公知である重合開始プロセスによって開始される。好ましい実施形態では、ポリ−ε−リシンとカルボキシル官能性架橋剤との溶液に混合された中空粒子が、ポリ−ε−リシンと架橋剤との溶媒と不混和性である溶媒に添加され、カルボジイミドが添加されて重合が実施される。ポリ−ε−リシンと架橋剤との溶液が水性の場合、溶媒は、例えばトルエンである。

好ましければ、ポリマーコーティングは、重合中または重合後に粒子に共有結合によって連結されてもよい。あるいは、ポリ−ε−リシンと架橋剤のうち１つまたは複数が、重合開始前に粒子表面に共有結合によって連結されてもよい。好ましくは、粒子は中空である。

本発明の粒状支持体は、固体支持体が使用されるいかなる化学的または物理的プロセスに使用されてもよい。

支持体は、導電性および発光ポリマーを伴う用途に採用されてもよい。発光ポリマーを含有する支持体を、表示パネル上に配置してもよい。

粒状支持体は、有機種、特に巨大分子の固相合成に、特に有用である。好ましい実施形態では、粒状支持体は、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴ糖の合成に採用されてもよい。

本発明は、クロマトグラフィー法における固相としての、本発明による粒状支持体の使用をさらに提供する。

本発明の粒状支持体は、バッチ式であるか、または支持体上の流れとしてであるかにかかわらず、支持体に接触するアルコール飲料から種を除去するための固相抽出、例えばイオン抽出およびイオン交換などにも有用である。

本発明の支持体は、抗体、オリゴヌクレオチド、酵素または蛍光体を含めた種を固定化するのに使用してもよく、各支持体が溶液の異なる成分を分析するようにアレイに置かれてもよい。その表面に共有結合した、または表面に結合したポリマーを介して共有結合したリガンドを有する粒子を、「ウェル」として採用してもよい。次いで、標的リガンド、例えば抗原または相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列などの特異的結合を、確立された方法を使用して検出してもよい。

本発明の粒状支持体はまた、生体触媒反応で使用するために生体触媒または細胞全体を固定化するのに採用されてもよい。生体触媒は、抽出下で混合物から固相を分離するためのフィルタープレートを備えたカラムまたはシステムで使用されることが多い。

本発明の粒状支持体は、固相試薬、金属触媒および他の触媒、生体触媒、酵素、タンパク質、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含めた抗体、細胞全体、ならびにポリマーを含めた、種の固定化にとりわけ有用である。本発明は、酵素、例えばリパーゼＣａｌＢなどの担持において特に有利である。リパーゼＣａｌＢは、エステル交換法に採用することができる。

本発明は、本発明の支持体を使用してバイオディーゼル油を酵素によって製造する方法をさらに提供する。

本発明は、プロテインＡなどのアフィニティーリガンドの固定化にもとりわけ有用である。プロテインＡは、モノクローナル抗体の精製に適切に使用される。

さらなる用途では、本発明の粒状支持体は、例えば遷移金属触媒およびリガンドを固定化することによって、化学触媒反応にも使用されてもよい。

なおさらなる用途では、本発明は細胞培養に使用されてもよい。動物細胞系の大量培養は、ウイルスワクチンおよびバイオテクノロジーの多くの製品の製造の基本である。動物の細胞培養における組換えＤＮＡ技術によって産生された生物学的製品には、酵素、合成ホルモン、免疫生物学的物質（モノクローナル抗体、インターロイキン、リンホカイン）および抗がん剤が含まれる。多くのより単純なタンパク質は、細菌培養においてｒＤＮＡを使用して産生することができるが、グリコシル化された（炭水化物修飾された）もっと複雑なタンパク質は、現在のところ動物の細胞内で作製しなければならない。かかる複雑なタンパク質の重要な例は、ホルモンであるエリスロポイエチンである。哺乳動物細胞培養物を成長させる費用は高いので、企業は絶えず技術の向上に目を向けている。

細胞は、懸濁液中でまたは接着培養物として成長させることができる。しかし、接着細胞には、細胞外基質成分をコーティングして接着性を上げることができ、また成長および分化に必要な他のシグナルを与えることができる表面が必要である。一般的に、固体組織に由来する細胞は接着性である。器官培養は、２次元培養皿ではなく３次元環境で細胞を成長させることを伴う。この３Ｄ培養系は、生化学的にも生理学的にもｉｎｖｉｖｏ組織の方に似ているが、多くの要因（例えば拡散）のために、維持するのは技術的に課題がある。ゼラチンは、加水分解されたコラーゲンであり、コラーゲンにおける鎖間および鎖内のアミド結合が化学的に加水分解されて可溶性ペプチド鎖が形成される。コラーゲンは、細胞が接着し、分化するのに理想的で自然な環境である。ポリ−ε−リシンは、他のタンパク質、例えばゼラチンなどと共重合して、コラーゲン様の環境を形成することもできる。

さらなる態様では、本発明は、細胞を培養するための、好ましくは支持体またはコーティングの表面上で細胞を培養するための、本発明による粒状のマクロポーラスまたはミクロポーラスの、支持体またはコーティングの使用を提供する。適切には、幹細胞を本発明の粒状支持体上で培養して、無制御分化を低減し、所望の分化を制御してもよい。

とりわけ好ましい実施形態では、本発明は、創傷ケアにおける使用に有益である。慢性創傷は、メタロプロテアーゼ（ｍｅｔａｌｌｉｎｏ−ｐｒｏｔｅａｓｅ）によって増悪し、それは、酵素によって必要とされる金属イオンをキレート化するポリマー粒子によって不活性にすることができる。架橋ポリ−ε−リシン、好ましくは金属キレート種でキャップされたものが、本用途での使用に適切である。本発明は、創傷治療製品またはその成分としての、架橋ポリ−ε−リシンまたは架橋ポリ−ε−リシンを含む粒状支持体の使用を提供する。創傷治療製品には、柔軟な物品が含まれてもよいが、好ましくは自立する物品が含まれる。創傷治療製品は、本発明によるポリマーもしくは粒状支持体、および創傷を治療する成分もしくは組成物、ならびに／または治療剤を適切に含む。

本明細書において、適切な使用に関して本発明のポリマーへの言及がなされた場合、特に記載のない限り、本発明の粒状支持体もかかる使用に適切である。

本発明は、イムノアッセイなどの医学的診断試験に特に有用である。したがって、本発明は、ある化合物の存在を検出するための医学的診断薬であって、本発明によるポリマーと、支持体中で該ポリマーによって担持される、検出すべき化合物と選択的に反応させるまたは結合させるための機能材料（酵素など、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）とを含む、医学的診断薬をさらに提供する。

多くの医学的診断薬は、様々な診断用リガンドを固定化する固体支持体に依存する。本発明のポリマー支持体を、液相を介して固相を物理的に分離する医学的診断法に使用してもよい。

さらなる用途では、ポリマー支持体は、吸収剤として使用されてもよい。ポリマー支持体は、家庭内でこぼれたもの、例えば、茶、コーヒーおよびワインを吸収するのに使用されてもよく、または大規模な用途で、例えば流出物から油を吸収するのに使用されてもよい。吸収性支持体は、流出物を吸収した後に放置して生分解させるのに使用してもよく、または油が水塊中に流出した場合、効率的に油を捕捉し、油を浮揚性の塊中に保持して、収集および廃棄するのに使用してもよい。有利には、架橋ポリ−ε−リシンは生分解性であり、それにより廃棄が容易になり、環境影響が低下する。

本発明のポリマー支持体は、ある期間にわたって放出すべき化合物、例えば薬学的または農薬的な化合物または組成物を運ぶ生分解性の担体として使用されてもよい。こうした使用により、支持体中の化合物の配合量に従って化合物の投与計画を適合させる手段が得られる。医薬品の場合、例えば化学療法など、患者に定期的に大用量を服薬することを要求するのではなく、例えば連続的な持続放出で活性物質の正しい用量を支援することにおいて、これは有利であり得る。

本発明を、添付の図面を参照することによって説明する。

ポリ−ε−リシンの図式表現を示す図である。二官能性カルボン酸と架橋したポリ−ε−リシンの図式表現を示す図である。例としてアスパラギン酸と架橋したポリ−ε−リシンの図式表現を示す図である。シスチンと架橋したポリ−ε−リシンの図式表現を示す図である。ニトリロ三酢酸と架橋したポリ−ε−リシンの図式表現を示す図である。Ｐｄ^２＋キレート化微小球の写真を示す図である。Ｐｄ^０キレート化微小球の写真を示す図である。粒子の顕微鏡写真を示す図である。ＨＰＬＣ試験クロマトグラムを示す図である。

本発明を、以下の非限定的な実施例によって説明する。

実施例１−アミンが活性である表面を有する粒子の調製
１．粒子表面の加水分解（−ＣＯＯＨを生成する）
中空のポリマー粒子（５００ｃｍ^３、ＡｋｚｏＮｏｂｅｌ−Ｅｘｐａｎｃｅｌ、等級９２０ＤＥＸ８０）を１ｄｍ^３のポリプロピレンのビンに入れ、水酸化ナトリウム溶液（４：１ｖ／ｖ水／メタノール、５００ｃｍ^３中１００ｇ）で覆った。混合物をローラー上に室温で一晩放置した。

粒子を、分液漏斗中で、水（５×５００ｃｍ^３）、塩酸水溶液（１ｍｏｌ／ｄｍ^３、５×５００ｃｍ^３）、次いで水（５×５００ｃｍ^３）で洗浄した。粒子を、次いでメタノール（５×５００ｃｍ^３）で洗浄し、風乾した。遊離カルボン酸基を粒子の表面上に有する粒子が作製された。

２．架橋ポリ−ε−リシンでの粒子のコーティング
上で調製したＤＥＸ８０粒子（５０ｃｍ^３、−ＣＯＯＨ官能性）を丸底フラスコに入れ、ポリ−ε−リシン（１０ｇ、−ＮＨ_２５１．５ｍｍｏｌ）、ニトリロ三酢酸（２．６４ｇ、ＣＯＯＨ４１．５ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（４．２ｇ、４１．５ｍｍｏｌ）の溶液（１００ｃｍ^３）中に懸濁させた。このスラリーを、ＳＰＡＮ８０（２％ｗ／ｖ）を含有するジクロロメタン（ＤＣＭ）（２５０ｃｍ^３）中に急速撹拌しながら分散させた。ＤＣＭ（２５０ｃｍ^３）中の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）（２３．９ｇ、１２５ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、重合を２時間進行させた。

ＤＣＭ層をデカンテーションによって除去し、粒子を、７５μｍのステンレス鋼篩上で、大量の水道水で洗浄した。粒子を焼結ガラス（ｇｌａｓｓｓｉｎｔｅｒ）に移し、水（５×５００ｃｍ^３）で洗浄し、次いでメタノール（５×５００ｃｍ^３）で洗浄し、風乾した（収量５．８ｇ）。

架橋ポリ−ε−リシンのアミン配合量を、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨをポリマーにカップリングし、その後Ｆｍｏｃアッセイを行うことによって決定した。配合量は０．９ｍｍｏｌ／ｇ（理論上最大値１ｍｍｏｌ／ｇ）であった。

３．架橋ポリ−ε−リシンでの粒子のコーティング
上で調製したＤＥＸ８０粒子（５０ｃｍ^３、−ＣＯＯＨ官能性）を丸底フラスコに入れ、ポリ−ε−リシン（１０ｇ、−ＮＨ_２５１．５ｍｍｏｌ）、ＨＯＯＣＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ（４．９９ｇ、ＣＯＯＨ２６．７ｍｍｏｌ）、およびＮ−メチルモルホリン（２．７ｇ、２６．７ｍｍｏｌ）の溶液（１００ｃｍ^３）中に懸濁させた。このスラリーを、ＳＰＡＮ８０（５％ｗ／ｖ）を含有するトルエン（２５０ｃｍ^３）中に急速撹拌しながら分散させた。ＥＤＣＩ（１０ｇ、５２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２５０ｃｍ^３）溶液を添加し、重合を１．５時間進行させた。

有機層をデカンテーションによって除去し、粒子を、７５μｍのステンレス鋼篩上で、アセトン（約１ｄｍ^３）および大量の水道水で洗浄した。粒子を焼結ガラスに移し、水（５×５００ｃｍ^３）で洗浄し、次いでメタノール（５×５００ｃｍ^３）で洗浄し、風乾した（収量１１．５ｇ、理論値の約９０％）。

架橋ポリ−ε−リシンのアミン配合量を、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨをポリマーにカップリングし、その後Ｆｍｏｃアッセイを行うことによって決定した。配合量は０．８４ｍｍｏｌ／ｇ（理論値１．７ｍｍｏｌ／ｇ）であった。

実施例２−ペプチドＡＣＰ（６４〜７５）の合成
１．カップリング剤のカップリング
４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）（０．５ｇ、３ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ｃｍ^３）中のＤＩＣ（０．５ｇ、４ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（０．８１ｇ、６ｍｍｏｌ）を使用して、上の実施例１．２で調製した架橋ポリ−ε−リシン（１．１ｇ、０．９ｍｍｏｌ）にカップリングした。

カップリング反応を、ニンヒドリンアッセイによって９０分以内に完了させた。ポリマー支持体を、焼結ガラス上で一定分量のＤＭＦ（１０×１０ｃｍ^３）で洗浄した。

２．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨのカップリング
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（０．８９ｇ、３ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ｃｍ^３）中のＤＩＣ（０．５ｇ、４ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を使用して、上で調製したＨＭＰＡ−ポリマーに６０分間カップリングした。

カップリングを繰り返し、ポリマーを焼結ガラス上で一定分量のＤＭＦ（１０×１０ｃｍ^３）で洗浄した。

ピペリジン／ＤＭＦ（２０ｃｍ^３、２０％ｖ／ｖ）を添加し、反応を３分間静置した。ピペリジン／ＤＭＦ（２０ｃｍ^３、２０％ｖ／ｖ）での２回目の処理を７分間行い、ポリマー支持体をＤＭＦ（１０×１０ｃｍ^３）で洗浄した。

３．Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨのカップリング
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１．４９２ｇ、２．５ｍｍｏｌ）および２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）（０．７６３ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｃｍ^３）に溶解した。４−メチルモルホリン（ＮＭＭ）（０．４１２ｃｍ^３、３．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２〜３分間予備活性化させた後に、上のＨ−Ｇｌｙ−ＨＭＰＡ−ポリマーに添加した。

カップリング反応を、ニンヒドリンアッセイによって決定される完了までカップリングした。ポリマー支持体を一定分量（１０×１０ｃｍ^３）のＤＭＦで洗浄した。

ピペリジン／ＤＭＦ（２０ｃｍ^３、２０％ｖ／ｖ）を、混合物に添加した。反応を３分間静置した。ピペリジン／ＤＭＦ（２０ｃｍ^３、２０％ｖ／ｖ）での２回目の処理を７分間行い、ポリマー支持体をＤＭＦ（１０×１０ｃｍ^３）で洗浄した。

４．Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨのカップリング
Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（０．８８４ｇ、２．５ｍｍｏｌ）およびＴＢＴＵ（０．７６３ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｃｍ^３）に溶解した。ＮＭＭ（０．４１２ｃｍ^３、３．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２〜３分間予備活性化させた後に、上のペプチド−ＨＭＰＡ−ポリマーに添加した。

ピペリジン／ＤＭＦ（２０ｃｍ^３、２０％ｖ／ｖ）を混合物に添加した。反応を３分間静置した。ピペリジン／ＤＭＦ（２０ｃｍ^３、２０％ｖ／ｖ）での２回目の処理を７分間行い、ポリマー支持体をＤＭＦ（１０×１０ｃｍ^３）で洗浄した。

５．Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨのカップリング
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（１．１４９ｇ、２．５ｍｍｏｌ）およびＴＢＴＵ（０．７６３ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｃｍ^３）に溶解した。ＮＭＭ（０．４１２ｃｍ^３、３．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２〜３分間予備活性化させた後に、上のペプチド−ＨＭＰＡ−ポリマーに添加した。

６．Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨのカップリング
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１．０２９ｇ、２．５ｍｍｏｌ）およびＴＢＴＵ（０．７６３ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｃｍ^３）に溶解した。ＮＭＭ（０．４１２ｃｍ^３、３．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２〜３分間予備活性化させた後に、上のペプチド−ＨＭＰＡ−ポリマーに添加した。

７．Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨのカップリング
Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（０．８８４ｇ、２．５ｍｍｏｌ）およびＴＢＴＵ（０．７６３ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｃｍ^３）に溶解した。ＮＭＭ（０．４１２ｃｍ^３、３．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２〜３分間予備活性化させた後に、上のペプチド−ＨＭＰＡ−ポリマーに添加した。

８．Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨのカップリング
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（０．８２３ｇ、２．５ｍｍｏｌ）およびＴＢＴＵ（０．７６３ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｃｍ^３）に溶解した。ＮＭＭ（０．４１２ｃｍ^３、３．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２〜３分間予備活性化させた後に、上のペプチド−ＨＭＰＡ−ポリマーに添加した。

９．Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨのカップリング
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（０．８２３ｇ、２．５ｍｍｏｌ）およびＴＢＴＵ（０．７６３ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｃｍ^３）に溶解した。ＮＭＭ（０．４１２ｃｍ^３、３．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２〜３分間予備活性化させた後に、上のペプチド−ＨＭＰＡ−ポリマーに添加した。

１０．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨのカップリング
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１．６０７ｇ、２．５ｍｍｏｌ）およびＴＢＴＵ（０．７６３ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｃｍ^３）に溶解した。４−メチルモルホリン（ＮＭＭ）（０．４１２ｃｍ^３、３．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２〜３分間予備活性化させた後に、上のペプチド−ＨＭＰＡ−ポリマーに添加した。

１１．Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨのカップリング
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（０．８４８ｇ、２．５ｍｍｏｌ）およびＴＢＴＵ（０．７６３ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｃｍ^３）に溶解した。ＮＭＭ（０．４１２ｃｍ^３、３．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２〜３分間予備活性化させた後に、上のペプチド−ＨＭＰＡ−ポリマーに添加した。

ピペリジン／ＤＭＦ（２０ｃｍ^３、２０％ｖ／ｖ）を混合物に添加した。反応を３分間静置した。ピペリジン／ＤＭＦ（２０ｃｍ^３、２０％ｖ／ｖ）での２回目の処理を７分間行い、ポリマー支持体をＤＭＦ（１０×１０ｃｍ^３）およびジエチルエーテル（５×１０ｃｍ^３）で洗浄した後、風乾した（収量１．９３ｇ、理論値の８６％）。

１２．ペプチドの切断
水（２．５％ｖ／ｖ）を含有するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２０ｃｍ^３）およびトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（２．５％ｖ／ｖ）を、上で調製したペプチド−ＨＭＰＡ−ポリマー（０．９３ｇ）に添加した。混合物を２時間放置して切断した。

ポリマー支持体を、分液漏斗中でＴＦＡ（５×１５ｃｍ^３）で洗浄した。合わせたＴＦＡ切断溶液および洗浄液を、ロータリーエバポレーター上で減少させて油状物にした。この油状物をジエチルエーテルで粉末化して、白色固体を形成した。エーテルをデカンテーションで除去し、ペプチドを一晩風乾した（収量０．４ｇ）。

逆相ＨＰＬＣによって、ペプチドは１つの主成分を含有することが示され、従来のポリマー支持体上で調製されたＡＣＰ（６４〜７５）の試料とともに共溶出された。架橋ポリ−ε−リシン上で調製されたペプチドは、従来のポリマー支持体上で調製されたＡＣＰ（６４〜７５）と比較すると、品質が若干高かった。

実施例３−ペプチドＡＣＰ（６４〜７５）の合成
実施例２の操作を、架橋ポリマーを使用して繰り返した。実施例２で上述した通りのＡＣＰ（６４〜７５）を、実施例１．３で調製した架橋ポリ−ε−リシン上で調製すると、すべてのカップリングを１時間に制限したときであっても、同様の質のペプチドを生成した。

実施例４−プロテインＡの架橋ポリ−ε−リシン上への固定化
ｒプロテインＡの架橋ポリ−ε−リシンへのカップリング
ポリマー支持体上のアミンをカルボン酸基に変換するために、０．１ｍｍｏｌ／ｇのアミン配合量（０．２ｇ）を有する架橋ポリ−ε−リシンを、水（５ｃｍ^３）中のグルタル酸無水物（２ｇ）で一晩処理した（得られたポリマーはニンヒドリンに陰性であった）。ポリマー支持体を、焼結ガラス上で水（５×１０ｃｍ^３）で洗浄した。モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（２５ｍｍｏｌ／ｄｍ^３、ｐＨ５．０、３×２０ｃｍ^３）を使用してポリマー支持体を洗浄した後に、タンパク質カップリングを行った。

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１ｇ）を冷ＭＥＳ緩衝液（２５ｍｍｏｌ／ｄｍ^３、ｐＨ５．０、２．５ｃｍ^３）に溶解し、この溶液をポリマー支持体に添加した。ＥＤＣＩ（１ｇ）をＭＥＳ緩衝液（２５ｍｍｏｌ／ｄｍ^３、ｐＨ５．０、２．５ｃｍ^３）に溶解し、この溶液を混合物に添加した。ポリマー支持体を、ボトルローラー上で３０分間混合し、活性化した。ポリマー支持体を、ＭＥＳ緩衝液（２５ｍｍｏｌ／ｄｍ^３、ｐＨ５．０、５×１０ｃｍ^３）で洗浄し、直ちにｒプロテインＡの溶液（５ｃｍ^３、２５ｍｍｏｌ／ｄｍ^３のＭＥＳ中４ｍｇ／ｃｍ^３、ｐＨ５．０）を混合物に添加し、ボトルローラー上で混合しながら、カップリングを室温で週末にわたって進行させた。ポリマー支持体を焼結ガラスの上に流し、Ｔｒｉｚｍａ−ＨＣｌ（３０ｃｍ^３、ｐＨ７．４）で洗浄し、ポリマー上の残りのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをすべてブロックした。ポリマー支持体を水（１０×１０ｃｍ^３）で洗浄し、水中のスラリーとして保存した。

プロテインＡがヒトＩｇＧを保持するかどうかを判定するために、プロテインＡベースの媒体を、クロマトグラフィー充填カラムを使用して、当業者に公知である標準条件下でヒトＩｇＧを使用して試験した。カラムは予想通りにヒトＩｇＧを保持することが示された。

実施例５−セバシン酸で架橋した球状粒子の調製
ポリ−ε−リシン（４２．８８ｇ、アミン含有量２５０ｍｍｏｌ）、セバシン酸（１２．６４ｇ、カルボキシル含有量１２５ｍｍｏｌ）およびＮａＯＨ（５．５ｇ、１３７．５ｍｍｏｌ）を水（２０８ｃｍ^３）に溶解し、次いで１．５％ｍ／ｖＳＰＡＮ８０を含有するジクロロメタン（ＤＣＭ）（１．２５ｄｍ^３）中に急速撹拌しながら分散させた。

ＥＤＣＩ（３６ｇ、１８７．５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２５０ｃｍ^３）に溶解し、上の分散液に添加した。重合を９０分間進行させた。ＤＣＭを濾過によって除去し、ポリマー微小球をＤＣＭ（３×５００ｃｍ^３）で洗浄し、残存するＳｐａｎ８０を除去した。次いでポリマーを水で完全に洗浄し、ＮａＯＨ溶液（１ｍｏｌ／ｄｍ^３）で中和し、次いで再び水で洗浄し、その後ＭｅＯＨ（３×５００ｃｍ^３）、ＤＣＭ（３×５００ｃｍ^３）、次いでＥｔ_２Ｏ（２×２５０ｃｍ^３）で洗浄した。このポリマー微小球を一晩風乾した（収量３４ｇ）。

実施例６−リパーゼＣａｌＢの固定化
実施例５で調製したポリマー微小球（２ｇ）の試料を計量してポリプロピレンのビンに入れた。グルタル酸無水物（６ｇ）をメタノール（２０ｃｍ^３）およびＮ−メチルモルホリン（６ｃｍ^３）の溶液に溶解し、ポリマーに添加し、ロール機上に２４時間置いた。

２４時間後、ポリマーを水で完全に洗浄した。水（２０ｃｍ^３）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３．２ｇ）およびＥＣＤＩ（５．３ｇ）の飽和溶液をポリプロピレンのビン中の球状物に添加し、カルボキシルを活性化するために、ローラー上に戻して１時間置いた。その後のＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイにおいて負の対照として作用させるために、１時間後に試料（５０ｍｇ）を取り出した。残りのポリマーを水で完全に洗浄し、次いで１０％ＣａｌＢ酵素溶液（４０ｃｍ^３）を含有するビンに添加し、その後ロール機上に２４時間置き、活性化したカルボン酸に酵素をカップリングした。２４時間後に、ポリマーを水で完全に洗浄してカップリングしていない酵素をすべて除去し、その後エタノールアミンの５％ｖ／ｖ溶液で洗浄して、残った遊離カルボキシル基をすべてキャップして取り去り、それによりさらなる反応が何も起こらないようにした。

Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡアッセイキット（Ｎｏ．２３２２５）を使用してＢＣＡアッセイを行い、ポリマー上のＣａｌＢ配合量を判定した。配合量は、ポリマー１ｇ当たりＣａｌＢ２１８ｍｇであることが判定された。

固定化酵素が、例えばバイオディーゼル油の酵素生成を含めたエステル交換反応で使用できることが確認され、固定化酵素の活性が溶液中の遊離酵素と等しいことが示された。

実施例７−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）で架橋した粒子の調製
ポリ−ε−リシン（４０ｇ、アミン含有量２０６ｍｍｏｌ）、ＮＴＡ（１０．９６ｇ、カルボキシル含有量１７２ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（１７．３７ｇ、１７２ｍｍｏｌ）を水（１４０ｃｍ^３）に溶解し、次いで２％ｍ／ｖＳＰＡＮ８０を含有するジクロロメタン（ＤＣＭ）（７５０ｃｍ^３）中に急速撹拌しながら分散させた。

ＥＤＣＩ（４９．５ｇ、２５８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４００ｃｍ^３）に溶解し、上の分散液に添加した。重合を９０分間進行させた。ＤＣＭを濾過によって除去し、ポリマー微小球をＤＣＭ（３×５００ｃｍ^３）で洗浄し、残存するＳｐａｎ８０を除去した。次いでポリマーを水で完全に洗浄し、ＮａＯＨ溶液（１ｍｏｌ／ｄｍ^３）で中和し、次いで再び水で洗浄し、その後ＭｅＯＨ（３×５００ｃｍ^３）、ＤＣＭ（３×５００ｃｍ^３）、次いでＥｔ_２Ｏ（２×２５０ｃｍ^３）で洗浄した。このポリマー微小球を一晩風乾した（収量４７ｇ）。

実施例８−ニッケルキレート化および次の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のためにＮＴＡでキャップしたＮＴＡ架橋粒子の調製
上の実施例７で調製したポリマー微小球（１０ｇ、１０ｍｍｏｌ）の一部を、ポリプロピレンのビン内で、水で膨潤させた。ＥＤＣＩ（１９．１７ｇ、１００ｍｍｏｌ）およびＮＴＡ（１９．１ｇ、１００ｍｍｏｌ）の水（約１００ｃｍ３）溶液を調製し、膨潤した微小球に添加した。混合物を、ロールミル上に一晩放置し、ＮＴＡでのキャッピングを完了させた。

ポリマーを水で完全に洗浄し、その後ＭｅＯＨ（３×１００ｃｍ^３）、ＤＣＭ（３×１００ｃｍ^３）、次いでＥｔ_２Ｏ（２×５０ｃｍ^３）で洗浄し、その後風乾した。ニッケルでキレート化して、次にＩＭＡＣで使用するのに、この材料はこれで適切なものとなった。

このＩＭＡＣポリマーは、当業者に公知の技術によるＨｉｓタグタンパク質精製に適切であることが確認された。

実施例９−エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）（ＥＤＴＡ）で架橋した粒子の調製
ポリ−ε−リシン（４２．８８ｇ、アミン含有量２５０ｍｍｏｌ）、ＥＤＴＡ（９．１３ｇ、カルボキシル含有量１２５ｍｍｏｌ）を水（２００ｃｍ^３）に溶解し、次いで２％ｍ／ｖＳＰＡＮ８０を含有するジクロロメタン（ＤＣＭ）（７５０ｃｍ^３）中に急速撹拌しながら分散させた。

ＥＤＣＩ（３６ｇ、１８７．５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２５０ｃｍ^３）に溶解し、上の分散液に添加した。重合を９０分間進行させた。ＤＣＭを濾過によって除去し、ポリマー微小球をＤＣＭ（３×５００ｃｍ^３）で洗浄し、残存するＳｐａｎ８０を除去した。次いでポリマーを水で完全に洗浄し、ＮａＯＨ溶液（１ｍｏｌ／ｄｍ^３）で中和し、次いで再び水で洗浄し、その後ＭｅＯＨ（３×５００ｃｍ^３）、ＤＣＭ（３×５００ｃｍ^３）、次いでＥｔ_２Ｏ（２×２５０ｃｍ^３）で洗浄した。このポリマー微小球を一晩風乾した（収量２７ｇ）。

実施例１０−次の金属キレート化のためにＥＤＴＡでキャップしたＥＤＴＡ架橋粒子の調製
上の実施例９で調製したポリマー微小球（１０ｇ、１０ｍｍｏｌ）の一部を、ポリプロピレンのビン内で、水で膨潤させた。ＥＤＣＩ（１９．１７ｇ、１００ｍｍｏｌ）およびＥＤＴＡ（２９．２ｇ、１００ｍｍｏｌ）の水（約１００ｃｍ３）溶液を調製し、膨潤した微小球に添加した。混合物を、ロールミル上に一晩放置し、ＥＤＴＡでのキャッピングを完了させた。

ポリマーを水で完全に洗浄し、その後ＭｅＯＨ（３×１００ｃｍ３）、ＤＣＭ（３×１００ｃｍ３）、次いでＥｔ_２Ｏ（２×５０ｃｍ３）で洗浄し、その後風乾した。この材料は、これで金属キレート化に適切なものとなった。

金属キレート化特性を確認するために、このポリマー１ｇを酢酸パラジウム（１００ｍｇ）の酢酸（２０ｃｍ^３）溶液に添加した。室温で２時間後に、酢酸パラジウム溶液のオレンジ色が退色し、色がポリマー微小球に移った。球状物をメタノールで洗浄し、メタノール中に放置し、キレート化されたＰｄ^２＋をＰｄ^０に変換した。

Ｐｄ^２＋およびＰｄ^０キレート化微小球の写真を図６ａおよび６ｂに示す。

実施例１１−浮揚性の超常磁性粒子の調製
ＤＥＸ８０中空粒子（５０ｃｍ^３）を丸底フラスコに入れ、ポリ−ε−リシン（１０ｇ、−ＮＨ_２５１．５ｍｍｏｌ）、セバシン酸（２．６ｇ、ＣＯＯＨ２５．７５ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（２．６ｇ、２５．７５ｍｍｏｌ）の溶液（１００ｃｍ^３）中に懸濁させた。超常磁性酸化鉄ナノ粒子（１ｇ、粒径５０ｎｍ）を添加し、このスラリーを、ＳＰＡＮ８０（２％ｗ／ｖ）を含有するジクロロメタン（ＤＣＭ）（２５０ｃｍ^３）中に急速撹拌しながら分散させた。ＥＤＣＩ（２３．９ｇ、１２５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２５０ｃｍ^３）溶液を添加し、重合を２時間進行させた。

ＤＣＭ層を濾過によって除去し、５００μｍのステンレス鋼篩上で粒子を大量の水道水で洗浄した。粒子を焼結ガラスに移し、水（５×５００ｃｍ^３）で洗浄し、水中のスラリーとして保存した。

粒子の顕微鏡写真を図７に示す。

実施例１２−超常磁性ナノ粒子の調製
超常磁性酸化鉄ナノ粒子（３ｇ、粒径５０ｎｍ）を、厚肉ガラス管に移した。クエン酸の飽和水溶液を添加し、混合物を３０分間４０℃で超音波処理した。デカンテーションの間に粒子を保持するのに磁気特性を使用して、ナノ粒子を水（１０×３０ｃｍ^３）で洗浄した。

ポリ−ε−リシン（２ｇ）を水（５ｃｍ^３）に溶解し、クエン酸でキレート化されたナノ粒子に添加した。混合物を３０分間室温で超音波処理し、次いで水（２ｃｍ^３）に溶解したＥＤＣＩ（２ｇ）を添加した。混合物をさらに３０分間４０℃で超音波処理し、次いで室温に一晩放置した。

デカンテーションの間に粒子を保持するのに磁気特性を使用して、ナノ粒子を、水（１０×３０ｃｍ^３）、ＭｅＯＨ（５×３０ｃｍ^３）およびＥｔ_２Ｏ（１０ｃｍ^３）で洗浄した。ナノ粒子を風乾した（収量３．９ｇ）。

クエン酸で架橋したポリ−ε−リシンでコーティングした、得られたナノ粒子はニンヒドリンに陽性であり、アミンコーティングの存在が確認された。ナノ粒子のアミン含有量は、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨをポリマーにカップリングし、その後Ｆｍｏｃ含有量を判定することによって判定した。アミン配合量は６６μｍｏｌ／ｇと判定された。

実施例１３−ポリ−ε−リシンでコーティングし、パルミチン酸でキャップしたシリカ粒子の調製
シリカ粒子（１０ｇ、Ｋｒｏｍａｓｉｌ、１０μｍ、孔径１０００Å）をアミノプロピルトリメトキシシランのＭｅＯＨ／水（５０ｃｍ^３、１％ｗ／ｖ、１０％水）溶液に懸濁させ、５〜１０分混合し、次いでＭｅＯＨおよびＤＭＦで洗浄し、その後ポリプロピレンのビンに移した。ＤＭＦ（５０ｃｍ^３）を添加し、その後グルタル酸無水物（５ｇ）およびＮ−メチルモルホリン（１０ｃｍ^３）を添加した。混合物をローラーミキサー上に一晩放置した。

粒子を、ＤＭＦで完全に洗浄し、次いでＤＭＦ（５０ｃｍ^３）に再懸濁させた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．７２ｇ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（３．３７ｃｍ^３）を添加し、混合物を５時間転がした。粒子を、再びＤＭＦで完全に洗浄した。

ポリ−ε−リシン（１．５７ｇ）を水（２５ｃｍ^３）に溶解し、ＤＭＦで湿ったシリカ粒子に添加した。Ｎ−メチルモルホリン（０．４４ｃｍ^３）を添加し、混合物を一晩転がした。

粒子を水、ＭｅＯＨおよびＤＭＦで完全に洗浄した。パルミチン酸（１．２ｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．５２ｇ）およびＤＩＣ（１．１ｃｍ^３）をＤＭＦ（５０ｃｍ^３）に溶解し、ＤＭＦで湿ったシリカ粒子に添加した。Ｎ−メチルモルホリン（０．７４ｃｍ^３）を添加し、混合物を一晩転がした。パルミチン酸カップリングを繰り返し、粒子をＤＭＦ、水およびＭｅＯＨで完全に洗浄し、その後風乾した。

こうした逆相クロマトグラフィー粒子をＨＰＬＣカラムに充填し、クロマトグラフ特性を確認するために試験した。ＨＰＬＣ試験クロマトグラムを図８に示す。

Claims

架橋ポリ−ε−リシンポリマー。
アミド結合によって連結された、ポリ−ε−リシンと架橋剤とを含む、請求項１に記載のポリマー。
ポリ−ε−リシンのアルファ炭素アミンと反応することができる少なくとも２つの官能基を含む架橋剤で架橋される、請求項１または２に記載のポリマー。
架橋剤が、２つ以上のカルボン酸基と、該２つ以上の基を連結する脂肪族鎖とを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリマー。
水および他の溶媒に不溶性である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリマー。
粒状の形状である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリマー。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の架橋ポリ−ε−リシンポリマーを含む、粒状支持体。
架橋ポリ−ε−リシン支持体が、球状、楕円状または不規則形状の粒子である、請求項７に記載の粒状支持体。
架橋ポリ−ε−リシン支持体が粒子を直接的にまたは間接的にコーティングするために使用される、請求項７または８に記載の粒状支持体。
架橋ポリ−ε−リシン支持体が、粒子をコーティングするために使用され、粒子に共有結合される、請求項７〜９のいずれか一項に記載の粒状支持体。
架橋ポリ−ε−リシンが、有機ポリマー粒子をコーティングするために使用される、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の粒状支持体。
架橋ポリ−ε−リシンが、無機ポリマー粒子をコーティングするために使用される、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の粒状支持体。
架橋ポリ−ε−リシンが官能化されて、触媒、ペプチド合成の開始剤種、オリゴヌクレオチド合成の開始剤種、固相有機合成の開始剤種、薬学的活性物質、農薬的活性物質、クロマトグラフ分離用の表面、細胞培養または分化を促進するための種、タンパク質または他の生体巨大分子を含む材料をもたらす、請求項７〜１２のいずれかに記載の架橋ポリ−ε−リシンベースの粒状支持体。
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリマーもしくは請求項７〜１３のいずれか一項に記載の粒状支持体、および創傷を治療するための成分もしくは組成物、ならびに／または治療剤を含む、創傷治療製品。
請求項７〜１３のいずれか一項に記載の粒状支持体を含み、かつ該支持体に結合したまたは保持される機能材料を含む、医学的診断薬。
機能材料が、ポリマーによって担持される酵素を含む、請求項１４に記載の医学的診断薬。
ペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖の固相合成；固相抽出；固相有機化学；固相試薬、金属触媒および他の触媒、生体触媒、酵素、タンパク質、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含めた抗体、細胞全体ならびにポリマーから選択される種の固定化；細胞培養；クロマトグラフ分離用固定相の調製から選択されるプロセスにおける、あるいは吸収剤としてまたは徐放製品用の生分解性担体として使用するための、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の粒状支持体の使用。