JP2014502153A - 多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図3
Description
a、単独のOct4、 Oct4とKlf4とSox2との組み合わせ、またはOct4とKlf4とc−MyCとSox2との組み合わせである転写因子とJhdm1bとを哺乳動物の成体細胞に転写し、誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
b、誘導獲得した多能性幹細胞クローンを幹細胞培地に培養増幅させるステップと、
を含む。
a、単独のOct4、Oct4とSox2との組み合わせ、 Oct4とKlf4との組み合わせ、Oct4とKlf4とSox2との組み合わせ、またはOct4とKlf4とSox2とc−mycとの組み合わせである転写因子とJhdm1bとを哺乳動物の成体細胞に転写し、ビタミンCを含む誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
b、誘導獲得した多能性幹細胞クローンを幹細胞培地に培養増幅させるステップと、
を含む。
a、単独のOct4、Oct4とSox2との組み合わせ、Oct4とKlf4との組み合わせ、またはOct4とKlf4とSox2との組み合わせである転写因子とJhdm1bとを哺乳動物の成体細胞に転写し、誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
b、誘導獲得した多能性幹細胞クローンを幹細胞培地に培養増幅させるステップである。
a、単独のOct4、Oct4とSox2との組み合わせ、Oct4とKlf4との組み合わせ、またはOct4とKlf4とSox2との組み合わせである転写因子とJhdm1bとJhdm1aを哺乳動物の成体細胞に転写し、誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
b、誘導獲得した多能性幹細胞クローンを幹細胞培地に培養増幅させるステップと、
を含む。
a、Oct4である転写因子とJhdm1bとJhdm1aを哺乳動物の成体細胞に転写し、ビタミンCを含む誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
b、誘導獲得した多能性幹細胞クローンをビタミンCを含む幹細胞培地に培養増幅させるステップと、
を含む。
1、Jhdm1aとJhdm1bコード領域を含むベクターの構築:
a.クローニング用プライマーの設計
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedからJhdm1a及びJhdm1bのcDNAの配列情報を取得した。その中、Jhdm1a cDNAのクローン領域の配列はSEQ ID NO:1であり、Jhdm1b cDNAのクローン領域の配列はSEQ ID NO:2であり、特異的プライマーを設計することによって、Jhdm1a及びJhdm1bのコード配列を増幅した。
Jhdm1a 下流プライマーの塩基配列はSEQ ID NO:4で示される;
Jhdm1b上流プライマーの塩基配列はSEQ ID NO:5で示される;
Jhdm1b下流プライマーの塩基配列はSEQ ID NO:6で示される。
下記の方法によって、分離されたICRマウス胎児線維芽細胞(MEF)及びヒトH1胚性幹細胞から総mRNAを抽出した。
図13を参照してください。増幅反応終了後、PCR産物に対してアガロースゲル電気泳動して、ゲル抽出キット(天根株式会社、DP214-03)を用いてPCR断片を抽出した。pMXsベクター(ベクターがaddgeneから購入され、マルチクローニングサイト及びFLAGタグ配列が挿入された)を使った。改造後のpMXsベクターがpMXs-FLAGと呼ばれ、そのプラスミド図については図13を参照すること。ベクターの自己連結を防止するためにpmel酵素切断で、CIAPウシ腸アルカリフォスファターゼを応用してそれを脱燐酸化した。ゲル抽出キット(天根株式会社、DP214-03)で処理済みのベクターを回収しておく。pMX-FLAGベクター及びJhdm1a/Jhdm1bの遺伝子断片をライゲーションキット(Takara株式会社、DNA Ligation Kit)で縛ってからライゲーション産物によってコンピテント大腸菌を転化し、陽性クローンを選び、プラスミドを抽出してシークエンシングした。最後にプラスミドを大量に調製した。
特別な説明がない場合、マウスの体細胞リプログラミングを全部以下の方式で行った。
フィーダー層細胞、MEF細胞及びPlatE細胞の培地の組成は、高糖基礎培地DMEM(Gibco)の上に、10%ウシ胎児血清(FBS、PAA)を加えた。
リプログラミングに採用された体細胞の類型は全部でOG2マウス胎児線維芽細胞(実験室自制)であり、その継代数が3代を超えない。幹細胞の特異的に発現するOct4遺伝子のプロモーターの後に緑色蛍光タンパク質(GFP)をライゲーションすることがOG2マウスの特徴の一つである。リプログラミングの過程において、OG2マウス胎児線維芽細胞の内因性Oct4が活性化された際には、同時に緑色蛍光タンパク質が発現され、蛍光マイクロスコープにおいて、リプログラミングに成功した細胞或はクローン細胞集塊は緑色を呈する。直接にリプログラミングクローン即ち緑色蛍光クローンの数を統計し或はフローサイトメータにて緑色蛍光細胞の比率を分析することにより、異なる条件下のリプログラミング効率を容易に比較することができる。
リプログラミング用転写因子はマウスOct4、Sox2、Klf4、c−MycのcDNAのレトロウイルスベクターpMXs(Addgene株式会社から入手し、番号はそれぞれPlasmid 13366、Plasmid 13367、Plasmid 13370及びPlasmid 13375である)を含む;Oct4,NCBIの登録番号:NM_013663;Sox2,NCBIの登録番号:NM_011443;Klf4,NCBIの登録番号:010637;c−Myc,NCBIの登録番号:NM_001177353。自製のリン酸カルシウムトランスフェクション試薬を用いてpMXベクター上のリプログラミング因子プラスミドをウイルスパッケージング細胞(PlatE)にトランスフェクトした。具体的な過程は以下の通りである。750万のPlatE細胞を直径10センチメートルのプレート(Corning)に接種し、12時間後、7.5mlのペニシリン/ストレプトマイシンを含まれていない培地で古い培地を置換し、その後、細胞をインキュベータに放置した。次に、トランスフェクション混合物を準備した:プラスミド25μgを取って15mlの遠心管に加え、順次2Mの塩化カルシウム溶液156.25μlを加え、適量の水を入れて三者の総体積を1.25mlにして、均一に混合してからHBS溶液を1.25ml加え、直ちに均一に混合してから2分間静置し、その後、PlatEプレート中に一滴ずつ加入し、均一に混合した。トランスフェクション後の9-12時間、10mlの新鮮な培養液で置換し、トランスフェクション後の48時間、その培養液を収集し、かつ0.45μmろ過膜で培養液をろ過し、第一次感染用ウイルス液とした。新鮮な培養液を添加し、24時間後、このように培養液を再び収集して第二次感染ウイルス液とした。
感染は2回に分けて行った。使用されている誘導因子は全部で同時に細胞に感染した。12ウェル板の各ウェルの感染ウイルスの用量が1mlであり、第1回感染後の24時間後に第2回の感染を行い、第2回感染後の24時間後にウイルス液をmES培地(前記)に置換した。液を取り替える日は第0日(D0)として記録された;感染後の異なる時点で、実験の必要に応じて、原ウェル内でGFP蛍光クローンの数を数え、又はGFP蛍光細胞の比率をフローサイトメータで分析した。
形態が隆起し、周辺がはっきりしている胚性幹細胞のような単一のクローンをガラス針で選び、事前に準備したフィーダー層細胞(フィーダー層細胞は、マイトマイシンで処理したICRマウス線維芽細胞)の培養板(Corning)に直接的に移し、KSR培地を用いて培養した。感染後の翌日、培養体系を新鮮な誘導培地で取り替え、以降は実験が終了するまで誘導培地を毎日取り替えた。
Klf4とSox2とc−MycとOct4との組み合わせは略してSKOMという。
図2を参照してください。ビタミンCが存在するか否かにもかかわらず、Jhdm1a又はJhdm1bはリプログラミングの効率を著しく高めた。ビタミンCが存在する場合、増加幅がより顕著である。図2は、Jhdm1a又はJhdm1bがSKOM媒介での多能性幹細胞の誘導効率を高めたデータを示している。その中、コントロールはいかなる遺伝子配列も挿入しないpMXs-FLAG空ベクターである;
図3を参照してください。ビタミンCが存在する場合、Jhdm1aとJhdm1bは共同して働き、SO、KO及びOct4のいずれか一つのみが存在する場合にも多能性幹細胞を誘導することができるようにする。mESC+Vcは誘導過程に用いられる培地が幹細胞培地mESであり、また、50μg/mlのビタミンCを加えることを表している。その中、コントロールはpMXs-FLAG空ベクターである。
実施例1で得られた誘導性多能幹細胞の同定:
図3及び図6〜10に示されるように、iPS細胞(誘導性多能幹細胞)であるかどうかを証明するため、Oct4及びJhdm1bに誘導された多能幹細胞クローンに対して一連の同定実験を行った。同定実験は定量PCR、その表面標識物に対する免疫蛍光分析、プロモーターメチル化程度の分析、核型の同定、キメラの形成などを含む。
定量PCR実験は全部Takara株式会社のキットを用いて、Biorad株式会社のCFX-96型定量PCR装置で終了した。反応条件は95℃2分間、95℃10秒、60℃30秒であり、蛍光値を記録し、このように40サイクルを実施した。
この分析は亜硫酸水素ナトリウムシークエンシング方法によって実施した。ターゲット細胞中のゲノムDNA(Promega株式会社、Wizard(登録商標)Genomic DNA Purification Kit)を抽出し、濃度値を測定し、約2ugのDNAを1.5mlEP管でddH2Oを用いて50μlに希釈し、新たに調製した3MのNaOHを5.5ul加え、42℃で水浴を30分間行った。その後、溶液を取り出し、10mMハイドロキナン(sigma)を前記水浴後の混合液中に30μl加えてから、前記水浴後の溶液中に3.6M亜硫酸水素ナトリウム(Sigma、S9000)を520μl加え、EP管の外側にアルミ箔紙で巻き、光を避けるように溶液を軽く転倒して均一に混合し、水分蒸発及び酸化を防止するように、パラフィンオイルを200μl加えて50℃で光を避けて水浴を16時間行った。
iPS細胞の核型同定は下記の方法に基づいて行った:核型分析しようとする細胞を、収穫前の2-3時間に5ug/mlのコルキシン(市販、終濃度は0.1ug/mlである)を0.1mlを加えて均一に混合する後、引き続き2-3時間培養してから10mlの遠心管へ移し、1500-2000rpm/minで10分間遠心し、上澄み液を除き、低張液(0.075M のKCl、37℃で予熱する)を8ml加えて細胞沈殿物を均一になるまで吹いたり打ったりしてから、インキュベータに37℃で半時間放置し、新たに調製した固定液(メタノール:氷酢酸の体積比が3:1の混合物であり、原材料は市販されている)を1ml加え、軽く均一に混合した後、前記のスピードと時間で遠心し、上澄み液を吸い取った。固定液を8mL加え、細胞を十分均一に混合し、室温で少なくとも半時間固定し、遠心を繰り返した後、上澄み液を除いて、新鮮な固定液を加えて再び少なくとも半時間(一晩放置するのが好ましい)固定した。遠心して上澄み液を除いた後の細胞沈殿物に新鮮な固定液を約0.2ml加えて、均一に混合し、細胞懸濁液を事前に冷却したスライドガラス(スライドガラス毎に3滴の細胞懸濁液が好適である)に点し、アルコールランプでガラスを乾かし、冷却後にバンディング処理を行った。
胞胚キメラテストにおいて、iPS細胞をドナーマウスの胞胚腔に注射し、注射後の胞胚を偽妊娠雌マウスの子宮に移植してキメラマウスを作成し、生まれたマウスの毛の色によって嵌合を生んだかどうかを判断した。
図12を参照してください。図12に示されるように、突然変異が発生したJhdm1bの変異体はリプログラミング効率を向上する活性を持っていない。従って、Jhdm1bのDNA結合ドメイン(CXXC)及び触媒ドメイン(Jmjc)はリプログラミングに対して必須的であり、いずれか一方がないと、リプログラミングを促進することができなくなる。そして、Oct4とJhdm1bとの組み合わせは普通の培地条件下でリプログラミングを完成することができ、ビタミンCが存在する場合により顕著な效果が得られる。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院広州生物医薬及び健康研究院
<120> 多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3486
<212> DNA
<213> 人工配列
<400> 1
atggaacctg aagaagaaag gattcggtac agccagagat tgcgtggtac catgcgtcgt 60
cgctatgaag atgatggcat ttcagatgat gaaattgaag ggaaaagaac ttttgacttg 120
gaagagaagc tccaaaccaa caaatataat gccaattttg ttacttttat ggagggaaaa 180
gattttaatg tagagtatat ccagcggggt ggcttgagag accctctcat tttcaagaat 240
tctgatggac ttggaataaa gatgccggat ccagacttca cagtgaatga tgtcaaaatg 300
tgtgtgggga gtcgtcggat ggtggatgtc atggatgtga acacacagaa ggggattgaa 360
atgaccatgg cacaatggac acgatactat gagactccag aggaagagcg agaaaaactc 420
tataatgtta tcagcctaga gtttagccac accaggcttg agaatatggt gcagcggcct 480
tccacggtgg atttcattga ctgggtagat aacatgtggc caaggcactt gaaagaaagt 540
cagacagaat caacaaatgc catcttagag atgcagtacc ctaaagtgca aaagtactgt 600
ctaatgagtg ttcgaggctg ctatactgac ttccatgtgg attttggagg tacttctgtt 660
tggtatcaca tccaccaagg tggaaaggtc ttctggctca tcccccctac agcccacaac 720
ctggagctgt acgagaattg gctgctatca gggaaacagg gagacatctt tctgggtgac 780
cgggtgtcag attgccaacg aattgagctc aagcagggct ataccttcgt tattccctca 840
ggttggattc atgctgtgta tactcctaca gacacattag tgtttggagg caattttttg 900
catagcttca acatccccat gcaattaaag atatacagca ttgaagatcg aacacgggtt 960
ccaaataaat tccgttaccc attttactat gaaatgtgtt ggtatgtgtt ggagcgctat 1020
gtatactgca taaccaaccg atcccaccta actaaggatt ttcagaaaga atcccttagc 1080
atggatatgg agttaaatga gttggagtct ggaaatggtg atgaggaagg ggtggacaga 1140
gaagcccgac gcatgaacaa taagcgatct gtgcttacca gccctgttgc taatggagtg 1200
aacctggatt acgatggact tggcaaagcc tgccgaagtc ttccaagtct gaagaaaact 1260
ttgtctggag actcatcctc agactctacc cggggatccc acaatggcca agtttgggat 1320
ccccaatgta gccctaaaaa ggataggcaa gtgcatctca cccattttga acttgaaggt 1380
cttcgatgtc ttgtagataa gttagagtca ctgccactgc acaagaagtg tgtccccaca 1440
ggaatagaag acgaagatgc tctgattgct gatgtaaaga ttttgctgga agaacttgcc 1500
agtagcgatc ccaagttagc cctcactgga gtccctatag tacagtggcc aaaaagggat 1560
aagcttaaat tccctaccag gccaaaggtg agggttccta caattcccat cacaaagcct 1620
cacaccatga agccagctcc acgcttaaca cctgtaaggc ctgctgcagc ctcccccatt 1680
gtgtcaggag ccaggcggag aagagtgcgg tgcaggaaat gcaaagcttg tgtgcaagga 1740
gaatgtggag tctgccacta ctgcagggac atgaagaaat ttggtggacc tggacgcatg 1800
aagcaatcct gtgtcctccg acagtgctta gcacccagac tgcctcattc agttacgtgt 1860
tctctctgtg gagaagtaga tcagaatgaa gagacccagg actttgaaaa gaaactcatg 1920
gaatgctgca tctgcaacga gatagttcat cctggctgcc tccagatgga tggagagggg 1980
ttgctgaacg aggaattgcc aaattgctgg gagtgtccaa agtgttacca ggaagacagc 2040
tcggacaaag cccagaagcg gaaaatagaa gagagtgatg aagaagctgt acaagccaaa 2100
gtcttacggc ccctgaggag ctgcgaggag cctctcacac ccccgcctca ctcacctact 2160
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gaggaggagg aggaagatga cagtgcagag gaggggggtg cagccaggct gaatggccgg 2640
ggcagttggg ctcaggatgg agacgaaagc tggatgcagc gggaggtctg gatgtctgtc 2700
ttccgctacc tcagccgcaa agaactttgt gaatgtatgc gagtgtgcaa gacatggtat 2760
aaatggtgct gtgataaacg actttggaca aaaattgact tgagtaggtg taaggccatc 2820
gtaccacaag ctctcagtgg tatcatcaag cggcagccag taagcctcga cctcagctgg 2880
actaacatct ccaaaaagca gctgacatgg ctggtcaata ggctgccagg attaaaagac 2940
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actgacttcc ggctggcagg ccttgacatc acagatgcta ctctccgact catcattcgc 3180
cacatgcccc ttttgtctcg acttgacctc agtcactgca gtcaccttac agatcagtcc 3240
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gcaggttgca ataaattgac agaccagacc ctgttcttcc taaggcgaat tgctaatgtc 3360
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tcagacttgt ccatcaacag cctctactgc ctgtctgatg agaaactgat acagaagatt 3480
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cctgtggtca gctggccaaa gaaaactgca aagaaccggg tggtgggtcg gcctaagggc 1680
aagttgggcc cggcctcagc ggtgaagttg gctgccaacc gaacaacagc aggagctcgc 1740
aggcgccgga cgcgatgccg caagtgcgag gcctgcctgc ggacggagtg tggagagtgc 1800
cacttttgca aggacatgaa gaagtttgga ggtcctgggc gcatgaagca gagctgcatc 1860
atgcggcagt gcatcgcgcc agtgctgccc cacaccgccg tgtgccttgt gtgtggcgag 1920
gcagggaagg aggacacagt ggaagaggaa gaaggcaagt ttaacctcat gctcatggaa 1980
tgctccatct gcaacgagat catccaccct ggatgcctta agattaagga atcggagggt 2040
gtggtcaacg atgagcttcc caactgctgg gagtgtccga agtgtaacca tgccggcaag 2100
accgggaaac aaaagcgtgg ccctggcttt aagtatgcct ccaacctgcc tggctccttg 2160
ctcaaggagc agaagatgaa ccgggacaac aaggaagggc aagagcctgc caagcggaga 2220
agtgagtgtg aagaggctcc ccgtcggagg tcagacgagc accccaaaaa ggtgcctgca 2280
gatggcatcc tccgccgaaa gtctgatgat gtgcacctga ggaggaagcg gaaatacgag 2340
aagccccaag agctgagtgg acgcaagcga gcctcgtcgc ttcaaacgtc ccccggttcc 2400
tcctctcacc tctcgccgag gccccctcta ggcagcagtc tcagcccttg gtggagatcc 2460
agtctcactt acttccagca gcagctaaaa cctggcaaag aagataagct tttcaggaaa 2520
aagcggcggt cctggaagaa cgctgaggat cgtctgtcac tggccaacaa gccccttcgg 2580
cgctttaagc aggaaccgga ggacgatctg cctgaggcac ctcctaagac ccgggagagt 2640
gatcagtcac gttccagctc acccactgct ggtcccagca ctgagggagc tgaaggccca 2700
gaagagaaga aaaaggtgaa gatgcgccgg aagcggcgac ttgttaacaa ggagctgagc 2760
aaagagctaa gcaaggagct caaccatgag atccaaaaga cggagagcac cctggctcac 2820
gagagccagc agcccatcaa gtcagagcct gagagcgaga acgacgagcc caagaggccc 2880
ttaagccact gcgagcgccc ccaccgcttc agcaaagggc tcaacggcac acctcgggag 2940
ctgcggcact cgctgggacc tggcctgcgt agtccacctc gtgttatgtc ccggcccccg 3000
ccctctgcat ccccacccaa gtgcatccag atggagcgtc acgtgatccg gccaccgccc 3060
atcagccccc cacctgactc gctgcccctg gatgatggag cagcccacgt catgcatagg 3120
gaggtgtgga tggcagtctt cagctacctc agccaccgag acctgtgtgt ctgcatgcgg 3180
gtctgcagga cctggaaccg ctggtgctgc gataagcggt tgtggacccg catcgacctg 3240
aaccgctgca agtccatcac acccctgatg ctgagcggta tcatccggcg acagcctgtc 3300
tcccttgacc tcagttggac caacatctcc aagaagcagc tgagttggct catcaaccgg 3360
ttgcctgggc tccgagactt ggtgctgtca ggctgctcat ggatcgctgt ctcagccctc 3420
tgtagctcca gttgtccatt gctccggacc ctggatgtcc agtgggtaga aggactaaag 3480
gatgcccaga tgagggatct cctgtctcca cccacagaca acaggccagg tcagatggac 3540
aatcggagca agctccggaa cattgtagag ctgcgcctag ctggcctgga catcacagat 3600
gtctccctgc ggctcattat tcgccatatg cccctgctct cgaagctcca actcagttac 3660
tgtaaccaca tcaatgacca gtccatcaac ctgctcactg ccgtcggcac caccacccga 3720
gactcgctga cagaggtcaa cctatcagac tgtaataagg taactgacct gtgcctgtcc 3780
ttcttcaaac gctgtggaaa tatctgtcat attgacctga ggtactgcaa gcaagtcacc 3840
aaggaaggct gtgagcaatt catagctgaa atgtctgtga gtgtccaatt tgggcaagtg 3900
gaagagaaac tcctgcaaaa actaagttag 3930
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工配列
<400> 3
atggaggcag agaaagactc t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工配列
<400> 4
acttagtttt tgcaggagtt tct 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工配列
<400> 5
atggaacctg aagaagaaag gattc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工配列
<400> 6
ttagctaatc ttctgtatca gtttc 25
<210> 7
<211> 1162
<212> PRT
<213> ヒト
<400> 7
Met Glu Pro Glu Glu Glu Arg Ile Arg Tyr Ser Gln Arg Leu Arg Gly
1 5 10 15
Thr Met Arg Arg Arg Tyr Glu Asp Asp Gly Ile Ser Asp Asp Glu Ile
20 25 30
Glu Gly Lys Arg Thr Phe Asp Leu Glu Glu Lys Leu His Thr Asn Lys
35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Phe Val Thr Phe Met Glu Gly Lys Asp Phe Asn Val
50 55 60
Glu Tyr Ile Gln Arg Gly Gly Leu Arg Asp Pro Leu Ile Phe Lys Asn
65 70 75 80
Ser Asp Gly Leu Gly Ile Lys Met Pro Asp Pro Asp Phe Thr Val Asn
85 90 95
Asp Val Lys Met Cys Val Gly Ser Arg Arg Met Val Asp Val Met Asp
100 105 110
Val Asn Thr Gln Lys Gly Ile Glu Met Thr Met Ala Gln Trp Thr Arg
115 120 125
Tyr Tyr Glu Thr Pro Glu Glu Glu Arg Glu Lys Leu Tyr Asn Val Ile
130 135 140
Ser Leu Glu Phe Ser His Thr Arg Leu Glu Asn Met Val Gln Arg Pro
145 150 155 160
Ser Thr Val Asp Phe Ile Asp Trp Val Asp Asn Met Trp Pro Arg His
165 170 175
Leu Lys Glu Ser Gln Thr Glu Ser Thr Asn Ala Ile Leu Glu Met Gln
180 185 190
Tyr Pro Lys Val Gln Lys Tyr Cys Leu Met Ser Val Arg Gly Cys Tyr
195 200 205
Thr Asp Phe His Val Asp Phe Gly Gly Thr Ser Val Trp Tyr His Ile
210 215 220
His Gln Gly Gly Lys Val Phe Trp Leu Ile Pro Pro Thr Ala His Asn
225 230 235 240
Leu Glu Leu Tyr Glu Asn Trp Leu Leu Ser Gly Lys Gln Gly Asp Ile
245 250 255
Phe Leu Gly Asp Arg Val Ser Asp Cys Gln Arg Ile Glu Leu Lys Gln
260 265 270
Gly Tyr Thr Phe Val Ile Pro Ser Gly Trp Ile His Ala Val Tyr Thr
275 280 285
Pro Thr Asp Thr Leu Val Phe Gly Gly Asn Phe Leu His Ser Phe Asn
290 295 300
Ile Pro Met Gln Leu Lys Ile Tyr Asn Ile Glu Asp Arg Thr Arg Val
305 310 315 320
Pro Asn Lys Phe Arg Tyr Pro Phe Tyr Tyr Glu Met Cys Trp Tyr Val
325 330 335
Leu Glu Arg Tyr Val Tyr Cys Ile Thr Asn Arg Ser His Leu Thr Lys
340 345 350
Glu Phe Gln Lys Glu Ser Leu Ser Met Asp Leu Glu Leu Asn Gly Leu
355 360 365
Glu Ser Gly Asn Gly Asp Glu Glu Ala Val Asp Arg Glu Pro Arg Arg
370 375 380
Leu Ser Ser Arg Arg Ser Val Leu Thr Ser Pro Val Ala Asn Gly Val
385 390 395 400
Asn Leu Asp Tyr Asp Gly Leu Gly Lys Thr Cys Arg Ser Leu Pro Ser
405 410 415
Leu Lys Lys Thr Leu Ala Gly Asp Ser Ser Ser Asp Cys Ser Arg Gly
420 425 430
Ser His Asn Gly Gln Val Trp Asp Pro Gln Cys Ala Pro Arg Lys Asp
435 440 445
Arg Gln Val His Leu Thr His Phe Glu Leu Glu Gly Leu Arg Cys Leu
450 455 460
Val Asp Lys Leu Glu Ser Leu Pro Leu His Lys Lys Cys Val Pro Thr
465 470 475 480
Gly Ile Glu Asp Glu Asp Ala Leu Ile Ala Asp Val Lys Ile Leu Leu
485 490 495
Glu Glu Leu Ala Asn Ser Asp Pro Lys Leu Ala Leu Thr Gly Val Pro
500 505 510
Ile Val Gln Trp Pro Lys Arg Asp Lys Leu Lys Phe Pro Thr Arg Pro
515 520 525
Lys Val Arg Val Pro Thr Ile Pro Ile Thr Lys Pro His Thr Met Lys
530 535 540
Pro Ala Pro Arg Leu Thr Pro Val Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ile
545 550 555 560
Val Ser Gly Ala Arg Arg Arg Arg Val Arg Cys Arg Lys Cys Lys Ala
565 570 575
Cys Val Gln Gly Glu Cys Gly Val Cys His Tyr Cys Arg Asp Met Lys
580 585 590
Lys Phe Gly Gly Pro Gly Arg Met Lys Gln Ser Cys Val Leu Arg Gln
595 600 605
Cys Leu Ala Pro Arg Leu Pro His Ser Val Thr Cys Ser Leu Cys Gly
610 615 620
Glu Val Asp Gln Asn Glu Glu Thr Gln Asp Phe Glu Lys Lys Leu Met
625 630 635 640
Glu Cys Cys Ile Cys Asn Glu Ile Val His Pro Gly Cys Leu Gln Met
645 650 655
Asp Gly Glu Gly Leu Leu Asn Glu Glu Leu Pro Asn Cys Trp Glu Cys
660 665 670
Pro Lys Cys Tyr Gln Glu Asp Ser Ser Glu Lys Ala Gln Lys Arg Lys
675 680 685
Met Glu Glu Ser Asp Glu Glu Ala Val Gln Ala Lys Val Leu Arg Pro
690 695 700
Leu Arg Ser Cys Asp Glu Pro Leu Thr Pro Pro Pro His Ser Pro Thr
705 710 715 720
Ser Met Leu Gln Leu Ile His Asp Pro Val Ser Pro Arg Gly Met Val
725 730 735
Thr Arg Ser Ser Pro Gly Ala Gly Pro Ser Asp His His Ser Ala Ser
740 745 750
Arg Asp Glu Arg Phe Lys Arg Arg Gln Leu Leu Arg Leu Gln Ala Thr
755 760 765
Glu Arg Thr Met Val Arg Glu Lys Glu Asn Asn Pro Ser Gly Lys Lys
770 775 780
Glu Leu Ser Glu Val Glu Lys Ala Lys Ile Arg Gly Ser Tyr Leu Thr
785 790 795 800
Val Thr Leu Gln Arg Pro Thr Lys Glu Leu His Gly Thr Ser Ile Val
805 810 815
Pro Lys Leu Gln Ala Ile Thr Ala Ser Ser Ala Asn Leu Arg His Ser
820 825 830
Pro Arg Val Leu Val Gln His Cys Pro Ala Arg Thr Pro Gln Arg Gly
835 840 845
Asp Glu Glu Gly Leu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
850 855 860
Glu Glu Asp Asp Ser Ala Glu Glu Gly Gly Ala Ala Arg Leu Asn Gly
865 870 875 880
Arg Gly Ser Trp Ala Gln Asp Gly Asp Glu Ser Trp Met Gln Arg Glu
885 890 895
Val Trp Met Ser Val Phe Arg Tyr Leu Ser Arg Arg Glu Leu Cys Glu
900 905 910
Cys Met Arg Val Cys Lys Thr Trp Tyr Lys Trp Cys Cys Asp Lys Arg
915 920 925
Leu Trp Thr Lys Ile Asp Leu Ser Arg Cys Lys Ala Ile Val Pro Gln
930 935 940
Ala Leu Ser Gly Ile Ile Lys Arg Gln Pro Val Ser Leu Asp Leu Ser
945 950 955 960
Trp Thr Asn Ile Ser Lys Lys Gln Leu Thr Trp Leu Val Asn Arg Leu
965 970 975
Pro Gly Leu Lys Asp Leu Leu Leu Ala Gly Cys Ser Trp Ser Ala Val
980 985 990
Ser Ala Leu Ser Thr Ser Ser Cys Pro Leu Leu Arg Thr Leu Asp Leu
995 1000 1005
Arg Trp Ala Val Gly Ile Lys Asp Pro Gln Ile Arg Asp Leu Leu
1010 1015 1020
Thr Pro Pro Ala Asp Lys Pro Gly Gln Asp Asn Arg Ser Lys Leu
1025 1030 1035
Arg Asn Met Thr Asp Phe Arg Leu Ala Gly Leu Asp Ile Thr Asp
1040 1045 1050
Ala Thr Leu Arg Leu Ile Ile Arg His Met Pro Leu Leu Ser Arg
1055 1060 1065
Leu Asp Leu Ser His Cys Ser His Leu Thr Asp Gln Ser Ser Asn
1070 1075 1080
Leu Leu Thr Ala Val Gly Ser Ser Thr Arg Tyr Ser Leu Thr Glu
1085 1090 1095
Leu Asn Met Ala Gly Cys Asn Lys Leu Thr Asp Gln Thr Leu Ile
1100 1105 1110
Tyr Leu Arg Arg Ile Ala Asn Val Thr Leu Ile Asp Leu Arg Gly
1115 1120 1125
Cys Lys Gln Ile Thr Arg Lys Ala Cys Glu His Phe Ile Ser Asp
1130 1135 1140
Leu Ser Ile Asn Ser Leu Tyr Cys Leu Ser Asp Glu Lys Leu Ile
1145 1150 1155
Gln Lys Ile Ser
1160
<210> 8
<211> 1309
<212> PRT
<213> マウス
<400> 8
Met Glu Ala Glu Lys Asp Ser Gly Arg Arg Leu Arg Ala Ile Asp Arg
1 5 10 15
Gln Arg Tyr Asp Glu Asn Glu Asp Leu Ser Asp Val Glu Glu Ile Val
20 25 30
Ser Val Arg Gly Phe Ser Leu Glu Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Tyr
35 40 45
Gln Gly Asp Phe Val His Ala Met Glu Gly Lys Asp Phe Asn Tyr Glu
50 55 60
Tyr Val Gln Arg Glu Ala Leu Arg Val Pro Leu Val Phe Arg Asp Lys
65 70 75 80
Asp Gly Leu Gly Ile Lys Met Pro Asp Pro Asp Phe Thr Val Arg Asp
85 90 95
Val Lys Leu Leu Val Gly Ser Arg Arg Leu Val Asp Val Met Asp Val
100 105 110
Asn Thr Gln Lys Gly Thr Glu Met Ser Met Ser Gln Phe Val Arg Tyr
115 120 125
Tyr Glu Thr Pro Glu Ala Gln Arg Asp Lys Leu Tyr Asn Val Ile Ser
130 135 140
Leu Glu Phe Ser His Thr Lys Leu Glu His Leu Val Lys Arg Pro Thr
145 150 155 160
Val Val Asp Leu Val Asp Trp Val Asp Asn Met Trp Pro Gln His Leu
165 170 175
Lys Glu Lys Gln Thr Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ala Glu Met Lys Tyr
180 185 190
Pro Lys Val Lys Lys Tyr Cys Leu Met Ser Val Lys Gly Cys Phe Thr
195 200 205
Asp Phe His Ile Asp Phe Gly Gly Thr Ser Val Trp Tyr His Val Phe
210 215 220
Arg Gly Gly Lys Ile Phe Trp Leu Ile Pro Pro Thr Leu His Asn Leu
225 230 235 240
Ala Leu Tyr Glu Glu Trp Val Leu Ser Gly Lys Gln Ser Asp Ile Phe
245 250 255
Leu Gly Asp Arg Val Glu Arg Cys Gln Arg Ile Glu Leu Lys Gln Gly
260 265 270
Tyr Thr Phe Phe Ile Pro Ser Gly Trp Ile His Ala Val Tyr Thr Pro
275 280 285
Val Asp Ser Leu Val Phe Gly Gly Asn Ile Leu His Ser Phe Asn Val
290 295 300
Pro Met Gln Leu Arg Ile Tyr Glu Ile Glu Asp Arg Thr Arg Val Gln
305 310 315 320
Pro Lys Phe Arg Tyr Pro Phe Tyr Tyr Glu Met Cys Trp Tyr Val Leu
325 330 335
Glu Arg Tyr Val Tyr Cys Val Thr Gln Arg Ser Tyr Leu Thr Gln Glu
340 345 350
Tyr Gln Arg Glu Leu Met Leu Ile Asp Ala Pro Arg Lys Thr Ser Val
355 360 365
Asp Gly Phe Ser Ser Asp Ser Trp Leu Asp Met Glu Glu Glu Ser Cys
370 375 380
Glu Gln Gln Pro Gln Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Lys Glu Glu
385 390 395 400
Glu Gly Asp Gly Ala Asp Lys Thr Pro Lys Pro Pro Thr Asp Asp Pro
405 410 415
Thr Ser Pro Thr Ser Thr Pro Pro Glu Asp Gln Asp Ser Thr Gly Lys
420 425 430
Lys Pro Lys Ala Pro Ala Ile Arg Phe Leu Lys Arg Thr Leu Ser Asn
435 440 445
Glu Ser Glu Glu Ser Val Lys Ser Thr Ser Met Pro Thr Asp Asp Pro
450 455 460
Lys Thr Pro Thr Gly Ser Pro Ala Thr Glu Val Ser Thr Lys Trp Thr
465 470 475 480
His Leu Thr Glu Phe Glu Leu Lys Gly Leu Lys Ala Leu Val Glu Lys
485 490 495
Leu Glu Ser Leu Pro Glu Asn Lys Lys Cys Val Pro Glu Gly Ile Glu
500 505 510
Asp Pro Gln Ala Leu Leu Glu Gly Val Lys Asn Val Leu Lys Glu His
515 520 525
Val Asp Asp Asp Pro Thr Leu Ala Ile Thr Gly Val Pro Val Val Ser
530 535 540
Trp Pro Lys Lys Thr Ala Lys Asn Arg Val Val Gly Arg Pro Lys Gly
545 550 555 560
Lys Leu Gly Pro Ala Ser Ala Val Lys Leu Ala Ala Asn Arg Thr Thr
565 570 575
Ala Gly Ala Arg Arg Arg Arg Thr Arg Cys Arg Lys Cys Glu Ala Cys
580 585 590
Leu Arg Thr Glu Cys Gly Glu Cys His Phe Cys Lys Asp Met Lys Lys
595 600 605
Phe Gly Gly Pro Gly Arg Met Lys Gln Ser Cys Ile Met Arg Gln Cys
610 615 620
Ile Ala Pro Val Leu Pro His Thr Ala Val Cys Leu Val Cys Gly Glu
625 630 635 640
Ala Gly Lys Glu Asp Thr Val Glu Glu Glu Glu Gly Lys Phe Asn Leu
645 650 655
Met Leu Met Glu Cys Ser Ile Cys Asn Glu Ile Ile His Pro Gly Cys
660 665 670
Leu Lys Ile Lys Glu Ser Glu Gly Val Val Asn Asp Glu Leu Pro Asn
675 680 685
Cys Trp Glu Cys Pro Lys Cys Asn His Ala Gly Lys Thr Gly Lys Gln
690 695 700
Lys Arg Gly Pro Gly Phe Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Pro Gly Ser Leu
705 710 715 720
Leu Lys Glu Gln Lys Met Asn Arg Asp Asn Lys Glu Gly Gln Glu Pro
725 730 735
Ala Lys Arg Arg Ser Glu Cys Glu Glu Ala Pro Arg Arg Arg Ser Asp
740 745 750
Glu His Pro Lys Lys Val Pro Ala Asp Gly Ile Leu Arg Arg Lys Ser
755 760 765
Asp Asp Val His Leu Arg Arg Lys Arg Lys Tyr Glu Lys Pro Gln Glu
770 775 780
Leu Ser Gly Arg Lys Arg Ala Ser Ser Leu Gln Thr Ser Pro Gly Ser
785 790 795 800
Ser Ser His Leu Ser Pro Arg Pro Pro Leu Gly Ser Ser Leu Ser Pro
805 810 815
Trp Trp Arg Ser Ser Leu Thr Tyr Phe Gln Gln Gln Leu Lys Pro Gly
820 825 830
Lys Glu Asp Lys Leu Phe Arg Lys Lys Arg Arg Ser Trp Lys Asn Ala
835 840 845
Glu Asp Arg Leu Ser Leu Ala Asn Lys Pro Leu Arg Arg Phe Lys Gln
850 855 860
Glu Pro Glu Asp Asp Leu Pro Glu Ala Pro Pro Lys Thr Arg Glu Ser
865 870 875 880
Asp Gln Ser Arg Ser Ser Ser Pro Thr Ala Gly Pro Ser Thr Glu Gly
885 890 895
Ala Glu Gly Pro Glu Glu Lys Lys Lys Val Lys Met Arg Arg Lys Arg
900 905 910
Arg Leu Val Asn Lys Glu Leu Ser Lys Glu Leu Ser Lys Glu Leu Asn
915 920 925
His Glu Ile Gln Lys Thr Glu Ser Thr Leu Ala His Glu Ser Gln Gln
930 935 940
Pro Ile Lys Ser Glu Pro Glu Ser Glu Asn Asp Glu Pro Lys Arg Pro
945 950 955 960
Leu Ser His Cys Glu Arg Pro His Arg Phe Ser Lys Gly Leu Asn Gly
965 970 975
Thr Pro Arg Glu Leu Arg His Ser Leu Gly Pro Gly Leu Arg Ser Pro
980 985 990
Pro Arg Val Met Ser Arg Pro Pro Pro Ser Ala Ser Pro Pro Lys Cys
995 1000 1005
Ile Gln Met Glu Arg His Val Ile Arg Pro Pro Pro Ile Ser Pro
1010 1015 1020
Pro Pro Asp Ser Leu Pro Leu Asp Asp Gly Ala Ala His Val Met
1025 1030 1035
His Arg Glu Val Trp Met Ala Val Phe Ser Tyr Leu Ser His Arg
1040 1045 1050
Asp Leu Cys Val Cys Met Arg Val Cys Arg Thr Trp Asn Arg Trp
1055 1060 1065
Cys Cys Asp Lys Arg Leu Trp Thr Arg Ile Asp Leu Asn Arg Cys
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1085 1090 1095
Pro Val Ser Leu Asp Leu Ser Trp Thr Asn Ile Ser Lys Lys Gln
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Leu Ser Trp Leu Ile Asn Arg Leu Pro Gly Leu Arg Asp Leu Val
1115 1120 1125
Leu Ser Gly Cys Ser Trp Ile Ala Val Ser Ala Leu Cys Ser Ser
1130 1135 1140
Ser Cys Pro Leu Leu Arg Thr Leu Asp Val Gln Trp Val Glu Gly
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Leu Lys Asp Ala Gln Met Arg Asp Leu Leu Ser Pro Pro Thr Asp
1160 1165 1170
Asn Arg Pro Gly Gln Met Asp Asn Arg Ser Lys Leu Arg Asn Ile
1175 1180 1185
Val Glu Leu Arg Leu Ala Gly Leu Asp Ile Thr Asp Val Ser Leu
1190 1195 1200
Arg Leu Ile Ile Arg His Met Pro Leu Leu Ser Lys Leu Gln Leu
1205 1210 1215
Ser Tyr Cys Asn His Ile Asn Asp Gln Ser Ile Asn Leu Leu Thr
1220 1225 1230
Ala Val Gly Thr Thr Thr Arg Asp Ser Leu Thr Glu Val Asn Leu
1235 1240 1245
Ser Asp Cys Asn Lys Val Thr Asp Leu Cys Leu Ser Phe Phe Lys
1250 1255 1260
Arg Cys Gly Asn Ile Cys His Ile Asp Leu Arg Tyr Cys Lys Gln
1265 1270 1275
Val Thr Lys Glu Gly Cys Glu Gln Phe Ile Ala Glu Met Ser Val
1280 1285 1290
Ser Val Gln Phe Gly Gln Val Glu Glu Lys Leu Leu Gln Lys Leu
1295 1300 1305
Ser
Claims (12)
- a)単独のOct4、 Oct4とKlf4とSox2との組み合わせ、またはOct4とKlf4とc−MyCとSox2との組み合わせである転写因子とJhdm1bとを哺乳動物の成体細胞に転写し、誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
b)誘導獲得した多能性幹細胞クローンを幹細胞培地に培養増幅させるステップと、
を含むことを特徴とする多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。 - a)単独のOct4、Oct4とSox2との組み合わせ、 Oct4とKlf4との組み合わせ、またはOct4とKlf4とSox2との組み合わせである転写因子とJhdm1bとを哺乳動物の成体細胞に転写し、ビタミンCを含む誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
b)誘導獲得した多能性幹細胞クローンを幹細胞培地に培養増幅させるステップと、
を含むことを特徴とする多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。 - a)単独のOct4、Oct4とSox2との組み合わせ、Oct4とKlf4との組み合わせ、またはOct4とKlf4とSox2との組み合わせである転写因子とJhdm1bとを哺乳動物の成体細胞に転写し、ビタミンCを含む誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
b)誘導獲得した多能性幹細胞クローンをビタミンCを含む幹細胞培地に培養増幅させるステップと、
を含むことを特徴とする請求項2に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。 - 前記転写因子とJhdm1bは多能性幹細胞誘導機能を有するコートされた、又はノンコードされたRNA、たんぱく質、或いはポリペプチドであることを特徴とする請求項2に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
- 哺乳動物の成体細胞へのJhdm1bの転写は、Jhdm1bを発現できるベクターを細胞に導入することによって実現することを特徴とする請求項3又は4に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
- 前記ベクターはウィルスベクター、プラスミドベクター、エピソームベクター、又はmRNAベクターであり、若しくは直接に化学合成されることを特徴とする請求項5に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
- 前記ウィルスベクターはレトロウイルスであり、当該レトロウイルスはpMXsベクターであることを特徴とする請求項5に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
- 前記Jhdm1bは脱メチル化修飾したポリペプチドであることを特徴とする請求項1に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
- 前記哺乳動物の成体細胞は線維芽細胞、神経細胞、造血細胞及び神経膠質細胞であることを特徴とする請求項1に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
- 前記哺乳動物の成体細胞はマウス胎児線維芽細胞であることを特徴とする請求項1に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
- a)単独のOct4、Oct4とSox2との組み合わせ、Oct4とKlf4との組み合わせ、またはOct4とKlf4とSox2との組み合わせである転写因子とJhdm1bとJhdm1aを哺乳動物の成体細胞に転写し、誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
b)誘導獲得した多能性幹細胞クローンを幹細胞培地に培養増幅させるステップと、
を含むことを特徴とする多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。 - a)Oct4である転写因子とJhdm1bとJhdm1aを哺乳動物の成体細胞に転写し、ビタミンCを含む誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
b)誘導獲得した多能性幹細胞クローンをビタミンCを含む幹細胞培地に培養増幅させるステップと、
を含むことを特徴とする請求項11に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
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