JP2014227404A - 新規化合物レンツトレハロース、その製造方法、及びその用途、並びに、新規微生物 - Google Patents

Abstract

【課題】優れた抗腫瘍作用、優れた骨強化作用、若しくは、優れた体重増加抑制作用を有し、甘味料としても利用可能な新規化合物、及び該新規化合物の製造方法の提供。【解決手段】レンツィア エスピー（Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ．）ＭＬ４５７−ｍＦ８株（ＮＩＴＥＰ−０１５８６）、などレンツィア（Ｌｅｎｔｚｅａ）属に属する微生物の培養物から新規構造式のトレハロース誘導体を分離する。更に、遺伝子工学的手法による前記化合物の生産も可能である。【選択図】なし

Description

本発明は、新規化合物、その製造方法、前記新規化合物を産生する能力を有する新規微生物、並びに前記新規化合物を含有する、組成物、抗腫瘍剤、骨強化剤、体重増加抑制剤、及び甘味料に関する。

トレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）は、多くの動植物や、微生物に見られる化合物である。前記トレハロースは、生物種によって、栄養源として、保湿剤として、或いは細胞壁成分などとして働いている。例えば、昆虫では血糖の主成分であり、キノコ類では、乾燥重量の１％〜１７％を占めていることが知られている。
前記トレハロースは、トレハレース（Ｔｒｅｈａｌａｓｅ）により分解され、グルコースとなる。なお、哺乳類自身は、前記トレハロースを持たないものの、前記トレハレースは持っている。
現在、前記トレハロースは、多くの食品に添加されているほか、化粧品、臓器移植時の保護液などにも利用されている。

また、前記トレハロースは、マウスでの実験において、抗腫瘍作用（例えば、非特許文献１参照）、骨強化作用（例えば、非特許文献２参照）、脂肪細胞肥大化抑制作用などを有することが報告されている。

しかしながら、前記トレハロースが有する抗腫瘍作用などは満足のいくものとはいえず、より優れた抗腫瘍作用などを有する新規化合物の速やかな開発が強く望まれているのが現状である。また、甘味料として用いることができる新規化合物の開発も強く望まれている。

Ｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ， Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｏｎ Ｓａｒｃｏｍａ １８０ ｉｎ ＩＣＲ Ｍｉｃｅ， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．， ５２， ３６７−３６８（２００５） Ｎｉｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ ａｌ， Ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ｍｉｃｅ， Ｎｕｔｒ． Ｒｅｓ．， ２０， ６５３−６６４（２０００）

本発明は、上記従来技術に鑑みて行われたものであり、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れた抗腫瘍作用、優れた骨強化作用、若しくは、優れた体重増加抑制作用を有し、甘味料としても利用可能な新規化合物、及び該新規化合物の製造方法、前記新規化合物の生産菌である新規微生物、並びに、前記新規化合物を利用した、化合物含有組成物、抗腫瘍剤、骨強化剤、体重増加抑制剤、及び甘味料を提供することを目的とする。

前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物である。
＜２＞ 前記＜１＞に記載の化合物の製造方法であって、
レンツィア（Ｌｅｎｔｚｅａ）属に属し、前記＜１＞に記載の化合物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から前記＜１＞に記載の化合物を採取する採取工程とを含むことを特徴とする化合物の製造方法である。
＜３＞ レンツィア（Ｌｅｎｔｚｅａ）属に属し、前記＜１＞に記載の化合物を生産する能力を有することを特徴とする微生物である。
＜４＞ 前記＜１＞に記載の化合物を含むことを特徴とする化合物含有組成物である。
＜５＞ 前記＜１＞に記載の化合物を含むことを特徴とする抗腫瘍剤である。
＜６＞ 前記＜１＞に記載の化合物を含むことを特徴とする骨強化剤である。
＜７＞ 前記＜１＞に記載の化合物を含むことを特徴とする体重増加抑制剤である。
＜８＞ 前記＜１＞に記載の化合物を含むことを特徴とする甘味料である。

本発明によれば、前記目的を達成することができ、優れた抗腫瘍作用、優れた骨強化作用、若しくは、優れた体重増加抑制作用を有し、甘味料としても利用可能な新規化合物、及び該新規化合物の製造方法、前記新規化合物の生産菌である新規微生物、並びに、前記新規化合物を利用した、化合物含有組成物、抗腫瘍剤、骨強化剤、体重増加抑制剤、及び甘味料を提供することができる。

図１は、前記構造式（Ａ）で表される化合物のＫＢｒ錠剤法で測定した、赤外線スペクトルのチャートである。縦軸：透過率（％）、横軸：波数（ｃｍ^−１）。 図２は、前記構造式（Ａ）で表される化合物の紫外線吸収スペクトルのチャートである。縦軸：吸光度（Ａｂｓ）、横軸：波長（ｎｍ）。 図３は、前記構造式（Ａ）で表される化合物の重メタノール中で２５℃にて測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。 図４は、前記構造式（Ａ）で表される化合物の重メタノール中で２５℃にて測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。 図５は、試験例１の結果を示すグラフである。 図６は、試験例２−１の結果を示すグラフである。 図７は、試験例２−２の結果を示すグラフである。 図８は、試験例３−１の結果を示すグラフである。 図９は、試験例３−２の結果を示すグラフである。 図１０は、試験例４の結果を示すグラフである。 図１１は、試験例５の結果を示すグラフである。

（新規化合物）
本発明の化合物は、下記構造式（Ａ）で表される化合物であり、本発明者らが分離した新規化合物である（以下、「レンツトレハロース（Ｌｅｎｔｚｔｒｅｈａｌｏｓｅ）」と称することがある）。

＜物理化学的性質＞
前記レンツトレハロースの物理化学的性質としては、次の通りである。
（１） 外観 ： 白色飴状
（２） 分子式 ： Ｃ_１７Ｈ_３２Ｏ_１３
なお、通常の状態では二水和物となり、元素分析ではＣ_１７Ｈ_３２Ｏ_１３・２Ｈ_２Ｏとして表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード） ：
実験値 ｍ／ｚ ４６７．１７３９ （Ｍ＋Ｎａ）^＋
計算値 ｍ／ｚ ４６７．１７３５ （Ｃ_１７Ｈ_３２Ｏ_１３Ｎａとして）
（４） 元素分析 ：
実験値 Ｃ４２．５ Ｈ７．７ Ｎ＜０．１
計算値（Ｃ_１７Ｈ_３２Ｏ_１３・２Ｈ_２Ｏ） Ｃ４２．５ Ｈ７．５
（５） 比旋光度 ： ［α］Ｄ^２２＝＋１３７°（ｃ ０．９４， ＭｅＯＨ）
（６） 赤外線吸収スペクトル ：
赤外線吸収スペクトルは、図１に示す通りである。
ν_ｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１ ： ３３９９．８９、 ２９３５．１３、 １６５２．７０、 １３７５．００、 １１５０．３３、 １０７８．９８、 １０４７．１６、 ９９１．２３、 ８０２．２４、 ６１０．３６
（７） 紫外線吸収スペクトル ：
水溶液における紫外線吸収は、図２に示す通り、ほとんど見られない（２００ｎｍにおけるε値は、水中で２０２であり、０．００５Ｍ ＨＣｌ中で１９２である）。
（８） プロトン核磁気共鳴スペクトル ：
６００ＭＨｚにおいて重メタノール中で２５℃にて測定した結果は、図３、及び表１に示す通りである。
（９） 炭素１３核磁気共鳴スペクトル ：
１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で２５℃にて測定した結果は、図４、及び表１に示す通りである。
（１０） 高速液体クロマトグラフィー ：
Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８ ＨＳ１２Ｓ０５−２５２０ ＷＴ（粒子径５μｍ、内径２０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、株式会社ワイエムシィ製）カラム、展開溶媒として水を用いて流速９．９ｍＬ／ｍｉｎで展開したときの保持時間は１５分である。

化合物が、前記構造式（Ａ）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、前記質量分析法、前記赤外分光法、前記紫外分光法、前記プロトン核磁気共鳴分光法、前記炭素１３核磁気共鳴分光法等の分析方法などが挙げられる。なお、前記各分析方法による測定値には、多少の誤差が生じることがあるが、当業者であれば、化合物が前記構造式（Ａ）で表される構造を有することは容易に同定することが可能である。

前記構造式（Ａ）で表される化合物の態様は、通常、水和物の態様であるが、塩の態様であってもよい。
前記塩としては、薬理学的に許容され得る塩であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酢酸塩、クエン酸塩等の有機塩、塩酸塩、炭酸塩などが挙げられる。

前記構造式（Ａ）で表される化合物は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する微生物から得られたものであってもよいし、化学合成により得られたものであってもよいが、後述する本発明の化合物の製造方法により得られることが好ましい。

＜用途＞
前記構造式（Ａ）で表される化合物は、後述する試験例で示されるように、優れた抗腫瘍作用、優れた骨強化作用、若しくは、優れた体重増加抑制作用を有し、安全性の高い化合物である。また、甘味料の成分としても用いることができる。そのため、前記構造式（Ａ）で表される化合物は、例えば、後述する本発明の、化合物含有組成物、抗腫瘍剤、骨強化剤、体重増加抑制剤、甘味料などの有効成分として好適に利用可能である。

（化合物の製造方法）
本発明の前記構造式（Ａ）で表される化合物の製造方法は、培養工程と、採取工程とを少なくとも含み、必要に応じてさらにその他の工程を含む。

＜培養工程＞
前記培養工程は、レンツィア（Ｌｅｎｔｚｅａ）属に属し、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程である。

前記微生物としては、レンツィア（Ｌｅｎｔｚｅａ）属に属し、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明者らの分離したレンツィア エスピー（Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ．）ＭＬ４５７−ｍＦ８株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１５８６、詳細は後述する本発明の微生物の項目に記す）が挙げられる。また、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産できるその他の菌株についても、常法によって、自然界より分離することが可能である。なお、前記レンツィア エスピー（Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ．）ＭＬ４５７−ｍＦ８株を含め、前記構造式（Ａ）で表される化合物の生産菌を、放射線照射やその他の変異処理に供することにより、前記構造式（Ａ）で表される化合物の生産能を高めることも可能である。更に、遺伝子工学的手法による前記構造式（Ａ）で表される化合物の生産も可能である。

前記微生物が前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有することを分析する方法としては、例えば、該微生物の培養物、好ましくは、液体培養後の培養上清中又は固体培養後の固体培地中の成分の、抗腫瘍作用、骨強化作用、若しくは体重増加抑制作用を分析する方法、各種分析法により前記構造式（Ａ）で表される化合物を検出する方法などが挙げられる。

前記培養は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する生産菌（以下、単に「化合物生産菌」と称することがある）を栄養培地（以下、単に「培地」と称することがある）中に接種し、前記構造式（Ａ）で表される化合物の生産に良好な温度で培養することによって行われる。

前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来放線菌の培養に利用されている公知のものを使用することができ、液体培地であってもよく、固体（寒天）培地であってもよい。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販されている大豆粉、小麦胚芽、押し麦、ペプトン、綿実粕、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等の窒素源；トマトペースト、グリセリン、デンプン、グルコース、ガラクトース、デキストリン、バクトソイトン等の炭水化物、脂肪等の炭素源；などが挙げられる。
更に、食塩、炭酸カルシウム等の無機塩を培地に添加して使用することもでき、その他、必要に応じて微量の金属塩を培地に添加して使用することもできる。
これらの材料は、前記化合物生産菌が利用し、前記構造式（Ａ）で表される化合物の生産に役立つものであればよく、公知の培養材料は全て用いることができる。

前記構造式（Ａ）で表される化合物の生産のための前培養液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、液体培地、平板培地、斜面培地、半斜面培地などの培地上で前記化合物生産菌を培養した生育物などを使用することができる。

前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、振とう培養、静置培養、タンク培養などが挙げられる。
前記培養の温度としては、前記化合物生産菌の発育が実質的に阻害されずに、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産し得る範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができるが、２５℃〜３５℃が好ましい。
前記培養のｐＨとしては、前記化合物生産菌の発育が実質的に阻害されずに、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産し得る範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができる。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、前記構造式（Ａ）で表される化合物の蓄積に合わせて適宜選択することができる。

＜採取工程＞
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物から前記構造式（Ａ）で表される化合物を採取する工程である。
前記構造式（Ａ）で表される化合物は、上述した物理化学的性質を有するので、その性質に従って培養物から採取することができる。

前記培養物としては、前記培養工程で得られ、前記構造式（Ａ）で表される化合物を含むものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、菌体、液体培養後の培養上清、固体培養後の固体培地、及びこれらの混合物などが挙げられる。
なお、前記培養物として、前記菌体を用いる場合は、適当な有機溶媒を用いた抽出方法や、菌体破砕による溶出方法などにより、前記構造式（Ａ）で表される化合物を菌体から抽出し、これを分離及び／又は精製に供してもよい。

前記採取の方法としては、特に制限はなく、微生物の生産する代謝物を採取するのに用いられる方法を適宜選択することができる。例えば、溶媒抽出法、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する方法、クロマトグラフ法などが挙げられる。これらの方法を単独又は適宜組み合せて、場合によっては反復使用することにより、分離及び／又は精製された前記構造式（Ａ）で表される化合物を採取することができる。

前記溶媒抽出法に用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、メタノール、アセトン、ブタノール、アセトニトリルなどが挙げられる。

前記吸着剤としては、特に制限はなく、公知の吸着剤の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン系吸着樹脂などが挙げられる。

前記クロマトグラフ法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薄層クロマトグラフ法、順相あるいは逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフ（分取用ＨＰＬＣ）法などが挙げられる。
前記クロマトグラフ法に用いる担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン交換樹脂、ゲル濾過、シリカゲル、アルミナ、活性炭などが挙げられる。
前記クロマトグラフ法に用いる担体の市販品の具体例としては、アンバーライト（登録商標）ＣＧ５０（シグマアルドリッチ株式会社製）等のイオン交換樹脂；Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ−２０（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社製）等のゲル濾過；Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８ ＨＳ１２Ｓ０５−２５２０ ＷＴ（株式会社ワイエムシィ製）等のシリカゲル；などが挙げられる。

前記吸着剤や前記クロマトグラフ法における担体から前記構造式（Ａ）で表される化合物を溶出させる方法としては、特に制限はなく、該吸着剤や該担体の種類や性質等に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリスチレン系吸着樹脂の場合には、溶出溶媒として、含水アルコール、含水アセトン等を用いて溶出する方法などが挙げられる。

以上のようにして前記構造式（Ａ）で表される化合物を製造することができる。

＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

（微生物）
本発明の微生物は、レンツィア（Ｌｅｎｔｚｅａ）属に属し、上述した本発明の化合物、即ちレンツトレハロースを生産する能力を有する。前記微生物は、レンツトレハロースを生産する能力を有し、そのために、上述した本発明の化合物の製造方法において、レンツトレハロースの生産菌として使用され得る微生物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

このような微生物の中でも、特に、公益財団法人 微生物化学研究会 微生物化学研究所において、新潟県佐渡市の土壌より分離された放線菌で、ＭＬ４５７−ｍＦ８株の菌株番号が付された微生物を使用することが好ましい。前記ＭＬ４５７−ｍＦ８株の菌学的性状は、以下の通りである。

１．形態
ＭＬ４５７−ｍＦ８株は、分枝した基生菌糸より、直状もしくは曲状の気菌糸を伸長する。成熟した胞子鎖は１０〜２０個の柱筒状の胞子を連鎖する。胞子の大きさは約０.４〜０.５×１.１〜１.５ミクロンで、胞子の表面は平滑である。

２．各種培地における生育状態
色の記載について［ ］内に示す標準は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ の ｃｏｌｏｒ ｈａｒｍｏｎｙ ｍａｎｕａｌ）を用いた。
（１）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、３０℃培養）
うす黄［２ ｇｃ， Ｂａｍｂｏｏ］の発育上に、白［Ｎｅａｒ ｇｒａｙ ｓｅｒｉｅｓ， ３ ｂａ， Ｐｅａｒｌ］の気菌糸を着生する。可溶性色素は認められない。
（２）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、３０℃培養）
うす黄［１ ｃａ， Ｐａｌｅ ｙｅｌｌｏｗ］の発育上に、白［Ｔｈｅ ｇｒａｙ ｓｃａｌｅ， ａ， Ｗｈｉｔｅ］の気菌糸を着生する。可溶性色素は認められない。
（３）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、３０℃培養）
うす黄［３ ｃａ， Ｓｈｅｌｌ］〜暗い黄［２ ｌｅ， Ｍｕｓｔａｒｄ］の発育上に、白［Ｔｈｅ ｇｒａｙ ｓｃａｌｅ， ａ， Ｗｈｉｔｅ］の気菌糸を着生する。可溶性色素は認められない。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、３０℃培養）
うす黄［１ １／２ ｅａ， Ｌｔ Ｙｅｌｌｏｗ］〜にぶ黄だいだい［３ ｉｃ， Ｌｔ Ａｍｂｅｒ］の発育上に、白［Ｎｅａｒ ｇｒａｙ ｓｅｒｉｅｓ， ３ ｂａ， Ｐｅａｒｌ］の気菌糸を着生する。可溶性色素は認められない。
（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７、３０℃培養）
うす黄茶［２ ｐｅ， Ｍｕｓｔａｒｄ Ｇｏｌｄ］の発育上に、白［Ｎｅａｒ ｇｒａｙ ｓｅｒｉｅｓ， ３ ｃｂ， Ｓａｎｄ］の気菌糸を着生する。可溶性色素は認められない。
（６）シュクロース・硝酸塩寒天培地（３０℃培養）
うす黄［２ ｃａ， Ｌｔ Ｉｖｏｒｙ］〜にぶ黄［２ ｉｃ， Ｈｏｎｅｙ Ｇｏｌｄ］の発育上に、白［Ｔｈｅ ｇｒａｙ ｓｃａｌｅ， ｂ， Ｏｙｓｔｅｒ Ｗｈｉｔｅ］の気菌糸を着生する。可溶性色素は認められない。

３．生理的性質
（１）生育温度範囲
イースト・スターチ寒天培地（溶性デンプン １％、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．２％、ひも寒天 ２．６％、ｐＨ７．０）を用い、１０℃、２０℃、２７℃、３０℃、３７℃、４２℃及び５０℃の各温度で試験した結果、１０℃及び５０℃での生育は認められず、２０℃〜４２℃の範囲で生育した。生育至適温度は３０℃付近である。

４．菌体成分
細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸はｍｅｓｏ−型である。

５．１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（１，４７４ｂｐ）を決定し、ＤＮＡデータベースに登録された公知菌株のデータと比較した。その結果、ＭＬ４５７−ｍＦ８株の塩基配列は以下に示すように、レンツィア（Ｌｅｎｔｚｅａ）属放線菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と高い相同性を示した。即ち、Ｌｅｎｔｚｉａ ｗａｙｗａｙａｎｄｅｎｓｉｓ（９９．１％）、Ｌ． ａｌｂｉｄａ（９９．０％）、Ｌ． ｖｉｏｌａｃｅａ（９８．５％）等である。なお、括弧内は塩基配列の相同値を表記した。

以上の性状を要約すると、ＭＬ４５７−ｍＦ８株は、その形態上、分枝した基生菌糸より、直状および曲状の気菌糸を伸長する。その先端は柱筒状の胞子を連鎖する。種々の培地で、うす黄〜うすだいだいの発育上に白〜灰白の気菌糸を着生する。生育至適温度は３０℃付近である。
ＭＬ４５７−ｍＦ８株の細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸はｍｅｓｏ−型である。
ＭＬ４５７−ｍＦ８株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列を解析し、公知菌株のデータと比較したところ、レンツィア属放線菌と高い相同性を示した。

以上の結果より、ＭＬ４５７−ｍＦ８株はレンツィア（Ｌｅｎｔｚｅａ）属に属するものと考えられる。そこで、ＭＬ４５７−ｍＦ８株をレンツィア エスピー（Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ．）ＭＬ４５７−ｍＦ８とする。
なお、ＭＬ４５７−ｍＦ８株を独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託申請し、平成２５年４月９日、ＮＩＴＥ Ｐ−０１５８６として受託された。

なお、他の菌にも見られるように、前記ＭＬ４５７−ｍＦ８株は、性状が変化し易いが、例えば、前記ＭＬ４５７−ｍＦ８株に由来する突然変異株（例えば、自然変異株や、紫外線、エックス線、放射線、薬品等の変異処理により取得できる人工変異株）、形質接合体、遺伝子組換体などであっても、前記構造式（Ａ）で表される化合物を生産する能力を有するものは、本発明の微生物に含まれる。

（化合物含有組成物、抗腫瘍剤、骨強化剤、体重増加抑制剤）
＜化合物含有組成物＞
本発明の化合物含有組成物は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。

前記化合物含有組成物における前記構造式（Ａ）で表される化合物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記化合物含有組成物は、前記構造式（Ａ）で表される化合物そのものであってもよい。

−その他の成分−
前記化合物含有組成物におけるその他の成分としては、特に制限はなく、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。

前記殺菌剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等のカチオン性界面活性剤などが挙げられる。

前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、クレゾールなどが挙げられる。

前記粘結剤、増粘剤、固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デンプン、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。

前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。

前記ｐＨ調整剤又は前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。

前記等張化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。

前記化合物含有組成物における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、前記構造式（Ａ）で表される化合物の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。

−用途−
前記化合物含有組成物は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を含むため、優れた抗腫瘍作用、優れた骨強化作用、及び優れた体重増加抑制作用の少なくともいずれかを有し、また、甘味も有し、安全性が高く、例えば、医薬組成物、抗腫瘍剤、骨強化剤、体重増加抑制剤、食品添加物などとして好適に利用可能である。
なお、前記化合物含有組成物は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記化合物含有組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。

＜抗腫瘍剤＞
本発明の抗腫瘍剤は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。

前記抗腫瘍剤における前記構造式（Ａ）で表される化合物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記抗腫瘍剤は、前記構造式（Ａ）で表される化合物そのものであってもよい。

−その他の成分−
前記抗腫瘍剤におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記化合物含有組成物で記載したその他の成分と同様のものが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

前記抗腫瘍剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、前記構造式（Ａ）で表される化合物の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。

−用途−
前記抗腫瘍剤は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を含むため、優れた抗腫瘍作用を有し、安全性が高く、肉腫などの予防剤又は治療剤として好適に利用可能である。
なお、前記抗腫瘍剤は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記抗腫瘍剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。

＜骨強化剤＞
本発明の骨強化剤は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。

前記骨強化剤における前記構造式（Ａ）で表される化合物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記骨強化剤は、前記構造式（Ａ）で表される化合物そのものであってもよい。

−その他の成分−
前記骨強化剤におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記化合物含有組成物で記載したその他の成分と同様のものが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

前記骨強化剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、前記構造式（Ａ）で表される化合物の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。

−用途−
前記骨強化剤は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を含むため、優れた骨強化作用を有し、安全性が高く、例えば、骨粗鬆症の予防剤又は治療剤、骨強化用の食品の添加物として好適に利用可能である。
なお、前記骨強化剤は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記骨強化剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
また、後述する試験例で示すように、前記骨強化剤は、閉経後の雌の個体に対して好適に用いることが可能である。

＜体重増加抑制剤＞
本発明の体重増加抑制剤は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。

前記体重増加抑制剤における前記構造式（Ａ）で表される化合物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記体重増加抑制剤は、前記構造式（Ａ）で表される化合物そのものであってもよい。

−その他の成分−
前記体重増加抑制剤におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記化合物含有組成物で記載したその他の成分と同様のものが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

前記体重増加抑制剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、前記構造式（Ａ）で表される化合物の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。

−用途−
前記体重増加抑制剤は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を含むため、優れた体重増加抑制作用を有し、安全性が高く、例えば、肥満の予防剤又は治療剤、ダイエット用の食品の添加物として好適に利用可能である。
なお、前記体重増加抑制剤は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記体重増加抑制剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
また、後述する試験例で示すように、前記体重増加抑制剤は、成体の個体に対して好適に用いることが可能である。

＜剤形＞
前記化合物含有組成物、抗腫瘍剤、骨強化剤、及び体重増加抑制剤の剤形としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。これらの剤形の前記化合物含有組成物、抗腫瘍剤、骨強化剤、及び体重増加抑制剤は、常法に従い製造することができる。

−固形剤−
前記固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、錠剤、チュアブル錠、発泡錠、口腔内崩壊錠、トローチ剤、ドロップ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、ドライシロップ剤、浸剤などが挙げられる。
前記固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、坐剤、パップ剤、プラスター剤などが挙げられる。

−半固形剤−
前記半固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、舐剤、チューインガム剤、ホイップ剤、ゼリー剤などが挙げられる。
前記半固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、インヘラー剤、ナザールジェル剤などが挙げられる。

−液剤−
前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤などが挙げられる。
前記液剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。

＜投与＞
前記化合物含有組成物、抗腫瘍剤、骨強化剤、及び体重増加抑制剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、例えば、局所投与法、経腸投与法、非経口投与法などが挙げられる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いることができる。

（甘味料）
本発明の甘味料は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。

前記甘味料における前記構造式（Ａ）で表される化合物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記甘味料は、前記構造式（Ａ）で表される化合物そのものであってもよい。

前記甘味料におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記化合物含有組成物で記載したその他の成分と同様のものが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

前記甘味料における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、前記構造式（Ａ）で表される化合物の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。

−用途−
前記甘味料は、前記構造式（Ａ）で表される化合物を含むため、優れた甘味を有し、安全性が高く、例えば、ダイエット用の食品の添加物として好適に利用可能である。
なお、前記甘味料は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする甘味料と併せて使用されてもよい。また、前記甘味料は、他の成分を有効成分とする甘味料中に、配合された状態で使用されてもよい。

前記甘味料の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粉末状、液状などが挙げられる。
前記甘味料の使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

以下に本発明の製造例、及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの製造例、及び試験例に何ら限定されるものではない。また、以下の製造例、及び試験例中、「％」は、特に明記のない限り「質量％」と表す。

（製造例１）
＜構造式（Ａ）で表される化合物の製造＞
−前培養液の調製−
ロータリーフラスコにＳ培地（２％ガラクトース、２％デキストリン、１％ ｓｏｙｐｅｐｔｏｎｅ、０．５％コーン・スティープ・リカー粉末、０．２％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．２％ ＣａＣＯ_３、シリコン消泡剤少量、ｐＨ７．４）を１１０ｍＬ入れ、レンツィア エスピー（Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ．）ＭＬ４５７−ｍＦ８株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１５８６）を植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで３日間培養し、前培養液を得た。

−培養工程−
押し麦１２０ｇに水を１５０ｍＬ加えて、１２１℃、２０分間オートクレーブした培地に、７０ｍＬの前記前培養液を加え、３０℃で１４日間、静置培養した。

−採取工程−
前記培養物に３２０ｍＬのエタノールを加え一晩抽出後、ペーパーフィルターにより濾過し、液体分を回収した。残渣に７０体積％エタノールを３２０ｍＬ加え、撹拌抽出後、同様に液体を回収し、初めの液体分と混ぜて、エバポレーターにより乾固した。
前記乾固したサンプルを１Ｌの水に溶解させ、そこに１Ｌの酢酸エチルを加え、よく混ぜた後、二層分配を行い、水層を回収し、エバポレーターにより乾固した。
前記水層乾固物を５０ｍＬの水で溶解し、Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８ ＨＳ１２Ｓ０５−２５２０ ＷＴ（株式会社ワイエムシィ製）を用いて、０．１％ ＴＦＡの均一溶媒系によるＨＰＬＣを数回行い、分離した。
前記レンツトレハロースを含む画分をメタノールを溶媒としたＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社製）カラムにかけ夾雑物を取り除き、エバポレーターにより乾固して精製し、レンツトレハロースを４３９ｍｇ得た。

−構造式（Ａ）で表される化合物（レンツトレハロース）の物理化学的性質−
得られたレンツトレハロースの物理化学的性質は、以下の通りであり、これらのことから、前記レンツトレハロースが、下記構造式（Ａ）で表される構造を有する新規化合物であることが確認された。
（１） 外観 ： 白色飴状
（２） 分子式 ： Ｃ_１７Ｈ_３２Ｏ_１３
なお、通常の状態では二水和物となり、元素分析ではＣ_１７Ｈ_３２Ｏ_１３・２Ｈ_２Ｏとして表される。
（３） 高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ：正イオンモード） ：
実験値 ｍ／ｚ ４６７．１７３９ （Ｍ＋Ｎａ）^＋
計算値 ｍ／ｚ ４６７．１７３５ （Ｃ_１７Ｈ_３２Ｏ_１３Ｎａとして）
（４） 元素分析 ：
実験値 Ｃ４２．５ Ｈ７．７ Ｎ＜０．１
計算値（Ｃ_１７Ｈ_３２Ｏ_１３・２Ｈ_２Ｏ） Ｃ４２．５ Ｈ７．５
（５） 比旋光度 ： ［α］Ｄ^２２＝＋１３７°（ｃ ０．９４， ＭｅＯＨ）
（６） 赤外線吸収スペクトル ：
赤外線吸収スペクトルは、図１に示す通りであった。
ν_ｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１ ： ３３９９．８９、 ２９３５．１３、 １６５２．７０、 １３７５．００、 １１５０．３３、 １０７８．９８、 １０４７．１６、 ９９１．２３、 ８０２．２４、 ６１０．３６
（７） 紫外線吸収スペクトル ：
水溶液における紫外線吸収は、図２に示す通り、ほとんど見られなかった（２００ｎｍにおけるε値は、水中で２０２であり、０．００５Ｍ ＨＣｌ中で１９２であった）。
（８） プロトン核磁気共鳴スペクトル ：
６００ＭＨｚにおいて重メタノール中で２５℃にて測定した結果は、図３、及び表２に示す通りであった。
（９） 炭素１３核磁気共鳴スペクトル ：
１５０ＭＨｚにおいて重メタノール中で２５℃にて測定した結果は、図４、及び表２に示す通りであった。
（１０） 高速液体クロマトグラフィー ：
Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８ ＨＳ１２Ｓ０５−２５２０ ＷＴ（粒子径５μｍ、内径２０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、株式会社ワイエムシィ製）カラム、展開溶媒として水を用いて流速９．９ｍＬ／ｍｉｎで展開したときの保持時間は１５分であった。

（試験例１：トレハレース反応試験）
各量のトレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、又はレンツトレハロース（Ｌｅｎｔｚｔｒｅｈａｌｏｓｅ）を１３５ｍＭ クエン酸バッファー（ｐＨ５．７）中で、０．２４ｕｎｉｔ／ｍＬのブタ腎臓トレハレース（Ｓｉｇｍａ社製、Ｔ８７７８）と３７℃で２０分間反応させた。
次いで、等量の５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加え反応を停止し、Ｇｌｕｃｏｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ社製、Ｇ３２９３）を３倍量加え室温で１５分間反応させた。
その後、３４０ｎｍで吸光度を測定し、グルコースをスタンダードとした検量線より、反応により放出されたグルコースの量を算出した。結果を図５に示した。

図５中、「○」はトレハロースの結果を示し、「●」はレンツトレハロースの結果を示す。
トレハロースは、トレハレースによって分解され、２分子のグルコースになるのに対し、図５に示されるように、レンツトレハロースは、トレハレースによって分解されにくく、グルコースの放出がほとんど見られなかった。
そのため、レンツトレハロースは、哺乳類（例えば、ヒト）の体内で、トレハロースよりも低濃度で、トレハロースと同様の生物活性を示す可能性があることが示唆された。

（試験例２−１：急性毒性試験−１）
４週齢の雌ＩＣＲマウスに生理食塩水で溶解した各濃度のレンツトレハロースを静脈注射し、その後、２週間の体重変化を観察した。結果を図６に示した。
図６中、「○及び実線」で示したものは、レンツトレハロースを投与しなかった場合（Ｎｏｒｍａｌ）の結果であり、「●及び実線」で示したものは、レンツトレハロースを５００ｍｇ／ｋｇ／０．４ｍＬで投与した場合の結果であり、「■及び実線」で示したものは、レンツトレハロースを２５０ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果であり、「▲及び実線」で示したものは、レンツトレハロースを１２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果であり、「×及び実線」で示したものは、レンツトレハロースを６２．５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果であり、「●及び破線」で示したものは、レンツトレハロースを３１．２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果であり、「■及び破線」で示したものは、レンツトレハロースを１５．６ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果であり、「▲及び破線」で示したものは、レンツトレハロースを７．８ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果である。

また、各濃度のレンツトレハロースを静脈注射し、２週間後に解剖を行い、各臓器の重量を測定した。結果を表３に示した。

前記試験例２−１の経過観察の結果、全ての投与群において、特に異常は見られなかった。図６の結果から、レンツトレハロースによる毒性を示すような濃度依存的な体重の減少は、見られなかった。表３の結果から、解剖後の臓器重量についても、特にレンツトレハロースの濃度依存性は見られなかった。
以上の結果から、５００ｍｇ／ｋｇまでの投与量では、レンツトレハロースの静脈注射による毒性は無いといえる。

（試験例２−２：急性毒性試験−２）
４週齢の雌ＩＣＲマウスに生理食塩水で溶解した各濃度のレンツトレハロースを経口投与し、その後、２週間の体重変化を観察した。結果を図７に示した。
図７中、「○及び実線」で示したものは、レンツトレハロースを投与しなかった場合（Ｎｏｒｍａｌ）の結果であり、「●及び実線」で示したものは、レンツトレハロースを５００ｍｇ／ｋｇ／０．４ｍＬで投与した場合の結果であり、「■及び実線」で示したものは、レンツトレハロースを２５０ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果であり、「▲及び実線」で示したものは、レンツトレハロースを１２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果であり、「×及び実線」で示したものは、レンツトレハロースを６２．５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果であり、「●及び破線」で示したものは、レンツトレハロースを３１．２５ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果であり、「■及び破線」で示したものは、レンツトレハロースを１５．６ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果であり、「▲及び破線」で示したものは、レンツトレハロースを７．８ｍｇ／ｋｇ／０．２ｍＬで投与した場合の結果である。

また、各濃度のレンツトレハロースを経口投与し、２週間後に解剖を行い、各臓器の重量を測定した。結果を表４に示した。

前記試験例２−２の経過観察の結果、全ての投与群において、特に異常は見られなかった。図７の結果から、レンツトレハロースによる毒性を示すような濃度依存的な体重の減少は、見られなかった。表４の結果から、解剖後の臓器重量についても、特にレンツトレハロースの濃度依存性は見られなかった。
以上の結果から、５００ｍｇ／ｋｇまでの投与量では、レンツトレハロースの経口投与による毒性は無いといえる。

（試験例３−１：抗腫瘍活性試験−１）
Ｓ−１８０細胞（４×１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ生理食塩水）をＩＣＲマウス（雌、５週齢、ｎ＝５）鼠蹊部に皮下接種し、図８の矢尻で示されたスジュールでレンツトレハロース、トレハロース、又は生理食塩水を投与し、継時的な腫瘍の成長を測定した。結果を図８に示した。

図８中、「○及び点線」で示したものは、コントロール（生理食塩水）の場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｓａｌｉｎｅ））の結果であり、「▲及び点線」で示したものは、トレハロースを５０ｍｇ／ｋｇ経口投与した場合（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ５０ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）の結果であり、「●（黒）及び実線」で示したものは、レンツトレハロースを５０ｍｇ／ｋｇ経口投与した場合（Ｌｅｎｔｚｔｒｅｈａｌｏｓｅ ５０ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）の結果であり、「●（グレー）及び実線」で示したものは、レンツトレハロースを１２．５ｍｇ／ｋｇ経口投与した場合（Ｌｅｎｔｚｔｒｅｈａｌｏｓｅ １２．５ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）の結果であり、「●（黒）及び点線」で示したものは、レンツトレハロースを５０ｍｇ／ｋｇ静脈投与した場合（Ｌｅｎｔｚｔｒｅｈａｌｏｓｅ ５０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）の結果である。
図８の結果から、試験例３−１ではトレハロースによる抗腫瘍効果は確認されなかった。一方、レンツトレハロースでは、経口投与群及び静脈投与群ともに腫瘍抑制効果が見られた（ｐ＜０．１、図８中の「＊」）。

（試験例３−２：抗腫瘍活性試験−２）
Ｅｈｒｌｉｃｈ細胞（２×１０^６ｃｅｌｌｓ／２５０μＬ生理食塩水）をＩＣＲマウス（雌、５週齢、ｎ＝７）に腹腔内接種後、図９の矢尻で示されたスジュールでレンツトレハロース、又は生理食塩水を投与し、マウスの生存期間を観察した。結果を図９に示した。

図９中、「点線」は、コントロール（生理食塩水）の場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｓａｌｉｎｅ））の結果を示し、「実線」は、レンツトレハロースを５０ｍｇ／ｋｇ経口投与した場合（Ｌｅｎｔｚｔｒｅｈａｌｏｓｅ）の結果を示す。
図９の結果から、レンツトレハロース投与群では、約１４．７％の延命効果が見られた。

（試験例４：骨強化作用試験）
２０週齢のＩＣＲ雌マウスの卵巣を摘出後、以下の各群に分けて５週間飼育した。前記飼育後、大腿骨を以下のようにして採取し、計量した。各群の大腿骨と体重との比（大腿骨／体重（ｍｇ／ｇ））を図１０に示した。
＜群＞
Ｈ_２Ｏ： 飲料水を、通常の飲料水とした群（ｎ＝１６）
ＬＴ Ｈ： 飲料水を、レンツトレハロースを０．６ｍｇ／ｍＬ含む飲料水とした群（ｎ＝１７）
ＴＨ Ｈ： 飲料水を、トレハロースを１．２ｍｇ／ｍＬ含む飲料水とした群（ｎ＝１６）
ＴＨ Ｌ： 飲料水を、トレハロースを０．６ｍｇ／ｍＬ含む飲料水とした群（ｎ＝１５）
なお、比較として、全く手術をしなかった２０週齢のＩＣＲ雌マウス（以下、「Ｉｎｔａｃｔ」と称することがある。ｎ＝１０）と、皮膚を切開し、一旦卵巣を取り出した後、切らずにそのまま戻した２０週齢のＩＣＲ雌マウス（以下、「Ｓｈａｍ」と称することがある。ｎ＝１６）について、飲料水を通常の飲料水として同様に試験した。
＜大腿骨の採取及び計量＞
前記大腿骨の採取は、前記マウスの両脚大腿骨周辺を切り離し、解剖ばさみにより出来るだけ筋肉を取り除いた後、０．５ｍｇ／ｍＬのｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ社製、１７１００−０１７）と、３．３ｍｇ／ｍＬのｄｉｓｐａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ社製、１７１０５−０４１）とを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で、３７℃、１０時間処理を行った。その後、水とアセトンで１度ずつ洗浄し、十分に乾燥させて計量した。

図１０中、各棒グラフは、左から順に、「Ｉｎｔａｃｔ群」、「Ｓｈａｍ群」、「Ｈ_２Ｏ群」、「ＬＴ Ｈ群」、「ＴＨ Ｈ群」、「ＴＨ Ｌ群」の結果を示す。
図１０の結果から、「ＬＴ Ｈ群」では、「Ｈ_２Ｏ群」に比べて骨重量が増加する傾向が見られた。また、レンツトレハロースは、トレハロースよりも低い濃度で同等以上の効果が見られた。

（試験例５：体重増加抑制作用試験）
２０週齢のＩＣＲ雌マウスの卵巣を摘出後、以下の各群に分けて５週間飼育し、マウスの体重変化を観察した。結果を図１１に示した。
＜群＞
ＯＶＸ Ｈ_２Ｏ： 飲料水を、通常の飲料水とした群（ｎ＝１６）
ＯＶＸ ０．６ｍｇ／ｍＬ Ｌｅｎｔｚｔｒｅｈａｌｏｓｅ： 飲料水を、レンツトレハロースを０．６ｍｇ／ｍＬ含む飲料水とした群（ｎ＝１７）
ＯＶＸ ０．３ｍｇ／ｍＬ Ｌｅｎｔｚｔｒｅｈａｌｏｓｅ： 飲料水を、レンツトレハロースを０．３ｍｇ／ｍＬ含む飲料水とした群（ｎ＝１６）
ＯＶＸ １．２ｍｇ／ｍＬ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ： 飲料水を、トレハロースを１．２ｍｇ／ｍＬ含む飲料水とした群（ｎ＝１６）
ＯＶＸ ０．６ｍｇ／ｍＬ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ： 飲料水を、トレハロースを０．６ｍｇ／ｍＬ含む飲料水とした群（ｎ＝１５）

図１１中、「●及び実線」で示したものは、「ＯＶＸ Ｈ_２Ｏ群」の結果であり、「■及び実線」で示したものは、「ＯＶＸ ０．６ｍｇ／ｍＬ Ｌｅｎｔｚｔｒｅｈａｌｏｓｅ群」の結果であり、「□及び実線」で示したものは、「ＯＶＸ ０．３ｍｇ／ｍＬ Ｌｅｎｔｚｔｒｅｈａｌｏｓｅ群」の結果であり、「▲及び実線」で示したものは、「ＯＶＸ １．２ｍｇ／ｍＬ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ群」の結果であり、「△及び実線」で示したものは、「ＯＶＸ ０．６ｍｇ／ｍＬ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ群」の結果である。
図１１に示されるように、レンツトレハロースは、トレハロースの半分から１／４の量で、同等の体重増加抑制（又は体重減少）効果を示した。また、レンツトレハロースを投与したマウスでは、投与開始１週間後には約５％の体重減少が見られ、その効果は投与を続ける限り試験終了時まで継続した。なお、各投与群の間で、摂餌、摂水量に違いは見られず、また、体重増加抑制群で下痢や嘔吐などの作用も見られなかった。トレハロースでは、脂肪細胞肥大化抑制作用が報告されており、レンツトレハロースの作用も毒性ではなく、脂質代謝の変化によるものと考えられる。

（試験例６：甘味試験）
前記レンツトレハロースの甘味試験を以下のようにして行った。
サンプルとして、レンツトレハロース、トレハロース、及びシュクロースのそれぞれについて、５００ｍｇ／ｍＬの水溶液を作製した。被験者１０名が、前記各水溶液を１０μＬ舐め、シュクロースの甘さを１０とし、水のみの甘さを０として、前記レンツトレハロース、及びトレハロースの甘さを点数化した。なお、前記レンツトレハロース、及びトレハロースのサンプルを舐める際には、サンプル名を伏せて試験を行った。結果を表５に示した。

表５の結果から、レンツトレハロースは、トレハロースと同程度の甘味を有しており、甘味料としても用いることができることがわかった。

ＮＩＴＥ Ｐ−０１５８６

本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ 下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物である。
＜２＞ 前記＜１＞に記載の化合物の製造方法であって、
レンツィア（Ｌｅｎｔｚｅａ）属に属し、前記＜１＞に記載の化合物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から前記＜１＞に記載の化合物を採取する採取工程とを含むことを特徴とする化合物の製造方法である。
＜３＞ レンツィア（Ｌｅｎｔｚｅａ）属に属し、前記＜１＞に記載の化合物を生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１５８６のレンツィア エスピー（Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ．）ＭＬ４５７−ｍＦ８株である前記＜２＞に記載の化合物の製造方法である。
＜４＞ レンツィア（Ｌｅｎｔｚｅａ）属に属し、前記＜１＞に記載の化合物を生産する能力を有することを特徴とする微生物である。
＜５＞ 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１５８６のレンツィア エスピー（Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ．）ＭＬ４５７−ｍＦ８株である前記＜４＞に記載の微生物である。
＜６＞ 前記＜１＞に記載の化合物を含むことを特徴とする化合物含有組成物である。
＜７＞ 前記＜１＞に記載の化合物を含むことを特徴とする抗腫瘍剤である。
＜８＞ 前記＜１＞に記載の化合物を含むことを特徴とする骨強化剤である。
＜９＞ 前記＜１＞に記載の化合物を含むことを特徴とする体重増加抑制剤である。
＜１０＞ 前記＜１＞に記載の化合物を含むことを特徴とする甘味料である。

本発明の構造式（Ａ）で表される新規化合物（レンツトレハロース）は、優れた抗腫瘍作用、優れた骨強化作用、及び優れた体重増加抑制作用の少なくともいずれかを有し、安全性の高い化合物であり、また、甘味料の成分としても用いることができるため、医薬組成物、抗腫瘍剤、骨強化剤、体重増加抑制剤、甘味料などの有効成分として好適に利用可能である。

Claims (10)

1. 下記構造式（Ａ）で表されることを特徴とする化合物。
   
2. 請求項１に記載の化合物の製造方法であって、
   レンツィア（Ｌｅｎｔｚｅａ）属に属し、請求項１に記載の化合物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
   前記培養工程で得られた培養物から請求項１に記載の化合物を採取する採取工程とを含むことを特徴とする化合物の製造方法。
3. レンツィア（Ｌｅｎｔｚｅａ）属に属し、請求項１に記載の化合物を生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１５８６のレンツィア エスピー（Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ．）ＭＬ４５７−ｍＦ８株である請求項２に記載の化合物の製造方法。
4. レンツィア（Ｌｅｎｔｚｅａ）属に属し、請求項１に記載の化合物を生産する能力を有することを特徴とする微生物。
5. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１５８６のレンツィア エスピー（Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ．）ＭＬ４５７−ｍＦ８株である請求項４に記載の微生物。
6. 請求項１に記載の化合物を含むことを特徴とする化合物含有組成物。
7. 請求項１に記載の化合物を含むことを特徴とする抗腫瘍剤。
8. 請求項１に記載の化合物を含むことを特徴とする骨強化剤。
9. 請求項１に記載の化合物を含むことを特徴とする体重増加抑制剤。
10. 請求項１に記載の化合物を含むことを特徴とする甘味料。