JP2014224782A - 血液凝固検査方法 - Google Patents

Abstract

【課題】凝固能が同じでも粘度が異なる検体であってもこれらを区別して正確に血液凝固検査ができるようにする。【解決手段】流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に緩衝液および血漿を含む検体を流路に導入し（第１工程）、流路を流れる流体の流速を測定して第１流速値を得る（第２工程）。次に、上記流路に新たに凝固活性剤を供給し、緩衝液，検体，および凝固活性剤が、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して第１工程と同じ状態で流路を流れる状態とし（第３工程）、流路を流れる流体の流速を測定して第２流速値を得る（第４工程）。この後、第１流速値で第２流速値を規格化した値により検体の血液凝固能を判定する（第５工程）。【選択図】 図１

Description

本発明は、血液や血漿の凝固能を測定する血液凝固検査方法に関するものである。

凝固活性は、臨床検査の重要な項目であり、凝固活性指標の１つにプロトロンビン時間（Prothrombin time：ＰＴ）がある。プロトロンビン時間を測定する血液凝固検査により、血液凝固活性（血液凝固能）を求めることができる。プロトロンビン時間は、外因系の凝固因子への感度が高いと考えられており、外因系の凝固因子の欠損のスクリーニングや、肝機能の異常、さらに経口投与による抗凝血薬療法のモニタリングに用いられる。

従来の血液凝固時間の測定には、撹拌抵抗方式，光散乱方式，熱伝導方式，水晶振動子方式などの方法が開発されているが、一般に、撹拌抵抗方式および光散乱方式が多く用いられている（非特許文献１参照）。撹拌抵抗方式は、試料（検体）を活性化剤と一緒に導入してフィンで撹拌し、撹拌の抵抗の上昇から血液凝固時間を測定する方法である。

光散乱方式は、測定容器内で、対象となる血漿に凝固活性化を促す成分を含む試薬を混合し、容器に対し光を入射させ、入射した光の散乱光の光量変化を測定して血液凝固時間を測定する方法である。散乱光量から血液凝固時間を得る方法としては、散乱光量をそのまま利用する方法、散乱光量の微分値を利用する方法、散乱光量がある一定値に達するまでの時間を求める方法がある。

屈折率変化を用いて測定する手法においては、マイクロ流路内における異なる地点の屈折率変化と、時間，溶液の移動距離から流速を算出し、算出した流速が血漿の凝固活性度の違いにより変化することを利用して血液凝固を検査する技術がある（特許文献１〜３参照）。マイクロ流路を用いた流速測定によれば、少量の検体で迅速かつ正確な凝固活性が測定できるという利点がある。

特開２０１１−２３２１３７号公報 特開２０１３−０５３９５９号公報 特開２０１３−０５２９６０号公報

小田由紀夫、「〈特集：凝固検査自動分析装置の現状〉、全自動血液凝固分析装置 COAGTRON」、生物試料分析、Vol. 32、 No. 5、２００９年。

しかしながら、マイクロ流路内を移送している検体の流速測定では、検体の流速が粘度に依存しているため、凝固能が同じでも粘度が異なる検体を測定する場合には、これらの凝固能を正しく区別できないという問題があった。

本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、凝固能が同じでも粘度が異なる検体であってもこれらを区別して正確に血液凝固検査ができるようにすることを目的とする。

本発明に係る血液凝固検査方法は、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に緩衝液および血漿を含む検体を流路に導入する第１工程と、流路を流れる流体の流速を測定して第１流速値を得る第２工程と、流路に新たに凝固活性剤を供給し、検体および凝固活性剤が、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して第１工程と同じ状態で流路を流れる状態とする第３工程と、凝固活性剤を供給した後で、流路を流れる流体の流速を測定して第２流速値を得る第４工程と、第１流速値で第２流速値を規格化した値により検体の血液凝固能を判定する第５工程とを備える。

上記血液凝固検査方法において、流路に接続して設けられた吸引流路の毛管力により吸引することで流れる状態とすればよい。また、流路に接続して設けられた吸引ポンプにより吸引することで流れる状態としてもよい。

上記血液凝固検査方法において、流速は、表面プラズモン共鳴に基づく流速測定により測定すればよい。

以上説明したことにより、本発明によれば、凝固能が同じでも粘度が異なる検体であってもこれらを区別して正確に血液凝固検査ができるようになるという優れた効果が得られる。

図１は、本発明の実施の形態における血液凝固検査方法を説明するフローチャートである。 図２は、フローセルの構成を示す平面図（ａ）および断面図（ｂ）である。 図３は、図２を用いて説明したフローセルを用いた血液凝固検査方法について説明する説明図である。 図４は、表面プラズモン共鳴測定装置の構成を示す構成図である。

以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における血液凝固検査方法を説明するフローチャートである。この方法は、まず、ステップＳ１０１で、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に緩衝液および血漿を含む検体を流路に導入する（第１工程）。次に、ステップＳ１０２で、流路を流れる流体の流速を測定して第１流速値を得る（第２工程）。

次に、ステップＳ１０３で、上記流路に新たに凝固活性剤を供給し、検体および凝固活性剤が、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して第１工程と同じ状態で流路を流れる状態とする（第３工程）。このようにして凝固活性剤を供給した後で、ステップＳ１０４で、流路を流れる流体の流速を測定して第２流速値を得る（第４工程）。以上のように、第１流速値および第２流速値を得たら、ステップＳ１０５で、第１流速値で第２流速値を規格化した値により検体の血液凝固能を判定する（第５工程）。

上述したように、実施の形態によれば、凝固活性剤を加えていない状態で測定した結果得られた第１流速値で、凝固活性剤を加えた状態で測定した第２流速値を規格化するようにしたので、検体（血漿）における粘性の影響を排除することができる。この結果、実施の形態によれば、凝固能が同じでも粘度が異なる検体であってもこれらを区別して正確に血液凝固検査ができるようになる。

次に、より詳細に説明する。まず、流速を測定するために用いる流路について説明する。測定には、図２に示すようなフローセルを用いればよい。図２は、フローセルの構成を示す平面図（ａ）および断面図（ｂ）である。このフローセルは、まず、ガラスなどの光を透過する下部基板２０１ａと、下部基板２０１ａの上に配置される上部基板２０２と、下部基板２０１ａと上部基板２０２との間に配置されるスペーサ部２０１ｂとを備える。

下部基板２０１ａは、例えば、ＢＫ７ガラスから構成することができる。また、下部基板２０１ａは、透明なプラスチックから構成してもよい。また、スペーサ部２０１ｂは、両面が接着面とされた樹脂のフィルムから構成されている。この場合、下部基板２０１ａ，スペーサ部２０１ｂ，上部基板２０２を重ねて接続することで、各々が接着固定されるものとなる。

下部基板２０１ａは、例えば、平面形状が１６ｍｍ×１６ｍｍで板厚が１ｍｍとされている。スペーサ部２０１ｂおよび上部基板２０２も、平面視の外形が１６ｍｍ×１６ｍｍとされている。また、上部基板２０２は、板厚３ｍｍ程度とされている。

上部基板２０２およびスペーサ部２０１ｂには、試料溶液が導入される導入口２０３が形成されている。導入口２０３は、上部基板２０２およびスペーサ部２０１ｂを貫通して形成されている。また、上部基板２０２と下部基板２０１ａとの間には、試料溶液が移送される流路２０４が配置されている。また、流路２０４の一端は、導入口２０３に接続している。流路２０４は、スペーサ部２０１ｂに形成された溝部により構成される。流路２０４は、例えば、幅１ｍｍ、高さ１０〜１００μｍ程度に形成されている。

また、このフローセルは、下部基板２０１ａの上部基板２０２側表面に、金属薄膜２０９が形成されている。金属薄膜２０９は、例えば、下部基板２０１ａ側のＴｉ層とチタン層の上に形成されたＡｕ層とから構成されている。例えば、よく知られたスパッタ法や真空蒸着法などにより、下地基板２０１ａの上に上記金属を堆積することで、金属薄膜２０９が形成できる。下部基板２０１ａの全域に金属薄膜２０９が形成されているので、流路２０４の下面（下部基板２０１ａ側）は、金属表面となる。

また、フローセルには、吸引流路２０６が形成され、吸引流路２０６には、流路２０４の他端が接続している。吸引流路２０６は、フローセルの流路２０４の両脇に展開して配置され、流路２０４の両脇の各々において、流路２０４に接続する連結部２０６ａおよび主吸引部２０６ｂを備える。導入口２０３と吸引流路２０６（連結部２０６ａ）とが、流路２０４により連通している。

また、吸引流路２０６の形成領域の上部基板２０２には、複数の貫通孔２０７が形成されている。貫通孔２０７は、例えば円筒形状（円管）である。例えば、連結部２０６ａにおいては、連結部２０６ａの幅方向には１つの貫通孔２０７が配置され、主吸引部２０６ｂにおいては、下部基板２０１ａ（上部基板２０２）の平面方向に、複数の貫通孔２０７が２次元的に配列されている。下部基板２０１ａと上部基板２０２の対向する方向に垂直な方向の吸引流路２０６の幅は、流路２０４より広く形成され、この幅方向に、複数の貫通孔２０７の列が配置され、この列が、幅方向に垂直な流路方向に配列されている。このような構造の上部基板２０２は、例えば、ポリジメチルシロキサンやアクリル樹脂などから形成すればよい。

ここで、流路２０４は、液体に対して毛細管現象が発現する範囲の断面寸法とされ、同様に、貫通孔２０７は、液体に対して毛細管現象が発現する範囲の管径とされている。また、吸引流路２０６の下部基板２０１ａおよび上部基板２０２の対向する方向（上下方向）の間隔は、流路２０４より液体が浸入したときに、上下方向に隙間が形成されない範囲とされている。言い換えると、浸入した液体が、吸引流路２０６の上下の両面に同時に接触可能な状態とされていればよい。

上述したフローセルによれば、導入口２０３より導入された試料溶液は、毛細管現象により流路２０４を流れて吸引流路２０６に浸入する。吸引流路２０６に到達した試料溶液は、今度は、貫通孔２０７の毛細管現象により吸い上げられる。このように、導入口２０３に導入された試料溶液は、吸引流路２０６における複数の貫通孔２０７に吸い上げられることで、流路２０４を所定の流速で吸引流路２０６の方向に流れていくことになる。

上記フローセルによれば、複数の貫通孔２０７が設けられている吸引流路２０６が、導入口２０３より導入される試料溶液を、所定の流速（流量）で流路２０４に流すための吸引ポンプとして機能する。流路２０４が、測定領域となる。また、このフローセルによれば、流路２０４の側方（両側）に、吸引流路２０６（主吸引部２０６ｂ）が展開して配置されているようにしたので、フローセル全体の面積を大きく広げることなく、吸引流路２０６の領域を拡大した状態となっている。

次に、上述したフローセルを用いた血液凝固検査方法について図３を用いて説明する。なお、図３では、フローセル２００の導入口２０３，流路２０４，吸引流路２０６を、仮想的に直線状に配列した状態として示している。

はじめに、導入口２０３に緩衝液としてオーレンベロナール緩衝液を１μＬ滴下する。この結果、図３の（ａ）に示すように、緩衝液２１１が、毛細管力によって流路２０４に導入されて流れていき、流路２０４を充填して吸引流路２０６に到達し、複数の貫通孔に吸い上げられていく。この後、ある程度の量の緩衝液２１１が、複数の貫通孔に吸い上げられたところで全体として釣り合い、流れが停止する。この結果、流路２０４が緩衝液２１１で充填された状態となる。

次に、図３の（ｂ）に示すように、７５％に希釈した血漿を含む検体２１２を、スポイト２０５により導入口２０３に１μＬ滴下する。このようにして新たに導入口２０３に検体２１２が供給されたことにより、吸引流路２０６の複数の貫通孔により緩衝液２１１が吸い上げられ、図３の（ｃ）に示すように、流路２０４の延在方向に、緩衝液２１１および検体２１２が直列に配列して隣り合う部分３２１が接触する状態で、流路２０４を流れる状態となる。この状態で、流速を測定して第１流速値を得る。

例えば、フローセル２００は、流路２０４の下側に金属薄膜２０９を備えており、図４に示すような表面プラズモン共鳴測定装置（ＳＰＲ）を用いることで流速が測定できる。この装置は、光源４０１，偏光板４０２，入射側レンズ４０３，プリズム４０４，測定面４０５，光検出部４０６，データ処理部４０７を備える。光源４０１は、例えば、発光ダイオードから構成すればよい。また、偏光板４０２は、ｐ偏光を通過させる。

測定においては、フローセル２００の下面（下部基板２０１ａ）を測定面４０５に設置する。プリズム４０４の測定面４０５と、フローセル２００との間には、マッチングオイル（不図示）を配置する。また、光源４０１からの光の光軸に、測定領域が重なるようにフローセル２００を載置する。

測定においては、まず、光源４０１から出射された光を、偏光板４０２を通過させて入射側レンズ４０３で集光してプリズム４０４に入射させ、プリズム４０４の測定面４０５に密着させているフローセル２００の測定領域に照射する。図２，図３を用いて説明したように、フローセル２００の測定領域となる流路２０４には金属薄膜２０９が形成されており、金属薄膜２０９の裏面に、フローセル２００を透過してきた集光光が照射される。

このようにして照射された集光光は、金属薄膜２０９の裏面で反射し、いわゆるＣＣＤイメージセンサなどの撮像素子よりなる光検出部４０５で光電変換されて強度（光強度）が得られる。このようにして得られた強度においては、流速測定対象の流体が接触した金属薄膜２０９の表面における、エバネッセント波と表面プラズモン波との共鳴が起こる角度で反射率が低くなる谷が観測される。この共鳴が起こる表面プラズモン共鳴角度は、金属薄膜２０９に接する測定対象の流体の屈折率に依存するため、光強度の変化により、屈折率の変化が求められる。データ処理部４０７では、上述した屈折率の変化から、流路２０４の測定領域を流れる流体の流速を算出する。得られた第１流速値は、７．５ｍｍ／ｓであった。

上述した流路２０４を緩衝液２１１および検体２１２が流れる状態は、例えば、図３の（ｄ）に示すように、検体２１２が流路２０４を充填して吸引流路２０６に到達し、ある程度、複数の貫通孔に吸い上げられたところで釣り合い、停止する。

次に、図３の（ｅ）に示すように、凝固活性剤２１３を、スポイト２０５により導入口２０３に滴下する。このようにして新たに導入口２０３に凝固活性剤２１３が供給されたことにより、吸引流路２０６の複数の貫通孔により緩衝液２１１および一部の検体２１２が吸い上げられ、図３の（ｆ）に示すように、流路２０４の延在方向に、検体２１２および凝固活性剤２１３が直列に配列して隣り合う部分３２２が接触する状態で、流路２０４を流れる状態となる。

この凝固活性剤２１３を加えた段階での流路２０４における流れは、吸引流路２０６における毛細管力により発生させており、図３の（ｃ）を用いて説明した検体２１２を加えた段階と、同じフローセルの同じ流路２０４における状態である。従って、凝固活性剤２１３を加えた段階での流路２０４における流れは、検体２１２を加えた段階での流路２０４における流れと、同じ状態（条件）となる。

ここで、凝固活性剤２１３が検体２１２に部分３２２で接触した時点で凝固反応が開始し、この後、凝固反応を起こしながら部分３２２は流路２０４を吸引流路２０６の方向に移動していく。この移動の速度が第２流速値として測定されるものとなる。

この状態で、前述同様に表面プラズモン共鳴測定装置により流速を測定して第２流速値を得る。測定の結果得られた第２流速値は、６．０ｍｍ／ｓであった。なお、流路２０４を検体２１２および凝固活性剤２１３が流れる状態は、例えば、図３の（ｆ）に示すように、検体２１２が、ある程度、複数の貫通孔に吸い上げられ、一方で、導入口２０３における凝固活性剤２１３がほぼなくなったところで全体が釣り合い、停止する。

以上のようにして得られた検体のみのときの第１流速値（７．５ｍｍ／ｓ）で、凝固反応中の第２流速値（６．０ｍｍ／ｓ）を規格化すると０．８となる。この規格化した値を凝固検査の指標として使用することで、検体（血漿）における粘性の影響を排除した状態で、検体の血液凝固能を判定することができる。

以上に説明したように、本発明によれば、緩衝液および血漿を含む検体が流路を流れる時の第１流速値で、検体に凝固活性剤を加えた状態で流路を流れる時の第２流速値を規格化するようにしたので、凝固能が同じでも粘度が異なる検体であってもこれらを区別して正確に血液凝固検査ができるようになる。

なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。例えば、流速は、表面プラズモン共鳴測定装置を用いた測定に限るものではない。

例えば、フローセルを透明な材料で構成すれば、流路を流れる流体の状態を、ビデオカメラなどにより撮像した結果により、流速測定を行うことができる。例えば、図２を用いて説明したフローセルの吸引流路２０６における貫通孔２０７を上昇する液面の移動状態をビデオカメラで撮像すれば、この移動距離と移動に要した時間とを求めることができる。この移動距離と移動に要した時間とから、流速を求めることができる。

また、上述では、毛細管力を用いた吸引により、流路に流れる状態を形成するようにしたが、これに限るものではなく、流路に吸引ポンプを接続して用いて流れる状態を形成するようにしてもよい。この場合、吸引ポンプの吸引力を、測定の間は一定の状態としておけばよい。

２０１ａ…下部基板、２０１ｂ…スペーサ部、２０２…上部基板、２０３…導入口、２０４…導入口、２０６…吸引流路、２０６ａ…連結部、２０６ｂ…主吸引部、２０７…貫通孔、２０９…金属薄膜。

Claims (4)

1. 流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して前記流路を流れる状態に緩衝液および血漿を含む検体を前記流路に導入する第１工程と、
   前記流路を流れる流体の流速を測定して第１流速値を得る第２工程と、
   前記流路に新たに凝固活性剤を供給し、前記検体および前記凝固活性剤が、前記流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して前記第１工程と同じ状態で前記流路を流れる状態とする第３工程と、
   前記凝固活性剤を供給した後で、前記流路を流れる流体の流速を測定して第２流速値を得る第４工程と、
   前記第１流速値で前記第２流速値を規格化した値により前記検体の血液凝固能を判定する第５工程と
   を備えることを特徴とする血液凝固検査方法。
2. 請求項１記載の血液凝固検査方法において、
   前記流路に接続して設けられた吸引流路の毛管力により吸引することで前記流れる状態とすることを特徴とする血液凝固検査方法。
3. 請求項１記載の血液凝固検査方法において、
   前記流路に接続して設けられた吸引ポンプにより吸引することで前記流れる状態とすることを特徴とする血液凝固検査方法。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の血液凝固検査方法において、
   前記流速は、表面プラズモン共鳴に基づく流速測定により測定することを特徴とする血液凝固検査方法。