JP2013053959A - 凝固活性測定装置、測定チップおよび測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】凝固活性測定装置は、溶液が流れる流路を備えた測定チップ100の流路の表面における屈折率を測定する表面プラズモン共鳴測定装置を備える。表面プラズモン共鳴測定装置は、プリズム1と、光源2と、偏光板3と、集光レンズ4と、CCDカメラ5と、データ処理装置6とから構成される。さらに、データ処理装置6は、測定チップ100の流路中に緩衝液が充填された後に、血液凝固を活性化する活性化剤と血漿とが混合された血漿サンプルが流路中に投入されたときの屈折率の変化から、流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出手段と、血漿の流速と凝固活性因子の指標との既知の関係に基づいて、流速算出手段が算出した流速から凝固活性因子の指標を算出する凝固活性因子指標算出手段とを備える。
【選択図】 図4
Description
上記のように、いずれの方式においても、複雑な凝固反応において、測定に供する血漿サンプル全体が凝固するレベル、いわば凝固反応の終状態レベルまで反応を進行させ観測している。
また、本発明の凝固活性測定装置の1構成例において、前記流速算出手段は、さらに、前記血漿サンプルの投入後に緩衝液が前記流路中に投入されたときの前記屈折率の変化から、血漿が緩衝液により押し流される際の洗浄流速を算出し、前記凝固活性因子指標算出手段は、前記血漿の流速と凝固活性因子の指標との既知の関係に基づいて、前記洗浄流速から凝固活性因子の指標を算出することを特徴とするものである。
また、本発明の凝固活性測定装置の1構成例において、前記凝固活性因子の指標は、プロトロンビン時間と相関するパラメータである。
本発明では、血液凝固の活性化を促す成分を含む試薬である活性化剤と血漿サンプルとをあらかじめ混合しておき、活性化剤と混合された血漿サンプルをマイクロ流路に導入して流速から凝固活性因子の指標を得る。マイクロ流路内の流速を求めるために、マイクロ流路の表面の位置を細分化して、それぞれの位置の屈折率の時間変化を観測する。
図1(A)に示すように、測定チップの基板1000上に形成された流路1001内を緩衝液1002で満たす。
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。図2は本発明の実施の形態に係る測定チップの構造を示す分解斜視図、図3は測定チップの平面図、図4は本発明の実施の形態に係る凝固活性測定装置の構成を示すブロック図である。
本実施の形態の測定チップ100は、略直方体状の外形をなし積層構造を有している。すなわち、水平方向の大きさが16mm×16mmで厚さが1mmのBK7ガラスあるいはプラスチックからなる矩形板状の透明の基板101と、平面視の外形が基板101と略同一に形成され、基板101上に積層される例えば樹脂からなる両面シール状のシート102と、平面視の外形が基板101と略同一に形成され、シート102上に積層されるアクリル筺体103とを備えている。
なお、本実施の形態においては、金薄膜104の表面にブロッキング剤105のスポットを形成するものとして説明したが、本発明では、金薄膜104の一部が凝固反応を阻害する生化学測定用ブロッキング剤により覆われていればよく、必ずしもスポットを形成する必要はない。
まず、測定対象の血漿とPT測定用試薬(活性化剤)とをそれぞれ37℃で温めておく。測定チップ100を凝固活性測定装置のプリズム1の平面上に載置し(図7ステップS1)、オーレン緩衝液4μLをインレット110から測定チップ100内に投入する(ステップS2)。緩衝液は、インレット110および円孔106を経て流路107〜109中に充填される。シート102に形成された流路107〜109のうち、観測領域の流路107が最も細くデザインされていることから、緩衝液は流路107内に留まる。
血漿サンプルの投入から60秒経過後に、さらにオーレン緩衝液4μLをインレット110から測定チップ100内に投入する(ステップS5)。血漿サンプルは、この追加投入された緩衝液により押し出されるようにして流路107中を進行する。
各測定チップ100について1回のみ測定を行い、測定を終えた測定チップ100は廃棄される。
データ処理装置6の画像処理部64は、CCDカメラ5から出力された濃淡画像データを取り込み、この濃淡画像データを処理して、光強度プロファイルを画像の1ライン毎に求める。
図8のX方向は図2〜図4のPX方向に対応し、図8のY方向は図2〜図4のPY方向に対応する。このY方向が、血漿の進行方向に相当する。図8の例では、CCDカメラ5が撮影した画像は、X方向が座標0〜479の480ピクセルからなり、Y方向も座標0〜479の480ピクセルからなるものとしている。図8におけるYnは、画像上のある1ラインのY座標を示している。
まず、血漿の流速VとPTとの関係の求め方について説明する。血漿の流速VとPTとの関係を求めるには、図7のステップS2で説明したとおり、流路中に緩衝液を充填した測定チップを用い、この測定チップに凝固活性値が既知の血漿を投入して、本実施の形態の凝固活性測定装置を用いて血漿の流速Vを算出すればよい。このとき用いるコントロール血漿の活性は、試薬に付属のデータから読み取り、またオーレン緩衝液でコントロール血漿を希釈することで、希釈率から活性値を調整して測定を実施した。また、コントロール血漿としては、正常域(活性82%)の血漿と異常域(活性32%)の血漿の両方を用いた。このような測定により、図11に示すような血漿の流速Vと血漿の活性値との関係を求めることができる。
PT[sec]=V[μm/sec]×0.0285[1/μm]
+2.48[sec] ・・・(1)
なお、言うまでもなく、血漿の流速Vは時間と共に変化するので、屈折率変化の時間変化の傾きも時間と共に変化する。本実施の形態では、血漿の進行によって最初に屈折率変化が起きた時点以降の複数点の屈折率変化から得られる血漿の流速V、すなわち血漿サンプルを投入したときの初速を計算して、この初速からPTを算出してもよいし、血漿サンプルを投入した後にさらに緩衝液を投入して血漿サンプルを洗い流す際の流速Vを算出して、この流速VからPTを算出してもよい。血漿サンプルが緩衝液により押し流される際の流速V、すなわち、図1(B)から図1(C)の状態に変化するときの流速Vを洗浄流速と定義すると、この洗浄流速も血漿サンプルの状態を反映するパラメータとなり得る。
Claims (7)
- 溶液が流れる流路を備えた測定チップの前記流路の表面における屈折率を測定する屈折率測定装置と、
前記測定チップの流路中に緩衝液が充填された後に、血液凝固を活性化する活性化剤と血漿とが混合された血漿サンプルが前記流路中に投入されたときの前記屈折率の変化から、前記流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出手段と、
前記血漿の流速と凝固活性因子の指標との既知の関係に基づいて、前記流速算出手段が算出した流速から凝固活性因子の指標を算出する凝固活性因子指標算出手段とを備えることを特徴とする凝固活性測定装置。 - 請求項1記載の凝固活性測定装置において、
前記流速算出手段は、さらに、前記血漿サンプルの投入後に緩衝液が前記流路中に投入されたときの前記屈折率の変化から、血漿が緩衝液により押し流される際の洗浄流速を算出し、
前記凝固活性因子指標算出手段は、前記血漿の流速と凝固活性因子の指標との既知の関係に基づいて、前記洗浄流速から凝固活性因子の指標を算出することを特徴とする凝固活性測定装置。 - 請求項1または2記載の凝固活性測定装置において、
前記凝固活性因子の指標は、プロトロンビン時間と相関するパラメータであることを特徴とする凝固活性測定装置。 - 緩衝液が充填された流路の表面における屈折率に基づいて流路中を進行する血漿の流速を算出し凝固活性因子の指標を算出する凝固活性測定装置用の測定チップであって、
基板表面に形成された金薄膜と、
この金薄膜上に形成された流路とを備え、
前記金薄膜は、その一部が凝固反応を阻害する生化学測定用ブロッキング剤により覆われていることを特徴とする測定チップ。 - 溶液が流れる流路を備えた測定チップの前記流路の表面における屈折率を測定する屈折率測定ステップと、
前記測定チップの流路中に緩衝液が充填された後に、血液凝固を活性化する活性化剤と血漿とが混合された血漿サンプルが前記流路中に投入されたときの前記屈折率の変化から、前記流路中を進行する血漿の流速を算出する流速算出ステップと、
前記血漿の流速と凝固活性因子の指標との既知の関係に基づいて、前記流速算出ステップで算出した流速から凝固活性因子の指標を算出する凝固活性因子指標算出ステップとを備えることを特徴とする凝固活性測定方法。 - 請求項5記載の凝固活性測定方法において、
前記流速算出ステップは、さらに、前記血漿サンプルの投入後に緩衝液が前記流路中に投入されたときの前記屈折率の変化から、血漿が緩衝液により押し流される際の洗浄流速を算出し、
前記凝固活性因子指標算出ステップは、前記血漿の流速と凝固活性因子の指標との既知の関係に基づいて、前記洗浄流速から凝固活性因子の指標を算出することを特徴とする凝固活性測定方法。 - 請求項5または6記載の凝固活性測定方法において、
前記凝固活性因子の指標は、プロトロンビン時間と相関するパラメータであることを特徴とする凝固活性測定方法。
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