JP5833716B1 - 血液凝固検査方法および血液凝固検査用流路チップ - Google Patents

Abstract

【課題】マイクロ流路を用いたＡＰＴＴ測定法による血液凝固検査で、正確な測定ができるようにする。【解決手段】第１流路１０３は、基板１０１の上に形成された直線状の管である。第１流路１０３は、内壁が血漿を含む検体および第１凝固活性剤溶液に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされ、第１流路１０３の一端に第１導入部１０２が接続し、他端に第２導入部１０４が接続している。第２流路１０５は、第２導入部１０４を介し、第１流路１０３の延長線上に形成された直線状の管である。第２流路１０５は、水に対して９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされている。第２流路１０５には、測定箇所１１２が配置される。【選択図】 図１

Description

本発明は、血液や血漿の凝固能を測定する血液凝固検査方法および血液凝固検査用流路チップに関するものである。

血液凝固活性は、外因系の凝固因子の欠損のスクリーニングや肝機能の異常、さらに経口投与による抗凝血薬療法のモニタリングに用いられる指標などを得るための重要な項目である。

このような血液凝固検査には、ＰＴ（プロトロンビン時間：Prothrombin Time）測定法、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間：Activated Partial Thromboplastin Time）測定法、およびフィブリノゲンテストなどが主に用いられている。これらの測定・テストは、病院内の大型分析装置を用いて実施されている。この中で、ＡＰＴＴ測定による検査では、凝固反応のトリガーとして、血液が凝固する主にタンパク質（トロンボモジュリンやエラグ酸）およびカルシウムイオンを血漿に混合し、混合開始から凝固完了までの時間（凝固点）を測定し、標準血漿の結果と比較して遅延時間を見積もっている。

この内外因性血液凝固ルートの血液凝固活性を測定するＰＴ法は、現在国際標準化（ＰＴ−ＩＮＲ）もされており再現性が高く信頼性の高い検査項目とされている。ＰＴ法を物理的に実施する方法として、まず、撹拌抵抗式がある。撹拌抵抗式は、試料（検体）を活性化剤と一緒に導入してフィンで撹拌し、撹拌の抵抗の上昇から血液凝固時間を測定する方法である。

また、ＰＴ測定法を実施する方法として光散乱法がある（特許文献１，２，３参照）。光散乱法は、測定容器内で、対象となる血漿に凝固活性化を促す成分を含む試薬を混合し、容器に対し光を入射させ、入射した光の散乱光の光量変化を測定して血液凝固時間を測定する方法である。散乱光量から血液凝固時間を得る方法としては、散乱光量をそのまま利用する方法、散乱光量の微分値を利用する方法、散乱光量がある一定値に達するまでの時間を求める方法がある（特許文献１参照）。

上述した撹拌抵抗式および光散乱法が、血液凝固の検査に現在一般に多く用いられている。これらの他に、熱伝導式、水晶振動子式、磁気ビーズによる凝集測定法（特許文献４参照）などが開発されている。

ＡＰＴＴ測定法においては、発明者らにより、マイクロ流路を備えるチップを用い、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定法で流速を測定することにより凝固活性を検査する方法が提案されている。この検査では、まず、エラグ酸などの凝固活性化剤を混合することによって完全に活性化した血漿試料を測定直前に調製する。次いで、予め塩化カルシウム溶液を満たしてある流路内に調整した血漿試料を導入することで、血漿試料が流路内を進む流速を凝固時間に変換して求めている（特許文献５参照）。また、血漿試料が流路内を移動する過程における屈折率の変化により、凝固能を検査する方法も開発されている。このようなマイクロ流路を用いた流速測定によれば、少量の検体で迅速な凝固活性が測定できるという利点がある。

特開平０６−０２７１１５号公報 特表２００９−５０６３３２号公報 特開平０９−２６６７９８号公報 特表平０９−５０２８００号公報 特開２０１１−２３２１３７号公報

ところで、ＡＰＴＴ測定法では、血漿にエラグ酸を混合して活性化させた後、この混合液に塩化カルシウム溶液を加えてさらに活性化させている。上述したマイクロ流路を用いる検査では、まず、マイクロ流路導入部に塩化カルシウム溶液を導入し、次いで血漿とエラグ酸との混合溶液を導入し、マイクロ流路に流通させ、マイクロ流路の途中に設けられた測定箇所で、流速や屈折率変化を測定する。

ところが、上述したように各溶液の導入は、ピペットなどを用いて実施されるが、血漿にエラグ酸溶液を加えるときに、気泡が発生しやすい状態となっている。この気泡がマイクロ流路に入り込み、測定箇所を流れていくと、正確な測定を阻害し、測定エラーを引き起こすという問題があった。

本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、マイクロ流路を用いたＡＰＴＴ測定法による血液凝固検査で、正確な測定ができるようにすることを目的とする。

本発明に係る血液凝固検査方法は、基板の上に形成され、内壁が血漿を含む検体および第１凝固活性剤溶液に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされた直線状の第１流路と、基板の上に形成されて第１流路の一端に接続された第１導入部と、基板の上に形成されて第１流路の他端に接続された第２導入部と、基板の上に第１流路の延長線上に形成され、水に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされ、一端が第２導入部に接続された直線状の第２流路と、第２流路の他端に接続された排出口とを備え、第１流路，第２流路，および第２導入部は、基板を共通の底面とし、第１流路が第２導入部に接続する第１流路接続面と、第２流路が第２導入部に接続する第２流路接続面とは、向かい合って配置されている血液凝固検査用流路チップを用い、第２導入部が空の状態で、第１導入部に検体を投入して第１流路の第１流路接続面まで検体で満たし、排出口より水を投入して第２流路の第２流路接続面まで水で満たし、第２流路において水に対して生じる毛細管力よりも小さな力で排出口より水を吸引する状態とする第１ステップと、第１ステップに続き、第２導入部が空の状態で、第１導入部に第１凝固活性剤溶液を投入して第１流路内の検体に第１凝固活性剤溶液を混合して混合検体とする第２ステップと、第２導入部に第２凝固活性剤溶液を投入し、第１流路接続面で混合検体と第２凝固活性剤溶液が接触し、第２流路接続面で水と第２凝固活性剤溶液が接触する状態とし、第１導入部の側より、混合検体，第２凝固活性剤溶液，水が、各々の隣り合う部分が接触して第２流路を流れる状態とする第３ステップと、混合検体と第２凝固活性剤溶液との接触領域が第２流路に設けられた測定箇所を通過していく過程における接触領域の移動速度、または接触領域で生じる屈折率変化を測定する第４ステップと、測定された移動速度または屈折率変化により、検体の血液凝固能を判定する第５ステップとを備える。

上記血液凝固検査方法において、第２導入部は、基板の法線方向に延在する流路から構成すればよい。また、第２導入部は、基板の平面に平行に延在する流路から構成し、基板の平面の法線方向の流路高さを、第１流路および第２流路より高くするものとしてもよい。

また、本発明に係る血液凝固検査用流路チップは、基板の上に形成され、内壁が血漿を含む検体および第１凝固活性剤溶液に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされた直線状の第１流路と、基板の上に形成されて第１流路の一端に接続された第１導入部と、基板の上に形成されて第１流路の他端に接続された第２導入部と、基板の上に第１流路の延長線上に形成され、水に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされ、一端が第２導入部に接続された直線状の第２流路と、第２流路の他端に接続された排出口と、第２流路に設けられた測定箇所とを備え、第１流路，第２流路，および第２導入部は、基板を共通の底面とし、第１流路が第２導入部に接続する第１流路接続面と、第２流路が第２導入部に接続する第２流路接続面とは、向かい合って配置されている。

上記血液凝固検査用流路チップにおいて、第２導入部は、基板の法線方向に延在する流路から構成されていればよい。また、第２導入部は、基板の平面に平行に延在する流路から構成され、基板の平面の法線方向の流路高さが、第１流路および第２流路より高くされているものとしてもよい。

以上説明したことにより、本発明によれば、マイクロ流路を用いたＡＰＴＴ測定法による血液凝固検査で、正確な測定ができるようになるという優れた効果が得られる。

図１は、本発明の実施の形態１において用いられる血液凝固検査用流路チップの構成を示す平面図（ａ）および断面図（ｂ）である。 図２Ａは、本発明の実施の形態１における血液凝固検査方法を説明する各ステップにおける状態を示す構成図である。 図２Ｂは、本発明の実施の形態１における血液凝固検査方法を説明する各ステップにおける状態を示す構成図である。 図２Ｃは、本発明の実施の形態１における血液凝固検査方法を説明する各ステップにおける状態を示す構成図である。 図２Ｄは、本発明の実施の形態１における血液凝固検査方法を説明する各ステップにおける状態を示す構成図である。 図３は、本発明の実施の形態２において用いられる血液凝固検査用流路チップの構成を示す平面図（ａ）および断面図（ｂ），（ｃ）である。 図４Ａは、本発明の実施の形態２における血液凝固検査方法を説明する各ステップにおける状態を示す構成図である。 図４Ｂは、本発明の実施の形態２における血液凝固検査方法を説明する各ステップにおける状態を示す構成図である。 図４Ｃは、本発明の実施の形態２における血液凝固検査方法を説明する各ステップにおける状態を示す構成図である。 図４Ｄは、本発明の実施の形態２における血液凝固検査方法を説明する各ステップにおける状態を示す構成図である。

以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。

［実施の形態１］
はじめに、本発明の実施の形態１について、図１，図２Ａ〜図２Ｄを用いて説明する。図１は、本発明の実施の形態１において用いられる血液凝固検査用流路チップの構成を示す平面図（ａ）および断面図（ｂ）である。また、図２Ａ〜図２Ｄは、本発明の実施の形態１における血液凝固検査方法を説明する各ステップにおける状態を示す構成図である。ここでは、断面を模式的に示している。

血液凝固検査用流路チップは、第１導入部１０２，第１流路１０３，第２導入部１０４，第２流路１０５，排出口１０６を備える。

第１流路１０３は、基板１０１の上に形成された直線状の管である。第１流路１０３は、内壁が血漿を含む検体および第１凝固活性剤溶液に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされている。このように構成された第１流路１０３の一端に第１導入部１０２が接続し、他端に第２導入部１０４が接続している。第１凝固活性剤は、例えばエラグ酸（Ｃ₁₄Ｈ₆Ｏ₈）などの接触因子活性化物質である。

第２流路１０５は、第１流路１０３の延長線上に形成された直線状の管である。第２流路１０５は、水に対して９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされている。このように構成された第２流路１０５の一端が、第２導入部１０４に接続され、他端が、排出口１０６に接続されている。また、第２流路１０５には、測定箇所１１２が配置される。この例では、基板１０１の表面にＡｕ層１１１が形成され、よく知られた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定法により、測定箇所１１２を通過する流体の流速、および屈折率変化が測定可能とされている。

ここで、第１流路１０３，第２流路１０５，および第２導入部１０４は、基板１０１を共通の底面として形成されている。なお、この例では、ＢＫ７ガラスからなる基板１０１と、膜厚５０ｎｍ程度のＡｕ層１１１と、溝および貫通穴などにより各流路，導入部，排出口などが形成された流路基板１０１ａとから上記チップが構成され、表面に形成されているＡｕ層１１１を含めて全体で基板１０１としている。従って、この例では、第１流路１０３，第２流路１０５，および第２導入部１０４は、Ａｕ層１１１の表面を共通の底面としていることになる。

加えて、第１流路１０３が第２導入部１０４に接続する第１流路接続面１３１と、第２流路１０５が第２導入部１０４に接続する第２流路接続面１３２とは、向かい合って配置されている。このため、第１流路１０３および第２流路１０５は、途中に第２導入部１０４が形成されている連続した流路ともいえる。

なお、流路基板１０１ａは、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から形成すればよい。例えば、流路とする溝部は、幅１ｍｍ、深さ（高さ）５０μｍ程度とすればよい。また、基板１０１と流路基板１０１ａとは個別に作製し、最後に、所定の流路部が測定箇所１１２に重なるように組み立てればよい。また、第１導入部１０２，第２導入部１０４，排出口１０６は、流路基板１０１ａを貫通して形成されており、基板１０１の平面に対して垂直な方向に形成された筒状の中空構造である。この中空構造は、大地の側の底部に各流路が接続し、この底部より離れる側に開口端が配置される。従って、例えば第１導入部１０２に投入された液体中の気泡は、所定時間後に開口端側に上昇していくため、第１流路１０３に流れ込むことがない。また、実施の形態１では、第２導入部１０４は、基板１０１の法線方向に延在する流路から構成されていることになる。

上述した血液凝固検査用流路チップでは、まず、第２導入部１０４が空の状態で、第１導入部１０２に検体を投入（導入）すると、検体は第１流路１０３に滲入する。第１流路１０３に滲入した検体の先端部は、いずれ第１流路接続面１３１に到達する。ここで、第１流路１０３は、検体および第１凝固活性剤溶液に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされている。このため、第１流路１０３に滲入した検体は、第１流路接続面１３１に到達すると、検体に接触していた第１流路１０３の内壁が存在しなくなり、到達した検体先端面（メニスカス）は、これ以上進行できない状態となる。このことは、検体に第１凝固活性剤溶液が混合されていても同様である。

また、第２導入部１０４が空の状態で、排出口１０６より水を供給すると、水は、第２流路１０５に滲入する。第２流路１０５に滲入した水の先端部は、いずれ第２流路接続面１３２に到達する。ここで、第２流路１０５は、水に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされている。このため、第２流路１０５に滲入した水は、第２流路接続面１３２に到達すると、水に接触していた第２流路１０５の内壁が存在しなくなり、到達したメニスカスは、これ以上進行できない状態となる。

以上のことにより、第２導入部１０４が空の状態では、各々導入された検体（検体と第１凝固活性剤溶液との混合液）および水が、第２導入部１０４に入り込むことがない。これらの構成は、上記材料構成により実現できる。

なお、これらのことは、第１導入部１０２に供給された液量により働く重力が、第１流路接続面１３１に形成される液先端面により発生する毛管力を超えない範囲の場合である。また、排出口１０６に供給された液量による働く重力が、第２流路接続面１３２に形成される液先端面により発生する毛管力を超えない範囲の場合である。検体などに対して毛細管力が発生する程度の径の流路による血液凝固検査用流路チップでは、第１導入部１０２や排出口１０６より供給できる液量には大きな制限があり、これにより発生する重力が、上記毛細管力を超えることはないものと考えられる。

次に、実施の形態１における血液凝固検査方法について図２Ａ〜図２Ｄを用いて説明する。この血液凝固検査方法では、上述した血液凝固検査用流路チップを用いて実施される。

まず、図２Ａに示すように、第２導入部１０４が空の状態で、第１導入部１０２に検体１２１を投入して第１流路１０３の第１流路接続面１３１まで検体１２１で満たす。また、排出口１０６より水１２２を投入して第２流路１０５の第２流路接続面１３２まで水１２２で満たす。加えて、第２流路１０５において水１２２に対して生じる毛細管力よりも小さな力で、排出口１０６より水１２２を吸引する状態とする（第１ステップ）。

例えば、排出口１０６に図示しない負圧機構を接続し、上記条件となる設定により、第２流路１０５内の水１２２を、排出口１０６を介して牽引（吸引）すればよい。負圧機構は、例えば、ステンレスパイプで接続された廃液タンクおよび負圧ポンプ（ＭＦＣＳ−ＶＡＣ，Ｆｌｕｉｇｅｎｔ社製）などから構成すればよい。

この状態では、第２導入部１０４が空の状態であるため、前述したように、第１流路１０３内の検体１２１の気液界面である先端面（メニスカス）は、第１流路接続面１３１より先には進行できない。また、同様に、第２流路１０５内の水１２２も、この気液界面である先端面が、第２流路接続面１３２より先には進行できない。

次に、第２導入部１０４が空の状態で、第１導入部１０２に第１凝固活性剤溶液を投入して第１流路１０３内の検体１２１に第１凝固活性剤溶液を混合し、図２Ｂに示すように、第１流路１０３の第１流路接続面１３１まで混合検体１２３で満たされた状態とする（第２ステップ）。例えば、一般的なＡＰＴＴ測定法で用いられるエラグ酸などの凝固活性剤であれば、液温を３７℃程度としておけば、これらは速やかに混合される。血液凝固検査用流路チップの全体を３７℃に温度制御しておけばよい。

以上のように第１凝固活性剤溶液を混合してから所定時間後に、図２Ｃに示すように、第２導入部１０４に第２凝固活性剤溶液１２４を投入し、第１流路接続面１３１で混合検体１２３と第２凝固活性剤溶液１２４が接触し、第２流路接続面１３２で水１２２と第２凝固活性剤溶液１２４が接触する状態とする。このことにより、図２Ｄに示すように、第１導入部１０２の側より、混合検体１２３，第２凝固活性剤溶液１２４，水１２２が、各々の隣り合う部分が接触して第２流路１０５を流れる状態となる（第３ステップ）。第２凝固活性剤溶液１２４は、例えば塩化カルシウム溶液など、カルシウムイオンを含んだ溶液である。

前述したように、第２流路１０５においては、内部の水１２２が、ここで発生する毛細管力よりも小さな力で排出口１０６の方向に吸引されている。この状態で、上述したように第２凝固活性剤溶液１２４が投入されると、第１流路接続面１３１と第２流路接続面１３２との空間が液体で満たされる。これにより、検体１２１の先端面、および水１２２の先端面が、液体である第２凝固活性剤溶液１２４に触れ、気液界面が消滅する。

この結果、水１２２に対する吸引力と毛細管力との釣り合いが解消され、水１２２が排出口１０６の側に移送される状態となる。これにより、まず、第２凝固活性剤溶液１２４が、第２流路１０５に流れ込む。次いで、混合検体１２３が、第２流路１０５に流れ込む。これらのことにより、混合検体１２３，第２凝固活性剤溶液１２４，水１２２が、各々の隣り合う部分が接触して第２流路１０５を流れ、測定箇所１１２を通過していく状態となる。また、前述したように、混合検体１２３に発生した気泡は、第１導入部１０２の開口端側に上昇しており、第１流路１０３に流れ込むことがなく、第２流路１０５に流れ込むこともない。

以上の結果、混合検体１２３と第２凝固活性剤溶液１２４との接触領域１４１が第２流路１０５に設けられた測定箇所１１２を通過していく過程で、接触領域１４１の移動速度、または接触領域１４１で生じる屈折率変化を測定する（第４ステップ）。次いで、測定された移動速度または屈折率変化により、検体１２１の血液凝固能を判定する（第５ステップ）。上述したように、実施の形態１によれば、気泡の混入が無い状態で測定できるので、マイクロ流路を用いたＡＰＴＴ測定法による血液凝固検査で、正確な測定ができる。

［実施の形態２］
次に、本発明の実施の形態２について、図３，図４Ａ〜図４Ｄを用いて説明する。図３は、本発明の実施の形態２において用いられる血液凝固検査用流路チップの構成を示す平面図（ａ）および断面図（ｂ）である。また、図４Ａ〜図４Ｄは、本発明の実施の形態２における血液凝固検査方法を説明する各ステップにおける状態を示す構成図である。ここでは、断面を模式的に示している。

血液凝固検査用流路チップは、第１導入部２０２，第１流路２０３，第２導入部２０４，第２流路２０５，排出口２０６を備える。また、実施の形態２では、第２導入部２０４に接続する導入口２０７を備える。

第１流路２０３は、基板２０１の上に形成された直線状の管である。第１流路２０３は、内壁が血漿を含む検体および第１凝固活性剤溶液に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされている。このように構成された第１流路２０３の一端に第１導入部２０２が接続し、他端に第２導入部２０４が接続している。第１凝固活性剤は、例えばエラグ酸などの接触因子活性化物質である。

第２流路２０５は、第１流路２０３の延長線上に形成された直線状の管である。第２流路２０５は、水に対して９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされている。このように構成された第２流路２０５の一端が、第２導入部２０４に接続され、他端が、排出口２０６に接続されている。また、第２流路２０５には、測定箇所２１２が配置される。この例では、基板２０１の表面にＡｕ層２１１が形成され、ＳＰＲ測定法により、測定箇所２１２を通過する流体の流速、および屈折率変化が測定可能とされている。

ここで、第１流路２０３，第２流路２０５，および第２導入部２０４は、基板２０１を共通の底面として形成されている。また、実施の形態２では、第２導入部２０４は、第２導入部２０４は、基板２０１の平面に平行に延在する流路から構成し、基板２０１の平面の法線方向の流路高さを、第１流路２０３および第２流路２０５より高くしている。

なお、実施の形態２でも、ＢＫ７ガラスからなる基板２０１と、膜厚５０ｎｍ程度のＡｕ層２１１と、各流路，導入部，排出口などが形成された流路基板２０１ａとから上記チップが構成され、表面に形成されているＡｕ層２１１を含めて全体で基板２０１としている。従って、この例では、第１流路２０３，第２流路２０５，および第２導入部２０４は、Ａｕ層２１１の表面を共通の底面としていることになる。

加えて、第１流路２０３が第２導入部２０４に接続する第１流路接続面２３１と、第２流路２０５が第２導入部２０４に接続する第２流路接続面２３２とは、向かい合って配置されている。このため、第１流路２０３および第２流路２０５は、途中に第２導入部２０４が形成されている連続した流路ともいえる。

なお、流路基板２０１ａは、例えば、ＰＤＭＳから形成すればよい。例えば、第１流路２０３，第２流路２０５とする溝部は、幅１ｍｍ、深さ（高さ）５０μｍ程度とすればよい。また、第２導入部２０４は、これらより大きな径とすればよい。また、基板２０１と流路基板２０１ａとは個別に作製し、最後に、所定の流路部が測定箇所２１２に重なるように組み立てればよい。また、第１導入部２０２，導入口２０７，排出口２０６は、流路基板２０１ａを貫通して形成されており、基板２０１の平面に対して垂直な方向に形成された筒状の中空構造である。この中空構造は、大地の側の底部に各流路が接続し、この底部より離れる側に開口端が配置される。従って、例えば第１導入部２０２に投入された液体中の気泡は、所定時間後に開口端側に上昇していくため、第１流路２０３に流れ込むことがない。

上述した血液凝固検査用流路チップでは、まず、第２導入部２０４が空の状態で、第１導入部２０２に検体を投入（導入）すると、検体は第１流路２０３に滲入する。第１流路２０３に滲入した検体の先端部は、いずれ第１流路接続面２３１に到達する。ここで、第１流路２０３は、検体および第１凝固活性剤溶液に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされている。このため、第１流路２０３に滲入した検体は、第１流路接続面２３１に到達すると、検体に接触していた第１流路２０３の内壁が存在しなくなり、到達した検体先端面（メニスカス）は、これ以上進行できない状態となる。このことは、検体に第１凝固活性剤溶液が混合されていても同様である。

また、第２導入部２０４が空の状態で、排出口２０６より水を供給すると、水は、第２流路２０５に滲入する。第２流路２０５に滲入した水の先端部は、いずれ第２流路接続面２３２に到達する。ここで、第２流路２０５は、水に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされている。このため、第２流路２０５に滲入した水は、第２流路接続面２３２に到達すると、水に接触していた第２流路２０５の内壁が存在しなくなり、到達したメニスカスは、これ以上進行できない状態となる。

以上のことにより、第２導入部２０４が空の状態では、各々導入された検体（検体と第１凝固活性剤溶液との混合液）および水が、第２導入部２０４に入り込むことがない。これらの構成は、上記材料構成により実現できる。

なお、これらのことは、第１導入部２０２に供給された液量により働く重力が、第１流路接続面２３１に形成される液先端面により発生する毛管力を超えない範囲の場合である。また、排出口２０６に供給された液量による働く重力が、第２流路接続面２３２に形成される液先端面により発生する毛管力を超えない範囲の場合である。検体などに対して毛細管力が発生する程度の径の流路による血液凝固検査用流路チップでは、第１導入部２０２や排出口２０６より供給できる液量には大きな制限があり、これにより発生する重力が、上記毛細管力を超えることはないものと考えられる。

次に、実施の形態２における血液凝固検査方法について図４Ａ〜図４Ｄを用いて説明する。この血液凝固検査方法では、上述した血液凝固検査用流路チップを用いて実施される。

まず、図４Ａに示すように、第２導入部２０４が空の状態で、第１導入部２０２に検体２２１を投入して第１流路２０３の第１流路接続面２３１まで検体２２１で満たす。また、排出口２０６より水２２２を投入して第２流路２０５の第２流路接続面２３２まで水２２２で満たす。加えて、第２流路２０５において水２２２に対して生じる毛細管力よりも小さな力で、排出口２０６より水２２２を吸引する状態とする（第１ステップ）。

例えば、排出口２０６に図示しない負圧機構を接続し、上記条件となる設定により、第２流路２０５内の水２２２を、排出口２０６を介して牽引（吸引）すればよい。負圧機構は、例えば、ステンレスパイプで接続された廃液タンクおよび負圧ポンプ（ＭＦＣＳ−ＶＡＣ，Ｆｌｕｉｇｅｎｔ社製）などから構成すればよい。

この状態では、第２導入部２０４が空の状態であるため、前述したように、第１流路２０３内の検体２２１の気液界面である先端面（メニスカス）は、第１流路接続面２３１より先には進行できない。また、同様に、第２流路２０５内の水２２２も、この気液界面である先端面が、第２流路接続面２３２より先には進行できない。

次に、第２導入部２０４が空の状態で、第１導入部２０２に第１凝固活性剤溶液を投入して第１流路２０３内の検体２２１に第１凝固活性剤溶液を混合し、図４Ｂに示すように、第１流路２０３の第１流路接続面２３１まで混合検体２２３で満たされた状態とする（第２ステップ）。例えば、一般的なＡＰＴＴ測定法で用いられるエラグ酸などの凝固活性剤であれば、液温を３７℃程度としておけば、これらは速やかに混合される。血液凝固検査用流路チップの全体を３７℃に温度制御しておけばよい。

以上のように第１凝固活性剤溶液を混合してから所定時間後に、図４Ｃに示すように、第２導入部２０４に第２凝固活性剤溶液２２４を投入し、第１流路接続面２３１で混合検体２２３と第２凝固活性剤溶液２２４が接触し、第２流路接続面２３２で水２２２と第２凝固活性剤溶液２２４が接触する状態とする。図３に示した導入口２０７より第２凝固活性剤溶液を導入すればよい。このことにより、図４Ｄに示すように、第１導入部２０２の側より、混合検体２２３，第２凝固活性剤溶液２２４，水２２２が、各々の隣り合う部分が接触して第２流路２０５を流れる状態となる（第３ステップ）。第２凝固活性剤溶液２２４は、例えば塩化カルシウム溶液など、カルシウムイオンを含んだ溶液である。

前述したように、第２流路２０５においては、内部の水２２２が、ここで発生する毛細管力よりも小さな力で排出口２０６の方向に吸引されている。この状態で、上述したように第２凝固活性剤溶液２２４が投入されると、第１流路接続面２３１と第２流路接続面２３２との空間が液体で満たされる。これにより、検体２２１の先端面、および水２２２の先端面が、液体である第２凝固活性剤溶液２２４に触れ、気液界面が消滅する。

この結果、水２２２に対する吸引力と毛細管力との釣り合いが解消され、水２２２が排出口２０６の側に移送される状態となる。これにより、まず、第２凝固活性剤溶液２２４が、第２流路２０５に流れ込む。次いで、混合検体２２３が、第２流路２０５に流れ込む。これらのことにより、混合検体２２３，第２凝固活性剤溶液２２４，水２２２が、各々の隣り合う部分が接触して第２流路２０５を流れ、測定箇所２１２を通過していく状態となる。また、前述したように、混合検体２２３に発生した気泡は、第１導入部２０２の開口端側に上昇しており、第１流路２０３に流れ込むことがなく、第２流路２０５に流れ込むこともない。

以上の結果、混合検体２２３と第２凝固活性剤溶液２２４との接触領域２４１が第２流路２０５に設けられた測定箇所２１２を通過していく過程で、接触領域２４１の移動速度、または接触領域２４１で生じる屈折率変化を測定する（第４ステップ）。次いで、測定された移動速度または屈折率変化により、検体２２１の血液凝固能を判定する（第５ステップ）。上述したように、実施の形態２においても、気泡の混入が無い状態で測定できるので、マイクロ流路を用いたＡＰＴＴ測定法による血液凝固検査で、正確な測定ができる。

以上に説明したように、本発明では、第１導入口において一方の凝固活性剤を検体に混合して流路に導入し、測定箇所を設けた流路に到達する前に配置されている第２流路より他方の凝固活性剤を導入するようにした。この結果、測定箇所を設けた流路への気泡の混入が防げるようになる。また、上記混合を、少ない試料で効果的に実施できるため、測定ごとの混合状態の違いによる測定誤差が抑制できるようになる。このように、本発明によれば、マイクロ流路を用いたＡＰＴＴ測定法による血液凝固検査で、正確な測定ができるようになる。また、検体と凝固活性剤との混合における加熱を、チップにおいて実施できるので、測定時間の短縮も実現できるようになる。

なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。例えば、各流路は、断面矩形に限るものではなく、断面円形の流路であってもよい。また、第１凝固活性剤を塩化カルシウムなどのカルシウムイオン供給源とし、第２凝固活性剤をエラグ酸などの接触因子活性化物質としてもよい。

１０１…基板、１０１ａ…流路基板、１０２…第１導入部、１０３…第１流路、１０４…第２導入部、１０５…第２流路、１０６…排出口、１１１…Ａｕ層、１１２…測定箇所、１３１…第１流路接続面、１３２…第２流路接続面、１４１…接触領域。

Claims (6)

1. 基板の上に形成され、内壁が血漿を含む検体および第１凝固活性剤溶液に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされた直線状の第１流路と、
   前記基板の上に形成されて前記第１流路の一端に接続された第１導入部と、
   前記基板の上に形成されて前記第１流路の他端に接続された第２導入部と、
   前記基板の上に前記第１流路の延長線上に形成され、水に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされ、一端が前記第２導入部に接続された直線状の第２流路と、
   前記第２流路の他端に接続された排出口と
   を備え、
   前記第１流路，前記第２流路，および前記第２導入部は、前記基板を共通の底面とし、
   前記第１流路が前記第２導入部に接続する第１流路接続面と、前記第２流路が前記第２導入部に接続する第２流路接続面とは、向かい合って配置されている
   血液凝固検査用流路チップを用い、
   前記第２導入部が空の状態で、前記第１導入部に前記検体を投入して前記第１流路の前記第１流路接続面まで前記検体で満たし、前記排出口より水を投入して前記第２流路の前記第２流路接続面まで水で満たし、前記第２流路において水に対して生じる毛細管力よりも小さな力で前記排出口より前記水を吸引する状態とする第１ステップと、
   前記第１ステップに続き、前記第２導入部が空の状態で、前記第１導入部に前記第１凝固活性剤溶液を投入して前記第１流路内の前記検体に前記第１凝固活性剤溶液を混合して混合検体とする第２ステップと、
   前記第２導入部に第２凝固活性剤溶液を投入し、前記第１流路接続面で前記混合検体と前記第２凝固活性剤溶液が接触し、前記第２流路接続面で水と前記第２凝固活性剤溶液が接触する状態とし、前記第１導入部の側より、前記混合検体，前記第２凝固活性剤溶液，前記水が、各々の隣り合う部分が接触して前記第２流路を流れる状態とする第３ステップと、
   前記混合検体と前記第２凝固活性剤溶液との接触領域が前記第２流路に設けられた測定箇所を通過していく過程における前記接触領域の移動速度、または前記接触領域で生じる屈折率変化を測定する第４ステップと、
   測定された移動速度または屈折率変化により、前記検体の血液凝固能を判定する第５ステップと
   を備えることを特徴とする血液凝固検査方法。
2. 請求項１記載の血液凝固検査方法において、
   前記第２導入部は、前記基板の法線方向に延在する流路から構成することを特徴とする血液凝固検査方法。
3. 請求項１記載の血液凝固検査方法において、
   前記第２導入部は、前記基板の平面に平行に延在する流路から構成し、前記基板の平面の法線方向の流路高さを、前記第１流路および前記第２流路より高くすることを特徴とする血液凝固検査方法。
4. 基板の上に形成され、内壁が血漿を含む検体および第１凝固活性剤溶液に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされた直線状の第１流路と、
   前記基板の上に形成されて前記第１流路の一端に接続された第１導入部と、
   前記基板の上に形成されて前記第１流路の他端に接続された第２導入部と、
   前記基板の上に前記第１流路の延長線上に形成され、水に対して内壁が９０度より小さい接触角を有して毛管力が作用する管径とされ、一端が前記第２導入部に接続された直線状の第２流路と、
   前記第２流路の他端に接続された排出口と、
   前記第２流路に設けられた測定箇所と
   を備え、
   前記第１流路，前記第２流路，および前記第２導入部は、前記基板を共通の底面とし、
   前記第１流路が前記第２導入部に接続する第１流路接続面と、前記第２流路が前記第２導入部に接続する第２流路接続面とは、向かい合って配置されている
   ことを特徴とする血液凝固検査用流路チップ。
5. 請求項４記載の血液凝固検査用流路チップにおいて、
   前記第２導入部は、前記基板の法線方向に延在する流路から構成されていることを特徴とする血液凝固検査用流路チップ。
6. 請求項４記載の血液凝固検査用流路チップにおいて、
   前記第２導入部は、前記基板の平面に平行に延在する流路から構成され、前記基板の平面の法線方向の流路高さが、前記第１流路および前記第２流路より高くされていることを特徴とする血液凝固検査用流路チップ。

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