CN110057890B - 一种凝血检测芯片和电化学传感器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种电化学检测芯片，包括使待测样品流经凝血检测芯片的检测区域的第一检测通道和第二检测通道；检测区域分为顺次连接的第一工作区域、过渡区域和第二工作区域；第一工作区域对应第一检测通道形成预反应区，第二工作区域对应第一检测通道和第二检测通道分别形成第一反应区和第二反应区；检测区域上设置有驱动待测样品由第一工作区域流向第二工作区域的驱动件。电化学检测芯片能够实现对PT和APTT的集成检测，且结果准确、灵敏度高，重复性好。本发明公开了一种电化学传感器，包括上述的电化学检测芯片，能够实现对PT和APTT的快速、灵敏的集成检测。

Description

一种凝血检测芯片和电化学传感器

技术领域

本发明涉及凝血检测技术领域，具体涉及一种凝血检测芯片和电化学传感器。

背景技术

凝血功能正常与否关系着人体生理健康状态，凝血功能的评估实验对多种疾病的诊断、治疗和预后判断有重要意义。凝血过程复杂，检测指标多样，主要分为外源性凝血途径和内源性凝血途径。凝血时间是衡量凝血状态的状态的重要指标，对于判断机体止血和凝血系统的病理性变化、术前凝血性疾病筛查等具有重要意义。其中，凝血酶原时间(PT，ProthrombinTime)是凝血时间检测中外源性凝血功能检测的重要指标，而活化部分凝血活酶时间(Activated partial thromboplatin time，APTT)是凝血时间检测中内源性凝血功能检测的重要指标。

凝血酶原时间PT取决于血液中的凝血酶原、纤维蛋白原及凝血因子II、V、VII、X等的水平，其中凝血因子主要由肝脏合成，因此PT对于肝硬化、肝炎等许多肝病患者的治疗具有极其重要意义，对于一些先天或后天型凝血因子缺乏患者、血栓性疾病患者和先天性FV增多症患者等也都需要严密监控PT凝血时间的变化。活化部分凝血活酶时间APTT是用于检测先天性或获得性凝血因子VIII、IX、XI缺陷以及机体是否存在相应抑制物的重要指标，因此对于凝血因子VIII、IX、XI缺乏的血友病A、血友病B以及因子XI缺乏症的筛查具有重要意义。由于APTT的高度敏感性，且肝素以内源性凝血途径为主要作用途径，APTT成为监测普通肝素首选指标，对于患有阻塞性黄疽、系统性红斑狼疮、不稳定性心绞痛、糖尿病血管病变、脑梗塞、深静脉血栓等患者的疾病监控至关重要。

目前临床PT、APTT检测多采用光学检测法，根据待测样品在凝固过程中散射光的变化来确定检测终点。但由于血液等复杂样本的透光性差，影响检测结果的准确性，且基于光学原理设计的检测仪器存在体积大、难以实现便携、小型化的缺陷。基于电化学方法的凝血时间(PT、APTT等)检测不需要使用大型设备，操作简单、降低了检测成本。目前用于凝血检测的电化学传感器多为单指标检测传感器，为充分评估凝血功能状况，市场上对多指标集成的电化学传感器的需求不断提高。

因此，开发新型的多凝血指标检测的电化学传感器，对于完善凝血功能的整体性评估，具有重要意义。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种能够集成凝血酶原时间检测和部分活化凝血活酶时间检测的凝血检测芯片。

为此，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种凝血检测芯片，包括使待测样品流经所述凝血检测芯片的检测区域的第一检测通道和第二检测通道；所述检测区域分为顺次连接的第一工作区域、过渡区域和第二工作区域；所述第一工作区域对应所述第一检测通道形成用于检测部分活化凝血活酶时间的预反应区，所述第二工作区域对应所述第一检测通道和所述第二检测通道分别形成用于检测部分活化凝血活酶时间的第一反应区，和用于检测凝血酶原时间的第二反应区；

所述检测区域上设置有驱动所述待测样品由所述第一工作区域流向所述第二工作区域的驱动件，使所述待测样品流经所述第一工作区域的速度V₁≤所述待测样品流经所述第二工作区域的速度V₂，或者使所述待测样品流经所述第一工作区域和所述过渡区域的速度V₄≤所述待测样品流经所述第二工作区域的速度V₂。

可选地，上述的凝血检测芯片，所述驱动件是位于所述过渡区域的折弯部，所述折弯部的两端分别连接所述第一工作区域和所述第二工作区域，并与所述第一工作区域和所述第二工作区域分别形成≥90°的夹角。

可选地，上述的凝血检测芯片，所述驱动件包括设置于所述第一工作区域和所述第二工作区域的亲水部，以及设置于所述过渡区域的疏水部；优选地，所述亲水部为修饰于所述第一工作区域和所述第二工作区域表面的聚乙烯和/或聚苯乙烯，所述疏水部为修饰于所述过渡区域的聚对二氯甲苯。

可选地，上述的凝血检测芯片，所述驱动件包括：位于所述第一工作区域的至少一个限流组件，所述限流组件包括第一限流件和第二限流件，所述第一限流件和所述第二限流件沿所述待测样品的流通方向形成第一开口和第二开口，所述第一开口的口径大于所述第二开口的口径；

位于所述过渡区域和/或所述第二工作区域的微孔组件，所述微孔组件包括开设于所述过渡区域的至少一个微孔，和/或开设于所述第二工作区域的至少一个微孔。

可选地，上述的凝血检测芯片，所述预反应区包括层叠设置的基底层和预反应层，所述预反应层含有部分活化凝血活酶时间的激活剂；优选地，所述激活剂包括鞣花酸、白陶土和/或硅土。

可选地，上述的凝血检测芯片，位于所述第二工作区域的所述第一检测通道内设置有第一工作电极，所述第一工作电极上形成所述第一反应区；所述第一工作电极包括层叠设置的第一导电层和第一凝血反应层，所述第一凝血反应层产生用于检测部分活化凝血活酶时间的电信号；

位于所述第二工作区域的第二检测通道内设置有第二工作电极，所述第二工作电极上形成所述第二反应区；所述第二工作电极包括层叠设置的第二导电层和第二凝血反应层，所述第二凝血反应层产生用于检测部分活化凝血活酶时间的电信号。

进一步可选地，上述的凝血检测芯片，所述第一工作电极还包括在所述第一凝血反应层远离所述第一导电层一侧设置的第一增强稳定层，和/或，所述第二工作电极还包括在所述第二凝血反应层远离所述第二导电层一侧设置的第二增强稳定层。

进一步可选地，上述的凝血检测芯片，所述第一增强稳定层和所述第二增强稳定层由100-500μM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，或含有如下至少一种成分的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液制得：羟乙基纤维素0-5wt％，微晶纤维素0.1-5wt％，聚环氧乙烷0-5wt％，曲拉通0.3-2wt％，铁氰化钾10-50mM，亚甲基蓝10-50mM，全氟磺酸聚四氟乙烯5-20wt％，蔗糖3wt％，甘油50wt％，氯化钠1.3wt％，叠氮化钠0.02wt％，甘露醇7wt％，右旋糖酐-4010wt％，乙二胺四乙酸0.1mM，三羟甲基氨基甲烷1M，明胶0.1wt％，氯化钾50mM，淀粉5wt％，普乐净6ppm，四氢嘧啶及衍生物10wt％；

所述第二凝血反应层由含有凝血酶原时间检测试剂和凝血酶底物的第二凝血反应溶液制得，所述凝血酶底物包括凝血酶识别多肽和以酰胺键连接所述多肽的对苯二胺；优选地，所述第二凝血反应溶液含有如下成分：凝血酶原时间检测试剂，凝血酶底物300μM，牛血清白蛋白0.5wt％；

所述第一凝血反应层由含有氯化钙和凝血酶底物的第一凝血反应溶液制得；优选地，所述第一凝血反应溶液含有如下成分：氯化钙25mmol/L，凝血酶底物300μM，牛血清白蛋白0.5wt％。

可选地，上述的凝血检测芯片，所述第一导电层中修饰有石墨烯材料，所述石墨烯材料用于传递和放大所述第一凝血反应层产生的电信号；和/或，所述第二导电层中修饰有石墨烯材料，所述石墨烯材料用于传递和放大所述第二凝血反应层产生的电信号；

优选地，所述石墨烯材料由下述方法处理得到：(1)将石墨烯用硝酸钠、硫酸和高锰酸钾进行剥离，得到氧化石墨烯；(2)使用所述氧化石墨烯配制为1g/L的分散液，超声剥离后使用水合肼还原所述氧化石墨烯，干燥后得到所述处理的石墨烯材料。

可选地，上述的凝血检测芯片，位于所述第二工作区域的所述第一检测通道内还设置有第一参比电极和第一对电极；优选地，所述第一参比电极为丝网印刷电极，和/或，所述第一对电极为丝网印刷电极；

位于所述第二工作区域的所述第二检测通道内还设置有第二参比电极和第二对电极；优选地，所述第二参比电极为丝网印刷电极，和/或，所述第二对电极为丝网印刷电极。

可选地，上述的凝血检测芯片，凝血检测芯片靠近所述第一工作区域的一端开设有进样口，所述进样口连接进样通道，所述进样通道远离所述进样口的一端具有第一连通口和第二连通口，所述第一连通口和所述第二连通口分别连接所述第一检测通道和所述第二检测通道。

第二方面，本发明提供了一种电化学传感器，包括：

上述的凝血检测芯片；

封装层，所述封装层具有至少三个开口，所述凝血检测芯片在所述至少三个开口处露出所述预反应区、所述第一反应区和所述第二反应区。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供的凝血检测芯片，分别在第一检测通道和第二检测通道内完成对部分活化凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)的检测。由于APTT检测需要经过待测样品中的凝血因子激活、然后进行凝血反应的两步反应过程，而PT检测仅需一步反应即可完成凝血检测。针对APTT和PT的不同检测过程，在凝血检测芯片中将检测区域划分为第一工作区域、过渡区域和第二工作区域，为APTT检测提供了多重的反应空间，使第一检测通道内的待测样品能够在预反应区上完成对凝血因子激活的预处理，然后在第二反应区上进行APTT检测的凝血反应过程；而第二检测通道内的待测样品仅需由第一工作区域流直接流向第二工作区域，然后在第二反应区上进行PT检测的凝血反应过程。上述双检测通道和双工作区域的划分，使凝血检测芯片能够兼顾PT检测的一步反应过程和APTT检测的两步反应过程，在不影响PT检测的情况下，完成对APPT检测的分阶段处理。

利用在检测区域上设置的驱动件，为第一检测通道和第二检测通道内的待测样品提供驱动力，使两个通道内的待测样品在流经第一工作区域后，能够继续流向第二工作区域流动，并在第二工作区域上发生凝血反应，完成APTT和PT的检测。同时，通过设置驱动件使待测样品流经第一工作区域的速度V₁≤待测样品流经第二通工作区域的速度V₂，或者使待测样品流经第一工作区域和过渡区域的速度V₃≤待测样品流经第二通工作区域的速度V₂，两个通道内的待测样品在第一工作区域能够相对停留更长的时间，为部分活化凝血活酶时间检测通道内的待测样品能够充分激活，提高待测样品的预处理效果以及APTT时间检测的准确性。

上述的凝血反应芯片，能够同时实现对APTT和PT的多指标检测，且检测结果的准确性高，有利于为凝血功能监测、临床疾病的诊断、预后评估和药物疗效监测等提供快速、全面、有效的指导依据。

2、本发明提供的凝血检测芯片，驱动件是位于过渡区域的折弯部，折弯部的两端分别连接第一工作区域和第二工作区域，并与第一工作区域和第二工作区域分别形成≥90°的夹角。折弯部的设计使与第一工作区域和第二工作区域的连接的过渡区域呈一定夹角的斜面，当待测样品留至折弯部时，由于斜面与第一工作区域的高度差，使待测样品的流速在重力作用下增加，待测样品在第二工作区域的流速V₂大于在第一工作区域的流速V₁，为待测样品提供了向第二工作区域流动的驱动力。

本发明提供的凝血检测芯片，驱动件还可以是包括设置于所述第一工作区域和所述第二工作区域的亲水部，和设置与所述过渡区域的疏水部。由于第一工作区域和第二工作区域设置有亲水部，而过渡区域设置有疏水部，待测样品在由第一工作区域流向过渡区域时，流速变慢；待测样品在由过渡区域流向第二工作区域时，流速增加，通过流速的变化使待测样品由第一工作区域被驱动流向第二工作区域。同时，待测样品由第一工作区域流向过渡区域时被限流，待测样品流经第一工作区域和过渡区域的速度V₄≤待测样品流经第二工作区域的速度V₂，使待测样品在第一工作区域能够停留更长的时间，部分活化凝血活酶时间检测的预处理更加充分。

本发明提供的凝血检测芯片，驱动件还可以是第一工作区域的至少一个限流组件，限流组件包括第一限流件和第二限流件，第一限流件和第二限流件沿待测样品的流通方向形成第一开口和第二开口，第一开口的口径大于第二开口的口径；过渡区域和/或第二工作区域的微孔组件，微孔组件包括开设于过渡区域的至少一个微孔，和/或开设于第二工作区域的至少一个微孔。由于限流组件第一开口的口径大于第二开口的口径，待测样品经第一开口流向第二开口时被拦隔，使其流动速度被限制。血液样品在流至过渡区域后，由于过渡区域和/或第二工作区域上开设有微孔，减小了血液流通的阻力，血液样品的流速增加，实现了V₁≤V₂，对血液样品产生驱动其流动的驱动力。

上述的驱动件设置于检测区域上，在不增加凝血检测芯片的体积的条件下，驱动待测样品在检测区域上流动，有利于实现电化学传感器的小型化。同时，通过设置驱动件能够实现待测样品在检测区域的自驱动流动，不产生额外能耗，降低了凝血检测芯片的使用成本。

3、本发明提供的凝血检测芯片，所述预反应区包括层叠设置的电极基底层和预反应层，所述预反应层含有部分活化凝血活酶时间的激活剂。待测的血液样品在流经预反应区时，在激活剂作用下，使血液中的凝血因子XII被激活为XIIa，凝血因子XIIa进一步激活XI得到凝血因子XIa，得到能够参与APTT检测的凝血反应过程的活化样品。

4、本发明提供的凝血检测芯片，位于第二工作区域的第一检测通道内设置有第一工作电极，第一工作电极上形成第一反应区；第一工作电极包括层叠设置的电极基底层和第一凝血反应层，第一凝血反应层产生用于检测部分活化凝血活酶时间的电信号。第一检测通道内的血液样品在第一工作区域的预反应区被激活后，流至第二工作区域，在第一凝血反应层内发生APPT检测的凝血反应过程，同时产生能够传递的电信号，电信号向电极基底层传递，形成可被记录的电流，通过采集电流信号随时间的变化监测凝血反应过程，实现对部分活化凝血酶原时间的检测。

位于第二工作区域的第二检测通道内设置有第二工作电极，第二工作电极上形成第二反应区；第一工作电极包括层叠设置的电极基底层和第二凝血反应层，第二凝血反应层产生用于检测部分活化凝血活酶时间的电信号。第二检测通道内的血液样品由第一工作区域流至第二工作区域后，在第二凝血反应层内发生PT检测的凝血反应过程，同时产生能够传递电信号，电信号向电极基底层传递，形成可被记录的电流，通过采集电流信号随时间的变化监测凝血反应过程，实现对凝血酶原时间的检测。

5、本发明提供的凝血检测芯片，第一工作电极还包括在第一凝血反应层远离电极基底层一侧设置的第一增强稳定层，和/或，第二工作电极还包括在第二凝血反应层远离电极基底层一侧设置的第二增强稳定层。通过设置第一增强稳定层和/或第二稳定增强层，增加APTT检测和/或PT检测的凝血反应环境的稳定性，使APTT检测和/或PT检测结果的准确性和重复性提高。同时，增强稳定层有利于促进电信号向电极基底层的传递，起到放大电信号的作用，使APTT检测和/或PT检测的灵敏度提高、检测时间缩短。增强稳定层设置于电极基底层原理凝血反应层的一侧，是凝血反应层产生的电信号能够直接向电极基底层传递，增加电信号的传递量，进一步提高检测的灵敏度和准确性。

其中，通过对第一增强稳定层和第二增强稳定层的成分进行有效的选择、配比，使增强稳定层能够具有维持凝血反应环境的稳定性，并且增加电信号传递的效果。第一、第二增强稳定层中添加的四氢嘧啶及衍生物有利于提高第一、第二凝血反应层中酶和蛋白的稳定性与反应活性，使凝血检测芯片能够长效工作。

6、本发明提供的凝血检测芯片，所述第一导电层中修饰有石墨烯材料，所述石墨烯材料用于传递和放大所述第一凝血反应层产生的电信号；和/或，所述第二导电层中修饰有石墨烯材料，所述石墨烯材料用于传递和放大所述第二凝血反应层产生的电信号。利用石墨烯材料的比表面积大、导电性强、电化学稳定性高、负载量高、生物相容性好等优点，增加了电信号传递的有效面积，增强了凝血检测芯片的导电性，并且降低了电极基底层的表面阻抗，实现对凝血反应层产生的电信号的放大作用，进而提高了APTT检测和/或PT检测的灵敏度和重复稳定性，缩短了检测所需的时间，有利于实现APTT和PT的快速、准确测定。

7、本发明提供的电化学传感器，包括上述的凝血检测芯片，能够同时实现对APTT和PT的多指标检测，且检测灵敏度高、稳定性高、重复性好、检测时间短，能够实现对血液样品的快速、灵敏、准确检测，有利于为凝血功能评估提供更加全面、有效的指导依据，对于以凝血酶原时间为参考依据的肝炎、肝硬化、肝癌等相关疾病，和以部分活化凝血活酶时间为参考依据的血友病、阻塞性黄疽、系统性红斑狼疮、不稳定性心绞痛、糖尿病血管病变、脑梗塞等相关疾病的诊断和预后提供更多的临床参考信息。

此外，利用电化学传感器检测凝血酶原时间和部分活化凝血活酶时间的操作简单、对操作人员的技术水平要求不高，适于凝血酶原检测和部分活化凝血活酶时间检测的大规模普及、应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的凝血检测芯片的结果示意图；

图2为本发明实施例1提供的驱动件的结构示意图；

图3为本发明实施例1提供的第二工作区域的电极结构示意图；

图4为本发明实施例1提供的第一检测通道的电极结构示意图；

图5为本发明实施例1提供的第一工作电极的结构示意图；

图6为本发明实施例1提供的第二工作电极的结构示意图；

图7为本发明实施例1提供的凝血检测芯片检测PT的原理图；

图8为本发明实施例1提供的凝血检测芯片检测APPT的原理图；

图9为本发明实施例3提供的驱动件的结构示意图；

图10为本发明实施例6提供的电化学传感器的第二工作区域的结构示意图；

图11为本发明实施例6提供的电化学传感器的位于第二工作区域的第一检测通道的结构示意图；

图12为本发明实施例7提供的电极制备流程图；

图13为本发明实验例1检测APTT的结果图；

图14为本发明实验例3检测的石墨烯修饰以及未修饰的电极特性电化学CV扫描对比结果图；

图15为本发明实验例3凝血酶测试实验中，石墨烯材料修饰的电化学传感器和普通传感器的凝血酶检测对比结果图；

图16显示实验例1检测PT的结果图。

附图标记说明：

1-第一检测通道；11-第一工作电极，111-第一导电层，112-第一凝血反应层，113-第一增强稳定层；12-第一对电极；13-第一参考电极；

2-第二检测通道，21-第二工作电极，211-第二导电层，212-第二凝血反应层，213-第二增强稳定层；

3-进样口；

4-进样通道；

5-检测区域，51-第一工作区域，52-第二工作区域，53-过渡区域；

6-基底层；

7-封装层；

8-驱动件，81-第一限流件，82-第二限流件，83-微孔；

9-导电轨道。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

实施例1

本实施例提供一种凝血检测芯片，凝血检测芯片的表面形成待测样品的检测区域5。沿待测样品的流动方向，检测区域5分为顺次连接的第一工作区域51、过渡区域53和第二工作区域52。如图1所示，凝血检测芯片包括进样口3、第一检测通道1和第二检测通道2。其中，进样口3开设于凝血检测芯片靠近第一工作区域51的一端，进样口3连接进样通道4，进样通道4远离进样口3的一端形成两个相互独立的第一连通口和第二连通口，第一连通口连接第一检测通道1，第二连通口连接第二检测通道2。待测样品由进样口3流入后，在进样通道4到被分流，然后经第一连通口和第二连通口分别流入第一检测通道1和第二检测通道2内。第一工作区域51对应第一检测通道1形成用于检测部分活化凝血活酶时间(APTT)的预反应区，第二工作区域52对应第一检测通道1和第二检测通道2分别形成用于检测凝血活酶时间的第一反应区，和用于检测凝血酶原时间的第二反应区。

凝血检测芯片的检测区域5上设置有驱动待测样品由第一工作区域51流向第二工作区域52的驱动件8，在驱动件8的驱动下，使待测样品流经第一工作区域51的速度V₁≤测样品流经第二通工作区域的速度V₂，或者使待测样品流经第一工作区域51和过渡区域53的速度V₃≤待测样品流经第二通工作区域的速度V₂。

需要说明的是，部分活化凝血活酶时间检测需要经过两步反应过程：首先激活待测的血液样品中的凝血因子，然后使激活的血液样品发生用于APTT检测的凝血反应过程，得到部分活化凝血活酶时间。而凝血酶原时间检测仅需要一步反应，待测的血液样品直接进行用于PT检测的凝血反应过程，得到凝血酶原时间。因此，为了同时实现对APTT和PT的集成检测，凝血检测芯片的检测区域5被分为第一工作区域51和第二工作区域52，第一检测通道1和第二检测通道2内的血液样品在同步流经第一工作区域51时，第一检测通道1内的血液样品在流经预反应区时血液样品被激活，然后流向第二工作区域52的第一反应区发生APTT检测的凝血反应过程；而第二检测通道2内的血液样品在流经第一工作区域51时不进行处理，直接流向第二工作区域52的第二反应区发生PT检测的凝血反应过程。通过多通道、多区域的设置，为APTT检测提供的多重的反应空间，使凝血检测芯片能够兼顾PT检测的一步反应过程和APTT检测的两步反应过程，在不影响PT检测的情况下，完成对APPT检测的分阶段处理。

进一步的，通过设置驱动件8，为第一检测通道1和第二检测通道2内的血液样品提供驱动力，使两个检测通道内的血液样品在流经第一工作区域51后，能够继续向第二工作区域52流动，以在第二工作区域52上完成APTT和PT检测的凝血反应过程。同时，驱动件8对血液样品流经第一工作区域51的速度V₁(或者血液样品流经第一工作区域51和过渡区域53的速度V₃)，和流经第二工作区域52的速度V₂进行调节，使血液样品在第一工作区域51上能够停留相对长的时间，以保障血液样品在预反应区上能够充分完成激活的预处理，提高血液样品的预处理效果与APTT检测的准确性。驱动件8同时设置于第一检测通道1和第二检测通道2对应的工作区域内，保持第一检测通道1和第二检测通道2内血液样品的同步流动。

具体地，如图2所示，驱动件8是位于过渡区域53的折弯部，折弯部的两端分别连接第一工作区域51和第二工作区域52，并与第一工作区域51和第二工作区域52分别形成≥90°的夹角(α)。折弯部使过渡区域53呈以一定夹角与第一过渡区域53和第二过渡区域53相连接的斜面，在血液样品由第一工作区域51流至过渡区域53时，由于过渡区域53与第一工作区域51的高度差，血液样品受重力作用进行加速，血液样品流经第一工作区域51的速度V₁小于血液样品流经过渡区域53的速度V₂，使血液样品受到由第一工作区域51向第二工作区域52流动的驱动力。同时，血液样品流经第一工作区域51的速度V₁小于血液样品流经第二工作区域52的速度V₂，使血液样品在能够在第一工作区域51的预反应区停留相对长的时间，以保证对血液样品的充分预处理。

第一检测通道1位于第一工作区域51的预反应区包括层叠设置的基底层6和预反应层，基底层6选用聚对苯二甲酸乙二醇酯材料。预反应层中含有部分活化凝血活酶时间的激活剂，激活剂可以选择含有鞣花酸的APTT检测试剂，或者白陶土和硅土的组合试剂。其中，以陶土和硅土的组合试剂形成的激活剂由含有如下浓度成分的溶液配制得到：白陶土0.13mg/L，硅土0.15mg/L。如图3所示，位于第二检测区域5的第一检测通道1内设置有第一工作电极11、第一对电极12和第一参比电极13，位于第二检测区域5的第一检测通道1内设置有第二工作电极21、第二对电极和第二参比电极。图4显示一种在第一检测通道1内的三电极体系，包括呈圆盘状结构第一工作电极11，呈环绕第一工作电极11呈圆弧状结构的第一对电极12，以及独立于第一对电极12和第一工作电极11设置的第一参比电极13。第一检测通道1内的基底层6上还铺设有导电轨道9，导电轨道9与第一检测通道1内的第一工作电极11、第一对电极12和第一参比电极13实现电连接，用于传输第一检测通道1内产生的APTT检测的电流响应信号。同样地，在第二检测通道2内的基底层6上也铺设有导电轨道9，用于传递PT检测的电流响应信号。

进一步地，如图5和图6所示，第一工作电极11包括沿远离基底层6方向依次层叠设置的第一导电层111、第一凝血反应层112和第一增强稳定层113，第一工作电极11上形成用于部分活化凝血活酶时间检测的第一反应区；第二工作电极21包括沿远离基底层6方向依次层叠设置的第二导电层211、第二凝血反应层212和第二增强稳定层213，第二工作电极21上形成用于凝血酶原时间检测的第二反应区。

第一工作电极11中，第一凝血反应层112含有氯化钙和凝血酶底物，凝血酶底物包括凝血酶识别多肽(序列：Tos-Gly-Pro-Arg)和对苯二胺，凝血酶识别多肽的羧基与对苯二胺的氨基以酰胺键连接，形成多肽-对苯二胺(Tos-Gly-Pro-Arg-p-Phenylenediamine)的凝血酶底物。具体地，第一凝血反应层112由含有如下浓度程度的溶液印刷形成：牛血清白蛋白0.5wt％，多肽-对苯二胺300μM，氯化钙25mmol/L。第一导电层111的选用金浆、银浆或导电碳浆等导电浆料形成，第一导电层111中修饰有石墨烯材料，具体地，通过在基底层6上印刷导电浆料和石墨烯浆料的混合的电极浆料，得到修饰有石墨烯材料的第一导电层111。第一增强稳定层113设置于第一凝血反应层112远离第一导电层111的一侧，具体地，第一增强稳定层113由含有如下浓度成分的溶液印刷形成：4-羟乙基哌嗪乙磺酸300μM，羟乙基纤维素1.3wt％，微晶纤维素1wt％，聚环氧乙烷3wt％，曲拉通0.9wt％，铁氰化钾10mM，亚甲基蓝20mM，全氟磺酸聚四氟乙烯5wt％，蔗糖3wt％，甘油50wt％，氯化钠1.3wt％，叠氮化钠0.02wt％，甘露醇7wt％，右旋糖酐-4010wt％，乙二胺四乙酸0.1mM，三羟甲基氨基甲烷1M，明胶0.1wt％，氯化钾50mM，淀粉5wt％，普乐净6ppm，四氢嘧啶10wt％。

第二工作电极21中，第二凝血反应层212含有凝血酶原时间检测试剂(凝血酶原时间检测试剂是包括外源性凝血途径所需的组织因子、凝血活酶等的检测试剂)和凝血酶底物，凝血酶底物为多肽-对苯二胺(Tos-Gly-Pro-Arg-p-Phenylenediamine)。具体地，第二凝血反应层212由含有如下成分的溶液印刷形成：凝血酶原时间检测试剂，牛血清白蛋白0.5wt％，多肽-对苯二胺300μM。第二增强稳定层213和第二导电层211的成分配比分别与第一增强稳定层113和第一导电层111相同。

第一对电极12选择与第一导电层111相同的电极浆料、或者金浆、银浆、导电碳浆等导电浆料形成，第一参比电极13选择氯化银浆料、金浆、银浆、导电碳浆等电极浆料形成。第一对电极12和第一参比电极13可以选择真空沉积、丝网印刷、电镀等工艺制备得到，其中，基于丝网印刷工艺的电极具有制备简单、检测灵敏度高和检测时间短的优势。同样地，第二对电极可以选择与第二导电层211相同的电极浆料、或者金浆、银浆、导电碳浆等导电浆料形成，第二参比电极选择氯化银浆料、金浆、银浆、导电碳浆等电极浆料形成。第二对电极和第二参比电极可以选择真空沉积、丝网印刷、电镀等工艺制备得到。

凝血检测芯片用于凝血酶原时间检测的原理如图7所示：待测的血液样品在流至第二工作电极21的第二反应区后，溶解第二凝血反应层212中的凝血酶原检测试剂和凝血酶底物，第二凝血反应层212中的凝血活酶在组织因子存在下将血液样品中的凝血酶原转化为凝血酶(图7：a1-b1)。在凝血酶作用下，血液中可溶性的纤维蛋白原转化为不可溶的纤维蛋白，使血液由液体的流动状态转变为不可流动的凝胶状态，发生凝血反应。与此同时，凝血酶识别凝血酶底物中的多肽，并切割多肽-对苯二胺的酰胺键，与多肽相连的对苯二胺被释放(图7：b1-c1)，发生如下反应：

在第二工作电极21上施加电压，对苯二胺被氧化，并丢失电子，电子移动形成可被记录的电流响应信号，通过记录在凝血反应过程中电流响应信号随时间的变化，能够实现凝血酶原时间的检测。电子经第二导电层211进行传递产生可以被记录的电流响应信号，由于第二导电层211中修饰有石墨烯材料，利用石墨烯材料的比表面积大、导电性强、电化学稳定性高、负载量高、生物相容性好等优点，增加了电子传递的有效面积，增强了第二导电层211的导电性，并且降低了电极基底层6的表面阻抗，实现对凝血反应层产生的电流信号的放大作用，使PT检测的灵敏度提高、重复稳定性好，检测结果准确，检测所需时间缩短。另一方面，由于第二工作电极21的第二增强稳定层213中含有羟乙基纤维素、微晶纤维素和聚环氧乙烷等为凝血反应提供稳定环境的成分，以及铁氰化钾、亚甲基蓝、全氟磺酸聚四氟乙烯等增强电子传递传递成分，有利于维持凝血反应的稳定发生，并进一步放大由第二导电层211传递的电信号。其中，第二增强稳定层213中的四氢嘧啶及衍生物有利于保持第二凝血反应层212中酶、蛋白等生物活性分子的反应活性，使凝血检测芯片能够长效工作。

凝血检测芯片用于部分活化凝血活酶时间检测的原理如图8所示：待测的血液样品首先流经第一工作区域51的预反应区，血液与预反应层中的激活剂接触，使血液中的凝血因子XII被激活为XIIa，凝血因子XIIa进一步激活XI得到凝血因子XIa，完成对待测血液样品激活的预处理(图8：a2)。激活后的血液样品在流至第一工作电极11的第一反应区后，与第一凝血反应层112中的Ca²⁺接触，凝血因子XIIa在Ca²⁺存在下，与激活态凝血因子VIII和脑磷脂结合生成X酶复合物，进而激活凝血因子X，活化的凝血因子X在Ca²⁺存在下与活化的凝血因子V形成凝血酶原复合物，凝血酶原复合物激活血液样品中的凝血酶原形成凝血酶(图8：a2-b2)。在凝血酶作用下，血液中可溶性的纤维蛋白原转化为不可溶的纤维蛋白，使血液由液体的流动状态转变为不可流动的凝胶状态，发生凝血反应。与此同时，凝血酶识别凝血酶底物中的多肽，并切割多肽-对苯二胺的酰胺键，与多肽相连的对苯二胺被释放。在第二工作电极21上施加电压，对苯二胺被氧化，并丢失电子，电子移动形成可被记录的电流响应信号(图8：b2-c2)。通过记录在凝血反应过程中电流响应信号随时间的变化，能够实现凝血酶原时间的检测。电子经第一导电层111进行传递产生可以被记录的电流响应信号，由于第一导电层111中修饰有石墨烯材料，利用石墨烯材料的比表面积大、导电性强、电化学稳定性高、负载量高、生物相容性好等优点，增加了电子传递的有效面积，增强了第二导电层211的导电性，并且降低了电极基底层6的表面阻抗，实现对凝血反应层产生的电流信号的放大作用，使APTT检测的灵敏度提高、重复稳定性好，检测结果准确，检测所需时间缩短。另一方面，由于第一工作电极11的第二增强稳定层213中含有羟乙基纤维素、微晶纤维素和聚环氧乙烷等为凝血反应提供稳定环境的成分，以及铁氰化钾、亚甲基蓝、全氟磺酸聚四氟乙烯等增强电子传递传递成分，有利于维持凝血反应的稳定发生，并进一步放大由第一导电层111传递的电信号。其中，第一增强稳定层113中的四氢嘧啶及衍生物有利于保持第一凝血反应层112中酶、蛋白等生物活性分子的反应活性，使凝血检测芯片能够长效工作。

进一步的，同时，导电轨道9与第二检测通道2内的第二工作电极21、第二对电极和第二参比电极实现电连接，用于传输第二检测通道2内产生的PT检测的电流响应信号，实现对APTT和PT多指标的集成检测。

实施例2

本实施例提供一种凝血检测芯片，与实施例1提供的凝血检测芯片的区别在于：

驱动件8包括设置于第一工作区域51和第二工作区域52的亲水部，以及设置于过渡区域53的疏水部。由于第一工作区域51上设置有亲水部，而过渡区域53设置有疏水部，血液样品由第一工作区域51流向过渡区域53时，流速变慢，起到对血液样品的限流作用。血液样品在由过渡区域53流向第二工作区域52时，由于第二工作区域52上设置有亲水部，血液样品由疏水区向亲水区流动，流速增加，最终使血液样品流经第一工作区域51和过渡区域53的速度V₄≤第二工作区域52的速度V₂。通过亲水部和疏水部的交替设置，实现对血液样品的驱动作用，使其由第一工作区域51流至第二工作区域52。同时，由于疏水部的限流作用，使血液样品在第一工作区域51充分停留，部分活化凝血活酶时间检测的预处理更加充分。

实施例3

本实施例提供一种凝血检测芯片，与实施例1提供的凝血检测芯片的区别在于：

如图9所示，驱动件8包括位于第一工作区域51的所需数量的限流组件，和位于过渡区域53与第二工作区域52的所需数量的微孔组件。其中，限流组件包括第一限流件81和第二限流件82，第一限流件81和第二限流件82在沿血液流动方向上具有第一开口和第二开口，第一开口的口径大于第二开口的口径。微孔组件包括开设在过渡区域53和第二工作区域52中的所需数量的微孔83组成。血液样品在流至限流组件时，由第一开口流入，然后由第二开口流出，在两个开口不同口径的设置下，血液样品的流速被限制。而当血液样品在流至过渡区域53后，由于微孔83的设置，减小了血液流通的阻力，使血液样品的流速增加。血液样品流经第一工作区域51的流速V₁≤血液样品流经过渡区域53的流速V₃，且V₁≤血液样品流经第二工作区域52的流速V₂，血液样品受到驱动其由第一工作区域51向第二工作区域52流动的驱动力，同时能够保证血液在第一工作区域51上停留充分的时间进行预处理。

实施例4

本实施例提供一种凝血检测芯片，与实施例1提供的凝血检测芯片的区别在于：

第一增强稳定层113由含有如下成分的溶液印刷形成：4-羟乙基哌嗪乙磺酸100μM，羟乙基纤维素5wt％，微晶纤维素0.1wt％，曲拉通0.3wt％，亚甲基蓝50mM，铁氰化钾10mM，全氟磺酸聚四氟乙烯5wt％，蔗糖3wt％，甘油50wt％，氯化钠1.3wt％，叠氮化钠0.02wt％，甘露醇7wt％，右旋糖酐-40 10wt％，乙二胺四乙酸0.1mM，三羟甲基氨基甲烷1M，明胶0.1wt％，氯化钾50mM，淀粉5wt％，普乐净6ppm，四氢嘧啶10wt％。

第二增强稳定层213由含有如下成分的溶液印刷形成：4-羟乙基哌嗪乙磺酸500μM，微晶纤维素5wt％，聚环氧乙烷5wt％，曲拉通2wt％，亚甲基蓝10mM，铁氰化钾50mM，全氟磺酸聚四氟乙烯20wt％，蔗糖3wt％，甘油50wt％，氯化钠1.3wt％，叠氮化钠0.02wt％，甘露醇7wt％，右旋糖酐-40 10wt％，乙二胺四乙酸0.1mM，三羟甲基氨基甲烷1M，明胶0.1wt％，氯化钾50mM，淀粉5wt％，普乐净6ppm，四氢嘧啶10wt％。

实施例5

本实施例提供一种凝血检测芯片，与实施例1提供的凝血检测芯片的区别在于：

第一增强稳定层113由含有如下成分的溶液印刷形成：4-羟乙基哌嗪乙磺酸500μM。

第二增强稳定层213由含有如下成分的溶液印刷形成：4-羟乙基哌嗪乙磺酸300μM，羟乙基纤维素2wt％，微晶纤维素0.6wt％，聚环氧乙烷0.05wt％，曲拉通0.9wt％。

实施例6

本实施例提供一种电化学传感器，包括实施例1提供的凝血检测芯片，凝血检测芯片上覆盖封装层7，封装层7由绝缘材料形成，例如：绝缘油墨材料。封装层7上开设有进样孔以及露出预反应区、第一反应区和第二反应区的三个开口。图10显示凝血检测芯片的第一工作区域51在覆盖封装层7后的结构示意图，图11显示凝血检测芯片的第一检测通道1在覆盖封装层7后的结构示意图。通过覆盖封装层7，有利于凝血检测芯片与外界环境隔离开，减少外界因素对传感器凝血检测性能的影响。

上述的电化学传感器，能够同时实现对部分活化凝血活酶时间和凝血酶原时间的多指标检测，且具有检测结果准确、灵敏度高、重复性好、响应时间短的优势，能够实现对血液样品的快速、灵敏、准确检测，有利于为凝血功能评估提供更加全面、有效的指导依据，对于以凝血酶原时间为参考依据的肝炎、肝硬化、肝癌等相关疾病，和以部分活化凝血活酶时间为参考依据的血友病、阻塞性黄疽、系统性红斑狼疮、不稳定性心绞痛、糖尿病血管病变、脑梗塞等相关疾病的诊断和预后提供更多的临床参考信息。此外，利用电化学传感器检测凝血酶原时间和部分活化凝血活酶时间的操作简单、对操作人员的技术水平要求不高，适于凝血酶原检测和部分活化凝血活酶时间检测的大规模普及、应用。

作为可替代的实施方式，电化学传感器中的凝血检测芯片还可以是实施例2-6中任一的凝血检测芯片。

实施例7

本实施例提供了一种实施例1中电化学检测芯片的制备方法，具体包括以下步骤：

S1，制备导电轨道9：

S11，选择聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)作为基底层6材料，印刷之前，将PET基材用去离子水冲洗去除表面杂质，并用氮气吹干。

S12，首先印刷导电银层，以提高丝网印刷电极的导电性并作为丝网印刷电极的导电轨道9。

S2，在基底层6上制备第一工作区域51的预反应区

以实施例1提供的制备预反应层的成分配制预反应层制备溶液，在第一工作区域51对应第一检测通道1的位置涂覆5μL的预反应层制备溶液。然后在恒温箱中36℃干燥10分钟，再在此基础上均匀涂覆2μL的第一增强稳定层113的溶液，第一增强稳定层113的溶液按照实施例1提供的体系成分进行配制，然后在恒温箱中36℃干燥15分钟，得到第一工作区域51的预反应区。

S3，在基底层6上制备第一检测通道1内的第一工作电极11的第一导电层111、第一参比电极13和第一对电极12

S31，处理石墨烯材料

S311，利用NaNO₃、H₂SO₄和KMnO₄，将石墨氧化剥离成氧化石墨烯；

S312，将氧化石墨烯配制成1g/L的分散液超声剥离60min，然后加入水合肼进行还原，将还原后的分散液在油浴中升温至90℃，反应60min得到稳定的黑色分散液，通过离心分离将获得的黑色沉淀物在60℃下真空干燥12h得到黑色粉体，即为处理后的石墨烯材料。

S32，将处理后的石墨烯分散到N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，超声60min制备得到石墨烯浆料，将石墨烯浆料与导电碳浆按照1∶9的体积比混合，在基底层6上继续印刷石墨烯浆料与导电碳浆的混合浆料，分别形成第一工作电极1121的第一导电层111和第一对电极12。其中第一工作电极11的导电层为圆盘状，第一对电极12呈与第一工作电极11间隔设置并且环绕第一工作电极11的环形结构。

S33，在导电银层的端部印刷氯化银浆料，形成第一参比电极13。

S4，步骤S3中提供的制备步骤在第二检测通道2内制备第二工作电极21的第二导电层211、第二参比电极和第二对电极。

S5，在第一导电层111和第二导电层211远离基底层6的一侧面上覆盖封闭层

并采用绝缘油墨印刷封闭层，留下用于固定试剂和发生反应的第一反应区和第二反应区，并在80-100℃温宿的干燥恒温箱中再次烘烤，直至绝缘油墨完全固化。

绝缘层4采用绝缘油墨固定在电极层2上，留下用于固定试剂和发生反应的工作区域，并在75℃干燥恒温箱中再次烘烤30分钟，制备好的电化学检测芯片在室温下老化2d，期间保存在避光干燥的环境中；

S5，对第一工作电极11和第二工作电极21进行表面修饰

S51，以实施例1中提供的第一增强稳定层113、第一凝血反应层112、第二增强稳定层213和第二凝血反应层212的成分体系配制第一增强稳定溶液、第一凝血反应溶液、第二增强稳定溶液和第二凝血反应溶液，在第一工作电极11的第一导电层111上涂覆修饰第一凝血反应溶液，在恒温箱中36℃干燥10分钟，再在此基础上均匀涂覆3μL第一增强稳定溶液，在恒温箱中36℃干燥15分钟，得到修饰完成的第一工作电极11。

在第二工作电极21的第二导电层211上涂覆修饰6μL第二凝血反应溶液，在恒温箱中36℃干燥10分钟，再在此基础上均匀涂覆5.2μL的第二信号增强液，在恒温箱中36℃干燥15分钟，得到修饰完成的第二工作电极21。

实验例1

1、实验目的：检测电化学传感器用于部分活化凝血酶原时间检测和凝血酶原时间检测的有效性。

2、实验过程：(1)从医院选取了3例病人的血浆样本，注入实施例6提供的电化学传感器，并分别记录第一检测通道内从开始反应到电流达到峰值的时间作为凝血的APTT值，以及第二检测通道内从开始反应到电流达到峰值的时间作为凝血的PT值。

(2)医院选取了8例血液样本，每个样本测试5次。使用上述的电化学传感器与SYSMEX CS 5100光学凝血仪的检测结果进行比对。

3、实验结果：

图13显示电化学传感器检测APTT的结果图，由图13可知，电化学传感器测试不同APTT值的血样的信号时间具有明显的区分度，3组样本所采集到的信号曲线清晰，3组样本测试结果分别为89.13s、124.24s、149.98s。

图16显示电化学传感器检测PT的结果图，由图16可知，电化学传感器测试不同PT值的血样的信号时间具有明显的区分度，3组样本所采集到的信号曲线清晰，3组样本测试结果分别为41.82s、57.66s、81.90s。

SYSMEX CS 5100光学凝血仪的APTT检测结果与电化学传感器的检测结果线性拟合曲线决定系数R₂为0.978。SYSMEX CS 5100光学凝血仪的PT检测结果与电化学传感器的检测结果线性拟合曲线决定系数R₂为0.988可以看出，电化学传感器可以较好的应用于临床检测凝血参数APTT。

实验例2

1、实验目的：检测电化学传感器的重复性。

2、实验过程，采用实验例1中的电化学传感器对3组血浆样本分别作了5次重复测量。3组样本依次记为第1组、第2组和第3组。

3、实验结果：

表1

表1显示电化学传感器的APTT重复性检测结果，由表1可知，3组实验重复性结果的变异系数CV值分别为3.20％、3.25％和2.84％。由此可以判断本发明提供的的传感器用以测量APPT具有良好一致性和重复性。

表2

表1显示电化学传感器的PT重复性检测结果，由表1可知，3组实验重复性结果的变异系数CV值分别为2.72％、2.01％和1，65％。由此可以判断本发明提供的的传感器用以测量APPT具有良好一致性和重复性。

实验例3：

1、实验目的：检测石墨烯材料修饰对电化学传感器的灵敏度的影响。

2、实验方法：采用实施例6提供的电化学传感器，与未修饰石墨烯材料的电化学传感器进行检测。

3、实验结果：

表3

表3显示两种传感器的的阻抗测试结果对比。其中组1为未修饰石墨烯材料的传感器，组2为实施例6提供的电化学传感器。由表2可知修饰前后的电极阻抗均值分别为1.67千欧和0.94千欧。测试电极阻抗变异系数CV值分别为4.19％、2.71％，可以看出石墨烯材料改性后电极阻抗更低，电导率更高，稳定性和一致性更好。

如图14所示为凝血酶测试实验中电极特性电化学CV扫描对比结果。可以看出石墨烯修饰后的电化学传感器的CV扫描曲线检测到的电流信号更大，这是由于石墨烯的结构特性可以有效增大传感器表面试剂反应的比表面积，从而增大电子传递的有效面积，增加传感器导电性，降低传感器的表面阻抗，起到放大电流信号的作用。由于内源性凝血过程的复杂性，电流信号强度与凝血酶验证实验比较而言更低，因此石墨烯材料修饰的电化学传感器将会更加利于检测到凝血过程的信号变化。

图15中显示了凝血酶测试实验中，石墨烯材料修饰的电化学传感器和普通传感器的凝血酶检测结果对比，以及在无修饰凝血酶底物的石墨烯材料修饰的电化学传感器上注入相同的凝血酶溶液的阴性对照实验，可以看出修饰了石墨烯材料的电化学传感器可以起到催化作用使电子移动速度变快，扩大响应信号，检测的电流响应信号强度增加了16±1％，且进液后，阴性对照试验仅有进液时引起传感器瞬间电流变化的进样峰，没有出现凝血酶信号的反应峰。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (13)

1.一种凝血检测芯片，其特征在于，包括使待测样品流经所述凝血检测芯片的检测区域的第一检测通道和第二检测通道；所述检测区域分为顺次连接的第一工作区域、过渡区域和第二工作区域；所述第一工作区域对应所述第一检测通道形成用于检测部分活化凝血活酶时间的预反应区，所述第二工作区域对应所述第一检测通道和所述第二检测通道分别形成用于检测部分活化凝血活酶时间的第一反应区，和用于检测凝血酶原时间的第二反应区；

所述检测区域上设置有驱动所述待测样品由所述第一工作区域流向所述第二工作区域的驱动件，使所述待测样品流经所述第一工作区域的速度V₁≤所述待测样品流经所述第二工作区域的速度V₂，或者使所述待测样品流经所述第一工作区域和所述过渡区域的速度V₄≤所述待测样品流经所述第二工作区域的速度V₂；

位于所述第二工作区域的所述第一检测通道内设置有第一工作电极，所述第一工作电极上形成所述第一反应区；所述第一工作电极包括层叠设置的第一导电层和第一凝血反应层，所述第一凝血反应层产生用于检测部分活化凝血活酶时间的电信号；

位于所述第二工作区域的第二检测通道内设置有第二工作电极，所述第二工作电极上形成所述第二反应区；所述第二工作电极包括层叠设置的第二导电层和第二凝血反应层，所述第二凝血反应层产生用于检测凝血酶原时间的电信号；

所述驱动件是位于所述过渡区域的折弯部，所述折弯部的两端分别连接所述第一工作区域和所述第二工作区域，并与所述第一工作区域和所述第二工作区域分别形成≥90°的夹角；

所述驱动件包括设置于所述第一工作区域和所述第二工作区域的亲水部，以及设置于所述过渡区域的疏水部；所述亲水部为修饰于所述第一工作区域和所述第二工作区域表面的聚乙烯和/或聚苯乙烯，所述疏水部为修饰于所述过渡区域的聚对二氯甲苯；

所述驱动件包括：位于所述第一工作区域的至少一个限流组件，所述限流组件包括第一限流件和第二限流件，所述第一限流件和所述第二限流件沿所述待测样品的流通方向形成第一开口和第二开口，所述第一开口的口径大于所述第二开口的口径；

位于所述过渡区域和/或所述第二工作区域的微孔组件，所述微孔组件包括开设于所述过渡区域的至少一个微孔，和/或开设于所述第二工作区域的至少一个微孔。

2.根据权利要求1所述的凝血检测芯片，其特征在于，所述预反应区包括层叠设置的基底层和预反应层，所述预反应层含有部分活化凝血活酶时间的激活剂。

3.根据权利要求2所述的凝血检测芯片，其特征在于，所述激活剂包括鞣花酸、白陶土和/或硅土。

4.根据权利要求1所述的凝血检测芯片，其特征在于，所述第一工作电极还包括在所述第一凝血反应层远离所述第一导电层一侧设置的第一增强稳定层，和/或，所述第二工作电极还包括在所述第二凝血反应层远离所述第二导电层一侧设置的第二增强稳定层。

5.根据权利要求4所述的凝血检测芯片，其特征在于，

所述第一增强稳定层和所述第二增强稳定层由100-500 μM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，或含有如下至少一种成分的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液制得：羟乙基纤维素0-5wt%，微晶纤维素0.1-5wt%,聚环氧乙烷0-5wt%，曲拉通0.3-2wt%，铁氰化钾10-50mM，亚甲基蓝10-50mM，全氟磺酸聚四氟乙烯5-20 wt%，蔗糖3wt%，甘油50wt%，氯化钠1.3 wt%，叠氮化钠0.02wt%，甘露醇7 wt%，右旋糖酐-40 10 wt%，乙二胺四乙酸0.1mM，三羟甲基氨基甲烷 1M，明胶0.1wt%，氯化钾50mM，淀粉5wt%，普乐净6ppm，四氢嘧啶及衍生物10wt%；

所述第二凝血反应层由含有凝血酶原时间检测试剂和凝血酶底物的第二凝血反应溶液制得，所述凝血酶底物包括凝血酶识别多肽和以酰胺键连接所述多肽的对苯二胺；所述第二凝血反应溶液含有如下成分：凝血酶原时间检测试剂，凝血酶底物300μM，牛血清白蛋白0.5wt%；

所述第一凝血反应层由含有氯化钙和凝血酶底物的第一凝血反应溶液制得；所述第一凝血反应溶液含有如下成分：氯化钙25 mmol/L，凝血酶底物300 μM，牛血清白蛋白0.5wt%。

6.根据权利要求4-5任一项所述的凝血检测芯片，其特征在于，所述第一导电层中修饰有石墨烯材料，所述石墨烯材料用于传递和放大所述第一凝血反应层产生的电信号；和/或，所述第二导电层中修饰有石墨烯材料，所述石墨烯材料用于传递和放大所述第二凝血反应层产生的电信号。

7.根据权利要求6所述的凝血检测芯片，其特征在于，

所述石墨烯材料由下述方法处理得到：（1）将石墨烯用硝酸钠、硫酸和高锰酸钾进行剥离，得到氧化石墨烯；（2）使用所述氧化石墨烯配制为1g/L的分散液，超声剥离后使用水合肼还原所述氧化石墨烯，干燥后得到所述的石墨烯材料。

8.根据权利要求4-5任一项所述的凝血检测芯片，其特征在于，位于所述第二工作区域的所述第一检测通道内还设置有第一参比电极和第一对电极。

9.根据权利要求8所述的凝血检测芯片，其特征在于，所述第一参比电极为丝网印刷电极，和/或，所述第一对电极为丝网印刷电极。

10.根据权利要求4-5任一项所述的凝血检测芯片，其特征在于，位于所述第二工作区域的所述第二检测通道内还设置有第二参比电极和第二对电极。

11.根据权利要求10所述的凝血检测芯片，其特征在于，所述第二参比电极为丝网印刷电极，和/或，所述第二对电极为丝网印刷电极。

12.根据权利要求1-5、7、9、11任一项所述的凝血检测芯片，其特征在于，凝血检测芯片靠近所述第一工作区域的一端开设有进样口，所述进样口连接进样通道，所述进样通道远离所述进样口的一端具有第一连通口和第二连通口，所述第一连通口和所述第二连通口分别连接所述第一检测通道和所述第二检测通道。

13.一种电化学传感器，其特征在于，包括：

权利要求1-12任一项所述的凝血检测芯片；

封装层，所述封装层具有至少三个开口，所述凝血检测芯片在所述至少三个开口处露出所述预反应区、所述第一反应区和所述第二反应区。

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