JP2014206488A - 分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の一実施形態は、角層中に含まれる成分の分布状態を精度良く定量することが可能な分析方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明の一実施形態は、角層中に含まれる成分を定量分析する方法であって、皮膚から複数層の角層を剥離する工程と、剥離された複数層の角層中のタンパク質の含有量を測定する工程と、ＤＡＲＴ又はＤＥＳＩを用いて、タンパク質の含有量が測定された複数層の角層から生成したイオンを順次質量分析計に導入して質量分析する工程を有する。
【選択図】なし

Description

本発明の一実施形態は、分析方法に関する。

皮膚状態の変化により、角層中に含まれるＮＭＦ（天然保湿因子）の量が変化することが知られている。ＮＭＦの成分としては、アミノ酸、ミネラル、ＰＣＡ（ピロリドンカルボン酸）、乳酸塩、尿素等が挙げられる。

角層中に含まれる成分を分析する方法としては、種々の方法が知られている。

特許文献１には、皮膚から採取した試料を熱分解マススペクトル法、または熱脱着マススペクトル法を用いて皮膚表面、または皮膚内部に存在する特定物質の定量を行う皮膚存在物質の分析方法が開示されている。このとき、皮膚から試料を採取する際に粘着性テープを使用する。

しかしながら、角層中に含まれる成分の分布状態を精度良く定量することができないという問題がある。

一方、質量分析におけるイオン化法として、種々の方法が知られているが、近年、ＤＡＲＴ（Ｄｉｒｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）や、ＤＥＳＩ（Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）が注目されている（例えば、特許文献２参照）。

ＤＡＲＴとしては、電子励起状態の原子又は分子を大気中の水に衝突させてペニングイオン化させて生成したプロトンを試料に付加してイオン化させる方法が知られている。例えば、準安定励起状態のヘリウムＨｅ（２^３Ｓ）を用いると、以下のようにして、試料Ｍをイオン化させることができる。

Ｈｅ（２^３Ｓ）＋Ｈ_２Ｏ→Ｈ_２Ｏ^＋＊＋Ｈｅ（１^１Ｓ）＋ｅ⁻
Ｈ_２Ｏ^＋＊＋Ｈ_２Ｏ→Ｈ_３Ｏ^＋＋ＯＨ^＊
Ｈ_３Ｏ^＋＋ｎＨ_２Ｏ→［（Ｈ_２Ｏ）_ｎＨ］^＋
［（Ｈ_２Ｏ）_ｎＨ］^＋＋Ｍ→ＭＨ^＋＋ｎＨ_２Ｏ
また、ＤＥＳＩは、イオン化した溶媒を試料に付着させてイオンを脱離させる方法である。

特開平９−２４３６３６号公報 特開２００８−１８０６５９号公報

本発明の一実施形態は、上記の従来技術が有する問題に鑑み、角層中に含まれる成分の分布状態を精度良く定量することが可能な分析方法を提供することを目的とする。

本発明の一実施形態は、角層中に含まれる成分を定量分析する方法であって、皮膚から複数層の角層を剥離する工程と、該剥離された複数層の角層中のタンパク質の含有量を測定する工程と、ＤＡＲＴ又はＤＥＳＩを用いて、該タンパク質の含有量が測定された複数層の角層から生成したイオンを順次質量分析計に導入して質量分析する工程を有する。

本発明の一実施形態によれば、角層中に含まれる成分の分布状態を精度良く定量することが可能な分析方法を提供することができる。

所定の間隔で切れ目が入れられている粘着テープの一例を示す図である。 切断された複数の粘着テープが固定されている板状部材の一例を示す上面図である。 図２の平板を用いる質量分析方法の一例を示す模式図である。 切断された複数の粘着テープが固定されている板状部材の他の例を示す下面図である。 切断された複数の粘着テープが固定されている柱状部材の一例を示す図である。 図５の直角二等辺三角柱を用いる質量分析方法の一例を示す模式図である。 図５の直角二等辺三角柱の変形例を示す断面図である。 柱状部材の変形例を示す断面図である。 複数の粘着テープが挟持されているデバイスの一例を示す図である。 切断された複数の粘着テープが挟持されているデバイスの変形例を示す断面図である。 第二の板状部材の変形例を示す断面図である。 実施例１の上腕内側部から剥離した１層目の角層のマススペクトルである。 実施例１の角層中のタンパク質の含有量の累積値と、角層中のタンパク質の含有量に対する各成分の含有量の比の関係を示すグラフである。 実施例１の角層中の各成分のマスクロマトグラムである。 実施例１の各成分の検量線である。

次に、本発明を実施するための形態を図面と共に説明する。

［第一の実施形態］
まず、所定の間隔で切れ目が入れられている複数の粘着テープを用いて、複数層の角層を剥離する。

粘着テープとしては、テープストリッピング法に適用することが可能であれば、特に限定されないが、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（ＣｕＤｅｒｍ社製）、セロテープ（登録商標）（ニチバン社製）、ＰＰＳテープ（ニチバン社製）等が挙げられる。

図１に、所定の間隔で切れ目が入れられている粘着テープの一例を示す。なお、（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ上面図及び断面図である。

粘着テープ１０は、円状であり、基材１０ａの表面に粘着剤層１０ｂが形成されており、所定の間隔で切れ目１１が３本入れられている。このため、角層中に含まれる成分を、必要に応じて、条件を変更して、複数回分析することができる。

粘着テープ１０の形状は、円状に限定されず、矩形状、楕円状等であってもよい。

粘着テープ１０に所定の間隔で切れ目１１を入れる方法としては、特に限定されないが、カッターを用いて切れ目を入れる方法等が挙げられる。

切れ目１１の間隔Ｇ_１は、通常、０．５〜５．０ｍｍであり、１．０〜３．０ｍｍであることが好ましい。

切れ目１１の数は、特に限定されないが、通常、２〜６個である。

なお、使用前の粘着テープ１０は、粘着剤層１０ｂの表面に剥離材が保持されている。

次に、剥離された複数層の角層中のタンパク質の含有量を測定する。

なお、剥離された複数層の角層中のタンパク質の含有量の測定方法としては、特に限定されないが、近赤外領域での吸光度を測定する方法、ＢＣＡ比色法等が挙げられる。中でも、近赤外領域での吸光度を測定する方法が好ましい。

さらに、複数層の角層を剥離した複数の粘着テープを切れ目の間隔に対応する幅で切断した後、切断された複数の粘着テープの角層が固定されている側と反対側の面を、所定の間隔を隔てて板状部材又は柱状部材に固定する。

次に、切断された複数の粘着テープが固定されている板状部材又は柱状部材を移動させながら、複数層の角層から生成したイオンを順次質量分析計に導入して質量分析する。

図２に、板状部材の一例として、平板２０を示す。

平板２０には、長さ方向Ｌに対して略平行に、２枚の両面テープ２１が固定されている。このため、粘着テープ１０が短冊状に切断された粘着テープの断片１０’を固定することができる。

平板２０を構成する材料としては、耐熱性を有していれば、特に限定されないが、ガラス、石英ガラス、セラミックス、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム、鉄、アクリル樹脂、ポリプロピレン、フッ素樹脂、塩化ビニル樹脂、ナイロン、ポリスチレン、ポリカーボネート、シリコーン樹脂等が挙げられる。

なお、使用前の平板２０は、両面テープ２１の粘着剤層の表面に剥離材が保持されている。

平板２０に固定されている、隣接する粘着テープの断片１０’の間隔Ｇ_２は、通常、１．０〜５０．０ｍｍであり、５．０〜１０．０ｍｍであることが好ましい。

平板２０には、間隔Ｇ_１及びＧ_２に応じて決定される、粘着テープの断片１０’を固定する位置１〜Ｎが表示されている。このとき、Ｎは、通常、１〜９０の整数である。また、平板２０には、角層を剥離していない以外は、粘着テープの断片１０’と同一の粘着テープの断片１０’’を固定する位置Ｂｌａｎｋが表示されている。

平板２０には、幅方向Ｗに対して略平行に、定量用標準試料の含有量が異なる複数個の定量用標準試料層２２が形成されている。このため、粘着テープの断片１０’が固定されている平板２０を用いて質量分析する際に、角層中に含まれる成分を定量することができる。このとき、定量用標準試料層２２の個数は、通常、２〜５個である。

なお、定量用標準試料層２２の個数が１個であっても、角層中に含まれる成分を定量することができる。

隣接する定量用標準試料層２２の間隔は、通常、１．０〜５０．０ｍｍであり、５．０〜１０．０ｍｍであることが好ましい。

定量用標準試料は、定量する角層中に含まれる成分である。

定量用標準試料層２２を形成する方法としては、特に限定されないが、所定濃度の定量用標準試料の溶液が粘着剤層１０ｂに所定量塗布されている以外は、粘着テープの断片１０’’と同一の粘着テープの断片を平板２０に固定する方法等が挙げられる。

なお、平板２０には、２枚の両面テープ２１が固定されていなくてもよく、接着剤を用いて、粘着テープの断片１０’を平板に固定してもよい。

また、平板２０には、質量校正用標準試料層がさらに形成されていてもよい。これにより、粘着テープの断片１０’が固定されている平板２０を用いて質量分析する際に、質量分析計を質量校正し、感度を補正することができる。

質量校正用標準試料としては、ＤＡＲＴイオン源を用いて、イオンを生成させることが可能であれば、特に限定されないが、質量校正の精度を考慮すると、マススペクトルのピークが等間隔で存在するポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０〜ＰＥＧ２０００）、炭素数が４〜３６の脂肪酸等が挙げられ、二種以上併用してもよい。

質量校正用標準試料層を形成する方法としては、特に限定されないが、質量校正用標準試料の溶液が基材に塗布されている粘着テープを平板２０に固定する方法、質量校正用標準試料が添加されているインクが充填されているペンを用いて平板２０に描画する方法、質量校正用標準試料が添加されているインクを平板２０に塗布する方法等が挙げられる。

さらに、粘着テープ１０の代わりに、切れ目が入れられていない粘着テープを用いてもよい。この場合、角層を剥離した粘着テープを所定の幅で切断してもよいし、切断しなくてもよい。

また、粘着テープ１０を用いて、皮膚から角層を剥離する代わりに、アロンアルファ（東亞合成社製）等の接着剤を皮膚に塗布して角層を剥離してもよい。

図３に、平板２０を用いる質量分析方法の一例を示す。

まず、略水平面内において、図中、矢印方向に移動させることが可能なサンプルステージ１００に、複数個の粘着テープの断片１０’が固定されている平板２０を、平板２０の長さ方向Ｌが矢印方向に対して略平行になるように載せる。次に、サンプルステージ１００を、図中、矢印方向に移動させながら、ＤＡＲＴイオン源２００を用いて、準安定励起状態のヘリウムＨｅ（２^３Ｓ）を大気中の水に衝突させてペニングイオン化させて生成したプロトンを、図中、矢印方向に対して、略垂直に、略水平面に対して、所定の角度で平板２０に照射して生成したイオンを、質量分析計３００に導入して質量分析する。このとき、所定の角度は、通常、１〜４５°である。このため、角層中に含まれる成分を二種以上同時に分析することができる。

このとき、質量分析計３００のイオン導入管３１０は、抵抗発熱線３１１が巻き付けられているため、電源（不図示）を用いて抵抗発熱線３１１に電圧を印加することにより、イオン導入管３１０を加熱しながら、生成したイオンを質量分析することができる。これにより、生成したイオンのイオン導入管３１０への付着を抑制することができる。その結果、角層中に含まれる成分の定量性を向上させることができる。このとき、イオン導入管３１０内は、コンプレッサー（不図示）により減圧されている。

なお、生成したイオンは、イオン導入管３１０のイオンが導入される側に付着しやすいため、通常、イオン導入管３１０のイオンが導入される側に抵抗発熱線３１１が巻き付けられる。

イオン導入管３１０を加熱するときのイオン導入管３１０の内壁の温度は、通常、５０〜５００℃であり、１００〜３００℃であることが好ましい。

なお、イオン導入管３１０を加熱する方法としては、抵抗発熱線３１１を巻き付けて加熱する方法に限定されず、セラミックファイバーヒーターを用いて加熱する方法、マイクロ波を照射して加熱する方法、熱風器を用いて加熱する方法等が挙げられる。

また、イオン導入管３１０を外して、イオン導入口を直接加熱してもよい。

さらに、イオン導入管３１０に生成したイオンが付着しにくい場合は、イオン導入管３１０を加熱しなくてもよい。

イオン導入管３１０を構成する材料としては、耐熱性を有していれば、特に限定されないが、セラミックス、ガラス、テフロン（登録商標）、ステンレス鋼、ニオブ鋼、タンタル鋼等が挙げられる。

イオン導入管３１０の内面に、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトン、シリコーン樹脂等がコーティングされていてもよい。

抵抗発熱線３１１を構成する材料としては、特に限定されないが、鉄−クロム−アルミ系合金、ニッケル−クロム系合金等の金属発熱体；白金、モリブデン、タンタル、タングステン等の高融点金属発熱体；炭化ケイ素、モリブデン−シリサイト、カーボン等の非金属発熱体等が挙げられる。

例えば、抵抗発熱線３１１として、直径が０．２６ｍｍのニクロム線を用いる場合は、１〜６Ａの電流を流す。

定量することが可能な角層中に含まれる成分としては、ＤＡＲＴイオン源を用いて、イオンを生成させることが可能であれば、特に限定されないが、アミノ酸、ピロリドンカルボン酸（ＰＣＡ）、脂肪酸、乳酸、スフィンゴシン脂質、脂肪酸グリセリド、スクワラン、ペプチド類、リン脂質、糖脂質、中性脂質等が挙げられる。

なお、平板２０の代わりに、粘着テープの断片１０’が固定される側とは反対側の面の粘着テープの断片１０’が固定されている位置及び定量用標準試料層２２に対応する位置に、抵抗発熱線２３が設置されている以外は、平板２０と同一の平板２０’（図４参照）を用いてもよい。これにより、質量分析する際に、電源（不図示）を用いて抵抗発熱線２３に電圧を印加することにより、所定の温度に加熱することができる。このとき、ペニングイオン化させて生成したプロトンが粘着テープの断片１０’又は１０’’に照射されるタイミングで、抵抗発熱線２３に電圧を印加すると、生成したイオンを効率的に脱離させることができる。

抵抗発熱線２３を構成する材料としては、特に限定されないが、鉄−クロム−アルミ系合金、ニッケル−クロム系合金等の金属発熱体；白金、モリブデン、タンタル、タングステン等の高融点金属発熱体；炭化ケイ素、モリブデン−シリサイト、カーボン等の非金属発熱体等が挙げられる。

また、粘着テープの断片１０’を複数列に亘って平板２０に固定し、サンプルステージ１００の代わりに、平板２０の長さ方向及び幅方向に移動させることが可能なサンプルステージを用いて、質量分析してもよい。

さらに、準安定励起状態のヘリウムＨｅ（２^３Ｓ）の代わりに、準安定励起状態のネオン、準安定励起状態のアルゴン、準安定励起状態の窒素等を用いてもよい。

また、ＤＡＲＴイオン源２００の代わりに、ＤＥＳＩイオン源を用いて、イオン化した溶媒を試料に付着させてイオンを脱離させてもよい。

イオン化させる溶媒としては、特に限定されないが、メタノール、メタノール水溶液、アセトニトリル、アセトニトリル水溶液等が挙げられる。

イオン化させる溶媒は、酸性物質や塩基性物質を含んでいてもよい。

図５に、柱状部材の一例として、直角二等辺三角柱４０を示す。なお、（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ斜視図及び断面図である。

直角二等辺三角柱４０の角部Ｃを挟む面Ｐ_１及びＰ_２には、高さ方向Ｈに対して略平行に、それぞれ１枚の両面テープ４１が固定されている。このため、粘着テープの断片１０’を固定することができる。

直角二等辺三角柱４０を構成する材料としては、耐熱性を有していれば、特に限定されないが、ガラス、石英ガラス、セラミックス、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム、鉄、アクリル樹脂、ポリプロピレン、フッ素樹脂、塩化ビニル樹脂、ナイロン、ポリスチレン、ポリカーボネート、シリコーン樹脂等が挙げられる。

なお、使用前の直角二等辺三角柱４０は、両面テープ４１の粘着剤層の表面に剥離材が保持されている。

直角二等辺三角柱４０に固定されている、隣接する粘着テープの断片１０’の間隔Ｇ_２は、通常、１．０〜５０．０ｍｍであり、５．０〜１０．０ｍｍが好ましい。

直角二等辺三角柱４０の角部Ｃを挟む面Ｐ_１及びＰ_２には、間隔Ｇ_１及びＧ_２に応じて決定される、粘着テープの断片１０’を固定する位置１〜Ｎが表示されている。このとき、Ｎは、通常、１〜９０の整数である。また、直角二等辺三角柱４０の角部Ｃを挟む面Ｐ_１及びＰ_２には、角層を剥離していない以外は、粘着テープの断片１０’と同一の粘着テープの断片１０’’を固定する位置Ｂｌａｎｋが表示されている。

直角二等辺三角柱４０の角部Ｃを挟む面Ｐ_１及びＰ_２には、それぞれ辺方向Ｓ_１及びＳ_２に対して略平行に、定量用標準試料の含有量が異なる複数個の定量用標準試料層４２が形成されている。このため、粘着テープの断片１０’が固定されている直角二等辺三角柱４０を用いて質量分析する際に、角層中に含まれる成分を定量することができる。このとき、定量用標準試料層４２の個数は、通常、２〜５個である。

なお、定量用標準試料層４２の個数が１個であっても、角層中に含まれる成分を定量することができる。

隣接する定量用標準試料層４２の間隔は、通常、１．０〜５０．０ｍｍであり、５．０〜１０．０ｍｍであることが好ましい。

定量用標準試料は、定量する角層中に含まれる成分である。

定量用標準試料層４２を形成する方法としては、特に限定されないが、所定濃度の定量用標準試料の溶液が所定量粘着剤層に塗布されている以外は、粘着テープの断片１０’’と同一の粘着テープの断片を直角二等辺三角柱４０に固定する方法等が挙げられる。

なお、直角二等辺三角柱４０の角部Ｃを挟む面Ｐ_１及びＰ_２には、２枚の両面テープ４１が固定されていなくてもよく、接着剤を用いて、粘着テープの断片１０’を固定してもよい。

また、直角二等辺三角柱４０の角部Ｃを挟む面Ｐ_１及びＰ_２には、質量校正用標準試料層がさらに形成されていてもよい。これにより、粘着テープの断片１０’が固定されている直角二等辺三角柱４０を用いて質量分析する際に、質量分析計を質量校正し、感度を補正することができる。

質量校正用標準試料としては、ＤＡＲＴイオン源を用いて、イオンを生成させることが可能であれば、特に限定されないが、質量校正の精度を考慮すると、マススペクトルのピークが等間隔で存在するポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０〜ＰＥＧ２０００）、炭素数が４〜３６の脂肪酸等が挙げられ、二種以上併用してもよい。

質量校正用標準試料層を形成する方法としては、特に限定されないが、質量校正用標準試料の溶液が基材に塗布されている粘着テープを直角二等辺三角柱４０に固定する方法、質量校正用標準試料が添加されているインクが充填されているペンを用いて直角二等辺三角柱４０に描画する方法、質量校正用標準試料が添加されているインクを直角二等辺三角柱４０に塗布する方法等が挙げられる。

図６に、直角二等辺三角柱４０を用いる質量分析方法の一例を示す。なお、図６において、図３と同一の構成については、同一の符号を付して、説明を省略する。

まず、略水平面内において、図中、矢印方向に移動させることが可能なサンプルステージ１００に、複数個の粘着テープの断片１０’が固定されている直角二等辺三角柱４０を、直角二等辺三角柱４０の高さ方向Ｈが矢印方向に対して略平行になるように載せる。このとき、直角二等辺三角柱４０のサンプルステージ１００に対して、垂直な面がＤＡＲＴイオン源２００と対向するように、直角二等辺三角柱４０を配置する。次に、サンプルステージ１００を、図中、矢印方向に移動させながら、ＤＡＲＴイオン源２００を用いて、準安定励起状態のヘリウムＨｅ（２^３Ｓ）を大気中の水に衝突させてペニングイオン化させて生成したプロトンを、略水平面内において、図中、矢印方向に対して、略垂直に、直角二等辺三角柱４０の角部Ｃに照射して生成したイオンを、質量分析計３００に導入して質量分析する。このため、角層中に含まれる成分を二種以上同時に分析することができる。また、角層中に含まれる成分の検出感度を向上させることができる。

なお、直角二等辺三角柱４０のサンプルステージ１００に対して、垂直な面が質量分析計３００と対向するように、直角二等辺三角柱４０を配置してもよい。

また、直角二等辺三角柱４０の代わりに、内部の粘着テープの断片１０’が固定されている位置に対応する位置に、抵抗発熱線が設置されている以外は、直角二等辺三角柱４０と同一の直角二等辺三角柱を用いてもよい。これにより、質量分析する際に、電源（不図示）を用いて抵抗発熱線に電圧を印加することにより、所定の温度に加熱することができる。このとき、ペニングイオン化させて生成したプロトンが粘着テープの断片１０’又は１０’’に照射されるタイミングで、抵抗発熱線に電圧を印加すると、生成したイオンを効率的に脱離させることができる。

抵抗発熱線を構成する材料としては、特に限定されないが、鉄−クロム−アルミ系合金、ニッケル−クロム系合金等の金属発熱体；白金、モリブデン、タンタル、タングステン等の高融点金属発熱体；炭化ケイ素、モリブデン−シリサイト、カーボン等の非金属発熱体等が挙げられる。

さらに、直角二等辺三角柱４０の代わりに、中空直角二等辺三角柱を用いてもよいし、折り曲げることにより角部が形成されている板を用いてもよい。

また、直角二等辺三角柱４０の代わりに、直角二等辺三角柱４０の角部Ｃが丸みを帯びている柱状部材（図７（ａ）参照）、直角二等辺三角柱４０から角部Ｃを含む直角二等辺三角柱を除去した台形柱（図７（ｂ）参照）、直角二等辺三角柱４０から角部Ｃを含む三角柱を除去した四角柱（図７（ｃ）、（ｄ）参照）を用いてもよい。このとき、θ_１は、通常、９０〜１８０°であり、θ_２は、通常、１３６〜１８０°である。

図８に、柱状部材の変形例を示す。

このとき、θ_３は、通常、９０〜１３５°である。また、図８（ｄ）〜（ｇ）の柱状部材は、断面がｎ回対称であるため、１枚の切断された粘着テープ１０’を用いて、ｎ回分析することができる。

［第二の実施形態］
まず、所定の間隔で切れ目が入れられていない粘着テープを用いる以外は、第一の実施形態と同様にして、皮膚から複数層の角層を剥離する。

次に、剥離された複数層の角層中のタンパク質の含有量を測定する。

なお、剥離された複数層の角層中のタンパク質の含有量の測定方法としては、特に限定されないが、近赤外領域での吸光度を測定する方法、ＢＣＡ比色法等が挙げられる。中でも、近赤外領域での吸光度を測定する方法が好ましい。

さらに、第一の板状部材及び所定の間隔を隔てて、複数の貫通孔が形成されている第二の板状部材を有するデバイスを用いて、複数の粘着テープの複数の角層が固定されている側を貫通孔に対向するようにして、複数の粘着テープを挟持する。

次に、複数の粘着テープ挟持されているデバイスを移動させながら、複数層の角層から生成したイオンを順次質量分析計に導入して質量分析する。このとき、切断された複数の粘着テープが固定されている板状部材又は柱状部材の代わりに、複数の粘着テープが挟持されているデバイスを用いる以外は、第一の実施形態と同様にして、質量分析することができる。

図９に、複数の粘着テープが挟持されているデバイスの一例として、平板３１及び平板３２を有するデバイス３０を示す。なお、（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ平板３１及び平板３２の上面図であり、（ｃ）は、デバイス３０の断面図である。

平板３１及び平板３２を構成する材料としては、特に限定されないが、ガラス、石英ガラス、セラミックス、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム、鉄、アクリル樹脂、ポリプロピレン、フッ素樹脂、塩化ビニル樹脂、ナイロン、ポリスチレン、ポリカーボネート、シリコーン樹脂等が挙げられる。

平板３１には、角層を剥離した粘着テープ４０’を挟持する位置１〜Ｎ及び角層を剥離していない以外は、粘着テープ４０’と同一の粘着テープ４０を挟持する位置Ｂｌａｎｋが表示されている。このとき、粘着テープ４０は、矩形状であり、位置１〜Ｎ及びＢｌａｎｋは、粘着テープ４０の幅に応じて決定される。このとき、Ｎは、通常、１〜９０の整数である。

また、平板３１には、幅方向Ｗに対して略平行に、定量用標準試料の含有量が異なる複数個の定量用標準試料層３１ａが形成されている。このため、複数の粘着テープ４０’が挟持されているデバイス３０を用いて質量分析する際に、角層中に含まれる成分を定量することができる。このとき、定量用標準試料層３１ａの個数は、通常、２〜５個である。

なお、定量用標準試料層３１ａの個数が１個であっても、角層中に含まれる成分を定量することができる。

隣接する定量用標準試料層３１ａの間隔は、通常、１．０〜５０．０ｍｍであり、５．０〜１０．０ｍｍであることが好ましい。

定量用標準試料は、定量する角層中に含まれる成分である。

定量用標準試料層３１ａを形成する方法としては、特に限定されないが、所定濃度の定量用標準試料の溶液が所定量粘着剤層に塗布されている以外は、粘着テープ４０と同一の粘着テープを平板３１に固定する方法等が挙げられる。

平板３２には、幅方向Ｗに対して略平行に、粘着テープ４０、４０’及び定量用標準試料層３１ａに対応する直方体状の貫通孔３２ａが形成されている。

粘着テープ４０及び４０’に対応する隣接する貫通孔３２ａの間隔Ｇ_３は、通常、０．５〜５０．０ｍｍであり、５．０〜１０．０ｍｍが好ましい。

複数の粘着テープ４０及び４０’が挟持されているデバイス３０を固定する方法としては、特に限定されないが、クリップ等の固定具を用いて固定する方法等が挙げられる。

なお、平板３１及び平板３２には、それぞれ質量校正用標準試料層及び質量校正用標準試料層に対応する貫通孔がさらに形成されていてもよい。これにより、複数の粘着テープ４０’が挟持されているデバイス３０を用いて質量分析する際に、質量分析計を質量校正し、感度を補正することができる。

質量校正用標準試料としては、ＤＡＲＴイオン源を用いて、イオンを生成させることが可能であれば、特に限定されないが、質量校正の精度を考慮すると、マススペクトルのピークが等間隔で存在するポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０〜ＰＥＧ２０００）、炭素数が４〜３６の脂肪酸等が挙げられ、二種以上併用してもよい。

質量校正用標準試料層を形成する方法としては、特に限定されないが、質量校正用標準試料の溶液が基材に塗布されている粘着テープを平板３１に固定する方法、質量校正用標準試料が添加されているインクが充填されているペンを用いて平板３１に描画する方法、質量校正用標準試料が添加されているインクを平板３１に塗布する方法等が挙げられる。

また、粘着テープ４０の形状は、矩形状に限定されず、円状、楕円状等であってもよい。粘着テープ４０が円状である場合は、貫通孔３２ａの形状が円柱状であってもよい。

さらに、デバイス３０の代わりに、粘着テープ４０及び４０’を挟持する領域、定量用標準試料層３１ａを形成する領域に凸状部３１ｂが形成されている平板３１’及び隣接する凸状部３１ｂの間の領域に対応する凸状部３２ｂが形成されている平板３２’を有するデバイス３０’を用いてもよい（図１０参照）。これにより、複数の粘着テープ４０及び４０’が挟持されているデバイス３０’を固定しやすくなる。

また、貫通孔３２ａに、平板３２の長さ方向Ｌに対して略平行な仕切りを設置し、サンプルステージ１００の代わりに、デバイス３０の長さ方向及び幅方向に移動させることが可能なサンプルステージを用いて、角層中に含まれる成分を、必要に応じて、条件を変更して、複数回定量分析してもよい。これにより、複数回定量分析する際に、コンタミネーションの発生を抑制することができる。

貫通孔３２ａに設置する仕切りの数は、通常、１〜６個である。

貫通孔３２ａに設置する仕切りの幅は、通常、０．５〜１０．０ｍｍである。

さらに、貫通孔３２ａの代わりに、台形柱状の貫通孔３２ａ’が形成されている平板３２’’を用いてもよい（図１１参照）。

テーパー角αは、通常、５〜８０°であり、１０〜５０°であることが好ましい。

［粘着テープ１０の作製］
３枚の刃が２ｍｍ間隔で固定されているカッターを用いて、直径が２２ｍｍの円形の粘着テープＤ−Ｓｑｕａｍｅ ｄｉｓｃ（ＣｕＤｅｒｍ社製）に切れ目１１を３本入れ、粘着テープ１０を得た。

［定量用標準試料層用塗布液の調製］
定量用標準試料層用塗布液として、グリシン２ｍｇ、セリン５ｍｇ、ピロリドンカルボン酸５ｍｇ及び乳酸５ｍｇを水１００ｍＬ中に溶解させて、定量用標準試料層用塗布液（１）を得た。

また、定量用標準試料層用塗布液（１）を水で２倍に希釈したものを定量用標準試料層用塗布液（２）とし、定量用標準試料層用塗布液（１）を水で１０倍に希釈したものを定量用標準試料層用塗布液（３）とした。

［直角二等辺三角柱４０の作製］
粘着テープ１０の切れ目１１の根元部分を切断し、２ｍｍ×２２ｍｍの短冊状に切断された粘着テープの断片１０’’を得た。

直角を挟む二辺の長さが１０ｍｍ、高さが１００ｍｍのガラス製のプリズムの高さ方向Ｈに対して平行に、３ｍｍ×６０ｍｍの両面テープ４１を、角部Ｃを挟む間隔が１４ｍｍとなるように２枚固定した後、粘着テープの断片１０’’を、基材１０ａ側の面が両面テープ４１に接着するように、１０ｍｍピッチで３枚固定した。さらに、粘着テープの断片１０’’の粘着剤層１０ｂ側の面に、定量用標準試料層用塗布液（１）〜（３）を１μＬずつ塗布することにより、定量用標準試料の含有量が異なる３個の定量用標準試料層４２を形成し、直角二等辺三角柱４０（Ｎ＝６）を得た。

［実施例１］
（角層の剥離）
上腕内側部を洗浄した後、乾燥させた。次に、粘着テープ１０を用いて、上腕内側部から６層の角層を剥離した。

（角層中のタンパク質の含有量の測定）
Ｄ−ｓｑｕａｍｅ Ｓｃａｎ ８５０Ａ（ＣｕＤｅｒｍ社製）を用いて、角層を剥離した粘着テープ１０の単位面積当たりのタンパク質の含有量［μｇ／ｃｍ^２］を測定した後、角層を剥離した粘着テープ１０の面積［ｃｍ^２］を用いて、角層中のタンパク質の含有量［μｇ］を算出した。

（角層を剥離した粘着テープの固定）
６層の角層を剥離した粘着テープ１０の切れ目１１の根元部分を切断し、２ｍｍ×２２ｍｍの短冊状の切断された粘着テープの断片１０’を得た。次に、１〜６層目の角層を剥離した粘着テープの断片１０’を、基材１０ａ側の面が両面テープ４１に接着するように、直角二等辺三角柱４０に１０ｍｍピッチで固定した。また、粘着テープの断片１０’’を、基材１０ａ側の面が両面テープ４１に接着するように、直角二等辺三角柱４０の位置Ｂｌａｎｋに固定した。

（角層の分析）
次に、図６の質量分析方法を用いて、直角二等辺三角柱４０の、粘着テープの断片１０’’、３個の定量用標準試料層４２及び６個の粘着テープの断片１０’から生成したイオンを順次質量分析した。具体的には、まず、直角二等辺三角柱４０を、高さ方向Ｈが矢印方向に対して略平行になるようにサンプルステージ１００に載せた。このとき、直角二等辺三角柱４０のサンプルステージ１００に対して、垂直な面がＤＡＲＴイオン源２００と対向するように、直角二等辺三角柱４０を配置した。次に、サンプルステージ１００を、略水平面内において、図中、矢印方向に０．２ｍｍ／ｓで移動させながら、ＤＡＲＴイオン源２００を用いて、準安定励起状態のヘリウムＨｅ（２^３Ｓ）を大気中の水に衝突させてペニングイオン化させて生成したプロトンを、略水平面内において、図中、矢印方向に対して、略垂直に、直角二等辺三角柱４０の角部Ｃに照射して生成したイオンを、質量分析計３００に導入して質量分析した。このとき、抵抗発熱線３１１に４Ａの電流を流すことにより、イオン導入管３１０を加熱したため、イオン導入管３１０の内壁の温度は１１０℃であった。

なお、ＤＡＲＴイオン源２００として、ＤＡＲＴ ＳＶＰ（イオンセンス社製）を用い、ガスヒーターの設定温度を５００℃とした。また、質量分析計３００として、ＭｉｃｒＯＴＯＦＱＩＩ（ブルカー ダルトニクス社製）を用い、測定モードをｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅとした。さらに、イオン導入管３１０として、外径が６．２ｍｍ、内径が４．７ｍｍ、長さが９４ｍｍのセラミックス製のチューブを用い、イオンが導入される側から３５ｍｍの領域に抵抗発熱線３１１を巻き付けた。このとき、抵抗発熱線３１１として、直径が０．２６ｍｍのニクロム線を用いた。

図１２に、右上腕内側部から剥離した１層目の角層のマススペクトルを示す。

図１３に、角層中のタンパク質の含有量の累積値と、角層中のタンパク質の含有量に対する各成分の含有量の比の関係を示す。

なお、角層中のタンパク質の含有量の累積値［μｇ］は、１〜６層目の角層中のタンパク質の含有量［μｇ］の累積値であり、数値が大きくなる程、角層の深さが深くなることを意味する。

また、角層中のタンパク質の含有量に対する各成分の含有量の比［ｎｇ／μｇ］は、１〜６層目の角層中のタンパク質の含有量［μｇ］に対する各成分の含有量［ｎｇ］の比である。ここで、１〜６層目の角層中の各成分の含有量［ｎｇ］は、角層中の各成分のマスクロマトグラム（図１４参照）のピーク面積を用いて算出した。具体的には、定量用標準試料の含有量が異なる３個の定量用標準試料層４２に由来するピーク面積から各成分の検量線を作成し（図１５参照）、６個の粘着テープの断片１０’に由来するピーク面積から、それぞれ１〜６層目の角層中の各成分の含有量［ｎｇ］を算出した。なお、図１５（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれグリシン、乳酸、セリン及びＰＣＡの検量線である。

図１３から、角層の深さにより、角層中の各成分の分布が変化することがわかる。このとき、角層の層数ではなく、角層中のタンパク質の含有量を用いているため、角層を剥離する際の粘着テープ１０に接着する角層の量のばらつきの影響を小さくすることができる。その結果、角層中の各成分の分布状態を精度良く定量することができる。

１０ 粘着テープ
１１ 切れ目
１０’ 粘着テープの断片
２０、２０’ 平板
２１ 両面テープ
２２ 定量用標準試料層
２３ 抵抗発熱線
３０、３０’ デバイス
３１、３１’ 平板
３１ａ 定量用標準試料層
３２、３２’、３２’’ 平板
３２ａ、３２ａ’ 貫通孔
４０ 直角二等辺三角柱
４１ 両面テープ
４２ 定量用標準試料層
１００ サンプルステージ
２００ ＤＡＲＴイオン源
３００ 質量分析計
３１０ イオン導入管
３１１ 抵抗発熱線

Claims (3)

1. 角層中に含まれる成分を定量分析する方法であって、
   皮膚から複数層の角層を剥離する工程と、
   該剥離された複数層の角層中のタンパク質の含有量を測定する工程と、
   ＤＡＲＴ又はＤＥＳＩを用いて、該タンパク質の含有量が測定された複数層の角層から生成したイオンを順次質量分析計に導入して質量分析する工程を有することを特徴とする分析方法。
2. 所定の間隔で切れ目が入れられている複数の粘着テープを用いて、前記皮膚から複数層の角層を剥離し、
   前記複数層の角層を剥離した複数の粘着テープを前記切れ目の間隔に対応する幅で切断する工程と、
   該切断された複数の粘着テープの前記角層が固定されている側と反対側の面を、所定の間隔を隔てて柱状部材に固定する工程をさらに有し、
   該切断された複数の粘着テープが固定されている柱状部材を移動させながら、前記複数層の角層から生成したイオンを順次質量分析計に導入して質量分析することを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
3. 前記柱状部材は、定量用標準試料の含有量が異なる複数個の定量用標準試料を含む層が形成されており、
   該複数個の定量用標準試料を含む層から生成したイオンを質量分析計に導入して質量分析することを特徴とする請求項２に記載の分析方法。

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