JP2016206190A - 分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】皮膚に含まれる成分を定量分析する場合に、検量線の直線性を向上させることが可能な分析方法及び内部標準物質を提供する。【解決手段】分析方法は、皮膚に含まれる成分を定量分析する方法であって、皮膚から採取された試料に、安定同位体で標識されたイオンサプレッションを受けやすい化合物及び／又は安定同位体で標識されたイオンサプレッションを受けにくい化合物を含む所定量の内部標準物質を供給する工程と、大気圧イオン化法を用いて、該内部標準物質が供給された試料から生成したイオンを質量分析する工程と、を有する。【選択図】なし

Description

本発明は、皮膚に含まれる成分を定量分析する方法及び皮膚に含まれる成分の定量分析に用いられる内部標準物質に関する。

皮膚状態の変化により、角層に含まれる天然保湿因子（ＮＭＦ）の量が変化することが知られている。ＮＭＦの成分としては、アミノ酸、ミネラル、ピロリドンカルボン酸、乳酸塩、尿素等が挙げられる。

皮膚に含まれる成分を分析する方法としては、種々の方法が知られている。

特許文献１には、角層中に含まれる成分を定量分析する方法として、皮膚から複数層の角層を剥離する工程と、該剥離された複数層の角層中のタンパク質の含有量を測定する工程と、ＤＡＲＴ又はＤＥＳＩを用いて、該タンパク質の含有量が測定された複数層の角層から生成したイオンを順次質量分析計に導入して質量分析する工程を有する分析方法が開示されている。

特開２０１４−２０６４８８号公報

しかしながら、皮膚に含まれる成分を定量分析する場合に、検量線の直線性を向上させることが望まれている。

本発明の一態様は、上記の従来技術が有する問題に鑑み、皮膚に含まれる成分を定量分析する場合に、検量線の直線性を向上させることが可能な分析方法及び内部標準物質を提供することを目的とする。

本発明の一態様は、皮膚に含まれる成分を定量分析する方法であって、皮膚から採取された試料に、安定同位体で標識されたイオンサプレッションを受けやすい化合物及び／又は安定同位体で標識されたイオンサプレッションを受けにくい化合物を含む所定量の内部標準物質を供給する工程と、大気圧イオン化法を用いて、該内部標準物質が供給された試料から生成したイオンを質量分析する工程と、を有する。

本発明の一態様は、皮膚に含まれる成分の定量分析に用いられる内部標準物質であって、安定同位体で標識されたイオンサプレッションを受けやすい化合物及び／又は安定同位体で標識されたイオンサプレッションを受けにくい化合物を含む。

本発明の一態様によれば、皮膚に含まれる成分を定量分析する場合に、検量線の直線性を向上させることが可能な分析方法及び内部標準物質を提供することができる。

所定の間隔で切れ目が入れられている粘着テープの一例を示す図である。 切断された複数の粘着テープが固定されている柱状部材の一例を示す図である。 図２の柱状部材を用いる質量分析方法の一例を示す模式図である。 実施例１の検量線作成用試料の抽出クロマトグラムである。 実施例１の安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸の検量線である。 実施例１の安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸の検量線である。 実施例１の角層中のタンパク質の含有量の累積値と、角層中のタンパク質の含有量に対するアミノ酸の含有量の比の関係を示す図である。 比較例１の安定同位体で標識されていないグリシンの検量線である。 比較例１の安定同位体で標識されていないリジンの検量線である。

次に、本発明を実施するための形態を図面と共に説明する。

本実施形態における分析方法は、皮膚に含まれる成分を定量分析する方法である。

皮膚に含まれる成分としては、特に限定されないが、アミノ酸、尿素、尿酸、ピロリドンカルボン酸、ウロカニン酸、乳酸、クレアチン、糖、有機酸、グリセリン、脂質等が挙げられる。

本実施形態における分析方法は、皮膚から採取された試料に所定量の内部標準物質を供給する工程と、大気圧イオン化法を用いて、内部標準物質が供給された試料から生成したイオンを質量分析する工程を有する。

内部標準物質は、安定同位体で標識されたイオンサプレッションを受けやすい化合物及び／又は安定同位体で標識されたイオンサプレッションを受けにくい化合物を含む。

なお、イオンサプレッションを受けやすい（又はイオンサプレッションを受けにくい）化合物とは、皮膚から採取された試料から大気圧イオン化法により生成したイオンを質量分析する際に、イオンサプレッションを受けやすい（又はイオンサプレッションを受けにくい）化合物を意味する。

また、本実施形態で内部標準物質として用いられるイオンサプレッションを受けやすい（又はイオンサプレッションを受けにくい）化合物は、イオンサプレッションを受ける程度が皮膚から採取された試料に含まれる分析対象成分と類似していることが好ましい。

本実施形態で内部標準物質として用いられるイオンサプレッションを受けやすい化合物及び／又はイオンサプレッションを受けにくい化合物は、皮膚に含まれる成分であることが好ましい。これにより、イオンサプレッションを受ける程度を皮膚から採取された試料に含まれる分析対象成分と同等にすることができる。

イオンサプレッションを受けやすい化合物及び／又はイオンサプレッションを受けにくい化合物に適用することが可能な皮膚に含まれる成分としては、特に限定されないが、アミノ酸、尿素、尿酸、ピロリドンカルボン酸、乳酸、クレアチン、有機酸、グリセリン、脂質等が挙げられる。

大気圧イオン化法としては、特に限定されないが、ＤＡＲＴ、ＤＥＳＩ、大気圧光イオン化法、大気圧ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ支援レーザー脱離イオン化法、大気圧個体分析プローブ法等が挙げられる。

皮膚から採取された試料としては、特に限定されないが、角層、汗、皮脂等が挙げられる。

次に、分析方法の具体例として、角層に含まれる複数のアミノ酸を定量分析する場合について説明する。

［第一の工程］
所定の間隔で切れ目が入れられている複数の粘着テープを用いて、皮膚から、複数層の角層を剥離する。

粘着テープとしては、テープストリッピング法に適用することが可能であれば、特に限定されないが、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（ＣｕＤｅｒｍ社製）、セロテープ（登録商標）（ニチバン社製）、ＰＰＳテープ（ニチバン社製）等が挙げられる。

図１に、所定の間隔で切れ目が入れられている粘着テープの一例を示す。なお、（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ上面図及び断面図である。

粘着テープ１０は、上面が円状であり、担体１０ａの表面に粘着剤層１０ｂが形成されており、所定の間隔で切れ目１１が３本入れられている。このため、角層に含まれるアミノ酸を、必要に応じて、条件を変更して、複数回分析することができる。

粘着テープ１０の上面の形状は、円状に限定されず、矩形状、楕円状等であってもよい。

粘着テープ１０に所定の間隔で切れ目１１を入れる方法としては、特に限定されないが、カッターを用いて切れ目を入れる方法等が挙げられる。

切れ目１１の間隔Ｇ_１は、通常、０．５〜５ｍｍであり、１〜３ｍｍであることが好ましい。

切れ目１１の数は、通常、２〜６個である。

ここで、使用前の粘着テープ１０は、粘着剤層１０ｂの表面に剥離材が保持されている。

なお、粘着テープ１０の代わりに、切れ目が入れられていない粘着テープを用いてもよい。この場合、角層を剥離した粘着テープを所定の幅で切断してもよいし、切断しなくてもよい。

また、粘着テープ１０を用いて、皮膚から角層を剥離する代わりに、アロンアルファ（登録商標）（東亞合成株式会社製）等の接着剤を皮膚に塗布して角層を剥離してもよい。

さらに、粘着テープを用いて、一層の角層を剥離してもよい。

［第二の工程］
剥離された角層中のタンパク質の含有量を測定する。

角層中のタンパク質の含有量の測定方法としては、特に限定されないが、近赤外領域での吸光度を測定する方法、ＢＣＡ比色法等が挙げられる。中でも、近赤外領域での吸光度を測定する方法が好ましい。

なお、第二の工程を省略して、角層中に含まれるアミノ酸を定量分析してもよい。

［第三の工程］
角層を剥離した粘着テープを切れ目の間隔に対応する幅で切断した後、切断された粘着テープの角層が固定されている側と反対側の面を、所定の間隔を隔てて柱状部材に固定する。

図２に、柱状部材の一例として、直角二等辺三角柱状の柱状部材２０を示す。なお、（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ斜視図及び断面図である。

柱状部材２０の角部Ｃを挟む面Ｐ_１及びＰ_２には、高さ方向Ｈに対して略平行に、それぞれ１枚の両面テープ２１が固定されている。このため、切断された粘着テープ１０'を固定することができる。

柱状部材２０を構成する材料としては、耐熱性を有していれば、特に限定されないが、ガラス、石英ガラス、セラミックス、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム、鉄、アクリル樹脂、ポリプロピレン、フッ素樹脂、塩化ビニル樹脂、ナイロン、ポリスチレン、ポリカーボネート、シリコーン樹脂等が挙げられる。

なお、使用前の柱状部材２０は、両面テープ２１の粘着剤層の表面に剥離材が保持されている。

柱状部材２０に固定されている、隣接する切断された粘着テープ１０'の間隔Ｇ_２は、通常、１〜５０ｍｍであり、５〜１０ｍｍであることが好ましい。

柱状部材２０の角部Ｃを挟む面Ｐ_１及びＰ_２には、間隔Ｇ_１及びＧ_２に応じて決定される、切断された粘着テープ１０'を固定する位置１〜Ｎが表示されている。このとき、Ｎは、通常、１〜９０の整数である。

なお、柱状部材２０の角部Ｃを挟む面Ｐ_１及びＰ_２には、２枚の両面テープ２１が固定されていなくてもよく、接着剤を用いて、切断された粘着テープ１０'を固定してもよい。

このとき、剥離された複数層の角層のうち、任意の層数の角層を単一の柱状部材２０に固定することができる。

なお、柱状部材２０の代わりに、板状部材を用いてもよい（特許文献１参照）。

また、第一の板状部材及び所定の間隔を隔てて、複数の貫通孔が形成されている第二の板状部材を有するデバイスを用いて、粘着テープの角層が固定されている側を貫通孔に対向するようにして、粘着テープを挟持してもよい（特許文献１参照）。

［第四の工程］
柱状部材２０に固定された、切断された粘着テープ１０'に所定量の内部標準物質を供給する。

内部標準物質は、安定同位体で標識されているグリシン及び安定同位体で標識されているリジンを含む。

安定同位体で標識されているグリシンとしては、角層に含まれる成分と分子量が異なれば、特に限定されないが、^１４Ｎが^１５Ｎにより置換されているグリシン等が挙げられる。

安定同位体で標識されているリジンとしては、角層に含まれる成分と分子量が異なれば、特に限定されないが、２個の^１４Ｎが^１５Ｎにより置換されているリジン等が挙げられる。

ここで、安定同位体で標識されているグリシンは、イオンサプレッションを受けやすいため、試料（角層）中の安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸に対する内部標準物質として用いる。具体的には、安定同位体で標識されているグリシン由来のピークの面積に対する安定同位体で標識されていないイオンサプレッションを受けやすいアミノ酸由来のピークの面積の比を用いて、角層に含まれるイオンサプレッションを受けやすいアミノ酸を定量分析する。その結果、検量線の直線性を向上させることができ、角層に含まれるイオンサプレッションを受けやすいアミノ酸の分布状態を精度良く定量することができる。

一方、安定同位体で標識されているリジンは、イオンサプレッションを受けにくいため、試料（角層）中のイオンサプレッションを受けにくいアミノ酸に対する内部標準物質として用いる。具体的には、安定同位体で標識されているリジン由来のピークの面積に対する安定同位体で標識されていないイオンサプレッションを受けにくいアミノ酸由来のピークの面積の比を用いて、角層に含まれるイオンサプレッションを受けにくいアミノ酸を定量分析する。その結果、検量線の直線性を向上させることができ、角層に含まれるイオンサプレッションを受けにくいアミノ酸の分布状態を精度良く定量することができる。

イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸としては、特に限定されないが、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、スレオニン、グルタミン、メチオニン、フェニルアラニン等が挙げられる。

イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸としては、特に限定されないが、リジン、ヒスチジン、チロシン、セリン等が挙げられる。

角層に所定量の内部標準物質を供給する方法としては、特に限定されないが、内部標準物質を溶媒中に溶解させた溶液を角層に滴下する方法等が挙げられる。

溶媒としては、内部標準物質を溶解させることが可能であれば、特に限定されないが、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ヘキサン等が挙げられる。

なお、剥離された角層に所定量の内部標準物質を供給するタイミングは、剥離された角層中のタンパク質の含有量を測定した後であれば、柱状部材２０に固定する前であってもよい。

［第五の工程］
切断された粘着テープ１０'が固定されている柱状部材２０を移動させながら、角層から生成したイオンを質量分析する。

また、柱状部材２０の角部Ｃを挟む面Ｐ_１及びＰ_２には、質量校正用標準試料層がさらに形成されていてもよい。これにより、切断された粘着テープ１０'が固定されている柱状部材２０を用いて質量分析する際に、質量分析計を質量校正し、感度を補正することができる。

質量校正用標準試料としては、ＤＡＲＴイオン源を用いて、イオンを生成させることが可能であれば、特に限定されないが、質量校正の精度を考慮すると、マススペクトルのピークが等間隔で存在するポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０〜ＰＥＧ２０００）、炭素数が４〜３６の脂肪酸等が挙げられ、二種以上併用してもよい。

質量校正用標準試料層を形成する方法としては、特に限定されないが、質量校正用標準試料の溶液が基材に塗布されている粘着テープを柱状部材２０に固定する方法、質量校正用標準試料が添加されているインクが充填されているペンを用いて柱状部材２０に描画する方法、質量校正用標準試料が添加されているインクを柱状部材２０に塗布する方法等が挙げられる。

図３に、柱状部材２０を用いる質量分析方法の一例を示す。

まず、略水平面内において、図中、矢印方向に移動させることが可能なサンプルステージ１００に、複数個の切断された粘着テープ１０'が固定されている柱状部材２０を、柱状部材２０の高さ方向Ｈが矢印方向に対して略平行になるように載せる。このとき、柱状部材２０のサンプルステージ１００に対して、垂直な面がＤＡＲＴイオン源２００と対向するように、柱状部材２０を配置する。次に、サンプルステージ１００を、図中、矢印方向に移動させながら、ＤＡＲＴイオン源２００を用いて、準安定励起状態のヘリウムＨｅ（２^３Ｓ）を大気中の水に衝突させてペニングイオン化させて生成したプロトンを、略水平面内において、図中、矢印方向に対して、略垂直に、柱状部材２０の角部Ｃに照射して生成したイオンを、質量分析計３００に導入して質量分析する。

このとき、質量分析計３００のイオン導入管３１０は、抵抗発熱線３１１が巻き付けられているため、電源（不図示）を用いて抵抗発熱線３１１に電圧を印加することにより、イオン導入管３１０を加熱しながら、生成したイオンを質量分析することができる。これにより、生成したイオンのイオン導入管３１０への付着を抑制することができる。その結果、角層に含まれるアミノ酸の定量性を向上させることができる。このとき、イオン導入管３１０内は、コンプレッサー（不図示）により減圧されている。

なお、生成したイオンは、イオン導入管３１０のイオンが導入される側に付着しやすいため、通常、イオン導入管３１０のイオンが導入される側に抵抗発熱線３１１が巻き付けられる。

イオン導入管３１０を加熱するときのイオン導入管３１０の内壁の温度は、通常、５０〜５００℃であり、１００〜３００℃であることが好ましい。

なお、イオン導入管３１０を加熱する方法としては、抵抗発熱線３１１を巻き付けて加熱する方法に限定されず、セラミックファイバーヒーターを用いて加熱する方法、マイクロ波を照射して加熱する方法、熱風器を用いて加熱する方法等が挙げられる。

また、イオン導入管３１０を外して、イオン導入口を直接加熱してもよい。

さらに、イオン導入管３１０に生成したイオンが付着しにくい場合は、イオン導入管３１０を加熱しなくてもよい。

イオン導入管３１０を構成する材料としては、耐熱性を有していれば、特に限定されないが、セラミックス、ガラス、テフロン（登録商標）、ステンレス鋼、ニオブ鋼、タンタル鋼等が挙げられる。

イオン導入管３１０の内面に、フッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトン、シリコーン樹脂等がコーティングされていてもよい。

抵抗発熱線３１１を構成する材料としては、特に限定されないが、鉄−クロム−アルミ系合金、ニッケル−クロム系合金等の金属発熱体；白金、モリブデン、タンタル、タングステン等の高融点金属発熱体；炭化ケイ素、モリブデン−シリサイト、カーボン等の非金属発熱体等が挙げられる。

例えば、抵抗発熱線３１１として、直径が０．２６ｍｍのニクロム線を用いる場合は、１〜６Ａの電流を流す。

なお、柱状部材２０のサンプルステージ１００に対して、垂直な面が質量分析計３００と対向するように、柱状部材２０を配置してもよい。

また、柱状部材２０の代わりに、内部の切断された粘着テープ１０'が固定されている位置に対応する位置に、抵抗発熱線が設置されている以外は、柱状部材２０と同一の柱状部材を用いてもよい。これにより、質量分析する際に、電源（不図示）を用いて抵抗発熱線に電圧を印加することにより、所定の温度に加熱することができる。このとき、ペニングイオン化させて生成したプロトンが切断された粘着テープ１０'に照射されるタイミングで、抵抗発熱線に電圧を印加すると、生成したイオンを効率的に脱離させることができる。

抵抗発熱線を構成する材料としては、特に限定されないが、鉄−クロム−アルミ系合金、ニッケル−クロム系合金等の金属発熱体；白金、モリブデン、タンタル、タングステン等の高融点金属発熱体；炭化ケイ素、モリブデン−シリサイト、カーボン等の非金属発熱体等が挙げられる。

さらに、柱状部材２０の代わりに、中空の直角二等辺三角柱状の柱状部材を用いてもよいし、折り曲げることにより角部が形成されている板を用いてもよい。

また、柱状部材２０の代わりに、柱状部材２０の角部Ｃが丸みを帯びている柱状部材、柱状部材２０から角部Ｃを含む直角二等辺三角柱を除去した台形柱状の柱状部材、柱状部材２０から角部Ｃを含む三角柱を除去した四角柱状の柱状部材等を用いてもよい（特許文献１参照）。

なお、準安定励起状態のヘリウムＨｅ（２^３Ｓ）の代わりに、準安定励起状態のネオン、準安定励起状態のアルゴン、準安定励起状態の窒素等を用いてもよい。

また、ＤＡＲＴイオン源２００の代わりに、ＤＥＳＩイオン源を用いて、イオン化した溶媒を試料に付着させてイオンを脱離させてもよい。

イオン化させる溶媒としては、特に限定されないが、メタノール、メタノール水溶液、アセトニトリル、アセトニトリル水溶液等が挙げられる。

イオン化させる溶媒は、酸性物質や塩基性物質を含んでいてもよい。

［検量線の作成］
ＤＡＲＴ又はＤＥＳＩを用いて、所定量のアミノ酸及び内部標準物質から生成したイオンを質量分析することにより、検量線を作成することができる。

例えば、角層を剥離せず、柱状部材に固定された、切断された粘着テープに所定量のアミノ酸及び内部標準物質を付着させる以外は、上記と同様にして、生成したイオンを質量分析することにより、検量線を作成することができる。

切断された粘着テープにアミノ酸及び内部標準物質を付着させる方法としては、特に限定されないが、アミノ酸及び内部標準物質を溶媒中に溶解させた溶液を粘着テープに滴下する方法等が挙げられる。

溶媒としては、アミノ酸及び内部標準物質を溶解させることが可能であれば、特に限定されないが、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ヘキサン等が挙げられる。

なお、検量線を作成する手順は、内部標準物質が供給された角層から生成したイオンを質量分析する手順に対応するように、実施すればよい。

［粘着テープ１０の作製］
３枚の刃が２ｍｍ間隔で固定されているカッターを用いて、上面が直径が２２ｍｍの円状の粘着テープＤ−Ｓｑｕａｍｅ ｄｉｓｃ（ＣｕＤｅｒｍ社製）に切れ目１１を３本入れ、粘着テープ１０を得た。

［柱状部材２０の作製］
直角を挟む二辺の長さが１０ｍｍ、高さが１６０ｍｍの直角二等辺三角柱状の石英製のプリズム（藤原製作所社製）の高さ方向Ｈに対して平行に、３ｍｍ×６０ｍｍの両面テープ２１を、角部Ｃを挟む間隔が１４ｍｍとなるように２枚固定し、柱状部材２０（Ｎ＝１５）を得た。

［実施例１］
（検量線作成用試料の水溶液の調製）
安定同位体で標識されていない、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、グルタミン、リジン、チロシン、ヒスチジン、セリン（以上、和光純薬社製）と、安定同位体で標識されているグリシン、リジン（以上、純正科学社製）を、それぞれ所定の濃度になるように純水中に溶解させ、５種類の検量線作成用試料の水溶液を得た。なお、各検量線作成用試料の水溶液における安定同位体で標識されていない、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、グルタミン、リジン、チロシン、ヒスチジン、セリンの濃度は、それぞれ１μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬである。また、各検量線作成用試料の水溶液における安定同位体で標識されているグリシン、リジンの濃度は、それぞれ１０μｇ／ｍＬである。

（内部標準物質の水溶液の調製）
安定同位体で標識されているグリシン（^１４Ｎが^１５Ｎにより置換されているグリシン）（純正科学社製）と安定同位体で標識されているリジン（２個の^１４Ｎが^１５Ｎにより置換されているリジン）（純正科学社製）を、濃度がそれぞれ１０μｇ／ｍＬになるように純水中に溶解させ、内部標準物質の水溶液を得た。

（検量線の作成）
３枚の刃が２ｍｍ間隔で固定されているカッターを用いて、上面が直径が２２ｍｍの円状の粘着テープＤ−Ｓｑｕａｍｅ ｄｉｓｃ（ＣｕＤｅｒｍ社製）を、粘着テープ１０に対応するように、幅が２ｍｍの短冊状に切断した。

次に、切断された粘着テープ１５枚を基材側の面が両面テープ２１に接着するように、１０ｍｍピッチで柱状部材２０に固定した。

さらに、シリンジを用いて、５種類の検量線作成用試料の水溶液を、それぞれ切断された粘着テープ３枚ずつに１μＬずつ滴下した後、３０分間乾燥させた。

次に、図３の質量分析方法に対応するように、柱状部材２０に固定された、切断された粘着テープから生成したイオンを順次質量分析した。具体的には、まず、柱状部材２０を、高さ方向Ｈが矢印方向に対して略平行になるようにサンプルステージ１００に載せた。このとき、柱状部材２０のサンプルステージ１００に対して、垂直な面がＤＡＲＴイオン源２００と対向するように、柱状部材２０を配置した。次に、サンプルステージ１００を、略水平面内において、図中、矢印方向に０．２ｍｍ／ｓで移動させながら、ＤＡＲＴイオン源２００を用いて、準安定励起状態のヘリウムＨｅ（２^３Ｓ）を大気中の水に衝突させてペニングイオン化させて生成したプロトンを、略水平面内において、図中、矢印方向に対して、略垂直に、柱状部材２０の角部Ｃに照射して生成したイオンを、質量分析計３００に導入して質量分析した。このとき、抵抗発熱線３１１に４Ａの電流を流すことにより、イオン導入管３１０を加熱したため、イオン導入管３１０の内壁の温度は１１０℃であった。

なお、ＤＡＲＴイオン源２００として、ＤＡＲＴ ＳＶＰ（Ｉｏｎｓｅｎｓｅ社製）を用い、ガスヒーターの設定温度を４５０℃とした。また、質量分析計３００として、ＭｉｃｒＯＴＯＦＱＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）を用い、測定モードをｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅとした。さらに、イオン導入管３１０として、外径が６．２ｍｍ、内径が４．７ｍｍ、長さが９４ｍｍのセラミックス製のチューブを用い、イオンが導入される側から３５ｍｍの領域に抵抗発熱線３１１を巻き付けた。このとき、抵抗発熱線３１１として、直径が０．２６ｍｍのニクロム線を用いた。

図４に、検量線作成用試料の抽出クロマトグラムを示す。なお、＊は、安定同位体で標識されていることを意味する。

図４には、各アミノ酸毎に、１５個のピークが示されている。これらのピークは、柱状部材２０に固定された粘着テープ１５枚からそれぞれ測定された各アミノ酸の信号強度に対応する。安定同位体で標識されていない試料の各アミノ酸（グリシン、アラニン、プロリン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、グルタミン、リジン、チロシン、ヒスチジン、セリン）については、図中左側から、濃度が低い順に３つずつ同じ濃度の試料のピークが表示されている。また、安定同位体で標識された試料の各アミノ酸（グリシン、リジン）については、全て１０μｇ／ｍＬの試料のピークが表示されている。

図５に、安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸の検量線を示す。

ここでは、安定同位体で標識されているグリシン由来のピーク（モノアイソトピック質量＝７６．０３）の面積Ｑｓに対する安定同位体で標識されていないイオンサプレッションを受けやすい各アミノ酸由来のピーク（例えば、グリシンの場合はモノアイソトピック質量＝７５．０３）の面積Ｑｔの比（Ｑｔ／Ｑｓ）を用いて、角層に含まれるイオンサプレッションを受けやすいアミノ酸を定量分析した。つまり、図５の抽出クロマトグラムのピーク面積比は、安定同位体で標識されているグリシン由来のピークの面積に対する、安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸のピークの面積の比を意味する。具体的には、図４に示した各粘着テープに対応するピーク毎にＱｔ／Ｑｓを算出し、同じ濃度の試料３つ毎にＱｔ／Ｑｓの平均値を算出して検量線の作成に用いた。また、イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸の含有量は、切断された粘着テープ１枚当たりの含有量を意味する。

図５から、安定同位体で標識されているグリシン由来のピークの面積を内部標準物質として用いることにより、安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸の検量線の直線性を良好にできることがわかる。なお、ここで、安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸として、グリシンだけでなく、アラニン、プロリン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、グルタミンについても、安定同位体で標識されているグリシン由来のピークの面積を内部標準物質として用いることにより、検量線の直線性を良好にすることができる。

図６に、安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸の検量線を示す。

ここでは、安定同位体で標識されているリジン由来のピーク（モノアイソトピック質量＝１４６．１０）の面積Ｑｓに対する安定同位体で標識されていないイオンサプレッションを受けにくい各アミノ酸由来のピーク（例えば、リジンの場合はモノアイソトピック質量＝１４８．１０）の面積Ｑｔの比（Ｑｔ／Ｑｓ）を用いて、角層に含まれるイオンサプレッションを受けにくいアミノ酸を定量分析した。つまり、図６の抽出クロマトグラムのピーク面積比は、安定同位体で標識されているリジン由来のピークの面積に対する、安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸のピークの面積の比を意味する。具体的には、図４に示した各粘着テープに対応するピーク毎にＱｔ／Ｑｓを算出し、同じ濃度の試料３つ毎にＱｔ／Ｑｓの平均値を算出して検量線の作成に用いた。また、イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸の含有量は、切断された粘着テープ１枚当たりの含有量を意味する。

図６から、安定同位体で標識されているリジン由来のピークの面積を内部標準物質として用いることにより、安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸の検量線の直線性を良好にできることがわかる。なお、ここで、安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸として、リジンだけでなく、チロシン、ヒスチジン、セリンについても、安定同位体で標識されているリジン由来のピークの面積を内部標準物質として用いることにより、検量線の直線性を良好にすることができる。

次に、図５及び図６に示した検量線を用いて、角層中のアミノ酸の含有量を検出する例を説明する。

（第一の工程）
前腕屈側部を洗浄した後、乾燥させた。次に、粘着テープ１０を用いて、前腕屈側部から１０層の角層を剥離した。

（第二の工程）
Ｄ−ｓｑｕａｍｅ Ｓｃａｎ ８５０Ａ（ＣｕＤｅｒｍ社）を用いて、１〜１０層目の角層を剥離した粘着テープ１０の単位面積当たりのタンパク質の含有量［μｇ／ｃｍ^２］を測定した。次に、切断された粘着テープ１０'の面積［ｃｍ^２］を用いて、１〜１０層目の角層の切断された粘着テープ１０'の１枚当たりのタンパク質の含有量［μｇ］を算出した。

（第三の工程）
１０層の角層を剥離した粘着テープ１０の切れ目１１の根元部分を切断し、幅が２ｍｍの矩形状の切断された粘着テープ１０'を得た。次に、１〜１０層目の角層を剥離した、切断された粘着テープ１０'を、担体１０ａ側の面が両面テープ２１に接着するように、柱状部材２０に１０ｍｍピッチで固定した。

（第四の工程）
柱状部材２０に固定された、切断された粘着テープ１０'に、内部標準物質の水溶液を１μＬずつ添加した後、３０分間乾燥させた。

（第五の工程）
検量線の作成と同様にして、柱状部材２０に固定された、切断された粘着テープ１０'から生成したイオンを順次質量分析した。次に、１〜１０層目の角層の抽出クロマトグラムのピーク面積比を算出した後、検量線を用いて、１〜１０層目の角層の切断された粘着テープ１０'の１枚当たりの各アミノ酸の含有量を求めた。ここで、角層の抽出クロマトグラムのピーク面積比は、各粘着テープ１０'毎に算出された、安定同位体で標識されているグリシン由来のピークの面積に対する、安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸のピークの面積の比及び安定同位体で標識されているリジン由来のピークの面積に対する、安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸のピークの面積の比である。さらに、１〜１０層目の角層の切断された粘着テープ１０'の１枚当たりのタンパク質の含有量を用いて、１〜１０層目の角層中のタンパク質の含有量に対するアミノ酸の含有量の比を算出した。

図７に、角層中のタンパク質の含有量の累積値と、角層中のタンパク質の含有量に対するアミノ酸の含有量の比の関係を示す。

なお、角層中のタンパク質の含有量の累積値は、１〜ｎ（ただし、ｎは、１〜１０の整数である。）層目の角層中のタンパク質の含有量の合計であり、大きくなる程、角層の深さが大きくなることを意味する。

図７から、表面付近の角層中のアミノ酸の含有量は、内部の角層中のアミノ酸の含有量よりも小さいことがわかる。

［比較例１］
（検量線作成用試料の水溶液の調製）
安定同位体で標識されていない、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、グルタミン、リジン、チロシン、ヒスチジン、セリン（以上、和光純薬社製）を、それぞれ所定の濃度になるように純水中に溶解させ、５種類の検量線作成用試料の水溶液を得た。なお、各検量線作成用試料の水溶液における安定同位体で標識されていない、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、グルタミン、リジン、チロシン、ヒスチジン、セリンの濃度は、それぞれ１μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬである。

（検量線の作成）
得られた検量線作成用試料の水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして、質量分析した。

図８及び図９に、安定同位体で標識されていない、グリシン及びリジンの検量線を示す。

なお、グリシン及びリジンの含有量は、切断された粘着テープ１枚当たりの含有量を意味する。

図８及び図９から、安定同位体で標識されていない、グリシン及びリジンの検量線は、図５及び図６で示したように、安定同位体で標識されているグリシン及びリジン由来のピークの面積を内部標準物質として用いて得られた安定同位体で標識されていない、グリシン及びリジンの検量線と対比すると、直線性が低いことがわかる。

以上、本発明の好ましい実施形態及び実施例について詳述したが、本発明は上記した特定の実施形態及び実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能なものである。

１０ 粘着テープ
１０ａ 担体
１０ｂ 粘着剤層
１１ 切れ目
１０' 切断された粘着テープ
２０ 柱状部材
２１ 両面テープ
１００ サンプルステージ
２００ ＤＡＲＴイオン源
３００ 質量分析計
３１０ イオン導入管
３１１ 抵抗発熱線

本発明の一態様は、皮膚の角層に含まれるアミノ酸を定量分析する分析方法であって、皮膚から採取された試料に、安定同位体で標識されたグリシン及び／又は安定同位体で標識されたリジンを含む所定量の内部標準物質を供給する工程と、
大気圧イオン化法を用いて、該内部標準物質が供給された試料から生成したイオンを質量分析する工程と、を有し、前記安定同位体で標識されたグリシン由来のピークの面積に対する、安定同位体で標識されていない、イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸由来のピークの面積の比、及び／又は前記安定同位体で標識されたリジン由来のピークの面積に対する、安定同位体で標識されていない、イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸由来のピークの面積の比を用いて、前記角層に含まれるアミノ酸を定量分析し、前記イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸が、アラニン、プロリン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、及びグルタミンから選択される少なくとも１つであり、前記イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸が、チロシン、ヒスチジン、及びセリンから選択される少なくとも１つである。

Claims (7)

1. 皮膚に含まれる成分を定量分析する方法であって、
   皮膚から採取された試料に、安定同位体で標識されたイオンサプレッションを受けやすい化合物及び／又は安定同位体で標識されたイオンサプレッションを受けにくい化合物を含む所定量の内部標準物質を供給する工程と、
   大気圧イオン化法を用いて、該内部標準物質が供給された試料から生成したイオンを質量分析する工程と、
   を有することを特徴とする分析方法。
2. 前記皮膚に含まれる成分は、角層に含まれるアミノ酸であり、
   前記イオンサプレッションを受けやすい化合物は、グリシンであり、
   前記イオンサプレッションを受けにくい化合物は、リジンであることを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
3. 前記安定同位体で標識されたグリシン由来のピークの面積に対する、安定同位体で標識されていない、イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸由来のピークの面積の比、及び／又は前記安定同位体で標識されたリジン由来のピークの面積に対する、安定同位体で標識されていない、イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸由来のピークの面積の比を用いて、前記角層に含まれるアミノ酸を定量分析することを特徴とする請求項２に記載の分析方法。
4. 表面に粘着剤層が形成されている担体を用いて、前記皮膚から角層を剥離する工程と、
   該角層を剥離した担体を所定の幅で切断する工程と、
   該切断された担体の前記角層が固定されている側と反対側の面を、所定の間隔を隔てて柱状部材に固定する工程をさらに有し、
   該切断された担体が固定されている柱状部材を移動させながら、前記角層から生成したイオンを質量分析することを特徴とする請求項２に記載の分析方法。
5. 前記角層中のタンパク質の含有量を測定する工程をさらに有し、
   該タンパク質の含有量が測定された角層に前記所定量の内部標準物質を供給することを特徴とする請求項２に記載の分析方法。
6. 前記大気圧イオン化法は、ＤＡＲＴ又はＤＥＳＩであることを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
7. 皮膚に含まれる成分の定量分析に用いられる内部標準物質であって、
   安定同位体で標識されたイオンサプレッションを受けやすい化合物及び／又は安定同位体で標識されたイオンサプレッションを受けにくい化合物を含むことを特徴とする内部標準物質。

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