JP6101385B2 - 分析方法 - Google Patents
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Description
大気圧イオン化法を用いて、該内部標準物質が供給された試料から生成したイオンを質量分析する工程と、を有し、前記安定同位体で標識されたグリシン由来のピークの面積に対する、安定同位体で標識されていない、イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸由来のピークの面積の比、及び/又は前記安定同位体で標識されたリジン由来のピークの面積に対する、安定同位体で標識されていない、イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸由来のピークの面積の比を用いて、前記角層に含まれるアミノ酸を定量分析し、前記イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸が、アラニン、プロリン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、及びグルタミンから選択される少なくとも1つであり、前記イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸が、チロシン、ヒスチジン、及びセリンから選択される少なくとも1つである。
所定の間隔で切れ目が入れられている複数の粘着テープを用いて、皮膚から、複数層の角層を剥離する。
剥離された角層中のタンパク質の含有量を測定する。
角層を剥離した粘着テープを切れ目の間隔に対応する幅で切断した後、切断された粘着テープの角層が固定されている側と反対側の面を、所定の間隔を隔てて柱状部材に固定する。
柱状部材20に固定された、切断された粘着テープ10'に所定量の内部標準物質を供給する。
切断された粘着テープ10'が固定されている柱状部材20を移動させながら、角層から生成したイオンを質量分析する。
DART又はDESIを用いて、所定量のアミノ酸及び内部標準物質から生成したイオンを質量分析することにより、検量線を作成することができる。
3枚の刃が2mm間隔で固定されているカッターを用いて、上面が直径が22mmの円状の粘着テープD−Squame disc(CuDerm社製)に切れ目11を3本入れ、粘着テープ10を得た。
直角を挟む二辺の長さが10mm、高さが160mmの直角二等辺三角柱状の石英製のプリズム(藤原製作所社製)の高さ方向Hに対して平行に、3mm×60mmの両面テープ21を、角部Cを挟む間隔が14mmとなるように2枚固定し、柱状部材20(N=15)を得た。
(検量線作成用試料の水溶液の調製)
安定同位体で標識されていない、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、グルタミン、リジン、チロシン、ヒスチジン、セリン(以上、和光純薬社製)と、安定同位体で標識されているグリシン、リジン(以上、純正科学社製)を、それぞれ所定の濃度になるように純水中に溶解させ、5種類の検量線作成用試料の水溶液を得た。なお、各検量線作成用試料の水溶液における安定同位体で標識されていない、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、グルタミン、リジン、チロシン、ヒスチジン、セリンの濃度は、それぞれ1μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mLである。また、各検量線作成用試料の水溶液における安定同位体で標識されているグリシン、リジンの濃度は、それぞれ10μg/mLである。
安定同位体で標識されているグリシン(14Nが15Nにより置換されているグリシン)(純正科学社製)と安定同位体で標識されているリジン(2個の14Nが15Nにより置換されているリジン)(純正科学社製)を、濃度がそれぞれ10μg/mLになるように純水中に溶解させ、内部標準物質の水溶液を得た。
3枚の刃が2mm間隔で固定されているカッターを用いて、上面が直径が22mmの円状の粘着テープD−Squame disc(CuDerm社製)を、粘着テープ10に対応するように、幅が2mmの短冊状に切断した。
前腕屈側部を洗浄した後、乾燥させた。次に、粘着テープ10を用いて、前腕屈側部から10層の角層を剥離した。
D−squame Scan 850A(CuDerm社)を用いて、1〜10層目の角層を剥離した粘着テープ10の単位面積当たりのタンパク質の含有量[μg/cm2]を測定した。次に、切断された粘着テープ10'の面積[cm2]を用いて、1〜10層目の角層の切断された粘着テープ10'の1枚当たりのタンパク質の含有量[μg]を算出した。
10層の角層を剥離した粘着テープ10の切れ目11の根元部分を切断し、幅が2mmの矩形状の切断された粘着テープ10'を得た。次に、1〜10層目の角層を剥離した、切断された粘着テープ10'を、担体10a側の面が両面テープ21に接着するように、柱状部材20に10mmピッチで固定した。
柱状部材20に固定された、切断された粘着テープ10'に、内部標準物質の水溶液を1μLずつ添加した後、30分間乾燥させた。
検量線の作成と同様にして、柱状部材20に固定された、切断された粘着テープ10'から生成したイオンを順次質量分析した。次に、1〜10層目の角層の抽出クロマトグラムのピーク面積比を算出した後、検量線を用いて、1〜10層目の角層の切断された粘着テープ10'の1枚当たりの各アミノ酸の含有量を求めた。ここで、角層の抽出クロマトグラムのピーク面積比は、各粘着テープ10'毎に算出された、安定同位体で標識されているグリシン由来のピークの面積に対する、安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸のピークの面積の比及び安定同位体で標識されているリジン由来のピークの面積に対する、安定同位体で標識されておらず、イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸のピークの面積の比である。さらに、1〜10層目の角層の切断された粘着テープ10'の1枚当たりのタンパク質の含有量を用いて、1〜10層目の角層中のタンパク質の含有量に対するアミノ酸の含有量の比を算出した。
(検量線作成用試料の水溶液の調製)
安定同位体で標識されていない、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、グルタミン、リジン、チロシン、ヒスチジン、セリン(以上、和光純薬社製)を、それぞれ所定の濃度になるように純水中に溶解させ、5種類の検量線作成用試料の水溶液を得た。なお、各検量線作成用試料の水溶液における安定同位体で標識されていない、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、グルタミン、リジン、チロシン、ヒスチジン、セリンの濃度は、それぞれ1μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mLである。
得られた検量線作成用試料の水溶液を用いた以外は、実施例1と同様にして、質量分析した。
10a 担体
10b 粘着剤層
11 切れ目
10' 切断された粘着テープ
20 柱状部材
21 両面テープ
100 サンプルステージ
200 DARTイオン源
300 質量分析計
310 イオン導入管
311 抵抗発熱線
Claims (4)
- 皮膚の角層に含まれるアミノ酸を定量分析する分析方法であって、
皮膚から採取された試料に、安定同位体で標識されたグリシン及び/又は安定同位体で標識されたリジンを含む所定量の内部標準物質を供給する工程と、
大気圧イオン化法を用いて、該内部標準物質が供給された試料から生成したイオンを質量分析する工程と、
を有し、
前記安定同位体で標識されたグリシン由来のピークの面積に対する、安定同位体で標識されていない、イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸由来のピークの面積の比、及び/又は前記安定同位体で標識されたリジン由来のピークの面積に対する、安定同位体で標識されていない、イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸由来のピークの面積の比を用いて、前記角層に含まれるアミノ酸を定量分析し、
前記イオンサプレッションを受けやすいアミノ酸が、アラニン、プロリン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、及びグルタミンから選択される少なくとも1つであり、前記イオンサプレッションを受けにくいアミノ酸が、チロシン、ヒスチジン、及びセリンから選択される少なくとも1つであることを特徴とする分析方法。 - 表面に粘着剤層が形成されている担体を用いて、前記皮膚から角層を剥離する工程と、
該角層を剥離した担体を所定の幅で切断する工程と、
該切断された担体の前記角層が固定されている側と反対側の面を、所定の間隔を隔てて柱状部材に固定する工程をさらに有し、
該切断された担体が固定されている柱状部材を移動させながら、前記角層から生成したイオンを質量分析することを特徴とする請求項1に記載の分析方法。 - 前記角層中のタンパク質の含有量を測定する工程をさらに有し、
該タンパク質の含有量が測定された角層に前記所定量の内部標準物質を供給することを特徴とする請求項1に記載の分析方法。 - 前記大気圧イオン化法は、DART又はDESIであることを特徴とする請求項1に記載の分析方法。
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