JP2014134812A - 紫外放射を用いた生細胞の３次元画像化 - Google Patents

Abstract

【課題】生体への影響を抑えた生細胞の３次元画像化方法を提供する。
【解決手段】光断層撮影システム（１１）内の生体（１）の３次元画像化方法であって、顕微鏡対物レンズ（１８）に対して生体（１）を動かして、変動する画角を提示することと、１５０ｎｍと３９０ｎｍの間の波長に制限されたスペクトル・バンド幅を有する放射を前記生体（１）に照射することと、前記生体（１）および前記顕微鏡対物レンズ（１８）を透過した放射を紫外カメラ（４８）で感知することと、前記感知された放射から前記生体（１）の複数の疑似投影画像を形成することと、前記複数の疑似投影画像を再構成して３次元画像を形成することとを含む、方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、一般に、光断層撮影法による画像化システムに関し、より詳細には、疑似投影式の画像化および３次元画像への再構成のために生体細胞などの小さな物体に紫外放射が照射される３次元顕微鏡法に対する光投影式の断層撮影法に関する。

光断層撮影法を使用する生体細胞の画像化の進歩は、たとえば、２００３年２月１８日出願の「Ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｏｂｊｅｃｔｓ ｉｎ ａ ｆｌｏｗ ｓｔｒｅａｍ ｕｓｉｎｇ ｏｐｔｉｃａｌ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ」という名称の米国特許第６，５２２，７７５号に開示のように、Ｎｅｌｓｏｎによって発展してきた。同特許の開示全体を、参照により組み込む。この分野のさらなる発展は、２００４年４月２２日出願の「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｏｆ ｓｈａｄｏｗｇｒａｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ」という名称の米国特許出願公開第２００４−００７６３１９−Ａ１号として公開された、２００３年１１月１８日出願のＦａｕｖｅｒらの米国特許出願第１０／７１６，７４４号（Ｆａｕｖｅｒ‘７４４）、および２００６年９月１８日出願の「Ｆｏｃａｌ ｐｌａｎｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｆｏｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ」という名称のＦａｕｖｅｒらの米国特許出願第１１／５３２，６４８号（Ｆａｕｖｅｒ‘６４８）に教示されている。これらの出願の開示全体もまた、参照によって組み込む。

光断層撮影システム内の処理は、試験片の準備から始まる。通常、患者から採取した試験片は、病院または診療所から受け取って、診断用でない要素を除去するように処理され、固定され、次いで染色される。次いで、染色された試験片は、光ゲルと混合されて微小毛細管内に挿入され、光断層撮影システムを使用して、試験片内の細胞などの物体の画像が作製される。その結果得られる画像は、１組の被写界深度を延ばした異なる観点からの画像を含み、「疑似投影画像」と呼ばれる。これらの疑似投影画像の組は、裏面投影およびフィルタリング技法を使用して当該細胞の３次元再構成をもたらすことによって再構成することができる。３つすべての次元で等角またはほぼ等しい分解能を有することができることは、特に定量的な画像分析の場合、３次元断層撮影法による細胞画像化の利点である。

このとき３次元再構成は、当該構造、分子、または分子プローブの定量化および位置の決定を可能にするため、分析に利用可能なままである。生体細胞などの物体は、少なくとも１つの染料またはタグ付き分子プローブで標識を付けることができ、またこのバイオマーカの測定された量および位置は、それだけに限定されるものではないが、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、胃癌、および膵癌などの様々な癌を含む細胞の病状に関する重要な情報をもたらすことができる。

本開示は、光投影式の断層撮影法を発展させて生細胞の画像化に用いることを可能にし、また細胞分析、薬品開発、個別化医療、および関連分野を進歩させることが予期される。これまで、生細胞の顕微鏡法は従来、位相コントラスト、ＤＩＣ、および偏光コントラスト顕微鏡法などの非標識２次元画像化技法によって行われてきた。

波長２５０ｎｍから２９０ｎｍの遠紫外（ＤＵＶ）を使用する固有吸収度および蛍光の画像化は技術的に困難であり、照射された細胞に光毒性をもたらす。より最近では、市販の顕微鏡（共焦点、デコンボリューション、および多光子励起の変種）は、３次元画像を生成するための複数の平面スライスを蓄積するのに蛍光に依拠するため、通常３次元生細胞画像化のための蛍光信号を放出する生体染色が使用されてきた。しかし、これらの場合、たくさんの２次元画像から得られる３次元画像の軸方向分解能は、各スライス内の横方向分解能の約４分の１であり、それによって定量的な分析を不正確にする。３つすべての次元で等角またはほぼ等しい分解能を有することができることは、特に定量的な画像分析の場合、３次元断層撮影法による細胞画像化の著しい利点である。

生細胞に対してＤＵＶ照射を使用する１つの利点は、天然ＤＮＡおよび蛋白質が、非正規状態である細胞の細胞膜および時には核膜に浸透しなければならないいかなる光化学標識も使用しないで、それぞれ２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの光を吸収することである。さらに、標識または染料は、標的蛋白質またはヌクレオチド（ＤＮＡ）の測定へ向けた中間ステップにすぎないが、この測定に大幅な変動性を加える。そのような外生種を排除すると、蛋白質またはヌクレオチド（ＤＮＡ）の定量的な測定の精度を潜在的に改善し、ならびにサンプル準備のステップを排除することによって時間、労力、および複雑さを低減させるはずである。しかし残念ながら、強い信号を刺激するには高い線量の放射が必要とされるため、ＤＵＶ照射の使用は、過去に光毒性を実証してきた。

しかし最近、培養されたヒトおよびマウスの生細胞のＤＵＶ画像化が、ＤＵＶ発光ダイオード（ＬＥＤ）を使用して２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで実証された（たとえば、Ｚｅｓｋｉｎｄ，ＢＪら、「Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｓｓ ｍａｐｐｉｎｇ ｂｙ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｄｅｅｐ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４（７）：５６７〜５６９頁（２００７）参照）。

米国特許第６，５２２，７７５号 米国特許出願第１０／７１６，７４４号 米国特許出願公開第２００４−００７６３１９−Ａ１号 米国特許出願第１１／５３２，６４８号 米国特許第６，７４１，７３０号 米国特許出願公開第２００７−０２１５５２８−Ａ１号

Ｚｅｓｋｉｎｄ，ＢＪら、「Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｓｓ ｍａｐｐｉｎｇ ｂｙ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｄｅｅｐ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４（７）：５６７〜５６９頁（２００７） Ｃｕｒｒｙ，Ａ．、Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｌ．、およびＷａｘ，Ａ．（２００６）、「Ｅｐｉ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｄａｒｋ−ｆｉｅｌｄ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ １４（１４）：６５３５〜６５４２頁

本開示は、細胞、より詳細には生細胞のＤＵＶ３次元画像化分野の長年の必要に対する解決策を提供する、新しく、新規で、かつ驚くほど効果的な３次元画像化システムについて記載する。

光断層撮影システム内の細胞の３次元画像化方法が提供される。この方法は、顕微鏡対物レンズに対して生体を動かして、変動する画角を提示することを含む。生体には、１５０ｎｍと３９０ｎｍの間の波長に制限されたスペクトル・バンド幅を有する光放射が照射される。生体によって透過、散乱、または２次的に放出されて顕微鏡対物レンズによって取り込まれる放射は、カメラで感知されて、複数の異なる視野角からの画像を記録する。感知された放射からの生体の複数の疑似投影画像が形成され、複数の疑似投影図を再構成して細胞の３次元画像を形成する。

紫外放射を使用する光断層撮影システム内の細胞の３次元画像化システムの一例を示す概略図である。 ＵＶカメラおよび任意選択の適応光学を使用して紫外放射を用いる光断層撮影システム内の細胞の３次元画像化システムの代替例を示す概略図である。 光断層撮影システムで使用するための温度制御式の筐体の一実施形態を示す概略図である。 細胞を画像化するためにレースウェイ構成で使用されるマイクロ流体カートリッジの一例を示す概略側面図である。 細胞を画像化するためにレーストラック構成で使用されるマイクロ流体カートリッジの一例を示す概略上面図である。 同じ経路に沿って別々の画像化ステージを含む光断層撮影プロセスを示す概略図である。

図面では、同一の参照番号が類似の要素または構成要素を識別する。図面内の要素の寸法および相対位置は、必ずしも原寸に比例して示すわけではない。たとえば、様々な要素の形状および角度は、原寸に比例して示すものではなく、これらの要素のいくつかは、図面の明瞭性を改善するために適宜拡大および位置決めされる。さらに、図示の要素の特定の形状は、特定の要素の実際の形状に関する何らかの情報を伝えるものではなく、図面内の認識を簡単にするためだけに選択された。

以下の開示は、当該物体を画像化するいくつかの実施形態およびシステムについて説明する。本発明の例示的な実施形態による方法およびシステムのいくつかの特徴について述べ、図で説明する。本発明の他の例示的な実施形態による方法およびシステムは、図に示すものとは異なる追加の手順または特徴を含みうることが理解されるであろう。例示的な実施形態について、本明細書では生体細胞に関連して説明する。しかし、これらの例は本発明の原理についての説明を目的とすること、そして本発明はそのように限定されないことが理解されるであろう。

さらに、本発明のいくつかの例示的な実施形態による方法およびシステムは、これらの図に示す特徴のすべてを含むわけではない可能性がある。図全体にわたって、同じ参照番号が類似または同一の構成要素または手順を指す。

文脈上異なる解釈を要する場合を除き、以下に続く明細書および特許請求の範囲全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、「を含むがそれだけに限定されるものではない」と同様に排他的でなく包括的な意味で解釈されるべきである。

本明細書全体にわたって、「一例（ｏｎｅ ｅｘａｍｐｌｅ）」または「例示的な実施形態（ａｎ ｅｘａｍｐｌｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「一実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、またはこれらの用語の様々な組合せへの言及は、その実施形態に関連して記載の特定の特徴、構造、または特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたって様々な位置に「一実施形態で（ｉｎ ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「一実施形態で（ｉｎ ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」という語句が現れるが、必ずしもすべて、同じ実施形態を指すわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性を、１つまたは複数の実施形態で任意の適切な形で組み合わせることができる。

定義
全体として本明細書では、光顕微鏡プロセスの文脈で使用されるとき、以下の用語は以下の意味を有する。
「毛細管」は、その一般に受け入れられている意味を有し、内径が通常５００ミクロン以下である透過性の微小毛細管および等価物を含むものとする。
「被写界深度」は、指定の特徴に対して受け入れがたい画像ぼけが生じないように焦点面をその範囲内で移動できる光軸に沿った長さである。
「物体」は、個々の細胞、物品、もの、または他の実体を意味する。
「疑似投影図」は、光学系の固有の被写界深度より大きなサンプル体積を表す単一の画像を含む。疑似投影図の概念は、Ｆａｕｖｅｒ‘７４４に教示されている。
「試験片」は、個々の患者からの単一の試験または手順から得られる完全な生成物を意味する（たとえば、分析用に提出された唾液、生検、または鼻腔スワブ）。試験片は、１つまたは複数の物体から構成されることがある。試験片診断の結果は、症例診断の一部になる。
「サンプル」は、アリコットまたは試験片のすべてまたは一部を含む、分析の準備ができた完成した細胞標本を意味する。
生細胞の画像化に関して、本開示では、（１）光放射の波長を赤外線より高い周波数（近赤外波長以下、１０００ｎｍ未満）に制限する核内のクロマチン構造には、ミクロン以下の等角の分解能が必要とされること、（２）個々の細胞が画像化、または場合によっては分析され、それにより複数の観点での回折測定を可能にできること、そして（３）画像化後の細胞の採集は細胞の損傷を最小にして行うことが望ましいことといういくつかの仮定がなされる。

次に図１を参照すると、紫外放射を使用する光断層撮影システム１１内の細胞の３次元画像化システムを概略的に示す。毛細管、微小毛細管、または等価物などの管２２が、顕微鏡対物レンズ１８および結像レンズ素子５２を含む顕微鏡１６によって見えるように位置決めされる。管２２には、回転機構、たとえば回転モータ２０が取り付けられる。顕微鏡対物レンズには、軸方向の平行移動機構、たとえばモータ３４が結合される。生体１を中に保持する管２２の一部に照射するように、放射源２９が位置決めされる。放射源２９は、１５０ｎｍと３９０ｎｍの間の波長に制限されたスペクトル・バンド幅を有する放射を生成する。１つの有用な例では、放射源２９は、少なくとも２つの選択された波長を透過する複数の源（ｓｏｕｒｃｅ）３０、３１を含み、これらの波長は、第１の光検出器１０および第２の光検出器１４によって同時に検出される。任意選択のフィルタ１２Ａ、１２Ｂは、固有トリプトファン蛍光など、ＵＶに制限されたスペクトル・バンド幅より長い波長を有する蛍光を遮断し、かつ／または異なる紫外放射信号の離隔距離を増大させるように選択される。放射源は、コンピュータ制御型の光源と集光レンズのアセンブリ５６内に組み込むことができると有利である。コンピュータ制御型の光源と集光レンズのアセンブリ５６は、集光レンズ光学系２４、２６、光拡散器２８、および放射源２９をさらに含むことができる。

１つの例示的な実施形態では、管２２は、標準的な顕微鏡スライド２３Ａと標準的な顕微鏡カバースリップ２３Ｂなど、２つの光学的に平坦な表面間の観察領域内に配置される。管２２と顕微鏡スライド２３Ａおよびカバースリップ２３Ｂとの間の隙間は、光ゲル３２または無機および有機油などの同等の材料で充填される。光ゲル３２または同等の材料の屈折率はまた、管２２、ならびに顕微鏡スライドおよびカバースリップの屈折率に実質上整合する。管２２自体は、類似の光学特性の油で被覆することができると有利である。管２２の外径は、たとえば約２５０ミクロンとすることができる。図面を簡略化して見やすくするために、常に示すわけではないが、本明細書に記載の様々な実施形態では、屈折率整合材料を使用して光学系を整合させることが理解されるであろう。光断層撮影システム内で使用される毛細管に整合される典型的な屈折率ｎは、たとえば５９０ｎｍでは約１．４８であるが、ＵＶでは分散曲線が急角度で上方へ動く。溶融シリカの毛細管の推定される屈折率は２５０ｎｍで１．５１であり、ＵＶグレードの溶融シリカによるＤＵＶの透過率は約９０％である。

生体１は、細胞、生細胞、固定細胞、非固定細胞、凍結細胞、解凍細胞、乾燥細胞、クローン細胞、移動細胞、固定化細胞、カプセル化細胞、細胞核、細胞器官、細胞小器官、亜細胞成分、染色体、および同等の材料からなる群から選択することができると有利である。光断層撮影法による画像化システム１１は、生体からの固有蛍光を刺激する周波数を有する照射放射を使用することができると有利であり、光検出器および画像処理装置は、刺激された蛍光を測定するモジュールをさらに含む。生体は、水性環境２内に含まれる。水性環境２は、以下に記載の生理緩衝食塩水または他の溶液を含む。

ビームスプリッタ１５が、生体中を透過した放射を少なくとも２つの選択された波長に分割するように位置決めされる。ビームスプリッタは、偏光ビーム・スプリッタ、ウォラストン・プリズム、複屈折素子、半透鏡、５０／５０強度ビームスプリッタ、誘電体で光学的に被覆されたミラー、ペリクル膜、ダイクロイック・ビームスプリッタ、ミラー、プリズム、回折光学素子、格子、および等価物からなる群から選択することができると有利である。第１の光検出器１０は、生体１、顕微鏡対物レンズ１８、ビームスプリッタ１５、および第１の組の任意選択のフィルタ１２Ａを透過する放射を感知するように位置決めされる。同様に、第２の光検出器１４は、生体１、顕微鏡対物レンズ１８、ビームスプリッタ１５、および第２の組の任意選択のフィルタ１２Ｂを透過する放射を感知するように位置決めされる。一例では、第１の光検出器１０および第２の光検出器１４はそれぞれ特に、紫外光に反応する画素アレイ検出器を含むことができ、各画素アレイ検出器は、２つの選択された波長のうちの異なる１つを検出するように選択される。

コンピュータ４１は、第１の光検出器１０および第２の光検出器１４からデータを受け取るように結合された画像処理装置４０を含む。画像処理装置４０には再構成モジュール４２が結合され、再構成モジュールは、たとえばＦａｕｖｅｒ‘７４４で教示されるような再構成アルゴリズム技法を使用し、データを処理して細胞の３次元画像を形成する。画像処理装置４０は、処理された画像データを３次元画像再構成モジュール４２へ伝送する。３次元画像再構成モジュール４２は、操作者が見るために、光ディスプレイ４４に結合することができると有利である。操作者制御および情報の目的で、ユーザ・インターフェース４６を提供することができる。ユーザ・インターフェース４６は、コンピュータ４１に結合されたＧＵＩインターフェースなどとすることができる。

一例では、軸方向の平行移動機構３４は、圧電変換器または同等のデバイスを含む。圧電変換器を制御するようにリンクされた制御装置３５は、コンピュータ、コンピュータ・モジュールなどとすることができると有利であり、圧電変換器は、対物レンズ１８を軸方向に動かすように制御される。

１つの例示的なシステムでは、光断層撮影法による画像化システム１１は、フィルタおよび放射源を使用し、２４０ｎｍと３００ｎｍの間に制限された波長を使用して細胞を画像化するように構成される。第１の検出器１０によって検出される放射は、主に２６０ｎｍと２６５ｎｍの間の第１の範囲内の波長を有することができる。第２の検出器１４によって検出される放射は、主に２８０ｎｍと２８５ｎｍの間の第２の範囲内の波長を有することができる。第１の範囲は、ＤＮＡおよびＲＮＡによる自然放射吸収度を高めるように動作する。第２の範囲は、蛋白質による自然放射吸収度を高めるように動作する。第１および第２の波長範囲は、１対の放射源を使用して提供することができ、各源は、波長範囲から選択された２つのうちの１つを伝送する。検出器の１つは、ＤＮＡおよび蛋白質などの親水性表面付近で２７０ｎｍ前後の吸収度を検出するように調整することができる。

一実施形態では、放射は、信号を分離する時間を使用して時系列で測定することができる。放射源は、信号対雑音を増大させて信号を分離するために、時系列でパルス化して細胞のパルス励起をもたらすことができる。たとえば、２６０ｎｍの放射源を時間Ｔ_０にパルス化し、その後Ｔ_１に２８０ｎｍのパルスが続き、その後、後の時間増分Ｔ_ｎに１つまたは複数のレーザ・パルスが続く。上式でｎは、後の時点を示す任意の数である。

別法として、固有トリプトファン蛍光を測定して、アミノ酸など、蛋白質の２次測定、ならびにその確認および成分を得ることができる。時系列照射を使用しない場合、第３のビーム・スプリッタが必要とされるはずである。この代替設計では、ビームスプリッタ１５は、すべてのＤＵＶ光（２４０〜３００ｎｍ）をＤＵＶ光検出器１４へ分割するはずであり、一方蛍光光検出器１０によって、より低い周波数の蛍光信号が検出されるはずである（３００ｎｍ超）。ＤＵＶ光源３０、３１の動作は時系列であり、したがって時間Ｔ_０に、主にヌクレオチドによる放射吸収度（２６０〜２６５ｎｍ）を捕獲することができ、一方同じ検出器１４を使用して時間Ｔ_１に、主にアミノ酸による放射吸収度（２８０〜２８５ｎｍ）を捕獲することができる。この例では、蛍光検出器前のセットが標準的なロングパス蛍光放出フィルタであり、ＤＵＶ検出器前のセットがＤＵＶバンドパス・フィルタまたはショートパス蛍光遮断フィルタであるため、フィルタ１２Ａ、１２Ｂについての議論が保証される。

さらに別の例では、レーザ光が、対物レンズの光軸に対して斜めの角度で入射し、非散乱光を遮断して、より大きな散乱角度での散乱プロファイルの暗視野測定を可能にする。可視波長でのレーザ散乱を使用する一例は、２００４年５月２５日出願のＲａｈｎの「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｏｕｒｉｅｒ Ｄｏｍａｉｎ」という名称の米国特許第６，７４１，７３０号に見出すことができる。同特許を、参照により本明細書に組み込む。

さらに別の例では、光軸と平行なレーザ照射が使用される。対物レンズの後焦点面に、吸収材料の円板が配置される。吸収材の直径は、非散乱光および非常に小さな角度の散乱光を遮断するのに十分なほどしか大きくない。その結果得られる環状開口により、より大きな散乱角度での散乱プロファイルの暗視野測定が可能になる。

さらに別の例では、生きた細胞内の蛋白質および／またはＤＮＡの分子特有の標識のため、標準的な明視野透過モード（回折分析を排除）では吸収度もしくは蛍光の生の染料が使用され、または暗視野照射モードでは抗体／プローブおよびナノ粒子が使用される。

動作の際には、画像再構成モジュール４２は、再構成された３次元画像内のボクセルの寸法を決定する。再構成モジュール４２は、既知のソフトウェア工学技法によって構築された、１ボクセル当たりの吸収度を測定することによって放射を吸収する分子の濃度を測定するモジュールをさらに含むことができる。

１つの有用な実施形態では、光断層撮影法による画像化システム１１は、ＤＵＶ吸収度の画像化によく適している。２０ｎｍのバンド幅で２６０ｎｍおよび２８０ｎｍのＬＥＤを使用すると、励起フィルタを必要とすることなく、簡単でかつ堅固な計測が可能になる。集光光学系５６は、たとえば、ＤＵＶ集光レンズ（たとえば、ドイツＺｅｉｓｓからのＵＶ−Ｋｏｎｄモデル）を含むことができ、対物レンズ１８は、Ｚｅｉｓｓから入手可能な１００倍、１．２５ＮＡのＵｌｔｒａｆｌｕａｒ、またはニューヨーク州ロチェスターのＯｐｔｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なカスタム２６５ｎｍの対物レンズなどのレンズを含むことができる。周囲光および蛍光を遮断するために、フィルタ１２Ａ、１２Ｂは、光がＵＶ感応性ＣＣＤカメラに到達する前に、どちらもバーモント州ブラットルボロのＣｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．またはＯｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌから入手可能な２５０ｎｍから２９０ｎｍのバンドパスを有するバンドパス・フィルタを含むことができる。有用なＣＣＤカメラには、日本のＳｏｎｙ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＣＣＤカメラ、ニュージャージー州トレントンのＰｒｉｎｃｅｔｏｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＰｈｏｔｏｎＭａｘモデル・カメラ、またはニュージャージー州プリンストンのＳａｒｎｏｆｆ Ｉｍａｇｉｎｇからのデバイスが含まれる。

生細胞の画像化では、試験片ステージおよびグリセロール、油、または水浸漬対物レンズを温度制御する必要があることが多い。２次元ＤＵＶの画像化から３次元Ｃｅｌｌ−ＣＴ ＤＵＶの画像化へ移行するには、直径５０ミクロンの微小毛細管内で分離された細胞を画像化するために短い透過距離（経路長さ）が必要とされるため、材料はＵＶ透過性でなければならない。たとえば、細胞培地は、細胞プラズマ膜との整合を助けるためにより高い屈折率を有することができる生理緩衝液とするべきである。水溶液への添加物には、それだけに限定されるものではないが、ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、変性または誘導ＰＥＧ、およびアガロース・ゲルを含むことができる。微小毛細管に使用されるガラスに細胞培地をうまく整合させることができないとき、内径を増大させると、内側の管壁の屈折の程度を低減させるのに役立つことがある。外側の管壁とは、生体適合性に対処する必要はないので、屈折率をうまく整合できるはずである。しかし、回転接合部が選択されているときは、２５０ｎｍ〜２９０ｎｍの信号の波長範囲内で蛍光を発しない材料を考慮すべきである。

次に図２を参照すると、ＵＶカメラおよび任意選択の適応光学を使用して紫外放射を用いる光断層撮影システム内の細胞の３次元画像化システムの代替例を概略的に示す。生細胞画像化の要件は、水溶液および生理緩衝液のタイプに、したがって細胞の周囲で使用できる屈折率の範囲に制限を課す。細胞周辺および管内のこの包埋媒体は、標準的な乾燥または油浸顕微鏡対物レンズに対して、その結果得られる画像に収差をもたらすのに十分なほどの屈折率不整合を有することが予期される。この屈折率不整合の補償は、対物レンズから生理緩衝剤を含む細胞までの指定の画像化深さまたは距離に対して設計することができる。しかし、下位の球面収差でさえ軸方向の深さの変動とともに変動し、したがって、軸方向の深さにわたる顕微鏡の画像化には、光波面歪みの動的補償が有利である。動的歪み制御または補償のこの技法は、適応光学と呼ばれる。そのような動的収差補償に使用される光学構成要素は、空間光変調器または変形可能な膜ミラーであることが多い。精巧な光学構成要素のＤＵＶ光の透過特性が最適でないため、適応反射鏡がＤＵＶ顕微鏡内で好ましい構成要素である。

細胞の３次元画像化システム２００は、図１に関して上述のものと同じまたは類似のいくつかの構成要素を含む。上述のように、当該物体１を見るために、管２２が、顕微鏡対物レンズ１８に対して位置決めされる。上述のように、顕微鏡１６は、対物レンズ１８および結像レンズ素子５２を含む。顕微鏡対物レンズ１８は、光軸２０２に沿って位置合わせされる。図１のシステムとは対照的に、当該物体の画像を取得するために、単一の紫外（ＵＶ）カメラ４８だけが使用される。ＵＶカメラ４８もまた、光軸２０２に沿って位置合わせされる。ＵＶカメラ４８と結像レンズ素子５２の間には、蛍光遮断フィルタ５０が置かれる。上記のように、蛍光遮断フィルタ５０は、より長い波長の蛍光を遮断し、かつ／または異なる紫外放射信号の離隔距離を増大させるように選択される。

水性環境２および当該物体１は、顕微鏡対物レンズ１８と管２２および光ゲル３２または等価物との間に、適応ミラー５４を関連する適応光学（ＡＯ）制御装置２０１とともに使用して深さに依存する画像収差を低減させることを必要とするのに十分なほど大きな屈折率不整合をもたらすことがある。この適応光学構成要素は、放射源２９、光学要素２７、および集光レンズ２４の間に位置する任意選択の素子とすることができる。一定の波面補償（２次元）プロファイルで無通電であるか、それとも通電しているかにかかわらず、適応ミラー５４は光学系内で静的に９０度回転し、これにより単一の深さレベルを補償することができる。

上述のように、ＵＶカメラ４８からの画像は、画像処理装置４０へ伝送される。画像処理装置は、処理された画像データを３次元画像再構成モジュール４２へ伝送する。３次元画像再構成モジュール４２は、望ましい場合、操作者が見るために、光ディスプレイ４４に結合することができると有利である。操作者制御および情報の目的で、ユーザ・インターフェース４６が提供される。ユーザ・インターフェース４６は、ＧＵＩインターフェースなどとすることができる。

次に図３を参照すると、光断層撮影システム内で使用するための温度制御式の筐体の一実施形態を概略的に示す。温度制御式の筐体３００は、生体細胞１または他の生物材料などの当該物体を含み、この物体は、顕微鏡対物レンズ１８に対して位置決めされた管、毛細管、または微小毛細管２２内に含まれる。微小毛細管２２は、微小毛細管２２内の細胞１の制御された回転運動２１を可能にするように、回転モータ２０によって回転可能である。細胞１およびゲル３２は、たとえばシリンジ８０によってかけられる陽圧によって、毛細管２２内で水平軸に沿って進めることができる。別のモータ３４は、顕微鏡対物レンズ１８および結像レンズ５２の垂直軸方向の動きを制御する。微小毛細管２２は、光ゲルまたは屈折率整合媒体３２内に入れられ、サンプル集光アセンブリ５６の一部となり、その上に位置する。

電力増幅器６０は、温度制御装置６４に対してエネルギーを提供する。温度制御装置６４は、少なくとも１つのセンサ７４に応答し、摂氏５から３９度などの指定の範囲内で所望の温度を維持するように、コンピュータおよび電子入力７８を用いてさらに調整することができる。しかし、生理レベルに達する機能を維持するためには、ヒトなどの温血動物の細胞は厳重な温度制御を必要とし、すなわち±摂氏０．５度の範囲内で摂氏３６度にする必要がある。温度ならびにマイクロ流体条件の調整により、細胞（すなわち、特に不安定な正常もしくは異常細胞、前癌性、癌性、ウイルス感染、または他の病原性細胞の集団）を生きたまま保つことが容易になる。一例では、３つのセンサ７４が、顕微鏡ヘッド１６付近、ならびに微小毛細管２２上および下に位置決めされる。いくつかの実施形態では、温度制御を助けるために、空気循環のための任意選択の内部ファン６８が存在する。ペルチェ熱電加熱器／冷却器７０をシステム全体にわたって位置決めすることができ、また微小毛細管２２の上と下の両方に位置決めして、優れた温度制御のために熱エネルギーを提供することができる。特有の実施形態では、ペルチェ加熱器／冷却器７０をさらに配置できると有利である。熱電加熱器／冷却器およびファンの代替手段は、顕微鏡を密閉するチャンバの周囲に温度制御式の水循環器または等価物を選択することである。いくつかの実施形態では、摂氏約３５度から摂氏約３６度の温度が使用され、他の実施形態では、温度をより高くまたはより低くすると、特有の生物学的プロセスの研究、または生きた細胞内での特有の試薬の使用を容易にすることができる。

光断層撮影システムについて上記で詳細に説明したが、本開示の理解を助けるため、システムの動作についての説明を次に提示する。生きた細胞などの生体１が、シリンジ・デバイス８０を介して微小毛細管２２内に注入され、加圧された毛細流８４が、生体１を顕微鏡１６の対物レンズ１８下の観察窓へ動かす。少なくとも１つの放射源２９（たとえば、ＤＵＶおよび可視光）が、生体１を含む微小毛細管２２の一部分に照射するように位置決めされる。いくつかの実施形態では、約２６０ｎｍから約２８０ｎｍの放射波長が使用される。放射は、サンプル集光アセンブリ５６の一部として、光拡散器２８と集光レンズ２４、２６のアセンブリを通過する。組み込まれたセンサ７４、温度制御装置６４、およびファン６８は、温度を維持して、細胞の生存性を維持および増大させる。このシステムは、定義および制御された条件下での生きた細胞の研究に多数の変形を可能にする。

上記その他に記載の光断層撮影システムは、温度制御およびマイクロ流体を使用して、それだけに限定されるものではないが、ヒトからの細胞、ならびに任意の他の種からの細胞を含む任意の生きた生物材料を検査できるのに適した条件を維持する。細胞、または他の生物材料は、１つまたは複数の管（たとえば、微小毛細管）の中を流れて画像化を容易にする。いくつかの実施形態では、微小毛細管２２は、２つ以上のチャネルからなるまっすぐな管を含む。特定の実施形態では、光断層撮影システムを使用して、細胞または亜細胞材料を採集できることが理解される。

いくつかの実施形態では、システムは、生きた細胞もしくは場合によっては生きていない細胞、またはその断片内に含まれる高分子複合体、核蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または蛋白質から出る画像化信号を含む放射を感知する。成分ＤＮＡ、ＲＮＡ、および蛋白質複合体を含む細胞は、それだけに限定されるものではないが、生物活性分子、ナノ粒子、変性ナノ粒子、マイクロスフェア、蛋白質原細胞、抗体、バイオマーカ、サイトカイン、他のヌクレオチド、他の蛋白質を含む化学物質、生物薬剤を用いて処理し、または別法として、顕微操作もしくは他の治療（たとえば、トランスフェクション試薬、ウイルス、リポソーム、および同様の薬剤）によって機械的に操作して、分子の取込みを変更もしくは容易にし、または画像化プロセス中の他の細胞プロセスに影響を及ぼすことができる。生物薬剤または化学薬剤は、発色団およびフルオロフォアで標識を付け、または変性させることができる。実施形態はまた、３次元画像または回折パターン内で光学コントラスト機構として働く吸収、蛍光、および散乱特性を有する金、コロイド金、鉄および酸化鉄、ならびに同様の分子で標識を付けることによって変性されたナノ粒子を使用する。発色団およびフルオロフォアに加えてナノ粒子およびマイクロスフェアを使用すると、３次元コントラストを高めることが可能になる。たとえば、細胞は、細胞周期、細胞分化、感染性に影響を及ぼし、病原性を低減もしくは増大させる薬剤で処理することができ、または細胞は、亜細胞区画化を変更するようにさらに操作することができる。これらの処理のすべてまたは一部の間、細胞表面バイオマーカ、あるいはクロマチンまたは他の細胞の核蛋白質もしくは高分子複合体の発現および露呈を検査することができる。

特定の実施形態では、生きた細胞または他の生物材料に、複数の波長の放射が照射される。そのような場合、入力画像のコンピュータ処理から形成される細胞または他の生物材料の複数の疑似投影画像は、レシオ・イメージング技法を使用して処理することができる。いくつかの実施形態では、レシオ・イメージングは、約２６０ｎｍから約２８０ｎｍの放射波長から形成された画像を含む。

別法として、場合によっては、それだけに限定されるものではないが、蛍光およびレーザ回折を含む生細胞染色技法を使用して画像を得ることができると有利である。

次に図４を参照すると、マイクロ流体カートリッジ４００の一例の側面図を概略的に示す。回転モータ２０は、ベルト１８８を回すように結合されたシャフト１２１を含み、ベルト１８８の第２の端部は、微小毛細管２２を回転させるように結合される。マイクロ流体カートリッジ４００は、レースウェイ内で細胞を動かすように陽圧および陰圧１２０で動作し、第２のチャネル５０４が、栄養素および酸素を供給し、代謝廃棄物を除去し、そして薬品が生理緩衝剤内の細胞と相互に作用できるようにする（図５に最もよく示す）。軸受けまたは摩擦嵌合９２により、細胞などの物体が管を通過する間、微小毛細管２２を回転させることが可能である。集光照射アセンブリ５６を含む顕微鏡１６は、顕微鏡１６の光軸に沿って物体が見えるように、カートリッジ近傍に位置決めされる。

次に図５を参照すると、細胞を画像化するためにレーストラック構成で使用されるマイクロ流体カートリッジの一例の上面図を概略的に示す。マイクロ流体カートリッジ４００は、流体レーストラック構成５００内に結合される。レーストラック構成は、光学窓を含む対物レンズの光軸に沿って画像化領域１１６を含む。また、入口弁９６、出口弁１２４、および第１のチャネル５０２が含まれる。第１のチャネル５０２は、第２のチャネル５０４と流動的に連通している。これらのチャネルは、たとえば半透過性膜１０４を用いてつなぎ合わせることができる。レーストラック全体は、図３に関して本明細書に記載のように、ペルチェ加熱器／冷却器素子または等価物を使用する温度制御式の環境内に維持される。いくつかの実施形態では、レーストラックおよびチャネルは導管を含む。

細胞の生存性を維持するのに必要とされる新鮮な栄養素、酸素、緩衝剤（ｐＨ、オスモル濃度など）、任意選択の薬品などは、流れ矢印１０８によって示すように第２のチャネル５０４を通って導入することができる。しかし、マイクロ流体条件が正しい場合、細胞は横方向には動かず、第１のチャネル５０２を通って軸方向だけに動き、一方拡散により、Ｏ_２などの新鮮な栄養素、緩衝材料、および代謝廃棄物が濃度勾配に沿って動き、したがって混合することが可能である。一例では、半透過性膜１０４は、つなぎ合わせたチャネルに置き換えることができ、荒れていない平行流により、元の流線形のマイクロ流体流内に細胞を維持しながら、小さな分子および溶液の拡散を可能にする。流速が遅い場合、生理学的範囲内のせん断応力が可能であり、一方チャネル幾何形状、流体の粘性、温度、および細胞タイプもまた役割を果たす。

動作の際には、入口弁９６を通ってマイクロ流体カートリッジ４００内に細胞が注入される。トラフ１００は、細胞が管を通って進む間、微小毛細管２２を回転させるのに使用される回転モータおよびベルトのための筐体として働く。陽圧および陰圧１２０をかけて、レーストラック全体にわたって、加圧された流れ８４を制御する。画像化後、出口弁１２４を使用して、流体を廃棄チャネル内に流すことによって、または生細胞を採集するために、選択された細胞１を誘導する。

検査されている試験片は、穿刺吸引（ＦＮＡ）からの生検とすることができる。その結果得られる生細胞のサンプルは、別々の入口弁（図示せず）を有するいくつかの異なるレーストラック内に分割することができる。検査されている各サブサンプルは、異なる薬品（薬品Ａ、薬品Ｂ、薬品の組合せＡ＋Ｂ、および対照（薬品なし）など）に露出させることができ、また反応は、患者に対する個別化薬品反応の目的で、リアルタイムのフィードバックとして監視することができる。

一例では、レーストラック構成は、研究／創薬計器として有用である。動作の際には、３次元で画像化しながら、生細胞をレーストラック内で循環させることができる。サンプル内の各生細胞を化学および環境プロトコルに露出させることができ、また細胞の反応のわずかな変化は、所望の細胞タイプを示すことができる。刺激に対するアポトーシス、有糸分裂、壊死、分泌、および他のプログラムされた細胞反応の変動を、リアルタイムで高い感度で測定することができる。生細胞が所望の特性を示すとき、これらの細胞を採集することができる。１つのそのような採集方法は、２００７年９月２０日公開のＨａｙｅｎｇａの「Ｃａｎｔｉｌｅｖｅｒｅｄ ｃｏａｘｉａｌ ｆｌｏｗ ｉｎｊｅｃｔｏｒ ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｏｒｔｉｎｇ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」という名称の同時係属の米国特許出願公開第２００７−０２１５５２８Ａ１号に開示されている。同願の開示全体を、参照により本明細書に組み込む。

いくつかの代替実施形態では、金またはナノスフェアの抗体／ＤＮＡの標識付けのように標識を付けたナノ粒子を生細胞とともに使用して、特有の蛋白質、クロマチン、およびＤＮＡに標識を付けることができる。たとえば、金ナノ粒子またはコロイド金は、吸収と散乱の両方のコントラストを有し、生きた細胞との生体適合性がある。蛍光標識されたナノスフェアおよびマイクロスフェアは、３次元画像または回折パターン内の光学コントラスト機構として吸収、蛍光、および散乱を有することができる。発色団およびフルオロフォアに加えてナノ粒子を使用すると、散乱という第３のコントラスト強調が可能になる。「黒色」背景または視野で高いコントラストとして散乱信号を画像化する手段は、画像化対物レンズのものを上回る入射角で入射する光を照射し、したがって信号散乱だけが収集されるようにすることである。この画像は、最終画像から照射光子が除去される蛍光画像化に類似している。暗視野顕微鏡法を使用する２次元の生細胞画像化は、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで行われている。たとえば、Ｃｕｒｒｙ，Ａ．、Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｌ．、およびＷａｘ，Ａ．（２００６）、「Ｅｐｉ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｄａｒｋ−ｆｉｅｌｄ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ １４（１４）：６５３５〜６５４２頁を参照されたい。

回折パターン測定は、ＤＮＡ、クロマチン、蛋白質、およびこれらの特有の標識付け強調の３次元の空間パターンを測定する上記の画像化技法と相補型の非画像化技法である。疾患特有の回折シグネチャは、細胞からの特有の散乱角度で測定される特有の空間周波数で見ることができる。レーザ・ビームからのゼロ次光は、生細胞からの弱散乱光より数桁大きいので、このゼロ次光が光学検出器またはカメラに到達するのを大幅に低減させるために、細胞の斜め照射の技法が提案される。この技法は、上記で論じたナノ粒子を使用する暗視野顕微鏡法に類似している。

上記のそれぞれの技法の例はまた、以下に示すいくつかの一般的な概念を使用して、組合せとして実施することができる。しかし、話を簡単にするために、そして生細胞の３次元画像化の開発段階中の複雑な不確定要素をなくすために、研究室の実装は、個々の技法の例として行われる可能性が最も高い。複数の画像化および測定技法を組み合わせるいくつかの例を、以下に提示する。

次に図６を参照すると、同じ経路に沿って別々の画像化ステージを含む光断層撮影プロセスを示す。別々の画像化ステージは、単一の微小毛細管などの同じ経路に沿って処理することができる。たとえば、第１のステージ６１１で、可視光の回折分析および細胞計数６０２を行い、その後第２のステージ６１２で、可視光の画像化６０４を行うことができる。生きた染料を使用して画像化する場合、第３のステージ６１３で、吸収２８０ｎｍの画像化６０６を行い、その後第４のステージ６１４で、吸収２６０ｎｍの画像化６０８を行うことができる。この例示的な実施形態では、細胞は、単一の回転毛細管を通って連続して下方へ動くので、各ステージの制限された視野内に位置合わせされるべきである。吸収２８０ｎｍの画像化は、約２７５ｎｍから２８５ｎｍの範囲内の第１の波長のＤＵＶ光を物体１に照射することを含む。吸収２６０ｎｍの画像化は、約２５５ｎｍから２６５ｎｍの範囲内の第２の波長のＤＵＶ光を物体１に照射することを含む。

別の例では、単一の画像化ステージが、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの波長の吸収など、１つまたは複数の画像コントラスト機構を組み合わせて、ＤＵＶ吸収および固有蛍光を測定し、または１つもしくは複数の生きた染料に対する３つ以上の可視波長の吸収を測定する。光学画像化技法を組み合わせる構成要素は、ビーム分割および組合せのための複数の光学構成要素（ダイクロイックまたは偏光ビームスプリッタ）、ならびに場合によっては複数のカメラを使用することができる。別法として、複数の励起光源が時系列でパルス化される場合、またはフィルタ・ホイールもしくは実際の源が時系列で物理的に動かされ、もしくは閉じられる場合、単一のカメラおよび検出経路を使用することができる。単一のステージで画像化および測定を行うことにより、視野との高精度の位置合せのために、細胞の流れの軸方向の輸送を停止させることが可能になる。

さらに別の例では、ナノ粒子散乱体による生きた細胞染料の暗視野画像化と、回折パターン分析にレーザを用いる細胞の斜め照射とを組み合わせることができると有利である。この技法は、より高速で行うことができ、最初の結果が特定の細胞の詳細な３次元画像を保証する場合、より遅い後の３次元画像化ステージの前の最初のステージとすることができる。

動作の際には、システムは、同じ経路に沿って別々の画像化ステージを含む光断層撮影プロセスを提供する。複数の生体が、経路２５に沿って第１のステージ６１１へ輸送される。第１のステージで、複数の物体のうちの少なくとも１つの物体に可視光を照射して回折パターンを作製し、この回折パターンが、光センサによって感知される。コンピュータ・プログラムまたは等価物を使用して、回折パターンを分析し、回折分析を行う。第２のステージ６１２で、少なくとも１つの物体１に可視光を照射し、少なくとも１つの物体から出る可視光を感知して、第１の複数の疑似投影画像を作製する。第３のステージ６１３で、少なくとも１つの物体１に第１の波長のＤＵＶ光を照射し、少なくとも１つの物体から出る第１の波長のＤＵＶ光を感知して、第２の複数の疑似投影画像を作製する。第４のステージで、少なくとも１つの物体に第２の波長のＤＵＶ光を照射し、このＤＵＶ光を感知して、第３の複数の疑似投影画像を作製する。第１、第２、および第３の複数の疑似投影画像から導出される特徴、ならびに回折分析に基づいて、分類器６１０を使用して、複数の物体を分類し、または他の方法で分離することができる。分類器６１０は、統計分類器、適応分離器、ニューラル・ネットワーク、または等価物など、コンピュータ内に存在するソフトウェア内で通常実施される多くのタイプの従来の分離器のいずれかとすることができる。

本発明について、特許法を順守するため、そして本発明の新規な原理を適用するのに必要な情報を当業者に提供するために、ならびにそのような例示的かつ特殊な構成要素を必要に応じて構築および使用するために、かなり詳細に本明細書に説明した。しかし、特に異なる機器およびデバイスによって本発明を実施できること、そして本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、機器の細部と動作手順の両方に関する様々な修正を実現できることを理解されたい。

Claims (64)

1. 光断層撮影システム（１１）内の生体（１）の３次元画像化方法であって、
   顕微鏡対物レンズ（１８）に対して生体（１）を動かして、変動する画角を提示することと、
   １５０ｎｍと３９０ｎｍの間の波長に制限されたスペクトル・バンド幅を有する放射を前記生体（１）に照射することと、
   前記生体（１）および前記顕微鏡対物レンズ（１８）を透過した放射を紫外カメラ（４８）で感知することと、
   前記感知された放射から前記生体（１）の複数の疑似投影画像を形成することと、
   前記複数の疑似投影画像を再構成して３次元画像を形成することとを含む、方法。
2. 前記スペクトル・バンド幅が、２４０ｎｍと３００ｎｍの間にさらに制限された波長を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記スペクトル・バンド幅が、２６０ｎｍと２６５ｎｍの間にさらに制限された波長を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記スペクトル・バンド幅が、２８０ｎｍと２８５ｎｍの間にさらに制限された波長を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記生体（１）が、細胞、細胞器官、染色体、生細胞、固定細胞、非固定細胞、凍結細胞、解凍細胞、乾燥細胞、クローン細胞、細胞核、細胞小器官、移動細胞、固定化細胞、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および蛋白質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
6. 前記放射が、前記生体（１）からの固有蛍光を刺激し、前記刺激された蛍光を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記再構成された３次元画像のボクセルの寸法が知られており、１ボクセル当たりの吸収度を測定することによって前記放射を吸収する分子の濃度を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記生体（１）が水性環境（２）内に含まれる、請求項１に記載の方法。
9. 前記水性環境（２）が生理緩衝食塩水を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記生体（１）が生細胞を含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記感知された放射が、ＤＮＡから出る画像化信号を含む、請求項３に記載の方法。
12. 前記感知された放射が、蛋白質から出る画像化信号を含む、請求項４に記載の方法。
13. 前記感知された放射が、親水性表面から出る画像化信号を含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記生体（１）に照射することが、複数の波長を照射することを含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記細胞（１）の複数の疑似投影画像を形成することが、レシオ・イメージングを使用して画像を処理することを含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記レシオ・イメージングが、２６０ｎｍから２８５ｎｍの範囲の波長から形成された画像を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 細胞を採集することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
18. 前記生体（１）が、微小毛細管（２２）内に保持される、請求項１に記載の方法。
19. 前記生体（１）が、画像化領域（１１６）を通って細胞を再循環させるように構成された管（２２）内にある、請求項１に記載の方法。
20. 前記放射が、ＤＮＡおよび蛋白質のうちの少なくとも１つによる自然放射吸収度を高めるように選択された少なくとも第１および第２の波長を含む、請求項１に記載の方法。
21. 前記放射が、時系列でパルス化された少なくとも２つの選択された波長を含む、請求項１に記載の方法。
22. 前記放射が、少なくとも２つの選択された波長を含む、請求項１に記載の方法。
23. 前記生体（１）を透過した前記放射を少なくとも２つの選択された波長に分割することを含む、請求項１に記載の方法。
24. 第１の波長に反応する第１の光検出器（１０）および第２の波長に反応する第２の光検出器（１４）を使用して、前記少なくとも２つの選択された波長を感知することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
25. 放射を分割することが、ビームスプリッタ（１５）を通って前記放射を誘導することを含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記ビームスプリッタ（１５）が、偏光ビーム・スプリッタ、ウォラストン・プリズム、複屈折素子、半透鏡、５０／５０強度ビームスプリッタ、誘電体で光学的に被覆されたミラー、ペリクル膜、およびダイクロイック・ミラー・プリズムからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
27. 前記放射を前記顕微鏡対物レンズ（１８）へ誘導するように適応ミラー（５４）を位置決めすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
28. 適応光学制御装置（２０１）で前記適応ミラー（５４）を制御することによって、深さに依存する画像収差を低減させることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記適応ミラー（５４）が、無通電適応ミラー、および一定の波面補償プロファイルで通電された適応ミラーからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
30. ３次元画像を取得する光断層撮影システム（１１）であって、
    波長が１５０ｎｍと３９０ｎｍの間のスペクトル・バンド幅を有する光を生成する少なくとも１つの光照射源（２９）と、
    被写界深度を有し、前記光を受け取るように配置された対物レンズ（１８）と、
    前記被写界深度を延ばすために、走査範囲を通って前記対物レンズ（１８）を平行移動させるように結合された軸方向の平行移動機構（３４）と、
    前記走査範囲内に存在するとき、試験片の複数の異なる見え方を提示するように適合された輸送手段と、
    前記対物レンズ（１８）を透過した光を感知する紫外センサと、
    前記センサからデータを受け取るように結合された画像処理装置（４０）と、
    前記画像処理装置（４０）に結合され、前記データを処理して前記細胞の３次元画像を形成する再構成モジュール（４２）とを含む、システム（１１）。
31. 前記軸方向の平行移動機構（３４）が圧電変換器を含む、請求項３０に記載のシステム（１１）。
32. 前記少なくとも１つの放射源（２９）が、コンピュータ制御型の光源と集光レンズのアセンブリ（５６）を含む、請求項３０に記載のシステム（１１）。
33. 前記輸送手段が微小毛細管（２２）を含む、請求項３０に記載のシステム（１１）。
34. コンピュータ（４１）が、前記圧電変換器を制御するようにリンクされ、前記圧電変換器が、前記対物レンズ（１８）の前記被写界深度を延ばすように前記対物レンズ（１８）を軸方向に動かす、請求項３１に記載のシステム（１１）。
35. 前記スペクトル・バンド幅が、２４０ｎｍと３００ｎｍの間にさらに制限された波長を有する、請求項３０に記載のシステム（１１）。
36. 前記スペクトル・バンド幅が、２６０ｎｍと２６５ｎｍの間にさらに制限された波長を有する、請求項３０に記載のシステム（１１）。
37. 前記スペクトル・バンド幅が、２８０ｎｍと２８５ｎｍの間にさらに制限された波長を有する、請求項３０に記載のシステム（１１）。
38. 前記生体（１）が、細胞、細胞器官、染色体、生細胞、固定細胞、非固定細胞、凍結細胞、解凍細胞、乾燥細胞、クローン細胞、細胞核、細胞小器官、移動細胞、固定化細胞、ＤＮＡ、および蛋白質からなる群から選択される、請求項３０に記載のシステム（１１）。
39. 前記光が、前記生体（１）からの固有蛍光を刺激する、請求項３０に記載のシステム（１１）。
40. 前記再構成された３次元画像のボクセルの寸法が知られており、１ボクセル当たりの吸収度を測定することによって前記放射を吸収する分子の濃度を測定する手段をさらに含む、請求項３０に記載のシステム（１１）。
41. 前記輸送手段が、水性環境（２）内の生体（１）を含む試験片を含む、請求項３０に記載のシステム（１１）。
42. 前記水性環境（２）が生理緩衝食塩水を含む、請求項４１に記載のシステム（１１）。
43. 前記生体（１）が生細胞を含む、請求項４１に記載のシステム（１１）。
44. 前記感知された放射が、ＤＮＡから出る画像化信号を含む、請求項３０に記載のシステム（１１）。
45. 前記感知された光が、蛋白質から出る画像化信号を含む、請求項３０に記載のシステム。
46. 前記感知された光が、親水性表面から出る画像化信号を含む、請求項３０に記載のシステム（１１）。
47. 前記少なくとも１つの光照射源（２９）が、複数の波長を有する光を生成する、請求項３０に記載のシステム（１１）。
48. 前記再構成モジュール（４２）が、レシオ・イメージング・プロセスを含む、請求項３０に記載のシステム（１１）。
49. 前記レシオ・イメージング・プロセスが、２６０ｎｍから２８０ｎｍの範囲の波長から形成された画像を含む、請求項４７に記載のシステム（１１）。
50. 前記輸送手段が、２つ以上のチャネルからなるまっすぐな管（２２）を含む、請求項３０に記載のシステム（１１）。
51. 前記紫外センサ（１０）が紫外画素アレイ検出器である、請求項３０に記載のシステム（１１）。
52. 前記スペクトル・バンド幅が、蛋白質による自然放射吸収度を高めるように選択された波長に制限される、請求項３０に記載のシステム（１１）。
53. 前記少なくとも１つの光照射源（２９）が、少なくとも２つの選択された波長を伝送する複数の源（３０）を含む、請求項３０に記載のシステム（１１）。
54. 前記輸送手段が、細胞、細胞器官、染色体、生細胞、固定細胞、非固定細胞、凍結細胞、解凍細胞、乾燥細胞、クローン細胞、細胞核、細胞小器官、ＤＮＡ、および蛋白質からなる群から選択される生体（１）を含む試験片を保持するように適合される、請求項３０に記載のシステム（１１）。
55. 前記紫外センサが、
    第１の波長を有する光に反応し、前記顕微鏡対物レンズ（１８）を通過した光を感知するように位置決めされた第１の光検出器（１０）と、
    第２の波長を有する光に反応し、前記顕微鏡対物レンズ（１８）を通過した光を感知するように位置決めされた第２の光検出器（１４）とを含み、前記第１の光検出器（１０）および前記第２の光検出器（１４）が、交差する光路に沿って位置決めされる、請求項３０に記載のシステム（１１）。
56. 前記第１および第２の波長のうちの少なくとも１つが、ＤＮＡによる自然放射吸収度を高めるように選択される、請求項５５に記載のシステム（１１）。
57. 前記生体（１）を透過した放射を、前記第１の光検出器（１０）および前記第２の光検出器（１４）へ別々に伝送される少なくとも２つの選択された波長に分割するように位置決めされたビームスプリッタ（１５）をさらに含む、請求項５５に記載のシステム。
58. さらに、前記第１の光検出器（１０）がＣＣＤセンサを含む、請求項５５に記載のシステム（１１）。
59. 前記第１の光検出器（１０）が、ヒトＤＮＡの自然吸収度に整合する波長を有する放射に反応する、請求項５５に記載のシステム（１１）。
60. 前記第２の光検出器が、蛋白質の自然吸収度に整合する波長を有する放射に反応する、請求項５５に記載のシステム。
61. 前記第１の光検出器（１０）が、親水性表面から出る画像化信号を含む波長を有する放射に反応する、請求項５５に記載のシステム（１１）。
62. 前記ビームスプリッタ（１５）が、偏光ビーム・スプリッタ、ウォラストン・プリズム、複屈折素子、半透鏡、５０／５０強度ビームスプリッタ、誘電体で光学的に被覆されたミラー、ペリクル膜、およびダイクロイック・ミラー・プリズムからなる群から選択される、請求項５７に記載のシステム（１１）。
63. 前記紫外センサと前記透過された放射の間に置かれた少なくとも１つのフィルタ（１２Ａ）をさらに含む、請求項３０に記載のシステム（１１）。
64. 前記少なくとも１つの放射源（２９）が、異なる波長を生成する１組のＵＶ光源（３０）を含む、請求項３０に記載のシステム（１１）。

Images