CN113777767B - 一种快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统及其方法。本发明采用线偏光制造的光镊来捕获和旋转样品，通过产生单光束梯度力阱，能够将微颗粒或者细胞在三维空间中约束在焦点附近，同时引起样品中各向异性的极化，从而产生一个依赖于双折射极化方向与电场方向夹角的力矩，因而能够控制被捕获的物体同步地与光场的偏振方向进行旋转；本发明采用光外差干涉的方法来合成偏振高速旋转的线偏光场用于产生光镊，能够快速、连续和无接触地对目标样品进行旋转，避免了扫描振镜引入的机械扰动，尤其是对于光学衍射层析成像，能够提高轴向分辨率，实现分辨率的各向同性；本发明光路紧凑，有利于实现微型光路。

Description

一种快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统及其方法

技术领域

本发明涉及光学显微成像技术，具体涉及一种快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统及其成像方法。

背景技术

光学显微镜是利用光与物质的相互作用来实现对人眼无法分辨的微小物体，例如细胞，进行放大和成像的一种技术手段。相对于其他显微成像手段例如电子显微镜，光学显微镜能够对活细胞实现非侵入式地、实时地成像和观察，对于生物医学领域有着广泛的应用场景。

光学层析显微成像技术则利用光通过样品后的散射、透射或者激发的荧光信号来对样品进行断层扫描成像，从而重构出样品上的三维数字模型的成像技术。其中光学投影层析成像技术(Optical Projection Tomography，OPT)可以实现对样品散射光场(无标记)或荧光信号光场(荧光标记)的强度的三维重构成像。照明光场通过样品后，通过对样品360°的旋转来实现三维信息的获取。光学投影层析成像具有大视场、高分辨率的特点；但是由于其层析重构算法没有考虑光的衍射，制约了其分辨率的提升。在分辨率上更进一步的则为光学衍射层析成像技术(Optical Diffraction Tomography，ODT)，通过记录样品散射光的强度和相位信息，可以对三维样品空间的折射率进行快速和高精度的无标记定量测量。三维折射率可以作为图像对比来实现三维样品上的成像。另一方面，高精度折射率的定量测量是一种适用范围从生物医学研究到材料计量等广泛领域的无标记对比机制，例如生物体系中蛋白质浓度和细胞的干质量与折射率密切对应，可以被用于干细胞和癌变生物物理研究。

光学衍射层析显微技术是建立在数字全息理论和光学散射理论的基础上。三维样品上的相位信息可以通过数字离轴全息成像获得，而通过对样品多个角度的全息信息的探测记录，其三维折射率分布可以通过衍射层析理论来重建得到。因此，光学衍射层析显微技术中不同离轴角的实现通常有两种手段：(1)使用照明光源来旋转式地扫描样品和(2)旋转样品。

其中照明光源的旋转通常是通过控制位于样品共轭面的两个扫描振镜来实现地。然而，机械驱动地扫描振镜在扫描地过程中，由于高电压造成的非线性响应会造成扫描位置的抖动。此外，由于二轴扫描振镜的旋转面不能准确地同样品共轭，照明激光中会被引入额外的相位干扰信息。同时，基于照明光源扫描的光学衍射层析显微技术，只能扫描有限的离轴角度；在轴向方向上的三维折射率分布的分辨率，则由于角度的缺失，要低于径向的分辨率，因而无法实现各向同性分辨率的三维成像。另一方面，扫描振镜的引入也增加了照明光路和控制系统的复杂程度，因而增加了开发微型成像系统的难度。

相比用光源旋转扫描的光学衍射层析技术，旋转样品上的方法具有其本质的优势。首先，样品可以360°的旋转来实现对整个区间离轴角度的探测和记录，从而实现对三维折射率分布的各向同性分辨率的成像。不需要扫描振镜则大大降低了成像系统的复杂程度，使得微型成像系统的开发成为可能。然而现有的旋转的样品技术通常通过机械的手段来实现，也存在其固有的一些缺陷：(1)机械旋转的速度限制了成像的时间分辨率；(2)作为机械旋转臂的毛细微管的反射需要额外的数值孔径的修正；(3)机械旋转样品上的手段由于与样品存在接触，会造成生物样品上的形变。

同样的，光学投影层析成像中，对于不同角度的成像，也是通过样品上的旋转来实现的。而这种样品上的旋转通常为机械接触式的，也存在光学衍射层析成像中同样的缺点和影响。

发明内容

针对现有的光学层析显微成像技术中机械式的旋转样品上的方法的不足，本发明提出了一种快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统及其成像方法，对样品进行快速、非接触式的三维旋转，在实现快速各向三维结构的测量的同时，也避免了接触式的机械旋转引入的样品形变。

本发明的一个目的在于提出一种快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统。

光学层析显微成像系统采用光学投影层析成像光路或光学衍射层析成像光路。

采用光学投影层析成像光路，本发明的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统包括：光镊产生光路、光学投影层析成像光路和同步控制系统；其中，

光学投影层析成像光路包括投影照明激光光源、第一声光调制器、第二望远镜系统、探测物镜、二向色镜、第一套筒透镜和第一相机；投影照明激光光源作为光学投影层析成像光路的光源发出投影照明激光，经第一声光调制器对一级光的强度进行快速的调制，经过第二望远镜系统调整至束腰大小与样品匹配的平行光照射在样品上，被样品散射后，透射光作为信号光由探测物镜收集；信号光经过二向色镜后通过第一套筒透镜成像于第一相机上；

光镊产生光路包括光镊激发光源、第一1/2波片、第一偏振分光棱镜、第一声光移频器、第二声光移频器、第二偏振分光棱镜、1/4波片、第一光纤耦合器、第一光纤转接件、第一准直透镜和第一望远镜系统；光镊激发光源产生相干高斯光，通过第一1/2波片改变相干高斯光的偏振方向，再经过第一偏振分光棱镜分光为水平偏振的线偏光和垂直偏振的线偏光，通过旋转第一1/2波片的角度来调节水平偏振的线偏光与垂直偏振的线偏光的能量配比；两束偏振正交的线偏光，其中一束经过第一声光移频器产生频率移动Δf₁，并且另一束经过第二声光移频器产生频率移动Δf₂后，经过第二偏振分光棱镜后，两束频率移动后的偏振正交的线偏光合束；两束偏振正交的线偏光合束后，通过方位角为45°的1/4波片，将两束线偏光转变为具有频率差Δf的左旋圆偏光和右旋圆偏光，Δf＝Δf₁-Δf₂，并进一步叠加形成偏振方向按照频率差Δf＝Δf₁-Δf₂为频率连续旋转的线性偏振光，然后通过第一光纤耦合器被耦合进光纤；在光纤的另一端，偏振连续旋转的线偏光通过第一光纤转接件后，经第一准直透镜准直，由第一望远镜系统扩大束腰至过填充探测物镜的后瞳，并通过二向色镜至探测物镜；经探测物镜形成紧聚焦的线偏光场，通过产生单光束梯度力阱，能够将微颗粒或者细胞在三维空间中约束在焦点附近，同时引起样品中各向异性的极化，从而产生一个依赖于双折射极化方向与电场方向夹角的力矩，使得微颗粒或者细胞的极化方向重新排布至同光场的偏振方向一致；当线偏光的偏振方向以设定的频率差高速旋转时，这个力矩使得被捕获的微颗粒或者细胞同步地被线偏光的高速旋转驱动着转动，来满足光学投影层析成像中对于样品旋转地需求，实现在光学投影层析成像对样品无接触且快速连续旋转的控制；

同步控制系统包括计算机和射频信号发生器，计算机连接至射频信号发生器，射频信号发生器分别连接至第一声光移频器和第二声光移频器；计算机连接至第一相机；计算机输出模拟信号控制射频信号发生器输出相应的射频信号至第一和第二声光移频器，使得第一和第二声光移频器产生频率差Δf＝Δf₁-Δf₂；同时计算机输出与频率差Δf相匹配的数字信号至第一相机，并控制第一相机以1/(Δf₁-Δf₂)的曝光时间进行曝光，实现对样品无接触快速连续旋转的同时，对每个角度同步地进行相机曝光和数据采集，完成光学投影层析显微成像。

采用光学衍射层析成像光路，本发明的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统包括：光镊产生光路、光学衍射层析成像光路和同步控制系统；其中，

光学衍射层析成像光路包括衍射照明激光光源、第二声光调制器、第二1/2波片、第三分光棱镜、第二和第三光纤耦合器、第二和第三光纤转接件、第二和第三准直透镜、第三望远镜系统、探测物镜、二向色镜、第四分光棱镜、第二套筒透镜和第二相机；衍射照明激光光源作为光学衍射层析成像光路的光源发出衍射照明激光，衍射照明激光为相干光，经第二声光调制器对一级光的强度进行快速的调制，之后经过第二1/2波片和第三分光棱镜产生激光分光为照明光和参考光，其中照明光经过第二光纤耦合器耦合进光纤，通过第二光纤转接件后，通过第二准直透镜准直；参考光经过第三光纤耦合器耦合进光纤，通过第三光纤转接件后，通过第三准直透镜准直；准直后的照明光经过第三望远镜系统调整到束腰大小与样品匹配作为照明光源照射到样品上产生散射光，散射光由探测物镜收集，并通过二向色镜在第四分光棱镜处与准直后的参考光合束并发生干涉，通过旋转第二1/2波片调整照明光和参考光的分光比，使得干涉条纹的对比度最高；然后通过第二套筒透镜将全息图投射在第二相机上；对记录的全息图通过雷托夫(Rytov)近似理论解算得到样品的三维折射率分布；

光镊产生光路包括光镊激发光源、第一1/2波片、第一偏振分光棱镜、第一声光移频器、第二声光移频器、第二偏振分光棱镜、1/4波片、第一光纤耦合器、第一光纤转接件、第一准直透镜和第一望远镜系统；光镊激发光源产生相干高斯光，通过第一1/2波片改变相干高斯光的偏振方向，再经过第一偏振分光棱镜分光为水平偏振的线偏光和垂直偏振的线偏光，其中通过旋转第一1/2波片的角度来调节水平偏振的线偏光与垂直偏振的线偏光的能量配比；两束偏振正交的线偏光，其中一束经过第一声光移频器产生频率移动Δf₁，并且另一束经过第二声光移频器产生频率移动Δf₂后，经过第二偏振分光棱镜后，两束频率移动后的线偏光合束；两束偏振正交的线偏光合束后，通过方位角为45°的1/4波片，将两束线偏光转变为具有频率差Δf的左旋圆偏光和右旋圆偏光，Δf＝Δf₁-Δf₂，并进一步叠加形成偏振方向按照频率差Δf＝Δf₁-Δf₂为频率连续旋转的线性偏振光，然后通过第一光纤耦合器被耦合进光纤；在光纤的另一端，偏振连续旋转的线偏光通过第一光纤转接件后，经第一准直透镜准直，由第一望远镜系统扩大束腰至过填充探测物镜的后瞳，并通过二向色镜至探测物镜，经探测物镜形成紧聚焦的线偏光场，通过产生单光束梯度力阱，能够将微颗粒或者细胞在三维空间中约束在焦点附近，同时引起样品中各向异性的极化，从而产生一个依赖于双折射极化方向与电场方向夹角的力矩，使得微颗粒或者细胞的极化方向重新排布至同光场的偏振方向一致；当线偏光的偏振方向以设定的频率差高速旋转时，这个力矩使得被捕获的微颗粒或者细胞同步地被线偏光的高速旋转驱动着转动，来满足光学衍射层析成像中对于样品旋转地需求，实现在光学衍射层析成像对样品无接触且快速连续旋转的控制；

同步控制系统包括计算机和射频信号发生器，计算机连接至射频信号发生器，射频信号发生器分别连接至第一声光移频器和第二声光移频器；计算机连接至第二相机；计算机输出模拟信号控制射频信号发生器输出相应的射频信号至第一和第二声光移频器，使得第一和第二声光移频器产生频率差Δf＝Δf₁-Δf₂；同时计算机输出与频率差Δf相匹配的数字信号至第二相机，并控制第二相机以1/(Δf₁-Δf₂)的曝光时间进行曝光，实现无接触快速连续旋转样品的同时，对每个角度同步的进行相机曝光和数据采集，完成光学衍射层析显微成像。

线偏光的偏振方向的设定的频率差为0～500MHz。

本发明的另一个目的在于提出一种快速连续旋转样品的光学层析显微成像方法。

本发明的快速连续旋转样品的光学层析显微成像方法，采用光学投影层析成像光路，包括以下步骤：

1)光学投影层析成像光路的实现：

a)投影照明激光光源作为光学投影层析成像光路的光源发出投影照明激光；

b)投影照明激光经第一声光调制器对一级光的强度进行快速的调制，经过第二望远镜系统调整至束腰大小与样品匹配的平行光照射在样品上；

c)平行光被样品散射后，透射光作为信号光由探测物镜收集；

d)信号光经过二向色镜后通过第一套筒透镜成像于第一相机上；

2)光镊产生光路的实现：

a)光镊激发光源产生相干高斯光；

b)高斯光通过第一1/2波片改变相干高斯光的偏振方向，再经过第一偏振分光棱镜分光为水平偏振的线偏光和垂直偏振的线偏光，通过旋转第一1/2波片的角度来调节水平偏振的线偏光与垂直偏振的线偏光的能量配比；

c)两束偏振正交的线偏光，其中一束经过第一声光移频器产生频率移动Δf₁，并且另一束经过第二声光移频器产生频率移动Δf₂后，经过第二偏振分光棱镜后，两束频率移动后的偏振正交的线偏光合束；

d)两束偏振正交的线偏光合束后，通过方位角为45°的1/4波片，将两束线偏光转变为具有频率差Δf的左旋圆偏光和右旋圆偏光，Δf＝Δf₁-Δf₂，并进一步叠加形成偏振方向按照频率差Δf＝Δf₁-Δf₂为频率连续旋转的线性偏振光，然后通过第一光纤耦合器被耦合进光纤；

e)在光纤的另一端，偏振连续旋转的线偏光通过第一光纤转接件后，经第一准直透镜准直，由第一望远镜系统扩大束腰至过填充探测物镜的后瞳，并通过二向色镜至探测物镜；

3)对样品的控制：

a)经探测物镜形成紧聚焦的线偏光场，通过产生单光束梯度力阱，能够将微颗粒或者细胞在三维空间中约束在焦点附近；

b)同时引起样品中各向异性的极化，从而产生一个依赖于双折射极化方向与电场方向夹角的力矩，使得微颗粒或者细胞的极化方向重新排布至同光场的偏振方向一致；

c)当线偏光的偏振方向以设定的频率差高速旋转时，这个力矩使得被捕获的微颗粒或者细胞同步地被线偏光的高速旋转驱动着转动，来满足光学投影层析成像中对于样品旋转地需求，实现在光学投影层析成像对样品无接触且快速连续旋转的控制；

4)信号同步的控制：

a)计算机输出模拟信号控制射频信号发生器输出相应的射频信号至第一和第二声光移频器，使得第一和第二声光移频器产生频率差Δf＝Δf₁-Δf₂；

b)同时计算机输出与频率差Δf相匹配的数字信号至第一相机，并控制第一相机以1/(Δf₁-Δf₂)的曝光时间进行曝光，实现对样品无接触快速连续旋转的同时，对每个角度同步的进行相机曝光和数据采集，形成光学投影层析显微成像。

本发明的快速连续旋转样品的光学层析显微成像方法，采用光学衍射层析成像光路，包括以下步骤：

1)光学衍射层析成像光路的实现：

a)衍射照明激光光源作为光学衍射层析成像光路的光源发出衍射照明激光，衍射照明激光为相干光；

b)衍射照明激光经第二声光调制器对一级光的强度进行快速的调制，之后经过第二1/2波片和第三分光棱镜将激光分为照明光和参考光；

c)其中照明光经过第二光纤耦合器耦合进光纤，通过第二光纤转接件后，通过第二准直透镜准直；参考光经过第三光纤耦合器耦合进光纤，通过第三光纤转接件后，通过第三准直透镜准直；

d)准直后的照明光经过第三望远镜系统调整到大小与样品匹配的束腰作为照明光源照射到样品上产生散射光，散射光由探测物镜收集，并通过二向色镜在第四分光棱镜处与准直后的参考光合束并发生干涉；

e)通过旋转第二1/2波片调整照明光和参考光的分光比，使得干涉条纹的对比度最高；

f)干涉后的光通过第二套筒透镜将全息图投射在第二相机上；

g)对记录的全息图通过雷托夫(Rytov)近似理论解算得到样品的三维折射率分布；

2)光镊产生光路的实现：

a)光镊激发光源产生相干高斯光；

b)高斯光通过第一1/2波片改变相干高斯光的偏振方向，再经过第一偏振分光棱镜分光为水平偏振的线偏光和垂直偏振的线偏光，通过旋转第一1/2波片的角度来调节水平偏振的线偏光与垂直偏振的线偏光的能量配比；

c)两束偏振正交的线偏光，其中一束经过第一声光移频器产生频率移动Δf₁，并且另一束经过第二声光移频器产生频率移动Δf₂后，经过第二偏振分光棱镜后，两束频率移动后的偏振正交的线偏光合束；

d)两束偏振正交的线偏光合束后，通过方位角为45°的1/4波片，将两束线偏光转变为具有频率差Δf的左旋圆偏光和右旋圆偏光，Δf＝Δf₁-Δf₂，并进一步叠加形成偏振方向按照频率差Δf＝Δf₁-Δf₂为频率连续旋转的线性偏振光，然后通过第一光纤耦合器被耦合进光纤；

e)在光纤的另一端，偏振连续旋转的线偏光通过第一光纤转接件后，经第一准直透镜准直，由第一望远镜系统扩大束腰至过填充探测物镜的后瞳，并通过二向色镜至探测物镜；

3)对样品的控制：

a)经探测物镜形成紧聚焦的线偏光场，通过产生单光束梯度力阱，能够将微颗粒或者细胞在三维空间中约束在焦点附近；

b)同时引起样品中各向异性的极化，从而产生一个依赖于双折射极化方向与电场方向夹角的力矩，使得微颗粒或者细胞的极化方向重新排布至同光场的偏振方向一致；

c)当线偏光的偏振方向以设定的频率差高速旋转时，这个力矩使得被捕获的微颗粒或者细胞同步地被线偏光的高速旋转驱动着转动，来满足光学衍射层析成像中对于样品旋转地需求，实现在光学衍射层析成像对样品无接触且快速连续旋转的控制；

4)信号同步的控制：

a)计算机输出模拟信号控制射频信号发生器输出相应的射频信号至第一和第二声光移频器，使得第一和第二声光移频器产生频率差Δf＝Δf₁-Δf₂；

b)同时计算机输出与频率差Δf相匹配的数字信号至第二相机，并控制第二相机以1/(Δf₁-Δf₂)的曝光时间进行曝光，实现无接触快速连续旋转样品的同时，对每个角度同步的进行相机曝光和数据采集，形成光学投影层析显微成像。

本发明的优点：

(1)本发明采用线偏光制造的光镊来捕获和旋转样品，相对于使用圆偏光产生的光镊来说具有其本征优点；后者通过将光场的角动量传递给被捕获的物体，物体表面对光场的吸收或散射会产生光扭矩，从而发生旋转；然而这种方法对光场的强度、物体的形状和微环境的粘度很敏感，因而对物体旋转的精确控制需要对转速进行额外的校正；相比之下，使用线偏光产生的光镊中，光扭矩则是通过光场和物体光轴的失配产生的，因而能够控制被捕获的物体同步地与光场的偏振方向进行旋转；

(2)现有的基于线偏光调制的旋转技术通常是基于机械地旋转1/2波片来实现的，因而很难同时实现快速、连续和非跳跃的光场调制，而通过光外差干涉的方法，则能够实现快速、连续和非跳跃的对被捕获物体的旋转；

(3)采用光外差干涉的方法来合成偏振高速旋转的线偏光场用于产生光镊，能够快速的、无接触地对目标样品进行旋转；这种方法能够避免了扫描振镜引入的机械扰动，尤其是对于光学衍射层析成像，能够提高轴向分辨率，实现分辨率的各向同性；

(4)不包含扫描振镜后的光学衍射层析成像系统的照明光路，只包含一个望远镜系统来调整照明光的束腰；而对于光学投影层析成像系统，不需要机械旋转装置，这都对光路起到了优化的作用，从而实现紧凑、微型光路的设计。

附图说明

图1为本发明的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统中采用光外差干涉的方法合成线性偏振光的原理图；

图2为本发明的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统中采用光外差干涉的方法合成线性偏振光以频率差为周期变化的原理图；

图3为本发明的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统的一个实施例的光镊产生光路的示意图；

图4为本发明的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统的实施例一的示意图；

图5为本发明的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统的实施例二的示意图；

图6为本发明的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统的一个实施例的同步控制系统的连接关系示意图；

图7为本发明的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统的一个实施例的同步控制的时序图。

具体实施方式

下面结合附图，通过具体实施例，进一步阐述本发明。

如图1所示，线偏光的光场E₀(t)为左旋圆偏光和右旋圆偏光的叠加：

其中，

和

分代表左旋圆偏分量和右旋圆偏分量，f₁和f₂是两个圆偏光的频率，

和

是其初始相位。在任一时间t，两个圆偏光的相位差取决与其初始相位的差值。因此，合成光场的线性偏振的时间依赖特性表达为：

当|f₁-f₂|＜＜f₁时，合成的线偏光的偏振旋转具有周期π，因而线性偏振随时间以f₂-f₁的频率连续地旋转，如图2所示。另外，线偏光的相位是随时间连续单调增长的，因而可以实现连续和无跳跃的偏振调制。

实施例一

本实施例采用光学投影层析成像光路，如图4所示，本实施例的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统包括：光镊产生光路、光学投影层析成像光路和同步控制系统；其中，

光学投影层析成像光路包括投影照明激光光源18、第一声光调制器19、第二望远镜系统17、探测物镜15、二向色镜14、第一套筒透镜20和第一相机21；投影照明激光光源作为光学投影层析成像光路的光源发出投影照明激光，经第一声光调制器对一级光的强度进行快速的调制，经过第二望远镜系统调整至束腰大小与样品匹配的平行光照射在样品16上，被样品散射后，透射光作为信号光由探测物镜收集；信号光经过二向色镜后通过第一套筒透镜成像于第一相机上；

如图3所示，光镊产生光路包括光镊激发光源1、第一1/2波片2、第一偏振分光棱镜3、第一声光移频器5、第二声光移频器6、第二偏振分光棱镜8、1/4波片9、第一光纤耦合器10、第一光纤转接件11、第一准直透镜12和第一望远镜系统13；光镊激发光源产生相干高斯光，通过第一1/2波片改变相干高斯光的偏振方向，再经过第一偏振分光棱镜分光为水平偏振的线偏光和垂直偏振的线偏光，通过旋转第一1/2波片的角度来调节水平偏振的线偏光与垂直偏振的线偏光的能量配比；两束偏振正交的线偏光，其中一束经过第一声光移频器产生频率移动Δf₁，并且另一束经第一反射镜4反射后经过第二声光移频器产生频率移动Δf₂再经第二反射镜7反射后后，经过第二偏振分光棱镜后，两束频率移动后的偏振正交的线偏光合束；两束偏振正交的线偏光合束后，通过方位角为45°的1/4波片，将两束线偏光转变为具有频率差Δf＝240MHz的左旋圆偏光和右旋圆偏光，Δf＝Δf₁-Δf₂，240Hz能够在一秒内对240个角度进行成像，完成一个成像体积每秒的数据采集速度；并进一步叠加形成偏振方向按照频率差Δf＝Δf₁-Δf₂为频率连续旋转的线性偏振光，然后通过第一光纤耦合器被耦合进光纤；在光纤的另一端，偏振连续旋转的线偏光通过第一光纤转接件后，经第一准直透镜准直，由第一望远镜系统扩大束腰至过填充探测物镜的后瞳，并通过二向色镜至探测物镜；经探测物镜形成紧聚焦的线偏光场，通过产生单光束梯度力阱，能够将微颗粒或者细胞在三维空间中约束在焦点附近，同时引起样品中各向异性的极化，从而产生一个依赖于双折射极化方向与电场方向夹角的力矩，使得微颗粒或者细胞的极化方向重新排布至同光场的偏振方向一致；当线偏光的偏振方向以设定的频率差高速旋转时，这个力矩使得被捕获的微颗粒或者细胞同步地被线偏光的高速旋转驱动着转动，来满足光学投影层析成像中对于样品旋转地需求，实现在光学投影层析成像对样品无接触且快速连续旋转的控制。

实施例二

本实施例中，采用光学衍射层析成像光路，如图5所示，本实施例的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统包括：光镊产生光路、光学衍射层析成像光路和同步控制系统；其中，

光学衍射层析成像光路包括衍射照明激光光源22、第二声光调制器23、第二1/2波片24、第三分光棱镜25、第二光纤耦合器26、第三光纤耦合器30、第二光纤转接件27、第三光纤转接件31、第二准直透镜28、第三准直透镜32、第三望远镜系统29、探测物镜15、二向色镜14、第四分光棱镜33、第二套筒透镜34和第二相机35；衍射照明激光光源作为光学衍射层析成像光路的光源发出衍射照明激光，衍射照明激光为相干光，经第二声光调制器对一级光的强度进行快速的调制，之后经过第二1/2波片和第三分光棱镜将激光分光为照明光和参考光，其中照明光经过第二光纤耦合器耦合进光纤，通过第二光纤转接件后，通过第二准直透镜准直；参考光经过第三光纤耦合器耦合进光纤，通过第三光纤转接件后，通过第三准直透镜准直；准直后的照明光经过第三望远镜系统调整到束腰大小与样品匹配作为照明光源照射到样品上产生散射光，散射光由探测物镜收集，并通过二向色镜在第四分光棱镜处与准直后的参考光合束并发生干涉；通过旋转第二1/2波片调整照明光和参考光的分光比，使得干涉条纹的对比度最高；然后通过第二套筒透镜将全息图投射在第二相机上；对记录的全息图通过雷托夫(Rytov)近似理论解算得到样品的三维折射率分布；

光镊产生光路包括光镊激发光源1、第一1/2波片2、第一偏振分光棱镜3、第一声光移频器5、第二声光移频器6、第二偏振分光棱镜8、1/4波片9、第一光纤耦合器10、第一光纤转接件11、第一准直透镜12和第一望远镜系统13；光镊激发光源产生相干高斯光，通过第一1/2波片改变相干高斯光的偏振方向，再经过第一偏振分光棱镜分光为水平偏振的线偏光和垂直偏振的线偏光，其中通过旋转第一1/2波片的角度来调节水平偏振的线偏光与垂直偏振的线偏光的能量配比；两束偏振正交的线偏光，其中一束经过第一声光移频器产生频率移动Δf₁，并且另一束经过第二声光移频器产生频率移动Δf₂后，经过第二偏振分光棱镜后，两束频率移动后的线偏光合束；两束偏振正交的线偏光合束后，通过方位角为45°的1/4波片，将两束线偏光转变为具有频率差Δf的左旋圆偏光和右旋圆偏光，Δf＝Δf₁-Δf₂，并进一步叠加形成偏振方向按照频率差Δf＝Δf₁-Δf₂为频率连续旋转的线性偏振光，然后通过第一光纤耦合器被耦合进光纤；在光纤的另一端，偏振连续旋转的线偏光通过第一光纤转接件后，经第一准直透镜准直，由第一望远镜系统扩大束腰至过填充探测物镜的后瞳，并通过二向色镜至探测物镜，经探测物镜形成聚焦的光场，捕获样品上的一个微颗粒或细胞，通过光场和物体光轴的失配产生光扭矩，当线偏光的偏振方向以频率差为频率高速旋转时，被捕获的一个微颗粒或细胞在光扭矩的作用下，同步地与线偏光的偏振方向进行旋转，从而捕获和旋转样品上的一个微颗粒或细胞，实现在光学衍射层析成像对样品无接触且快速连续旋转的控制。

如图6所示，同步控制系统包括计算机41和射频信号发生器42，计算机连接至射频信号发生器，射频信号发生器分别连接至第一声光移频器和第二声光移频器；计算机连接至第一相机21。

如图7所示，计算机发出外触发信号后，相机开始响应。相机从位于中间一行的第四像素行R4开始向上和向下同时曝光至两侧的第三和第五像素行R3和R5来完成一个曝光周期，这个曝光周期需要同线偏光的旋转频率Δf₁-Δf₂相同步，即曝光周期应为1/(Δf₁-Δf₂)。在一个曝光周期中，激光光源后的声光调制器的触发信号在大部分时间为关闭状态，只有当相机所有像素行均打开曝光后，在一个远短于曝光周期的时间内触发使得相机得到有效曝光，来减少样品的移动对成像的影响。

最后需要注意的是，公布实施例的目的在于帮助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。

Claims (6)

1.一种快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统，采用光学投影层析成像光路，其特征在于，所述光学层析显微成像系统包括：光镊产生光路、光学投影层析成像光路和同步控制系统；其中，

光学投影层析成像光路包括投影照明激光光源、第一声光调制器、第二望远镜系统、探测物镜、二向色镜、第一套筒透镜和第一相机；投影照明激光光源作为光学投影层析成像光路的光源发出投影照明激光，经第一声光调制器对一级光的强度进行快速的调制，经过第二望远镜系统调整至束腰大小与样品匹配的平行光照射在样品上，被样品散射后，透射光作为信号光由探测物镜收集；信号光经过二向色镜后通过第一套筒透镜成像于第一相机上；

光镊产生光路包括光镊激发光源、第一1/2波片、第一偏振分光棱镜、第一声光移频器、第二声光移频器、第二偏振分光棱镜、1/4波片、第一光纤耦合器、第一光纤转接件、第一准直透镜和第一望远镜系统；光镊激发光源产生相干高斯光，通过第一1/2波片改变相干高斯光的偏振方向，再经过第一偏振分光棱镜分光为水平偏振的线偏光和垂直偏振的线偏光，通过旋转第一1/2波片的角度来调节水平偏振的线偏光与垂直偏振的线偏光的能量配比；两束偏振正交的线偏光，其中一束经过第一声光移频器产生频率移动Δf₁，并且另一束经过第二声光移频器产生频率移动Δf₂后，经过第二偏振分光棱镜后，两束频率移动后的偏振正交的线偏光合束；两束偏振正交的线偏光合束后，通过方位角为45°的1/4波片，将两束线偏光转变为具有频率差Δf的左旋圆偏光和右旋圆偏光，Δf＝Δf₁-Δf₂，并进一步叠加形成偏振方向按照频率差Δf＝Δf₁-Δf₂为频率连续旋转的线性偏振光，然后通过第一光纤耦合器被耦合进光纤；在光纤的另一端，偏振连续旋转的线偏光通过第一光纤转接件后，经第一准直透镜准直，由第一望远镜系统扩大束腰至过填充探测物镜的后瞳，并通过二向色镜至探测物镜；经探测物镜形成紧聚焦的线偏光场，通过产生单光束梯度力阱，能够将微颗粒或者细胞在三维空间中约束在焦点附近，同时引起样品中各向异性的极化，从而产生一个依赖于双折射极化方向与电场方向夹角的力矩，使得微颗粒或者细胞的极化方向重新排布至同光场的偏振方向一致；当线偏光的偏振方向以设定的频率差高速旋转时，这个力矩使得被捕获的微颗粒或者细胞同步地被线偏光的高速旋转驱动着转动，来满足光学投影层析成像中对于样品旋转地需求，实现在光学投影层析成像对样品无接触且快速连续旋转的控制；

同步控制系统包括计算机和射频信号发生器，计算机连接至射频信号发生器，射频信号发生器分别连接至第一声光移频器和第二声光移频器；计算机连接至第一相机；计算机输出模拟信号控制射频信号发生器输出相应的射频信号至第一和第二声光移频器，使得第一和第二声光移频器产生频率差Δf＝Δf₁-Δf₂；同时计算机输出与频率差Δf相匹配的数字信号至第一相机，并控制第一相机以1/(Δf₁-Δf₂)的曝光时间进行曝光，实现对样品无接触快速连续旋转的同时，对每个角度同步地进行相机曝光和数据采集，完成光学投影层析显微成像。

2.如权利要求1所述的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统，其特征在于，所述线偏光的偏振方向的设定的频率差为0～500MHz。

3.一种快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统，采用光学衍射层析成像光路，其特征在于，所述光学层析显微成像系统包括：光镊产生光路、光学衍射层析成像光路和同步控制系统；其中，

光学衍射层析成像光路包括衍射照明激光光源、第二声光调制器、第二1/2波片、第三分光棱镜、第二和第三光纤耦合器、第二和第三光纤转接件、第二和第三准直透镜、第三望远镜系统、探测物镜、二向色镜、第四分光棱镜、第二套筒透镜和第二相机；衍射照明激光光源作为光学衍射层析成像光路的光源发出衍射照明激光，衍射照明激光为相干光，经第二声光调制器对一级光的强度进行快速的调制，之后经过第二1/2波片和第三分光棱镜产生激光分光为照明光和参考光，其中照明光经过第二光纤耦合器耦合进光纤，通过第二光纤转接件后，通过第二准直透镜准直；参考光经过第三光纤耦合器耦合进光纤，通过第三光纤转接件后，通过第三准直透镜准直；准直后的照明光经过第三望远镜系统调整到束腰大小与样品匹配作为照明光源照射到样品上产生散射光，散射光由探测物镜收集，并通过二向色镜在第四分光棱镜处与准直后的参考光合束并发生干涉，通过旋转第二1/2波片调整照明光和参考光的分光比，使得干涉条纹的对比度最高；然后通过第二套筒透镜将全息图投射在第二相机上；对记录的全息图通过雷托夫近似理论解算得到样品的三维折射率分布；

光镊产生光路包括光镊激发光源、第一1/2波片、第一偏振分光棱镜、第一声光移频器、第二声光移频器、第二偏振分光棱镜、1/4波片、第一光纤耦合器、第一光纤转接件、第一准直透镜和第一望远镜系统；光镊激发光源产生相干高斯光，通过第一1/2波片改变相干高斯光的偏振方向，再经过第一偏振分光棱镜分光为水平偏振的线偏光和垂直偏振的线偏光，其中通过旋转第一1/2波片的角度来调节水平偏振的线偏光与垂直偏振的线偏光的能量配比；两束偏振正交的线偏光，其中一束经过第一声光移频器产生频率移动Δf₁，并且另一束经过第二声光移频器产生频率移动Δf₂后，经过第二偏振分光棱镜后，两束频率移动后的线偏光合束；两束偏振正交的线偏光合束后，通过方位角为45°的1/4波片，将两束线偏光转变为具有频率差Δf的左旋圆偏光和右旋圆偏光，Δf＝Δf₁-Δf₂，并进一步叠加形成偏振方向按照频率差Δf＝Δf₁-Δf₂为频率连续旋转的线性偏振光，然后通过第一光纤耦合器被耦合进光纤；在光纤的另一端，偏振连续旋转的线偏光通过第一光纤转接件后，经第一准直透镜准直，由第一望远镜系统扩大束腰至过填充探测物镜的后瞳，并通过二向色镜至探测物镜，经探测物镜形成紧聚焦的线偏光场，通过产生单光束梯度力阱，能够将微颗粒或者细胞在三维空间中约束在焦点附近，同时引起样品中各向异性的极化，从而产生一个依赖于双折射极化方向与电场方向夹角的力矩，使得微颗粒或者细胞的极化方向重新排布至同光场的偏振方向一致；当线偏光的偏振方向以设定的频率差高速旋转时，这个力矩使得被捕获的微颗粒或者细胞同步地被线偏光的高速旋转驱动着转动，来满足光学衍射层析成像中对于样品旋转地需求，实现在光学衍射层析成像对样品无接触且快速连续旋转的控制；

同步控制系统包括计算机和射频信号发生器，计算机连接至射频信号发生器，射频信号发生器分别连接至第一声光移频器和第二声光移频器；计算机连接至第二相机；计算机输出模拟信号控制射频信号发生器输出相应的射频信号至第一和第二声光移频器，使得第一和第二声光移频器产生频率差Δf＝Δf₁-Δf₂；同时计算机输出与频率差Δf相匹配的数字信号至第二相机，并控制第二相机以1/(Δf₁-Δf₂)的曝光时间进行曝光，实现无接触快速连续旋转样品的同时，对每个角度同步的进行相机曝光和数据采集，完成光学衍射层析显微成像。

4.如权利要求3所述的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统，其特征在于，所述线偏光的偏振方向的设定的频率差为0～500MHz。

5.一种如权利要求1所述的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统的成像方法，采用光学投影层析成像光路，其特征在于，所述成像方法包括以下步骤：

1)光学投影层析成像光路的实现：

a)投影照明激光光源作为光学投影层析成像光路的光源发出投影照明激光；

b)投影照明激光经第一声光调制器对一级光的强度进行快速的调制，经过第二望远镜系统调整至束腰大小与样品匹配的平行光照射在样品上；

c)平行光被样品散射后，透射光作为信号光由探测物镜收集；

d)信号光经过二向色镜后通过第一套筒透镜成像于第一相机上；

2)光镊产生光路的实现：

a)光镊激发光源产生相干高斯光；

b)高斯光通过第一1/2波片改变相干高斯光的偏振方向，再经过第一偏振分光棱镜分光为水平偏振的线偏光和垂直偏振的线偏光，通过旋转第一1/2波片的角度来调节水平偏振的线偏光与垂直偏振的线偏光的能量配比；

c)两束偏振正交的线偏光，其中一束经过第一声光移频器产生频率移动Δf₁，并且另一束经过第二声光移频器产生频率移动Δf₂后，经过第二偏振分光棱镜后，两束频率移动后的偏振正交的线偏光合束；

d)两束偏振正交的线偏光合束后，通过方位角为45°的1/4波片，将两束线偏光转变为具有频率差Δf的左旋圆偏光和右旋圆偏光，Δf＝Δf₁-Δf₂，并进一步叠加形成偏振方向按照频率差Δf＝Δf₁-Δf₂为频率连续旋转的线性偏振光，然后通过第一光纤耦合器被耦合进光纤；

e)在光纤的另一端，偏振连续旋转的线偏光通过第一光纤转接件后，经第一准直透镜准直，由第一望远镜系统扩大束腰至过填充探测物镜的后瞳，并通过二向色镜至探测物镜；

3)对样品的控制：

a)经探测物镜形成紧聚焦的线偏光场，通过产生单光束梯度力阱，能够将微颗粒或者细胞在三维空间中约束在焦点附近；

b)同时引起样品中各向异性的极化，从而产生一个依赖于双折射极化方向与电场方向夹角的力矩，使得微颗粒或者细胞的极化方向重新排布至同光场的偏振方向一致；

c)当线偏光的偏振方向以设定的频率差高速旋转时，这个力矩使得被捕获的微颗粒或者细胞同步地被线偏光的高速旋转驱动着转动，来满足光学投影层析成像中对于样品旋转地需求，实现在光学投影层析成像对样品无接触且快速连续旋转的控制；

4)信号同步的控制：

a)计算机输出模拟信号控制射频信号发生器输出相应的射频信号至第一和第二声光移频器，使得第一和第二声光移频器产生频率差Δf＝Δf₁-Δf₂；

b)同时计算机输出与频率差Δf相匹配的数字信号至第一相机，并控制第一相机以1/(Δf₁-Δf₂)的曝光时间进行曝光，实现对样品无接触快速连续旋转的同时，对每个角度同步的进行相机曝光和数据采集，形成光学投影层析显微成像。

6.如权利要求3所述的快速连续旋转样品的光学层析显微成像系统的成像方法，采用光学衍射层析成像光路，其特征在于，所述成像方法包括以下步骤：

1)光学衍射层析成像光路的实现：

a)衍射照明激光光源作为光学衍射层析成像光路的光源发出衍射照明激光，衍射照明激光为相干光；

b)衍射照明激光经第二声光调制器对一级光的强度进行快速的调制，之后经过第二1/2波片和第三分光棱镜将激光分为照明光和参考光；

c)其中照明光经过第二光纤耦合器耦合进光纤，通过第二光纤转接件后，通过第二准直透镜准直；参考光经过第三光纤耦合器耦合进光纤，通过第三光纤转接件后，通过第三准直透镜准直；

d)准直后的照明光经过第三望远镜系统调整到大小与样品匹配的束腰作为照明光源照射到样品上产生散射光，散射光由探测物镜收集，并通过二向色镜在第四分光棱镜处与准直后的参考光合束并发生干涉；

e)通过旋转第二1/2波片调整照明光和参考光的分光比，使得干涉条纹的对比度最高；

f)干涉后的光通过第二套筒透镜将全息图投射在第二相机上；

g)对记录的全息图通过雷托夫近似理论解算得到样品的三维折射率分布；

2)光镊产生光路的实现：

a)光镊激发光源产生相干高斯光；

b)高斯光通过第一1/2波片改变相干高斯光的偏振方向，再经过第一偏振分光棱镜分光为水平偏振的线偏光和垂直偏振的线偏光，通过旋转第一1/2波片的角度来调节水平偏振的线偏光与垂直偏振的线偏光的能量配比；

c)两束偏振正交的线偏光，其中一束经过第一声光移频器产生频率移动Δf₁，并且另一束经过第二声光移频器产生频率移动Δf₂后，经过第二偏振分光棱镜后，两束频率移动后的偏振正交的线偏光合束；

d)两束偏振正交的线偏光合束后，通过方位角为45°的1/4波片，将两束线偏光转变为具有频率差Δf的左旋圆偏光和右旋圆偏光，Δf＝Δf₁-Δf₂，并进一步叠加形成偏振方向按照频率差Δf＝Δf₁-Δf₂为频率连续旋转的线性偏振光，然后通过第一光纤耦合器被耦合进光纤；

e)在光纤的另一端，偏振连续旋转的线偏光通过第一光纤转接件后，经第一准直透镜准直，由第一望远镜系统扩大束腰至过填充探测物镜的后瞳，并通过二向色镜至探测物镜；

3)对样品的控制：

a)经探测物镜形成紧聚焦的线偏光场，通过产生单光束梯度力阱，能够将微颗粒或者细胞在三维空间中约束在焦点附近；

b)同时引起样品中各向异性的极化，从而产生一个依赖于双折射极化方向与电场方向夹角的力矩，使得微颗粒或者细胞的极化方向重新排布至同光场的偏振方向一致；

c)当线偏光的偏振方向以设定的频率差高速旋转时，这个力矩使得被捕获的微颗粒或者细胞同步地被线偏光的高速旋转驱动着转动，来满足光学衍射层析成像中对于样品旋转地需求，实现在光学衍射层析成像对样品无接触且快速连续旋转的控制；

4)信号同步的控制：

a)计算机输出模拟信号控制射频信号发生器输出相应的射频信号至第一和第二声光移频器，使得第一和第二声光移频器产生频率差Δf＝Δf₁-Δf₂；

b)同时计算机输出与频率差Δf相匹配的数字信号至第二相机，并控制第二相机以1/(Δf₁-Δf₂)的曝光时间进行曝光，实现无接触快速连续旋转样品的同时，对每个角度同步的进行相机曝光和数据采集，形成光学投影层析显微成像。

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