JP2014074016A

JP2014074016A - メタロチオネイン産生促進剤

Info

Publication number: JP2014074016A
Application number: JP2013185864A
Authority: JP
Inventors: Hide Sudo; 秀須藤
Original assignee: Mikimoto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mikimoto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-09-13
Filing date: 2013-09-09
Publication date: 2014-04-24

Abstract

【課題】
本発明の目的はメタロチオネインの産生を促進し、生体内の酸化ストレスに対する抵抗性が向上して、紫外線等による皮膚傷害を防ぐ製剤を得ること。
【解決手段】
真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物がメタロチオネイン産生を促進し、皮膚外用剤として有効なことを確認した。
【選択図】図１

Description

本発明は、メタロチオネインの産生を促進し、皮膚を健全に保つ製剤に関する。

メタロチオネイン (metallothionein) は、1957年にMargoshesとValleeによってウマの腎臓からカドミウムを結合するタンパク質として発見された金属結合性のタンパク質であり、六十数個のアミノ酸残基で構成され、そのうちの約１／３がシステイン残基である分子量６０００〜７０００の蛋白質でできることから、必須微量元素の恒常性維持あるいは重金属元素の解毒の役割を果たしている。
メタロチオネインは上記の作用のほかに活性酸素のスカベンジャーの働きがあると報告されている。（非特許文献１参照）
その結果、生体内の酸化ストレスに対する抵抗性が向上して、紫外線等による皮膚傷害を防御することが可能になる。
皮膚への太陽紫外線の照射等によって活性酸素が生じ、活性酸素は皮膚に対してＤＮＡ損傷等の種々のダメージを加えることはよく知られている。
また、メタロチオネイン以外の多くの活性酸素のスカベンジャーは不安定なものが多い。
メタロチオネインの産生を促進する物質としては、高級脂肪酸亜鉛、金属錯体、ヒノキチオール又はその塩等が知られている。（非特許文献１、特許文献１〜３）

真珠や真珠層由来蛋白加水分解物は加水分解コンキオリンとして化粧品に古くより、利用されており、例えば、ヒスタミン抑制、活性酸素抑制等の効果が知られている。
ＨａｎａｄａＫ．ｅｔａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，ｖｏｌ．１７９（ｓｕｐｐｌ．１），ｐ．１４３，１９８９特開平０７−０９７３０９号公報特開２００１−２７０８１５号公報特開２００５−２８１１６０号公報特開平０６−２１１６２５号公報特開平０６−２１１６４０号公報

本発明の目的はメタロチオネインの産生を促進し、生体内の酸化ストレスに対する抵抗性が向上して、紫外線等による皮膚傷害を防ぐ製剤を得ること。

本発明者らが鋭意検討した結果、真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物が上記目的を達することがわかった。
ここで利用する真珠及び真珠層について説明する。
まず、真珠とは，生きた真珠貝の中で球状または半球状(多少の変形を含む)に形成される代謝生産物であって，かつ，この外見しうる部分の主たる構成物質が，真珠貝の真珠層と等質であるものをいう。
真珠貝は貝殻に真珠層を有する貝類をいうが、二枚貝綱、腹足綱、頭足綱などのうち特定の古い系統の貝類を指し、例示すれば、アコヤガイ、シロチョウガイ、クロチョウガイ、ベニコチョウガイ、マベガイ等のアコヤガイ属の二枚貝類の他に、イガイ、ムラサキイガイ、ヤコウガイ、イケチョウガイ、カワシンジュガイ、カサガイ等が挙げられる。
このうち、アコヤガイ、シロチョウガイ、クロチョウガイが養殖も実施されており原料の確保の点から好ましい。

真珠はそのままか或いは核を取り除く。
真珠層を有する貝殻を利用する場合は貝殻に付着した、触手動物、軟体動物、節足動物、環形動物、脊索動物、海藻類等々多種多様の生物や海泥等の無機物を、水、ブラシ、ヘラ等で取り除く。（勿論貝肉等もなるべく取り除いておく）
また、貝殻の内、殻皮層、稜柱層は場合によっては、ブラシ、ヘラ、グラインダーを用いて取り除く。また、特開昭６２−１２０３１９号公報、特開２００３−２５０４８９号公報、特開２０１１−７２２０７号公報等にも種々の方法が記載されているので任意の方法を選択すればよい。
以上、真珠或いは真珠層を有する貝殻の一方又は両方より、炭酸カルシウム等を除くために脱灰する。これをスムーズに行うために破砕・粉砕工程を必要に応じて加える。
破砕・粉砕は、金槌、棒等で破砕してもよいし、ジャイレトリクラッシャー、コーンクラッシャー、シングルロールクラッシャー、ダブルロールクラッシャー、インパクトクラッシャー、ボールミル、ハンマーミル、ロッドミル等のクラッシャーや粉砕機を用いて破砕・粉砕を行ってもよい。

脱灰は通常酸を用いて行われる。用いる酸は、カルシウムと反応して水に溶解するものであれば用いることができる。例示すれば、塩酸、硝酸、乳酸、酢酸、グリコール酸等の無機酸、有機酸を挙げることができるが、なかでもコストの面から塩酸が選択される場合が多い。塩酸を使用するときは発泡するので、必要に応じて、水を加えて、徐々に塩酸を加えながら撹拌する。撹拌は加えた水の量、貝殻の粉砕程度、反応温度、発砲の程度等によって撹拌の強度を選択する。
また、反応時間は粉砕の程度、反応温度等によって変化するが、１０時間〜１０日間程度が好ましい。
加える塩酸の量は炭酸カルシウムが溶解する程度でよいが、後工程の蛋白の加水分解工程で酸を用いる場合は加水分解時の酸濃度が変化するので、塩酸の量は炭酸カルシウムが溶解するに必要な量より若干多めにし、充分に脱灰しておく。
これを遠心分離、濾過等で不溶物を集める。用途によっては後述する脱塩工程を実施する場合、脱塩の方法によってはこの工程で充分に塩を取り除く必要があるので、不溶物に水を加えて、撹拌後、遠心分離、濾過等で不溶物を集める工程を複数回繰り返すとよい。

集めた不溶物を加水分解する。加水分解の方法は酸、アルカリ、蛋白分解酵素等を用いて行うが、真珠或いは真珠層の蛋白は通常の蛋白分解酵素では分解できないので、酵素の種類、分解条件を工夫する必要がある。
酸としては、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、亜硫酸、シュウ酸、クエン酸、酢酸、ギ酸、乳酸などが使用でき、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が例示されるが、このうちの１種又は２種以上を用いて、さらには蛋白分解酵素と組み合わせて蛋白を加水分解する。この中でもよく用いられるのは、塩酸、硫酸が挙げられる。
加水分解の条件は、酸、アルカリ、酵素の種類によって選択されるが、塩酸や硫酸を用いる場合は、１〜１０モル、室温〜１２０℃、１時間〜１０日間程度がよく、加圧も加えてもよい。
加水分解後、酸やアルカリを用いた場合は中和、酵素を用いた場合は加熱等の失活操作を必要に応じて行う。さらに用途によっては、完全に或いは一部脱塩する。
その後、必要に応じて脱色工程や乾燥工程を加え、真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物を得る。
また、特開昭６２−２２３１０４号公報、特開平０２−０７６５９７号公報、特開平０５−０４３４４４号公報の方法も参考になる。

本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。

また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。

上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。

油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。

本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。

本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができ、クリーム、乳液、化粧水等の形態とすることができる。

次に実施例（製造例）を挙げて本発明を詳細に説明する。

製造例１
貝肉や貝殻に付着物を水、ブラシで除去し、約１〜５mm程度に粉砕したアコヤガイ貝殻５０kgに水４５０kgを加えて撹拌しつつ、塩酸１００kgを徐々に加えた。さらに水１００kgを加え３日間撹拌した。塩酸１０kgを徐々に加えた。さらに水２００kgを加え２日間撹拌した。撹拌しつつ、水酸化ナトリウム３kgを徐々に加えた。
ｐＨ７になるように２５％水酸化ナトリウムで調整した後水２００kg加えた。これをシャープレス遠心機で沈殿を集めた。
沈殿を解砕し、０．１モル塩酸２０kgを加えて２４日間ゆっくり撹拌した。これに水１０００kgを撹拌しつつ加えたのち、シャープレス遠心機で沈殿を集めた。
沈殿を解砕し、これに水１０００kgを撹拌しつつ加えたのち、シャープレス遠心機で沈殿を集めた。
この沈殿２００ｇに１０倍希釈した硫酸を３kg加え、１１０℃のオイルバスで２４時間加水分解した。
放冷後、水酸化バリウムを徐々に加えながらｐＨ３．０に調整した後、遠心分離（６０００rpm、１５分間）し、上澄みにアンバーライトＩＲＡ９１０をｐＨ７．０になるまで徐々に加えた。これを濾過して濾液に活性炭を１０ｇ加え３０分間撹拌した。
これを濾過し、凍結乾燥した。

製造例２
貝肉や貝殻に付着物を水、ブラシで除去し、約１〜５mm程度に粉砕したクロチョウガイ貝殻５kgに水４５kgを加えて撹拌しつつ、塩酸１０kgを徐々に加えた。さらに水１０kgを加え３日間撹拌した。塩酸１kgを徐々に加えた。さらに水２００kgを加え２日間撹拌した。撹拌しつつ、水酸化ナトリウム３００ｇを徐々に加えた。
１０％硫酸５００ｇを加え、１１０℃のオイルバスで２４時間加水分解した。
放冷後、水酸化ナトリウムを徐々に加えながらｐＨ７．０に調整した後、遠心分離（６０００rpm、１５分間）し、上澄みを得た。これに２倍量のエタノールを加え、ゆっくり撹拌した後、４℃で１週間静置した。
これを濾過し、凍結乾燥した。

確認試験１ＤＮＡマイクロアレイ解析
試験方法は、製造例１の０．５％を表皮ケラチノサイトに作用して４８時間後に上記（ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ）と同様にしてコントロールと共にＲＮＡを抽出し、各３μｇのＲＮＡからＱｕｉｃｋＡｍｐＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ，ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＣｙ３，Ｃｙ５標識プローブを作成した。ＱｕｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて標識プローブを精製後、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｋｉｔ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＷｈｏｌｅＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅスライド（４×４４Ｋ，ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で６０℃、１７時間ハイブリダイズした。洗浄後、ＡｇｉｌｅｎｔＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓｃａｎｎｅｒ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてスキャンし、ＦｅａｔｕｒｅＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｔｗａｒｅを使ってデータ処理を行った。

試験結果は、ＬｏｇＲａｔｉｏとして、メタロチオネイン１Ａは０．８１０、メタロチオネイン１Ｂは０．９３３、メタロチオネイン１Ｅは０．７５３、メタロチオネイン１Ｆは０．４７１、メタロチオネイン１Ｇは１．０１０、メタロチオネイン１Ｈは０．９１８、メタロチオネイン１Ｌは０．２８９、メタロチオネイン１Ｍは０．５０９、メタロチオネイン１Ｘは０．９５７、メタロチオネイン２Ａは１．０８５、メタロチオネイン３は０．４９４、メタロチオネイン４は０．２８８となった。

確認試験２
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、製造例を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。

＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からのＴｏｔａｌＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、ＳＶＴｏｔａｌＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、プロメガ社の添付マニュアル（日本語プロトコールＮｏＴＭ０４８Ｊ２００１年６月作成）に従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。

＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌＲＮＡを使い、ＭＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳＦＯＲＬＩＦＥＳＣＩＥＮＣＥ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００リアルタイムＰＣＲＳｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤＳＹＢＲｑＰＣＲＭｉｘ，東洋紡社）、７５００リアルタイムＰＣＲＳｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。

＜使用プライマー＞
メタロチオネイン１Ａ：フォワードプライマーがＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＧＡＧＴＧＣＡＡＡ（配列番号１）の塩基配列と、リバースプライマーがＡＴＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＧＴＡＴＧＧＡ（配列番号２）の塩基配列とのセット
メタロチオネイン１Ｅ：フォワードプライマーがＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号３）の塩基配列と、リバースプライマーがＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣＣＡＣＡ（配列番号４）の塩基配列とのセット
メタロチオネイン１Ｆ：フォワードプライマーがＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号５）の塩基配列と、リバースプライマーがＡＡＡＧＧＴＴＧＴＣＣＴＧＧＣＡＴＣＡＧ（配列番号６）の塩基配列とのセット
メタロチオネイン２Ａ：フォワードプライマーがＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＧＡＧＴＧＣＡＡＡ（配列番号７）の塩基配列と、リバースプライマーがＡＴＣＣＡＧＧＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＴＣＧ（配列番号８）の塩基配列とのセット
ＧＡＰＤＨ：フォワードプライマーがＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号９）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ（配列番号１０）の塩基配列とのセット

確認試験２の結果は、製造例１を０．５％作用させて実験した結果を図１に示す。
結果を見ると、製造例１は０．５％で作用させた場合、メタロチオネイン１Ａの遺伝子発現量を約２．８倍、メタロチオネイン１Ｅの遺伝子発現量を約２．１倍、メタロチオネイン１Ｆの遺伝子発現量を約３．５倍、メタロチオネイン２Ａの遺伝子発現量を約４．７倍に増加させることがわかった。
次に、製造例２を０．５％作用させて実験した結果を図２に示す。
結果を見ると、製造例２は０．５％で作用させた場合、メタロチオネイン１Ｆの遺伝子発現量をを約１．９倍に増加させることがわかった。

このように、アコヤガイ由来の製造例１は、ＤＮＡマイクロアレイ解析で、メタロチオネイン１Ａ、１Ｂ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、１Ｌ、１Ｍ、１Ｘ、２Ａ、３、４の各遺伝子の発現を促進することが示された。
さらに、定量的なｍＲＮＡ遺伝子発現試験で、メタロチオネイン１Ａ、１Ｅ、１Ｆ、２Ａの各遺伝子の発現を確認したところ、遺伝子の発現を促進することを確認した。
また、クロチョウガイ由来の製造例２でもメタロチオネイン１Ｆの遺伝子の発現を促進することを確認した。

また、製造例を配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、肌荒れ防止、肌理正常化が改善がみられた。

製造例１の終濃度０．５％での確認試験２の結果で、メタロチオネイン１Ａ、１Ｅ、１Ｆ、２Ａの各遺伝子発現量変化を示す図である。縦軸は製造例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としたときの遺伝子発現量である。製造例２の終濃度０．５％での確認試験２の結果で、メタロチオネイン１Ｆの遺伝子発現量変化を示す図である。縦軸は製造例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としてときの遺伝子発現量である。

Claims

真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物を有効成分とするメタロチオネイン産生促進剤。
アコヤガイ属の二枚貝を由来とする真珠及び／又は真珠層由来蛋白加水分解物を有効成分とするメタロチオネイン産生促進剤。