JP2013535240A - 組織マトリックスの成形方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
脱細胞化し、コラーゲン線維を再配向させるための組織の処理:
死体提供者からヒト皮膚を得、上部を厚さ約2mmに分割した。0.5%(w/v)TRITON X100を含有する1.0M塩化ナトリウム溶液中でインキュベートすることにより、室温で17時間、提供者の皮膚を脱表皮化した。2%(w/v)デオキシコール酸ナトリウム中で22時間インキュベートすることにより、組織を脱細胞化した。脱表皮化され、脱細胞化された組織マトリックスを、5mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含有するDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.5)中で洗浄し、一時的に貯蔵するために−80℃で凍結した。凍結真皮は室温(約22℃)で解凍し、DulbeccoのPBS溶液で終夜洗浄した。
示差走査熱量測定(DSC)を使用して、対照組織マトリックス(脱細胞化したが、コラーゲン再配向を行わなかったもの)と再水和された成形組織製品との差を評価した。図4は、対照の無細胞ヒト皮膚材料と成形組織製品の示差走査熱量測定サーモグラムである。図示するように、対照の材料と成形組織製品のサーモグラムは非常に類似しており、類似の変性温度を有し、コラーゲン架橋または損傷がほとんどないことが分かった。従って、部分脱水および低線量γ線を用いたコラーゲン線維の再配向では、コラーゲン線維と組織マトリックスの構造および安定性はあまり変化しなかった。
再水和された組織マトリックスを2%グルタルアルデヒド中で24時間固定し、25%、50%、75%、90%、98%および100%(v/v)エタノール溶液中で順次脱水した。各エタノール脱水ステップの持続時間は、少なくとも2時間であった。エタノールで脱水したサンプルをヘキサメチルジシラザン中で乾燥させ、次いで、10キロボルトで走査型電子顕微鏡(SEM)観察を行う前に金でスパッタコーティングした。
脱細胞化し、コラーゲン線維を再配向させるための組織の処理:
ブタ皮膚を分割し、表皮と皮下脂肪を除去した。残りの組織は、厚さ1.9±0.2mm(N=5)であった。2%(w/v)デオキシコール酸ナトリウム中で24時間室温でインキュベートすることにより組織を脱細胞化した後、1回の洗浄につき2時間、PBSで3回洗浄した。脱細胞化された皮膚マトリックスを滅菌GAMMA WIPES(登録商標)で吸い取り乾燥させることにより部分的に脱水し、乾燥組織質量1グラム当たり水2.34±0.37グラムの組織水和レベルまたは70%(w/w)の最終含水量を達成した。脱水により約43%の組織水が除去された。吸い取りプロセスは、組織マトリックスに機械的圧力(圧縮力)を加えて、組織マトリックス中のコラーゲン線維を再配向させるためにも使用した。
示差走査熱量測定(DSC)を使用して、対照組織マトリックス(脱細胞化したが、コラーゲン再配向を行わなかったもの)と再水和された成形組織製品との差を評価した。図6は、対照の無細胞ブタ皮膚材料と成形組織製品の示差走査熱量測定サーモグラムである。図示するように、サーモグラムでの成形組織製品の変性温度は、僅かに高温に(1〜2℃)シフトしたが、対照の材料と成形組織製品のサーモグラムは類似していた。コラーゲンの再配向とγ線照射により生じたシフトが小さかったことから、コラーゲン架橋の量が少ないことが分かった。
再水和されたサンプルを、SEM観察について実施例1に記載したように、固定し、脱水し、準備した。図7A〜図7Dは、対照の無細胞ブタ皮膚材料(図7Aおよび図7B)と成形組織製品(図7Cおよび図7D)の走査型電子顕微鏡写真である。低倍率画像(図7Aおよび図7C)から、処理の結果、コラーゲン線維の再配列が起こったことが分かる。さらに、より高倍率の画像(図7Bおよび図7D)から、処理によりコラーゲン線維が互いに接近したが、コラーゲン線維の構造は変化しなかったことが分かる。
0.9cmの開口部を有するフランツセル拡散チャンバを使用し、組織マトリックスシートを透過するフルオレッセイン・イソチオシアネート(FITC)標識BSAの拡散速度を測定した。ドナーチャンバのFITC−BSA濃度は10μg/mlに維持した。レセプターチャンバの溶液の蛍光を1時間毎に7時間測定した。拡散評価の終了時、組織サンプルを10ミクロンの薄片に凍結薄切し、蛍光顕微鏡を使用して画像化した。
ブタ皮膚を0.2%水酸化カルシウム溶液に5日間浸漬して、表皮と体毛を浸軟させ(loosen)、表皮と体毛を擦り取ることにより機械的に除去した。脱表皮化し、脱毛した真皮を酢酸で中和し、蒸留水中で48時間十分洗浄した。次いで、清浄にした真皮を、2%(w/v)デオキシコール酸ナトリウム溶液と10mMのETDAとを含有する溶液中に40時間浸漬することにより脱細胞化した。脱細胞化後、皮膚マトリックス(厚さ約2mm)をPBS溶液中で洗浄し、残留界面活性剤を除去した。
死体提供者からヒト皮膚を得た。ダーマトームを使用して表皮を除去した。皮膚組織(約2.5mm)を24時間2%(w/v)デオキシコール酸ナトリウムで脱細胞化し、PBS中で20時間洗浄して、界面活性剤残留物を除去した。脱細胞化された皮膚シート片を吸い取り乾燥させ、プラスチックコーン(plastic cone)(φ=4cm)上に載置した。第2のプラスチックコーンをその上に載せ、皮膚マトリックスをコーンの形態に固定した。この構造物を箔−箔バッグに包装し、16.7kGyの線量で電子線を照射した。
ブタ頚動脈(長さ7〜8cm)を動物の首から切除し、その外径により2群に分けた(A群、5〜6mm;B群、7〜8mm)。切除した動脈を30分間0.5%(w/v)TRITON X100で洗浄し、血液を除去した。動脈を凍結し、抗生物質カクテル(50μg/mlペニシリン、1.25μg/mlアムホテリシンB、および50μg/mlストレプトマイシン)を含有する2%デオキシコール酸ナトリウム溶液中で3回解凍した。凍結−解凍サイクルの後、動脈を37℃で96時間、同じデオキシコール酸ナトリウム溶液中で脱細胞化した。脱細胞化された動脈を、50u/mlペニシリン、1.25ug/mlアムホテリシンB、および50ug/mlストレプトマイシンを有するDulbeccoのPBSで4回洗浄した(1回の洗浄につき2時間)。A群とB群の処理された動脈の半分を、抗生物質を有するPBS中で4℃で貯蔵した。処理された動脈の他方の半分にγ線を照射した。各動脈に5−mmの外科用ドレーンを挿入して支持した後、動脈をGAMMA WIPES(登録商標)で吸い取り乾燥させた。吸い取りプロセスは、組織マトリックスに機械的圧力(圧縮力)を加えて、組織マトリックス中のコラーゲン線維を再配向させるためにも使用した。
LifeCell Corporationから、ALLODERM(登録商標)およびSTRATTICE(商標)皮膚組織マトリックスを入手した。ALLODERM(登録商標)は凍結乾燥させた無細胞ヒト皮膚マトリックスであり、STRATTICE(商標)は水和された無細胞ブタ皮膚マトリックスである。ALLODERM(登録商標)組織マトリックスをPBS中で無菌的に再水和させ、3回洗浄して凍結保護物質を除去した。使用の準備が整うまで、再水和されたヒト皮膚マトリックスを4℃で貯蔵した。STRATTICE(商標)組織マトリックスをPBS中で3回無菌的に洗浄し、組織保存溶液を除去した。
「無細胞組織マトリックス」という用語は、本明細書で使用する場合、一般に、細胞および/または細胞成分を実質的に含まない任意の組織マトリックスを指す。皮膚、皮膚の一部(例えば、真皮)、および他の組織(血管、心臓弁、筋膜、軟骨、骨、および神経結合組織など)を使用して、本開示の範囲に入る無細胞マトリックスを製造することができる。無細胞組織マトリックスが細胞および/または細胞成分を実質的に含まないかどうかを判定するために、多くの方法で無細胞組織マトリックスの試験または評価を行うことができる。例えば、処理された組織を光学顕微鏡検査で検査して、細胞(生細胞もしくは死細胞)および/または細胞成分が残存するかどうか判定することができる。さらに、特定のアッセイを使用して細胞または細胞成分の有無を確認することができる。例えば、DNAまたは他の核酸のアッセイを使用して、組織マトリックス中に残存する核物質を定量化することができる。一般に、残存するDNAまたは他の核酸がない場合、完全に脱細胞化されている(即ち、細胞および/または細胞成分が除去されている)ことが分かる。最後に、細胞特有の成分(例えば、表面抗原)を同定する他のアッセイを使用して、組織マトリックスが無細胞であるかどうかを判定することができる。
Claims (60)
- 組織マトリックスの成形方法であって、
コラーゲン含有組織マトリックスを選択するステップと;
前記組織マトリックスを部分的に脱水するステップと;
前記組織マトリックスに機械的力を加えて、前記組織マトリックス中の少なくとも一部のコラーゲン線維の配向を変化させるステップと;
前記組織マトリックスを放射線に曝露するステップと;
を含む方法。 - 請求項1に記載の方法において、前記組織マトリックスが無細胞組織マトリックスであることを特徴とする方法。
- 請求項1または2に記載の方法において、前記組織マトリックスが皮膚組織マトリックスを含むことを特徴とする方法。
- 請求項1または2に記載の方法において、前記組織が、筋膜、心膜組織、硬膜、臍帯組織、胎盤組織、心臓弁組織、靭帯組織、腱組織、動脈組織、静脈組織、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、および腸組織から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法において、前記組織マトリックスを部分的に脱水するステップが、95%(w/w)〜50%(w/w)の含水量を有する組織マトリックスを製造するように水を除去するステップを含むことを特徴とする方法。
- 請求項5に記載の方法において、前記含水量が80%(w/w)〜65%(w/w)であることを特徴とする方法。
- 前記組織マトリックスを再水和するステップをさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法において、前記放射線が5Gy〜50kGyの線量で照射されることを特徴とする方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法において、前記放射線が5Gy〜20kGyの線量で照射されることを特徴とする方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法において、前記放射線が10kGy未満の線量で照射されることを特徴とする方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法において、前記放射線が5kGy未満の線量で照射されることを特徴とする方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法において、前記放射線が1kGy未満の線量で照射されることを特徴とする方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法において、前記放射線がγ線、電子線、およびX線から選択されることを特徴とする方法。
- コラーゲンを含む細胞外組織マトリックス、
を含む組織製品において、前記細胞外組織マトリックスが、
前記細胞外組織マトリックスを部分的に脱水するステップと;
前記組織マトリックスに機械的力を加えて、前記組織マトリックス中の少なくとも一部のコラーゲン線維を再配向させるステップと;
前記組織マトリックスを放射線に曝露するステップと;
を含む方法で形成される安定な三次元形状を有することを特徴とする製品。 - 請求項14に記載の製品において、前記組織マトリックスが無細胞組織マトリックスであることを特徴とする製品。
- 請求項14または15に記載の製品において、前記組織マトリックスが皮膚組織マトリックスを含むことを特徴とする製品。
- 請求項14または15に記載の製品において、前記組織が、筋膜、心膜組織、硬膜、臍帯組織、胎盤組織、心臓弁組織、靭帯組織、腱組織、動脈組織、静脈組織、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、および腸組織から選択されることを特徴とする製品。
- 請求項14〜17のいずれか1項に記載の製品において、前記組織マトリックスを部分的に脱水するステップが、95%(w/w)〜50%(w/w)の含水量を有する組織マトリックスを製造するように水を除去するステップを含むことを特徴とする製品。
- 請求項14〜17のいずれか1項に記載の製品において、前記含水量が80%(w/w)〜65%(w/w)であることを特徴とする製品。
- 請求項14〜19のいずれか1項に記載の製品において、前記三次元形状がカップ状の形状であることを特徴とする製品。
- 請求項14〜19のいずれか1項に記載の製品において、前記三次元形状が管状の形状であることを特徴とする製品。
- 請求項14〜21のいずれか1項に記載の製品において、前記放射線が5Gy〜50kGyの線量で照射されることを特徴とする製品。
- 請求項14〜21のいずれか1項に記載の製品において、前記放射線が5Gy〜20kGyの線量で照射されることを特徴とする製品。
- 請求項14〜21のいずれか1項に記載の製品において、前記放射線が10kGy未満の線量で照射されることを特徴とする製品。
- 請求項14〜21のいずれか1項に記載の製品において、前記放射線が5kGy未満の線量で照射されることを特徴とする製品。
- 請求項14〜21のいずれか1項に記載の製品において、前記放射線が1kGy未満の線量で照射されることを特徴とする製品。
- 請求項14〜26のいずれか1項に記載の製品において、前記放射線がγ線、電子線、およびX線から選択されることを特徴とする製品。
- 請求項14〜26のいずれか1項に記載の製品において、前記組織マトリックスの流体透過性が、脱水、機械的力の印加、および照射の前の前記組織マトリックスの透過性より低いことを特徴とする製品。
- コラーゲン線維を含む細胞外組織マトリックス、
を含む組織製品において、前記マトリックス中のコラーゲン線維の少なくとも一部の配向は、前記マトリックスが製造される組織中の線維の配向と異なり、前記マトリックスは安定な三次元形状を形成し、示差走査熱量測定で測定される前記マトリックスの変性温度は、前記マトリックスが製造される組織の変性温度の5℃以内であることを特徴とする製品。 - 請求項29に記載の製品において、差走査熱量測定で測定される前記変性温度は、前記マトリックスが製造される組織の変性温度の3℃以内であることを特徴とする製品。
- 請求項29または30に記載の製品において、前記組織マトリックスが無細胞組織マトリックスであることを特徴とする製品。
- 請求項29〜31のいずれか1項に記載の製品において、前記組織マトリックスが皮膚組織マトリックスを含むことを特徴とする製品。
- 請求項29〜31のいずれか1項に記載の製品において、前記組織が、筋膜、心膜組織、硬膜、臍帯組織、胎盤組織、心臓弁組織、靭帯組織、腱組織、動脈組織、静脈組織、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、および腸組織から選択されることを特徴とする製品。
- 請求項29〜33のいずれか1項に記載の製品において、前記細胞外組織マトリックスは、前記組織マトリックスが製造される組織の三次元形状と異なる安定な三次元形状を形成することを特徴とする製品。
- 請求項29〜34のいずれか1項に記載の製品において、前記三次元形状がカップ状の形状であることを特徴とする製品。
- 請求項29〜34のいずれか1項に記載の製品において、前記三次元形状が管状の形状であることを特徴とする製品。
- 請求項29〜36のいずれか1項に記載の製品において、前記放射線が5Gy〜50kGyの線量で照射されることを特徴とする製品。
- 請求項29〜36のいずれか1項に記載の製品において、前記放射線が5Gy〜20kGyの線量で照射されることを特徴とする製品。
- 請求項29〜36のいずれか1項に記載の製品において、前記製品が実質的に流体不透過性であることを特徴とする製品。
- コラーゲン線維を含む細胞外組織マトリックス、
を含む組織製品において、前記マトリックス中のコラーゲン線維の少なくとも一部の配向は、前記マトリックスが製造される組織中の線維の配向と異なり、前記マトリックスは、化学架橋剤を使用することなく、安定な三次元形状を形成することを特徴とする製品。 - 請求項40に記載の製品において、前記組織マトリックスが無細胞組織マトリックスであることを特徴とする製品。
- 請求項40または41に記載の製品において、前記組織マトリックスが皮膚組織マトリックスを含むことを特徴とする製品。
- 請求項40〜42のいずれか1項に記載の製品において、前記細胞外組織マトリックスは、前記組織マトリックスが製造される組織の三次元形状と異なる安定な三次元形状を形成することを特徴とする製品。
- 組織マトリックスの成形方法であって、
コラーゲン含有組織マトリックスを選択するステップと;
前記組織マトリックスを部分的に脱水するステップと;
前記組織マトリックスに機械的力を加えて、前記組織マトリックス中のコラーゲン線維の少なくとも一部の配向を変化させるステップと;
前記組織マトリックスを放射線に曝露することにより、前記三次元構造を安定化させるステップと;
を含む方法。 - コラーゲンを含む細胞外組織マトリックス、
を含む組織製品において、前記細胞外組織マトリックスが、
前記細胞外組織マトリックスを部分的に脱水するステップと;
前記組織マトリックスに機械的力を加えて、前記組織マトリックス中のコラーゲン線維の一部または全部を再配向させるステップと;
前記組織マトリックスを放射線に曝露することにより、前記マトリックスの三次元構造を安定化させるステップと;
を含む方法により形成された安定な三次元形状を有することを特徴とする製品。 - 請求項45に記載の製品において、前記三次元形状がカップ状の形状であることを特徴とする製品。
- 請求項45に記載の製品において、前記三次元形状が管状の形状であることを特徴とする製品。
- 請求項45〜47のいずれか1項に記載の製品において、前記組織マトリックスの流体透過性が、脱水、機械的力の印加、および照射の前の前記組織マトリックスの透過性より低いことを特徴とする製品。
- 請求項45〜48のいずれか1項に記載の製品において、示差走査熱量測定で測定される前記マトリックスの変性温度は、前記マトリックスが製造される組織の変性温度の5℃以内であることを特徴とする製品。
- 請求項49に記載の製品において、差走査熱量測定で測定される前記変性温度は、前記マトリックスが製造される組織の変性温度の3℃以内であることを特徴とする製品。
- 請求項45〜50のいずれか1項に記載の製品において、前記細胞外組織マトリックスは、前記組織マトリックスが製造される組織の三次元形状と異なる安定な三次元形状を形成することを特徴とする製品。
- 請求項45〜51のいずれか1項に記載の製品において、前記製品が実質的に流体不透過性であることを特徴とする製品。
- 請求項45〜52のいずれか1項に記載の組織製品において、前記マトリックスが、化学架橋剤を使用することなく、安定な三次元形状を形成することを特徴とする製品。
- 請求項1〜53のいずれか1項に記載の方法または製品において、前記組織マトリックスが無細胞組織マトリックスであることを特徴とする方法または製品。
- 請求項1〜54のいずれか1項に記載の方法または製品において、前記組織マトリックスが皮膚組織マトリックスを含むことを特徴とする方法または製品。
- 請求項1〜55のいずれか1項に記載の方法または製品において、前記組織が、筋膜、心膜組織、硬膜、臍帯組織、胎盤組織、心臓弁組織、靭帯組織、腱組織、動脈組織、静脈組織、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、および腸組織から選択されることを特徴とする方法または製品。
- 請求項44または54〜56のいずれか1項に記載の方法において、前記組織マトリックスを部分的に脱水するステップが、95%(w/w)〜50%(w/w)の含水量を有する組織マトリックスを製造するように水を除去するステップを含むことを特徴とする方法。
- 前記組織マトリックスを再水和するステップをさらに含む、請求項44または54〜57のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜58のいずれか1項に記載の方法または製品において、前記放射線が5Gy〜50kGyの線量で照射されることを特徴とする方法または製品。
- 請求項1〜59のいずれか1項に記載の方法または製品において、前記放射線がγ線、電子線、およびX線から選択されることを特徴とする方法または製品。
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